KR100287424B1 - 헬리코박터 감염에 대한 우레아제 기재 백신(Urease-Based Vaccine Against Helicobacter Infection) - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따라서 항원으로서 면역학적 유효량의 헬리코박터 우레아제 또는 우레아제 소단위를 숙주에 투여함으로써 포유 동물 숙주에서 헤리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시키는 방법 및 백신 조성물이 제공된다.
Description
[발명의 명칭]
헬리코박터 감염에 대한 우레아제 기재 백신(Urease-Based Vaccine Against Helicobacter Infection)
[발명의 배경]
본 발명은 인가을 포함한 포유류에서의 위장 감염증의 예방 및 치료범에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 인간을 포함한 포유류에서의 헬리코박터 감염의 예방 및 치료에 사용하기에 적합한 백신 및 위장 감영증, 만성 위염 또는 소화성 궤양과 같은 그의 휴유증을 앓고 있는 인간의 치료 방법 및 위암의 예방법에 관한 것이다.
인간 위장 상피의 헬리코박터 감염은 위염을 일으키며, 그것은 소화성 궤양 및 위 임파종 발병의 주원인이며, 위암 발병의 위험 요인이 될 수 있다[문헌 1 내지 3 참고]. 가장 빈번한 감염원은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylor)이며, 그 다음에는 헬리코박터 헤일마니(Helicobacter heilmanii)에 의해 자주 감염된다. 에이치. 필로리는 가느라단 S형 그람 음성 미생물이며, 그것은 통상적으로 위염 또는 소화성 궤양의 조직학적 증거를 가진 성인 및 어린이의 위 생검법에 의해 회수된다. 에이치. 필로리 및 위십이지장 질병 사이의 인과 관계에 대한 증거는 궤양 및 위암 환자 지원자, 순수 격리 돼지 및 무균 설치류로 연구하여 얻었다. 병인에 관하여, 코호의 요청은 예전에 비감염되었던 개체에 조직학적으로 확인된 위염을 일으키고, 이어서 생존 미생물을 소비하고[문헌 4 내지 11 참고], 위염 치료 및 소화성 궤양 질환을 앓고 있는 환자에 있어서는 재발율을 감소시키는 방벙으로써 에이치. 필로리를 제거 처리하여 만조시켰다[문헌 12 참고].
많은 살균제에 대한 생체외 민감성에도 불구하고, 발병된 에이치. 필로리 감염증을 살균제로 생체외 근절시키는 것이 종종 어려울 때도 있다[문헌 13 참고]. 미생물은 위점막 소와(小窩) 내의 위 상피를 중첩하는 점막 내에서 발견된다. 이곳은 항생 물질이 고투여량으로 경구 투여될 때에도 적당한 살균 농도가 얻어지도록 하는 보이지 않는 위치이다. 현재 대부분의 기관은 2 내지 4주 동안 "삼중 치료", 즉 비스무스염을 테트라사이클린 및 메트로니다졸과 같은약물과 병용하는 것을 추천한다. 그러나, 이러한 또는 다른 화학 치료 양생법의 효능은 최적 이하인 상태였다. 또한, 이러한 치료는 심각한 약물 부작용을 일으킬 수 있다.
현재에는, 위에서의 점막 면역계의 역할에 관해 알려진 바가 거의 없다. 정상 위동(胃洞)에서의 면역글루불린(Ig) 생성 세포의 분포는 IgA 혈장 세포가 총혈장 세포 집단의 80%를 구성한다는 것을 나타낸다. 또한, 위동에 존재하는 혈장 IgA 세포의 수는 다른 점막과 비교할만 하다[문헌 14 및 15 참고]. 인간 모델에서의 많은 연구[문헌 16 참고] 및 동물 모델에서의 많은 연구[문헌 8 및 10 참고]에서의 헬리코박터 감염에 대한 반응에 있어서 혈청 및 위 분비물에서의 특이적 IgG 및 IgA 반응이 증명되었다. 그러나, 에이치. 필로리 감염이 수년동안 만성적 감염으로서 유지된 경우는, 국소적 및 전신적 면역 반응을 유발시킨다 하더라도 면역화 방법이 전개될 수 없다는 것이 관찰되었다.
리(Lee) 등은 에이치. 필로리 및 재현성 조직학적 위염과 밀접한 관련이 있는 세균인 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis)로 무균 설치류를 감염시키는 능력에 대해 보고하였다. 그 이후에 이러한 세균-숙주 쌍은 헬리코박터 매개 위염 및 그의 개시 인자를 연구하기 위한 좋은 모델로서 이용되었다. 친(Czinn) 등은 에이치. 필로리의 조 용균액과 콜레라 독소 보조제에 의한 반복적인 경구 면역화는 마우스 및 페렛 동물(ferrets)에서 격렬한 위장 IgA 항-에이지. 필로리 반응을 유도한다는 것을 증명하였다[문헌 13 참고]. 또한, 첸(Chen) 및 친 등은 최근에 에이치. 페리스의 조 용균액에 의한 경구 면역화는 마우스에서의 에이치. 펠리스 감염에 대한 보호를 유도한다는 것을 보고한 바 있다[문헌 21 및 22 참고]. 그러나, 이러한 보호를 유발시키는 항원(들ㅇ)의 정확한 성질은 측정되지 않았으며, 이 병원체에 대한 보호를 유발시키는 에이치. 펠리스의 보호 항원(들)은 다른 헬리코박터종가지도 교차 반응 보호를 유도한다는 것을 제안한 바도 없다.
본 발명자들은 에이치. 필로리 및 에이치. 펠리스 음파 처리에 대해 최초로 증명하였으며, 에이치. 필로리에 대한 항체의 몇몇은 에이치. 펠리스와 교차 반응하고 또한 그 반대로 반응한다는 것을 보여주었다[문헌 24 및 25 참고]. 이러한 교차 반응성에 대한 근거는 알려지지 않았다.
다른 알려진 우레아제 아미노산 서열 사이에 존재하는 상동성에 기초하여 우레아제가 에이치. 필로리에 대한 백신으로서 사용될 수 있다는 것을 제안하였다[문헌 26 참고]. 그럼에도 불구하고, 교차 반응성은 규칙적이지 않다. 구오 및 리우(Guo and Liu)는 수년전에 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri)의 우레아제는 서로 교차 반응성을 나타내는 반면, 작두콩(jack bean) 및 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii)의 우레아제는 상기한 세가지 우레아제와 면역학적으로 상이하다는 것을 발표하였다. 에이치. 필로리 우레아제와 다른 헬리코박터 우레아제의 항원성 교차 반응성이 타당성이 있는 것으로 가정했다 하더라도, 본 발명자들이 몇몇 에이치. 펠리스 모노클로날 항체가 에이치. 필로리 우레아제와 교차 반응한다는 것을 증명할 때까지 이 경우를 실질적으로 입증하는 데이타가 없었다[문헌 25 참고]. 팝포(J. Pappo)는 또한 에이치. 펠리스에 의해 감염되었던 마우스가 작두콩 우레아제가 아니라 에이치. 필로리 우레아제와 교차 반응하는 항체를 생산한다는 것을 증명하였다[J. Pappo, 미공개 데이타, 1993].
에이치. 필로리 감염에 대한 백신으로서의 에이치. 필로리 우레아제, 또는 관련 우레아제의 사용은 라빈(A. Labigne)에 의해 유럽 특허 공개 제367,644호에 이미 제안되었다[문헌 28 참고]. 그러나, 이 출원은 어떠한 헬리코박터 감염에 대해 우레아제를 사용하여 임의의 포유 동물을 백신 접종한 증거를 갖고 있지 않다.
더우기, 다른 세균 우레아제와 상동성인 서열이 에이치. 필로리 감염에 대한 백신으로서의 우레아제의 사용을 지지할 수는 있지만, 인간의 에이치. 필로리 감염에 대한 현재의 정보는 없다. 첫째, 감염된 개체가 종종 우레아제에 대한 강한 항체 반응을 하게 한다는 사실에도 불구하고, 항우레아제 면역 반은은 감염을 허용하거나 또는 제어하지 않는다. 두번째로, 에이치. 필로리는 세포 밖으로 우레아제를 수송하고 그의 표면으로부터 그것을 방출시킬 수 있다[문헌 19 및 20 참고]. 따라서 , 우레아제는 보호 점막 면역 반응의 발생에 대한 적절한 타겟을 나타낼 수 없다. 사실상, 점막 면역 보호는 주로 분비 IgA에 의해 매개된다고 생각되며, 그 응집 활성은 인지된 항원이 타겟 병원체에 의해 방출될 수 있을 때 약화되므로 보호 항체에 대한 유인체로서 작용한다. 세번째로, 우레아제는 배양물 중의 상피 세포에 대해 독성이 있는 것으로 나타나며 생체내 점막 분해 및 소화성 궤양에서의 역활에 지장을 받았다. 따라서, 항원으로서의 그의 사용은 독성이 될 수 있다.
그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 이러한 항원이 다음과 같은 경우라면 잠재적으로 효과적인 백신이 될 수 있다고 추론하였다.
-첫째, 자연 발생 면역 반응보다 더 강력한 면역 반응을 유발시키기에 충분한 고투여량으로 경구 투여하는 경우,
-둘째, 형성된 항체의 양이 방출되거나 또는 방출되지 않은 모든 우레아제와 결합하기에 충분한 경우,
-셋째, 비독성인 우레아제의 소단위 또는 분자종을 사용하는 경우,
개략적으로 보면, 인간의 에이치. 필로리 유도된 위 감염의 효과적인 치료 및 예방법이 요구되고 있다. 최근의 데이타는 이 감염에 대한 백신의 생상 가능성을 제안하였지만, 안전하고 효과적인 백신으로 혼입될 수 있는 에이치. 필로리의 모든 균주에 대해 공통적인 분명한 항원(들)의 명확한 동정법을 제공하지 않았다.
본 발명에서, 백신으로서 에이치. 필로리의 우레아제 항원을 동정하였으며 동물 모델에서의 그의 효능을 증명하였다. 이러한 결과는 펠리코박터 감염의 자연적인 역사에 비추어 예측하지 못한 것이었다.
[발명의 요약]
본 발명자는 헬리코박터의 표면 위 또는 주위에 위치한 우레아제 에피토프를 이용하고 백신 타겟으로서 그것들을 사용함으로써 위장 헤리코박터 감염에 민감성인 포유 동물에서 면역성이 유도될 수 있다는 것을 발견하였다. 면역성은 자연 우레아제로 면역화시킴으로써 유도될 수 있지만, 또한 효소적으로 불활성인 것으로 생산되어 비독성 형태가 된 제조합 우레아제 소단위로 유도될 수도 있다. 본 발명은 포유 동물의 점막 표면에 폴리아미노산 제제, 즉 적절한 보조제와 함께 사용되는 펩타이드 및(또는) 단백질의 혼합물을 투여함으로써 헬리코박터 감염에 대한 면역성을 유발시키는 방법을 제공한다. 이러한 폴리아미노산 제제는 헬리코박터 감염에 대해 내인성인 우레아제 효소에 의해 발휘되는 많은 에피토프 특성을 갖는다. 폴리아미노산 제제는 경구 투여될 수 있다.
이 제제의 활성 성분은 자연 도는 생합성 에피토프로 이루어질 수 있으며 다양한 형태를 취할 수 있다. 가능한 제제의 비제한적 에로는 정제되고, 자연 발생된 또는 재조합적으로 생성된 세균 또는 다른 근원의 우레아제 제제, 우레아제의 소화물, 우레아제 에피토프로 이루어진 융합 단백질, 우레아제 효소의 절단 형태, 또는 우레아제 아미노산 서열과 상동성인 펩타이드를 들 수가 있다. 면역성 발생은 헬리코박터 감염 생물에 결합하는 체액 및(또는) 세포 면역 반응의 유도에 좌우되기 때문에, 바람직한 제제는 감염 생물에 대해 내인성인 우레아제의 에피토프와 가장 밀접하게 중복되는 것이다. 예를 들면, 에이치. 필로리의 우레아제의 에피토프를 나타내는 제제는 에이치. 필로리에 민감성인 인간에게 투여하기에 바람직하다. 그러나, 본 발명의 중요한 국면에 따라서, 다른 종으로부터 얻은 우레아제도 사용될 수 있음을 발견하였다. 예를 들면, 본 발명자는 마우스에서의 에이치. 필로리 감염이 에이치. 필로리로부터 얻은 우레아제를 투여함으로써 방지될 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명의 한 국면에 따라서, 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 면역학적 유효량의 우레아제 항원, 바람직하게는 에이치. 필로리 우레아제 또는 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위가 숙주의 점막 표면에 투여되는 것으로 이루어지는, 포유류 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 국면에 따라서, 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제 중에 포함되어 있으며, 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 유효량의 우레아제 항원, 바람직하게는 에이치. 필로리 우레아제 또는 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위로 이루어진, 헬리코박터 감염의 예방에 적합한 백신 조성물이 제공된다.
본 발명의 또다른 국면에 따라서, 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 우레아제, 바람직하게는 에이치. 필로리 우레아제 또는 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위로 면역화된 숙주에세 생산되는 면역학적 유효량의 우레아제 특이적 항체를 숙주의 점막 표면에 투여하는 것으로 이루어지는, 헬리코박터 감염에 대한 수동적인 보호능을 포유류 숙주에 부여하는 방법이 제공된다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 더욱 상세히 설명될 것이다. 제1도 내지 6도는 표1 내지 6에 기재된 결과를 나타낸 그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명자들에 의해서, 에이치. 필로리 우레아제의 에피토프가 존재하는 폴리아미노산 제제를 마우스에 경구 투여함으로써 헬리코박터 감염에 대한 면역 반응 연구에서 일반적으로 승인된 동물 모델인 마우스에서 에이치. 펠리스에 대하여 보호 면역 반응이 유발된다는 것이 밝혀졌다[문헌 9 참조]. 보호 면역 반응의 효과는 면역화된 동물이 병원체에 의해 공격받을 때 비면역화된 동물에 비햐여 감염유발이 훨씬 감소된다는 것이다. 또한, 본 발명자들은 효소적으로 불활성인 재조합 단백질로서 생산된 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위를 사용하여 마우스를 경구 면역화시킬 때, 감염되는 비면역화 동물에 비해 감염 유발이 훨씬 감소된다는 것이다.
따라서, 그 첫번째 국면으로서 본 발명은 포유 동물 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 인간을 포함한 포유류의 점막 표면에 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 면역학적 유효량의 우레아제 항원, 바람직하게는 에이치. 필로리 우레아제를 투여하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 범주에는 또한 인간을 포함한 포유류의 헬리코박터 감염에 대한 치료 또는 예방법이 포함되며, 이는 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 면역학적 유효량의 우레아제 또는 그의 소단위를 환자의 점막 표면에 투여하는 것으로 이루어진다. 우레아제는 바람직하게는 에이치. 필로리 우레아제 또는 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위이며, 이는 단독으로 또는, 예를 들어 담체 입자로서의 히드록시아파타이트와 같은 히드록실화 칼슘 포스페이트에 결합되어 투여될 수 있다. 또한, 에이치. 필로리 우레아제는 점막 보조제, 콜레라 독소의 B 소단위, 뮤라밀 디펩타이드 또는 기타 보조제와 함께 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 우레아제 항원 또는 그의 B 소단위를 점막 표면에 투여하는 것이 통상의 점막 면역제 및 아마도 위장 점막의 국소적 면역제를 자극하여 위장 분비물 중 헬리코박터 감염을 예방하는 에이치. 필로리 특이적 IgA 항체의 출현을 포함한 면역 반응이 일어난다고 믿고 있다. 인간에게 사용하기 위한 새로운 백신의 예비 임상 실험을 동물 모델에서 수행하는 것은 일상적인 일이므로, 본 발명의 방법은 인간에서, 특히 위궤양, 위염, 위암 및 에이치. 필로리 및(또는) 에이치. 헤일마니의 존재에 기인하여 발생되는 기타 증상의 예방 및 치료에 유효하다고 믿어진다.
A- 세균 배양 및 우레아제 정제
본 연구에 사용되는 에이치. 필로리 균주는 십이지장 궤양이 있는 환자로부터 유래된 것으로서, 등질성을 나타낼 때까지 BHI 아가로오스 플레이트상에서 아 배양시킨 것이다. 에이치. 필로리는 적절한 배지, 전형적으로는 0.25%의 효모 추출물 및 10%의 태 송아지 혈청을 함유하며 0.4% 캄필로박터(Campylobacter) 선택적 보조제(Skirrow supplement, Oxoid 69)로 보충된 BHI(Brain-Heart Infusion; 뇌-심장 침출액) 배치에서 배양시킨다. 세균을 병 중에서 37℃에서 2 내지 3일동안 진탕시켜 액체 배양물을 생성시킨다. 배양물은 또한 0.25%의 효모 추출물 및 5%의 양 혈액을 함유하는 BHI로 구성된 아가로오스 플레이트 중 미호기성 조건하에 37℃에서 3일 동안 배양시켜 제조할 수도 있다. 세균의 양은 660㎚에서 BHI 용액의 광학 밀도를 측정하여 계산하며, 1 광학 밀도 단위는 108개의 세균에 상응한다. 아가로오스 플레이상의 배양물을 우선 154 mM NaCl에 재현탁시킨다.
우레아제 에피토프를 나타내는 폴리아미노산의 바람직한 공급원은 정제된 우레아제, 예를 들어 문헌[Dunn et al., J. Biol. Chem. 265, 9464-9469]에 기재된 일반적 방법에 따라 수득하고 하기와 같이 변형시킨 에이치. 필로리 우레아제이다. 배양 후 에이치. 필로리를 물 중에 수확하고 와동 회전시키고 다시 원신 분리하여 상동액을 수득한다. 에이치. 필로리 우레아제 활성(속성 우레아제 시험에 의해 검정, 하기 참조)을 함유하는 용액을 CL-6B 사이징 컬럼상에서 크로마토그래피하고, 강한 우레아제 활성을 나타내는 분획들을 모은 다음, 밤새 투석하고 음이온 교환 겔 상에서 다시 크로마토그래피한다. 분획들을 증가되는 농도의 NaCl 완충액으로 용출시키고, 강한 우레아제 활성을 갖는 분획들을 수집하여 개별적으로 SDS 겔 크로마토그래피를 수행한 다음 쿠마시(Coomassie) 염색한다. 분자량 약 63 및 약 29kDa에 해당하는 두가지의 뚜렷한 밴드는 우레아제로 판명된다. 우레아제를 함유하는 분획들을 모아서 순도가 95 내지 99%에 이르는 정제된 에이치. 필로리 우레아제를 수득한다.
B-에이치. 필로리로부터 정제된 우레아제를 사용한 경구 면역화
항원성 물질로서 상술한 바와 같이 수득된 정제 에이치. 필로리 우레아제를 사용하는 것이 바람직할 것이나, 자연에 존재하거나 재조합 DNA 기술에 의해 수득된 우레아제 또는 우레아제의 소단위, 및 이들의 분해된 단편, 이러한 단편 또는 전체 우레아제를 포함하는 융합 단백질, 말단 절단된 우레아제 구조물, 또는 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 우레아제 에피토프가 존재하는 기타 펩타이드 또는 단백질 제제(하기 참조)는 또한 항원성 물질로서 사용될 수 있음을 이해하여야 할 것이다. 따라서, 에이치. 필로리 우레아제에 관련하여 실질적 상동성을 가지며 헬리코박터에 대한 교차-보호 면역 반응을 일으키는데 효과적인 우레아제를 사용할 수 있다. 이러한 우레아제의 예는 에이치. 필로리 우레아제와 약 70%의 상동성을 갖는 작두콩 우레아제이다. 본 발명은 따라서 완전한 우레아제로 한정되는 것은 아니며, 우레아제 에피토프를 나타내며 숙주내에서 헬리코박터 감염에 대해 보호 면역 반응을 유발시키는데 효과적인 어떠한 폴리아미노산 제제를 사용하여도 무방하다. 전형적으로, 에이치. 필로리 우레아제에 관련하여 70 내지 95%의 상동성, 예를 들어 80 내지 90%의 상동성을 갖는 우레아제를 본 발명의 우레아제 항원으로 사용할 수 있다.
잠재적으로 유용한 우레아제 제제 공급원의 비제한적 예네는 다른 헬리코박터종의 내인성 우레아제 효소, 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 또는 프로테우스 미라빌리스와 같은 다른 세균으로부터의 우레아제, 및 마친가지로 에이치. 필로리 우레아제와 교차 반응성 에피토프를 갖는 기타 우레아제가 포함된다. 상기 언급한 모든 생물의 우레아제 유전자는 완전한 단백질 또는 그의 부분으로서 재조합 우레아제 생성물을 발현시키는 유용한 도구이다.
잠재적으로 유용한 우레아제 제제의 비제한적 예에는 정제된 우레아제(공급원은 상기한 바와 같다)로부터 물리적 및(또는) 화학적 분해 과정(즉, CnBr), 및(또는) 단백질 분해(예를 들어, V8-프로테아제, 트립신 등의 프로테아제를 사용)에 의해 생성된 펩타이드, 또는 화학적으로 합성되었으며 우레아제와 일치하는 에피토프를 갖는 펩타이드가 포함된다.
잠재적으로 유용한 에피토프의 기타 공급원에는 항-우레아제 항체를 사용한 스크리닝 결과 우레아제와 교차 반응성을 갖는 것으로 확인된 에피토프가 포함된다. 이러한 펩타이드는 천연 펩타이드 또는 화학 합성 펩타이드일 수 있다. 또한, 이러한 펩타이드는 재조합 랜덤 올리고뉴클레오타이드를 발현시켜 수득할 수 있다.
잠재적으로 유용한 에피토프의 또 다른 공급원에는 우레아제에 대한 항-인자형 항체를 생성시킴으로써 확인될 수 있는 우레아제와 유사한 에피토프가 포함된다. 어떠한 면역 적격 숙주에서나 생산되는 이러한 항-인자형 항체는 우레아제와 구조적 상동성을 갖는, 항-우레아제 항체에 대한 항체를 유발시킬 목적으로 이러한 수주를 항-우레아제 항체로 숙주를 면역화시켜 수득한다.
본 명세세의 설명은 에이치. 필로리에 의해 자연적으로 생산되는 우레아제(B항)를 사용하는 것에 촛점을 맞추고 있다. 그러나, 목적하는 보호 면역 반응을 일으킬 수 있는 상기 언급한 우레아제, 그의 소단위 또는 구조물이 본 분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있음을 이해하여야 한다. 특정 제제의 효능은 동물 모델을 이용한 통상의 투여 방법으로서 시험 백신을 경구 투여하고 후술하는 과정과 실질적으로 유사 또는 동일한 프로토콜을 사용하여 병원체로 공격시킴으로써 측정될 수 있다.
하기 표 1 및, 2, 제1 내지 5도는 마우스를 정제된 에이치. 필로리 우레아제로 경구 면역화시켰을 때 수득된 결과를 나타낸 것이다. 첫번째 실험에서, 상기 A항에 기술된 바와 같이 젱제되고 M 세포 결합 및 흡수를 증진시키는 담체로 사용되는 히드록시아파타이트 결정에 커플링된 에이치. 필로리 우레아제를 마우스에 경구 투여하여 에이치. 필로리 항원을 투여하였다. 콜레라 독소(Sigma사 제조)를 점막 보조제로 사용하였다. 이 실험에서, 생후 6주된 SPF BALB/c 암컷 마우스의 군들을 제0, 7, 14 및 21일에 1㎎의 히드록시아파타이트에 커플링된 30㎍의 정제 에이치. 필로리 우레아제 및 10㎍의 콜레라 독소 보조제로 각각 경구 면역화시켰다. 마우스를 제28 및 30일에 108에이치. 필로리로 2회 공격하였다. 비교를 위해, 유사한 생후 6주된 SPF BALB/c 암컷 마우스를 제0, 7, 14 및 21일에 전세포 에이치. 필로리 용균액(음파 처리물)과 10㎍의 콜레라 독소를 사용하여 경구 면역화시켰다. 마우스들을 제28 및 30일에 에이치. 필로리로 공격하였다. 에이치. 필로리 음파 처리물은 세포 배양물로부터 에이치. 필로리를 수거하고 원심 분리하여 펠렛화시킨 다음, 펠렛을 0.9% 염화나트륨 용액에 재현탁시키고 음파 처리함으로써 제조하였다.
대조군으로서, 생후 6주된 SPF BALB/c 암컷 마우스를 제0, 7, 14 및 21일에 10㎍의 콜레라 독소 및 1㎎의 히드록시아파타이트로 경구적으로 허위 면역화시켰다. 모든 마우스를 우리에 가두고, 동등하게 면역화 및 공격하였다. 본 연구에 사용된 모든 마우스는 제35일에 죽였다.
C-에이치. 필로리 재조합 우레아제 소단위를 사용한 경구 면역화
에이치. 필로리 우레아제의 구조 A 및 B 소단위를 코딩하는 유전자는 이미 공개된 서열에 기초하여 표준 방법에 따라 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 클로닝에 의해 수득하였다[문헌 29 참조]. 이러한 유전자를 이, 콜라이 중 외래 유전자가 고도로 발현되고 용이하게 정제될 수 있도록 설계된 벡커(pEV 40)내로 삽입시켰다. 간략히 설명하면, 6개의 히스티딘을 반복적으로 코딩하는 서열의 프레임내 고온-억제성 프로모터의 하류에 외래 유전자를 삽입시켰다. 이 벡터 상에는 형질 전환체의 선별을 위해 ampR 유전자가 존재한다. 적절한 온도 조건하에, 수득된 재조합 단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘으로 보충되는데. 이는 닉켈 칼럼상에서의 1 단계 친화 정제를 가능케한다. 에이치. 필로리 재조합 우레아제 A 및 B 소단위는 이. 콜라이 중에서 개별적으로 발현되었으며 닉켈 칼럼상에서 순도 95%로 정제되었다.
상술한 바와 같이 수득된 재조합 에이치. 필로리 우레아제를 항원성 물질로 사용하는 것이 바람직한 반면, 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있으며 우레아제의 항원성 부위를 발현시키는, 재조합 기술에 의해 수득된 어떠한 우레아제 또는 우레아제 소단위(예를 들어, 융합 단백질)을 항원성 물질로 사용하여도 무방함을 이해하여야 한다. 따라서, 에이치. 필로리 우레아제와 실질적인 상동성을 가지며 헬리코박터에 대한 교차 보호 면역 반응을 일으키는데 효과적인 우레아제 유전자를 구조물로 사용할 수 있다. 이러한 우레아제의 예로는 에이치. 필로리 우레아제와의 상동성이 약70%인 작두콩 우레아제, 또는 에이치. 필로리 우레아제와의 상동성이 약 88%인 에이치. 필로리 우레아제가 있다. 따라서 본 발명은 에이치. 필로리 우레아제 유전자 및 그의 유전자 생성물의 사용에 국한되는 것이 아니라, 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 일으키는데 효과적인 어떠한 재조합 우레아제 또는 그의 소단위의 사용을 허용한다. 전형적으로는, 에이치. 필로리 우레아제에 관련한 상동성아 70 내지 95%, 예를 들어 80 내지 90%인 재조합 우레아제를 본 발명의 재조합 우레아제 항원으로 사용할 수 있다.
본 명세서의 촛점은 이. 콜라이에 의해 생산된 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 및 B 소단위(상기 C항 참조)의 사용에 맞추어져 있다. 그러나, 목적하는 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는, 상기한 재조합 우레아제, 그의 소단위 또는 구조물은 본 기술 분야에 공지된 다른 재조합 DNA 기술 및 원핵 및 진핵 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있음을 이해하여야 한다.
하기 표 3 내지 5 및 제6도는 이. 콜라이에 의해 생산된 재조합 에이치. 필로리 우레아제 소단위로 마우스를 경구 면역화시켰을 때 수득된 결과를 나타낸 것이다. 이 실험에서, 이. 콜라이에 의해 생산되고 전술한 바와 같이 정제되었으며, M 세포 결합 및 흡수를 증진시키는 담체로 사용되는 히드록시아파타이트 결정에 커플링된 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 또는 B 소단위를 마우스에 경구 투여하여 에이치. 필로리 항원의 투여를 수행하였다. 콜레라 독소(Sigma사 제조)를 점막 보조제로 사용하였다. 이 실험에서, 생후 6주된 SPF BALB/c 암컷 마우스의 군들을 제0, 8, 14 및 21일에 1㎎의 히드록시아파타이트에 커플링된 30㎍의 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 및 B 소단위 및 10㎍의 콜레라 독소 보조제롤 각각 경구 면역화시켰다. 마우스를 제32, 34 및 36일에 108의 에이치. 펠리스로 2회 공격하였다. 비교를 위해, 유사한 생후 6주된 SPF BALB/c 암컷 마우스를 제0, 8, 14 및 21일에 히드록시아파타이트에 커플링된 30㎍의 재조합 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위 및 10㎍의 콜레라 독소를 사용하여 경구 면역화시켰다. 마우스들을 제32, 34 및 36일에 에이치. 펠리스로 3회 공격하였다. 대조군으로서, 생후 6주된 SPF BALB/c 암컷 마우스를 제0, 8, 14 및 21일에 10㎍의 콜레라 독소 및 1㎎의 히드록시아파타이트로 경구적으로 허위 면역화시켰다. 마우스를 제32, 34 및 36일에 에이치. 펠리스로 공격하였다. 본 연구에 사용된 모든 마우스는 동등하게 면역화 및 공격하였다. 동물들을 제48일(공격후 12일) 또는 공격후 10주 되는 날에 죽였다.
D. 위장 피검 조직, 혈액 및 장내 분비물의 분석
위장으로부터 피검 조직을 취하고, 심장으로부터 혈액을 수득하였다. 장을 제거하고 ELISA 분석을 위한 장내 분미물을 수득하기 위해 PBS 완충액 중 1 mM PMSF(Boeringer사 제조)로 세척하였따.
에이치. 펠리스 콜로니화에 대한 보호를 평가하기 위해 각 동물로부터의 위장 피검 조직을 공급자의 지시에 따라 야트록스(Jatrox) HP 시험(Rohm Pharma)에 의해 우레아제 활성을 신속히 측정함으로써 에이치. 펠리스의 존재에 대해 선별하였다. 간단히 설명하면, 위장 피검 조직을 우레아 및 pH 지시약으로서의 페놀레드로 이루어진 0.5㎖의 혼합물에 침지시킨다. 우레아제 활성은 요소로부터 암모니아 및 중탄삼염을 발생시키며, 용액은 550㎚에서 보다 높은 흡수도를 갖는 쪽으로 색 변화를 일으킨다. 우레아제 활성은 분광측광법으로 정량화하였다.
상기 B항에 기술된 실험에 포함된 각 동물의 위장 피검 조직을 에이치. 펠리스의 검출을 위해 상기와 같이 보충된 BHI 아가로오스 플레이트 상에서 배양시켰다. 미호기성 조건하에 3 내지 10일 동안 배양시킨 후, 그램 염색 및 우레아제 활성의 측정으로 에이치. 펠리스의 존재를 확인하였다. 첫번째의 일련의 실험들에서 에이치. 펠리스 배양물의 검출에 관한 매우 높은 상관성이 나타났으므로(표 3 참조), C항에 기술된 실험에서 에이치. 펠리스의 검출을 위해서 위장 피검 조직 우레아제 시험만을 수행하였다. 에이치. 펠리스의 검출은 두 가지 상이한 염색시약(아크리딘 오렌지 및 크레실 바이올렛)을 사용한 서로 무관한 두명의 검사자에 의한 현미경 검사에 의해 확인하였다.
혈액 시료를 응고되도록 상온에서 3시간 동안 방치하고, 혈청을 수확하여 분석시까지 -20℃에서 동결시켜 보관하였다. 장내 분비물을 4℃에서 5분간 원심 분리하여 파편을 제거하고, -20℃에서 동결시켜 보관하였다. 각 동물의 혈청 및 장내 분비물 시료를 항-헬리코박터 활성을 측정하기 위해 표준 방법에 따라 ELISA법으로 분석하였다. 간략히 설명하면, 96-웰 플레이트를 에이치. 필로리의 음파 처리물로 코팅한 다음, 5% 탈지유로 포화시켰다. 시료를 1:1에서 1:1000으로 연속 희석시키고 ELISA 플레이트상에서 4℃로 밤새 배양시켰다. 항체 수준의 측정을 위해서, 비오틴화 항-마우스 IgA(혈청) 및 항-마우스 IgA, 이어서 스트렙타비딘-호스래디쉬(Streptavidin-Horseradish) 퍼옥시다아제를 사용하였다.
정제된 에이치. 필로리 우레아제로 면역화시킨 후, 에이치. 펠리스로 공격한 결과는 표 1 내지 3 및 제1도 내지 4도에 나타내었으며, 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 및 B 소단위로 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격한 결과는 표 4 내지 6 및 제5 및 6도에 나타내었다.
[표 1]
[표 1b]
상기 B항에 기술된 실험의 결과를 나타낸 표 1 에서, "h"는 시간을, "Ig"는 면역글로볼린을, "ND"는 측정되진 않았음을, "우레아제+HF"는 마우스를 우레아제(히드록시아파타이트에 커플링된 상태, 콜레라 독소도 함께 투여됨)로 면역화시킨 다음 에이치. 펠리스로 공격하였음을, "우레아제"는 마우스를 우레아제(히드록시아파타이트에 커플링된 상태, 콜레라 독소도 함께 투여됨)로 면역화시키고 공격은 하지 않았음을, "CF+HF"는 마우스를 콜레라 독소로 호위 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격하였음을, "HP 음파 처리물+HF"는 마우스를 에이치. 필로리 음파 처리물과 콜레라 독소로 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격하였음을, 그리고 "HP 음파 처리물"은 마우스를 에이치. 필로리 음파 처리물과 콜레라 독소로 면역화시키고 공격하지는 않았음을 의미한다. 표 1에서 항체 결과에 대한 수치는 595㎚에서의 흡광도에 1000을 곱한 것이다. 항체 부재시에 측정된 블랭크의 값을 삭감하였다.
위장 피검 조직 우레아제 시험 및 에이치. 펠리스 배양물의 그램 염색에 의해 수득된, B항에 기술된 실험의 결과는 표 2에 나타내었다. 감염을 우레아제 시험 또는 배양물의 그램 염색을 포함하여, 에이치. 펠리스에 의한 하나 이상의 콜로니화 표지를 갖는 마우스로 정의되었다.
[표 2]
표 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, 에이치. 필로리 음파 처리물 또는 콜레라 독소를 사용하여 면역화시킨 경우와 비교할 때 에이치. 필로리 우레아제를 사용하여 경구 면역화시킨 경우가 에이치. 펠리스 공격에 대해 통계학적으로 의미있는 보효율을 나타낸다. 표 2를 보면, 에이치. 필로리 음파 처리물로 면역화시킨 동물 중 6마리 및 콜레라 독소로 면역화시킨 동물 중 9마리에 비햐여, 에이치. 필로리 우레아제로 면역화시킨 총 10마리의 동물 중 단 3마리만이 감염되었음을 알 수 있다. 에이치. 필로리 음파 처리물로 면역화되고 에이치. 펠리스에 의해 공격받은 동물에 있어서의 33%, 및 콜레라 독소로 면역화되고 에이치. 펠리스에 의해 공격받은 동물에 있어서의 10%만이 보호되었음에 비하여, 에이치.필로리 우레아제로 면역화시킨 동물에 있어서는 70%가 에이치. 펠리스의 공격으로부터 보호되었다. 다시 말해서, 에이치. 펠리스에 노출된 대조 마우스의 90%가 병원체에 의해 감염되었음에 반해, 이와는 대조적으로 에이치. 펠리스에 노출되기 28일 전에 에이치. 필로리 우레아제로 면역화된 마우스에 있어서는 감염율이 단지 30%에 자나지 않았다. 이는 감염율에 있어서의 상당한 감소를 의미한다(대조 마우스와 비교하여, 피셔 정밀 시험에서 p=0.0198). 마우스를 에이치. 필로리 음파 처리물로 경구 면역화시킨 경우, 감염율은 67%였다(이는 대조군에 비햐여 상당한 수치가 아님). 에이치. 필로리 우레아제를 사용하여 수득한 보호율은 예상치 못한 것이었으며, 에이치. 필로리 음파 처리물을 사용하여 얻은 결과에 기초하여 예견될 수 없었던 것이다.
제1도 내지 4도에 있어서, 제1도는 우레아제로 면역화된 후, 보호되지 않은 마우스에 있어서, 혈청 및 장내 분비물 중의 항체(각각 IgG 및 IgA)에 대한 시험 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이들은 표 1의 제1, 4 및 6번 마우스들로서, A군을 구성한다. 제2도는 우레아제로 면역화된 후 보호된 마우스, 즉 2, 3, 5 및 7 내지 10번 마우스(B군)의 항체 반응을 나타낸 것이다.
제3도 및 제4도는 31 내지 39번 마우스에서 얻은 결과에 관한 것이다. 제3도는 에이치. 필로리 음파 처리물로 면역화된 후 보호되지 않은 마우스(마우스 번호 31, 32, 33, 35, 36 및 38; C군)의 항체 반응을 도시한 것이며, 제4도는 에이치. 필로리 음파처리물로 면역화된 후 보호된 마우스(마우스 번호 34, 37 및 39; D군)의 항체 반응을 도시한 것이다. 제3도 및 4도와 관련하여 (IgG가 아닌) IgA 항체 반응이 보호되지 않은 마우스에 있어서 보다 보호된 마우스에서 다 높은 것은 흥미있는 것으로서, 이는 보호와 IgA 반응의 상관성을 암시하고 있다. 형철 IgG 반응은 상관성을 보이지 않고 있다. 혈청 IgG 항체가 아닌 점막 IgA 항체가 소화관의 세균 감염증에 대한 보호에 있어서 역할을 하는 것으로 알려져 있다[문헌 3 참고].
위장 피검 조직 중 에이치. 펠리스의 검출에 관한 우레아제 시험 및 배양 확인 사이의 상관성은 표 3에 나타내었다.
[표 3]
표 3은 위장 피검물상에 수행된 우레아제 시험 결과와 에이치. 펠리스의 배양 확인 사이에 매우 밀접한 상관성이 있음을 보여주는 것으로, 우레아제 시험은 감도가 더 좋기 때문에 하기 실험에서 마우스의 에이치. 펠리스 감염을 진단하는데 바람직하였다. 이러한 접근 방식은 각 마우스의 보다 위장의 큰 피검물에 대해 우레아제 시험을 수행하는 것을 가능케 했으며, 우레아제 시험은 감도가 어욱 증가되었다. 더우기. 고감도의 방법을 사용함으로써 시험될 백신 제제에 의해 얻어지는 보호율을 과도 평가하는 것을 방지할 수 있다. 양성 배양물을 감염의 표준으로 사용할 때, B항에 기술된 실험 도중 우레아제 면역화 후에 유도된 보호는 우레아제 시험과 배양 시험을 동시에 사용한 경우에서와 같이 유의적이다(p=0.021 대 p=0.019).
위장 피검물에 우레아제 시험에 기초하여 얻은, C항에 기술된 실험(재조합 우레아제 소단위)의 결과를 표 4, 5 및 6에 나타내었으며 제6도에 도시하였다.
[표 4]
[표 5]
[표 6]
표 4에서, "CT"는 콜레라 독소를 의마하고, "UreA"는 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 소단위를 의미하고, "UreB"는 재조합 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위를 의미하고, "HAP"는 히드록시아파타이트 결정을 의미한다. 마우스 20ㅂㄴ 내지 54번을 공격 후 제12일 후에 죽이고, 마우스 68번 내지 82번은 공격 후 제10주(106일)에 죽였다. 각 동물의 위의 생체 조직 검사로 수행된 우레아제 시험 결과를 550㎚에서의 OD 값으로 표시하였다. 에이치. 펠리스의 검출을 위한 우레아제 시험의 양성 반응 또는 음성 반응에 따른 (+) 및 (-) 부호는 각 동물의 최종 감염 상태를 나타낸다. 양성 : OD 550값＞0.2.
상기 표4, 5 및 6에 나타낸 결과로부터, 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 소단위 또는 콜레라 독소를 사용하여 얻은 결과와 비교하여 재조합 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위를 사용하는 경구 면역화의 경구, 에이치. 펠리스 공겨에 대해 통계학적으로 유의 수준의 보호를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 표 4에 있어서, 공격 후 12일에 우레아제의 에이치. 필로리 A 소단위로 면역된 10마리 모두 및 콜레라 독소로 면역된 동물 10마리 모두가 감염된 것에 비하여 우레아제 A 소단위로 면역된 후 에이치. 펠리스 공격을 받은 동물의 0%가 보호되고, 콜레라 독소로 면역된 후 에이치. 펠리스 공격을 받은 동물의 0%가 보호된 것에 비햐여, 우레아제 B 소단위로 면역된 경우 에이치. 펠리스 공격으로부터 70%가 보호된다는 것을 나타낸다. 즉, 에이치. 펠리스로 공격받은 마우스 대조군의 100%가 감염된 것과는 대조적으로 재조합 에이치. 필로리우레아제 B 소단위로 면역된 마우스의 경우 감염율이 단지 30%였다. 이는 마우스 대조군에 비하여 현저한 감염 감소(p=0.0031, 피셔 정밀 시험)를 나타내는 것이다.
에이치. 필로리 우레아제로 관측된 보호가 전적으로 우레아제 B 소단위 면역화에 의해 제공된 결과이며, A 소단위는 상기의 효과가 없다는 사실은 정제 우레아제를 사용한 본 발명자들의 실험에 기초하여서는 예상할 수 없었다. 따라서, 보호성 면역 반응의 발달에 있어서, 우레아제의 두 구조 소단위의 역할에 대한 상기 설명은 신규한 것이다. 또한, 효소적으로 불활성인 재조합 우레아제 B 소단위를 사용하여 얻는 보호는 우레아제의 비독성 형태가 헬리코박터 감염에 대한 경구용 백신으로서 사용될 수 있음을 시사한다. 더우기 상기 결과는 활성 부위의 인지가 보호를 위해 요구되지 아니하며, 따라서 불활성 우레아제 B 소단위는 천연 우레아제의 촉매 부위를 인지하고 방해하는 항체를 유도하지 않을 가능성이 크다는 것을 강하게 암시한다.
표 6에 있어서, 마우스가 감염후 10주에 죽게 되는 경우, 우레아제 B 소단위로 면역된 동물의 60%(마우스 10마리 중 6마리) 및 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위로 면역된 동물의 80%(마우스 5마리 중 4마리)가 에이치. 펠리스 감염에 대해 보호되었다. 우레아제 B 소단위에 의한 면역화를 통해 얻어진 보호가 오랜시간에 걸쳐 지속되고, 우레아제 A에 의한 면역화가 우레아제 B 소단위에 의해 유도된 보호에 비하여 변화된 보호를 유도한다는 사실은 정제 우레아제를 사용한 본 발명자들에 의한 실험 또는 종래에 수행되었던 다른 실험으로부터 예측될 수 없었다. 우레아제 B 소단위 면역화가 결정적으로 보호에 기여한다는 사실은 활성 부위의 인지가 보호에 요구되지 아니함을 입중한다. 제6도는 재조합 우레아제 A 및 B 소단위에 의한 경구 면역화 후에 얻어진 결과를 요약한 것이다(표 5 및 6에 기재함).
또한, 본 발명은 헬리코박터 감염 예방에 적합한 백신 조성물을 제공한다.
조성물은 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 숙주에서 유발시킬 수 있는 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제 중에 포함된 유효량의 우레아제 항원, 바람직하게는 에이치. 필로리 우레아제 또는 재조합 에이치. 필로리 우레아제 소단위로 이루어진다.
본 발명의 백신은 당업자에 의해 용이하게 결정되는 양으로 투여한다. 즉, 성인의 경우 적합한 투여랑은 10㎍ 내지 100㎎ 바람지하게는 50㎍ 내지 50㎍이다, 유사 투여랑이 소아에게도 적용된다. 인체에서의 담체계는 위의 산성환경으로부터 항원을 보호하는 장내 방출 캡슐제 및 융합 단백질로서 불용성 형태의 우레아제 항원을 포함한다. 백신은 성인 또는 소아에서는 1차 예방제로서, 감염된 숙주에서는 에이치. 필로리의 성공적인 제거 후 2차 예방제로서, 또는 에이치. 필로리 제거의 기여에 민감한 숙주의 면역 반응을 유도할 목적의 치료제로서 투여할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 적합한 점막 보조제는 콜레라 독소이다. 이외에 뮤라밀 디펩타이드 또는 그의 유도체, 콜레라 독소의 B 소단위를 포함하는 콜레라 독소의 비독성 유도체, 및(또는) 우레아제 항원과 콜레라 독소 또는 그의 B 소단위와의 접합체 또는 유전 공학적 융합체가 사용될 수 있다. 기타 적합한 운반 방법으로는 생분해성 미소 캡슐 또는 면역 자극 복합체(ISCOM'S) 또는 리포좀, 바이러 또는 세균과 같은 유전 공학적으로 감쇄된 생 벡터 및 재조합(키메릴) 바이러스형 입자, 예를 들면 블루텅(bluetongue)을 들 수 있다. 사용되는 점막 보조제의 양은 사용되는 점막 보조제의 유형에 의존한다. 예를 들면, 점막 보조제가 콜레라 독소인 경우, 5㎍ 내지 50㎍, 바람직하게는 10㎍ 내지 35㎍의 양이 적합하다. 미소 캡슐형으로 사용되는 경우, 사용량은 목적 투여량을 달성하기 위해 미소 캡슐의 기질 내에 사용된 양에 의존한다. 상기 양의 결정은 당업자의 수준내에서 가능하다. 본 발명에 따른 백신에 대한 담체로서는 장용피 캡슐 및 폴리악티드-글리콜리드(polyactide-glycolide) 소구체가 적합하다. 희석제로는 0.2N NaHCO3및(또는) 식염수가 적합하다.
입자상 히드록실화 칼슘 포스페이트(HCP)는 점막 표면에 도포하기 위한 에이치. 필로리 우레아제용 담체로서 특히 유용하다. 에이치. 필로리 우레아제-히드록실화 칼슘 포스페이트 접합체는 폴리 Ig 면역 반응이 일어나는 상피 세포를 가포질러 이동되는 것으로 생각된다. 바람직하게는, 히드록실화 칼슘 포스페이트는, 특히 상피 세포를 가로질러 이동하도록 분화된 세포(M 세포)에 의해 상피 세포를 가로질러 이동하기에 적합한 미소 입자 형태이다. 히도록실화 칼슘 포스페이트의 바람직한 형태는 시판되는 결정성 히도록실화 칼슘 포스페이트 Ca10(PO4)6(OH)2인 히드록시아파타이트이다.
통상적으로, 시판되는 히드록시아파타이트는 정상 골조직 중에 있는 무기 히드록시아파타이트와 화학적 및 물리적으로 유사한 플레이트형 결정체로 이루어진다. 기본골에서 유래된 칼슘/인 영양 보조제의 존재에 의해 입증된 바와 같이 섭취될 수 있도록 고안된 히드록시아파타이트의 섭취는 안전하다. 시판용 고분해성 히드록시아파타이트(CalBioChecm사 제품)는 다양한 크기의 결정으로 이루어져 있다. 길이가 1㎛를 넘는 결정은 M 세포에 의해 흡수될 가능성이 없다. 따라서, 본 발명에 있어서, 시판용 히드록시아파타이트 결정을 예를 들면 음파 처리에 의한 것과 같이 작고, 비교적 균일한 결정성 단편으로 분쇄하여 사용한다. 바람직하게는 히드록시아파타이트의 상당한 부분이 약 0.01 내지 0.0㎛의 단편으로 존재한다. 단편화는 표준 방법을 사용하는 전자 현미경법 또는 광산란법에 의해 측정될 수 있다.
에이치. 필로리 우레아제 항원의 바람직한 투여 방식은 경구, 비강내, 직장내 또는 안구 투여이다. 경구 투여는 장 점막을 포함한 다른 G. I. 점막으로 전달시킬 수 있다.
본 발명의 백신은 에어로졸, 현탁제, 캠슐제 및(또는) 좌제 형태로 점막 표면에 투여될 수 있다. 투여 방법은 당업자에게는 명백할 것이다.
또한, 본 발명은 헬리코박터 감염에 대한 인간을 포함한 포유 동물의 수동적인 면역화에 관한 것이다. 이는 유효량의 우레아제 특이적 항체, 바람직하게는 유효량의 에이치. 필로리 우레아제 특이적 IgA 모토클로날 항체를 환자의 점막 표면에 투여함으로써 달성할 수 있다.
에이치. 필로리 우레아제는 보호 면역의 유도에 관련된 항원을 나타내므로, 본 발명의 또 다른 면은 우레아제 기재 백신이 투여된 인체의 면역 반응을 측정하거나 각 개인의 면역성 또는 민감성(즉, 백신 접종이 요구됨) 여부를 결정하기 위한 진단 시약으로서의 에이치. 필로리 우레아제 용도이다. 또한, 본 발명은 헬리코박터 면역성의 진단, 헬리코박터에 대한 민감성의 평가, 및 백신에 대한 면역 반응의 확인을 위한 검정 시험 및 키트를 구성하기 위한 우레아제 및 우레아제 특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
[실시예]
본 발명을 다음의 비제한적 실시얘를 참고로 다 상세히 기재한다.
a) 세균 균주
에이치. 펠리스는 포(J. Fo)에 의해 제공되었다[Division of Cooperative Medicine, Mass, Institute of Technology, Bston, USA 참조]. 궤양성 질환 환자로부터 에이치. 필로리를 단리하였다)CHUV, Lausanne, Switxerland)
b) 세균 배양
액체 배양-세균을 0.4%의 캄필로박터 선택 보체(Oxoid)로 보충된, 0.25% 효모 추출물(Difco) 및 10% 태 송아지 혈청을 함유하는 BHI(Branin-Heart Infusion, BioMerieux) 액체 배지상에서 배양하였다. 세균을 미호기성 조건하에 37℃에서 밤새 배양시킨 후 37℃에서 2 내지 3일 동안 진탕 배양시켰다.
아가로즈 평판 배양- 세균을 미호기성 조건하에 37℃에서 3일간 BHI, 0.25%의 효모 추출물 및 5%의 양의 혈액이 함유된 한천 평판상에서 배양시켰다.
정량화- 세균의 양을 660㎚에서 BHI 용액의 광학 농도(1 광학 농도 단위는 108세균에 대응함)에 의해 측정하였다.
c) 음파 처리물의 제조
에이치. 필로리를 0.15M NaCl 중의 31개의 혈액 한천 평판으로부터 수집하고, 40℃에서 1400g으로 5분간 회전시켰다. 펠렛을 NaCl 3㎖ 중에 재현탁시키고, 4분간 초음파 처리하였다. 단백질의 야을 브래트포드 분석(공급원의 지시에 따라 BioRad Kit)에 의해 평가하였다.
d) 히드록시아파타이트와 면역 항원의 커플링
면역 항원(우레아제 또는 그의 소단위)을 4℃에서 히드록시아파타이트와 함께 1시간 동안 배양시켰다. 히드록시아파타이트 1.0㎎을 마우스 한 마리당 30㎍의 면역 항원에 대해 사용하였다. 배양 말기에, 콜레라 독소 10㎍을 최종 용적 200㎕의 PBS 중에 첨가하였다.
[실시예 1]
a) 추출
30개의 혈액 한천 평판으로부터 에이치. 필로리를 얼음 위의 0315 M NaCl 주에 수확하였다. 용액을 4℃에서 1400g으로 5분간 회전시켰다. 펠렛을 H2O 20㎖ 중에서 재현탁시키고 45초간 (최대 속도로) 와동시켰다. 이어서, 추출물을 4℃에서 6700 g으로 20분간 회전시켰다. 상충액을 회수하고, 단백질 양을 평가(상기 "정량화" 참조)하고, 70%의 황산 암모늄으로 침전시켰다.
b) 우레아제의 정제
용액을 이동상으로서 PBS(인산염 완충 식염수)를 사용한 세파로즈 CL-6B 칼럼(Pharmacia) 상에서 크로마토그래피시켰다. 강한 우레아제 활성을 나타내는 22개의 수집 분획을 함께 합하고, 4㎖에서 PEB를 사용하여 Q 세파로즈 패스트 플로우(Q Sepharose fast flow; Pharmacia) 상에서 크로마토그래피시켰다. 이 분획들을 0 내지 500 nM NaCl 농도 구배로 용출시켰다. 강한 우레아제 활성을 갖는 10개의 수집 분획을 개별적으로 SDA 겔을 걸고, 쿠마시(Coomassie) 염색하였다. MW-63 및 MW-28 KDa에 대응하는 2개의 명확한 띠를 나타내는 6개의 분획을 합쳐서 정제 우레아제로서 간주하였다.
[실시예 2(B 항 참조)]
면역화 연구에 사용된 마우스를 위내 면역화에 앞서 에테르로 약하게 마취시켰다. 이어서, 음파 처리물 또는 정제 우레아제, 히드록시아파타이트 및 콜레라 독소를 PBS 중에 현탁시키고, 200㎕를 피하 주사기에 부착된 폴리에틸렌제 관을 사용하여 각각의 마우스의 위로 전달시켰다. 이 방법은 경구 면역화 방법으로서 인용될 것이다.
3개의 경구 면역화 프로토콜이 평가되었다. 이들을 이하에 기재한다.
프로토콜 B1-정제 우레아제를 사용한 백신 접종
생후 6주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제0일, 7일,14일 및 21일에 정제 에이치. 필로리 우레아제 30㎍ 및 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 10마리의 마우스를 제28일 및 30일에 액체 배양액으로부터 5×107및 108의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.
프로토콜 B2-헬리코박터의 음파 처리물을 사용한 백신 접종
생후 6주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제0일, 7일,14일 및 21일에 정제 에이치. 필로리 음파 처리물 2㎎의 용액을 사용하여 경구 면역화시켰다. 10마리의 마우스를 28일 및 30일에 5×107및 108의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.
프로토콜 B3-대조군
생후 6주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제0일, 7일,14일 및 21일에 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 마우스를 제 28일 및 30일에 5×107및 108의 에이치. 펠리스로 공격하였다.
제35일에 모든 마우스를 죽이고, 위, 소장 분비물 및 혈액으로부터 생검 시료를 취하였다.
보호 및 평가
보호를 평가하기 위해, 생검 조직을 예트록스 HP 검사(Jetrox HP test; Tohm Pharma)에 의해 공급원의 지시에 따라 우레아제 활성에 대해 탐색하였다. 우레아제를 550㎚에서의 분광학적 측정법으로 정량화하였다. 또한, 생검 조직을 에이치. 펠리스 존재하에 배양시키고, 그람 염색법으로 평가하였다. 위동 생검 조직을 균질화시키고, 0.15 M NaCl중에 희석(1:10 및 1:1,000)시키고, 혈액 한천 평판상에 압인 후, 미호기성 조건하에 37℃에서 4 내지 10일간 배양하였다.
엘리사(ELISA)법
소장 분비물 및 혈액을 항체 적정량을 평가하기 위해 ELISA법으로 분석하였다. ELISA법을 다음과 같이 수행하였다. 37℃에서 폴리스티렌 평판(96 웰)을 2시간 동안 웰 당 정제 우레아제 1㎍으로 도포하였다. 비특이적 결합 부위를 37℃에서 30분간 PBS 0.1% 트윈(Tween)중의 5% 분유로 차단시켰다. 평판들을 PBS 0.1% 트윈을 사용하여 1회 세척하였다. 혈액 시료를 희석비 1:100으로 시험하고, 또 소장 분비물을 희석비 1:!로 하여 시험하였다. 각 시료 100㎕를 항원 도포 평판에 첨가하였다. 2시간의 배양 후, 평판을 PBS 0.1% 트윈으로 3회 세척시켰다. 염소로부터의 항 마우스 비오티닐화 전(全) 항체 및 항 마우스 IgA, IgG 및 IgM 비오티닐화(Amersham)을 IgA(1:250)를 제외하고 희석비 1:500으로 첨가(100㎕)시키고, 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 평판을 PBS 0.1% 트윈으로 3회 세척시키고, PBS 0.1% 트윈 중의 스트렙타비딘 호스래디쉬 과산화효소 희석액(1:1,000) 100㎕를 첨가하고, 37℃에서 30분간 배양시켰다. 평판을 3회 세척시키고, 1㎕/㎖의 30% H2O2와 함께 pH 5.0의 시트레이트 완충액 중의 o-페닐-디아민 희석액(1:50) 50㎕를 첨가하고 실온에서 20분간 배양시켰다. 495㎚에서의 흡광도를 각 웰 마다 측정하였다.
[실시예 3 (C항 참조)]
면역화 연구에 사용된 마우스를 위내 면역화에 앞서 에테르로 약하게 마취시켰다. 이어서, 히드록시아파타이트가 결합되고 콜레라 독소가 보충된, 대장균에서 제조된 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 및 B 소단위 30㎍을 PBS 중에 현탁시키고, 200㎕를 피하 주사기에 부착된 폴리에틸렌제 관을 사용하여 각각의 마우스의 위로 전달시켰다. 이 방법은 경구 면역화 방법으로서 인용될 것이다.
3개의 경구 면역화 프로토콜이 평가되었다. 이들을 이하에 기재한다.
프로토콜 C1-재조합 우레아제 A 소단위를 사용한 백신 접종
생후 6주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제0일, 8일,14일 및 21일에 정제된 재조합 에이치. 필로리 우레아제 A 소단위 30㎍, 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 10마리의 마우스를 제32일, 34일 및 36일에 액체 배양액으로부터 108의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.
프로토콜 C2-재조합 우레아제 B 소단위를 사용한 백신 접종
생후 6주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제0일, 8일,14일 및 21일에 재조합 에이치. 필로리 우레아제 B 소단위 30㎍, 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 10마리의 마우스를 제32일, 34일 및 36일에 액체 배양액으로부터 108의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.
프로토콜 C3-대조군
생후 6주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제0일, 8일,14일 및 21일에 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 마우스를 제32일, 34일 및 36일에 108의 에이치. 펠리스로 공격하였다.
제42일 또는 106일에 마우스를 죽이고, 위로부터 다수의 생검 시료를 취하였다.
보호 및 평가
보호를 평가하기 위해, 위의 체(體) 및 위동의 생검 시료를 예트록스 HP 검사(Rohm Pharma)에 의해 공급원의 지시에 따라 우레아제 활성에 대해 탐색하였다. 우레아제를 550㎚에서의 분광학적 측정법으로 정량화하였다. 위체 및 위동의 총 OD 값을 더하여 각 마우스에 대한 최종 OD 값을 얻었다.
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Claims (23)
- 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제 또는 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제의 소단위(subunit) 또는 면역원성 단편(immunogenic fragment)을 포함하는, 포유동물에서 헬리코박터(Helicovacter)에 대한 면역반응을 유발하는 점막 백신제조용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 포유동물이 헬리코박터(Helicovacter)에 감염될 우려가 있지만 감염된 것은 아닌 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 포유동물이 헬리코박터(Helicovacter)에 감염된 것인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 소단위가 우레아제 A 소단위인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 소단위가 우레아제 B 소단위인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제 또는 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제의 소단위(subunit) 또는 면역원성 단편(immunogenic fragment)이 헬리코박터 우레아제에 대한 항-이디오타입 항체를 포함하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제 또는 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제의 소단위(subunit) 또는 면역원성 단편(immunogenic fragment)이 재조합체인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제 또는 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제의 소단위(subunit) 또는 면역원성 단편(immunogenic fragment)이 융합단백질로 생산된 것인 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 융합 단백질이 콜레라 독소 소단위를 포함하는 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 점막 백신이 상기 포유동물에 점막 보조제와 함께 투여되는 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 점막 보조제가 콜레라 독소를 포함하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 점막 백신이 상기 포유동물에 히드록실화된 칸슘 포스페이트(hydroxylated calcium phosphate)와 함께 투여되는 조성물.
- 제 13항에 있어서, 상기 히드록실화된 칼슘 포스페이트가 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)인 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 히드록시아파타이트가 상피(epithelium)를 통한 수송에 적합한 입자 형태인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 점막 백신이 상기 포유동물의 경구, 비내, 직장내 또는 안구 표면을 통해 투여되는 조성물.
- 제약학상 혀용되는 담체 또는 희석제 중에 포함된, 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제 또는 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제의 소단위(subunit) 또는 면역원성 단편(immunogenic fragment)을 포함하는 포유 동물에서 헬리코박터에 대한 점막 면역 반응을 유발하는 백신.
- 제 17항에 있어서, 상기 백신이 점막 보조제를 추가로 포함하는 백신.
- 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제 또는 헬리코박터 필로리(Helicovacter pylori) 우레아제의 소단위(subunit) 또는 면역원성 단편(immunogenic fragment)에 대해 특이적인 IgA 항체를 포함하는, 점막 투여에 의해 포유동물에 헬리코박터 감염에 대한 수동적인 보호능(passive protection)을 부여하는 약물용 조성물.
- 제 19항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인 조성물.
- 인간을 제외한 포유동물의 위장관으로부터 수득한 시료에서 헬리코박터의 폴리펩타이드와 반응성인 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 헬리코박터 생물체에 의해 감염된 인간을 제외한 포유동물의 면역 반응의 평가방법.
- 제21항에 있어서, 상기 헬리코박터의 폴리펩타이드가 헬리코박터 우레아제인 방법.
- 제 21항에 있어서, 상기 방법이 상기 검출 단계 이전에 상기 포유 동물의 점막 표면에 백신 항원으로서 헬리코박터의 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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