PL218700B1 - Doustna szczepionka zawierająca przetrwalniki Bacillus subtilis oraz jej zastosowanie do immunizacji przeciwko Helicobacter pylori - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest doustna szczepionka zawierająca przetrwalniki Bacillus subtilis oraz jej zastosowanie przeciwko zakażeniom Helicobacter pylori, do stosowania u ssaków narażonych na zakażenie (efekt ochronny) lub zakażonych patogenem (efekt terapeutyczny).

Podstawy wynalazku

Zakażenia bakterią Helicobacter pylori występują powszechnie na całym świecie, chociaż stwierdza się różnice w częstości infekcji w poszczególnych krajach. W Polsce, według Polskiego Towarzystwa Gastroenterologii, zakażonych jest 70% populacji. W wyniku rozwoju zakażenia H. pylori w żołądku dochodzi do zapalenia błony śluzowej głównie w części przedodźwierni kowej, które może dalej rozprzestrzeniać się na większy obszar żołądka. W dalszym etapie u około 8090% osób zakażonych rozwija się przewlekłe zapalenie błony śluzowej żołądka. Przy długo utrzymującej się infekcji przewlekły stan zapalny może doprowadzić do zaniku błony śluzowej tzw. zapalenia zanikowego. Nasilone zapalenie może powodować ubytki błony śluzowej nazywane nadżerkami lub nawet być przyczyną krwotoku tj. zapalenie krwotoczne. Co więcej przyjmuje się, że infekcja H. pylori jest główną przyczyną choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy.

U osób zakażonych H. pylori dostrzeżono korelację pomiędzy obecnością bakterii a występowaniem wczesnego raka żołądka. Światowa Organizacja Zdrowia uznała H. pylori za czynnik o udowodnionym działaniu rakotwórczym.

Niekiedy w następstwie infekcji H. pylori może dojść do niekontrolowanego rozrostu tkanki układu chłonnego w żołądku tzw. chłoniak typu MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). Powikłanie tego typu jest szczególnie poważnym problemem dla krajów tzw. rozwijających się w tym szczególnie Chin i Indii gdzie procent osób zakażonych sięga 80-90% populacji.

Zakażenie H. pylori występuje powszechnie na całym świecie jednakże ilość osób zakażonych różni się znacząco dla krajów wysokorozwiniętych i rozwijających się. W populacji jednostek zakażonych w danym kraju istnieje nierównomierny rozkład w zależności od wieku pacjenta. Ogólne występowanie zakażenia H. pylori jest silnie skorelowane z warunkami socjoekonomicznymi. Jednostki w wieku średnim z krajów rozwijających się w ponad 80% przypadków są zakażone. Natomiast ta sama grupa wiekowa zamieszkująca kraje wysoko rozwinięte są zakażone w 20 do 50%.

Użycie przetrwalników Bacillus subtilis jako 'nośnika' do prezentacji antygenów i przez to znajdującego zastosowanie w szczepionkach zostało zaprezentowane w pracach opublikowanych na początku roku 2000.

W publikacji Duc i współpracowników z 2003 roku, opisane zostały metody użycia przetrwalników do prezentacji fragmentu toksyny tężcowej (Clostridium tetani) podawanych dożołądkowo zwierzętom doświadczalnym (myszom). W wyniku cyklu zastosowania rekombinowanych przetrwalnikami uzyskano oporność na toksynę tężca w wyniku której, przeżyło 50% zwierząt, którym podano 20-krotność dawki LD50. Uzyskane wyniki wykazały bezspornie, że przetrwalniki mogą zostać efektywnie wykorzystane jako makrocząsteczki do prezentacji antygenów stosowane w doustnej immunizacji.

W opisie patentowym WO 2008/040155 (patent EP 2 082 750 B) ujawniono zrekombinowane białko wykorzystywane do immunoprofilaktyki zakażeń ludzi przez Helicobater pylori. Dokładniej zastrzeżono rekombinowane białko utworzone przez połączenie podjednostki A2 i podjednostki B termo labilnej enetotoksyny enterotoksycznej Escherichia coli i podjednostki B ureazy Helicobacter pylori. Preparat farmaceutyczny jest w postaci mikrosfer o powolnym uwalnianiu.

W opisie patentowym WO 94/09823 (PL 174448 B) ujawniono szczepionkę na infekcję Helicobacter pylori, która zawiera ureazę H. pylori lub H. felis lub polipeptyd zawierający jej podjednostkę, ponadto zawiera również adiuwant śluzówkowy (toksyna cholery).

Podobnie w publikacji WO 95/22987 (PL 179149 B) ujawniono szczepionkę na infekcję Helicobacter pylori, która zawiera, ureazę H. pylori lub H. felis lub polipeptyd zawierający jej podjednostkę, ponadto zawiera również adiuwant śluzówkowy w postaci termicznie labilnej toksyny Escherichia coli lub polipeptyd obejmujący jej podjednostki lub fragmenty.

Jedną z istotnych przyczyn stojących na przeszkodzie zaproponowania skutecznej szczepionki jest fakt iż miejscem kolonizacji w ciele ludzkim jest żołądek. Środowisko kwaśne jakie paPL 218 700 B1 nuje w żołądku niszczy przeciwciała przez co tradycyjne metody immunizacji wywołujące odpowiedź humoralną zawodzą.

Stworzenie skutecznej szczepionki przeciw zakażeniom Helicobacter pylori jest jednym z wyzwań współczesnej medycyny. H. pylori jest odpowiedzialny za wywoływanie choroby wrzodowej oraz wiąże się go z rakiem żołądka.

W chwili obecnej powszechnie stosowana metoda leczenia to terapia antybiotykowa. Jednakże niesie ona ze sobą wiele niekorzystnych efektów. Terapia antybiotykowa jest uciążliwa i wiąże się z wieloma efektami ubocznymi które są wielce niepożądane. Jednym z nich jest powstawanie szczepów bakterii odpornych na konkretny antybiotyk. Ma to ogromne znaczenie ponieważ powoduje konieczność stosowania coraz to innych antybiotyków, i jak twierdzi wielu specjalistów medycynie zaczyna brakować odpowiednich antybiotyków. Dodatkowo obecnie stosowany rodzaj terapii jest długotrwały co w przypadku antybiotyków jest wysoce niewskazane i powodujące dodatkowe komplikacje. Poważnym minusem terapii antybiotykowej jest jej tylko chwilowy efekt co wiąże się z nawrotami zakażenia H. pylori.

Na dzień dzisiejszy nie ma dostępnej żadnej szczepionki przeciwko zakażeniom H. pylori a dostępna terapia sprowadza się do zastosowania antybiotyków.

W National Institute of Health w USA zarejestrowano 104 badania kliniczne, w których przedmiotem jest Helicobacter. Przytłaczająca większość badań dotyczy leczenia zakażenia dwoma, trzema i większą ilością antybiotyków. Żaden z zarejestrowanych testów klinicznych nie wskazuje na przeprowadzanie testów celem rejestracji szczepionki przeciw Helicobacter pylori. Z różnych przyczyn część badań i aktywnych testów została przerwana np. w fazach I do IV przerwano 69 badań/testów, w tym w fazie I-8, II-17, III-18, IV-26.

Istota wynalazku

Nieoczekiwanie okazało się, że można zastosować przetrwalniki Bacillus subtilis jako swego rodzaju nośniki dla antygenów. W tym celu wybrane białka UreA, UreB z H. acinonychis stanowiące antygeny (podjednostki ureazy bakteryjnej), będą prezentowane na powierzchni przetrwalników jako białka fuzyjne z naturalnymi składnikami płaszcza - zewnętrznej struktury budującej przetrwalników

B. subtilis. Zastosowanie białek Helicobacter acinonychis zostało zaproponowane ze względu to, iż z genetycznego punktu H. pylori rożni się zaledwie w 8% od H. acinonychis co czyni go dogodnym modelem do badań na zwierzęcych modelach. Otrzymane rezultaty powinny być takie same przy zastosowaniu metody wobec ludzkiego H. pylori.

Istotą projektu są zrekombinowane przetrwalniki kosmopolitycznie występującej i niepatogennej bakterii glebowej Bacillus subtilis, mogące służyć jako nośniki doustnej szczepionki przeciwko zakażeniom Helicobacter pylori.

W tym celu wybrane białka UreA i UreB (stanowiące antygeny), będące podjednostkami ureazy ba kteryjnej z rodzaju Helicobacter będą prezentowane na powierzchni przetrwalników jako białka fuzyjne z białkami Cot - naturalnymi składnikami płaszcza, zewnętrznej struktury budującej przetrwalnik. W próbach immunizacji zostały wykorzystane całe białka UreA i UreB jak i ich fragmenty wykazujące największe prawdopodobieństwo posiadania epitopów antygenowych. W przygotowaniu białek fuzyjnych posłużono się wektorami integracyjnymi. Wektory te posiadają powielone metodą PCR geny kod ujące białka CotB, CotC, CotG i CotZ wraz z rejonami promotorowymi. Dodatkowo podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne, które ułatwiły zarówno proces klonowania do wektorów jak i tworzenia białek fuzyjnych. Uzyskane geny fuzyjne zostały poddane transformacji do komórek B. subtilis, gdzie po zajściu podwójnego crossing-over zostały wbudowane do locus amyE, thrC lub lacA. Uzyskane geny fuzyjne znajdują się pod kontrolą fizjologicznego promotora B. subtilis ulegającego aktywacji wyłącznie w późnych etapach procesu sporulacji. Powstałe białka fuzyjne zostaną użyte w tworzeniu płaszcza i dzięki temu będą obecne na powierzchni przetrwalników.

Zastosowanie przetrwalników jako nośników szczepionek stanowi nowe podejście do immunizacji ludzi lub zwierząt i może znaleźć istotne zastosowanie zwłaszcza w przypadku immunizacji prowadzącej do ochrony przed infekcjami w obrębie przewodu pokarmowego. W tym przypadku doustne dostarczenie szczepionki umożliwia uzyskanie odporności śluzówkowej oraz systemowej oraz wzrost czasu pół-trwania podanego antygenu. Niewątpliwą zaletą przetrwalników B. subtilis jako nośnika szczepionki jest ich działanie jako adiuwantu co uwidacznia się jako

PL 218 700 B1 wzmaganie odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego (Th1). Może to mieć istotne znaczenie dla skuteczności działania szczepionki.

Ponadto, wykorzystanie przetrwalników B. subtilis jako nośników antygenów daje również łatwość produkcji endospor - B. subtilis jest bakterią o niewielkich wymaganiach troficznych, co wiąże się z stosunkowo niskim kosztem wytwarzania przetrwalników w ilościach przemysłowych. Co więcej, wytwarzanie przetrwalników jest procesem naturalnym i nie wymaga ingerencji człowieka w fizjologię bakterii.

Wszechobecność przetrwalników w środowisku naturalnym, w tym i pożywieniu człowieka, wskazuje na ich niewielką immunogenność, co zapobiegnie powstawaniu odczynów alergicznych podczas podawania przetrwalników prezentujących antygeny.

Wysoka oporność przetrwalników na różnorodne warunki środowiska pozwala na ich łatwe przechowywanie, bez potrzeby mrożenia czy zachowywania ciągu chłodniczego.

Możliwość mieszania przetrwalników prezentujących różne antygeny umożliwia wytwarzanie wielu kombinacji ilościowych oraz jakościowych szczepionek. Co więcej, umożliwia to natychmiastowe przygotowanie żądanej kombinacji epitopów antygenowych poprzez mieszanie w odpowiednich proporcjach rekombinowanych przetrwalników w warunkach standardowego ambulatorium.

Podawanie szczepionki składającej się z przetrwalników może przynieść dodatkowe pozytywne efekty zdrowotne, gdyż przetrwalniki B. subtilis są stosowane jako probiotyki, a ich modyfikacja w kierunku prezentowania antygenów nie zmniejszy ich dobroczynnego działania na układ pokarmowy immunizowanych zwierząt czy też człowieka.

Przygotowanie przetrwalników B. subtilis, których częściami są fragmenty białek UreA i/lub UreB w postaci białek fuzyjnych z np. CotB, CotC, CotG lub CotZ. Tak przygotowany materiał jest/będzie podawany pacjentowi drogą doustną i w ten sposób przekazywany do miejsca docelowego jakim jest żołądek. Przetrwalnik i związana z nim odporność na trawienie jest zabezpieczeniem dla antygenów, które będą mogły stymulować odpowiedź immunologiczną przeciwko H. pylori co będzie stanowiło o odporności organizmu na ten patogen.

Stworzenie swoistego leku przeciwko zakażeniom H. pylori utrudnione jest ze względu na fakt posiadania przez patogen mechanizmu pozwalającego na adaptację np. ekspresję antygenów zbliżonych strukturalnie do nosiciela - LPS bakterii i antygeny grupy Lewis obecne na komórkach błony śluzowej żołądka. Mimikra antygenowa może w efekcie skutecznie prowadzić do wygaszenia specyficznej reakcji immunologicznej.

Dodatkowym utrudnieniem w opracowaniu skutecznej szczepionki jest środowisko w którym H. pylori zasiedla organizm, czyli żołądek. Można uznać, że jest to środowisko 'żrące' ze względu na role żołądka jako miejsca trawienia pokarmu. Ten sam proces trawienia powoduje że zastosowanie klasycznych metod immunizacji nie daje efektów terapeutycznych i ochronnych.

Metoda zaproponowana w projekcie pozwala 'przetrwać' szczepionce w nieprzyjaznym środowisku żołądka i wyeliminować konieczność stosowania terapii antybiotykowej.

W przypadku szczepionki podstawową korzyścią będzie uodpornienie na zarażenie H. pylori i reinfekcję ozdrowieńców. Pozwoli to znacząco zmniejszyć liczbę zakażeń a tym samym zmniejszy koszty leczenia pacjentów zakażonych. Dodatkowo wymierną korzyścią zastosowania szczepionki będzie możliwość rezygnacji z terapii antybiotykowej w takim zakresie jak to ma miejsce dotychczas. W efekcie, spowolnieniu ulegnie proces nabywania lekooporności przez H. pylori. Jest to tym ważniejsze, że wielu lekarzy i naukowców zwraca uwagę, że już teraz wyczerpują się możliwości leczenia antybiotykami z powodu pojawiania się szczepów wielolekoopornych. Oznacza to, że w stosunkowo niedalekiej przyszłości, może zaistnieć sytuacja w której nie będzie można skutecznie leczyć zakażenia ponieważ bakteria będzie odporna na wszystkie dostępne antybiotyki. Zakażenia H. pylori w około 50% przypadków prowadzi do rozwoju raka żołądka. Liczbę osób cierpiących na to schorzenie na świece szacuje się na ponad 970 000 przypadków rocznie co stanowi ok 10% wszystkich zachorowań na raka. Zastosowanie skutecznej szczepionki przeciwko H. pylori pozwoli znacznie zredukować ilość nowych przypadków raka żołądka. Wynalazek ma również potencjał do zastosowania terapeutycznego, jako lek u osób już zakażonych. Możliwość zastosowania terapeutycznego niesie ze sobą wiele korzyści takich jak znaczne ograniczenie terapii antybiotykowej i związanych z nią efektów ubocznych oraz związane z tym korzyści finansowe.

PL 218 700 B1

Dodatkową korzyścią będzie forma przyjmowania szczepionki/leku. Celem projektu jest opracowanie preparatu, który będzie przyjmowany doustnie bez konieczności wykonywania zabiegów takich jak zastrzyki. Takie rozwiązanie niesie ze sobą korzyści zarówno dla pacjenta jak i dla 'systemu opieki zdrowotnej', szczególnie w krajach rozwijających się, gdzie często nie jest stosowany sprzęt jednorazowego użytku (szczególnie igły), co sprzyja szerzeniu się innych infekcji Możliwość rezygnacji ze stosowania sprzętu jednorazowego (igły, strzykawki, środki antyseptyczne) pozwoli na obniżenie kosztów immunizacji dużych grup pacjentów. Ponadto, doustna forma szczepionki pozwoli również zmniejszyć irracjonalny strach przed zastrzykami, który u części populacji powoduje odłożenie szczepienia na nieokreślony czas. Dzięki zastosowaniu przetrwalników bakterii jako nośników antygenu gotowy preparat szczepionki nie będzie musiał być przechowywany w ściśle określonych warunkach takich jak niska temperatura co ułatwia transport i nawet długotrwałe (kilku-kilkunastoletnie) przechowywanie. Pacjent będzie mógł zakupić szczepionkę w postaci np. proszku lub zawiesiny i swobodnie ją w dowolnej chwili spożyć (np. przed, lub po posiłku). Kolejną korzyścią, która przyniesie stosowanie opracowywanej szczepionki będzie fakt wprowadzania do układu pokarmowego pacjentów bakterii B. subtilis, które są od lat stosowane jako probiotyki pomagające uregulować pracę przewodu pokarmowego.

Przedmiotem wynalazku jest doustna szczepionka zawierająca przetrwalniki Bacillus subtilis jako nośnik antygenu, białka ureazy UreA, UreB Helicobacter pylori lub Helicobacter acinonychis jako antygen oraz białka płaszcza antygenu CotB, CotC, CotG, CotZ.

Białka ureazy UreA i UreB, są umieszczone na powierzchni przetrwalników jako białka fuzyjne z białkami CotB, CotC, CotG, CotZ.

Białka ureazy UreA, UreB Helicobacter pylori lub Helicobacter acinonychis stanowią jej podjednostki.

Zastosowanie przetrwalników Bacillus subtilis według wynalazku do wytwarzania doustnej szczepionki stosowanej do immunizacji przeciwko Helicobacter pylori u pacjentów z chorobą wrzodową żołądka i dwunastnicy.

Doustna szczepionka zawiera przetrwalniki Bacillus subtilis, białka ureazy UreA, UreB Helicobacter pylori lub Helicobacter acinonychis jako antygen oraz białka płaszcza antygenu CotB, CotC, CotG, CotZ w ilości dostosowanej do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce.

Zastosowanie doustnej szczepionki do stosowania w postaci proszku, zawiesiny i w innych formach do podawania dostosowanych do miejsca występowania bakterii Helicobacter pylori.

Zalety z wdrożenia projektu są:

• możliwość szczepienia dużych populacji a tym samym wyeliminowania lub znaczącego ograniczenia występowania zakażenia H. pylori i rozwoju choroby wrzodowej czy raka żołądka;

• łatwość podania szczepionki w formie zawiesiny przyjmowanej doustnie;

• możliwość przechowywania szczepionki/leku w warunkach normalnych bez konieczności utrzymywania szczególnych warunków.

• ograniczenie stosowania terapii antybiotykowej, • obniżenie kosztów terapii.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.

P r z y k ł a d 1:

Przygotowanie białek fuzyjnych w oparciu o podjednostkę UreA H. acinonychis z białkami płaszcza przetrwalników oraz sprawdzenie poziomu ekspresji i obecności rekombinowanych białek na powierzchni przetrwalników.

Wykazano, że fuzje białek CotBCGZ z podjednostką UreA z H. acinonychis oraz jej fragmentami są efektywnie prezentowane na powierzchni endospor B. subtilis. Co więcej w zależności od zastosowanego tła genetycznego ilość rekombinowanych białek izolowanych z płaszcza przetrwalników była zbliżona lub wyższa w stosunku do danych literaturowych. Dzięki zastosowaniu doświadczeń immunofluorescencji zaobserwowano dwa rodzaje przetrwalników. W pierwszych antygen był eksponowany bezpośrednio na powierzchni natomiast w drugich białka fuzyjne znajdowały się wewnątrz płaszcza i w konsekwencji nie były eksponowane na zewnątrz endospor.

PL 218 700 B1 «β **

W

Rys.2. Białka fuzyjne UreA-CotC jest rozpoznawane zarówno przez przeciwciała skierowane przeciwko białku CotC jak i UreA

Rys.l Białka fuzyjne UreA-CotB jest rozpoznawane zarówno przez przeciwciała skierowane przeciwko białku CotB jak i UreA

250 —

130 —

100 —

antkCotB antHJreAl antkCotC antł-UreA

PL 218 700 B1

Rys. 4 Oznaczenie ilościowe białek fuzyjnych UreA-CotC prezentowanych na powierzchni rekombinowanych przetrwalników wytworzonych w szczepach o różnym tle genetycznym. 1 - oczyszczone białko UreA, 2 - ekstrakt z białek płaszcza przetrwalników typu dzikiego, 3 - ekstrakt z przetrwalników szczepu cotB::ureA1, 4 - ekstrakt z przetrwalników szczepu cot::ureA1, 5 - ekstrakt z przetrwalników szczepu cotC::spc cotC::ureA1, 6 - ekstrakt z przetrwalników szczepu cotC::spc cotU::erm coc::ureA1, 7 - ekstrakt z przetrwalników szczepu cotG::ureA, 8 - ekstrakt z przetrwalników szczepu tocZ::ureA.

W immunologicznej części badań użyte zostały oba rodzaje przetrwalników (prezentujących fragmenty białka UreA lub UreB). Przetrwalniki w których antygen nie jest bezpośrednio eksponowany na powierzchni, może być efektywniej chroniony przed degradacją w trakcie przechodzenia przez górne części układu pokarmowego do miejsca docelowego (żołądek, jelita) i w konsekwencji powinno to pozwolić na możliwie optymalną indukcję reakcji immunologicznej.

P r z y k ł a d 2:

Badania immunizacji zwierząt doświadczalnych wytworzonymi szczepionkami według wynalazku

W celu przygotowania białka fuzyjnego (CotZ-UreA) posłużono się wektorem integracyjnym pDL jako punktem wyjścia. Gen cotZ pochodzący z B. subtilis wraz z rejonem promotorowym powielono

PL 218 700 B1 metoda PCR przy użyciu primerów: cZ-F 5'- GCT TAG GAT CCA TGA TGA TGT GTA CGA TTG -3' i cY-R 5'- CGT AGC GAA TTC AGT TAT CAC TCT TGT CCT C -3'. Podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne (BamHI i EcoRI, zaznaczone kolorem czerwonym w sekwencji primerów) które ułatwiły zarówno proces klonowania do wektorów jak i tworzenia białka fuzyjnego. Drugą składową rekombinowanego białka została podjednostka UreA ureazy H. acinonyhis. Gen ureA powielono metoda PCR przy użyciu primerów: uA-F 5'- GAG GGA TCC ATG AAA CTC ACC CCA AAA G-3' i uA-R 5'- CGC GAG CTC TAG GGC CAT ACA TAG AAA C- 3'. Podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne (BamHI i SacI, zaznaczone kolorem czerwonym w sekwencji primerów) które ułatwiły fuzje genów cotZ i ureA w prawidłowej ramie odczytu. Uzyskany gen fuzyjny został zsekwencjonowany, aby potwierdzić otrzymanie zaplanowanego produktu. Uzyskany plazmid niosący gen fuzyjny nazwano pKH102. Białka fuzyjne (CotG-UreA, CotC-UreA1 oraz CotB-UreA1) zostały przygotowane w analogiczny sposób (Ryc. 1.)

CotG-UreA ttg ggc cac tat tcc cat tct gac atc gaa gaa gcg gtg aaa tcc gca aaa LGHYSHSDIEEAVKSAK

»...........................cotG-ureA............................>

».............................cotG...............................>

aaa gaa ggt tta aag gat tat tta tac caa gag cct cat gga aaa aaa cgc KEGLK DYLYQEPHGKKR > ............................cotG-ureA............................>

>..............................cotG...............................>

103 agt cat aaa aag tcg cac cgc act cac aaa aaa tct cgc agc cat aaa aaa SHKKSHRTHKKSRSHKK > ............................cotG-ureA............................>

> ..............................cotG...............................>

154 tca tac tgc tct cac aaa aaa tct cgc agt cac aaa aaa tca ttc tgt tct SYCSHKKSRSHKKSFCS >.,..........................cotG-ureA........................... ·>

>.,.

.. . .COtG.....

. .>

205

cac

aaa

aaa

tct

cgc

agc

cac

aaa aaa tca

tac

tgc

tct

cac

aag

aaa

tct

H

K

K

S

R

s

H

K K s

Y

c

S

H

K

K

s

>. . .

.. .>

>.. .

....cotG.....

255

cgc

agc

cac

aaa

aaa

tcg

tac

cgt tct cac

aaa

aaa

tct

cgc

agc

tat

aaa

R

s

H

K

K

s

Y

R S H

K

K

s

R

S

Y

K

>...

. . .>

>.. .

. . . .cotG.....

, . ,>

307

aaa

tct

tac

cgt

tct

tac

aaa

aaa tct cgt

agc

tat

aaa

aaa

tct

tgc

cgt

K

s

Y

R

S

Y

K

K S R

S

Y

K

K

s

C

R

>. ..

..cotG-ureA..

>...

....cotG.....

, . .>

358

tct

tac

aaa

aaa

tct

cgc

agc

tac aaa aag

tct

tac

tgt

tct

cac

aag

aaa

s

Y

K

K

s

R

S

Y K K

s

Y

C

s

H

K

K

>...

..cotG-ureA..

. . . >

>,,,

. , . . cotG.....

, . .>

409

aaa

tct

cgc

agc

tat

aag

aag

tca tgc cgc

aca

cac

aaa

aaa

tct

tat

cgt

K

s

R

s

Y

K

K

S C R

T

H

K

K

s

Y

R

>.. .

..cotG-ureA..

>...

,»..cotG.....

. . . >

4 60

tcc

cat

aag

aaa

tac

tac

aaa

aaa ccg cac

cac

cac

tgc

gac

gac

tac

aaa

S

H

K

K

Y

Y

K

K E H

H

H

c

D

D

Y

K

>. .

. . . >

, ...cotG.....

, .. >

511

aga

cac

gat

gat

tat

gac

agc

aaa aaa gaa

tac

tgg

aaa

gac

ggc

aat

tgc

R

H

D

D

Y

D

s

K K E

Y

w

K

D

G

N

C

>. ..

..cotG-ureA..

.. .>

>. . .

....cotG.....

PL 218 700 B1

562

tgg W >...

gta V

gtc aaa

aag K ;G. . .

aaa K

tac aaa gga tcc atg

aaa K

ctc L

acc cca aaa

gag E . . > . « >

V

K . cot

Y

K G S .cotG-ureA.. .»

M »..

T LreA.

P

K

613

tta

gac

aag

ttg

atg

ctc

cac

tat gct gga

gaa

ttg

gct

aaa

aaa

cgc

aaa

L

D

K

L

M

L

H

Y A G

E

L

A

K

K

R

K

>...

.cotG-ureA..

. . >

>. ..

...ureA.....

. .>

664

gaa

a aa

ggc

att

aag

ctt

aac

tat gta gaa

gcg

gta

gct

ttg

att

agt

gcc

E

K

G

I

K

L

N

Y V E

A

V

A

L

I

S

A

>. . .

.cotG-ureA..

. .>

>. . .

....

...ureA.... .

. .>

715

cat

att

atg

gaa

gaa

gcg

aga

gct ggt aaa

aag

act

gcg

gct

gaa

ttg

atg

H

I

M

E

E

A

R

A G K

K

T

A

A

E

L

M

>...

.cotG-ureA. .

>...

...ureA.....

766

caa

gaa

ggg

cgc

act

Ctt

tta

aaa ccg gat

gat

gtg

atg

gat

ggc

gtg

gca

Q

E

G

R

T

I

L

K P D

D

V

M

D

G

V

A

>« < .

.cotG-ureA..

>. ..

.,.ureA.....

. . >

817

agc

atg

atc

cat

gaa

gtg

ggt

att gaa gcg

atg

ttt

cct

gat

ggg

aca

aaa

S

M

I

H

E

V

G

I E A

M

F

P

D

G

T

K

>. ..

.cotG-ureA. .

>. ..

. ..ureA.....

868

ctc

gta

acc

gtg

cat

acc

cct

att gag gcc

aat

ggt

aaa

tta

gtt

cct

ggt

L

V

T

V

H

T

P

I E A

N

G

K

L

V

P

G

>. . .

..cotG-ureA..

. . .>

>. . .

....ureA.....

919

gag

ttg

ttc

tta

aaa

aat

gaa

gac atc act

atc

aac

gaa

ggc

aaa

aaa

gcc

E

L

F

L

K

N

E

D I T

I

N

E

G

K

K

A

>. . .

,.cotG-ureA..

,. .>

>...

,...ureA.....

,,, >

970

gtt

agc

gtg

aaa

gtt

aaa

aat

gtt ggc gac

aga

ccg

gtt

caa

atc

ggc

tca

V

s

V

K

V

K

N

V G D

R

P

V

Q

I

G

S

>. . ,

..cotG-ureA..

.. .>

>...

....ureA....

.. .>

1021

cac

ttc

cat

ttc

ttt

gaa

gtg

aat aga tgc

tta

gac

ttt

gac

aga

gaa

aaa

H

F

H

F

F

E

V

N R C

L

D

F

D

R

E

K

>. .

..cotG-ureA.

. . . >

....ureA....

. . . >

1072

act

ttc

ggt

aaa

cgc

tta

gac

att qcq agc

ggg

aca

gcg

gta

agg

ttt

gag

T

F

G

K

R

L

D

I A S

G

T

A

V

R

F

E

>.. >- t

..cotG-ureA.

. . . .

Λ Λ

1123

cct

ggc

gaa

gaa

aaa

tcc

gta

gaa ttg att

gac

att

ggc

ggt

aac

aga

aga

P

G

E

E

K

S

V

ELI

D

I

G

G

N

R

R

>..

.,cotG-ureA.

. . .>

>. -

. ...ureA....

. . .>

PL 218 700 B1

1174

atc

ttt

gga

ttt

aac

gcg

ttg

gtt gat

agg

caa

gca

gac

aac

gaa

agc

aaa

I

F

G

F

N

A

L

V D

R

Q

A

D

N

E

s

K

>. .

>...

....ureA.

1225

aaa

att

gct

tta

cac

aga

gct

aaa gag

cgt

ggt

ttt

cat

ggc

gct

aaa

agc

K

I

A

L

H

R

A

K E

R

G

F

H

G

A

K

s

... >

>

... >

1276

gat

gac

aac

tat

gta

aaa

aca

att aag

gag

taa

D

D

N

y

V

K

T

I K

E

-

..»

. ureA.

.»

CotC-UreAl atg ggt tat tac aaa aaa tac aaa gaa gag tat tat acg gtc aaa aaa acg

».

M

K

K

K E ..cotC.

V

K

K

». .

, cotC-ureAl..

.. >

52

tat

tat

aag

aag

tat

tac

gaa

tat gat aaa

aaa

gat

tat

gac

tgt

gat

tac

Y

Y

K

K

Y

Y

E

Y D K

K

D

Y

D

c

D

Y

>. .

.. >

,cotC-ureAl..

.. >

103

gac

aaa

aaa

tat

gat

gac

tat

gat aaa aaa

tat

tat

gat

cac

gat

aaa

aaa

D

K

K

Y

D

D

Y

D K K

Y

Y

D

H

D

K

K

>

.. >

154

gac

tat

gat

tat

gtt

gta

gag

tat aaa aag

cat

aaa

aaa

cac

tac

gat

atc

D

Y

D

Y

V

V

E

Y K K

H

K

K

H

Y

D

I

>..,

. .»

>

. . . >

205

ggt

aaa

aag

act

gcg

gct

gaa

ttg atg caa

gaa

ggg

cgc

act

ctt

tta

aaa

G

K

K

T

A

A

E

L M Q

E

G

R

T

L

L

K

mtC-urpAl..

»..

....ureAl....

256

ccg

gat

gat

gtg

atg

gat

ggc

gtg gca agc

atg

atc

cat

gaa

gtg

ggt

att

P

D

D

V

M

D

G

V A S

M

I

H

E

V

G

I

> .

. . . . ureAl. ...

. . .>

307

gaa

gcg

atg

ttt

cct

gat

ggg

aca aaa ctc

gta

acc

gtg

cat

acc

cct

att

E

A

M

F

P

D

G

T K L

V

T

V

H

T

P

I

notC—ureAl . .

... >

.. ..ureAl. . .

. . . >

PL 218 700 B1

358

gag gcc aat

ggt G

aaa K

tta L

gtt V

cct ggt gag ttg ttc

tta L

aaa K

aat N

gaa E

gac D . . > . . >

E >. - . >. . .

A

N

P G E , cotC-ureAl.. ....ureAl....

L

F

409

atc

act

atc

aac

gaa

ggc

aaa

aaa gcc gtt

agc

gtg

aaa

gtt

aaa

aat

gtt

I

T

I

N

E

G

K

K A V

s

V

K

V

K

N

V

>...

. cotC-ureAl..

.. .>

>.,,

. ...ureAl... .

460

ggc

gac

aga

ccg

gtt

caa

atc

ggc tca cac

ttc

cat

ttc

ttt

gaa

gtg

aat

G

D

R

P

V

Q

I

G S H

F

H

F

F

E

V

N

>...

, cotC-ureAl.,

>...

....ureAl....

511

aga

tgc

tta

gac

ttt

gac

aga

gaa aaa act

ttc

ggt

aaa

cgc

tta

gac

att

R

C

L

D

F

D

R

Ε K T

F

G

K

R

L

D

I

.cotC-ureAl..

>...

....ureAl....

... >

562

gcg

agc

ggg

aca

gcg

gta

agg

ttt gag cct

ggc

gaa

gaa

aaa

tcc

gta

gaa

A

S

G

T

A

V

R

F Ε P

G

E

E

K

S

V

E

>...

. cotC-ureAl.,

, ...ureAl... ,

.. >

613

ttg

att

gac

att

ggc

ggt

aac

aga aga atc

ttt

gga

ttt

aac

gcg

ttg

gtt

L

I

D

I

G

G

N

R R I

F

G

F

N

A

L

V

>. . .

. cotC-ureAl.,

. .. >

>...

. ,..ureAl....

664

gat

agg

caa

gca

gac

aac

gaa

agc aaa aaa

att

gct

tta

cac

aga

gct

aaa

D

R

Q

A

D

N

E

S K K

I

A

L

H

R

A

K

>..,

.cotC-ureAl..

... >

>...

, ..-ureAl....

.. .>

715

gag

cgt

ggt

ttt

cat

ggc

gct

aaa agc gat

gac

aac

tat

gta

aaa

aca

att

E

R

G

F

H

G

A

K S D

D

N

Y

V

K

T

I

>.. .

,cotC-ureAl..

. . . >

>...

. . ..ureAl....

766 aag gag taa K E >........» cotC-ureAl >..ureAl.»

CotB-UreAl atg agc aag agg aga atg aaa tat cat tca aat aat gaa ata tcg tat tat

»..................... cotB-ureAl.................... >

».............................COtB...............................>

aac ttt ttg cac tca atg aaa gat aaa att gtt act gta tat cgt gga ggt > ................... cotB-ureAl............................>

> ..............................cotB............................ . . .>

103 ccg gaa tct aaa aaa gga aaa tta aca gct gta aaa tca gat tat ata gct

PL 218 700 B1

>...................... . >.......................	.... cotB-ureAl............................> .......cotB...............................>
154 tta caa gct gaa aaa aaa >...................... .	ata att tat tat cag ttg gag cat gtg aaa agt .... cotB-ureAl............................>
>.......................	.......cotB...............................>
205 att act gag gat acc aat >.........,.............	aat agc acc aca aca att gag act gag gaa atg . . . . cotB-ureAl............................>
>.......................	.......cotB...............................>
256 ctc gat gct gat gat ttt >.......................	cat agc tta atc gga cat tta ata aac caa tca , . . . . cotB-ureAl............................>
>.......................	........cotB...............................>
307 gtt caa ttt aac caa ggg >.......................	ggt ccg gaa tct aaa aaa gga aga ttg gtc tgg , . . . . cotB-ureAl............................>
>.......................	........cotB...............................>
358 ctg gga gat gat tac gct >....................... >.......................	gcg tta aac aca aat gag gat ggg gta gtg tat , . .. . cotB-ureAl............................> ........cotB...............................>
409 ttt aat atc cat cac atc >.......................	aaa agt ata agt aaa cac gag cct gat ttg aaa , . . . . cotB-ureAl............................>
>.......................	........COtB...............................>
460 ata gaa gag cag acg cca >.......................	gtt gga gtt ttg gaa gct gat gat tta agc gag , . . cotB-ureAl............................>
>.......................	........cotB...............................>
511 gtt ttt aag agt ctg act >....................... >.......................	cat aaa tgg gtt tca att aat cgt gga ggt ccg . . . . . cotB-ureAl............................> ........cotB...............................>
562 gaa gcc att gag ggt atc >.......................	ctt gta gat aat gcc gac ggc cat tat act ata .....cotB-ureAl............................>
>.......................	........cotB............................... >
613 gtg aaa aat caa gag gtg >....................... >.......................	ctt cgc atc tat cct ttt cac ata aaa agc atc .....cotB-ureAl............................ > ........cotB............................... >
664 agc tta ggt cca aaa ggg >......, ............ . . . . >......, ...............	tcg tac aaa aaa gag gat caa aaa aat gaa caa .....cotB-ureAl............................> ........cotB...............................>
715 aac cag gaa gac aat aat >.......................	gat aag gac agc aat tcg ttc att tct tca aaa .....cotB-ureAl............................>
>......................	........cotB...............................>
766 tca tat agc tca tca aaa >...................... >......................	tca tct aaa ega tca eta aaa tct tca gat gat .....cotB-ureAl............................> ........cotB...............................>
817 caa tca tcc gat atc ggt >...................... >. . cotB. .» ».	aaa aag act gcg gct gaa ttg atg caa gaa ggg .....cotB-ureAl............................> ..................ureAl....................>

868 cgc act ctt tta aaa ccg gat gat gtg atg gat ggt gtg gca agc atg atc

PL 218 700 B1

>. . .

cotB-ureAl. .

>. . .

. ..ureAl... .

. . >

919

cat

gaa

gtg

ggt

att

gaa

gcg

atg ttt cct

gat

ggg

acc

aaa

ctc

gta

acc

>. . ,

cotB-ureAl..

>. .,

...ureAl....

.. . >

97 0

gtg

cat

acc

cct

att

gag

gct

aat ggt aaa

ttg

gtt

cct

ggt

gag

ttg

ttc

>...

cotB-ureAl..

. . . >

...ureAl...,

1021

tta

aaa

aat

gaa

gac

atc

act

atc aac gaa

ggc

aaa

aaa

gee

gtt

agc

gtg

>, . ,

cotB-ureAl..

. . . >

>...

...ureAl....

1072

aa a

gtt

aaa

aac

gtg

ggc

gac

aga ccg gtt

caa

atc

ggt

tea

cac

ttc

cat

>. . .

,cotB-ureAl..

.. . >

>, , ,

... . . ureAl. . . .

1123

ttc

ttt

gaa

gtg

aat

aga

tgc

eta gac ttt

gac

aga

gaa

aaa

act

ttc

ggc

>...

,cotB-ureAl..

.. . >

>. . .

....ureAl...,

.. ·>

1174

aaa

cgc

tta

gac

att

gcg

agc

ggg aca gcg

gta

agg

ttt

gag

cct

ggc

gaa

>, , .

,cotB-ureAl.,

>. . .

....ureAl...,

1225

gaa

aaa

tcc

gta

gaa

ttg

att

gac att ggt

ggc

aac

aga

aga

atc

ttt

gga

>...

.cotB-ureAl.,

,. .>

>...

....ureAl...,

.. . >

1276

ttt

aac

gca

ttg

gtt

gat

agg

caa gca gac

aac

gaa

agc

aaa

aaa

att

gct

>...

. cotB-ureAl..

.. .>

>.. -

....ureAl...,

1327

tta

cac

aga

gct

aaa

gag

cgt

ggt ttt cat

ggt

gct

aaa

agc

gat

gac

aac

>. . ,

.cotB-ureAl. .

. . . >

>. . ,

....ureAl....

1378

tat

gta

aaa

aca

att

aag

gag

taa

>. .

jreAl... .

,.»

..ureAl..

,.»

CotZ-UreA

1

atg M ». , »..

agc cag aaa

aca T

tea S

agc S

tgc gtg cgt C V R ,...cotz..... ..cotZ-ureA..

gaa E

gct A

gta V

gaa E

aat N

att I

gaa E . . . > . . . >

s

Q

K

52

gat

ctg

caa

aac

gct

gtt

gaa

gaa gac tgc

ccg

acc

ggc

tgc

cac

tet

aag

D

L

Q

N

A

V

E

E D C

p

T

G

C

H

S

K

> . .>

>...

. .cotZ-ureA..

.. . >

103

ctt

tta

tet

gta

agc

cat

teg

tta ggc gac

aca

gtg

cct

ttt

gca

ata

ttt

L

L

S

V

s

H

S

L G D

T

V

P

F

A

I

F

>. . ,

. ...cotZ.....

.. . >

PL 218 700 B1

>. .

154

aca

tca

aaa

tca

acg

cca

tta

gtc gee ttc

gga

aat

gtc

ggc

gaa

etc

gat

τ

S

K

S

T

P

L

V A F

G

N

V

G

E

L

D

>. .

. . . .cotZ....

. . . >

>. .

.. .>

205

aac

ggc

cct

tgc

ttt

aat

aca

gta ttt ttc

agg

gtc

gaa

aga

gtg

cat

gga

N

G

P

C

F

N

T

V F F

R

V

E

R

V

H

G

>. .

....cotZ....

. . . >

>. .

..cotZ-ureA.

256

agc

tgt

gca

aca

ctg

tca

tta

tta atc gca

ttt

gac

gaa

cac

aaa

cac

att

s

C

A

T

L

S

L

L I A

F

D

E

H

K

H

I

>. .

. ...cotZ....

.. .>

>.. .

.,cotZ-ureA.

... >

307

ttg

gac

ttc

acc

gat

aaa

gat

acg gtg tgt

gaa

gtg

ttc

ega

etc

gaa

aaa

L

D

F

T

D

K

D

T V C

E

V

F

R

L

E

K

>. . .

. . . . cotZ. . . . .

. . .>

>. ,,

..cotZ-ureA,.

358

acg

aac

tac

tgt

att

gaa

gtt

gac tta gac

tgc

ttc

tgc

gca

atc

aac

tgc

T

N

y

C

I

E

V

D L D

C

F

C

A

I

N

C

>...

....cotZ.....

. . . >

>. . .

. . cotZ-ureA..

, . . >

409

tta

aat

cct

ega

tta

atc

aat

cgt aca cat

cat

cat

gga

tcc

atg

aaa

etc

L

N

P

R

L

I N . .cotZ.,.

R Τ H

H

H , .»

G

S

M

K

L

>...

. .cotZ-ureA..

>>.ureA,

. . >

460

acc

cca

aaa

gag

tta

gac

aag

ttg atg etc

cac

tat

gct

gga

gaa

ttg

gct

T

P

K

E

L

D

K

L M L

H

Y

A

G

E

L

A

>. . .

..cotZ-ureA..

. . >

>. , ,

....ureA.....

511

aaa

aaa

cgc

aaa

gaa

aaa

ggc

att aag ctt

aac

tat

gta

gaa

gcg

gta

gct

K

K

R

K

E

K

G

I K L

N

Y

V

E

A

V

A

>..,

.cotZ-ureA..

>. ..

...ureA.....

562

ttg

att

agt

gee

cat

att

atg

gaa gaa gcg

aga

gct

ggt

aaa

aag

act

gcg

L

I

S

A

H

I

M

E E A

R

A

G

K

K

T

A

.cotZ-ureA..

.. >

>. . .

...ureA.....

, . >

613

gct

gaa

ttg

atg

caa

gaa

ggg

cgc act ctt

tta

aaa

ccg

gat

gat

gtg

atg

A

E

L

M

Q

E

G

R T L

L

K

P

D

D

V

M

>...

.cotZ-ureA..

. . >

>. . .

...ureA.....

. . >

664

gat

ggc

gtg

gca

age

atg

atc

cat gaa gtg

ggt

att

gaa

gcg

atg

ttt

cct

D

G

V

A

s

M

I

Η E V

G

I

E

A

M

F

P

>...

.cotZ-ureA..

. . >

>. . .

...ureA.....

. . >

715

gat

ggg

aca

aaa

etc

gta

acc

gtg cat acc

cct

att

gag

gee

aat

ggt

aaa

D

G

T

K

L

V

T

V Η T

P

I

E

A

N

G

K

>...

.COtZ-ureA..

. . >

PL 218 700 B1

>.. .

....ureA.....

766

tta

gtt

cct

ggt

gag

ttg

ttc

tta aaa aat

gaa

gac

atc

act

atc

aac

gaa

L

V

P

G

E

L

F

L K N

E

D

I

T

I

N

E

>. . .

..cotZ-ureA..

>.. .

....ureA.....

,. . >

817

ggc

aaa

aaa

gcc

gtt

agc

gtg

aaa gtt aaa

aat

gtt

ggc

gac

aga

ccg

gtt

G

K

K

A

V

s

V

K V K

N

V

G

D

R

P

V

>.. .

..cotZ-ureA..

>...

,...ureA.....

. . . >

868

caa

atc

ggc

tca

cac

ttc

cat

ttc ttt gaa

gtg

aat

aga

tgc

tta

gac

ttt

Q

I

G

S

H

F

H

F F E

V

N

R

C

L

D

F

>.. .

..cotZ-ureA..

>.. .

....ureA.....

919

gac

aga

• gaa

aaa

act

ttc

ggt

aaa cgc tta

gac

att

gcg

agc

ggg

aca

gcg

D

R

E

K

T

F

G

K R L

D

I

A

s

G

T

A

>. . .

..cotZ-ureA..

. .. >

>.. .

....ureA.....

970

gta

agg

ttt

gag

cct

ggc

gaa

gaa aaa tcc

gta

gaa

ttg

att

gac

att

ggc

V

R

F

E

P

G

E

E K S

V

E

L

I

D

I

G

>. . .

..cotZ-ureA..

>. . .

. ...ureA.....

. . . >

1021

ggt

aac

aga

aga

atc

ttt

gga

ttt aac gcg

ttg

gtt

gat

agg

caa

gca

gac

G

N

R

R

I

F

G

F N A

—1

V

D

R

Q

A

D

>. . .

..cotZ-ureA..

. . . >

>. . .

,...ureA.....

. . . >

1072

aac

gaa

agc

aaa

aaa

att

gct

tta cac aga

gct

aaa

gag

cgt

ggt

ttt

cat

N

E

s

K

K

I

A

L H R

A

K

E

R

G

F

H

>. . .

..cotZ-ureA..

. . . >

>. . .

....ureA.....

1123

ggc

gct

aaa

agc

gat

gac

aac

tat gta aaa

aca

att

aag

gag

taa

G

A

K

3

D

D

N

Y V K

T

I

K

E

>...

. .cotZ-ureA......

. .»

>..,

, . . .ureA.........

. .»

Ryc. 1. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa rekombinowanego genów i białka UreA lub jego fragmentów.

Kolejnym krokiem była transformacja komórek B. subtilis plazmidem pKH102 zawierającym gen fuzyjny. W konsekwencji rekombinowany gen został wbudowany do chromosomu bakteryjnego w locus amyE. Uzyskany szczep nazwano BKH102. Z kolei transformacja komórek B. subtilis plazmidami pKH20, pKH03 i PKH14 (Ryc. 2) zawierające rekombinowane geny cotB-ureA, cotC-ureA1 oraz cotB-ureA1 pozwoliła na uzyskanie szczepów BKH20, BKH03 oraz BKH14. Analizę poziomu ekspresji i obecności rekombinowanych białek na powierzchni przetrwalników z użyciem tych szczepów obrazuje przykład 1.

PL 218 700 B1

PL 218 700 B1

Ryc. 2. Mapy wektorów integracyjnych: pKH20 (A), pKH03 (B), pKH14 (C), pKH102 (D). Ekspresję rekombinowanych genów zapewniają fizjologiczne promotory genów kolejno cotG, cotC, cotB oraz cotZ.

W celu wzmocnienia odpowiedzi uzyskiwanej po podaniu zwierzętom doświadczalnym preparatu został przygotowany wektor na bazie plazmidu pDG1662 umożliwiający umieszczenie w chromosomie B. subtilis w locus thrC genu kodującego podjednostkę UreA ureazy H. acinonychis pod kontrolą silnego promotora aktywnego w komórkach wegetatywnych (promotor genów rybosomalnego RNA rrnO P2). Podane jako szczepionka przetrwalniki kiełkują w przewodzie pokarmowym formując komórki wegetatywne, które mogą wyrażać dodatkowe ilości antygenu. Rejon promotorowy powielono metodą PCR przy użyciu primerów: rOP2-F 5- GAT GGC TAA GCT TCA TGG GTC TCA CCT CCT TGT TC -3' i rOP2-R 5'- GGC GTA GAG GAA TTC GAT CTG CAT GAC CAT TAT GAC -3'. Podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne (Hindlll i EcoRI, zaznaczone kolorem czerwonym w sekwencji primerów). Następnie powielono metodą PCR gen ureA przy użyciu primerów: ruA-F 5- GGC ATT AAG CTT AAC TAT GTA G -3' i ruA-R 5'- CTA AAC ATG TTC ATT TCT TAC TC -3'. Podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne (Hindlll i Pcil, zaznaczone kolorem czerwonym w sekwencji primerów) i umieszczono go pod kontrolę promotora rybosomalnego. Uzyskany wektor nazwano pKH115.

PL 218 700 B1

1

ega

tct

gca

tga cca

tta tga eta

gta

aaa

act

ttt

tca

aaa aag tat tga rrnO P2 ». .>

52

cct >. . .

agt

taa

eta aaa atg ..rrnO P2....

tta

eta tta

agt

agt

cgc

ttt

gag

aga

agc

aca

103

caa

agt

tct

ttg

aaa

act

aaa

caa

gac

aaa

acg

tac

ctg

tta

att

cat

ttt

154

tat

aaa

tcg

cac

agc

gat

gtg

cgt

agt

cag

tca

aac

tag

ggc

ctg

cac

gac

205

gca

ggt

cac

aca

ggt

gtc

gee

gca

gga

tgc

ggt

gaa

Ctt

aac

ctg

ttc

tag

256

aac

aag

gag

gtg

aga

CCC

atg M »..

aag K

ctt L

aac N

tat gta Y V ,,.,ureA.

gaa E

gcg A

gta V

get A

ttg L . . >

>>RBS sspA.>>

307

att agt

gee cat

att I

atg M

gaa E

gaa gcg E Ά . . . .ureA.

aga R

get A

ggt G

aaa aag

act T

gcg get

I >.. .

s

A

H

K

K

A

A . . >

358

gaa

ttg

atg

caa

gaa

ggg

cgc

act ctt

tta

aaa

ccg

gat

gat

gtg

atg

gat

E

L

M

Q

E

G

R

T L

L

K

P

D

D

V

M

D

>.. ,

... .ureA.

409

ggc

gtg

gca

agc

atg

atc

cat

gaa gtg

ggt

att

gaa

gcg

atg

ttt

cct

gat

G

V

A

S

M

I

H

E V

G

I

E

A

M

F

P

D

>...

..ureA.

460

ggg G >...

aca T

aaa K

etc L

gta V

acc T

gtg V

cat H

acc T ureA.

cct P

att I

gag E

gee A

aat N

ggt G

aaa K

tta L . . . >

511

gtt V

cct P

ggt G

gag E

ttg L

ttc F

tta L

aaa K

aat N

gaa E

gac D

atc I

act T

atc I

aac N

gaa E

ggc G

>...

. . . >

5 62

aaa K

aaa K

gee A

gtt V

agc S

gtg V

aaa K

gtt V

aaa K

aat N

gtt V

ggc G

gac D

aga R

ccg P

gtt V

caa Q

>..............................ureA...............................>

613

atc ggc

tca S

cac ttc

cat H

ttc ttt gaa gtg

aat N

aga R

tgc C

tta L

gac ttt

gac D . .>

I >. . .

G

H

F

F

F E ....ureA.

V

D

F

664

aga

gaa

aaa

act

ttc

ggt

aaa

cgc tta

gac

att

gcg

agc

ggg

aca

gcg

gta

R

E

K

T

F

G

K

R L

D

I

A

S

G

T

A

V

>. . .

. . >

715

agg

ttt

gag

cct

ggc

gaa

gaa

aaa tcc

gta

gaa

ttg

att

gac

att

ggc

ggt

R

F

E

P

G

E

E

K S

V

E

Ł

I

D

I

G

G

>. . .

....ureA.

. .>

766

aac

aga

aga

atc

ttt

gga

ttt

aac gcg

ttg

gtt

gat

agg

caa

gca

gac

aac

N

R

R

I

F

G

F

N A

L

V

D

R

Q

A

D

N

>.. .

....ureA.

.....

. . >

817

gaa

agc

aaa

aaa

att

get

tta

cac aga

get

aaa

gag

cgt

ggt

ttt

cat

ggc

E

s

K

K

I

A

L

H R

A

K

E

R

G

F

H

G

>. .

....

868

get

aaa

agc gat gac aac tat gta aaa aca

att

aag

gag

taa

gaa

atg

A

K i

D

D

N

Y V

K

T

I

K

E

-

>..

..»

919

atg

Ryc. 3. Sekwencja nukleotydowa promotora rrnOP2 oraz sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa genu i białka UreA.

Kolejnym krokiem była transformacja komórek B. subtilis szczepu BKH102 (amyE::cotZ-ureA) plazmidem pKH115. W konsekwencji rekombinowany gen został wbudowany do chromosomu bakteryjnego w locus thrC. Dzięki takiemu rozwiązaniu skonstruowano szczep wyrażający antygen UreA na

PL 218 700 B1 powierzchni przetrwalnika (białko fuzyjne CotZ-UreA) oraz w komórce wegetatywnej. Uzyskany szczep nazwano BKH116 (amyE::cotZ-ureA, thrC::prm02-ureA).

Ryc. 4. Wektor integracyjny pKH115 zawierający gen ureA pod kontrolą promotora rybosomalnego rrnO P2.

Hodowle szczepów BKH102 oraz BKH116 zostały przeanalizowane w kierunku ekspresji rekombinowanego białka CotZ-UreA jak również białka UreA przy użyciu przeciwciał mysich anty-UreA otrzymanych w naszym laboratorium. Obecność białka fuzyjnego została sprawdzona w ekstraktach białkowych uzyskanych z płaszcza przetrwalników szczepu BKH102 natomiast białko UreA w ekstraktach białkowych przygotowanych z komórek wegetatywnych szczepu BKH116. W obu wypadkach zastosowano metodę western-blotting, polegającą na wykrywaniu poszukiwanego białka związanego z błoną za pomocą przeciwciał związanych z enzymem, który przeprowadza reakcję barwną pozwalającą na jego zlokalizowanie.

Ryc. 5. Western Blotting z użyciem ekstraktów białkowych uzyskanych z płaszcza przetrwalników. Naniesione próbki: 1 - Oczyszczone UreA, 2 - 168 (szczep typu dzikiego), 3 - BKH102 (amyE:: cotZ-ureA), 4 - BKH115 (thrC:: rrnOP2-ureA), 5- BKH116 (amyE:: cotZ-ureA, thrC:: rrnOP2-ureA).

PL 218 700 B1

Ryc. 6. Western Blotting z użyciem ekstraktów białkowych uzyskanych z komórek wegetatywnych.

Naniesione próbki: 1 - Oczyszczone UreA, 2 - 168 (szczep typu dzikiego), 3 - BKH116 (amyE:: cotZ-ureA, thrC:: rrnOP2 - ureA).

Przydatność przetrwalników niosących fuzyjne białka do doustnej immunizacji jest połączona z położeniem białka fuzyjnego w obrębie struktur przetrwalnika. Przyjmuje się, że białka fuzyjne obecne na powierzchni przetrwalnika mają większy potencjał pobudzania układu odpornościowego. Obecność rekombinowanego białka CotZ-UreA na powierzchni przetrwalników wytworzonych przez szczep BKH102 została potwierdzona metodą immunofluorescencji (rys. 7, prawy panel). Widoczna czerwona fluorescencja układająca się dookoła przetrwalnika stanowi dowód na powierzchniowe położenie poszukiwanego białka.

Ryc. 7. Immunofluorescencja z użyciem przetrwalników oczyszczonych metoda płukań detergentami ze szczepu BKH102. W doświadczeniu użyto mysie l-rzędowe przeciwciała anty-UreA oraz przeciwciała II-rzędowe anty-mysz lgG-Cy3 umożliwiające ich wizualizację w mikroskopie fluorescencyjnym. Lewe zdjęcie przedstawia obraz widziany w świetle widzialnym (kontrast fazowy), prawe natomiast obraz fluorescencyjny tego samego pola widzenia.

PL 218 700 B1

Po sprawdzeniu ekspresji i położenia białka fuzyjnego w strukturach przetrwalnika przystąpiono do oczyszczania przetrwalników w ilości wystarczającej do immunizacji grupy 10 myszy. W tym celu zapoczątkowano hodowlę na większą skalę (15 litrów pożywki DSM), która posłużyła do izolacji odpowiedniej ilości przetrwalników. Przetrwalniki zostały oczyszczone metodą płukań woda z detergentami i zliczone w komorze Thoma. Każda partia oczyszczonych przetrwalników została przetestowana na obecność odpowiednich białek fuzyjnych na ich powierzchni (dane nie pokazane). Oczyszczenie przetrwalników zakończyło etap przygotowywania materiału, który w dalszym etapie, został wykorzystany do immunizacji zwierząt doświadczalnych (myszy). Immunizacja zwierząt doświadczalnych wytworzoną szczepionką i ocena odpowiedzi immunologicznej (ocena stopnia oraz rodzaju indukcji odpowiedzi immunologicznej) oraz w następnym etapie jej skuteczność dokonywana była na myszach szczepu BALB/c (samice w wieku powyżej 6 tygodni). Szczepionka złożona z dziewięciu dawek po 1,0 x 10¹⁰ (co stanowi 5 mg przetrwalników/na dawkę) zawierających na powierzchni antygen w postaci podjednostki UreA ureazy H. acinonychis została wprowadzana dożołądkowo, za pomocą strzykawki połączonej z polietylenową kaniulą. Szczepionka została podawana zwierzętom kolejno w dniu 0, 3, 5, 14, 16, 18, 30, 32, 34. W dniu 56 - zwierzęta zostały uśmiercone. Grupa doświadczalna składała się z 10 zwierząt. Reakcję układu immunologicznego analizowano pod kątem odpowiedzi humoralnej oraz komórkowej. Materiałem do badań były krew, odchody oraz tkanki zwierząt (śledziona, żołądek).

W teście ELISPOT, będącym połączeniem techniki immunoenzymatycznej fazy stałej z krótkoterminową hodowlą komórkową wykryto podwyższoną ilość cytokin (IFN-γ) wydzielanych przez splenocyty (komórki układu odpornościowego izolowane ze śledziony) myszy immunizowanych przetrwalnikami prezentującymi białko fuzyjne CoZ-UreA. Uzyskany wynik świadczy o aktywacji komórkowej odpowiedzi immunologicznej (th1). Jest to dobry prognostyk dla dalszych prac nad rozwojem szczepionki, ponieważ analiza dostępnych informacji literaturowych wskazuje, że ten typ odpowiedzi odpornościowej jest najbardziej efektywny w eliminacji patogenu.

ELISPOT

Naive

PY79

W BKH102

I mm uniżać je

Ryc. 8. Wyniki doświadczenia ELISPOT. Każdy „spot jest śladem jednej komórki wydzielającej IFN-γ w odpowiedzi na obecność antygenu. Splenocyty były izolowane z myszy nieimmunizowanych, immunizowanych przetrwalnikami typu dzikiego -168 oraz BH102 prezentującymi antygen.

PL 218 700 B1

P r z y k ł a d 3:

Przygotowanie białek fuzyjnych w oparciu o podjednostkę UreB H. acinonychis z białkami płaszcza przetrwalników oraz sprawdzenie poziomu ekspresji i obecności rekombinowanych białek na powierzchni przetrwalników.

W celu przygotowania białka fuzyjnego (CotC-UreB3) posłużono się wektorem integracyjnym pDG364 jako punktem wyjścia. Gen cotC pochodzący z B. subtilis wraz z rejonem promotorowym powielono metoda PCR przy użyciu primerów: cC-F 5'- ACC CAA GCT TTG TAG GAT AAA TCG TTT G -3' i cC-R 5'- GAT ATC GTA GTG TTT TTT ATG CTT -3'. Podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne (Hindlll i EcoRV, zaznaczone kolorem czerwonym w sekwencji primerów) które ułatwiły zarówno proces klonowania do wektorów jak i tworzenia białka fuzyjnego. Drugą składową rekombinowanego białka został fragment podjednostki UreB ureazy H. acinonyhis. Fragment genu ureB powielono metodą PCR przy użyciu primerów: uB-F 5'- GCT GGT GAT ATC GGC TTT AAA ATC CAC-3' i uB-R 5'-GCA CCT TAC TAG TAA CTT TTG TTG CTT GAG C -3'. Podczas reakcji PCR zostały wprowadzone miejsca restrykcyjne (EcoRV i Spel, zaznaczone kolorem czerwonym w sekwencji primerów) które ułatwiły fuzje genów cotC i ureB w prawidłowej ramie odczytu. Uzyskany gen fuzyjny został zsekwencjonowany, aby potwierdzić otrzymanie zaplanowanego produktu. Uzyskany plazmid niosący gen fuzyjny nazwano pKH28

Ryc. 9. Mapa wektora integracyjnych: pKH28 Ekspresję rekombinowanego genu zapewnia fizjologiczny promotor genu cotC.

1

atg M ». . ». .

ggt G

tat Y

tac Y

aaa K

aaa K

tac aaa gaa gag tat

tat Y

acg T

gtc V

aaa K

aaa K

acg T . . . > . . . >

Y

Κ Ε E . cotC-ureB3. . ....cotC.....

Y

52

tat

tat

aag

aag

tat

tac

gaa

tat gat aaa

aaa

gat

tat

gac

tgt

gat

tac

Y

Y

K

K

Y

Y

E

Y D K

K

D

Y

D

C

D

Y

>. . .

.cotC-ureB3..

. . . >

>. . .

,...cotC.....

, . . >

103

gac

aaa

aaa

tat

gat

gac

tat

gat aaa aaa

tat

tat

gat

cac

gat

aaa

aaa

D

K

K

Y

D

D

Y

D Κ K

Y

Y

D

H

D

K

K

>. . .

.cotC-ureB3..

.. . >

>.. .

....cotC.....

. , . >

154

gac

tat

gat

tat

gtt

gta

gag

tat aaa aag

cat

aaa

aaa

cac

tac

gat

atc

D

Y

D

Y

V

V

E

Y K K

H

K

K

H

Y

D

I

. cotC-ureB3. .

, . . >

PL 218 700 B1

>.......

, .»

205

aaa

tac

acc

att

aac

cca

gcg

atc gct cat

ggg

att

agc

gag

tat

gta

ggt

K

Y

T

I

N

P

A

1 A H

G

I

s

E

Y

V

G

>. . .

, cotC-ureB3. .

. . . >

>>.,

....ureB3....

. . . >

256

tct

gta

gaa

gtg

ggc

aaa

gtg

gct gac ttg

gta

ttg

tgg

agt

ccc

gca

ttc

S

V

E

V

G

K

V

A D L

V

L

w

S

P

A

F

>. ..

. cotC-ureB3. .

.. . >

>. . .

. ...ureB3... .

. . . >

307

ttt

ggc

gta

aaa

CCC

aac

atg

atc atc aaa

ggc

ggg

ttc

att

gcg

ttg

agt

F

G

V

K

P

N

M

I I K

G

G

F

I

A

L

S

>. . .

. cotC-ureB3. ,

... >

. ...ureB3... .

.. ·>

358

caa

atg

ggt

gac

gcg

aac

gct

tct atc cct

acc

cca

caa

cca

gtt

tat

tac

Q

M

G

D

A

N

A

S I P

T

P

Q

P

V

Y

Y

>. . ,

. cotC-ureB3. .

>.. .

....ureB3. .. .

409

aga

gaa

atg

ttc

gct

cat

cat

ggt aaa gcc

aaa

tac

gat

gca

aac

atc

act

R

E

M

F

A

H

H

G K A

K

Y

D

A

N

I

T

>.. .

.cotC-ureB3..

, , . >

>. . .

,...ureB3....

,. . >

460

ttt

gtg

tct

caa

gcg

gct

tat

gac aaa ggc

att

aaa

gaa

gaa

tta

ggg

ctt

F

V

s

Q

A

A

Y

D K G

I

K

E

E

L

G

L

. cotC-ureB3. .

, . . >

....ureB3....

511

gaa

aga

caa

gtg

ttg

ccg

gta

aaa aat tgc

aga

aac

atc

act

aaa

aaa

gac

E

R

Q

V

L

P

V

K N C

R

N

I

T

K

K

D

. cotC-ureB3. .

. . . >

. ...ureB3... .

. . .>

562

atg

caa

ttc

aac

gac

act

acc

gct cac att

gaa

gtc

aat

cct

gaa

act

tac

M

Q

F

N

D

T

T

A Η I

E

V

N

P

E

T

Y

, cotC-ureB3.,

—

,...ureB3.. . .

. .. >

613

cat

gtg

ttc

gtg

gat

ggc

aaa

gaa gta act

tct

aaa

cca

gcc

aat

aaa

gtg

H

V

F

V

D

G

K

E V T

S

K

P

A

N

K

V

>. . «

. cotC-ureB3..

>

664

agc

ttg

gcg

caa

ctc

ttt

agc

att ttc tag

s

L

A

Q

L

F

s

1 F -

> .............cotC-ureB3.............» > ................ureB3...............»

Ryc. 10. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa rekombinowanego genu i białka CotC-UreB3

Kolejnym krokiem była transformacja komórek B. subtilis plazmidem pKH28 zawierającym gen fuzyjny. W konsekwencji rekombinowany gen został wbudowany do chromosomu bakteryjnego w locus amyE. Uzyskany szczep nazwano BKH28.

Hodowla szczepu BKH28 została przeanalizowana w kierunku ekspresji rekombinowanego białka CotC-UreB3 przeciwciał mysich anty-UreB otrzymanych w naszym laboratorium. Obecność białka fuzyjnego została sprawdzona w ekstraktach białkowych uzyskanych z płaszcza przetrwalników

PL 218 700 B1 szczepu BKH28. Zastosowano metodę western-blotting, polegającą na wykrywaniu poszukiwanego białka związanego z błoną za pomocą przeciwciał związanych z enzymem, który przeprowadza reakcję barwną pozwalającą na jego zlokalizowanie.

anti-UreB

Ryc. 11. Western Blotting z użyciem ekstraktów białkowych uzyskanych z płaszcza przetrwalników. Naniesione próbki: 1 - 168 (szczep typu dzikiego), 2 - BKH28 (amyE:: cotC-ureB3), 3 - RH101 (cotC:: spc)

4-BKH48 (cotC:: spc, amyE:: cotC-ureB3), 4 - BKH48 (coc:: spc, amyE:: cotC-ureB3), 5 - RH209 (cotC::.spc cotU::erm), 6- BKH49 (cotC:: spc, cotU::erm, amyE:: cotC-ureB3).

Obecność rekombinowanego białka CotC-UreB3 na powierzchni przetrwalników wytworzonych przez szczep BKH28 została potwierdzona metodą immunofluorescencji (rys. 12, prawy panel).

Ryc. 12 Immunofluorescencja z użyciem przetrwalników oczyszczonych metoda płukań detergentami ze szczepu BKH28. W doświadczeniu użyto mysie l-rzędowe przeciwciała anty-UreB oraz przeciwciała II-rzędowe anty-mysz lgG-Cy3 umożliwiające ich wizualizację w mikroskopie fluorescencyjnym. Lewe zdjęcie przedstawia obraz widziany w świetle widzialnym (kontrast fazowy), prawe natomiast obraz fluorescencyjny tego samego pola widzenia.

Claims (6)

1. Doustna szczepionka zawierająca przetrwalniki Bacillus subtilis, znamienna tym, że zawiera przetrwalniki Bacillus subtilis jako nośnik antygenu, białka ureazy UreA, UreB Helicobacter pylori lub Helicobacter acinonychis jako antygen oraz białka płaszcza antygenu CotB, CotC,

CotG, CotZ.

2. Doustna szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że białka ureazy UreA i UreB, są umieszczone na powierzchni przetrwalników jako białka fuzyjne z białkami CotB, CotC,

CotG, CotZ.

3. Doustna szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że białka ureazy UreA, UreB Helicobacter pylori lub Helicobacter acinonychis stanowią jej podjednostki.

4. Zastosowanie przetrwalników Bacillus subtilis według wynalazku do wytwarzania doustnej szczepionki stosowanej do immunizacji przeciwko Helicobacter pylori u pacjentów z chorobą wrzodową żołądka i dwunastnicy.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że doustna szczepionka zawiera przetrwalniki Bacillus subtilis, białka ureazy UreA, UreB Helicobacter pylori lub Helicobacter acinonychis jako antygen oraz białka płaszcza antygenu CotB, CotC, CotG, CotZ w ilości dostosowanej do podawania w terapeutycznie skutecznej dawce.

6. Zastosowanie według zastrz. 4-5, znamienne tym, że wytwarza się doustną szczepionkę do stosowania w postaci proszku, zawiesiny i w innych formach do podawania dostosowanych do miejsca występowania bakterii Helicobacter pylori.