RO114870B1

RO114870B1 - COMPOZITII FARMACEUTICE PENTRU PREVENIREA SAU TRATAREA INFECTIEI CU Helicobacter

Info

Publication number: RO114870B1
Application number: RO94-01132A
Authority: RO
Inventors: Pierre Michetti; Andre Blum; Catherine Davin; Rainer Haas; Irene Corthesy-Theulaz; Jean Pierre Kraehenbuhl; Emilia Saraga
Original assignee: Oravax Inc
Priority date: 1992-11-03
Filing date: 1993-11-02
Publication date: 1999-08-30
Also published as: SK79394A3; IL107474A0; CZ284416B6; AU5561994A; FI943171A0; CZ160994A3; HU9402261D0; ATE217196T1; AU2003270987A1; PL304419A1; NZ258118A; AU678195C; DK0625053T3; FI112032B; JPH07503255A; FI943171A; NO942490D0; CA2127283A1; EP0625053B1; OA10087A

Description

Prezenta invenție se referă la compoziții farmaceutice pentru prevenirea sau tratarea infecției cu Helicobacter, utilizate pentru infecțiile gastrice la mamifere,dar și la oameni, cum ar fi gastrita cronică și ulcerul peptic, precum și la prevenirea cancerului gastric.

Este cunoscut că infectarea epiteliului gastric cu Helicobacter produce gastrite, care sunt un factor major al apariției ulcerelor peptice și al limfomului gastric, și pot reprezenta un risc pentru apariția cancerului gastric. Cel mai frecvent agent de infectare este Helicobacter pylori, urmat cu o frecvență mai scăzută de Helicobacter heilmariii. Helicobacter pylori este un microorganism 10 gram-negativ sub formă de S-subțire, care este identificat în mod deosebit în biopsiile gastrice ale adulților și copiilor, cu evidență histologică a gastritei sau ulcerației peptice. Dovada unei relații cauzate între Helicobacter pylori și boala ? gastroduodenală apare în studii pe pacienți umani voluntari, cu ulcere și cancer i gastric, porci gnotobiotici și rozătoare fără germeni. Cu privire la etiologie, 15 postulatele lui Koch sunt demonstrate prin apariția de gastrite confirmate histologic la indivizii neinfectați în prelabil, după consumarea de microorganisme viabile (așa cum este prezentat în literatura de specialitate), și prin tratament pentru a eradica H.pylori cu rezorbirea gastritei și, la pacienții suferinzi de ulcer peptic, cu descreșterea gradului de reapariție.

In ciuda susceptibilității in vitro la mulți agenți antimicrobieni, eradicarea in vivo a infecției cu H. Pylori stabilite este adesea dificil de realizat (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Microorganismul este găsit în stratul mucos care acoperă epiteliul gastric și în epigastru. Acestea sunt localizări care nu permit atingerea de niveluri antimicrobiene adecvate atunci 25 când antibioticele sunt administrate pe cale orală și în doze mari. In prezent, cea mai mare parte a specialiștilor recomandă o “triplă terapie”, și anume o sare de bismut și metronidazol, timp de 2...4 săptămâni. Totuși, eficacitatea acestui tratament sau a altor tratamente chimioterapeutice rămâne suboptimă. Mai mult, acest tratament produce serioase reacții adverse ale medicamen30 tului.

La ora actuală, se cunoaște puțin în ceea ce privește rolul sistemului imun a mucusului din stomac. Distribuția imunoglobulinei (Ig) care produce celule în antrumul gastric normal indică că celulele plasmatice IgA reprezintă până la 80% din totalul populației de celule plasmatice. In plus, numărul de 35 celule IgA din plasmă care sunt prezente în antrumul gastric este comparabil celorlalte membrane mucoase. Un număr de studii pe oameni și pe modele animale au demonstrat răspunsuri specifice IgG și IgA, în ser și în secrețiile gastrice la infectarea cu Helicobacter (așa cum rezultă din literatura de specialitate). Totuși, observația că infecția cu H. pylori persistă ca o infecție cronică 40 timp de mai mulți ani, în ciuda inducerii unui răspuns imun local și sistematic, nu este încurajatoare pentru dezvoltarea unei strategii de imunizare.

In literatura de specialitate s-a raportat capacitatea rozătoarelor care sunt lipsite de germeni, de a fi infectate cu Helicobacter felis, care este o bacterie înrudită foarte mult cu Helicobacter pylori, precum și date în ceea ce 45 privește reproductibilitatea histologică a gastritei. De atunci, această pereche bacterie-gazdă a fost acceptată ca un model bun pentru a se studia gastrita mediată de Helicobacter și factorii săi de inițiere (de asemenea arătat în literatura de specialitate). Tot în materialele cunoscute din stadiul tehnicii, s-a arătat că imunizarea orală repetată cu un lizat brut de H.pylori, împreună cu un

RO 114870 Bl adjuvant de toxină de holeră,induce un răspuns gastrointestinal IgA antî-H.pylori 50 viguros la șoareci și la dihori. De asemenea s-a mai arătat, în literatura de specialitate, că imunizarea orală cu un lizat burt de H.felis induce protecție împotriva infectării cu H.felis la șoareci. Natura exactă a antigenilor care sunt responsabili pentru inducerea acestei protecții nu a fost totuși determinată și nu s-a sugerat nici o informație că antigenii respectivi de H.felis care au indus 55 protecția împotriva acestui patogen ar induce o protecție încrucișată,care se extinde și la alte specii de Helicobacter.

S-a mai demonstrat, în literatura de specialitate, că H.pylori și H.felis sonichează și s-a arătat că unii dintre acești anticorpi care sunt îndreptați împotriva H.pylori vor reacționa încrucișat cu H.felis și invers. Bazele pentru 60 aceste reactivități încrucișate sunt, însă, necunoscute.

Bazat pe omologia existentă între diferite secvențe cunoscute de aminoacid ureaze, s-a propus că ureaza ar putea fi folosită ca vaccin împotriva H.pylori. Cu toate acestea, reactivitatea încrucișată nu constituie o regulă. In literatura de specialitate s-a arătat că ureazele de Proteus mirabilis, Proteus 65 vulgaris și Providencia rettgeri prezintă contra-reactivitate una față de alta, pe când ureazele de fasole soia și Morganella morganii sunt distincte din punct de vedere imunologic de cele trei ureaze precedente. Chiar dacă o reactivitate încrucișată antigenică a ureazei de H.pylori cu alte ureaze de Helicobacter a fost postulată în mod rațional, nu au existat date care să demonstreze că 70 aceasta este cu adevărat cazul până când s-a arătat că unii anticorpi monoclonali de H. felis contrareacționează Cu ureaza de H.pylori.

S-a demonstrat, în plus, că șoareci care au fost infectați cu H.felis produc anticorpi care contrareacționează cu ureaza de H.pylori, dar nu cu ureaza de fasole soia (aceste date sunt cunoscute din literatura de specialitate). 75

Utilizarea ureazei de H.pylori sau a ureazelor care sunt înrudite, drept vaccin împotriva infectării cu H.pylori a fost propusă în acest sens.

Mai mult, în timp ce omologia de secvență cu alte ureaze bacteriene ar putea sprijini utilizarea drept candidat al vaccinului împotriva infectării cu H.pylori, cunoștințele actuale ale infectării cu H.pylori umane nu presupun 80 aceasta. In primul rând, în ciuda faptului că indivizii infectați prezintă adesea un răspuns de anticorpi puternic la ureaze, răspunsul imun anti-urează nu conduce la vindecarea sau controlul vindecării. In al doilea rând, H.pylori este capabil să transporte ureaza afară din celulă și să o îndepărteze de pe suprafața sa (datele sunt cunoscute din literatura de specialitate). Astfel, ureaza poate să nu 85 reprezinte o țintă adecvată pentru dezvoltarea unui răspuns mucos protector. Intr-adevăr, protecția imună de mucoasă se crede că ar fi mediată în principal de IgA secretoriu, a cărui activitate aglutinantă ar fi diminuată atunci când antigenul recunoscut poate fi îndepărtat de patogenul țintă și prin aceasta servește drept model de momeală pentru anticorpul protector. In al treilea 90 rând, ureaza apare a fi toxică pentru celulele epiteliale în cultură și a fost suspectată că ar juca un rol în degradarea mucoasei și în ulcerația peptică in vivo. Astfel, utilizarea sa drept antigen poate fi toxică.

Cu toate acestea, s-a gândit că acest antigen poate fi un vaccin de eficiență potențială, dacă: mai întâi, va fi eliberat pe cale orală într-o doză suficient 95 de mare pentru a provoca un răspuns imun mai puternic decât cel apărut pe cale naturală; în al doilea rând, cantitatea de anticorpi produsă va fi suficient de mare pentru a lega toată ureaza eliberată sau neeliberată; în al treilea rând,

RO 114870 Bl s-ar folosi unități (de fapt, subunități) de ureaze sau specii moleculare care să nu fie toxice.

Este cunoscută, de asemenea, utilizarea a cinci gene ale ureazei de H.pylori în cadrul metodelor de diagnosticare. Se cunoaște, de asemenea, și utilizarea vaccinulu cu H.pylori în tratamentul infecțiilor cu acesta. Totuși, în acest caz, nu sunt descrise vaccinuri cu subunități H.pylori care conțin preparate de poliaminoacid care prezintă epitopi de urează Helicobacter. Nu se precizează, de asemenea, utilizarea anticorpilor monoclonal IgA împotriva Helicobacter ureazei în cadrul metodelor pasive de imunizare.

In rezumat, rămâne necesar existența unui tratament care să fie eficace în tratamentul și prevenirea infectării induse de H.pylori la oameni. Datele recente au sugerat posibilitatea de a fi generat un vaccin împotriva acestei infectări, dar nu s-a oferit o identificare clară a antigenilor definiți, care sunt comuni tuturor speciilor de H.pylori, și care pot fi încorporate într-un vaccin sigur și eficace.

Compozițiile farmaceutice pentru prevenirea sau tratarea infecției cu Helicobacter, conform invenției, sunt constituite dintr-un preparat poliaminoacid prezentând un număr suficient de epitopi prezentați de o urează endogenă la organismul Helicobacter pentru a provoca un răspuns imun protector la infectarea cu organismul respectiv în cantitate de 10 pg...1OO mg, de exemplu 50 pg...5O mg, un adjuvant de mucoasă de toxină de holeră în cantitate de 5 pg...5O pg, de exemplu 10 pg...35 pg, fosfat de calciu hi-droxilat sub formă de cristale cu dimensiunea de peste 1 pm și un purtător sau diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Preparatul respectiv cuprinde o urează intactă purificată dintr-un organism. Preparatul cuprinde peptide omoloage cu porțiuni inactive din punct de vedere enzimatic ale secvenței de aminoacid a ureazei. Preparatul respectiv cuprinde peptide neomoloage cu secvențe de aminoacid a unei ureaze și prezintă epitopi reacționând încrucișat cu ureaza. Preparatul respectiv cuprinde urează de H.pylori, cuprinde cel puțin subunități ale unei ureaze, cu sau fără activitate enzimatică. Preparatul respectiv cuprinde anticorpi anti-idiotipici ai unei ureaze, cuprinde peptide care reacționează încrucișat din punct de vedere imunologic cu ureaza. Peptidele respective sunt obținute prin sinteză chimică. Preparatul cuprinde ureaza producând antigeni, utilizând tehnici de ADN recombinant. Preparautl cuprinde fragmente subgenice de urează produse cu tehnici recombinante sau produse ca proteine fuzionate pe cale genetică. Proteinele fuzionate cuprind subunități de toxină de holeră. Fosfatul de calciu hidroxilat este hidroxiapatita, care este sub formă de particule adecvate pentru transport prin epiteliu. Pentru a conferi, la un mamifer, protecție pasivă la infectarea cu Helicobacter, compozițiile farmaceutice se administrează pe suprafața mucoasei într-o cantitate eficace din punct de vedere imunologic dintr-un anticorp IgA specific-urează produs într-o gazdă prin imunizare cu o urează care provoacă un răspuns imun protector la Helicobacter. Anticorpul respectiv este un anticorp IgA specific ureazei de Helicobacter pylori.

Avantajul prezentei invenții este acela că se obține o incidență mult redusă a infectării animalelor.

In rezumat, există necesitatea existenței unui tratament eficace, cât și de prevenire a infectării induse de H.pylori la oameni. Datele recente au sugerat posibilitatea obținerii unui vaccin împotriva acestei infectări, dar nu s-a

RO 114870 Bl prezentat o identificare clară a antigenilor definiți, care sunt comuni tuturor speciilor de H.pylori și care pot fi incorporate într-un singur vaccin care să fie eficace.

In această invenție, a fost identificat antigenul urează de H.pylori, care poate fi un posibil vaccin, și se demonstrează eficiența acestuia pe un model animal. Aceste rezultate s-au dovedit a fi neașteptat de bune în tratarea infecțiilor cu Helicobacter.

S-a descoperit că la mamiferele susceptibile de infectare gastrointestinală cu Helicobacter, imunitatea poate fi indusă prin exploatarea epitopilor de urează etalați pe/sau aproape de suprafața organismelor de Helicobacter, care sunt utilizați drept țintă a vaccinului. Imunitatea poate fi indusă prin imunizare cu ureaze naturale, dar poate fi indusă de asemenea cu subunități recombinate de urează, produse ca o formă inactivă din punct de vedere enzimatic, și prin urmare netoxică. Invenția asigură o metodă pentru inducerea imunității la infectarea cu Helicobacter, prin administrarea pe mucoasă (a unui mamifer) a unui preparat poliaminoacid, adică un amestec de peptide și/sau proteine, împreună cu un adjuvant potrivit. Acest preparat de poliaminoacid prezintă o pluralitate de epitopi caracteristici care sunt expuși de o enzimă urează endogenă infectat de organismul Helicobacter. Administrarea acestui preparat se poate face pe cale orală.

Ingredientul activ al preparatului poate cuprinde epitopi naturali sau biosintetici și poate lua diverse forme. O listă neexhaustivă de preparate posibile include preparate de ureaze apărute pe cale naturală sau produse recombinante, de origine bacteriană sau de alte origini, ureaze digerate, proteine de fuziune care conțin epitopi de urează, forme truncheate de enzimă urează, sau omologi peptidici cu secvențe de aminoacid de urează. Deoarece dezvoltarea imunității depinde de inducerea timpului de răspuns imun umoral sau celular care se leagă de organismul infecțios Helicobacter, preparatele preferate sunt cele care copiază cel mai fidel epitopii de urează endogenă față de organismul infecțios. De exemplu, preparatele care prezintă epitopii de urează de H.pylori sunt preferate pentru administrarea la oamenii sensibili la H.pylori. Totuși, conform unui aspect important al invenției, s-a descoperit că și ureaza jjin alte specii poate fi utilizată. De exemplu, s-a arătat că infectarea cu H.felis la șoareci poate fi prevenită prin administrare de H.pylori.

Conform unui aspect al invenției, este asigurată o metodă pentru a provoca la un mamifer gazdă un răspuns imun la infectarea cu Helicobacter, în care pe o suprafață de mucoasă a gazdei se administrează o cantitate eficace din punct de vedere imunologic, dintr-un antigen de urează care este capabilă să provoace un astfel de răspuns imun protector, preferabil urează de H.pylori sau subunitate B de urează de H.pylori.

Conform unui alt aspect al prezentei invenții, este asigurată o compoziție de vaccin adecvată pentru prevenirea infectării cu Helicobacter, cuprinzând o cantitate eficace dintr-un antigen de ureză, preferabil urează de H.pylori Sau subunitate B de urează de H.pylori, care este capabilă să provoace la o gazdă un răspuns imun protector la infectarea cu Helicobacter, în asociere cu un purtător sau diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

Conform unui aspect suplimentar al prezentei invenții, este prezentată o metodă care conferă unei gazde de mamifer o protecție pasivă la infectarea cu Helicobacter, cuprinzând administrarea pe suprafața de mucoasă a gazdei a

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

RO 114870 Bl unei cantități eficace din punct de vedere imunologic dintr-un anticorp specific de urează produs la o gazdă imunizată cu o urează, preferabil urează de H.pylori sau subunitate de B de H.pylori capabilă să provoace un răspuns imun la infectarea cu Helicobacter.

S-a descoperit că administrarea pe cale orală, la șoareci, a unor preparate de poliaminoacid care prezintă epitopi de urează de H.pylori dă naștere la un răspuns imunologic protector împotriva H.felis la șoareci, un model de animal de valoare generală acceptată pentru studiul răspunsului imun la infectarea cu Helicobacter (așa cum este prezentat în literatura de specialitate]. Efectul răspunsului protector imun este că animalele imunizate, atunci când sunt provocate cu patogen, au o incidență cu mult redusă a infectării, comparativ cu animalele neimunizate. Mai mult, prin prezenta invenție s-a descoperit că imunizarea orală a șoarecilor utilizând subunitatea B de urezaă de H.pylori, produsă sub forma unei proteine recombinante inactivă din punct de vedere enzimatic, dă naște re la un răspuns imunologic protector la șoareci împotriva H.felis. Efectul răspunsului imun protector este că animalele imunizate, atunci când sunt provocate cu patogen, au de asemenea o incidență cu mult redusă a infectării, comparativ cu animalele neimunizate care sunt infectate.

Astfel, într-un prim aspect, prezenta invenție asigură o metodă de provocare la un mamifer gazdă a unui răspuns imun protector pentru infectarea cu Helicobacter. Metoda cuprinde etapa administrării pe o suprafață de mucoasă a mamiferului, incluzând oamenii, a unei cantități eficace din punct de vedere imunologic dintr-un antigen urează, preferabil urează de H.pylori, capabilă să provoace un astfel de răspuns imun protector.

Intr-un al doilea aspect, prezenta invenție asigură o metodă de provocare la un mamifer gazdă a unui răspuns imun protector pentru infectarea cu Helicobacter. Metoda cuprinde etapa administrării pe o suprafață de mucoasă a animalului, inclusiv a oamenilor, a unei cantități eficace din punct de vedere imunologic dintr-un antigen subunitate B recombinantă de urează inactivă din punct de vedere imunologic, preferabil subunitate B de urează de H.pylori recombinată, care este capabilă să provoace un astfel de răspuns imun protector.

Invenția include, de asemenea, în domeniul său, tratamentul sau profilaxia la mamifere, incluzând și oamenii, a infectării cu Helicobacter, în care pe o suprafață de mucoasă a pacientului este administrată o cantitate eficientă din punct de vedere imunologic de urează sau subunitățile sale, care sunt capabile să provoace un răspuns imun protector pentru infectarea cu Helicobacter. Preferabil, ureaza este urează de H.pylori sau subunitate B de urează de H.pylori, iar ureaza poate fi administrată fie singură, fie legată cu un fosfat de calciu hidroxilat, de exemplu hidroxiapatită cu rol de particulă purtătotoare. Mai mult, se preferă administrarea ureazei H.pylori în asociere cu un adjuvant de mucoasă, cum ar fi subunitatea B de toxină de holeră, muranil dipeptidă sau alt astfel de adjuvanți.

Nefiind limitați de nici o teorie, în prezenta invenție se consideră că administrarea antigenului de urează, sau a subunității B a acesteia, pe o suprafață de mucoasă, stimulează sistemul imun mucos obișnuit și poate situsuri locale din mucoasa gastrică, incluzând un răspuns imun, deci incluzând apariția anticorpilor IgA specifici de H.pylori în secrețiile gastrice care previn infectarea cu Helicobacter. întrucât conducerea unor teste pre-clinice pentru

RO 114870 Bl un potențial vaccin de utilizare umană pe modele animale este o problemă de rutină, se consideră că metodologia prezentei invenții este eficace la oameni, în special pentru prevenirea și tratamentul ulcerelor peptice, a gastritelor, a malignozelor gastrice și a altor afecțiuni care apar ca rezultat al prezenței Hpylori și/sau H.heilmanii.

Se dau în continuare patru exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1 ... 6:

- fig. 1 reprezintă grupa A, șoareci neprotejați după imunizare cu urează; -fig.2 reprezintă grupa B, șoareci protejați după imunizare cu urează;

- fig.3 reprezintă grupa C, șoareci neprotejați după imunizare cu H.pylori sonicat;

- fig.4 reprezintă grupa D, șoareci protejați după imunizare cu H.pylori sonicat;

- fig.5 reprezintă testul Fisher, șoareci protejați, după imunizare cu H.pylori sonicat și H.pylori urează;

- fig.6 reprezintă rezultatele obținute după imunizarea orală cu subunitățile A și B de urează recombinantă.

Exemplul 1.Pentru obținerea compozițiilor farmaceutice care sunt folosite pentru prevenirea sau tratamentul infecției cu Helicobacter se asociază următoarele: 10 pg ... 100 mg (de preferat 50 pg ... 50 mg) urează endogenă la microorganismul Helicobacter,care poate provoca un răspuns imun protector la infectarea cu organismul respectiv, 5 pg ... 50 pg (de preferat 10 pg ... 35 pg) adjuvant de mucoasă de toxină de holeră, fosfat de calciu hidrolilat sub formă de cristale cu dimensiunea de peste 1 pm, precum și un purtător sau diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

Pentru obținerea și purificarea ureazei de H.pylori, imunizarea orală cu această urează și imunizarea orală cu subunități de urează recombinantă de H.pylori, se prezintă următoarele:

A - Culturi bacteriene și purificarea ureazei

Specia de H.pylori care a fost folosită în studiu provine de la un pacient cu ulcer duodenal și a fost subcultivată pe plăcuțe cu agaroză BHI, până la omogenitate. Microorganismul H.pylori este cultivat într-un mediu adecvat, do obicei mediu BHI (infuzie creier-inimă), care conține 0,25% extract de drojdie și 10% ser fetal și suplimentat cu 0,4% complement selectiv Campylobacter. Bacteriile cultivate sunt incubate peste noapte în condiții microaerofile la temperatura de 37°Cîn sticle care apoi sunt sigilate și agitate la 37°C, timp de 2 până la 3 zile, pentru a se produce o cultură lichidă. O cultură mai poate fi preparată pe plăcuțe de agaroză constând din BHI cu 0,25% extract de drojdie și 5% sânge de capră, în condiții microaerofile la 37°C și timp de 3 zile. Cantitatea de bacterii este determinată prin densitatea optică a soluției de BHI la 660 nm, cu o unitate de densitate optică care corespunde la 10⁸ bacterii. Culturile pe plăcuțe de agaroză sunt mai întâi resuspendate în 154 mm NaCI.

O sursă preferată în mod curent de poliaminoacid prezentând epitopi de urează este ureaza purificată, de exemplu urează de H.pylori obținută urmând metoda generală, care este cunoscută din literatura de specialitate și care este modificată așa cum este descris mai jos. După cultivare, H.pylori este recoltat în apă, centrifugat și din nou centrifugat pentru a produce un supernatant. Soluția care conține activitatea de urează de H.pylori (demonstrată prin testul rapid de urează, vezi mai jos) este apoi cromatografiată pe un gel schimbător

250

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 114870 Bl de anioni. Fracțiunile sunt eluate în gradient de tampon de NaCI, și fracțiunile colectate care au o puternică activitate de urează sunt supuse în mod individual pe un gel SDS, urmat de spotare Coomassie. Două benzi distincte, care corespund unei greutăți moleculare de circa 63 și circa 29 KDa, sunt identificate ca ureaze. Fracțiunile care conțin ureaze sunt colectate pentru a se obține ureaza de H.pylori purificată care are o puritate în regiunea de 95% la 99%.

B - Imunizarea orală cu urează din H.pylori purificată

Deși se preferă folosirea ureazei de H.pylori purificată, așa cum s-a descris (drept material antigenic), se înțelege că este posibil, de asemenea, să se utilizeze drept material antigenic orice urează sau subunitate de urează care este obținută fie pe cale naturală, fie prin tehnici de ADN recombinant, ca și fragmente digerate ale acestora, proteine de fuziune cuprinzând fragmente sau urează întreagă, construcții truncheate de urează sau alte preparate peptidice sau proteinice care prezintă epitopi de urează care sunt capabile să provoace un răspuns imun protector la infectarea cu H.pylori (vezi mai jos). Astfel, este posibil să fie folosită urează având o omologie substanțială cu ureaza de H.pylori și care este eficace în provocarea unui răspuns imun contra protector la Helicobacter. Un exemplu de astfel de urează este ureaza de fasole soia care posedă circa 70% omologie cu ureaza de H.pylori. Prin urmare, invenția nu se limitează la utilizarea ureazei intacte, ci acoperă utilizarea oricărui preparat poliaminoacid care prezintă epitopi de urează și este eficace pentru a genera un răspuns imunologic protector la o gazdă cu infecție Helicobacter. In mod tipic, o urează care are o omologie de 70 ... 95%, de exmeplu 80 ... 90%, față de ureaza de H.pylori poate fi folosită drept antigen urează în prezenta invenție.

□ listă nelimitativă de surse de preparate de ureaze potențiale include enzimele ureazice endogene din diferite specii de Helicobacter, ureaze din alte bacterii, cum ar fi Klebsiella pneumoniae sau Proteus mirabilis, și,prin analogie, orice altă urează cu condiția ca aceste ureaze să conțină epitopi cu reactivitate încrucișată cu ureaza de H.pylori. Genele ureazice din toate organismele menționate mai sus reprezintă o posibilitate potențială pentru exprimarea produselor recombinante ureazice ca o proteină integrală sau ca o parte a acesteia.

O listă nelimitativă, de preparate de urează potențial utile, include peptide generate din ureaze purificate (sursele sunt menționate mai sus), utilizând proceduri de scindare fizică și/sau chimică (adică CnBr) și/sau scindare proteolitică (utilizând proteaze, de exmeplu protează-V8, tripsină sau altele), sau peptide sintetizate pe cale chimică și împărtășind epitopi consecutivi cu ureaza.

Alte surse de epitopi utili în mod potențial includ epitopi identificați prin reactivitatea lor încrucișată cu ureaza, ca rezultat al testării cu anticorpi antiurează. Aceste peptide pot fi peptide de origină naturală sau peptide rezultate prin sinteză chimică. Mai mult, astfel de peptide pot rezulta din exprimarea oligonucleotidelor recombinante întâmplătoare.

Altă sursă de epitopi cu potențială utilitate include epitopi similari ureazei ca rezultat al generării anticorpilor anti-idiotipici la urează. Astfel de anticorpi anti-idiotipici, generați de orice gazdă imunocompetentă, sunt obținuți prin imunizarea acestei gazde cu anticorpi anti-urează,cu scopul de a genera anticorpi direcționați împotriva anticorpilor anti-urează, care împărtășesc aceeași omologie cu ureaza.

RO 114870 Bl

345

Cele prezentate mai sus se axează pe utilizarea ureazelor produse pe cale naturală de H.pylori (secțiunea B). Totuși, se va aprecia că ureaza sau subunitățile sau constructele acesteia menționate mai sus, capabile să producă răspunsul imun protector dorit, poate fi produsă prin tehnici de ADN recombinant care sunt bine cunoscute în domeniul de specialitate. Eficacitatea unor anumite preparate poate fi determinată prin administrarea obișnuită, utiluzând modele animale, administrarea orală a potențialului vaccin și provocarea cu patogen utilizând un protocol, în principiu similar sau identic procedeului descris mai jos.

Tabelele 1 și 2 care vor fi prezentate în cele ce urmează și fig.1 ... 5 descriu rezultatele obținute atunci când șoarecii sunt imunizați pe cale orală cu urează H.pylori purificată. In acest prim experiment, administrarea de antigen Hpylori este realizată prin administrarea orală la șoareci a ureazei H.pylori purificată, așa cum se descrie în secțiunea A, și cuplată cu cristale de hidroxiapatită care este utilizată drept purtător pentru a mări legarea de celule M și preluarea. Toxina de holeră este folosită ca adjuvant de mucoasă. In acest experiment, grupe de femele de șoareci SPF BALB/c cu vârstă de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală, cu 30 pg urează H.pylori purificată cuplată cu 1 mg hidroxiapatită și cu 10 pg adjuvant toxină de holeră, în zilele O, 7, 14 și 21. Șoarecii sunt supuși solicitării cu 1O^B H.fells, de două ori, în zilele 28 și 30. Pentru comparație, femele similare de șoareci SPF BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală cu lizat integral de H.pylori'(sonicat] și 10 pg toxină de holeră în zilele O, 7, 14 și 21. Șoarecii sunt provocați în zilele 28 și 30 cu H.felis. Sonicatul de H.pylori se prepară prin colectarea H.pylori din culturi celulare, peletizate prin centrifugare și resuspendare a paletei în soluție 0,9% clorură de sodiu, urmată de sonicare.

Drept control se folosesc femele de șoareci SPF BALB/c de șase săptămâni cu pseudo-imunizare cu 10 pg toxină de holeră și 1 mg hidroxiapatită în zilele O, 7, 14 și 21. Toți șoarecii sunt adăpostiți, imunizați și stimulați în paralel. Toți șoarecii care sunt supuși studiulu sunt sacrificați în ziua 35.

C - Imunizarea orală cu subunități de urează reocmbinantă din H.pylori

Genele care codifică subunitățile A și B de urează de H.pylori sunt obținute prin reacția în lanț a polimerazei (PCR), donând conform procedurilor standard, bazat pe secvențele publicate în prealabil (așa cum este prezentat în literatura de specialitate). Aceste gene sunt inserate într-un vector (numit pEV40) desemnat pentru exprimarea înaltă și purificarea ușoară a genelor străine în E.coli. Pe scurt, gena străină este inserată în partea inferioară a unui promotor termo-reprimabil și în rama unei secvențe care codifică o repetare a șase histidine. Pe acest vector este prezentată o genă ampR pentru selctarea transformanților. In condiții adecvate de temperatură, proteina reocmbinantă obținută este suplimentată cu șase histidine la N-terminal, ceea ce permite o purificare de afinitate într-o etapă pe o coloană de nichel. Ambele subunități A și B de urează recombinantă din H.pylori sunt exprimate separat în E.coli și sunt purificate pe o coloană de nichel până la o puritate de 95%.

Deși se preferă folosirea drept material antigenic a ureazei recombinante de H.pylori obținută așa cum s-a descris mai sus, se va înțelege că este de asemenea posibil să se utilizeze drept material antigenic orice urează sau subunitate de urează obținută prin tehnici recombinante (de exemplu, proteină de fuziune) care exprimă situsurile antigenice de urează, care este capabilă să

350

355

360

365

370

375

380

385

390

RO 114870 Bl provoace un răspuns imun protector la infecția cu Helicobacter. Astfel, este posibil ca într-un construct să fie folosită o genă de urează având o omologie substanțială față de ureaza de H.pylori și care este eficace pentru provocarea unui răspuns imun protector la Helicobacter. Exemple de astfel de ureaze sunt ureaza de fasole soia care posedă circa 70% omologie cu ureaza de H,.pylori, sau urează de H.felis care posedă circa 88% omologie cu ureaza de H.pylori. Prin urmare, invenția nu se limitează la utilizarea genelor de urează de H.pylori și a produșilor de genă, și acoperă utilizarea oricărei ureaze recombinante sau a subunităților acesteia, care este eficace pentru a genera un răspuns imunologic protector la o gazdă la infectarea cu Helicobacter. In mod obișnuit, drept antigen de urează recombinantă în prezenta invenție poate fi folosită o urează recombinantă având o omologie de 70 ... 95%, de exemplu 80 ... 90% omologie față de urează de H.pylori.

Cele prezentate în invenția de față sunt îndreptate asupra utilizării subunităților A și B de urează de H.pylori produse de E.coli (secțiunea C). Totuși, se va aprecia că ureaza recombinantă sau subunitățile sau constructele sale menționate mai sus, care sunt capabile să provoace răspunsul imun protector, pot fi produse utilizând alte tehnici recombinante și alți vectori de exprimare a eucariotelor sau procariotelor care sunt bine cunoscute în domeniu.

Tabelele 3, 4 și 5 care vor fi prezentate în continuare și fig.6 descriu rezultatele obținute atunci când șoarecii sunt imunizați pe cale orală cu subunități de urează de H.pylori produse în E.coli. In acest experiment, administrarea antigenului de H.pylori se realizează prin administrarea pe cale orală la șoareci, a subunităților A și B de urează H.pylori produse în E.coli și purificate, așa cum s-a descris mai sus, și cuplate cu cristale de hidroxiapatită care este utilizată drept purtător pentru a mări legarea de celulă M și preluarea.

Toxina de holeră este administrată ca adjuvant pentru mucoasă. In acest experiment, grupe de femele de șoareci SPF BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate fiecare, pe cale orală cu 30 pg de subunitate A și B de urează H.pylori cuplată cu 1 mg hidroxiapatită, plus 10 pg adjuvant toxină holeră, în zilele O, 8, 14 și 21. In continuare, șoarecii sunt provocați de trei ori cu 10⁸H.felisîn zilele 32 și 34 și 36. Pentru scopuri comparative, femele similare de șoareci SPF BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală cu 30 pg de subunitate B de urează de H.pylori cuplată cu hidroxiapatită, plus 10 pg toxină de holeră, în zilele □, 8, 14 și 21. Șoarecii sunt provocați de trei ori, în zilele 32, 34 și 36 cu H.felis. Drept control, femelele de șoareci SPF BALB/c de șase săptămâni sunt fiecare pseudo-imunizate pe cale orală cu 10 pg de toxină de holeră și 1 mg hidroxiapatită în zilele O, 8, 14 și 21. Șoarecii sunt provocați în zilele 32, 34 și 36 cu H.felix. Toți șoarecii sunt supuși studiului, imunizați și provocați paralel. Animalele sunt sacrificate în ziua 48 (la 1 2 zile de la provocare) sau la 10 săptămâni de la provocare.

Se preiau biopsii din stomac și se obține sânge din inimă.

Intestinele sunt îndepărtate și sunt spălate cu 1 mM PMSF în tampon PBS, pentru a se obține secreții intestinale pentru analiza ELISA.

Pentru a evalua protecția împotriva clonizării cu H.felis, biopsiile gastrice de la fiecare animal sunt testate pentru determinarea prezenței de H.felis ,prin determinarea activității rapide a ureazei prin testul Jatrox, care este cunoscut în domeniul de specialitate. Pe scurt, biopsiile gastrice sunt imersate în 0,5 ml

RO 114870 Bl amestec care conține uree și roșu de fenol ca indicator de pH. Activitatea ureazei generează amoniac și bicarbonat de uree și este urmată de schimbarea colorimetrică a soluției către o absorbanță înaltă la 550 nm. Activitatea ureazei se determină cantitativ prin analiză spectrofotomemtrică.

Biopsiile gastrice ale fiecărui animal inclus în experimentul descris în secțiunea B sunt cultivate pe plăcuțe BHI pe agaroză, suplimentate ca mai sus, pentru detectarea H.felis. După incubare, timp de la 3 până la 10 zile, în condiții de microaerofilie, prezența H.felis este confirmată prin spotare Gram și determinare a activității ureazei. Deoarece s-a obținut o corelație foarte semnificativă pentru detectarea culturilor de H.felis în timpul primului set de experimente (vezi tabelul 3], pentru detectarea de H.felisîn experimentul descris în secțiunea C au fost conduse numai testele de urează din biopsiile optice. Detectarea de H.felis a fost confirmată prin microscopie de către doi investigatori independenți, utilizând doi coloranți diferiți (portocaliu acridină și violet erezii).

Probele de sânge au fost lăsate să coaguleze timp de trei ore la temperatura camerei, se recoltează serul și apoi se îngheață la temperatura de 2O°C, până se efectuează analiza. Secrețiile intestinale sunt agitate timp de 5 min la temperatura de 4°C,pentru a îndepărta resturile, și sunt păstrate în stare de congelare la temperatura de -2O°C. Serul și probele intestinale ale fiecărui animal se analizează prin metoda ELISA pentru evaluarea activității antiHelicobacter, conform procedurilor standard. Pe scurt, plăcuțe cu 96 adâncuri sunt acoperite cu un sonicat de H.pylori, urmat de saturarea cu 5% lapte degresat. Probele sunt diluate în serie de la 1 : 1 la 1 : 1D00 și sunt incubate peste noapte la temperatura de 4°C pe plăcuțe ELISA. Pentru determinarea nivelurilor de anticorp se utilizează ser anti-șoarece IgG și anti-șoarece IgA biotinilat, urmat de peroxidază din hrean-streptavidin.

Rezultatele provocării cu H.felis de după imunizări cu urează din H.pylori purificată sunt prezentate în tabelele 1...3 și fig. 1...4, iar rezultatele provocărilor cu H.felis de după imunizare cu subunități A și B de urează recombinantă de H.pylori sunt prezentate în tabelele 4... 6 și fig. 5 și 6.

445

450

455

460

465

470

Tabelul 1

Șoarece număr	Imunizare	Urează test (12 h)	Cultură Gram	Imunologlobuline
Ser	Secreție intestinală
•g	IgG	ig	IgA
1	2	3	4	5	6	7	8
1.	Urează + HF	+	H. felis	27	0	25	258
2.	Urează + HF	0	0	264	273	221	246
3.	Urează + HF	0	0	84	44	318	354
4.	Urează + HF	+	H. Felis	81	42	12	5
5.	Urează + HF	0	0	98	137	126	234
6.	Urează + HF	+	0	968	2093	31	22

475

480

RO 114870 Bl

485

Tabelul 1 (continuare)

490

495

500

505

7,	Urează + HF	0	0	98	0	96	34
8.	Urează + HF	0	0	247	1010	214	128
9.	Urează + HF	0	0	N.D	N.D	48	23
10.	Urează + HF	0	0	50	0	124	99
11.	Urează	0	0	319	205	44	53
12.	Urează	0	0	14	0	86	87
13.	Urează	0	0	0	0	0	0
14.	Urează	0	0	0	0	43	61
15.	Urează	0	0	58	0	110	127
16.	Urează	0	0	140	63	21	37
17.	Urează	0	0	84	240	114	280
18.	Urează	0	0	N.D	N.D	93	148
19.	Urează	0	0	45	0	135	216
20.	Urează	0	0	261	197	161	261
21.	CT+HF	0	0	0	0	0	2
22.	CT+HF	+	H.felis	63	0	310	303
23.	CT+HF	+	H.felis	90	0	N.D	N.D.
24.	CT+HF	+	H.felis	31	0	150	192
25	CT+HF	+	H.felis	197	250	250	440
26.	CT+HF	+	H.felis	105	135	214	138
27.	CT+HF	+	H.felis	140	47	109	...55
28	CT+HF	+	0	0	0	16	15
29	CT+HF	+	H.felis	0	0	0	0
30.	CT+HF	+	H.felis	N.D	N.D	N.D	N.D
31.	HP sonicat+HF	+	H.felis	0	0	76	103
32.	HP sonicat+HF	+	H.felis	77	0	1 1	33
33	HP sonicat+HF	+	H.felis	549	748	57	36
34.	HP sonicat+HF	0	0	660	153	180	286

510

RO 114870 Bl

Tabelul 1 [continuare]

515

35.	HP sonicat+HF	+	H.felis	730	192	0	5
36.	HP sonicat+HF	+	H.felis	32	□	5	64
37.	HP sonicat+HF	O	□	400	400	312	1149
38.	HP sonicat+HF	+	H.felis	1007	1360	149	26
39.	HP sonicat+HF	□	0	220	186	133	122
40.	HP sonicat	□	□	873	1016	352	514
41.	HP sonicat	□	□	727	899	126	191
42.	HP sonicat	□	□	109	68	44	83
43.	HP sonicat	□	□	147	949	167	97
44.	HP sonicat	□	0	845	1094	246	64
45.	HP sonicat	□	□	1217	1198	210	157
46.	HP sonicat	□	□	81	0	256	218
47.	HP sonicat	□	□	329	210	241	276
48.	HP sonicat	□	□	1049	737	197	211

520

525

530

In tabelul 1, care se referă la experimentul descris în secțiunea B, “h” înseamnă ore, “Ig” înseamnă imunoglobulină, “ND” înseamnă nedeterminat, “urează + HF înseamnă că șoarecii au fost imunizați cu urează cuplată cu hidroxiapatită și toxină de holeră și apoi provocați cu H.felis, “urează” înseamnă că șoarecii au fost imunizați cu urează (cuplată la hidroxiapatită, cu toxină de holeră) și neprovocați, “CT+HF” înseamnă că șoarecii sunt pseudo-imunizați cu toxină de holeră și provocați cu H.felis, ΉΡ senicat +HFînseamnă că șoarecii sunt imunizați cu sonicat de H.pylori cu toxină de holeră și sunt provocați cu H.felis, și “HP sonicat” înseamnă că șoarecii sunt imunizați cu sonicat de H.pylori cu toxină de holeră și nu sunt provocați.

In tabelul 1, numerele pentru rezultatele de anticorp sunt date ca o măsură a absorbției la 595 nm multiplicată cu 1000. Baza măsurată în absența anticorpilor se extrage.

Rezultatele experimentului descris în secțiunea B, pe baza testelor de urează din biopsiile gastrice și a spotării Gram a culturilor de H.felis sunt prezentate în tabelul 2. Infectarea este definită de șoareci cu unul sau mai mulți markeri de colonizare de către H.felis, incluzând testul de urează sau spotarea Gram a culturilor.

535

540

545

RO 114870 Bl

55Q

Tabelul 2

555

560

565

570

575

580

585

590

Imunizare	Provocare	% Infectare	%Protecție
Urează	H.felis	3/10(30%)	7/10(70%)⁺
Sonicat	H.felis	6/9(66%)	3/9(33%)⁺⁺
CT	H.felis	9/10(90%)	1/10(10%)

+ p = 0,0198 (testul Fisher exact cu două cozi] comparat cu controlul CT ++p = 0,303 [testul Fisher exact cu două cozi) comparat cu controlul CT

Din rezultatele prezentate în tabelele 1 și 2 se observă că prin imunizarea pe cale orală utilizând urează H.pylori, se obține o protecție semnificativă din punct de vedere static împotriva H.felis, comparativ cu cea obținută utilizând fie sonicat de H.pylori sau toxină de holeră. Atunci când se face referire la tabelul 2, se observă că din totalul de 10 animale imunizate, numai 3 sunt infectate, comparativ cu cele 6 animale imunizate cu sonicat de H.pylori și cu cele 9 animale imunizate cu toxină de holeră.

Tabelul 2 arată că 70% dintre animale sunt protejate de infectarea cu H.felis, comparativ cu 33% din animalele imunizate cu sonicat de H.pylori și 10% dintre animalele imunizate cu toxină de holeră și apoi supuse provocării cu H.felis. Cu alte cuvinte, 90% din șoarecii de control expuși la H.felis devin infectați cu agentul patogen, pe când în contrast, la șoarecii imunizați cu urează de H.pylori cu 28 de zile înainte de expunere la H.felis procentul este de numai 30%. Aceasta reprezintă o reducere semnificativă a infecției [p = 0,0198 în testul Fisher exact, comparativ cu șoarecii de control.]. Atunci când șoarecii sunt imunizați pe cale orală cu sonicat de H.pylori, rata infectării este de 67% (nesemnificativ față de control]. Protecția obținută utilizând urează de H.pylori este neașteptată și poate să nu fie prezisă pe baza rezultatelor observate atunci când se utilizează sonicat de H.pylori.

Referitor la fig. 1 ... 4, fig. 1 reprezintă în mod grafic rezultatele testelor pentru anticorpi în ser (IgG) și secreție intestinală (IgH) la șoarecii neprotejați după imunizarea cu urează. Aceștia sunt șoarecii cu numerele 1,4 și 6 care sunt prezentați în tabelul 1 și constituie grupa A. Fig. 2 arată răspunsurile anticorp al șoarecilor care au fost protejați după imunizarea cu urează (Grupa

B] , adică șoarecii 2, 3, 5 și 7 și șoarecii 7 ... 10 din tabelul 1. Fig. 3 și 4 se refe ră la rezultatele obținute cu șoarecii cu numerele 31 ... 39. Fig.3 (Grupa

C] reprezintă răspunsurile anticorp ale șoarecilor neprotejați după imunizare cu sonicat de H.pylori (șoarecii cu numerele 31, 32, 33, 35, 36 și 38). Fig. 4 (Grupa D) reprezintă răspunsurile anticorp ale șoarecilor protejați după imunizare cu sonicat de H.pylori (șoarecii cu numerele 34, 37 și 39). Este de interes să se arate cu referire la fig.3 și 4, că răspunsurile anticorp IgA (dar nu IgG) sunt mai mari la șoarecii care prezintă protecție, decât la șoarecii care nu sunt protejați, aceasta sugerând o corelație între protecție și răspunsul IgA. Răspunsurile serului IgG nu prezintă o corelare. IgA mucus, dar nu și anticorpii IgG din ser sunt cunoscuți ca jucând un rol de protecție împotriva infectărilor bacteriale ale intestinelor.

Rezultatele corelației între detectarea H.felis în biopsiile gastrice prin testul de urează și prin culturi sunt prezentate în tabelul 3 care urmează.

595

RO 114870 Bl

Tabelul 3

600

	Test urează+	Test urează-	Total
Cultură de H.felis+	16	0	16
Cultură de H.felis-	2	30	32
Total	18	30	48

Testul Fisher exact cu două cozi p < 0,0001

Tabelul 3 ara tă că există o corelație foarte semnificativă între rezultatele testelor de urează realizate pe biopsiile gastrice și identificarea infecțiilor cu H.felis, decât testele de urează; testele de urează au fost preferate pentru diagnosticarea infectării cu H.felis la șoareci în experimentele următoare, datorită sensibilității sale mai bune. Această abordare permite duplicarea testelor de urează cu fragmente mai mari ale stomacului fiecărui șoarece, și o creștere suplimentară a sensibilității testulu de urează. Mai mult, utilizarea metodei cu cea mai mare sensibilitate previne o supraestimare a protecției obținute cu ajutorul preparatului de vaccin de testat. Atunci când se utilizează o cultură pozitivă drept standard pentru infectare, protecția indusă după imunizare cu urează în timpul experimentului descris în secțiunea B, este la fel de semnificativ ca și pentru utilizarea combinată a testului de urează și a culturii [p = 0,021 față de 0,019).

Rezultatele experimentelor descrise în secțiunea C (subunități recombinante de urează), obținute pe baza testului de urează la biopsiile gastrice, sunt prezentate în tabelul 4, 5 și 6 și sunt reprezentate în fig.6.

605

610

615

620

Tabelul 4

Imunizare	Nr. Șoareci	Test urează	Infectare
(D	(2)	(3)	(4)
CT	20	0,49	+
	21	0,31	+ '
	22	0,62	+
	23	0,67	+
	24	0,55	+
	50	0,50	+
	51	0,37	+
	52	0,29	+
	53	0,79	+
	54	0,32	+
ureA+HAP+CT	40	0,67	+
	41	0,48	+

625

630

635

RO 114870 Bl

Tabelul 4 [continuare]

640

645

650

655

660

	42	0,42	+
	43	0,65	+
	44	0,56	+
	45	0,52	+
	46	0,33	+
	47	0,63	+
	48	0,22	+
	49	0,37	+
ureB+HAP+CP	25	0,15
	26	0,07	-
	27	0,03	-
	28	0,64	+
	29	0,13	-
	30	0,02	-
	31	0,66	+
	32	0,00	-
ureA+HAP+CT	68	0,00
	69	0,07	-
	70	0,42	-
	71	0,00	-
	72	0,00	-
ureB+HAP+CT	73	0,37	+
	74	0,00	-
	75	0,37	+
	76	0,00	-
	77	0,00	-
	78	0,00	-
	79	0,39	+
	80	0,00	-
	81	0,37	+
	⁸²	0,00	-

665

RO 114870 Bl

In tabelul 4 de mai sus, “CT” înseamnă toxină de holeră, “ureA” înseamnă subunitate A de urează de H.pylori recombinantă, “ureB” înseamnă subunitate B de urează de H.pylori recombinantă și “HAP” înseamnă cristale de hidroxiapatită.

Șoarecii 20 la 54 sunt sacrificați în zilele 1 2 după provocare și șoarecii de 68 la 82 sunt sacrificați la 10 săptămâni (106 zile) după provocare. Rezultatele testului de urează, realizate din biopsiile de stomac ale fiecărui animal, sunt exprimate ca valori OD la 550 nm. Semnele pozitive și negative reprezintă stadiul final al infectării fiecărui animal, conform testului de pozivitate sau negativitate al ureazei pentru detectarea H.felis. Pozitivitatea OD 550 valori > 0,2.

Tabelul 5

670

675

680

Protecția la 12 zile după provocare

Imunizare	Provocare	% Infectat	%Protejat
Subunitate A a ureazei	H. felis	10/10(%)	0/10(%)
Subunitate B a ureazei	H. felis	3/10(30%)	7/1O(7O%)⁺
CT	H. felis	10/10(100%)	0/10(%)

+) p = 0,0031 (testul Fisher exact, cu două cozi) comparativ cu controlul CT

685

690

Tabelul 6

Protecția măsurată la 10 săptămâni după provocare

Imunizare	Provocare	%lnfectat	%Protejat
Subunitate A a ureazei	H. felis	1 /5 (20%)	4/5(80%)⁺
Subunitate B a ureazei	H. felis	4/10(40%)	6/10(60%)⁺⁺

+) p = 0,003 (testul Fisher exact, cu două cozi) comparativ cu controlul CT ++) p = 0,01 (testul Fieher exact, cu două cozi) comparativ cu controlul CT

695

Din rezultatele prezentate în tabelele 4, 5 și 6 se poate constata că se obține o protecție semnificativă din punct de vedere statistic împotriva provocării H.felis prin imunizare orală, utilizând subunitate B de urează de H.pylori recombinantă în comparație cu cea obținută utilizând fie subunitate A de H.pylori recombinantă sau toxină de holeră. Referitor la tabelul 4, se poate constata că la 12 zile după provocare, din totalul de 10 animale imunizate numai 3 sunt găsite infectate în grupe cu subunitate B de urează, comparativ cu toate cele 10 animale imunizate cu subunitate A de urează de H.pylori și cu 10 din 10 animale imunizate cu toxină de holeră. Tabelul 4 arată că 70% din animale sunt protejate împotriva H.felis, comparativ cu 0% din animalele imunizate cu subunitate A de urează de H.pylori și 0% din animalele imunizate cu toxină de holeră și supuse apoi provocării cu H.felis. Cu alte cuvinte, 100% din șoarecii de control provocați cu H.felis devin infectați, pe când în contrast, la șoarecii imunizați cu subunitate B de urează de H.pylori recombinantă rata infectării este numai de 30%. Aceasta reprezintă o reducere semnificativă a infectării /p=0,0031, testul Fisher exact), comparativ cu șoarecii de control.

De fapt, pe baza experimentului de față efectuat cu urează purificată de H.pylori, este neașteptat faptul că protecția cu urează H.pylori este conferită în întregime de imunizarea cu subunitate B a ureazei și că subunitatea A a

700

705

710

715

RO 114870 Bl ureazei nu are un astfel de efect. Prin urmare, această definiție a rolurilor celor două subunități structurale de urează în dezvoltarea unui răspuns imun protector este nouă. Protecția obținută, utilizând subunitate B de urează recombinantă, care este inactivă din punct de vedere enzimatic, indică de asemenea că formele netoxice ale ureazei pot fi utilizate drept vaccin oral împotriva infectării cu Helicobacter. Mai mult, aceste teste sugerează că recunoașterea situsului activ nu este necesară pentru protecție, deoarece o subunitate B de urează inactivă este improbabil să inducă anticorpi care vor recunoaște și inhiba situsul catalitic al ureazei native.

Referitor la tabelul 6, se constată că atunci când șoarecii sunt sacrificați la 10 săptămâni după infectare, 60% (6 din 10 șoareci) din animalele imunizate cu subunitate B de urează și 80% (4 din 5 șoareci) din animalele imunizate cu subunitate A de urează de H.pylori sunt protejate împotriva infectării cu H.felis. Faptul că protecția obținută prin imunizare cu subunitate B de urează durează în timp și că imunizarea cu urează A induce o protecție care este dezlocuită comparativ cu cea indusă cu subunitatea B de urează, este neașteptat din experimentul de față cu urează purificată sau cu alte experimente realizate mai înainte. Faptul că imunizarea cu subunitate B de urează conferă protecție, dovedește în mod sigur că recunoașterea situsului activ nu este necesară pentru protecție. Fig.6 rezumă rezultatele obținute după imunizarea orală cu subunitățile A și B de urează recombinantă (descrise în tabelul 5 și 6).

Prezenta invenție asigură, de asemenea, compoziții de vaccin adecvate pentru prevenirea infectării cu Helicobacter. Compoziția cuprinde o cantitate eficace dintr-un antigen urează, preferabil urează de H.pylori sau subunități recombinante de urează de H.pylori, capabile să producă la o gazdă un răspuns imun protector la infectarea cu Helicobacter, în asociație cu un purtător sau diluant care este acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

Vaccinurile din invenția de față sunt administrate în cantități ușor de determinat și de către un specialist în domeniu. Astfel, pentru adulți o doză adecvată va fi în intervalul de 10 pg până la 100 mg, de exmeplu 50 pg până la 50 mg. Intervale similare de dozare vor fi aplicabile și pentru copii. Sistemul purtător, la oameni poate include capsule cu eliberare enterică.care protejează antigenul de mediu acid din stomac, și incluzând antigen urează într-o formă insolubilă ca proteine de fuziune. Vaccinul poate fi administrat ca agent profilactic primar la adulți sau la copii, ca prevenție secundară, după eradicarea cu succes a H.pylori la o gazdă infectată sau ca agent terapeutic cu dorința de a induce un răspuns imun la o gazdă, susceptibil de a contribui la eradicarea de H.pylori.

Așa cum s-a arătat mai sus, un adjuvant adecvat pentru mucoasă este toxina de holeră. Alți adjuvanți de mucoasă care pot fi utilizați sunt muramil dipeptidă sau derivații săi, derivați netoxici de toxină de holeră incluzând subunitatea sa B și/sau conjugate sau fuzionate care sunt obținute pe cale genetică a antigenului.plus toxină de holeră sau subunitatea B. Alte metode potrivite de eliberare includ microcapsule biodegradabile sau complecși stimulanți imuni (ISCQM’S) sau lipozomi, reactori cu activitate atenuată obținuți pe cale genetică, cum ar fi viruși sau bacterii, și particule de tip-virus recombinant (himeric), de exemplu “bluetongue”. Cantitatea de adjuvant mucos care este folosită depinde de tipul de adjuvant mucos care este utilizat. De exemplu, când adjuvantul

RO 114870 Bl

765 mucos este toxina de holeră, este potrivit să fie utilizat într-o cantitate de 5 pg, de exmeplu 10 pg până la 35 pg. Atunci când se utilizează sub formă de microcapsule, cantitatea utilizată va depinde de cantitatea folosită în matricea microcapsulei pentru a realiza dozarea care este dorită. Determinarea acestei cantități este la îndemâna specialistului din domeniu. Portători adecvați pentru vaccinurile din prezenta invenție sunt capsulele acoperite și microsfere de poliactid-glicolidă. Diluanți adecvați sunt NaCHQ₃ D,2N și/sau saramura.

Fosfatul de calciu hidroxilat sub formă de particule (HOP) este deosebit de util ca drept purtător pentru ureaza de H.pylori și pentru aplicare pe suprafețele mucoase. Se crede că, conjugatul urează H.pylori-fosfat de calciu hidroxilat este transportat prin epiteliu și dă naștere la un răspuns imun poli-lg. Preferabil, fosfatul de calciu hidroxilat este sub formă de microparticule adecvate pentru transportul prin epiteliu, în particular de către celule specializate în acest scop (celulele M). 0 formă preferată de fosfat de calciu hidroxilat este hidroxiapatita, un fosfat de calciu hidroxilat alcalin accesibil comercial Ca_1o(PO₄)₆.(OH) ₂

Hidroxiapatita care este accesibilă industrial constă în general din cristale sub formă de lamele care sunt analoage din punct de vedere chimic și fizic cu hidroxiapatita anorganică din țesutul osos normal. Prin urmare, ingerarea de hidroxiapatită ar trebui să fie neprimejdioasă, lucru care este evidențiat prin existența suplimentelor nutriționale calciu/fosfor derivate din oase măcinate, care sunt destinate ingerării. Hidroxiapatita comercială de puritate mare, așa cum se găsește în comerț, constă din cristale care au dimensiuni variabile. Cristalele cu dimensiuni de peste 1 pm în lungime este puțin probabil să fie luate de celulele M. Prin urmare, pentru utilizarea acesteia în conformitate cu prezenta invenție, cristalele comerciale de hidroxiapatită sunt sparte în fragmente mici cristaline, care sunt relativ uniforme, obținute de exemplu prin sonicare. Este de preferat o proporție substanțială a hidroxiapatitei ca fragmente de circa 0,01 ... 0,0 pm. Fragmentarea poate fi măsurată fie prin microscopie electronică, fie prin dispersie cu lumină, utilizând tehnici standard.

Modurile preferate de administrare a antigenului de urează de H.pylori sunt pe cale orală, nazală, rectală și oculară. Administrarea orală poate asigura eliberarea și altor mucoase G.I., incluzând mucoasa intestinală.

Vaccinurile din prezenta invenție pot fi administrate pe o suprafață de mucoasă sub formă de aerosol, suspensie, capsulă și/sau supozitor. Metoda de administrare va fi evidentă pentru un specialist care lucrează în domeniul respectiv.

Prezenta invenție mai include imunizarea pasivă a mamiferelor, incluzând și oamenii, împotriva infectării cu Helicobacter. Aceasta se realizează prin administrarea pe o mucoasă a unui pacient a unei cantități eficiente de anticorp specific ureazei, preferabil o cantitate eficientă dintr-un anticorp monoclonal IgA specific ureazei de H.pylori.

întrucât se arată că ureaza de H.pylori reprezintă antigenul implicat în inducerea imunității protectoare, un alt aspect al invenției este reprezentat de utilizarea ureazei de H.pyloricu rol de diagnosticare, pentru a măsura răspunsul imun al unei persoane care a primit un vaccin bazat pe urează sau pentru a determina dacă un individ este imun sau susceptibil (și prin urmare are nevoie de vaccinare). Prezenta invenție include, de asemenea, utilizarea ureazei și a anticorpilor specifici ureazei pentru a efectua teste și truse de diagnostic pentru

770

775

780

785

790

795

800

805

810

RO 114870 Bl imunitatea la Helicobacter, determinarea susceptibilității la Helicobacter și definirii răspunsului imun la vaccinuri.

Pentru aplicarea celor prezentate mai sus, se ara tă și următoarele:

a) Speciile bacteriene - H.felis a fost furnizat din sectorul medical, iar H.pylori a fost izolat de la pacienții cu boală ulceroasă.

b) Culturi bacteriene

Cultura lichidă - bacteriile sunt cultivate pe mediu lichid BHI (InfuzieCreier-lnimă), care conține 0,25% extract de drojdie și 10% ser fetal de vițel suplimentat cu 0,4% complement selectat Campylobacter. Bacteriile sunt incubate peste noapte în condiții microfilice la temperatura de 37°C și apoi sunt agitate timp de 2... 3 zile, tot la temperatura de 37°C.

Cultura pe plăcuțe de agazoră - bacteriile sunt cultivate pe plăcuțe de agar constând din BHI care conține 0,25% extract de drojdie și 5% sânge de oase, în condiții microfilice la 37°C și timp de 3 zile.

Deschiderea cantitativă - cantitatea de bacterii se determină prin densitatea optică a soluției de BHI la 660 nm (o unitate de densitate optică corespunzând la 10^s bacterii).

c) Prepararea sonicatelor

Bacteria H.pylori se colectează de pe 31 de plăcuțe agar cu sânge în NaCI 0,1 5 M și se centrifughează timp de 5 min la 1400 x g, la temperatura de 4°C. Paleta obținută se resuspendă în 3 ml NaCI și se sonichează timp de 4 min. Cantitatea de proteine se evaluează printr-un test Bradford (care este cunoscut din literatura de specialitate).

d) Cuplarea imunoqenului la hidroxiapatită

Imunogenul (urează sau o subunitate a acesteia) se incubează timp de 1 oră la temperatura de 4°C cu hidroxiapaptită. Se utilizează 1,0 mg hidroxiapatită pentru 30 pg imunogen pe șoarece. La sfârșitul incubării se adaugă 10 pg de toxină de holeră, într-un volum final de 200 pl PBS.

Exemplul 2.a] Extracția - H.pylori din 30 plăcuțe de agar cu sânge se recoltează în 0,15 M NaCI pe gheață. Soluția se centrifughează timp de 5 min la 1400 x g și la temperatura de 4°C. Paleta obținută se resuspendă în 20 ml H₂0 și se centrifughează timp de 45 sec (la viteză maximă). Extractul obținut se centrifughează timp de 20 min la 6700 rotații și la temperatura de 37°C. Se recuperează supernatantul și se evaluează cantitatea de proteină (vezi, Determinarea cantitativă de mai sus) și se precipită cu sulfat de amoniu de concentrație 70%.

b) Purificarea ureazei - Soluția se cromatografiază pe o coloană Sepharose CL-6B cu PBS (saramură tamponată cu fosfat) ca fază mobilă. Cele 22 de fracțiuni colectate, care prezintă o activitate ureazică puternică, se reunesc și se dializează peste noapte la temperatura de 4°C contra a 3 I PEB (tampon fosfat 20 nM, pH 7) și apoi se cromatografiază pe Sepharose Q cu curgere rapidă, cu PEB ca fază mobilă.

Fracțiunile se eluează cu gradient de la O la 500 de NaCI. Zece din fracțiunile colectate, cu activitate ureazică puternică, sunt supuse în mod individual unui gel SDA urmat de spotare Coomassie. Cele 6 fracțiuni prezentând două benzi distincte corespunzând la MW - 63 și -28 KDa sunt reunite și sunt considerate ca fiind urează purificată.

Exemplul 3 (vezi de asemenea secțiunea B).

Șoarecii folosiți în studiile de imunizare sunt anesteziați ușor cu eter

RO 114870 Bl înainte de imunizarea intragastrică. Apoi preparatul sonicat sau ureaza purificată, hidroxiapatita și toxina de holeră se suspendă în PBS, și 2OO pl se introduc în stomacul șoarecilor respectivi folosind un tub de polietilenă atașat la seringa hipodermică. La această procedură, se face referire când se vorbește de imunizarea orală.

Trei protocoale de imunizare au fost evaluate. Acestea sunt descrise în cele ce urmează.

Protocolul Β_ή - Vaccinare cu urează purificată femele de șoarece BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală cu 30 pg urează de H.pylori purificată și 1 mg de hidroxiapatită și 10 pg de toxină de holeră, în zilele O, 7, 14 și 21. Zece șoareci sunt provocați în zilele 28 și 30 cu 5 x 10⁷ și 10⁸ H.felis din cultura lichidă.

Protocolul B₂ - Vaccinare cu sonicate de Helicobacter femele de șoareci BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală cu 2 mg soluție de H.pylori sonicat, în zilele O, 7, 14 și 21. Zeci șoareci sunt provocați în zilele 28 și 30 cu 5 x 10⁷ și 10^θ H.felis.

Protocolul B - Control femele de șoareci BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală cu 1 mg hidroxiapatită și 10 pg toxină de holeră în zilele O, 7, 14 și 21. Șoarecii sunt provocați în zilele 28 și 30 cu 5 x 10⁷ și 10^B H.felis.

In ziua 35, șoarecii sunt sacrificați și din stomacul lor, ca și din secrețiile intestinale și sânge se fac biopsii.

Pentru a evalua protecția, biopsiile sunt testate pentru activitatea ureazei prin testul Jetrox HP, conform instrucțiunilor furnizorului. Ureaza este determinată cantitativ prin măsurarea spectrofotometrică la 550 nm. Biopsiile sunt cultivate, de asemenea, în prezența H.felis și se estimează prin spotare Gram. Biopsiile gastrice antrale sunt omogenizate și diluate (1:10 și 1:1000) în NaCI 0,15 IVI și sunt întinse pe plăcuțe de agar-sânge și incubate în condiții microfilice la temperatura de 37°C timp de 4 la 10 zile.

ELISA - Secrețiile intestinale și sângele se analizează prin metoda ELISA, pentru evaluarea titrului anticorpului. Metoda ELISA se realizează după cum urmează: Plăcuțe din polistiren cu 96 adâncituri sunt acoperite cu 1 pg/adâncitură urează purificată la 37°C timp de 2 h. Situsurile nespecifice de legare se blochează cu pulbere de lapte 5% în PBC, 0,1%Tween, la temperatura de 37°C timp de 30 min. Plăcuțele se spală o dată cu PBS 0,1% Tween. Probele de sânge se testează la diluție 1:100 și secrețiile intestinale 1:1. In continuare, 100 pl din fiecare probă se adaugă la plăcuțele acoperite cu antigen. După două ore de incubare, plăcuțele se spală de trei cu PBS 0,1 Tween. Se adaugă 100 pl anticorp integral biotinilat anti-șoarece de la capră și IgA, IgG și IgG biotinilat anti-șoarece la diluții 1:500, cu excepția IgA (1:250) și se incubează la 37°C timp de 1 h.

Plăcuțele sunt spălate de 3 ori cu PBS 0,1% Tween și se adaugă 100 pl streptavidin peroxidază de hrean 1: 1000 în PBS 0,1% Tween și se incubează la 37°C timp de 30 min. Plăcuțele se spală de 3 ori și se adaugă 50 pl Ofenildiamină în tampon citrat pH=5, 1pl/ml în H₂0₂ 30% și se incubează la temperatura camerei timp de 20 min. In fiecare adâncitură se măsoară absorbția la 495 nm

Exemplul 4 (vezi de asemenea secțiunea C).

Șoarecii folosiți în testele de imunizare sunt ușor anesteziați cu eter,

865

870

875

880

885

890

895

900

905

910

RO 114870 Bl

915

920

925

930

935

940

945

950 înainte de imunizarea intragastrică. In continuare, 30 pg subunități A și B de urează recombinantă de H.pylori produsă în E.coli, legată la hidroxiapatită și suplimentată cu toxină de holeră, se suspendă în PBS și 200 pl se eliberează în stomacul șoarecilor respectivi, utilizând un tub de polietilenă atașat la o seringă hipodermică. In această procedură, se va face referire ca la imunizarea orală.

Au fost evaluate trei protocoale de imunizare orală. Acestea sunt descrise în cele ce urmează:

Protocolul C-! - Vaccinare cu subunitate A de urează recombinantă femele de șoareci BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală cu 30 pg subunitate A de urează recombinantă de H.pylori și 1 mg hidroxiapatită și 10 pg toxină de holeră, în zilele O, 8, 14 și 21. Zece șoareci sunt provocați în zilele 32, 34 și 36 cu 10⁸ H.felis din cultura lichidă.

Protocolul C₂ - Vaccinare cu subunitate B de urează recombinantă femele de șoareci BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate cu 30 pg de subunitate B de urează recombinantă de H.pylori, 1 mg de hidroxiapatită și 10 pg de toxină de holeră în zilele O, 8, 14 și 21. Zece șoareci sunt provocați în zilele 32, 34 și 36 cu 10⁸ H.felis din cultura lichidă.

Protocolul C - Control femele șoareci BALB/c de șase săptămâni sunt imunizate pe cale orală cu 1 mg hidroxiapatită și 10 pg toxină de holeră în zilele O, 8, 14 și 21. Șoarecii sunt provocați, în zilele 32, 34 și 36 cu 10⁸ H.felis. In ziua 42 sau în ziua 106, șoarecii sunt sacrificați și sunt luate biopsii multiple din stomac.

Protecție și evaluare:

Pentru a evalua protecția, biopsiile de corp și antrum de stomac sunt testate pentru activitatea ureazei, prin testul Jatrox HP, conform instrucțiunilor furnizorului.Ureaza este determinată cantitativ prin măsurători spectrofotometrice la 550 nm.

Titrul valorilor OD ale corpului și antrumului sunt adiționate pentru a se obține o valoare OD finală pentru fiecare șoarece.

Claims

Revendicări

1. Compoziții farmaceutice pentru prevenirea sau tratarea infecției cu Helicobacter, caracterizate prin aceea că sunt constituite dintr-un preparat poliaminoacid prezentând un număr suficient de epitopi prezentați de o urează endogenă la organismul Helicobacter, pentru a provoca un răspuns imun protector la infectarea cu organismul respectiv în cantitate de 10 pg ... 100 mg, de exemplu 50 pg ... 50 mg, un adjuvant de mucoasă de toxină de holeră în cantitate de 5 pg ... 50 pg, de exemplu 10 pg ... 35 pg, fosfat de calciu hidroxilat sub formă de cristale cu dimensiunea de peste 1 pm și un purtător sau diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
2. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde o urează intactă, purificată dintr-un organism.
3. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde peptide omoloage cu porțiuni inactive din punct de vedere enzimatic ale secvenței de aminoacid a ureazei.
4. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin

955

RO 114870 Bl aceea că preparatul respectiv cuprinde peptide neomoloage cu secvențe de aminoacid a unei ureaze și prezintă epitopi reacționând încrucișat cu ureaza.
5. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde urează de H.pylori.
6. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde cel puțin subunități ale unei ureaze, cu sau fără activitate enzimatică.
7. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde anticorpi anti-idiotipici ai unei ureaze.
8. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde peptide care reacționează încrucișat din punct de vedere imunologic cu ureaza.
9. Compoziții farmaceutice, conform revendicărilor 3 și 4, caracterizate prin aceea că peptidele respective sunt obținute prin sinteză chimică.
10. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde ureaza producând antigeni, utilizând tehnici ADN recombinant.
11. Compoziții farmaceutice, conform revenidicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde fragmente subgenice de urează produse cu tehnici recombinante.
12. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că preparatul respectiv cuprinde fragmente subgenice de urează produse ca proteine fuzionate pe cale genetică.
13. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 12, caracterizate prin aceea că respectivele proteine fuzionate cuprind subunități de toxină de holeră.
14. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că respectivul fosfat de calciu hidroxilat este hidroxiapatita.
1 5. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că hidroxiapatita este sub formă de particule adecvate pentru transport prin epiteliu.
16. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că, pentru conferirea la un mamifer a unei protecții pasive la infectarea cu Helicobacter, se administrează pe suprafața mucoasei a mamiferului respectiv o cantitate eficace din punct de vedere imunologic dintr-un anticorp IgA specific-urează produs într-o gazdă prin imunizare cu o urează,care provoacă un răspuns imun protector la Helicobacter.
17. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 16, caracterizate prin aceea că anticorpul respectiv este un anticorp IgA specific ureazei de Helicobacter pylori.
18. Compoziții farmaceutice, conform revendicării 17, caracterizate prin aceea că mamiferul respectiv este omul.