CN103097399A - 用于去除生物膜的组合物及方法 - Google Patents

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史蒂文·D·古德曼
劳伦·O·巴凯勒特兹
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University of Southern California USC
Research Institute at Nationwide Childrens Hospital
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Abstract

本发明提供了用于给患有慢性/复发性生物膜疾病的个体接种疫苗或用于治疗现有感染患者的分离或重组的多肽。所述个体免疫系统随后将天然产生通过干扰功能保护性生物膜的构建和/或保持以预防或清除来自宿主的细菌的抗体。或者，可施用所述多肽的抗体以治疗或预防感染。不能形成功能性生物膜的细菌比较容易被宿主免疫系统的其余部分清除。

Description

用于去除生物膜的组合物及方法
关联申请的交叉引用
本申请主张享有美国法典第35篇第119(e)条（35 U.S.C.§119(e)）下的2010年3月29日提交的美国临时申请61/318,743、2010年5月21日提交的美国临时申请61/347,362、2010年6月16日提交的美国临时申请61/397,891以及2011年3月21日提交的美国临时申请61/454,972的权益，每件申请的内容在此通过引用整体并入本发明。
政府支持的声明
本发明是在由美国国立卫生院的国立牙科和颅面研究所(NIDCR)获得的合同号为5R01DE013230的政府支持下完成的。政府在本发明中享有一定的权益。
技术领域
本发明主要涉及以减少和/或治愈临床或工业细菌生物膜的方法和组合物。
背景技术
哺乳动物体内生物膜中存在的细菌引发了约三分之二的慢性/复发性疾病。这些生物膜由被外部“粘液”保护的细菌组成，所述粘液通常主要由DNA组成，其阻碍天然免疫及获得性免疫系统、抗生素和其它抗菌剂从获取入口到达所述生物膜内细菌，使得从机体清除所述感染十分困难。此外，所述生物膜可作为未来的通常具有致死后果的急性感染的储存器。
已发现DNABII家族蛋白中的至少一种蛋白在所有已知真细菌中存在，并被发现自然存在于所述细菌细胞的外部。当它们引起强烈的天然免疫反应时，其感染结果是宿主个体不能自然产生针对家族成员的特异性抗体。细菌生物膜带来的主要问题是宿主免疫系统和/或抗生素及其它抗菌剂无法获得接近所述生物膜内受保护的细菌的途径。
生物膜也存在于工业环境中。例如，生物膜广泛影响了从生产领域到加油站储罐的石油处理问题。在该领域，硫酸盐还原生物膜细菌产生硫化氢（酸性油）。在生产管道中，生物膜活性产生了阻塞滤器及管口的粘液。生物膜及生物膜有机体也引起了管道及石油处理设备的腐蚀。这些问题可出现于整个石油或天然气生产设备，直至在终产物储存罐表面也发现污染和腐蚀性生物膜有机体的地步。
在家庭中，生物膜被发现存在于支持微生物生长的物体内或任意表面上，如谷物内、食品表面、卫生间内以及游泳池和温泉中。
生物膜广泛影响了家庭以及工业的水处理。它们能够生长在处理设备表面并妨碍该设备的性能，如热传导的降低或堵塞过滤器和膜。生长在冷却塔填料上的生物膜可以增加足够的重量以引起所述填料的塌陷。生物膜甚至引起高度专化不锈钢的腐蚀。水处理中的生物膜可降低终产品的价值，如造纸过程中的生物膜污染或硅芯片上甚至单个细胞的接触。生长在饮用水配送系统中的生物膜可以藏匿降低水质的潜在病原微生物、腐蚀性微生物或细菌。
因此，存在突破生物膜的保护性屏障以治疗或杀死相关细菌感染并将其从表面及水系统中清除出去的需要。本发明满足了这一需要并且还提供了相关的优点。
序列表
Seq.ID NO.1
A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9
其中:
A1是V或者I;
A2是K,Q,E,A,V或Y中任意一个;
A3是K,L,I,V或F中任意一个;
A4是S,I，R或V中任意一个;
A5是G或S;
A6是F;
A7是G;
A8是N或S或T或K;以及
A9是F.
Seq.ID NO.2是VKKSGFGNF
SEQ ID NO.3是B1-B2-B3-B4-B5-B5-B6-B7
其中:
B1缺失或是G或K;
B2缺失或是R,I或K中任意一个;
B3是N或V；
B4是P或I;
B5是K,Q,S或G中任意一个;
B6是T，K或S中任意一个;以及
B7是G，K,Q或D中任意一个.
Seq.ID NO.4是NP(K/Q)TG
Seq.ID NO.5GRNP(K/Q)TG
Seq.ID NO.6全长野生型(wt)86-028NP流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)IhfA;Genbank登录号:AAX88425.1,最后获取时间2011年3月21日:
MATITKLDIIEYLSDKYHLSK
QDTKNVVENFLEEIRLSLESGQDVKLSGFGNFELRDKSSRPGRNPKTGDVVPVSAR
RVVTFKPGQKLRARVEKTK
Seq.ID NO.7全长野生型(wt)86-028NP流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)HU,Genbank登录号:YP_248142.1,最后获取时间2011年3月21日:
MRFVTIFINHAFNSSQVRLSFAQFLR
QIRKDTFKE SNFLFNRRYKFMNKTDLIDAIANAAELNKKQAKAALEATLDAITASL
KEGEPVQLIGFGTFKVNERAARTGRNPQTGAEIQIAASKVPAFVSGKALKDAIK
Seq.ID NO.8全长野生型R2846流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)IhfA,Genbank登录号:ADO96375,最后获取时间2011年3月21日:
MATITKLDIIEYLSDKYHLSKQDTKNVVENFL
EEIRLSLESGQDVKLSGFGNFELRDKSSRPGRNPKTGDVVPVSARRVVTFKPGQKL
RARVEKTK
Seq.ID NO.9全长野生型Rd流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)IhfA;Genbank登录号:AAC22959.1,最后获取时间2011年3月21日:
MATITKLDIIEYLSDKYHLSKQDTK
NVVENFLEEIRLSLESGQDVKLSGFGNFELRDKSSRPGRNPKTGDVVPVSARRVVT
FKPGQKLRARVEKTK;
Seq.ID NO.10全长野生型大肠杆菌(E.coli)K12株系IhfA;Genbank登录号:AAC74782.1,最后获取时间2011年3月21日:
MALTKAEMSEYLFDKLGLSKRDAKELVELFFE
EIRRALENGEQVKLSGFGNFDLRDKNQRPGRNPKTGEDIPITARRVVT
FRPGQKLKSRVENASPKDE;DNA Genbank号.NC_000913
Seq.ID NO.11全长野生型铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PA 01株系IhfA;Genbank登录号:AAG06126.1,最后获取时间2011年3月21日:
MGALTKAEIAERLYEELGLNKREA
KELVELFFEEIRQALEHNEQVKLSGFGNFDLRDKRQRPGRNPKTGEEIPITARRVV
TFRPGQKLKARVEAYAGTKS
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SEQ ID NO.28:大肠杆菌(E.coli)hupA,Genbank登录号:AP_003818,最后获取时间2011年3月21日:
MNKTQLIDVIAEKAELSKTQAKAALESTLAAITESLKEGDAVQLVGFGTFK
VNHRAERTGRNPQTGKEIKIAAANVPAFVSGKALKDAVK
SEQ ID NO.29:大肠杆菌(E.coli)hupB,Genbank登录号:AP_001090.1,最后获取时间2011年3月21日:
MNKSQLIDKIAAGADISKAAAGRALDAIIASVTE SLKEGDDVALVGFG
TFAVKERAARTGRNPQTGKEITIAAAKVPSFRAGKALKDAVN
SEQ ID NOS.30和31:SEQ ID NO.28的β-3和α-3部分,SEQ ID NO.30:AFVSGK以及SEQ ID NO.31:ALKDAVK
SEQ ID NOS.32和33:SEQ ID NO.29的β-3和α-3部分,SEQ ID NO.32:SFRAGK以及SEQ ID NO.33:ALKDAVN
SEQ.ID NO.34:IHF αC末端的20个氨基酸:TFRPGQKLKSRVENASPKDE
SEQ.ID NO.35:IHF βC末端的20个氨基酸:KYVPHFKPGKELRDRANIYG
SEQ.ID NO.36:DNABII结合共有序列:WATCAANNNNTTR其中W是A或T，N是任意碱基并且R是嘌呤
SEQ.ID NO.337:大肠杆菌(E.coli)IHFα:GRNPKTGEDIPI
SEQ.ID NO.338:大肠杆菌(E.coli)IHFβ:GRNPKTGDKVEL
SEQ.ID NO.339:大肠杆菌(E.coli)HUα:GRNPQTGKEIKI
SEQ.ID NO.340:大肠杆菌(E.coli)HUβ:GRNPQTGKEITI
表格说明
表1-5是指定生物体内生物膜逆转的体外生物测试的结果。
表6是化脓性中耳炎(OM)南美栗鼠模型(Chinchilla model)的中耳内生物质相对量的计分方案。
表7是经DNA酶处理的生物膜逆转的体外生物测试的结果。
表8是可用于本发明所提供方法的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌所产生的DNA结合蛋白的非限制性汇总。
表9A是本发明各个实施例的DNA结合蛋白的相关部分的序列比对。粗体字母表示共有序列的精确匹配，浅灰色的字母表示保守氨基酸变化，并且浅色阴影或深色阴影序列是不同物种间高度保守的。氨基端和/或羧基端的灰色阴影不明确序列是不具有共有序列的不明确氨基酸。表9A是基于先前Obeto等人1994年发表于Biochimie 76:901-908的信息。表9B是16氨基酸肽基序与Liu等人2008年发表于Cell Microbiol.10(1):262-276的比较。
表10是来源于指定生物体DNABII蛋白的α、β以及C末端部分的列表。
发明内容
在细菌细胞内，DNABII蛋白是通过结合弯曲DNA底物所需的DNA结合蛋白。相似地，已处于弯曲构型的DNA是优选底物，因为不需要弯曲所需的能量。
DNABII蛋白家族被发现存在于生物膜状态的细菌细胞之外。申请人展示了这些蛋白质实际上在关键分支节点结合细胞外DNA。一方面，申请人展示了通过可产生特异性抗体的多肽和蛋白质免疫所述宿主，基于DNA的晶格充分改变从而允许宿主免疫系统清除所述生物膜。
申请人还通过以DNABII家族成员(E.coli整合宿主因子,IHF)免疫的各种模型证明了南美栗鼠宿主中耳内预先形成的未分型流感嗜血杆菌生物膜的清除。这种南美栗鼠中耳生物膜动物系统作为人中耳炎（或中耳感染）的优秀模型已是得到充分证明的。
应用这种技术的方法是直截了当的。在一个具体实施方式中，本发明所述多肽用于免疫个体作为对慢性/复发性生物膜疾病的预防或作为那些已被感染个体的治疗。所述个体的免疫系统将随之天然地产生通过干扰功能保护性生物膜构建和或保持以从所述宿主预防或清除所述细菌的抗体。或者，可施用所述多肽的抗体以治疗或预防感染。不能形成功能性生物膜的细菌更容易被宿主免疫系统的其余部分所清除。
因此，本发明一个方面提供了一种用于抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白结合微生物DNA的方法，通过包含或主要包括，或者还进一步包括DNABII多肽或蛋白或微生物DNA与干扰剂相接触，从而抑制、竞争或中和DNABII蛋白质或多肽结合微生物DNA。所述接触可在体外或体内进行。
在本发明的另一方面，提供了一种用于抑制、预防或分解微生物生物膜的方法，包括或可选地主要包括，或者还进一步包括所述生物膜与干扰剂相接触，从而抑制、预防或分解所述微生物生物膜。所述接触可在体外或体内进行。
在本发明的又一方面，提供了一种在受试者中抑制、预防或分解微生物生物膜的方法，包括或可选地主要包括，或者还进一步包括给所述受试者施用有效量的干扰剂，从而抑制、预防或分解所述微生物生物膜。
在本发明的又一方面，提供了一种用于抑制、预防或治疗在受试者中产生生物膜的微生物感染的方法。所述方法包括或可选地主要包括，或者还进一步包括给所述受试者施用有效量的干扰剂，从而抑制、预防或治疗在受试者中产生生物膜的微生物感染。
对于本文所述的方法，任何可干扰或阻碍微生物DNA结合所述DNABII蛋白或多肽的制剂均在本发明的范围内。干扰剂的非限制性实例包括：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)与整合宿主因子竞争性结合微生物DNA的多肽或多核苷酸；
(g)类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；
(h)编码(a)至(f)中任意一项的分离或重组的多核苷酸，或SEQ ID NO.36的分离或重组的多核苷酸或其等价物，或在严格条件下与所述多核苷酸杂交的多核苷酸、其等价物或互补分子；
(i)特异性识别或结合(a)至(f)中任一项的抗体或抗原结合片段，或其每种抗体或抗原结合片段的等价物或片段；
(j)编码(i)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸或其互补分子；或
(k)与DNABII蛋白或多肽竞争性结合微生物DNA的小分子。
本发明还提供了一种在有需要的受试者体内诱导免疫反应或赋予被动免疫的方法，包括或可选地主要包括，或者还进一步包括给所述受试者施用有效剂量的一种或多种选自下述组的试剂：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)编码(a)至(f)中任意一种的分离或重组的多核苷酸，或SEQ ID NO.36的分离或重组的多核苷酸或其等价物，或在严格条件下与所述多核苷酸杂交的多核苷酸、其等价物或互补分子；
(g)特异性识别或结合(a)至(e)中任一项的抗体或抗原结合片段，或其等价物或片段；
(h)编码(g)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸。
(i)以(a)至(e)中任意一项冲击的抗原呈递细胞；以及
(j)以编码(a)至(e)中任意一项的一个或多个多核苷酸转化的抗原呈递细胞。
有所述免疫应答需要的受试者包括具有产生微生物生物膜感染的风险或痛苦的那些人。
本发明还提供了用于上述方法的组合物，其非限制性实例在下面讨论。
一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或者基本由选自SEQ ID NO.1-5或12-27、30-35、101-340或图6所确定的DNA结合肽或者其片段或等价物的氨基酸序列组成。
另一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.1或2，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.3、4或5，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
另一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.12、14、16、18、20、22、24、26、30或32，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.13、15、17、19、21、23、25、27、31或33，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.337、338、339或340，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.12和13、或14和15、或16和17、或18和19、或20和21、或22和23、或24和25、或26和27、或30和31、或32和33，条件是所述多肽不是SEQ IDNO.6-11、28、29或42-100。
一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括包含有DNABII多肽、IHF多肽、HU多肽、SEQ ID NO.6-11、28、29或者表8、表10所确定的那些多肽或其片段或等价物的至少10个、或可选地至少15个、或可选地至少20个、或可选地至少25个、或可选地至少30个C末端氨基酸的C末端区域。
在一个方面，提供了下述组的分离或重组的多肽：
具有SEQ ID NO.12和13的多肽；
具有SEQ ID NO.14和15的多肽；
具有SEQ ID NO.16和17的多肽；
具有SEQ ID NO.18和19的多肽；
具有SEQ ID NO.20和21的多肽；
具有SEQ ID NO.23和24的多肽；
具有SEQ ID NO.25和26的多肽；
具有SEQ ID NO.30和31的多肽；
具有SEQ ID NO.32和33的多肽；
具有SEQ ID NO.34和35的多肽；
具有SEQ ID NO.337和338的多肽；或
具有SEQ ID NO.339和340的多肽；
条件是所述多肽不是IHFα、IHF β或SEQ ID NO.6至11、28、29，或42至100中任意一个的野生型。
在一个方面，提供了下述组的分离或重组的多肽：
基本由SEQ ID NO.12和13组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.14和15组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.16和17组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.18和19组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.20和21组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.23和24组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.25和26组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.30和31组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.32和33组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.34和35组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.337和338组成的多肽；或
基本由SEQ ID NO.339和340组成的多肽；
条件是所述多肽不是IHFα、IHF β或SEQ ID NO.6至11、28、29，或42至100中任意一个的野生型。
本发明还提供了分离或重组的多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括两个或以上、或者三个或以上、或者四个或以上、或多个上述确定的分离多肽，包括其片段和等价物。所述分离多肽的例子包括SEQ ID NO.1-4和/或12-29、和/或30-33、和/或30-35，例如SEQ ID NO.1和2，或者可选择地1和3或可选择地1和4，或者可选择地2和3，或者可选择地SEQ ID NO.1、2和3或可选择地2、3和4，或者可选择地1、3和4或多肽等价物，这些例子如表9所示。所述多肽可以是任意方向的，例如SEQID NO.1、2和3或SEQ ID NO.3、2和1或可选择地SEQ ID NO.2、1和3，或者可选择地3、1和2，或者可选择地11和12，或者可选择地1和12，或者可选择地2和12，或者可选择地，1和12，或者可选择地2和13，或者可选择地12、16和1，或者可选择地1、16和12。
另一方面，本发明提供了分离或重组的多肽，包括SEQ ID NO.1或2以及3或4，或者一种多肽或重组多肽，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括相当于DNABII蛋白片段例如流感嗜血杆菌IHFα或IHFβ微生物的β-3和/或α-3片段的氨基酸，非限制性的例子包括SEQ ID NO.12-27，或者所述多肽的片段或等价物，其实例如表9所示。一方面，分离的野生型多肽被明确排除，例如所述多肽不是SEQ ID NO.6-11或表8所确定的野生型序列中的任何一个。在这个具体实施方式中，SEQ ID NO.1或2、或者包括或可选地主要包括或者还进一步包括相当于IHFα或IHFβ微生物β-3和/或α-3片段的氨基酸的多肽，位于SEQ ID NO.3或4或者其片段或等价物的上游或氨基末端，所述多肽的非限制性例子包括SEQ ID NO.12-27以及30-33或其等价物。另一方面，所述分离的多肽包括SEQ ID NO.3或4、或者包括或可选地主要包括或者还进一步包括相当于IHFα或IHFβ微生物β-3和/或α-3片段的氨基酸的多肽，非限制性的例子包括SEQID NO.12-27或其等价物，其位于SEQ ID.NO.1或2或其等价物的上游或氨基末端。
在上述任一个具体实施方式中，可在所述多肽、其片段或等价物的N末端或C末端添加肽接头。一方面，所述接头连接本发明的多肽，例如SEQ ID NO.1-4、28、29、34，或35或30-33、34，或35或包括或可选地主要包括或者还进一步包括相当于流感嗜血杆菌IHFα或IHFβ微生物β-3和/或α-3片段的氨基酸的多肽，所述多肽的非限制性的例子包括SEQ ID NO.12-27或其等价物。“接头”或“肽接头”指的是连接多肽序列的N末端或C末端的肽序列。一方面，所述接头为约1个至约20个氨基酸残基长度，或者可选择地2至约10个、约3个至约5个氨基酸残基长度。肽接头的一个例子是Gly-Pro-Ser-Leu-Lys-Leu(SEQ ID NO:37)。
本发明进一步提供了上述确定的任意一种多肽的分离或重组多肽、以及包括或可选地主要包括或者还进一步包括两个或多个上述确定的分离或重组多肽的分离或重组多肽的片段或等价物。
本发明还进一步提供了一种干扰微生物DNA与多肽或其片段或等价物结合的多核苷酸，例如SEQ ID 36，或类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；编码上述多肽或其抗体或片段的分离或重组的多核苷酸，其可选择性连接所述多核苷酸表达和/或复制所必需的调控元件。所述多核苷酸可被包含于载体内。
本发明还提供了一种分离的宿主细胞，其包括或可选地主要包括或者还进一步包括上述的分离或重组的多肽、类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸、类似复制叉的三路交叉多核苷酸、具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；如上所述的分离或重组的多核苷酸，或如上所述的载体。
一方面，所述细胞是包含所述分离或重组多肽的分离的抗原呈递细胞。另一方面，所述多肽是存在于所述细胞如树突状细胞表面的。另一方面，所述抗原呈递细胞以一个或多个编码所述多肽的多核苷酸转染。
本发明还进一步提供了特异性识别和结合上述分离或重组多肽、包括其片段或等价物的抗体或抗原结合片段。抗体的非限制性例子包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人源抗体、抗体衍生物、镶嵌抗体(a veneered antibody)、双抗体、嵌合抗体、抗体衍生物、重组人源抗体或抗体片段。在一个特定的方面，所述抗体是单克隆抗体。本发明还进一步提供了产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明还提供了编码一种或多种上述确定的分离或重组多肽或其抗体或片段的分离或重组的多核苷酸。还进一步提供了包含所述分离的多核苷酸的载体。一方面，当本发明的分离多肽不止一种时，所述分离的多核苷酸可被包含于一个多顺反子载体内。
本发明进一步提供了本文所述的包含一个或多个分离或重组多肽、或者分离或重组多核苷酸或所述载体的分离的宿主细胞。在一个方面，所述分离的宿主细胞是原核细胞或诸如抗原呈递细胞的真核细胞，例如树突状细胞。
所述多核苷酸、多肽、抗体、抗原结合片段、载体或宿主细胞可进一步包含可检测标签。
本发明还提供了包含运载体以及一个或多个本发明的分离或重组的多肽、本发明的分离或重组的多核苷酸、本发明的载体、本发明的分离的宿主细胞、或所述具体实施方式的抗体的组合物。所述运载体可以是一个或多个固体支持物、医疗器械如支架或牙植入体、或诸如药学上可接受运载体的液体。所述组合物可进一步包含佐剂、抗菌剂或抗原肽。
所述组合物可进一步包含其它生物活性成分。一个非限制性的例子是抗菌剂诸如其它免疫成分(即抗原肽)如表面抗原，例如OMP P5、rsPilA、OMP 26、OMP P2或IV型菌毛蛋白(参见Jurcisek和Bakaletz(2007)J.of Bacteriology 189(10):3868-3875以及Murphy,TF,Bakaletz,LO和Smeesters,PR(2009)The Pediatric Infectious DiseaseJournal,28:S121-S126)以及抗菌剂。
本发明还提供了一种通过在有利于所述多核苷酸表达的条件下生长或培养宿主细胞以产生抗原肽的方法，所述宿主细胞包含编码上述抗原肽的分离的多核苷酸。经该方法产生的多肽可分离出来用于进一步的体外或体内应用。
本发明还提供了一种用于诊断或治疗用途的试剂盒，其包含上述的组合物以及使用说明。本发明还提供了一种用于筛选新药物和/或如本文所提供的联合治疗的试剂盒。
附图说明
图1A是通过NTHI株系86-028NP在南美栗鼠中耳内形成并标记NTHI Tfp菌毛蛋白(在该图的背景下显示为白色或浅灰色斑点和小团)、以及以DAPI标记双链DNA(dsDNA)(在该图的前景下显示为深灰色的重叠链以及具有间歇性团块的成束物质)的生物膜。该图是从Jurcisek和Bakaletz(2007)J.of Bacteriology 189(10):3868-3875转载而来。图1B是来源于具有囊性纤维化的儿童的肺脏支气管肺泡灌洗液(BAL)的免疫标记。具有囊性纤维化的儿童的肺脏经由BAL冲洗，并且所述洗液中的颗粒物经冷冻并附着在玻片上用于免疫标记。所述冷冻的颗粒物以抗IHF抗体免疫标记。人囊性纤维化患者生物膜内IHF阳性灶的存在充分体现了人囊性纤维化的病因包括在双链DNA(dsDNA)顶点具有IHF的生物膜。图1C显示了鼻窦手术时从人鼻窦收集并嵌入OCT(最适切割温度介质，可从Fisher Scientific商购获得，商品目录号14-373-65)冷冻液的分泌物。切割10μm的冷冻分泌物并以抗IHF标记（显示为灰色团簇）。所述样品中dsDNA以荧光染色剂DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,从Invitrogen商购获得)染色。鼻窦炎患者生物膜内IHF阳性灶的存在充分体现了人鼻窦炎的病因包括在dsDNA顶点具有IHF的生物膜。
图2是南美栗鼠中耳内形成的NTHI生物膜内双链DNA的免疫组化标记(在该图中显示为白色链)。几乎在100%的由dsDNA形成的顶点上观察到IHF的阳性标记(如在该3画面图中的中间画面由指向点状灶的箭头所示)。顶点间的平均距离大约为6μm，或如果假定B型DNA的每一个DNA碱基0.34nm的话，每个顶点间距大约18kb。据我们所知，具有与抗IHF交叉反应的表位的蛋白仅有HU和IHF。因此，基于这些观察，看来不仅在NTHI生物膜基质内存在细胞外DNABII蛋白，更重要地，这些蛋白似乎是专门定位于类似十字结构的eDNA链上(参见图1画面B，底部区域)，因而强烈暗示其在调节eDNA产生弯曲构型中的作用。
图3显示了抗IHF抗体逆转了已在室玻片内形成的NTHI生物膜。图3A显示了以非特异性抗体处理的生物膜。图3B显示了以新鲜兔血清处理的生物膜。注意具有丰富塔(abundant towers)(显示为白色或浅灰色团簇区)和水通道(黑色空间)的强健NTHI生物膜。图3C是以抗IHF处理的生物膜。注意在以抗IHF处理后生物膜结构的根除。残余个别的NTHI(显示为小圈点白至浅灰色点)以及稀疏、短的塔(显示为密集的白色至浅灰色团簇区)。图3D和3E进一步描绘了抗IHF抗体逆转已建立的NTHI生物膜。如图3(画面E)所示，与以新鲜血清孵育相比较(图3，画面D)，所述生物膜显示出立体结构的巨大损失。通过多重复制检测的COMSTAT分析，所测得的生物膜高度参数、生物量以及生物膜厚度均在以抗IHF孵育后平均减少了80%以上。
图4A和图4B是显示以抗IHF处理已由NTHI形成的生物膜导致更多的NTHI释放至上清液中的图形。在室玻片中生长16小时的NTHI生物膜以无菌培养基(sBHI)假处理或以新鲜兔血清或兔抗IHF处理。6小时后(图4A)或10小时后(图4B)，收集上清液并分析。注意在以抗IHF处理后上清液中NTHI数量的增大。以抗IHF孵育导致约6小时内室玻片内培养基中培养的浮游细菌的明显增长，并且在孵育10小时后显著增加。这些结果提示了细菌从生物膜基质释放。
图5显示了以IHF经皮免疫后减少中耳内已建立的生物膜的结果。注意听泡的相对残余生物膜质量在0至4+等级上盲目无序。
图6A是指示IHF与IHF-IHF二聚体中另一IHF相互作用或结合(通过上一层的三角形指示)或与DNA相互作用或结合的氨基酸残基(通过下一层的三角形指示)的谱图。所述肽通过短竖线分成含有3个氨基酸的区域。
图6B图形化地描述了微生物DNA与IHF的相互作用。
图7描述了由金黄色葡萄球菌、淋球菌和铜绿假单胞菌形成的生物膜在与兔抗IHF孵育后相对于与新鲜兔血清孵育后的减少。
图8显示了由E.coli在体外形成的生物膜与新鲜血清或抗IHF血清孵育的效果。生物膜的代表图像如画面A-F所示，各个生物膜的高度显示在图像右侧，其中用生物膜高度、生物量和平均厚度经与抗IHF孵育调节的减少百分数表达的平均数如每一行末尾的表中所示。画面A&B-亲本株系MG1655，画面C&D-HU-hupA,hubB双缺失突变体，画面E&F-IHF-himD,himA双缺失突变体。注意抗IHF血清正如预期地减少由亲本分离物或HU缺陷突变体诱导的生物膜，但不能减少IHF缺陷株系诱导的。
图9A证明了通过经皮递送途径的IHF免疫诱导了显著降低驻留在南美栗鼠中耳内NTHI诱导的生物膜生物量的抗体的形成(p<0.001)。
图9B描述了残留在单独以佐剂免疫与以IHF+佐剂免疫的动物耳内的生物量的代表图像。图9B最后的柱状图显示了本发明所应用评分系统的极值的生物量图像。上图是含有评分值为4+生物量的中耳的图像，下图是评分值为0、表示没有生物量的健康中耳。
图10A显示了从已单独应用佐剂与应用IHF+佐剂经皮免疫(TCI)的南美栗鼠中耳回收的生物膜的冰冻切片H&E染色。注意由IHF+佐剂免疫的动物所回收生物膜相对于仅以佐剂免疫的凝聚且萎陷的外观。画面A中的图像以相同的倍数放大显示以说明两种代表性生物量在高度及密度上的差异。
图10B证实了在单独应用佐剂与应用IHF+佐剂免疫的动物中耳内细菌负载量的显著减少(p<0.05)。
图11描述了证明在用于免疫南美栗鼠的条件下IHF与dsDNA形成特异性复合物的电泳迁移率变动分析。
图12图形化地表现了相较于仅接受佐剂免疫(p<0.017)、仅接受dsDNA免疫(p<0.003)或已结合dsDNA的IHF+佐剂免疫(p<0.001)，以天然IHF+佐剂的经皮免疫诱导了显著减少驻留在南美栗鼠中耳内生物量的抗体的形成。该结果提示dsDNA与天然IHF的结合屏蔽了这种DNABII家族成员的保护性抗原表位。
图13描述了在以IHF或结合dsDNA的IHF经皮免疫后，血清内抗体对IHF（箭头）的识别（箭头）。
图14是协同效应的示范，单独的次优浓度抗IHF血清(1:200)与DNAseI，然后混合(图14A)；单独的次优浓度抗IHF(1:100)与抗外膜蛋白P5血清(OMP P5)，然后混合(图14B)；或单独的抗IHF的有效稀释(根据生物膜的消退但不包括诱导性细菌细胞死亡)与阿莫西林，然后混合(图14C)。在这些情况中，当任意一种试剂与抗IHF组合时，观察到的生物膜消退和/或杀伤作用大于任意一种试剂单独使用时所见到的。注意：生物膜的高度（以微米表示）标注在每张图像下方。
图15是以新鲜兔血清或兔抗IHF血清(顶行的图像)处理的E.coli的比较；以新鲜大鼠血清或大鼠抗HNS（中间行的图像）血清处理的E.coli的比较；或以新鲜小鼠血清或小鼠抗DPS血清（底行的图像）。注意到以抗IHF血清处理后生物量的明显减少，然而，在此使用的抗HNS血清和抗DPS血清都不能诱导生物量的减少。抗IHF的处理导致生物膜高度48.2%的减少，生物膜平均厚度81%的减少以及生物量64.5%的减少。与之相比，抗HNS处理或抗DPS处理导致标称高度分别减少0.7%和4.2%，平均厚度分别减少5.8%和6.4%，并且生物量分别减少0.3%和17.4%
图16显示了生物膜内来源于宿主生物体或来源于所述细菌的DNA的相对分布的原位杂交。在每一种情况下，这些黑白图像前景内，DNA显示为更亮、更白的区域。宿主来源的DNA在右上的图像内标记得更密集，证明其在生物膜的外周更多分布，而细菌来源的DNA在左下由4画面组成的图像内标记得更密集，从而证明了其在生物膜内侧更密集分布。
具体实施方式
除非另有规定，本发明所应用的所有技术和科技术语均与发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。本发明所提供的所有核苷酸均以5’至3’方向呈现。尽管任何类似或等价于本文所述的方法和物质均可用于本发明的实践或检验，在此介绍优选的方法、设备以及物质。本文所引用的所有技术出版物和专利出版物的全部内容以引用的方式并入本文。此处的任何信息均不构成对本发明不能享受借助在先发明的提早公开的承认。
除非另有说明，本发明的实践将应用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的传统技术，其在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook和Russell主编的(2001)分子克隆：实验室手册，第三版；该系列的Ausubel等主编的(2007)Current Protocols in Molecular Biology；该系列的Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRLPress at Oxford University Press)；MacPherson等(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane主编的(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第五版；Gait主编的(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利4,683,195；Hames和Higgins主编的(1984)NucleicAcid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins主编的(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRLPress(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos主编的(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(冷泉港实验室)；Makrides主编的(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer和Walker主编的(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；以及Herzenberg等主编的(1996)Weir’s Handbook of ExperimentalImmunology。
包括范围在内的所有数字标号，如pH值、温度、时间、浓度以及分子量，为增量1.0或0.1的(+)或(-)变化的近似值，适当的或者可选的+/-15%的变化，或者可选的10%或者可选的5%或者可选的2%。尽管并不总是明确规定，应当可以理解所有的数字标号之前均有术语“大约”。同样应当可以理解，尽管并不总是明确规定，本发明所述的试剂仅仅是示例性的并且其等价物是本领域所知晓的。
除非上下文另有明确说明，说明书和权利要求书中所应用的单数形式“a”、“an”以及“the”包括复数指代。例如，术语“一个多肽”包括多个多肽（包括其混合物）。
如本文所应用的，术语“包括”意指所述组合物和方法包括所列举的要素但不排除其它要素。当“主要包括”用于限定组合物和方法时，指将其它具有重要意义的要素排除出用于使用目的的组合。因此，主要包括本文所定义的要素的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物以及药学上可接受的载体如磷酸盐缓冲液、防腐剂等等。“由……组成”指排除超过痕量的其它成分和施用本发明组合物的重要方法步骤。由这些过渡术语定义的具体实施方式包括在本发明范围内。
“生物膜”意指偶然粘附至某结构（其可以是有机或无机的）表面的微生物及其分泌和/或释放的多聚物（如DNA）的有组织的群落。所述生物膜十分耐受微抗生素(microbiotics)和抗菌剂。他们生活在牙龈组织、牙齿和修复组织(restorations)上，引起龋齿以及牙周疾病，也被成为牙周斑块疾病。它们也引发慢性中耳感染。生物膜还可以在牙科植入物、支架、导管线和接触镜上形成。它们生长在心脏起搏器、心脏瓣膜置换物、人工关节和其它外科植入物上。疾病控制中心估计，超过65%的院内（医院获得性）感染是由生物膜引起的。它们引发慢性阴道感染病并在具有脆弱免疫系统的人群中引起威胁生命安全的全身性感染。生物膜还参与了许多的疾病。例如，假单胞菌感染的囊性纤维化病人通常产生抗生素耐受性生物膜。
术语“抑制、竞争或中和”意指作为微生物生物膜成分的DNA/蛋白质基质的形成减少（例如图1所示）。
“DNABII多肽或蛋白”意指由DNA结合结构域组成并因而具有特异或一般的微生物DNA亲和性的DNA结合蛋白或多肽。一方面，它们结合DNA的小沟。DNABII蛋白的非限制性例子是整合宿主因子(IHF)蛋白和来源于U93E.coli株系的组蛋白样蛋白(HU)。其它可能与生物膜相关的DNA结合蛋白包括DPS（Genbank登录号：CAA49169）、H-NS（Genbank登录号：CAA47740）、Hfq（Genbank登录号：ACE63256）、CbpA（Genbank登录号：BAA03950）和CbpB（Genbank登录号：NP_418813）。
“IHF”蛋白的“整合宿主因子”是噬菌体用于整合其DNA至宿主细菌的细菌蛋白质。它们也结合细胞外的细菌DNA。在E.coli中编码IHF蛋白亚基的基因是himA(Genbank登录号:POA6X7.1)和himD(POA6Y1.1)基因。在其它有机体中发现了这些基因的同源基因，并且其它有机体的对应于这些基因的肽在表10中能找到。
“HMGB1”是一种高迁移率族B1蛋白，据报道其结合并扭曲DNA的小沟，而且其是干扰剂的一个实例。重组或分离的蛋白和多肽可以从Atgenglobal、ProSpecBio、Protein1和Abnova商购获得。
“HU”或“E.coli株系U93来源的组蛋白样蛋白”指通常与E.coli相关的一类异源二聚体蛋白。已知HU蛋白结合DNA交叉(DNA junctions)。相关蛋白已从其它微生物体分离得到。E.coli HU的氨基酸全序列是Laine等人(1980)Eur.J.Biochem.103(3):447-481报道的。HU蛋白的抗体可从Abcam商购获得。E.coli中编码HU蛋白亚基的基因是分别对应于SEQ ID Nos:28和29的hupA和hupB。在其它有机体中发现了这些基因的同源基因，并且其它有机体的对应于这些基因的肽在表10中能找到。
术语“表面抗原”或“表面蛋白”指细胞（如细菌细胞）表面的蛋白质或肽。表面抗原的例子有例如OMP P5(Genbank登录号:YP_004139079.1)、OMP P2(Genbank登录号:ZZX87199.1)、OMP P26(Genbank登录号:YP_665091.1)、rsPilA或重组可溶性PilA(Genbank登录号:EFU96734.1)以及IV型Pilin(Genbank登录号:YP_003864351.1)的外膜蛋白。
术语“流感嗜血杆菌”指能够引起多种不同感染例如耳部感染、眼部感染以及鼻窦炎的病原菌。已分离到许多流感嗜血杆菌的不同株系且其具有IhfA基因或蛋白质。流感嗜血杆菌的不同株系的一些非限制性例子包括Rd KW20、86-028NP、R2866、PittGG、PittEE、R2846以及2019。
“微生物DNA”指来源于产生生物膜的微生物的单链DNA或双链DNA。
“抑制、预防或分解”生物膜指生物膜结构的预防或治疗性减少。生物膜分解或减少的例子如图5所示。
“干扰剂”指一种竞争、抑制、阻止、中和DNABII多肽（如IHF）结合微生物DNA中的一种或多种或者分解微生物生物膜的试剂。它可以是一种或多种化学分子或生物分子。例如，IHF可以特异性结合、弯曲或扭曲DNA结构，例如含有四路交叉、顺铂加合物、DNA环或碱基突起的DNA。所述试剂的例子包括但不限于(1)抑制IHF的DNA结合活性的小分子，(2)在DNA结合中与IHF竞争的小分子，如聚胺和精胺，(3)在DNA结合中与IHF竞争的多肽，如IHF的肽片段，(4)抗IHF的抗体或片段，或者(5)在IHF结合中竞争的四路多核苷酸或弯曲的多核苷酸或者其它类型的含有弯曲或扭曲DNA结构的多核苷酸。“抑制IHF与核酸结合的小分子”指上述(1)或者(2)的分子并且包括结合DNA小沟的那些分子，例如小沟结合分子。“四路多核苷酸”指在四条DNA链间含有四路交叉、也叫Holliday交叉的多核苷酸。
“弯曲的多核苷酸”指在一条不能与另一条链配对的链上含有小环的双链多核苷酸。在某些具体实施方式中，所述环为1个碱基至约20个碱基长度，或可选地2个碱基至约15个碱基长度，或可选地3个碱基至12个碱基长度，或可选地4个碱基至10个碱基长度，或可选地具有约4、5、或6、或7、或8、或9或10个碱基。
“在DNA结合中与IHF竞争的多肽”指在结合弯曲的或扭曲的DNA结构时与IHF竞争但不与所述DNA形成生物膜的蛋白质或多肽。例子，包括但不限于包含IHF或其生物等价物的一个或多个DNA结合结构域的IHF片段。DNA结合结构域如图6所示。
用于诊断或治疗的“受试者”是细胞或动物，如哺乳动物或人类。用于诊断或治疗的非人类的动物是那些用于感染或动物模型的，例如，猿人，鼠类例如大鼠、小鼠、南美栗鼠，犬类例如狗，兔类例如兔子，牲畜，运动动物以及宠物。
术语“蛋白质”、“肽”以及“多肽”可互换使用，并在其最广泛的意义上指具有两个或多个氨基酸亚单位、氨基酸类似物或模拟肽的化合物。所述亚单位可通过肽键连接。在另一个具体实施方式中，所述亚单位可通过其它键如酯键、醚键等连接。蛋白质或多肽必须含有至少两个氨基酸并且氨基酸的最大数目没有限制，其可以包含一个蛋白质或多肽的序列。本文所应用的术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D型和L型光学异构体、氨基酸类似物和模拟肽。
“C末端多肽”指多肽的至少10个、或可选地至少15个、或可选地至少20个、或至少25个C末端氨基酸或可选地为多肽的一半。另一方面，对于含有90个氨基酸的多肽，C末端多肽将包含46-90位氨基酸。一方面，所述术语指羧基末端的20个C末端氨基酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并指代任意长度的聚合物形式的核酸，或者是脱氧核糖核酸或者是核糖核酸或其类似物。多核苷酸可具有立体结构并可行使已知或未知的任何功能。下面是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段（例如探针、引物、EST或SAGE标签）、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、干扰RNA(RNAi)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的任意序列的DNA、分离的任意序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果有，核苷酸结构的修饰可在多核苷酸组装之前或之后给予。核苷酸序列可被非核苷酸成分所中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如与标签成分结合。所述术语也指代双链分子和单链分子。除非另有说明或要求，本发明的任何具体实施方式中，多核苷酸包涵双链形式以及已知或预期形成双链形式的两条互补单链形式。
多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及当多核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换成尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母顺序排列表示。这种字母顺序排列表示可输入具有中央处理器的计算机中的数据库并用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性搜索。
本文所应用的与核酸（例如DNA或DNA）相关的术语“分离的”或“重组的”，指代从其它DNAs或RNAs分离出来的分子，其分别存在于天然来源的高分子以及多肽。术语“分离或重组的核酸”是指包括不作为片段自然存在并且自然状态下无法见到的核酸片段。术语“分离的”也在此用于指代从其它细胞蛋白分离出来的多核苷酸、多肽和蛋白质，并且包括纯化和重组的多肽。在其它的具体实施方式中，术语“分离或重组的”表示从所述细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常在自然界相关的成分、细胞等等中分离出来。例如，分离的细胞是一种由组织或具有不同表型或基因型的细胞中分离出来的细胞。分离的多核苷酸是由通常与其原始或自然环境相关（例如，在染色体上）的由3’至5’的连续核苷酸分离的。如本领域技术人员所显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体及其片段，并不要求“分离”至将它与其天然存在的代表相区别开。
无需详细列举可以推断，并且除非另有打算，当本发明涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体，这样的等价物或生物学等价物将包含在本发明的范围内。如本文所用的，指一个参考蛋白质、抗体、片段、多肽或核酸时，术语“其生物学等价物”是“其等价物”的代名词，意指具有最小同源性但仍保持所需的结构和功能的物质。除非在本文中特别说明，假定本文提及的任意多核苷酸、多肽或蛋白质还包括其等价物。一方面，多核苷酸等价物是在严格条件下与所述多核苷酸杂交或用于所描述方法的本文所述多核苷酸的配对物。另一方面，抗体或抗原结合多肽等价物意指相对于参考抗体或抗原结合片段，以至少70%、或可选地至少75%、或可选地至少80%、或可选地至少85%、或可选地至少90%、或可选地至少95%亲和性或更高亲和性结合的抗体或抗原结合多肽。另一方面，所述抗体或抗原结合片段与其等价物在竞争性ELISA试验中竞争结合其抗原。另一方面，等价物指相对于参考蛋白、多肽或核酸，具有至少约80%同源性或同一性并且可选地至少约85%、或可选地至少约90%、或可选地至少约95%、或可选地98%的同源性或同一性百分比，并且展示出基本相同的生物学活性。多肽的生物学等价物的例子在表9中提供，其确定了优选氨基酸序列的保守氨基酸替换。
与另一序列具有某个百分比(例如80%、85%、90%或95%)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）是指，在两个序列比较中比对时，该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。所述比对以及同源性或序列同一性的百分数可应用本领域已知的软件程序确定，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等主编1987)副刊30，7.7.18章，表7.7.1所记载的。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是应用默认参数的BLAST。特别地，优选程序是BLASTN与BLASTP，应用下述默认参数：Genetic code=standard;filter=none;strand=both;cutoff=60;expect=10;Matrix=BLOSUM62;Descriptions=50sequences;sort by=HIGH SCORE;Databases=non-redundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可从下述的因特网网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。序列同一性和百分比同一性通过将其纳入clustalW(可在网页地址获得://align.genome.jp/，2011年3月7日最后一次访问)确定。
“同源性”或“同一性”或“相似性”指两条肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较用于比较目的而比对的每一序列中的某一位置来确定。当被比较序列的某一位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么所述分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列所共有的匹配或同源位置的数量函数。“不相关”或“非同源”的序列与本发明的序列具有小于40%的同一性、或可选地小于25%的同一性。
“同源性”或“同一性”或“相似性”也可以指两个在严格条件下杂交的核酸分子。
“杂交”指一个或多个多核苷酸反应以形成复合物的反应，所述复合物通过核苷酸残基的碱基对之间的氢键来稳定。所述氢键可通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合、或其它任何序列特异性方式形成。所述复合物可包含形成复式结构的双链、形成多重链复合物的三链或多个链、自杂交的单链或其任意组合。杂交反应可构成一个更广泛过程例如PCR反应的起始、或多核苷酸通过核酶酶切中的一个步骤。
严格杂交条件的例子包括：约25°C至约37°C的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤液。温和杂交条件的例子包括：约40°C至约50°C的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的杂交缓冲液浓度；约30%至约50%的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤液。高度严格杂交条件的例子包括：约55°C至约68°C的孵育温度；约1x SSC至约0.1xSSC的杂交缓冲液浓度；约55%至约75%的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤液。通常来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1个、2个或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1分钟、2分钟或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸缓冲液。不言而喻地，可以采用应用其它缓冲系统的SSC等价物。
本文所用的“表达”指多核苷酸转录为mRNA的过程和/或转录的mRNA继而翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。如果所述多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪切。
当术语“编码”用于多核苷酸时，其指代被认为“编码”多肽的多核苷酸，如果处于其原生状态或当以本领域技术人员公知的方法处理时，它可被转录和/或翻译以产生所述多肽和/或其片段的mRNA。所述反义链是这种核酸的配对物，并且所述编码序列可由此推断出来。
本文所用的术语“处理”、“治疗”等等在此用于意指获得所需的药学和/或生理学效果。所述效果可以是从完全或部分地预防紊乱或其标志或症状的方面来说的预防性，和/或从紊乱和/或可归结于所述紊乱的副作用的部分或完全治愈方面来说的治疗。
预防是指在易患某种紊乱或影响的系统或受试者的体外或体内预防所述紊乱或影响。一个这样的例子是，预防生物膜在已知可产生生物膜的微生物感染的系统内形成。
“组合物”是指活性试剂与另外一种惰性（例如，检测试剂或标签）或活性的化合物或组合物（例如佐剂）的组合。
“药物组合物”是指包括活性试剂与惰性或活性载体的组合，使得所述组合物适于体外、体内或离体的诊断或治疗应用。
“药学上可接受的载体”指任意的稀释剂、赋形剂，或可用于本发明组合物的载体。药学上可接受的载体包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白（例如人血清白蛋白）、缓冲物质（例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾）、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质（例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁）、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。合适的药物载体在这一领域的标准参考文本Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company中有记载。优选根据预期给药形式选择所述载体，所述给药形式有口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等等，并与常规药物实践相一致。
本发明的“生物活性试剂”或活性试剂是指一个或多个分离或重组的多肽、分离或重组的多核苷酸、载体、分离的宿主细胞、或抗体以及包含一个或多个相同物质的组合物。
“给药”可在整个治疗期间持续或间歇性以单剂实现。确定给药的最有效方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且根据用于治疗的所述组合物、所述治疗的目的、待治疗的靶细胞以及待治疗的受试者变化。单次或多次给药可根据主治医生选择的剂量水平和模式进行。施用所述试剂的合适剂型和方法是本领域已知的。给药途径也可以确定，并且确定最有效的给药途径的方法是本领域技术人员已知的并且随用于治疗的组合物、治疗目的、待治疗受试者的健康状况或疾病阶段以及靶细胞或靶组织变化。给药途径的非限制性例子包括口服给药、鼻腔给药、注射和局部给药。
本发明的试剂可通过任何合适给药途径给药用于治疗。还应当理解优选的途径将随接受者的病情和年龄以及待治疗的疾病变化。
术语“有效剂量”指足以获得所需要效果的份量。在治疗或预防的背景下，有效量将取决于所讨论病情的类型和严重程度、以及个体受试者的特点如一般健康状况、年龄、性别、体重以及药物组合物的耐受性。在免疫原性组合物的背景下，某些具体实施方式中，有效量是足以引起对病原的保护性反应的份量。在其它具体实施方式中，免疫原性组合物的有效量是足以导致针对所述抗原的抗体产生的份量。在某些具体实施方式中，有效量是在有此需要的受试者中给予被动免疫所要求的份量。对于免疫原性组合物，在某些具体实施方式中，除上述记载的因素外，有效量将取决于预期的用途、特定抗原化合物的免疫原性程度、以及所述受试者免疫系统的健康状况/响应。熟练的技术人员能够依靠这些因素以及其它因素确定适宜份量。
体外应用的情况下，在某些具体实施方式中，所述有效量取决于论及应用的规模和性质。它也取决于所述体外靶标的性质和灵敏度以及使用方法。熟练的技术人员能够基于这些考虑和其它考虑确定有效量。有效量可包含取决于具体实施方式的组合物的一次给药或多次给药。
术语“结合的基序”指能通过与嵌合多肽的残基形成共价键而添加至分离的嵌合多肽的基序。所述基序可以直接结合所述嵌合多肽的残基或者与依次和所述嵌合多肽的残基形成共价键的接头形成共价键。
“肽结合”指通过一个或多个多肽和另一个化学或生物学化合物的共价或非共价结合的联合。在非限制性的例子中，多肽与化学分子的“结合”产生符合预期目的的提高稳定性或效力的多肽。在一个具体实施方式中，肽结合载体，其中所述载体是脂质体、胶束或药学上可接受的聚合物。
“脂质体”是由同心脂双层组成的微观囊泡。在结构上，脂质体的大小变化，形状从长管到球形，具有从几百埃至几分之一毫米的尺寸。选择囊泡形成的脂质以获得指定程度流动性或刚性的最终复合物，所述最终复合物提供所述外层的脂质组合物。这些脂质是中性（胆固醇）或双极性的，并包括磷脂，例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)以及其它类型的双极性脂质，包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，具有14-22范围内的碳氢链长度，以及是饱和的或具有一个或多个C=C双键。能够单独地或与其它脂质成分组合形成稳定脂质体的例子是磷脂，例如氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血性磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱（POPC）、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺（POPE）和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-碳水化合物的草酸酯（DOPE-mal）。可整合入脂质体的其它无磷脂质包括硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、肉豆蔻酸异丙酯、三乙醇胺月桂基硫酸盐、烷基芳基硫酸盐、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、十六烷基stereate、两性的丙烯酸类聚合物、聚草酸酯的脂肪酸酰胺、以及上面提到的阳离子脂质(DDAB,DODAC,DMRIE,DMTAP,DOGS,DOTAP(DOTMA),DOSPA,DPTAP,DSTAP,DC-Chol)。能够形成囊泡的带负电荷的脂质包括硬脂酸(PA)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和磷酸鲸蜡酯。通常地，基于整体大小和层状结构的性质，脂质体可分为三类。如New York Academy Sciences Meeting,"Liposomes andTheir Use in Biology and Medicine,"1977年12月,所开发的三个分类是多片层囊泡(MLVs)、小单片层囊泡(SUVs)和大型单向板层囊泡(LUVs)。所述生物活性试剂可包装入与本文所述方法相符的用于给药的囊泡。
“胶束”是分散在液态胶质中的表面活性剂分子的聚集。水溶液中的典型胶束通过与周围的溶剂接触的亲水性“头部”区域形成聚集，将疏水性尾部区域封存在胶束中心。这种类型的胶束被称为正相胶束（水包油型胶束）。反相胶束的头部集群在中心而尾部延伸出来（油包水型胶束）。胶束可用于连接多核苷酸、多肽、抗体或本文所述组合物以便能有效地递送到所述靶细胞或组织。
短语“药学上可接受的聚合物”指一组可结合一个或多个本文所述多肽的化合物。可以设想的是，多聚物与所述多肽的结合能够延长所述多肽在体内和体外的半衰期。非限制性的例子包括聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、纤维素衍生物、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、糖、多元醇及其混合物。所述生物活性试剂可结合与本文所述方法相符的用于给药的药学上可接受的聚合物。
“基因递送载体”被定义为可以携带被插入的多核苷酸进入宿主细胞的任何分子。基因递送载体的例子有脂质体、胶束生物相容性的聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工的病毒薄膜；金属颗粒；以及细菌或病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、脂质体、真菌载体和其它通常用于本领域的重组载体，其已记载用于各种真核和原核宿主内的表达，并可用于基因治疗以及简单的蛋白表达。
本发明的多核苷酸可应用基因递送载体递送至细胞或组织。“基因递送”、“基因转移”、“转导”等如本文所应用的术语是指外源多核苷酸至宿主细胞的引进（有时称为“转基因”），不考虑引进所应用的方法。这样的方法包括各种公知技术例如载体介导的基因转移（通过例如，病毒感染/转染、或各种其它的基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物）以及促进“裸”多核苷酸递送的技术（例如电穿孔、“基因枪”递送以及各种其它的用于多核苷酸引进的技术）。所导入的多核苷酸可以在宿主细胞内稳定或暂时保持。稳定保持通常要求所导入的多核苷酸或者含有能与宿主细胞相容的复制起始或者整合入所述宿主细胞的复制子例如染色体外的复制子（例如质粒）或者核酸或线粒体染色体。如本领域已知的以及本文所述，已知许多的载体能够介导基因至哺乳动物细胞的转移。
如本文所述的术语“eDNA”是指发现作为致病性生物膜成分的细胞外DNA。
“质粒”是从染色体DNA分离出来的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA复制。在许多情况下，质粒是环状的而且是双链。质粒提供了一种在一群微生物中水平基因转移的机制并通常提供了给定环境状态下的选择性优势。质粒可携带在竞争性环境生态位下对天然存在的抗生素提供抗性的基因，或可选择地产生的所述蛋白可在相似环境下充当毒素。
基因工程中应用的“质粒”叫“质粒载体”。许多质粒是可商购获得用于此类应用的。待复制的基因被插入到含有使细胞耐受特定抗生素的基因以及一个多克隆位点(MCS,或者多接头)的质粒拷贝中，所述多克隆位点是含有几个允许DNA片段在该位点容易插入的常用限制性位点的短区域。质粒的另一主要用途是生产大量的蛋白质。在此情况下，研究者生长含有质粒的细菌，所述细菌含有目的基因。正如所述细菌产生赋予其抗生素耐药性的蛋白，其也可以诱导用于由所述插入基因生产大量的蛋白质。这是一种大规模生产基因或其编码蛋白质的廉价且简单的方法。
“酵母人工染色体”或“YAC”指用于克隆大片段DNA（大于100kb并且高达3000kb）的载体。它是一种人工构建的染色体并且含有端粒、着丝粒以及在酵母细胞中复制和保存所需的复制起始序列。应用起始环状质粒构建，通过应用限制性内切酶线性化，进而DAN连接酶可通过应用粘性末端在所述线性分子内加入目的序列或基因。酵母表达载体例如YACs、Yips（酵母整合质粒）以及YEps（酵母游离质粒）十分有用，比如能够获得具有翻译后修饰的真核细胞蛋白产物，如同酵母就是自身的真核细胞一样，然而已发现YACs不如BACs稳定，产生了嵌合体效应。
“病毒载体”被定义为包含待递送至体内、离体或体外宿主细胞的多核苷酸的重组产生的病毒或病毒颗粒。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等等。感染性烟草花叶病毒(TMV)为基础的载体可用于制造蛋白质并已被报道在烟叶中表达Griffithsin(O'Keefe等(2009)Proc.Nat.Acad.Sci.USA106(15):6099-6104)。甲病毒载体，例如基于森林脑炎病毒的载体和基于辛德毕斯病毒的载体，已被开发应用于基因治疗和免疫治疗。参见Schlesinger&Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439以及Ying等(1999)Nat.Med.5(7):823-827。在逆转录病毒载体介导基因转移等方面，载体构建物指包含逆转录病毒基因组或其部分以及治疗性基因的多核苷酸。
如本文所述，“逆转录病毒介导的转基因”或“逆转录病毒转导”具有相同的意义，并且指基因或核酸序列凭借所述病毒进入细胞且整合其基因组至宿主基因组的稳定转入宿主细胞的过程。所述病毒可通过其正常的感染机制进入宿主细胞，或通过使得其结合不同的宿主细胞表面受体或配体的修饰机制以进入细胞。如本文所述，逆转录病毒载体指能够通过病毒或病毒进入机制将外源核酸引入细胞的病毒颗粒。
逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息；然而，一旦病毒感染细胞，所述RNA逆转录为能够整合入所感染细胞基因组DNA的DNA形式。整合的DNA形式称为原病毒。
在DNA病毒载体例如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)介导的转基因等方面，载体构建物指包含所述病毒基因组或其部分、以及转基因的多核苷酸。腺病毒(Ads)是一种相对完善的同质组病毒，包括超过50种血清型。参见例如，PCT国际申请WO 95/27071。Ads并不要求整合入所述宿主细胞基因组。还构建了重组腺病毒衍生载体，特别是那些降低了野生型病毒的重组和生殖潜能的。参见PCT国际申请WO 95/00655和WO95/11984。野生型AAV具有高传染性和整合到宿主细胞基因组的高度特异性。参见Hermonat&Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470以及Lebkowski等(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。
同时含有启动子以及多核苷酸能够可操作地连接的克隆位点的载体是本领域公知的。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并可从例如(La Jolla,CA)以及PromegaBiotech(Madison,WI)的来源商购获得。为优化表达和/或体外转录，可能有必要去除、添加或改变所述克隆的5’和/或3’非翻译部分，以消除额外的、潜在不恰当的替代翻译起始密码子或可干扰或者在转录水平或翻译水平上降低表达的其它序列。或者，可将共识核糖体结合位点紧邻起始密码子5’插入以增强表达。
基因递送载体还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶病毒蛋白-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本发明的方法。除了将多核苷酸递送至细胞或细胞群，本文所述的蛋白质进入所述细胞或细胞群的直接引入可通过蛋白质转染的非限制性技术完成，或者，能够增强本发明所述蛋白质表达和/或促进其活性的培养条件属于其它的非限制性技术。
如本文所述，术语“抗体（单数）”、“抗体（复数）”和“免疫球蛋白”包括全抗体及其任意的抗原结合片段或单链。因此，术语“抗体”包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的任意蛋白质或多肽。术语“抗体（单数）”、“抗体（复数）”和“免疫球蛋白”还包括任意同种型的免疫球蛋白、保留对抗原特异性结合的抗体的片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、scFv、dsFv、Fd片段、dAb、VH、VL、VhH以及V-NAR结构域，小分子抗体、双抗体、三抗体、四抗体以及kappa抗体，由一个或多个分离的抗体片段构成的多特异性抗体片段。这样的例子包括但不限于重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区、或其任意部分、结合蛋白的至少一部分、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、以及包含抗体的抗原结合部分以及菲康体蛋白的融合蛋白。免疫球蛋白分子重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织的结合。当术语“抗”用于蛋白质名称之前时，例如抗IHF、抗HU、抗OMP P5，指代结合和/或具有对特定蛋白质的亲和力的单克隆抗体或多克隆抗体。例如，抗IHF是指结合IHF蛋白的抗体。所述特异性抗体可对其针对的蛋白以外的蛋白质具有亲和力或结合能力。例如，抗IHF，尽管特异性地抗IHF蛋白，还可以结合通过序列同源性或结构同源性相关的其它蛋白。
所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体），以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。抗体可从任意合适的生物来源分离，例如小鼠、大鼠、绵羊和犬。
如本文所述，“单克隆抗体”指基本同质的抗体群获得的抗体。由于每个单克隆抗体针对抗原上的一种决定簇，单克隆抗体是高度特异的。所述抗体可以是被可检测地标记的，例如以放射性同位素、生成可检测产物的酶、荧光蛋白等等。所述抗体可进一步与其它基序结合，例如特异性的结合对成员如生物素（生物素-亲和素特异性结合对成员）等等。抗体还可以结合固相支持物，包括但不限于聚苯乙烯板或珠等等。
单克隆抗体可应用本领域已知的杂交瘤技术或重组DNA方法产生。杂交瘤是一种实验室中产生的、由产生抗体的淋巴细胞和不产生抗体的肿瘤细胞（通常是多发性骨髓瘤或淋巴瘤）融合而来的细胞。杂交瘤增殖并产生特异性单克隆抗体的连续性syple(continuous syple)。生成或选择抗体的可替代技术包括淋巴细胞对感兴趣抗原的体外暴露，以及细胞、噬菌体或类似系统内抗体展示文库的筛选。
本文所用的术语“人类抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，由体外随机突变或位点特异性突变或者体内的体细胞突变导入的突变）。然而，本文所用的术语“人类抗体”不包括已移植到人类框架序列的来源于其它哺乳动物品种（例如小鼠）CDR序列的抗体。因此，如本文所述，术语“人类抗体”指代基本上所述蛋白的每一部分（例如CDR，框架区，CL、CH结构域（例如CH1、CH2、CH3），铰链区，(VL,VH))在人体内基本无免疫原性的、仅具有极小序列改变或变化的抗体。相似地，指定灵长类（猴、狒狒、黑猩猩等等）、啮齿动物（小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、仓鼠等等）以及其它哺乳动物的抗体命名为这些物种、亚属、属、亚家族、家族特异性抗体。进一步地，嵌合抗体包含上述抗体的任意组合。这样的改变或变化可选地并且优选在人类或其它物种中相对于非修饰抗体保留或降低免疫原性。因此，人类抗体不同于嵌合抗体或人源化抗体。需要指出，人类抗体可通过非人动物或能够表达功能性重排的人免疫球蛋白（例如，重链和/或轻链）基因的原核细胞或真核细胞产生。进一步的，当人类抗体是单链抗体时，其可包含在天然人类抗体中未发现的连接肽。例如，Fv可包含如两个到八个甘氨酸或其它氨基酸残基的连接肽，其连接所述重链的可变区与所述轻链的可变区。这种连接肽被认为是人类起源的。
如本文所述，人类抗体“来自”特定的种系序列，如果所述抗体自应用人类免疫球蛋白序列的系统获得，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库。来自人种系免疫球蛋白序列的人类抗体可通过例如所述人类抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较来鉴定。选择的人类抗体通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，并且含有当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列（例如，小鼠种系序列）比较时鉴定所述人类抗体属于人类的氨基酸残基。在某些情况下，人类抗体与所述种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常地，来自特定人种系序列的人类抗体展示的与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的差异不超过10个氨基酸。在某些情况下，所述人类抗体可展示与所述种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的差异不超过5个、或甚至不超过4、3、2或者1个氨基酸。
“人单克隆抗体”指具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的、展示单一结合特异性的抗体。所述术语也意指重组人类抗体。制备这样的抗体的方法如本文所述。
本文所述的术语“重组人类抗体”包括所有通过重组方式制备、表达、建立或分离的人类抗体，例如分离自人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体(transchromosomal)动物（例如小鼠）或由此制得的杂交瘤的抗体，分离自转化为表达所述抗体的宿主细胞（例如转染瘤）的抗体，分离自重组、组合的人抗体文库的抗体，以及通过其它涉及人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列拼接的方式而制备、表达、建立或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些具体实施方式中，尽管所述重组人类抗体可发生体外突变（或者当应用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞突变），并且所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来自或与人种系VH和VL序列相关的序列时，其可能不会自然存在于体内的人类抗体种系系统(repertoire)内。制备这些抗体的方法如本文所述。
如本文所述，嵌合抗体是其轻链和重链基因通常已通过基因工程由属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。
如本文所述，术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”指含有来自非人类免疫球蛋白的最小序列的人类/非人类嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是受者可变区的残基被非人物种（例如小鼠、大鼠、兔、或具有所需特异性、亲和性以及能力的非人灵长类）（供者抗体）可变区残基取代的人类免疫球蛋白（受者抗体）。人源化抗体可包含在受者抗体或供者抗体内未发现的残基。所述人源化抗体可选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常是人类免疫球蛋白的所述免疫球蛋白恒定区、含有框架区、恒定区或已被来自人类抗体相应位置氨基酸替代的CDR的一个或多个氨基酸的非人类抗体的至少一部分。一般说来，期望人源化抗体相比于相同抗体的非人源化版本在人类宿主内产生降低的免疫反应。人源化抗体可具有基本上不影响抗原结合或其它抗体功能的保守氨基酸替换。保守替换组合包括：甘氨酸-丙氨酸，缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，丝氨酸-苏氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文所述的术语“多克隆抗体”或“多克隆抗体组合物”指来自不同B细胞系的抗体制剂。它们是分泌针对特定抗原的免疫球蛋白分子的混合物，每个识别不同的表位。
如本文所述，术语“抗体衍生物”包含全长抗体或抗体片段，其中一个或多个氨基酸通过烷基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等等化学修饰，例如用于连接抗体与第二分子。抗体衍生物包括但不限于PEG化抗体、半胱氨酸-PEG化抗体及其变体。
如本文所述，术语“标签”指直接或间接结合待测组合物的可直接或间接检测的化合物或组合物，例如N末端组氨酸标签(N-His)，磁活性同位素例如115Sn、117Sn以及119Sn，非放射性同位素例如13C和15N，多核苷酸或蛋白质例如抗体以产生标记的组合物。所述术语还包括提供插入序列表达的信号的连接所述多核苷酸的序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)等等。所述标签可通过自身可检测（例如放射性同位素标签或荧光素标签）或者，在酶促标签的情况下，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。因此，适宜的标签包括但不限于磁活性同位素、染料以及包括酶的蛋白质。所述标签可被简单地检测或可被定量。简单检测的反应通常包括仅仅是确认其存在的反应，而定量的反应通常包括具有可定量（例如可数值式报告）值（例如强度、极化和/或其它特性）的反应。在发光或荧光实验中，可以应用与事实上涉及结合的实验成分相关的发光团或荧光直接产生、或者间接应用与另一成分（例如报告分子或指示分子）相关的发光团或荧光产生可检测反应。产生信号的发光标记的例子包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光反应通常包含发光信号的改变或发生。适宜的方法以及用于发光标记实验组分的发光团是本领域已知的并且记载在例如Haugland,Richard P.(1996)Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals(第6版)中。荧光探针的例子包括但不限于水母发光蛋白和荧光素酶。
如本文所述，术语“免疫偶联”包括与第二试剂相关或连接的抗体或抗体衍生物，所述第二试剂例如细胞毒性剂、可检测剂、放射性剂、靶向剂、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、半合成抗体或多特异性抗体。
合适的荧光标记的例子包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、萤黄、Cascade BlueTM以及德克萨斯红。其它合适的光学染料记载在Haugland,Richard P.(1996)Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals(第6版)中。
另一方面，所述荧光标记官能化地促进与存在于所述细胞或组织内或表面的细胞成分（例如细胞表面标记）共价结合。合适的功能性基团包括但不限于异硫氰酸酯基团、氨基基团、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基酯和磺酰卤，所有这些可用于将所述荧光标记连接到第二分子。荧光标记的功能性基团的选择取决于连接或者是接头、所述试剂、所述标记，或者是第二标记试剂的位点。
“真核细胞”包含除原核生物外的生命王国的所有生物。它们可通过膜结合核简单区分。动物、植物、真菌以及原生动物是通过内部膜和细胞骨架将其组织成复合结构的真核细胞或有机体。膜结合结构的最主要特征是所述核。除非特别申明，术语“宿主”包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。真核细胞或宿主的非限制性例子包括猴、牛、猪、小鼠、大鼠、鸟类、爬行动物和人类。
“原核细胞”通常缺少核或任何其它的膜结合细胞器，并分为两个领域，细菌和古细菌。除了染色体DNA，这些细胞还可以包含称为附加体的圆环内的遗传信息。细菌细胞非常小，差不多是动物线粒体的大小（约1-2μm的直径以及10μm长）。原核细胞以三种主要形状为特征：杆形、球形和螺旋形。细菌细胞通过二分裂的方式分裂，代替了如真核细胞的复杂的复制过程。细菌的例子包括但不限于芽孢杆菌属细菌，大肠杆菌的细菌，和沙门氏菌细菌。
“原生”或“天然”抗原是含有表位的多肽、蛋白质或片段，其是从天然的生物源分离的，并能够特异性结合抗原受体特别是受试者内的T细胞抗原受体(TCR)。
术语“抗原”和“抗原性”指具有被抗体识别的能力或以其它方式充当抗体-配体对成员的分子。“特异性结合”指抗原与免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的相互作用。抗体-抗原结合可发生在体内或体外。本领域技术人员应当理解，包括蛋白质、核酸、脂肪酸、脂质、脂多糖和多糖的大分子具有充当抗原的能力。本领域技术人员还应进一步理解，编码具有充当抗体配体能力的蛋白质的核酸一定是编码抗原。本领域技术人员还应进一步理解，抗原不限于全长分子，还可包括部分分子。术语“抗原性”是具有抗原特性的分子的形容词性参考。所述术语涵盖具有免疫原性的物质例如免疫原，以及包括诱导免疫无应答或无反应性的物质例如anergens。
“改变的抗原”是主要序列与相应的野生型抗原不同的抗原。改变的抗原可通过合成或重组的方法制备，包括但不限于，翻译时或翻译后差异修饰（例如通过磷酸化，糖基化，交联，酰化，蛋白水解裂解，连接抗体分子、膜分子或其它配体）的抗原性肽(Ferguson等(1988)Ann.Rev.Biochem.57:285-320)。本发明的合成肽或改变的抗原的目的是类似天然表位结合相同的TCR。
在此也指代天然或野生型抗原的“自身抗原”是一种在受试者中极少或不诱导免疫应答的抗原性肽，归结于所述抗原的自身耐受性。自身抗原的例子是黑色素瘤特异性抗原gp100。
术语“主要组织相容复合物”或“MHC”指编码抗原呈递至T细胞以及快速移植排异所需的细胞表面分子的基因的复合物。在人类中，MHC也称为“人白细胞抗原”或“HLA”复合物。由MHC编码的蛋白称为“MHC分子”并分为MHC I类分子和MHC II类分子。MHC I类分子包括由MHC编码的α链非共价结合β2微球蛋白组成的膜异源二聚体蛋白。MHC I类分子几乎为所有有核细胞所表达并显示出在CD8+T细胞抗原呈递中的功能。人类中的I类分子包括HLA-A、B和C。MHC II类分子也包括由非共价结合的α链和β链组成的膜异源二聚体蛋白。已知MHC II类分子在CD4+细胞中起作用，并且在人类中包括HLA-AP、-DQ以及DR。在一个优选的具体实施方式中，本发明的组合物和配体可以与任意HLA型的MHC分子复合。本领域技术人员熟悉HLA的血清型和基因型。参见：bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/hla coefficient viewing page.Rammensee H.G.,Bachmann J和Stevanovic S.MHC Ligands and Peptide Motifs(1997)Chapman&Hall Publishers;Schreuder G.M.Th等The HLA dictionary(1999)TissueAntigens 54:409-437。
本文所用的术语“抗原呈递基质”意指能够以所述抗原被T细胞表面的T细胞抗原受体结合的方式递呈抗原的分子或多个分子。所述抗原呈递基质可在APC微囊制剂中处于抗原呈递细胞(APC)的表面，或以合成基质的形式存在于类似珠或板的固相支持物上。合成的抗原呈递基质的例子有复合β2微球蛋白的纯化的MHC I类分子、此类纯化MHCI类分子的多聚体、纯化的MHC II类分子、或其连接固相支持物的功能部分。
术语“抗原呈递细胞”指能够以被免疫系统中的特异性效应细胞识别的抗原-MHC复合物形式呈递一个或多个抗原，从而诱导针对所述抗原或所呈递抗原的有效细胞免疫应答的一类细胞。尽管很多类型的细胞能够呈递抗原至其细胞表面用于T细胞识别，但仅仅专职APCs具有呈递有效量抗原并进一步激活T细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的能力。APCs可以是完整的全细胞例如巨噬细胞、B细胞核树突状细胞；或其它的天然产生或合成的分子例如复合β2微球蛋白的纯化MHC I类分子。
术语“树突状细胞(DCs)”指在各种淋巴和非淋巴组织中发现的形态相似细胞类型的不同种群(Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9:271-296)。树突状细胞构成最有效及首选的哺乳动物APCs。部分（如果不是全部）DC细胞来自骨髓前体细胞，外周血中有少量循环并且或者以不成熟的朗格汉斯细胞或者以终末分化成熟细胞出现。尽管DCs可从单核细胞衍生而来，但它们具有不同的表型。例如，在树突状细胞中未发现一种特定的分化标记CD14抗原，但其在单核细胞中由单核细胞高表达。参见例如Jersmann等,(2005)Immunol.Cell Biol.83:462。
此外，成熟的树突状细胞不是吞噬性的，而单核细胞是强吞噬细胞。成熟的单核细胞和DCs通过不同的机制内吞物质。单核细胞通过细胞吞噬的方式吞食，而DCs利用巨胞饮作用。因此，Dcs相比于单核细胞通常吞食较小的物质（参见例如Conner和Schmid,(2003)Nature 433:37-44）。已表明DCs与其它抗原呈递细胞具有相同的内生活性(endocytically active)，并提供了T细胞激活与增殖所必需的所有信号（参见例如Levine和Chain,(1992)ONAS 89(17):8342）。
术语“抗原呈递细胞募集因子”或“APC募集因子”同时包括完整全细胞以及能够募集抗原呈递细胞的其它分子。合适的APC募集因子的例子包括例如白细胞介素4(IL4)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Sepragel以及巨噬细胞炎性蛋白3α(MIP3α)的分子。它们可从Immunex,Schering-Plough and R&D Systems(Minneapolis,Minn.)获得。它们也可以应用Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等主编(1987))所公开的方法重组生产。与上述提到因子具有相同生物活性的肽、蛋白质以及化合物包括在本发明的范围内。
术语“免疫效应细胞”指能够结合抗原并调节免疫应答的细胞。这些细胞包括但不限于T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞CTLs)例如CTL细胞系、CTL克隆以及来源于肿瘤、炎症或其它浸润的CTLs。已确定某些疾病组织表达特异性抗原以及特异于这些抗原的CTLs。
本文所述的术语“免疫效应分子”指能够抗原特异性结合的分子，并包括抗体、T细胞抗原受体、B细胞抗原受体以及MHC I类和II类分子。
“幼稚”免疫效应细胞是一种从未暴露于可激活该细胞的抗原的免疫效应细胞。幼稚免疫效应细胞的激活需要抗原:MHC复合物的识别以及经专职APC的共刺激信号的同时传递，以增殖和分化为抗原特异性武装的效应T细胞。活化的T细胞能够通过提供共刺激信号经免疫突触再激活特异性B细胞。活化的B细胞随后产生针对特定抗原的抗体。幼稚B细胞也可以通过T细胞非依赖机制活化。这种情况发生在抗原能够结合B细胞受体并产生共刺激信号时。
“免疫应答”广泛地指代淋巴细胞对外源物质的抗原特异性应答。术语“免疫原”和“免疫原性”指代具有引发免疫应答能力的分子。所有的免疫原都是抗原，然而并非所有的抗原都是免疫原。本发明的免疫应答可以是体液免疫（通过抗体活性）或细胞介导的免疫（通过T细胞活化）。所述应答可发生在体内或体外。本领域技术人员应当理解各种大分子，包括蛋白质、核酸、脂肪酸、脂质、脂多糖和多糖有可能是免疫原性的。本领域技术人员应当进一步理解编码能够引发免疫应答的分子的核酸必需编码免疫原。本领域技术人员应当进一步理解免疫原不限于全长分子，还可包括部分分子。
术语“被动免疫”指免疫力通过抗体的转移从一个受试者转移至另一个受试者。被动免疫可自然发生，如当母体抗体转移到胎儿时。过继免疫还可以人为发生，如当抗体组合物施用给非免疫受试者时。抗体供者和受者可以是人类或非人类受试者。抗体可以是多克隆或单克隆的，可以在体外或体内生成，并且根据环境可以是纯化的、部分纯化的或未纯化的。在本文的某些具体实施方式中，过继免疫通过特异性识别或结合特定抗原的抗体或抗原结合片段的给药赋予给有此需要的受试者。在某些具体实施方式中，过继免疫通过编码特异性识别或结合特定抗原的抗体或抗原结合片段的分离或重组多核苷酸的给药赋予。
在本发明的上下文中，“配体”是多肽。一方面，本文所用的术语“配体”指结合另一分子特定位点的任意分子。换句话说，配体将与免疫效应细胞或抗体反应的所述蛋白的特异性赋予蛋白质或由DNA赋予给蛋白质。一方面，与免疫效应细胞上互补结合位点直接结合的是所述蛋白内的配体位点。
一方面，本发明的肽或配体结合免疫效应细胞的抗原决定簇或表位，例如抗体或T细胞受体(TCR)。配体可以是本发明的抗原、肽、蛋白质或表位。
另一方面，配体可结合抗体上的受体。在一个具体实施方式中，本发明的配体为约4-约8个氨基酸长度。
在又一方面，配体可结合MHC I类分子上的受体。在一个具体实施方式中，本发明的配体为约7-约11个氨基酸长度。
在又一方面，配体可结合MHC II类分子上的受体。在一个具体实施方式中，本发明的配体为约10-约20个氨基酸长度。
如本文所述，术语“受驱动的抗原特异性免疫效应细胞”是如上文所定义的免疫效应细胞，其曾经遇到过抗原。与幼稚效应细胞相比，受驱动的抗原特异性免疫效应细胞的活化不需要共刺激信号。所述肽:MHC复合物的识别就足够了。
当“活化”与T细胞相关时，意味着所述细胞不再是G0期，并开始产生一个或多个细胞毒素、细胞因子以及其它膜相关蛋白。所述细胞类型（例如CD8+或CD4+）的特征是能够识别和结合在其表面展示特定抗原的任意靶细胞，并释放其效应分子。
术语“交叉反应”用于描述功能重叠的本发明的化合物。更特别地，通过变构配体，天然配体和/或由此活化的免疫效应细胞的免疫原性特征在某种程度上是共享的，这样，所述变构配体与所述天然配体和/或由此活化的免疫效应细胞是“交叉反应”的。为了本发明的目的，交叉反应是表现在多个级别上的：(i)配体级别，例如变构配体可结合天然配体CTLs的TCR并活化该CTLs；(ii)T细胞级别，例如本发明的变构配体结合一群T细胞（不同于天然配体CTLs群体）的TCR并活化所述T细胞，所述T细胞可有效靶向并裂解展示所述天然配体的细胞；以及(iii)抗体级别，例如“抗”变构配体的抗体可以检测、识别和结合天然配体并起始免疫应答中的效应机制，其最终导致天然配体由宿主中清除。
如本文所述，术语“在受试者中诱导免疫应答”是本领域很好理解的术语，并意指在将所述抗原（或表位）导入受试者后，相对于抗原（或表位）导入受试者之前的免疫反应（如果有），可检测或测量到对抗原（或表位）的免疫应答增加了至少约2倍、更优选地至少约5倍、更优选地至少约10倍、更优选地至少约100倍、甚至更优选地至少约500倍、甚至更优选地至少约1000倍或更多。对抗原（或表位）的免疫应答包括但不限于抗原特异性（或表位特异性）抗体的产生，以及其表面表达特异性结合抗原（或表位）的分子的免疫细胞的产生。确定对给定抗原（或表位）的免疫应答是否已诱导的方法是本领域公知的。例如，抗原特异性抗体可应用本领域已知的各种免疫测试来检测，包括但不限于ELISA，其中，例如，通过可检测标记的第二抗体（例如酶标小鼠抗人Ig抗体）检测样品中抗体与固定抗原（或表位）的结合。
“共刺激分子”涉及表达在抗原呈递细胞和T细胞表面的受体-配体对的相互作用。过去几年的累计研究已信服地证明静息T细胞至少需要两种信号用于诱导细胞因子基因表达与增殖(Schwartz(1990)Science 248:1349-1356以及Jenkins(1992)Immunol.Today 13:69-73)。赋予特异性的一个信号可通过TCR/CD3复合物与合适的MHC/肽复合物的相互作用产生。第二信号不是抗原特异性的并被称为“共刺激”信号。这种信号最初被定义为由骨髓源辅助细胞（例如被称为“专职”APCs的巨噬细胞和树突状细胞）提供的活性。已有数种分子显示增强共刺激活性。这些是热稳定抗原(HSA)(Liu等(1992)J.Exp.Med.175:437-445)、硫酸软骨素改性的MHC不变链(Ii-CS)(Naujokas等(1993)Cell 74:257-268)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)(Van(1992)Cell 71:1065-1068)。这些分子各显示出通过与其同源的T细胞上的配体的相互作用协助共同刺激。共刺激分子调节共刺激信号，其是在正常生理条件下获得幼稚T细胞的完全活化所必需的。一个示范性的受体-配体对是，APCs表面的B7共刺激分子及其在T细胞上的对应受体CD28或CTLA-4(Freeman等(1993)Science 262:909-911;Young等(1992)J.Clin.Invest.90:229以及Nabavi等(1992)Nature 360:266-268)。其它重要的共刺激分子是CD40、CD54、CD80以及CD86。术语“共刺激分子”涵盖了当与被T细胞表面的TCR结合时的肽/MHC复合物共同作用时，提供获得结合所述肽的T细胞活化的共刺激效应的分子或分子组合。该术语因而涵盖了B7、或在抗原呈递基质（例如APC）上的其它共刺激分子、或当T细胞表面的TCR特异性结合所述肽时与肽/MHC复合物一起结合同源配体并导致所述T细胞活化的片段（单独的、与另一（些）分子复合、或作为融合蛋白的一部分）。共刺激分子可从各种来源商购获得，包括例如Beckman Coulter,Inc.(Fullerton,Calif.)。虽然并不总是明确规定，与野生型或纯化的共刺激分子（例如重组产生或其突变蛋白）具有相似生物学活性的分子意在用于本发明的精神和范围内。
如本文所述，可互换使用的“固相支持物”或“固体支持物”不限于特定类型的支持物。相当多的支持物是可以获得的并且是本领域普通技术人员已知的。固相支持物包括硅胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶。如本文所述，“固体支持物”还包括合成的抗原呈递基质、细胞和脂质体。可基于不同方案所需的最终应用以及适合性选择合适的固相支持物。例如用于肽合成，固相支持物可以指树脂，例如聚苯乙烯(例如从Bachem Inc.,Peninsula Laboratories等获得的PAM-树脂)、POLYHIPE.RTM.树脂(从Aminotech,Canada获得)、聚酰胺树脂(从PeninsulaLaboratories获得)、聚乙二醇接枝的聚苯乙烯树脂(TentaGel.RTM.,Rapp Polymere,Tubingen,Germany)或聚二甲基树脂(从Milligen/Biosearch,Calif获得)。
固相支持物的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、葡聚糖、天然或改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩以及磁铁。所述载体的性质或者是一定程度可溶的或者是不溶的。支持物可具有几乎任何可能的结构构型，只要所偶联分子能够结合多核苷酸、多肽或抗体。因此，所述支持物构型可以是像珠子的球形，或在试管内表面的圆柱形，或是杆的外表面。或者，所述表面可以是平的，例如薄板、测试条等等，或者可选地聚苯乙烯珠。本领域技术人员知道许多其它的适合抗体或抗原结合的载体，或能够通过应用常规实验确定这样的载体。
本文所用的术语“免疫调节剂”是一种调节免疫应答的分子、大分子复合物或细胞，并涵盖了仅有本发明的合成抗原肽或本发明所描述的各种制剂中的任何一个；包含本发明合成抗原肽的多肽；编码本发明的肽或多肽的多核苷酸；结合抗原呈递基质上的MHCI类或II类分子的本发明的合成抗原肽，所述抗原呈递基质包括APC以及合成抗原呈递基质(共刺激分子存在或不存在)；与另一(些)分子或大分子结构共价或非共价复合的本发明的合成抗原肽；以及特异于本发明肽的受驱动的抗原特异性免疫效应细胞。
术语“调节免疫应答”包括诱导（增加、引发）免疫应答；以及削弱（抑制）免疫应答。免疫调节方法（或方案）是在调节受试者免疫应答的方法。
如本文所述，术语“细胞因子”指对细胞产生各种影响的许多因子中的任意一种，例如诱导生长或增殖。可在本发明实践中单独或组合使用的细胞因子的非限制性例子包括，白细胞介素2(IL-2)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素1α(IL-1α)、白细胞介素11(IL-11)、MIP-11、白血病抑制因子(LIF)、c-kit配体、血小板生成素(TPO)和flt3配体。本发明还包括一个或多个细胞因子从培养基中明确排除的培养条件。细胞因子可从数家供应商商购获得，例如Genzyme(Framingham,Mass.),Genentech(South San Francisco,Calif.),Amgen(Thousand Oaks,Calif.),R&D Systems(Minneapolis,Minn.)以及Immunex(Seattle,Wash.)。尽管并不总是明确规定，与野生型或纯化细胞因子（例如重组产生或其突变蛋白）具有相似生物学活性的分子意在用于本发明的精神和范围内。
诊断和治疗方法
提供了一种用于抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA结合的方法，其通过所述DNABII多肽或蛋白质或所述微生物DNA与干扰剂相接触，从而抑制、竞争或中和DNABII蛋白质或多肽与微生物DNA结合。另一方面，所述DNABII多肽与微生物DNA是可检测标记的，例如以彼此紧密接触时能够发出信号的发光分子标记。所述接触可在体外或体内进行。
另一方面，通过生物膜与干扰剂的接触提供了一种抑制、预防或分解微生物膜的方法，从而抑制、预防或分解所述微生物膜。另一方面，DNABII多肽与微生物DNA是可检测标记的，例如以彼此紧密接触时能够发出信号的发光分子标记。所述接触可在体外或体内进行。
在体外实践时，所述方法用于筛选或确认与本发明的多肽、多核苷酸、抗体、宿主细胞、小分子以及组合物具有相同、相似或相反能力的干扰剂。或者，它们可用于鉴定哪一种干扰剂最适于治疗微生物感染。例如，可以通过两种含有例如DNABII多肽与微生物DNA以及待测试剂的样品筛选新试剂或治疗组合。第二样品含有DNABII多肽与微生物DNA以及已知作用的试剂，例如抗IHF-抗体或作为阳性对照的小分子。另一方面，将所提供的数种样品和所述干扰剂加入到稀释度增加的系统中以确定临床上有效治疗受试者的最佳剂量。如本领域技术人员所显而易见的，可提供含有DNABII多肽与微生物DNA的阴性对照。另一方面，所述DNABII多肽与微生物DNA是可检测标记的，例如以彼此紧密接触时能够发出信号的发光分子标记。在类似的条件下将所述样品包含所述试剂有效时间量，以抑制、竞争或中和DNABII多肽与微生物DNA间的相互作用，继而检测所述样品中由所述发光分子发射的信号。如果所述样品发射信号，那么所述试剂不能有效抑制结合。
另一方面，在小型化室玻片系统中实施所述体外方法，其中引发感染的微生物（例如细菌）分离物可从人类/动物分离，随后培养以允许其作为生物膜在体外生长，参见例如下述的实施例1。所述干扰剂（例如抗IHF抗体）或潜在干扰剂生物膜单独或与另一试剂组合加入至培养基，所述潜在干扰剂或干扰剂如抗IHF（或其它抗体、小分子、试剂等等）具有或不具有增加的稀释度，用以找到将其递送至所述感染存在的受试者时能有效治疗患者的最佳剂量。如本领域技术人员所显而易见的，阳性对照和阴性对照可同时进行。
另一方面，所述方法可在流通池内具有干扰剂（例如抗IHF抗体）和/或潜在干扰剂（单独或与另一试剂组合）的高通量平台实施。所述干扰剂（例如抗IHF抗体）或潜在干扰剂生物膜单独或与另一试剂组合加入至培养基，所述潜在干扰剂或干扰剂如抗IHF（或其它抗体、小分子、试剂等等）具有或不具有增加的稀释度，用以找到将其递送至所述感染存在的受试者时能有效治疗患者的最佳剂量。生物膜分离物是从DNABII多肽（例如结合微生物DNA的IHF）超声分离的生物膜细菌。所述DNABII多肽-DNA复合物凭借所述平台上的抗IHF抗体分离。然后所述微生物DNA以例如盐洗涤释放，并用于鉴定所添加的生物膜细菌。然后游离的DNA通过例如PCR测序鉴定。如果DNA不是游离的，则所述干扰剂成功进行或结合所述微生物DNA。如果样品中发现了DNA，则所述试剂不干扰DNABII多肽-微生物DNA结合。如本领域技术人员所显而易见的，阳性对照和阴性对照可同时进行。
上述的方法也可以用做诊断测试，因为给定细菌种类通过一个试剂比另一试剂更好地应答其生物膜逆转是可能的，这种快速高通量检测系统允许本领域技术人员检测一组可能的抗IHF样试剂以鉴定该组中最有效的。
这些方法的优势在于，大多数医院内临床微生物实验室已配备应用生长在液体培养基中（或浮游地）的细菌进行这些各种各样测试（例如，测定MIC、MBC值）。如本领域技术人员所显而易见的，当细菌引起疾病时通常不浮游生长。取而代之的是，它们作为稳定的生物膜生长并且这些生物膜更显著地耐受抗生素、抗体治疗或其它疗法。这种耐受性是为什么大多数MIC/MBC值不能准确预测体内疗效的原因。因此，通过确定何种“剂量”试剂能在体外逆转细菌微生物膜（如上所述），申请人的临床前检测将是临床疗效、甚至作为个性化医疗应用的一个更可靠的预测。
除了临床环境，所述方法可用于鉴定引起所述感染的微生物和/或确定工业环境下的有效干扰剂。
在上述方法的又一方面，顺序或同时添加已知抑制潜在感染生长的抗生素或抗菌剂，以鉴定所述感染是否被抑制。另外，还可以在加入所述缺失复合物之前加入所述微生物DNA或DNABII多肽的干扰剂以检测生物膜抑制。
当在非人动物例如南美栗鼠体内实践时，所述方法提供了鉴定可单独或与其它试剂组合以分解生物膜的干扰剂的临床前筛选。这种方法的例子如下述的实施例2-7所述。
另一方面，本文提供了一种抑制、预防或分解受试者体内生物膜的方法，其通过给受试者施用有效量的干扰剂，从而抑制、预防或分解所述微生物生物膜。这种方法的例子如下述的实施例2-7所述。
为了上述提到的体外和体内方法的目的，所述干扰剂是下述组内的：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)与整合宿主因子竞争性结合微生物DNA的多肽或多核苷酸；
(g)类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；
(h)编码(a)至(f)中任意一种的分离或重组的多核苷酸，或SEQ ID NO.36的分离或重组的多核苷酸或其等价物，或在严格条件下与所述多核苷酸杂交的多核苷酸、其等价物或互补分子；
(i)特异性识别或结合(a)至(f)中任一项的抗体或抗原结合片段，或其每种抗体或抗原结合片段的等价物或片段；
(j)编码(i)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸或其互补分子；或
(k)与DNABII蛋白或多肽竞争性结合微生物DNA的小分子。
本发明还提供了一种在有此需要的受试者上诱导免疫应答或赋予被动免疫的方法，包括或者可选地主要包括，或者还进一步包括给所述受试者施用有效剂量的一种或多种选自下述组的试剂：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)编码(a)至(f)中任意一种的分离或重组的多核苷酸，或SEQ ID NO.36的分离或重组的多核苷酸或其等价物，或在严格条件下与所述多核苷酸杂交的多核苷酸、其等价物或互补分子；
(g)特异性识别或结合(a)至(e)中任一项的抗体或抗原结合片段，或其等价物或片段；
(h)编码(g)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸。
(i)负载(a)至(e)中任意一项的抗原呈递细胞；以及
(j)以编码(a)至(e)中任意一项的一个或多个多核苷酸转化的抗原呈递细胞。
在一个特定的方面，所述干扰剂是分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段、IHF多肽的C末端片段、或其各自的等价物。在另一特定的方面，所述干扰剂是分离或重组的HU多肽或其片段、HU多肽的C末端片段、或其各自的等价物。非限制性的例子是IHF或HU α或β多肽；IHF多肽；卡他莫拉菌HU；E.coli HupA、HupB、himA、himD；粪肠球菌HU（例如V583）、HMGB1（高迁移率族B1蛋白，一种具有与DNABII家族蛋白质相似的DNA结合及DNA底物特异性、但主要氨基酸序列不同的蛋白质；功能同源基因）以及表8或表10所确定的那些。
在又一方面，所述方法进一步包括或可选地主要包括，或者还进一步包括给所述受试者施用有效量的一种或多种抗菌剂、抗原肽或佐剂。
抗菌剂的一个非限制性例子是另一疫苗组分，诸如表面抗原例如OMP P5、rsPilA、OMP 26、OMP P2或IV型菌毛蛋白(参见Jurcisek和Bakaletz(2007)J.of Bacteriology189(10):3868-3875以及Murphy,TF,Bakaletz,LO和Smeesters,PR(2009)The PediatricInfectious Disease Journal,28:S121-S126)。
本发明的试剂和组合物可与其它抗菌剂和/或表面抗原同时或顺序给药。在一个特定的方面，通过直接注射或例如吸入在感染部位局部给药。给药的其它非限制性例子包括，包含透皮、尿道、舌下、直肠、阴道、眼部、皮下、肌内、腹膜内、鼻内、通过吸入或口服的一种或多种方法。
可通过本发明方法治疗的微生物感染和疾病包括由实施例1和表8所确定的生物体导致的感染，例如无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌、密螺旋体、齿密螺旋体、梅毒螺旋体、洋葱伯克氏菌或类鼻疽伯克氏菌。一方面，所述微生物感染是流感嗜血杆菌（不分型）、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌。这些微生物感染可存在于气道的上部、中部和下部（中耳炎、鼻窦炎、气管炎）以及慢性阻塞性肺病加重(COPD)、慢性咳嗽、囊性纤维化(CF)的并发症和/或主要原因、以及社区获得性肺炎(CAP)。因此，通过实施本发明所述体内方法，还可以预防或治疗这些感染的疾病和并发症。
感染还可发生在口腔内（龋齿、牙周炎）并且由变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、Aggregatibacter actinomycetemcomitansI引发。还可以是局部皮肤感染（脓肿、金黄色葡萄球菌感染、脓疱病、烧伤的二次感染、莱姆病）并且由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和伯氏螺旋体）引发。尿路感染(UTI)也可以治疗并且通常由大肠杆菌引起。胃肠道(GI)感染(腹泻、霍乱、胆结石、胃溃疡)通常由伤寒沙门菌、霍乱弧菌和幽门螺旋杆菌引起。生殖道感染包括在内并通常由淋病奈瑟氏菌引起。感染可以是由粪肠球菌引起的膀胱感染或留置设备感染。通常由多种细菌引起的与植入假体设备（例如人工髋关节或膝关节置换物、或牙科植入物、或诸如泵、导管、支架或监测系统的医疗设备）相关的感染可通过本发明的方法治疗。这些设备可包被或偶合本文所述的试剂。因此，通过实施本发明所述体内方法，还可以预防或治疗这些感染的疾病和并发症。
由无乳链球菌引起的感染也可以通过本发明的方法治疗，并且其是新生儿细菌性败血症的主要原因。还可以治疗由可导致脑膜炎的脑膜炎奈瑟氏菌引起的感染。
因此，可应用本发明方法的给药途径包括鼻内、肌内、尿路、气管内、皮下、皮内、局部给药、静脉内、直肠、鼻腔、口服、吸入以及其它肠内或胃肠外给药途径。如果需要，给药途径可以根据所述试剂和/或所需效果组合或调节。活性试剂可以以单剂或多剂给药。这些适于递送的方法和途径的具体实施方式包括全身和局部途径。通常地，适于本发明方法的给药途径包括但不限于：直接注射、肠内、胃肠外或吸入途径。
吸入给药以外的非胃肠道给药途径包括但不限于：局部、经皮、皮下、肌内、眼窝内、囊内、椎管内、胸骨内以及静脉途径，即通过消化道以外的任何给药途径。非胃肠道给药可以有效进行所述抑制剂的全身或局部递送。需要全身性递送时，给药通常涉及药物制剂的介入性或全身性局部吸收或粘膜给药。
本发明的干扰剂还可以通过肠内给药递送给所述受试者。肠内给药途径包括但不限于：口服和直肠（例如，使用栓剂）递送。
通过皮肤或粘膜施用所述活性物质的方法包括但不限于：合适药物制剂的局部给药，经皮传输，透皮传输，注射以及表皮给药。对于透皮传输，吸收促进剂或离子导入是适宜的方法。可以应用商购获得的“贴剂”完成等离子体透皮传输，其通过电脉冲经完整的皮肤持续递送其产品数天时间或更久。
在本发明方法的各种具体实施方式中，所述干扰剂可通过吸入、注射或口服持续地、每天、每天至少一次(QD)、以及在各种具体实施方式中两次(BID)、三次(TID)或者甚至一天四次给药。通常地，每日治疗有效剂量至少约1mg，或至少约10mg，或至少约100mg，或约200-约500mg，并且有时候根据所述化合物，多达约1g至约2.5g。
剂量可以与本发明的方法相一致地通过应用胶囊、片剂、口服悬浮剂、肌内注射悬浮剂、静脉滴注悬浮剂、局部给药的凝胶或霜剂、或者关节内注射用悬浮剂完成。
本文所述组合物的剂量、毒性和治疗效果可通过细胞培养物或实验动物内的标准制药程序确定，例如，确定LD50（半数致死剂量）和ED50（半数治疗有效剂量）。毒性效果和治疗效果之间的剂量比为治疗指数并可表示为LD50/ED50比例。优选显示高治疗疗指数的组合物。尽管可应用显示毒副作用的化合物，应当小心设计靶向此类化合物至感染组织位置的递送系统，以减少对未感染细胞的潜在损害并从而降低副作用。
由细胞培养物实验和动物研究获得的数据可用于制定在人体内应用的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。所述剂量可根据所采用的剂型以及应用的给药途径在此范围内变化。对于所述方法中应用的任何化合物，治疗有效剂量可从细胞培养物实验开始估计。可在动物模型中制定剂量以获得包括如在细胞培养物中确定的IC50（即获得症状半数最大抑制的最优化合物的浓度）的循环血药浓度范围。这些信息可用于更准确确定人类的有用剂量。血浆中的水平可通过例如高效液相色谱法测量。
在某些具体实施方式中，足以获得治疗或预防效果的组合物有效量范围为约0.000001mg每千克体重每次给药至约10,000mg每千克体重每次给药。适宜地，剂量范围为约0.0001mg每千克体重每次给药至约100mg每千克体重每次给药。给药可以以初始剂量、后随一个或多个加强剂量提供。加强剂量可以在初始剂量一天、两天、三天、一周、两周、三周、一、二、三、六或十二个月后提供。在某些具体实施方式中，加强剂量可以在评估所述受试者对之前给药的应答之后给药。
本领域技术人员能够理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所要求的剂量和时间，包括但不限于，所述疾病或紊乱的严重程度、以往的治疗、所述受试者的一般健康状况和/或年龄以及存在的其它疾病。而且，以治疗有效剂量的本文所述治疗组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。
多肽
本发明还提供了用于本发明方法的干扰剂和组合物，其中所述干扰剂是下述组内的：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)与整合宿主因子竞争性结合微生物DNA的多肽或多核苷酸；
在一个特定的方面，所述干扰剂是分离或重组的DNABII多肽或其片段或等价物。这样的干扰剂的非限制性例子是IHF或HUα或β多肽；IHFα多肽；卡他莫拉菌HU；E.coli HupA、HupB、himA、himD；粪肠球菌HU（例如V583）、HMGB1以及表8所确定的那些。
另一方面，所述干扰剂是主要由选自SEQ ID NO.1-5或12-27、30-35、101-340的氨基酸序列或图6所确定的DNA结合肽组成的分离或重组多肽。
另一方面，所述分离或重组的多肽包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQID NO.1或2，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
另一方面，所述分离或重组的多肽包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQID NO.3、4或5，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
另一方面，所述分离或重组的多肽包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQID NO.12、14、16、18、20、22、24、26、30或32，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.6-11、28、29或42-100。
另一方面，所述分离或重组的多肽包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQID NO.13、15、17、19、21、23、25、27、31、33、34或35，条件是所述多肽不是SEQID NO.6-11、28、29或42-100。
另一方面，所述分离或重组的多肽包括或可选地主要包括或者还进一步包括下述组内的分离或重组的多肽：
具有SEQ ID NO.12和13的多肽；
具有SEQ ID NO.14和15的多肽；
具有SEQ ID NO.16和17的多肽；
具有SEQ ID NO.18和19的多肽；
具有SEQ ID NO.20和21的多肽；
具有SEQ ID NO.23和24的多肽；
具有SEQ ID NO.25和26的多肽；
具有SEQ ID NO.30和31的多肽；
具有SEQ ID NO.32和33的多肽；
具有SEQ ID NO.34和35的多肽；
具有SEQ ID NO.337和338的多肽；或
具有SEQ ID NO.339和340的多肽；
条件是所述多肽不是IHFα、IHF β或SEQ ID NO.6至11、28、29，或42至100中任意一个的野生型。
另一方面，所述分离或重组的多肽是下述组内的：
基本由SEQ ID NO.12和13组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.14和15组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.16和17组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.18和19组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.20和21组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.23和24组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.25和26组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.30和31组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.32和33组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.34和35组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.337和338组成的多肽；或
基本由SEQ ID NO.339和340组成的多肽；
条件是所述多肽不是IHFα、IHF β或SEQ ID NO.6至11、28、29，或42至100中任意一个的野生型。
进一步提供的作为用于本发明方法的试剂是上述的分离或重组多肽的片段或等价物。片段的例子是C末端多肽。又一方面，所述分离或重组多肽包括或可选地主要包括或者还进一步包括两个或多个上述的分离或分离的多肽。
例如，所述分离或重组多肽包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID.NO.1-6、12-27或30-33中的任意一种，或者片段或等价物多肽，其例子如表8所确定的或如表9A、表9B或表10所示。一方面，排除了分离的野生型肽，即所述多肽不是SEQ IDNO.6至11、28、29，或者表8所确定或表9A所示的野生型序列。
一方面，本发明提供了主要由SEQ ID.NO.1-6、12-27或30或35、1-6以及13-35的氨基酸序列组成的分离或重组的多肽，或者包括或可选地主要包括或者还进一步包括相应于流感嗜血杆菌IHFα或IHFβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽，其非限制性的例子包括SEQ ID NO.12-27，或其片段或等价物。又一方面，本发明提供了包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.1-4或其片段或等价物的氨基酸序列的分离或重组的多肽，或者包括或可选地主要包括或者还进一步包括相应于流感嗜血杆菌IHFα或IHFβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽，其非限制性的例子包括SEQID NO.12-27或其片段或生物学等价物，其进一步独立地包含至少2个、或可选地至少3个、或可选地至少4个、或可选地至少5个、或至少6个、或可选地至少7个、或可选地至少8个、或可选地至少9个或可选地至少10个所述多肽的氨基和/或羧基末端的氨基酸。一方面，排除了分离的野生型DNA结合多肽，即所述多肽不是SEQ ID NO.6至11、28、29或42至100，或表8所列举的或表9A所示的分离的野生型多肽序列。
另一方面，本发明提供了包括或可选地主要包括或者还进一步包括单独的SEQ ID.NO 1或2的分离或重组的多肽，或与包括或可选地主要包括或者还进一步包括相应于流感嗜血杆菌IHFα或IHFβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽组合，其非限制性的例子包括SEQ ID NO.12-27或其片段或生物学等价物。一方面，排除了分离的野生型DNA结合多肽，即所述多肽不是SEQ ID NO.6至11、28、29或42至100，或表8所列举的或表9A所示的分离的野生型多肽序列。
又一方面，本发明提供了包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID.NO 3或4或其片段或等价物的分离或重组的多肽，单独地或与包括或可选地主要包括或者还进一步包括相应于流感嗜血杆菌IHFα或IHFβ的β-3和/或α-3片段的氨基酸序列的多肽组合，其非限制性的例子包括SEQ ID NO.12-27、以及34-35或其生物学等价物。一方面，排除了分离的野生型DNA结合多肽，即所述多肽不是SEQ ID NO.6至11、28、29或42至100，或表8所列举的或表9A所示的分离的野生型多肽序列。
本发明还提供了包括或可选地主要包括或者还进一步包括所有十四个分离或重组多肽中的两个或多个、或三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个、八个或多个、九个或多个、十个或多个、十一个或多个、十二个或多个、十三个或多个或其片段或等价物的分离或重组的多肽。这样的例子包括包含SEQ ID NO.1-4的分离或重组的多肽，例如SEQ ID NO.1和2，或可选地1和3或可选地1和4，或可选地2和3，或可选地1、2和3或可选地2、3和4，或可选地1、3和4。所述多肽可以是任意方向的，例如SEQ ID NO.1、2和3或SEQ ID NO.3、2和1或可选地2、1和3、或可选地3、1和2。这些多肽的生物学等价物进一步包含于本发明，条件是所述序列不包括分离的野生型序列，例如表8和9中所确定的那些。
另一方面，本发明提供了包括或可选地主要包括或者还进一步包括SEQ ID NO.1或2以及3或4或其片段或等价物的分离或野生型多肽，条件是所述多肽不是SEQ ID NO.5-10，并且它们可进一步包括SEQ ID Nos.11-26中的任何一个或多个，例如11和12，或可选地1和11，或可选地2和11，或可选地1和12，或可选地2和12，或可选地11、12和1，或可选地2、11和12。在这个具体实施方式中，SEQ ID NO.1或2位于SEQ IDNO.3或4的上游或氨基末端，条件是所述氨基酸序列不是分离野生型多肽，例如没有SEQ ID NO.6-11、28和29。另一方面，所述分离多肽包含位于SEQ ID.NO.1或2上游或氨基末端的SEQ ID NO.3或4。这些多肽的生物学等价物进一步包含于本发明，条件是所述序列不包括分离的野生型多肽。
在一个具体实施方式中，与所述野生型多肽或Pedulla等(1996)PNAS93:15411-15416所公开的具有序列同源性的任意多肽或蛋白质被排除出本发明。
在上述具体实施方式的任意一个中，可添加肽接头至所述多肽的N末端或C末端。“接头”或“肽接头”指连接多肽序列的或者是N末端或者是C末端的肽序列。一方面，所述接头为约1至约20个氨基酸残基长度或可选地2至约10个、约3至约5个氨基酸残基长度。肽接头的一个例子是Gly-Pro-Ser-Leu-Lys-Leu(SEQ ID NO:37)。其它的例子包括Gly-Gly-Gly；Gly-Pro-Ser-Leu(SEQ ID NO:38)；Gly-Pro-Ser；Pro-Ser-Leu-Lys(SEQ ID NO:39)；Gly-Pro-Ser-Leu-Lys(SEQ ID NO:40)以及Ser-Leu-Lys-Leu(SEQ IDNO:41)。
本发明的分离多肽意在包括分离的野生型以及由原核和真核宿主细胞重组产生的多肽和蛋白质，以及其突变蛋白、类似物和片段，这些细胞的例子如上所述。在某些具体实施方式中，该术语还包括本文所述的抗体以及抗独特型抗体。这样的多肽可应用本领域已知的以及本文简要记载的方法分离或产生。
据了解，所述野生型多肽或蛋白质的功能性等价物或变体也在本发明的范围内，例如那些具有氨基酸的保守氨基酸替换的，参见例如表9。其它的类似物包括融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明的蛋白质或多肽，其可包括连接到抗原呈递基质的多肽。
又一方面，所述多肽可耦合或连接可检测标记。适宜的标记是本领域已知的并如本文所述。
又一方面，所述具有或不具有可检测标记的多肽可包含于或表达在原核宿主或真核宿主细胞的表面，例如树突状细胞。
所述蛋白质和多肽可通过本领域技术人员已知的一些方法获得，其包括纯化、化学合成以及重组方法。多肽可通过诸如以抗体免疫沉淀以及诸如凝胶过滤、离子交换、反向以及亲和层析的方法从诸如宿主细胞系统的制剂中分离。对于这样的方法，参见例如Deutscher等(1999)Guide To Protein Purification:Methods In Enzymology(Vol.182,Academic Press)。相应地，本发明还提供了获得这些多肽的方法以及通过这些方法可获得的以及获得的产品。
所述多肽还可应用商购获得的自动肽合成机通过化学合成获得，所述自动肽合成机例如Perkin/Elmer/Applied Biosystems,Inc.,Model 430A or 43lA,Foster City,CA,USA所制造的。所述合成多肽可沉淀并进一步纯化，例如通过高效液相色谱(HPLC)。相应地，本发明也通过提供所述蛋白质的序列及试剂提供了化学合成本发明所述蛋白质的方法，例如氨基酸和酶以及以正确方向和线性序列将所述氨基酸连接在一起。
或者，所述蛋白质和多肽可通过本文所述的公知的重组方法获得，例如，Sambrook等(1989)supra中的，应用本文所述的宿主细胞和载体系统。
本申请还提供了用于诊断方法应用的偶联可检测试剂的多肽。例如，可检测标记的多肽可结合色谱柱并用于抗体的检测和纯化。它们还可在下述的抗体生产中用作免疫原。本发明的所述多肽在用于筛选调节细胞过程的试剂或药物的体外实验系统中是有用的。
本领域技术人员都知道，可对本发明的肽进行修饰以提供改变特性的肽。本文所用的术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D或L的光学异构体、以及氨基酸类似物及模拟肽。具有三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽，如果所述肽链短的话。如果所述肽链长，所述肽通常称为多肽或蛋白质。
本发明的肽可修饰以包含非天然氨基酸。因此，所述肽可包含D氨基酸、D氨基酸和L氨基酸的组合、以及各种“设计师”氨基酸（例如β-甲基氨基酸、C-α.-甲基氨基酸、以及N-α-甲基氨基酸，等等）以传递特定属性给肽。另外，通过在特定的偶联步骤分配特定的氨基酸，可生产具有α螺旋、β转折、β片层、γ转折的肽以及环形肽。通常地，据信，优选α螺旋二级结构或随机二级结构。
本发明的多肽也可以与各种固相载体组合，例如植入物、支架、糊剂、凝胶、牙科植入物、或医疗植入物、或液相载体例如珠子、无菌或水溶液、药学上可接受的载体、药学上可接受的多聚物、脂质体、胶束、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。当用于制备抗体或在体内诱导免疫应答时，所述载体还可以包括可用于非特异性增强特定免疫应答的佐剂。本领域技术人员可以很容易地确定是否需要佐剂并选择一种。然而，只是为了说明的目的，适宜的佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂和不完全佐剂、矿物盐和多核苷酸。其它适宜的佐剂包括单磷酸脂质A(MPL)、E.coli热不稳定肠毒素的突变衍生物、霍乱毒素的突变衍生物、CPG寡核苷酸以及来自角鲨烯的佐剂。
本发明还提供了包括或可选地主要包括或者还进一步包括任意一种本发明的多肽、类似物、突变体或片段的药物组合物，单独或互相组合或与其它试剂例如抗生素或可接受的载体或固体支持物组合。这些组合物对于本文所述的各种诊断及治疗方法是有用的。
多核苷酸
本发明还提供了编码一种或多种上述确定的分离或重组的多肽及其相应互补片段的分离或重组的多核苷酸。进一步提供了包含所述分离或重组的多核苷酸的载体，其例子是本领域公知的并且在本文有简要介绍。一方面，当超过一个分离或重组的多核苷酸作为一个单元表达时，所述分离或重组的多核苷酸可包含在多顺反子载体内。所述多核苷酸可以是DNA、RNA、mRNA或干扰RNA，例如siRNA、miRNA或dsRNA。
另一方面，本发明提供了一种干扰剂，其是一种干扰微生物生物膜内所述DNA与多肽或蛋白质结合的多核苷酸，或类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸、类似复制叉的三路交叉多核苷酸、具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸，其可治疗或抑制DNABII多核苷酸与微生物DNA结合以及治疗、预防或抑制微生物膜形成及相关的感染或紊乱。本领域技术人员可利用本文提供的信息以及本领域技术人员的知识制造这样的多核苷酸。参见Goodman和Kay(1999)J.Biological Chem.274(52):37004-37011以及Kamashev和Rouviere-Yaniv(2000)EMBO J.19(23):6527-6535。
本发明进一步提供了可操作地连接RNA转录启动子以及DNA或RNA复制和/或短暂或稳定表达的其它调节序列的分离或重组的多核苷酸。如本文所应用的，术语“可操作地连接”指以所述启动子可引导RNA从DNA分子转录出来的方式定位。所述启动子的例子是SP6、T4和T7。在某些具体实施方式中，细胞特异性启动子被用于所插入多核苷酸的细胞特异性表达。含有启动子或启动子/增强子、具有终止密码子和选择标记的序列以及DNA片段插入的多克隆位点的载体可以可操作地连接本领域已知的以及可商购获得的启动子。对于一般的方法和克隆策略，参见Gene Expression Technology(Goeddel主编，Academic Press,Inc.(1991))及其引用文献，以及Vectors:EssentialData Series(Gacesa和Ramji主编,John Wiley&Sons,N.Y.(1994))，其含有各种适宜载体的图谱、功能特性、商业供应商以及GenEMBL登录号参考。
在一个具体实施方式中，来自本发明所述多核苷酸的多核苷酸编码具有本文所述诊断和治疗用途的多肽或蛋白质，以及鉴定所述蛋白的转录是否存在的探针。这些核酸片段可通过例如通过较大多核苷酸的限制性内切酶消化制备，继而以可检测标志标记。或者，可应用所述分子的缺口翻译产生随机片段。这些片段的制备和标记方法参见Sambrook等，(1989)supra。
含有这些核酸的表达载体对获得宿主载体系统以生产蛋白质或多肽是有用的。这暗示这些表达载体必须可在宿主生物体内或者作为附加体或者作为染色体DNA不可分割的一部分复制。适宜表达载体的非限制性例子包括质粒、酵母载体、病毒载体和脂质体。因为腺病毒载体的高水平表达以及体外和体内的高效细胞转化，其在将基因导入体内组织时特别有用。当核酸插入到适宜宿主细胞时，例如原核或真核细胞以及所述宿主细胞复制体，所述蛋白可以重组产生。适宜的宿主细胞取决于所述载体并可包括应用已知方法构建的哺乳动物细胞、动物细胞、人类细胞、猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞以及细菌细胞。参见Sambrook等，(1989)supra。除了病毒载体用于插入外源核酸进入细胞的应用外，所述核酸可通过本领域已知的方法例如细菌细胞转化、用于哺乳动物细胞的应用磷酸钙沉淀的转染、或DEAE-葡聚糖、电穿孔或显微注射插入所述宿主细胞。方法参见Sambrook等，(1989)supra。因此，本发明还提供了一种含有编码蛋白质或多肽或抗体的多核苷酸的宿主细胞，例如哺乳动物细胞、动物细胞（大鼠或小鼠）、人类细胞或原核细胞例如细菌细胞。
多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果有，核苷酸结构的修饰可在多核苷酸组装之前或之后给予。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过以标签成分耦合。所述术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，本发明的任一具体实施方式中，多核苷酸涵盖双链形式以及每一个已知或预测构成双链形式的两条互补单链形式。
当所述载体用于体内或离体的基因治疗时，优选药学上可接受的载体，例如复制缺陷的逆转录病毒载体或腺病毒载体。含有本发明所述核酸的药学上可接受载体为了所插入多核苷酸的暂时或稳定表达可进一步地修饰。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”包括但不限于具有选择性靶向以及将所述核酸导入分裂细胞能力的载体或递送工具。这样的载体的例子是依据其不能产生病毒蛋白而定义的“复制缺陷型”载体，防范了所述载体在感染的宿主细胞中的传播。复制缺陷型逆转录病毒载体的例子是LNL6(Miller等，(1989)BioTechniques 7:980-990)。已经建立了应用复制缺陷型逆转录病毒的、用于逆转录病毒介导的基因标记的基因转移方法。(Bordignon(1989)PNAS USA86:8912-8952;Culver(1991)PNAS USA 88:3155;以及Rill(1991)Blood79(10):2694-2700)。
本发明还提供了含有和/或表达本发明所述多核苷酸的遗传修饰细胞。所述遗传修饰细胞可通过上游调节序列（例如启动子或基因活化剂）的插入产生（参见美国专利5,733,761）。
所述多核苷酸可偶联一个可检测标志，例如用于核酸检测和/或所述基因在细胞内表达的酶标签或放射性同位素。各种各样的可检测标志是本领域已知的，包括荧光、放射性、酶或其它配体，例如抗生物素蛋白/生物素，其能够给予可检测信号。一方面，人们可能会希望应用荧光素标签或酶标签例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶代替放射性或其它对环境不良的试剂。就酶标签而言，可应用热量指示底物提供人眼可见或分光光度法的方式，以确定与互补核酸含有样品的特异性杂交。因此，通过靶单链多核苷酸与本发明所述多核苷酸一部分的标记单链多核苷酸（探针）在允许互补单链多核苷酸杂交条件（优选中等严格杂交条件）下接触，或更优选地在高严格杂交条件下，本发明进一步提供了用于检测单链多核苷酸或其互补核酸的方法。杂交的多核苷酸对从未杂交的单链多核苷酸分离出来。所述杂交的多核苷酸对应用本领域技术人员已知的方法检测并阐述于例如Sambrook等,(1989)supra。
体现在本发明的多核苷酸可应用化学合成、重组克隆方法、PCR或其任意组合获得。多核苷酸化学合成的方法是本领域已知的并且不需要在此详细描述。本领域技术人员可应用本文所提供的序列数据，通过应用DNA合成仪或从商业服务订购获得所需的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以应用PCR分离或复制。所述PCR技术是美国专利4,683,195、4,800,159、4,754,065以及4,683,202的主题，并记载在PCR:The Polymerase ChainReaction(Mullis等主编,Birkhauser Press,Boston(1994))或者MacPherson等.(1991)以及(1995)supra、及其引用文献中。或者，本领域技术人员可应用本文提供的序列以及商业DNA合成仪复制所述DNA。相应地，本发明还提供了获得本发明的多核苷酸的方法，其通过提供所述多核苷酸的线性序列、核苷酸、合适的引物分子、化学制品例如酶以及用于其复制和化学复制或以正确方向连接核苷酸以获得所述多核苷酸的说明书。在一个单独的具体实施方式中，这些多核苷酸进一步分离。更进一步，本领域技术人员可在适宜的复制载体内插入所述多核苷酸并将所述载体插入适宜的宿主细胞（原核或真核）用于复制和扩增。本文进一步提供了通过该方法获得多核苷酸的方法以及如此获得的多核苷酸。
RNA可通过在适宜宿主细胞首次插入DNA多核苷酸获得。所述DNA可通过任意适宜的方法递送，例如通过适宜基因递送工具（例如脂质体、质粒或载体）的应用或通过电穿孔。当所述细胞复制及所述DNA转录为RNA时，所述RNA然后可应用本领域技术人员已知的方法分离，例如Sambrook等,(1989)supra阐述的。例如，mRNA可应用各种裂解酶或根据Sambrook等,(1989)supra阐述步骤的化学溶液分离，或通过核酸结合树脂按照厂商提供的附带说明提取。
显示与本发明多核苷酸序列互补或同源性的多核苷酸可用作杂交探针或作为本文所确定的特异性多核苷酸的等价物。由于转录的完整编码序列是已知的，该序列的任意部分或同源性序列可用于本发明的方法。
本领域已知“完全匹配”的探针不是特异性杂交必须的。通过少量碱基的取代、缺失或插入获得的探针序列微小变化并不影响杂交特异性。通常情况下，可容许20%的碱基对错配（最佳排列时）。优选用于检测上述mRNA的探针与所述同源区至少具有约80%同一性。更有选地，在同源区对齐后，所述探针与相应的基因序列具有85%同一性，甚至更优选地，其展示90%同一性。
这些探针可用于放射性分析（例如Southern blot及Northern blot分析）以检测、预后、诊断或检测各种细胞或含有这些细胞的组织。所述探针还可以附着于固体支持物或阵列例如用于检测对应本发明多核苷酸的基因表达的高通量筛选分析的芯片。相应地，本发明也提供了包含或对应本发明多核苷酸或其等价物或其互补核酸或其片段的探针，其附着在固体支持物上用于高通量筛选。
片段的总体大小以及互补延伸的大小取决于所述特定核酸片段的预期用途或应用。通常发现较小的分子用于杂交实施方式，其中所述互补区域的长度可变化，例如在至少5至10至约100个核苷酸之间，或甚至是根据人们希望检测的互补序列的全长。
通常优选具有过度延伸大于5-10个核苷酸长度的互补序列的核苷酸探针，以便增加所述杂交的稳定性和选择性，并从而提高获得的特定杂交份子的特异性。更有选地，人们可设计具有10个或多个或超过50个核苷酸长度或需要时甚至更长的基因互补延伸的多核苷酸。这样的片段可容易地制备，通过例如，通过化学方法直接合成所述片段，通过核酸复制技术、例如美国专利4,603,102所述的具有两个启动寡核苷酸的PCR技术或通过引导所选择序列进入重组载体而重组产生。一方面，探针为约50-75或可选地50-100个核苷酸长度。
本发明的多核苷酸可作为本文所述的表达于细胞内的基因或基因转录子检测的引物。在本发明的上下文中，扩增意味着采用引物依赖的聚合酶、能够以合理的保真度复制靶序列的任意方法。扩增可通过天然或重组的DNA聚合酶（例如T7DNA聚合酶、E.coli DNA聚合酶的Klenow片段）以及逆转录酶进行。仅作说明用途，引物与所确定的探针长度等长。
扩增多核苷酸的一种方法是PCR，并且PCR扩增的试剂盒是可商购获得的。扩增后，获得的DNA片段可通过本领域已知的任意适宜方法检测，例如通过琼脂糖凝胶电泳后以溴化乙锭染色以及紫外线照射的可视化。
已经开发了施用有效量的基因递送载体或工具至细胞的方法，并且是本领域技术人员已知以及本文所述的。用于检测基因表达的方法是本领域已知的，并包括例如与DNA微阵列杂交、原位杂交、PCR、RN酶保护分析以及Northern blot分析的技术。这些方法可用于检测和定量细胞内所述基因的表达。或者所述编码多肽的表达可通过各种方法检测。尤其是，它可用于制备与所述靶多肽特异性反应的多克隆或单克隆抗体。此类抗体可应用例如免疫组化、ELISA以及Western blotting的技术用于可视化表达所述多肽的细胞。这些技术可用于确定所表达多核苷酸的表达水平。
抗体及其衍生物
本发明还提供了结合和/或特异性识别并且结合用于本发明所述方法的分离多肽的抗体。所述抗体可以是本文所述的各种抗体，其非限制性例子包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人类抗体、镶嵌抗体、双抗体、人源化抗体、抗体衍生物、重组人源化抗体、或其衍生物或片段。一方面，所述片段包括或可选地主要包括或者还进一步所述抗体的CDR。一方面，所述抗体是被可检测标记的或进一步包含偶联的可检测标志。还提供了产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本文还进一步提供了包括或可选地主要包括或者还进一步包括一个或多个上述具体实施方式的组合物。进一步提供了编码所述抗体氨基酸序列的多核苷酸以及重组生产或化学合成所述抗体多肽及其片段的方法。所述抗体多肽可以再真核细胞或原核细胞中生产，或通过本领域已知的其它方法以及本文所述的方法。
抗体可应用本领域已知的传统技术产生并且在所述文献中有很好的记载。存在数种生产多克隆抗体的方法。例如，多克隆抗体通常通过适宜动物例如但不限于鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠以及兔子的免疫而产生。给所述哺乳动物注射抗原，其诱导B淋巴细胞产生特异于所述抗原的免疫球蛋白。免疫球蛋白可从哺乳动物的血清中纯化出来。特异于IHFα和IHFβ的抗体可通过相应于IHFα和IHFβ不同表位的多肽的注射而产生。例如，可应用每个亚单位的20个氨基酸例如IHFα的TFRPGQKLKSRVENASPKDE(SEQ ID NO.34)以及IHFβ的KYVPHFKPGKELRDRANIYG(SEQ ID No.35)产生抗体。这种方法的变化包括为了优化生产以及动物人道待遇的佐剂、给药途径和位点、每个位点的注射体积以及每一动物位点数的修改。例如，佐剂通常可用于改善或增强对抗原的免疫应答。大多数佐剂提供用于注射位点抗原储存，其允许抗原缓慢释放进入引流淋巴结。其它的佐剂包括在大的表面积上提高蛋白质抗原浓度的表面活性剂以及免疫调节分子。用于多克隆抗体产生的佐剂的非限制性例子包括弗氏佐剂、Ribi佐剂系统以及Titermax。多克隆抗体可应用本领域已知的方法产生，其记载于美国专利7,279,559、7,119,179、7,060,800、6,709,659、6,656,746、6,322,788、5,686,073以及5,670,153。
单克隆抗体可应用本领域已知的传统杂交瘤技术以及文献中很好描述了的方法产生。例如，杂交瘤可通过适宜永生化细胞系（例如，骨髓瘤细胞系例如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SS1、Sp2SA5、U397、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A、CHO、PerC.6、YB2/O）或等等、或异质骨髓瘤及其融合产物、或由其衍生的任意细胞或融合细胞、或本领域已知的任意其它适宜细胞系（参见，下述网址的那些，例如atcc.org,lifetech.com，2007年11月26日最后登录）与抗体产生细胞的融合产生，所述抗体产生细胞例如但不限于，分离或克隆的脾、外周血、淋巴结、扁桃体或其它免疫或B细胞包含细胞，或表达重链或轻链恒定区或可变区或框架结构或CDR序列的任意其它细胞，或者是内源性或外源性核酸或者是重组或内源性的，病毒、细菌、藻类、原核、两栖类、昆虫、爬行类、鱼类、哺乳动物、啮齿类、马、绵羊、山羊、绵羊、灵长类、真核、基因组DNA、cDNA、rNDA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、rRNA、单链、双链或三链、杂交的等等或者其任意组合。抗体产生细胞还可以由已经过目标抗原免疫的人类或其它适宜动物的外周血、或优选脾脏或淋巴结获得。任何其它适宜的宿主细胞也可用于编码本发明的抗体、特定片段或其变体的外源性或内源性核酸的表达。可应用选择性培养条件或其它已知的适宜方法分离所述融合细胞（杂交瘤）或重组细胞，并通过有限稀释或细胞分选或其它已知方法克隆。
可应用其它适宜的方法生产或分离具有所需特异性的抗体，包括但不限于，由肽或蛋白质文库选择重组抗体的方法（例如但不限于，噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA等等展示文库，例如可从各个商业供应商如MorphoSys(Martinsreid/Planegg,Del.)、BioInvent(Lund,Sweden)、Affitech(Oslo,Norway)应用本领域已知的方法获得。本领域已知的方法记载于专利文献，其中一些包括美国专利,704,692、5,723,323、5,763,192、5,814,476、5,817,483、5,824,514、5,976,862。替代方法依赖于转基因动物（例如SCID小鼠，Nguyen等(1977)Microbiol.Immunol.41:901-907(1997)；Sandhu等(1996)Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118；Eren等(1998)Immunol.93:154-161）的免疫接种，其能够产生人类抗体产品，如本领域已知的和/或本文所述。这些技术包括但不限于，核糖体展示（Hanes等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942;Hanes等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14130-14135），单细胞抗体生产技术（例如选择淋巴细胞抗体方法("SLAM")(美国专利5,627,052,Wen等(1987)J.Immunol.17:887-892;Babcook等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-7848)），凝胶微滴和流式细胞仪(Powell等(1990)Biotechnol.8:333-337;One Cell Systems,(Cambridge,Mass).;Gray等(1995)J.Imm.Meth.182:155-163;以及Kenny等(1995)Bio.Technol.13:787-790)，B细胞选择(Steenbakkers等(1994)Molec.Biol.Reports 19:125-134)。
本发明的抗体衍生物还可以通过编码本发明抗体的多核苷酸递送至适宜宿主而制备，以至于提供了转基因动物或哺乳动物，例如山羊、奶牛、马、绵羊等等，其在乳液中生产这种抗体。这些方法是本领域已知的，并记载于例如美国专利5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362以及5,304,489。
术语“抗体衍生物”包括所述抗体或片段的线性多肽序列的翻译后修饰。例如美国专利6,602,684B1描述了乙二醇形式修饰抗体的产生，包括全抗体分子，抗体片段，或包括免疫球蛋白Fc区的等价区域、具有增强的Fc介导的细胞毒性的融合蛋白，以及由此产生的糖蛋白。
本发明的抗体还包括任意类型分子通过共价结合修饰所述抗体、使得所述共价结合不阻止所述抗体产生抗独特性应答的衍生物。抗体衍生物包括但不限于，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护性/封闭基团的衍生化、蛋白水解裂解、与细胞内配体或其它蛋白质连接等修饰的抗体。另外，所述衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。
抗体衍生物还可通过递送本发明的多核苷酸以提供转基因植物和产生所述抗体、植物器官或由此培养的植物细胞内的特定部分或变体的培养植物细胞（例如但不限于烟草、玉米以及浮萍）而制备。例如，Cramer等(1999)Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118及其引用的参考文献记载了表达大量重组蛋白的转基因烟叶的产生，例如用于可诱导启动子。转基因玉米已被用于商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其具有与在其它重组系统生产或由天然来源纯化的相等生物活性。参见例如Hood等(1999)Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147及其引用的参考文献。抗体衍生物包括抗体片段例如单链抗体(scFv's)还可以从转基因植物种子大量生产，包括烟草种子和马铃薯块茎。参见例如Conrad等(1998)Plant Mol.Biol.38:101-109及其引用的参考文献。因此，抗体还可根据已知的方法应用转基因植物生产。
抗体衍生物还可以通过例如添加外源序列以修饰免疫原性或降低、增强或修饰结合、亲和、打开率、离解率、亲和力、特异性、半衰期或任意其它适宜特性。保留了非人类或人类CDR序列的全部或一般部分，但可变区和恒定区的非人类序列被人类的或其它的氨基酸置换。
通常，所述CDR残基直接并最显著地影响抗原结合。抗体的人源化或工程化可应用任意的本领域已知方法进行，例如但不限于美国专利5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539以及4,816,567所记载的那些。
本发明的嵌合、人源化或灵长类抗体可基于应用标准分子生物学技术制备的参照单克隆抗体的序列制备。编码免疫球蛋白所述重链和轻链的DNA可从感兴趣的杂交瘤获得并应用标准分子生物学技术改造以含有非参考（例如人类）免疫球蛋白序列。例如，为制造嵌合抗体，小鼠的可变区可应用本领域已知的方法连接人类的恒定区（美国专利4,816,567）。为制造人源化抗体，小鼠CDR区可应用本领域已知的方法插入到人源框架区（美国专利5,225,539和5,530,101、5,585,089、5,693,762以及6,180,370）。相似地，为制造灵长类抗体，小鼠CDR区可应用本领域已知的方法插入到灵长类的框架区(WO93/02108以及WO 99/55369)。
用于制备部分或完全的人源抗体的技术是本领域已知的并可应用任何此类的技术。根据一个具体实施方式，完全人源抗体序列在转基因小鼠中制备，所述小鼠已被改造表达人重链和轻链抗体基因。已制得多个品系的此类转基因小鼠，其可生产不同类别的抗体。可产生所需抗体的转基因小鼠的B细胞可融合制备杂交瘤细胞系以持续生产所需抗体。（参加例如，Russel等(2000)Infection and Immunity April 2000:1820-1826;Gallo等(2000)European J.of Immun.30:534-540;Green(1999)J.of Immun.Methods 231:11-23;Yang等(1999A)J.of Leukocyte Biology 66:401-410;Yang(1999B)Cancer Research59(6):1236-1243;Jakobovits(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42;Green和Jakobovits(1998)J.Exp.Med.188(3):483-495;Jakobovits(1998)Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4):607-614;Tsuda等(1997)Genomics 42:413-421;Sherman-Gold(1997)Genetic Engineering News 17(14);Mendez等(1997)Nature Genetics 15:146-156;Jakobovits(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology,The IntegratedImmune System Vol.IV，194.1-194.7;Jakobovits(1995)Current Opinion inBiotechnology 6:561-566;Mendez等(1995)Genomics 26:294-307;Jakobovits(1994)Current Biology 4(8):761-763;Arbones等(1994)Immunity 1(4):247-260;Jakobovits(1993)Nature 362(6417):255-258;Jakobovits等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(6):2551-2555;以及美国专利6,075,181.)。
本发明的抗体还可被修饰以制造嵌合抗体。嵌合抗体是由超过一个物种的DNA编码抗体的重链及轻链各个域的抗体。参见例如美国专利4,816,567。
或者，本发明的抗体还可以修饰以制造镶嵌抗体。镶嵌抗体是一个物种的抗体的外部氨基酸残基被另一物种合理取代或镶嵌，使得第一物种的抗体在第二物种中不具有免疫原性，从而降低了所述抗体的免疫原性。由于蛋白质的抗原性主要取决于其表面性质，抗体的免疫原性可通过取代暴露残基而降低，其与在另一哺乳动物物种抗体中通常所发现的不同。外部残基的合理替换应当极少或不影响内部结构域或域间接触。因此，作为限于可变区框架残基改变的结果，配体结合特性应当不受影响。这种方法被称为“镶嵌”是因为仅仅抗体的外表或皮肤被改变，支持残基不受干扰。
“镶嵌”过程使用了Kabat等(1987)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,4th ed.,Bethesda,Md.,National Institutes of Health汇编的人源抗体可变区可获得的序列数据，该数据库的更新，以及其它可获得的美国及外国数据库（核酸和蛋白质）。用于产生镶嵌抗体的方法的非限制性例子包括EP 519596、美国专利6,797,492、以及Padlan等(1991)Mol.Immunol.28(4-5):489-498所记载的。
术语“抗体衍生物”还包括“双抗体”，其是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含一个连接至同一肽链的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。（参见例如EP 404,097、WO 93/11161以及Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448）。通过在同一链的两个结构域间应用足够短而不能配对的接头，所述结构域被迫与另一链的互补结构域配对并造成两个抗原结合位点（也参见美国专利6,632,926至Chen等人，其公开了具有一个或多个氨基酸插入亲本抗体的高变区并且对靶抗原的结合亲和力比亲本抗体对靶抗原的结合亲和力至少强约2倍的抗体）。
术语“抗体衍生物”进一步包括工程抗体分子、片段及单个结构域例如scFv、dAbs、纳米抗体、小分子抗体、Unibodies以及Affibodies(Holliger&Hudson(2005)NatureBiotech 23(9):1126-36;美国专利公开US 2006/0211088;PCT公开W02007/059782;美国专利5,831,012)。
术语“抗体衍生物”进一步包括“线性抗体”。用于制备线性抗体的过程是本领域已知的并描述于Zapata等(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062。简要地，这些抗体包含形成一对抗原结合结构域的一对随机Fd片段(VH-CH 1-VH-CH1)。线性抗体可以是双特异或单特异的。
本发明的抗体可以通过已知方法包括但不限于蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析以及凝集素层析来回收和纯化。高效液相色谱("HPLC")也可用于纯化。
本发明的抗体包括天然纯化的产品、化学合成步骤的产品、以及通过重组技术从真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞、或可选地从上述的原核宿主生产的产品。许多的抗体生产系统记载于Birch&Radner(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58:671-685。
如果待测抗体与蛋白质或多肽结合，则待测抗体和本发明所提供的抗体是等价的。还可以不经过过度实验，通过检测待测抗体是否阻止本发明的抗体结合与所述抗体通常是反应性的蛋白质或多肽，确定抗体是否具有与本发明所述抗体相同的特异性。如果如本发明的单克隆抗体结合降低所示，所述待测抗体与本发明的抗体竞争，则很可能这两种抗体结合相同或密切相关的抗原表位。或者，人们可将本发明的抗体与其通常是反应性的蛋白质预孵育，并检测所述待测抗体结合抗原的能力是否被抑制。如果所述待测抗体被抑制，则在所有可能性中，其与本发明的抗体具有相同或密切相关的表位特异性。
术语“抗体”还旨在包括所有免疫球蛋白同种型和子类的抗体。单克隆抗体的特定同种型可通过或者从起始融合的选择直接制备，或通过应用近亲选择技术应用Steplewski等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8653or Spira et al.(1984)J.Immunol.Methods 74:307所记载的步骤分离类别转换变体、从分泌不同同种型单克隆抗体的亲本杂交瘤次级制备。或者，可以应用重组DNA技术。
具有本文所述单克隆抗体特异性的其它单克隆抗体的分离，也可以经本领域普通技术人员通过抗独特型抗体的产生来完成。Herlyn等(1986)Science 232:100。抗独特型抗体是能够识别感兴趣的单克隆抗体所呈现的独特决定簇的抗体。
在本发明的某些方面，可检测地或治疗性地标记所述抗体是有用的。适宜的标记如supra所述。偶联抗体至这些试剂的方法是本领域已知的。仅为了说明的目的，抗体可应用可检测基团例如放射性原子、发色团、荧光基团等标记。此类标记的抗体可用于诊断技术，或者在体内，或者在分离测试样品中。
抗体与低分子量半抗原的耦合可增加所述抗体在测试中的敏感度。所述半抗原随后可以通过第二反应的方式被特异性地检测。例如，常见应用例如生物素（其与抗生物素蛋白反应）、或二硝基苯酚、吡哆醛以及荧光素（其可与特异性康半抗原抗体反应）的半抗原。参见Harlow以及Lane(1988)supra。
本发明所述抗体的可变区可通过突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内的氨基酸残基而修饰以提高所述抗体的一种或多种结合特性（例如亲和性）。突变可通过位点定向诱变或PCR介导的诱变引入，并且其在抗体结合上的效果或其它感兴趣的功能特性可在体外或体内试验适当评价。优选导入保守氨基酸修饰并通常在一个CDR域内改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。
可对所述抗体进行框架修饰以降低免疫原性，例如通过“回复突变”一个或多个框架残基至相应的种系序列。
此外，本发明的抗体可被设计在Fc域内包含修饰以改变所述抗体的一种或多种特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖型细胞的细胞毒。此类修饰包括但不限于，铰链区半胱氨酸残基数量的改变以协助轻链和重链的装配或提高或降低所述抗体的稳定性（美国专利5,677,425），以及Fc铰链区的氨基酸突变以降低所述抗体的生物半衰期（美国专利6,165,745）。
此外，本发明的抗体可被化学修饰。抗体的糖基化可被改变，例如通过修饰所述抗体序列内一个或多个糖基化位点以增加所述抗体对抗原的亲和力（美国专利5,714,350和6,350,861）。或者，为增加抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，可通过改变的糖基化机制在宿主细胞内表达所述抗体，获得具有降低岩藻糖残基数量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分葡萄糖结构的抗体(Shields,R.L.等2002J.Biol.Chem.277:26733-26740;Umana等1999Nat.Biotech.17:176-180)。
本发明的抗体可通过所述抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)或PEG的活性酯或醛衍生物，在一个或多个PEG基团开始连接所述抗体或抗体片段的条件下反应而被PEG化以增加生物半衰期。抗体的PEG化可通过与反应性PEG分子（或反应性水溶性多聚物的类似物）的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所述，术语“聚乙二醇”旨在包括已用于衍生化其它蛋白质的任意形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可以是糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的并可应用于本发明的所述抗体（EP0154316以及EP0401384）。
此外，抗体可通过偶联或融合所述抗体的抗原结合区至血清蛋白例如人血清白蛋白而化学修饰，以增加结果分子的半衰期。这样的方法是，例如记载于EP0322094以及EP0486525。
本发明的抗体或其片段可偶联诊断试剂并用于诊断，例如监测疾病的发展或进程并确定给定治疗方案的效果。诊断试剂的效果包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、应用不同的正电子发射断层扫描的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁金属离子。可检测物质或者可直接耦合或偶联所述抗体或其片段，或者应用本领域已知技术通过接头间接地耦合或偶联。适宜的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。适宜的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。适宜的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三唑嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或枣红蛋白。发光材料的例子包括鲁米诺。生物发光材料的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。适宜的放射性材料的例子包括125I、131I、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199以及铅-211。单克隆抗体可通过与所述抗体共价结合的双官能螯合剂的应用间接与放射性金属例子偶联。螯合剂可通过胺(Meares等,1984Anal.Biochem.142:68-78)、氨基酸残基的巯基(Koyama 1994Chem.Abstr.120:217262t)以及糖基(Rodwell等.1986PNAS USA 83:2632-2636;Quadri等.1993Nucl.Med.Biol.20:559-570)连接。
进一步的，本发明的所述抗体或其片段可偶联治疗剂。适宜的治疗剂包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、睾丸素、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘诺尔、以及嘌呤霉素、抗代谢物（如氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，氟达拉滨，5-氟尿嘧啶，氮烯咪胺，羟基脲，天冬酰胺酶，吉西他滨，克拉屈滨）、烷基化剂（如氮芥，thioepa，苯丁酸氮芥，美法仑，卡氮芥（BSNU），洛莫司汀（CCNU），环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌素，达卡巴嗪（DTIC），丙卡巴肼，丝裂霉素C，顺铂及其它铂衍生物，如卡铂）、抗生素（如放线菌素D（前身为放线菌素），博来霉素，柔红霉素（原柔红霉素），多柔比星，伊达比星，普卡霉素，丝裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素，氨茴霉素（AMC））、白喉毒素和相关的分子（如白喉A链及其活性片段和杂交分子）、蓖麻毒素（如蓖麻毒蛋白A或去糖基化的蓖麻蛋白A链毒素）、霍乱毒素、志贺样毒素（SLT-I，SLT-II，SLT-IIV）、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆包曼-毕尔克蛋白酶抑制剂、绿脓杆菌外毒素、alorin、皂草、莫迪素、gelanin、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-次黄嘌呤、油桐蛋白、二蒽蛋白、美洲商陆蛋白（PAPI，PAPII，以及PAP-S）、苦瓜抑制剂、核糖体失活蛋白、巴豆毒素、sapaonaria地榆抑制剂、白树种子储藏蛋白、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、伊洛霉素以及混合的毒素。
其它适宜的偶联分子包括核糖核酸酶(RNase)、DNase I、反义核酸、抑制性RNA分子例如siRNA分子、免疫刺激核酸、适体、核酶、三链形成分子以及外部引导序列。适体是15-50碱基长度变化的小核酸，其折叠进入确定的二级和三级结构，例如茎-环或者四G碱基体，并且可结合小分子例如ATP(美国专利5,631,146)和茶碱(美国专利5,580,737)，以及大分子例如逆转录酶(美国专利5,786,462)和凝血酶(美国专利5,543,293)。核酶是能够催化或者是分子外或者是分子内的化学反应的核酸分子。核酶通常经过与随后裂解的靶分子底物的识别和结合裂解核酸底物。三链形成功能核酸分子可以通过形成三链分子与双链或单链核酸相互作用，其中DNA的三条链形成依赖Watson-Crick以及Hoogsteen碱基配对的复合物。三链分子可以以高亲和力和特异性结合靶区域。
功能性核酸分子可用作效应子、抑制子、调节子以及靶分子所具有的特异活性的刺激剂，或者功能性核酸分子可具有从头独立于其它任何分子的活性。所述治疗剂可应用许多可用的方法直接或间接连接所述抗体。例如，试剂可通过二硫键形成在还原抗体成分的铰链区应用交联剂例如N-琥珀酰3-(2-吡啶基)丙酸(SPDP)、或通过抗体Fc区域的碳水化合物基序(Yu等1994Int.J.Cancer 56:244;Upeslacis等,"Modification ofAntibodies by Chemical Methods,"in Monoclonal antibodies:principles andapplications,Birch等主编,页码187-230(Wiley-Liss,Inc.1995);Price,"Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,"in Monoclonalantibodies:Production,engineering and clinical application,Ritter等主编,页码60-84(Cambridge University Press 1995))连接。
偶联所述治疗性试剂至抗体的技术是本领域公知的(Amon等,"MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",在MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy内,Reisfeld等主编,pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom等，"Antibodies For Drug Delivery",在Controlled Drug Delivery内(第二版),Robinson等主编,pp.623-53(Marcel Dekke r,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",在Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications内,Pinchera等主编,pp.475-506(1985);"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody in Cancer Therapy",在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy内,Baldwin等主编,pp.303-16(Academic Press 1985),以及Thorpe等,"ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"1982Immunol.Rev.62:119-58)。
本发明的抗体或其抗原结合区域可连接另一功能分子例如受体的另一抗体或配体，以生成结合至少两个或多个不同结合位点或靶分子的双特异性或多特异性分子。所述抗体与一个或多个其它结合分子例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物的连接，可通过例如化学耦合、基因融合或非共价结合完成。多特异性分子可进一步包含除第一和第二靶表位外的第三结合特异性。
双特异性和多特异性分子可应用本领域已知的方法制备。例如，双特异性分子的每个结合单元可分别生成继而彼此偶联。当所述结合分子是蛋白质或肽时，可应用各种耦合或交联剂以共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A，碳化二亚胺，N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA），5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB），邻-亚苯基（oPDM），N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫）丙酸酯（SPDP），以及磺基琥珀酰亚胺基4-（N-马来酰亚胺基甲基）环以正己烷-I-羧酸酯（磺基-SMCC）(Karpovsky等,1984J.Exp.Med.160:1686;Liu等,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。当所述结合分子是抗体时，它们可通过两条重链C末端铰链区的巯基键偶联。
本发明所述的抗体或其片段可连接对细胞有毒的基序至结合形成“消耗”抗体的所述抗体。当本申请需要耗尽NK细胞时，这些抗体是特别有用的。
本发明的抗体还可连接固体支持物，其特别有用于所述靶抗原的免疫检测或纯化。这样的固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
所述抗体还可以结合许多不同的载体。因此，本发明还提供了含有所述抗体和另一活性或惰性物质的组合物。公知的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然或改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及磁铁。载体的性质根据本发明的目的或者是可溶性的或者是不溶性的。本领域技术人员知晓用于结合单克隆抗体的其它适宜载体，或能够应用常规实验确定此类载体。
APCs的分离、培养和扩增（包括树突状细胞）
本发明还提供了包含一个或多个本发明的分离多肽或分离多核苷酸或所述载体的分离的宿主细胞。一方面，所述分离的宿主细胞是真核细胞例如抗原呈递细胞(APC)，例如树突状细胞。另一方面，所述分离宿主细胞是原核细胞。一方面，本发明是在促进所述多核苷酸表达的条件下培养的分离的宿主细胞。本发明还提供了所述宿主细胞、表达系统以及由该表达系统生产的多肽。
下面是APC分离的两个基本途径的简要说明。这些途径涉及（1）由血液分离骨髓前体细胞(CD34+)并刺激他们分化为APC，或者（2）由外周血收集前定向的（precommitted）APC。在第一个途径中，所述患者必须以诸如GM-CSF的细胞因子治疗以增加外周血中循环的CD34+干细胞的数量。
用于分离APCs的第二个途径是收集已在血液中循环的相对大量的前定向APCs。以前用于由人外周血分离定向APCs的技术涉及物理过程如甲泛影酰胺梯度以及粘附/非粘附步骤(Freudenthal等.(1990)PNAS 87:7698-7702)，Percoll梯度分离(Mehta-Damani等.(1994)J.Immunol.153:996-1003)，以及荧光激活细胞分选技术(Thomas等.(1993)J.Immunol.151:6840-52)。
一种用于将大量细胞彼此分离的技术被称为对流离心淘析法(CCE)。细胞样品置于特定的淘析转子上。所述转子然后以恒定速率例如3000rpm旋转。一旦所述转子到达所需速率，加压空气用于控制细胞的流速。淘析器中的细胞同时经受离心以及流速持续增加的缓冲液洗出水流。这产生了主要根据但不完全根据细胞大小的级分细胞分离。
在本发明的一个方面，所述APC是前定向的或者是能够由哺乳动物例如小鼠、类人猿或人类的白血细胞级分中分离成熟树突状细胞(参见例如,WO 96/23060)。所述白血细胞级分可从哺乳动物的外周血获得。这种方法包括以下步骤：(a)提供通过本领域已知的方法例如白细胞分离术由哺乳动物来源获得的白血细胞级分；(b)将步骤(a)中的白血细胞级分通过对流离心淘析分为四小份或更多份，(c)通过所述细胞与钙离子载体、GM-CSF和IL-13或者GM-CSF和IL-4接触，刺激步骤(b)来源的一个或多个级分的单核细胞转变为树突状细胞，(d)确定步骤(c)来源的树突状细胞富集级分，以及(e)收集步骤(d)所述的富集级分，优选在约4°C。确定所述树突状细胞富集级分的一个方法是通过荧光激活细胞分选技术。所述白血细胞级分可以在其它细胞因子例如重组(rh)rhIL-12、rhGM-CSF或rhIL-4存在下以钙离子载体处理。所述白血细胞级分的细胞在分离步骤前可在缓冲液中冲洗并悬浮于无Ca++/Mg++的培养基。所述白血细胞级分可通过白细胞分离术获得。所述树突状细胞可通过至少一个下述标志的存在确定：HLA-DR、HLA-DQ或B7.2，同时没有下述标志：CD3、CD16、CD56、CD57以及CD19、CD20。特异于这些细胞表面标志的单克隆抗体是可商购获得的。
更特别地，所述方法要求由白细胞分离术收集富集的白细胞和血小板，从而通过对流离心淘析(CCE)进一步级分(Abrahamsen等.(1991)J.Clin.Apheresis.6:48-53)。在这种技术中，细胞同时经受离心和流速持续增加的缓冲液洗出水流。这产生了主要根据但不完全根据细胞大小的级分细胞分离。
APC以及更特异性DC集合的质量控制及其在培养中的成功活化的确定，依赖于检测单核细胞和树突状细胞亚群以及可能的污染T淋巴细胞的同时多色FACS分析技术。细胞分选是基于细胞表面标志的差异表达，包括CD3(T细胞)、CD16/CD56/CD57(NK/LAK细胞)以及CD19/CD20(B细胞)。DCs有别于单核细胞部分基于CD14的水平，相对于DCs其在单核细胞上以极高的水平表达。DCs在血液中循环时显示出高水平表达的HLA-DR、显著的HLA-DQ和B7.2(但很少或没有B7.1)（此外，它们表达Leu M7和M9，其也是单核细胞和中性粒细胞表达的髓系标记）。
当与用于分析死亡细胞的第三种显色剂组合时，碘化丙啶(PI)，有可能正确识别所有的细胞亚群。
收集时的FACS分析的目标是确认所述DCs在期望的级分中富集、检测中性粒细胞污染以及确保适当的标记表达。适合于临床应用的、由人类外周血快速批量收集富集的DCs，完全依赖于上述用于质量控制的分析性FACS技术。如果有必要，成熟DCs可在这一点通过用于“鸡尾酒阴性”细胞的荧光分选立即从单核细胞分离。可能没有必要从单核细胞常规分离DCs，因为所述单核细胞本身仍然能够培养分化为DCs或功能性DC样细胞。
一旦收集，所述DC富集/单核细胞APC级分（通常是150-190）能够汇集并被冻存以备将来使用，或立即置于短期培养。
或者，他人已报道了用于上调（激活）树突状细胞并将单核细胞转化为活化的树突状细胞表型的方法。该方法涉及钙离子载体加入到培养基，将单核细胞转化为活化的树突状细胞。钙离子载体A23187的添加，例如在24-48小时培养期的开始，导致一致活化以及所汇集的“单核细胞+DC”级分的树突状细胞表型转化：典型地，所述活化群体称为统一的CD14(Leu M3)阴性，并且上调了HLA-DR、HLA-DQ、ICAM-1、B7.1以及B7.2。此外，这种活化的混合群体像以进一步纯化的少量群体为基础的一样功能良好。
细胞因子的特定组合已成功用于放大（或部分代替）以钙离子载体获得的所述活化/转化：这些细胞因子包括但不限于纯化或重组的("rh")rhGM-CSF、rhIL-2以及rhIL-4。每种细胞因子单独给予时不足以最优化上调。
抗原呈递至APC
为了免疫的目的，所述多肽(例如,SEQ ID NO.1至33)可作为蛋白质/肽或者以编码所述蛋白质/肽的cDNA的形式递送给抗原呈递细胞。抗原呈递细胞(APCs)可包括树突状细胞(DCs)、单核细胞/巨噬细胞、B淋巴细胞或表达必需的MHC/共刺激分子的其它细胞。下述的方法主要集中于DCs，其是最有效力的、优选的APCs。
通过在体外/离体将APCs暴露于本发明的抗原蛋白或多肽完成冲击。所述蛋白或多肽以1-10μm的浓度添加至APCs约3小时。应用编码抗原或抗原多肽的多核苷酸的APC转染，通过APCs在本领域已知的转染试剂（包括但不限于阳离子脂质）存在时暴露于所述核酸而实现。转染的或冲击的APCs可随即经静脉内、皮下、鼻内、肌内或腹膜内的递送途径给药所述宿主。
蛋白质/肽抗原还可以和佐剂一起经静脉内、皮下、鼻内、肌内或腹膜内的递送途径体内递送。
培养的抗原呈递细胞
Foster抗原呈递细胞是特别有用的靶细胞。Foster APCs是从人源细胞系174XCEM.T2（称为T2）分离的，其具有在抗原加工过程中限制内源性肽与细胞表面MHC I类分子结合的突变(Zweerink等.(1993)J.Immunol.150:1763-1771)。这归结于涵盖TAP1、TAP2、LMP1以及LMP2基因的MHC II区域大量的纯合性缺失，其是抗原呈递给MHC I类限制性CD8+CTLs所需的。实际上，仅有“空载”MHC I类分子存在于这些细胞的表面。添加至培养基的外源肽结合这些MHC分子，表明所述肽含有等位基因特异的结合基序。这些T2细胞在本文中称为"foster"APCs。它们可用于配合本发明呈递抗原。
以特异性重组MHC等位基因转导T2细胞，容许MHC限制性分布重新定向。所述重组等位基因的定制文库将优选由其呈递，因为所述锚定残基将有效阻止结合所述内源性等位基因。
MHC分子的高表达使得APC更容易被CTLs识别。在T2细胞内应用强力转录启动子(例如CMV启动子)表达感兴趣的MHC等位基因，产生了更具活性的APC（最可能是由于所述细胞表面更高浓度的活性MHC-肽复合物）。
免疫效应细胞的扩展
本发明应用这些APCs以刺激抗原特异性免疫效应细胞富集群体的产生。所述抗原特异性免疫效应细胞消耗所述APCs（死亡于培养物中）而扩增。所述幼稚免疫细胞由其它细胞驱动的方法主要描述于Coulie(1997)Molec.Med.Today 3:261-268。
如上所述制备的APCs与幼稚免疫效应细胞混合。优选地，所述细胞在细胞因子例如IL2存在下培养。因而树突状细胞分泌强效的免疫调节细胞因子，例如IL-12，因而可能不需要在扩增第一轮和连续两轮添加补充细胞因子。在任何情况下，所述培养条件是，抗原呈递细胞的扩展（即增殖）速率比APCs高得多。可进行APCs以及可选的细胞因子的多重输注以进一步扩展抗原特异性细胞群体。
在一个具体实施方式中，所示免疫效应细胞是T细胞。在一个单独的具体实施方式中，所述免疫效应细胞可通过编码例如IL-2、IL-11或IL-13的转基因转导而基因修饰。体外、离体以及体内转导转基因的方法是本领域已知的。
抗体功能分析
本发明的抗体可用于纯化本发明的多肽以及鉴定抗体和/或多核苷酸的生物学等价物。它们还可用于鉴定修饰本发明所述多肽功能的试剂。这些抗体包括多克隆抗血清、单克隆抗体，以及来自本领域技术人员熟悉的以及前述的这些制剂的各种试剂。
中和由所鉴定基因编码蛋白的活性的抗体还可在体内或体外应用，以证明在体内及体外测试系统加入所述中和抗体的功能。它们还可用作药剂以调节本发明所述多肽的活性。
各种抗体制剂还可用于诸如ELISA实验或Western blots的分析方法以证明由所鉴定基因编码的蛋白质通过测试细胞在体外或体内的表达。代谢期间通过蛋白酶降解产生的此类蛋白质的片段还可以通过应用适当的多克隆抗血清以及来自试验样品的样本确定。
本发明的抗体可用于免疫或增强免疫，单独或与多肽或蛋白质为基础的疫苗或树突状细胞为基础的疫苗组合。
组合物
进一步提供了组合物。所述组合物包含载体以及一个或多个本发明的分离多肽、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的分离的宿主细胞、本发明的小分子或抗体。所述载体可以是一个或多个固体支持物或药学上可接受的载体。所述组合物可进一步包含佐剂或其它适合作为疫苗给药的其它成分。一方面，所述组合物配制有一个或多个药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂。此外，本发明所述组合物的具体实施方式包含一个或多个本发明的分离多肽、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、小分子、本发明的分离的宿主细胞、或本发明的抗体，配制有一个或多个药学上可接受的辅料。
对于口服制剂，任意一种或多种本文所述的分离或重组的多肽、本文所述的分离或重组的多核苷酸、本文所述的载体、本文所述的分离的宿主细胞、本文所述的小分子或抗体，可单独或以本发明的药物制剂的形式使用，包括或主要包括，所述化合物与适当的添加剂组合以制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与传统的添加剂如乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与分解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂。药学相容的结合剂和/或辅助材料可作为组合物的一部分包括在内。所述片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等等可含有任意的下述成分或具有相似性质的化合物：结合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；分解试剂例如藻酸、普里莫凝胶或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如胶体二氧化硅；增甜剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
适于口服给药的药物制剂及单位剂量形式在慢性疾病、感染的治疗以及患者自施用药物的治疗中特别有用。一方面，所述制剂特别用于小儿给药。
本发明提供了药物制剂，其中一种或多种本发明的分离多肽、本发明的分离多核苷酸、本发明的载体、本发明的分离的宿主细胞或本发明的抗体可通过其在水溶剂或非水溶剂中溶解、悬浮或乳化配制入与符合本发明的用于注射的配方，所述非水溶剂例如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇；并且如果需要，具有常用的添加剂例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂或其它抗微生物剂。此类物质的非限制性例子是抗微生物剂例如其它疫苗组分如表面抗原例如OMPP5、rsPilA、OMP 26、OMP P2、IV型菌毛蛋白(参见Jurcisek和Bakaletz(2007)J.ofBacteriology 189(10):3868-3875以及Murphy,TF,Bakaletz,LO和Smeesters,PR(2009)The Pediatric Infectious Disease Journal,28:S121-S126)以及抗菌剂。对于静脉给药，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany,N.J.)、或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，用于胃肠外给药的组合物必须是无菌的并且应该是易于注射的流体。
本发明所提供的气雾剂可通过吸入给药并可以是基于推进剂的或非基于推进剂的。例如，本发明的药物制剂的具体实施方式包括配制入压力可接受推进剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等的本发明的化合物。对于吸入给药，所述化合物可以以来自压力容器或含有合适推进剂例如一种诸如二氧化碳的气体分配器或喷雾器的喷雾形式递送。非推进剂的非限制性例子是通过机械力方式（即以手指往下推活塞或通过容器的压缩，例如通过施加给容器壁的压缩力或由容器壁自身的弹力（例如通过弹性囊））从封闭容器喷射的喷雾泵。
本发明的栓剂可通过本发明化合物与任何各种的碱例如乳化剂碱或水溶性碱混合而制备。本发明化合物的这种药物制剂的具体实施方式可通过栓剂直肠给药。所述栓剂可包括运载工具例如可可脂、碳氮化蜡和聚乙二醇，其在体温下熔解但在室温下固化。
可提供口服或直肠给药的单位剂量形式例如糖浆剂、酏剂和悬浮液，其中每一剂量单元例如茶匙、汤匙、片剂或栓剂包含预设量的含有一个或多个本发明化合物的组合物。相似地，注射或静脉给药的单位剂量形式可包含组合物如无菌水、生理盐水或另一药学上可接受载体中的溶液中的本发明的化合物。
本发明的药物制剂的具体实施方式包括一个或多个的本发明的分离的多肽、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、用于本发明的小分子、本发明的分离的宿主细胞或本发明的抗体配制在可注射组合物内的那些药物制剂。本发明的可注射药物制剂制备成液体溶液或悬浮液，或适合于溶解、悬浮或注射前液体运输的固体形式。所述制剂还可被乳化或者所述活性成分被封装在符合本发明所述药物制剂的其它实施方式的脂质体内。
在一个具体实施方式中，配制一个或多个本发明的分离的多肽、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的分离的宿主细胞、或本发明的抗体用于通过连续递送系统的递送。术语“连续递送系统”在本文可与“受控递送系统”互换使用并且涵盖了连续（或受控）递送设备（例如泵）与导管、注射设备等等本领域已知的各种物质相组合。
机械或机电式输液泵也适于本公开的应用。此类设备的例子包括那些描述于，例如美国专利4,692,147、4,360,019、4,487,603、4,360,019、4,725,852、5,820,589、5,643,207、6,198,966等等。通常，本发明所述化合物的递送可应用任意各种可重复灌装的泵系统来完成。泵提供了随时间推移连续地受控释放。某些具体实施方式中，本发明的化合物是药物防渗容器内的液体制剂，并以连续的方式递送给个体。
在一个具体实施方式中，所述药物递送系统是一种至少部分可植入的装置。所述可植入装置可应用本领域公知的方法和装置在任意适宜植入位点植入。植入位点是药物递送装置导入并定位在受试者身体内的位点。植入位点包括但不必要限于真皮下、皮下、肌内或患者身体内的其它适宜位点。由于其植入以及从所述药物递送装置移除的便捷性，真皮下植入位点用于某些具体实施方式。
适于本公开应用的药物释放装置可基于任意各种操作模式。例如，所述药物释放装置可基于扩散系统、对流系统或侵蚀系统（例如一种以侵蚀为基础的系统）。例如，所述药物释放装置可以是电化学泵、渗透泵、电渗泵、蒸汽压泵、或渗透破裂基质，例如，当所述药物整合入多聚物，所述多聚物提供了伴随药物浸渍聚合材料（例如，可生物降解的药物浸渍聚合材料）降解的药物制剂释放。在其它具体实施方式中，所述药物释放装置基于电扩散系统、电解泵、泡腾泵、压电泵、水解系统等等。
基于机械或机电输液泵的药物释放装置还可适用于本公开的应用。此类装置的例子包括那些描述于，例如美国专利4,692,147、4,360,019、4,487,603、4,360,019、4,725,852等等。通常，受试者治疗方法可应用任意各种可重复灌装的、非可交换泵系统完成。通常优选泵及其它对流系统，归结于它们通常随时间推移更连续地受控释放。渗透泵应用于某些具体实施方式，归结于它们更连续地受控释放与相对小尺寸的组合优势（参见例如，PCT申请公开WO 97/27840以及美国专利5,985,305和5,728,396）。示例性的适于本公开应用的渗透驱动装置包括但不必要限于美国专利3,760,984、3,845,770、3,916,899、3,923,426、3,987,790、3,995,631、3,916,899、4,016,880、4,036,228、4,111,202、4,111,203、4,203,440、4,203,442、4,210,139、4,327,725、4,627,850、4,865,845、5,057,318、5,059,423、5,112,614、5,137,727、5,234,692、5,234,693、5,728,396等等所描述的。适于本公开的进一步示例性装置是Synchromed输液泵(Medtronic)。
在某些具体实施方式中，所述药物递送装置是可植入装置。所述药物递送装置可应用本领域公知的方法和装置在任意适宜植入位点植入。正如文中提到的，植入位点是药物递送装置导入并定位在受试者身体内的位点。植入位点包括但不必要限于皮下、真皮下肌内或患者身体内的其它适宜位点。
本发明化合物的适宜赋形剂载体是，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合。此外，如果需要，所述载体可含有少量辅助物质例如润湿剂或乳化试剂或pH缓冲剂。制备此类剂型的方法对本领域技术人员是已知的，或在考虑本公开后是显而易见的。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,第17版,1985。任何情况下，待施用所述组合物或制剂含有足以在接受治疗的受试者内获得所需状态的化合物的量。
本发明的组合物包括包含了持续释放或受控释放基质的那些组合物。此外，本发明的具体实施方式可用于与应用持续释放试剂的其它治疗配合。如本文所述，持续释放基质是由通常是可通过酶或基于酸的水解或通过溶解降解的聚合物物料制备的基质。一旦插入体内，所述基质被酶和体液作用。所需的持续释放基质选自生物相容性物质例如脂质体、聚丙交酯（聚乳酸）、聚乙交酯（乙醇酸的聚合物）、聚丙交酯共乙交酯（乳酸和乙醇酸的共聚物）、聚酐、聚（原）酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂类、多糖类、核酸、聚氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚丙烯、聚乙烯基吡咯烷酮和聚硅氧烷。示范性生物降解基质包括聚丙交酯基质、聚乙交酯基质、以及聚丙交酯共乙交酯（乳酸和乙醇酸的共聚物）基质。
另一具体实施方式中，所述干扰剂（以及组合的组合物）在受控释放系统中递送。例如，本发明的化合物可应用静脉输液、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它给药模式给药。在一个具体实施方式中，可应用泵(Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwald等.(1980)Surgery 88:507;Saudek等.(1989)N.Engl.J.Med.321:574)。在另一具体实施方式中，应用聚合物物质。在又一具体实施方式中，受控释放系统置于所述治疗靶点（即肝脏）的附近，因此仅需要全身性剂量的一部分。在又一具体实施方式中，受控释放系统置于所述治疗靶点附近，因此仅需要全身性剂量的一部分。其它受控释放系统在Langer的综述(1990)Science 249:1527-1533中有讨论。
在另一具体实施方式中，本发明的所述组合物（以及单独地或组合在一起的组合物）包括通过在吸收性材料中注入本文所述抑制剂而形成的例如缝合线、绷带以及纱布，或包被在固相材料表面的，例如手术缝合钉、拉链和导管以递送所述组合物。对本领域技术人员来说，这种类型的其它递送系统在考虑本即时公开后是显而易见的。
本发明提供了给药宿主（例如人类）一个或多个干扰剂用于微生物感染的治疗的方法和组合物。在各种具体实施方式中，本发明的这些方法横跨适于药物递送的几乎任意可用方法以及途径，包括体外和离体方法，以及全身性和局部给药途径。
筛选实验
本发明提供了用于筛选等价试剂的方法，例如本文所述多克隆抗体的等价单克隆抗体，以及调节本发明所述活性试剂和药物组合物活性或者本发明所述多核苷酸编码的多肽或肽产品功能的各种试剂。为了本发明的目的，“试剂”旨在包括但不限于生物或化学类化合物例如简单或复杂的有机或非有机分子、肽、蛋白质（例如抗体）、多核苷酸（例如反义）或核酶。可以合成大量的化合物，例如多聚物如多肽和多核苷酸，以及基于各种核心结构的合成有机化合物，并且这些也包括在术语“试剂”中。此外，各种天然来源可提供用于筛选的化合物，例如植物或动物提取物等等。应当理解，尽管并不总是明确说明，所述试剂单独或与另一与本发明筛选鉴定的试剂具有相同或不同生物活性的试剂组合应用。
一个具体实施方式是用于筛选能够与所述DNA-DNABII（例如IHF）相互作用、结合或抑制DNA-DNABII相互作用的试剂的方法。本发明在图6B中提供了所述微生物DNA和IHF的立体结构。相应地，本公开允许应用虚拟设计技术也称为计算机辅助、在硅片上设计或模拟以设计、选择并合成能够与所述DNA-DNABII（例如IHF）相互作用、结合或抑制DNA-DNABII相互作用的试剂。反过来，候选试剂可有效用于治疗生物膜和本文所述的相关疾病或状态（医疗、工业或兽医用）。因此，本公开也提供了由硅片上方法鉴定或设计的试剂。
IHF-DNA复合物的立体结构在图6B中有说明，并且Protein Data Bank提供了一种具有X、Y、Z坐标的代表结构，登录号1IHF，Rice等.Cell 87:1295-1306(1996)提供了相关细节。IHF-DNA复合物中IHF蛋白质的立体结构可用于所述筛选方法。适宜试剂是人们相对于IHF-DNA复合物中相互作用的IHF蛋白质结构定位的、鉴定为涉及与DNA相互作用的至少1个、或可选地2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个或至少10个氨基酸残基。
图6A应用E.coli IHF序列(SEQ ID NO:42)作为例子，说明了涉及IHF-DNA相互作用的氨基酸残基。图6A中由较低水平箭头标明的氨基酸残基在下面以粗体和下划线的字母进一步描述。亦即，对于E.coli IHF，所述涉及DNA结合的氨基酸是T4、K5、A6、E28、Q43、K45、S47、G48、N51、R55、K57、R60、R63、N64、P65、K66、R76、T80、R82或Q85。
MAL
Figure BDA00002167913600661
EMSE  YLFDKLGLSK  RDAKELV
Figure BDA00002167913600662
LF  FEEIRRALEN  GE
Figure BDA00002167913600663
V
Figure BDA00002167913600664
LFG
Figure BDA00002167913600671
FDL
Figure BDA00002167913600672
D
Figure BDA00002167913600673
NQ
Figure BDA00002167913600674
PGTGED IPITA
Figure BDA00002167913600676
RVV
Figure BDA00002167913600677
F
Figure BDA00002167913600678
PG
Figure BDA00002167913600679
KLKSR VENASPKDE (SEQ IDNO:42)
因此，本公开的一个具体实施方式提供了用于鉴定抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA结合的试剂，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解受试者中生物膜，或抑制、预防或治疗在受试者体内产生生物膜的微生物感染的计算机实现方法，包括针对整合宿主因子(IHF)蛋白的候选试剂的立体结构定位，其中IHF蛋白质的立体结构是基于IHF和DNA复合物的晶体形式确定的X、Y、Z原子结构坐标，其中所述试剂与IHF在两个或多个选自如SEQ ID NO:42所示的T4、K5、A6、E28、Q43、K45、S47、G48、N51、R55、K57、R60、R63、N64、P65、K66、R76、T80、R82或Q85的IHF氨基酸或其等价物相互作用，鉴定所述试剂抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA的结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解生物膜，或抑制、预防或治疗产生生物膜的微生物感染。
一方面，候选试剂在氨基酸63、64、65或66中的一个、或两个或三个与IHF蛋白质作用。一方面，候选试剂在氨基酸R63、N64、P65、K66中的一个、或两个或三个与IHF蛋白质作用。另一方面，候选试剂在63或66中的至少一个与IHF蛋白质作用。另一方面，候选试剂在R63或K66中的至少一个与IHF蛋白质作用。
本领域中应当理解，确切的位置及氨基酸残基根据所述IHF序列变化。然而，本领域技术人员基于所述序列容易确定此类位置和氨基酸残基。例如，IHF序列可以与如表9中示出的E.coli IHF序列(SEQ ID NO:42)对准，以揭示对应于与DNA作用的E.coliIHF氨基酸的那些氨基酸。同样，IHF-DNA复合物中的此类IHF序列的立体结构可用于所述筛选。
除了本发明提供的计算机实现的方法，本公开还提供了订制的计算机系统，其包括例如处理器、存储器和/或用于执行所述方法的程序，以及计算机可读介质例如储存执行所述方法的适当计算机程序或代码的非暂时性计算机可读介质。
相应地，另一具体实施方式提供了定制的计算设备，包括：
至少一个处理器；
偶联所述至少一个处理器的存储器；
与所述存储器和至少一个处理器通讯的存储介质，所述存储介质含有一套处理器可执行指令，当其被配置处理器的定制计算设备执行以鉴定抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解受试者体内的生物膜，或抑制、预防或治疗在受试者体内产生生物膜的微生物感染的试剂，其中所述配置包括：
定位抗整合宿主因子(IHF)蛋白质立体结构的候选试剂的立体结构，其中IHF蛋白质的立体结构是基于IHF和DNA复合物的晶体形式确定的X、Y、Z原子结构坐标，其中所述试剂与IHF在两个或多个选自如SEQ ID NO:42所示的T4、K5、A6、E28、Q43、K45、S47、G48、N51、R55、K57、R60、R63、N64、P65、K66、R76、T80、R82或Q85的IHF氨基酸或其等价物相互作用，鉴定所述试剂抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA的结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解生物膜，或抑制、预防或治疗产生生物膜的微生物感染。
又一具体实施方式提供了包含一套处理器可执行指令的非暂时计算机介质，当其被处理器执行时，鉴定抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解受试者体内的生物膜，或抑制、预防或治疗在受试者体内产生生物膜的微生物感染的试剂，包括针对整合宿主因子(IHF)蛋白的候选试剂的立体结构定位，其中IHF蛋白质的立体结构是基于IHF和DNA复合物的晶体形式确定的X、Y、Z原子结构坐标，其中所述试剂与IHF在两个或多个选自如SEQID NO:42所示的T4、K5、A6、E28、Q43、K45、S47、G48、N51、R55、K57、R60、R63、N64、P65、K66、R76、T80、R82或Q85的IHF氨基酸或其等价物相互作用，鉴定所述试剂抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA的结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解生物膜，或抑制、预防或治疗产生生物膜的微生物感染。
硅片分子上的或药物设计的方法是本领域公知的，通常参见Kapetanovic(2008)Chem Biol.Interact.,171(2):165-76。简要地，所述立体结构的原子坐标被输入计算机使得所述结构的图像和各种参数在屏幕上显示。该设计通常涉及立体结构至所述靶分子的立体结构的定位。所述定位可通过使用者及计算机图形界面的辅助控制，并可通过搜寻潜在良好匹配的计算机算法进一步引导。定位还涉及所述立体结构之一或两者围绕任意尺寸的移动。
然后，将所产生的数据输入虚拟的化合物库和/或试剂库。由于虚拟库被包含在虚拟筛选软件例如DOCK-4(Kuntz,UCSF)内，上述的数据可输入这样的软件内。可应用虚拟或非虚拟药物候选化合物立体结构数据库例如MDDR(Prous Science,西班牙)搜索候选试剂。
发现候选试剂能够结合DNA和/或DNABII蛋白质，如果在所述候选试剂与一方或两方之间发现所需的相互作用。所述相互作用可定量，例如相互作用的强度和/或作用位点的数量，或定性例如相互作用或缺乏相互作用。相应地，该方法的输出可定量或定性。因此，一方面，本公开还提供了用于鉴定不能抑制所述相互作用或可选地增强DNA和蛋白质之间相互作用的试剂的方法。
试剂例如小分子化合物的潜在抑制或结合效应（即相互作用或关联）可在其实际合成前分析并通过应用计算机模拟技术测试。如果给定化合物的理论结构提示其与生物膜内的微生物DNA和/或DNABII蛋白之间不足以相互作用及关联，所述试剂的合成和测试可以省却。然而，如果计算机模拟提示强烈的相互作用，然后可以合成所述试剂并应用各种方法例如体外或体内实验来测试其结合或抑制所述相互作用的能力。测试试剂单独或与另一试剂连接而抑制或中和生物膜的方法如本文所述。以这种方式，可避免失效试剂及化合物的合成。
本领域技术人员可应用几种方法中的任一种筛选化学或生物学实体或片段，为了它们与DNABII或微生物DNA以及更特异地与特异性结合位点结合的能力。所选择的片段或化学实体然后可以在各种方向定位，或停驻在DNA或DNABII多肽的个体结合位点内。停驻可通过应用软件例如QUANTA、SYBYL，后随以标准的分子力学力场例如CHARMM和AMBER的能量最小化和分子动力学来完成。
商用计算机程序也可用于硅片上的设计。例子包括但不限于GRID(OxfordUniversity,Oxford,UK)、MCSS(Molecular Simulations,Burlington,Mass.)、AUTODOCK(Scripps Research Institute,La Jolla,Calif.)、DOCK(University ofCalifornia,San Francisco,Calif.)、GLIDE(Schrodinger Inc.)、FlexX(Tripos Inc.)以及GOLD(Cambridge Crystallographic Data Centre)。
一旦通过上述方法设计或选择了一个试剂或化合物，可以测试所述试剂或化合物相互结合的效率并通过计算机评估优化。例如，一种有效的DNABII片段或优选证明在其结合状态及自由状态之间能量差异相对较小（即，小的结合形变能）。
设计或选择的化合物可进一步计算机优化使得在其结合状态下，其优选与所述靶蛋白缺乏静电斥力作用。此类非互补作用（例如，静电的）包括电荷-电荷、偶极-偶极、以及电荷-偶极的斥力作用。特异地，当所述试剂或化合物结合DNABII或生物膜内微生物DNA之间的一种试剂时，优选所述试剂与DNABII和/或生物膜内微生物DNA之间的静电作用总和对结合焓作出中性或正面的贡献。
计算机软件也可用于本领域以评估化合物形变能以及静电相互作用。例子包括但不限于Gaussian 92[Gaussian,Inc.,Pittsburgh,Pa.]，AMBER[University of California atSan Francisco]，QUANTA/CHARMM[Molecular Simulations,Inc.,Burlington,Mass.]，以及Insight II/Discover[Biosysm Technologies Inc.,San Diego,Calif.]。
一旦结合试剂如上所述最佳选择或设计，然后可取代其某些原子或支链基团以提高或修饰其结合特性。通常，最初的取代是保守的，即，取代基团与原始基团具有几乎相同的大小、形状、疏水性和电荷。应当理解，应当避免本领域已知的改变构型的成分。然后可以通过与上文详述相同的计算机方法分析此类取代化学化合物适于所述DNABII蛋白质和/或生物膜内微生物DNA的效率。
一个优选具体实施方式是一种筛选能与本发明所述蛋白质或多核苷酸作用的小分子的方法。为了本发明的目的，“小分子”是具有低分子量(MW)的分子，其在一个具体实施方式中能够结合感兴趣的蛋白质从而改变所述蛋白的功能。优选，小分子的MW不超过1000。筛选可改变蛋白质功能的小分子的方法是本领域已知的。例如，You等.(1997)Chem.Biol.4:961-968所讨论的用于检测细胞内小分子-蛋白质作用的小型化阵列分析。
为在体外实践所述筛选方法，首先提供了以待治疗的微生物感染的适宜细胞培养物或组织。所述细胞条件培养（温度、生长或培养基质以及气体(CO2)）适宜时间量以获得没有密度依赖限制的指数增殖。保留作为对照的不被感染的额外独立细胞培养物也是可取的。
正如本领域技术人员所显而易见的，适宜细胞可在微量滴定板中培养，并且通过标明微量滴定板中的基因型变化、表型变化或衰减同时分析数种试剂。
当所述试剂是DNA或RNA以外的组合物时，例如上述的小分子，所述试剂可直接添加至细胞培养物或添加至用于添加的培养基。正如本领域技术人员所显而易见的，必须添加能够凭经验确定的有效量。
当所述试剂是抗体或抗原结合片段时，所述试剂可与本文所述的靶抗原及多克隆抗体在实行竞争性ELISA的条件下接触或孵育。此类方法是本领域技术人员已知的。
还可以在受试者体内实行所述方法。当所述受试者是例如大鼠、南美栗鼠、小鼠或类人猿的动物时，所述方法提供了可用于人类患者的试剂临床测试之前的合适动物模型系统。在该系统中，如果与未治疗的具有相同感染的动物相比较，所述疾病或微生物感染的症状减少或消除，候选试剂是强效药物。具有一个健康且未经治疗的独立阴性对照细胞组或动物组也是有用的，其提供了用于比较的基础。
所述试剂和组合物可用于药物生产，以及用于通过与常规步骤相符的给药例如药物组合物中的活性成分的人类及其它动物的治疗。
联合治疗
本发明的组合物及相关方法可用于与其它疗法的给药相组合。这包括但不限于DN酶、抗生素、抗菌剂或其它抗体的给药。
在某些具体实施方式中，所述方法和组合物包括与抗DNABII抗体协同作用的脱氧核糖核酸酶(DNase)。DNase是催化DNA骨架内磷酸二酯键裂解的酶。已知不仅靶向十字型结构，而且靶向DNA各种二级结构的DNase的三个非限制例子包括DNAse I、T4EndoVII以及T7Endo I。在某些具体实施方式中，当与DNase组合时，破坏所述生物膜所需的抗DNABII抗体有效量降低。当体外给药时，所述DNase可直接添加至所述实验或已知稳定所述酶的适宜缓冲液中。DNase的有效单位剂量及实验条件可根据本领域已知的方法改变及优化。
在其它具体实施方式中，所述方法和组合物可与抗生素和/或抗菌剂组合。抗菌剂是杀死或已知微生物如细菌、真菌或原生动物生长的物质。尽管生物膜通常耐受抗生素的作用，本文所述的组合物和方法可用于使涉及生物膜的感染对用于治疗感染的传统治疗方法敏感。在其它具体实施方式中，抗生素或抗菌剂与本文所述方法和组合物的组合应用使得抗菌剂和/或生物膜还原剂的有效量减小。用于与本发明所述方法组合的抗菌剂和抗生素的一些非限制性例子包括阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢地尼、阿奇霉素以及磺胺甲噁唑-甲氧苄氨嘧啶。与生物膜还原剂组合的抗菌剂和/或抗生素的治疗有效剂量可以很容易地通过传统方法确定。在某些具体实施方式中，与生物膜还原剂组合的抗菌剂剂量是已显示在其它细菌感染中有效的平均有效剂量，例如细菌感染其中所述感染的病因不包括生物膜。在其它具体实施方式中，所述剂量是平均有效剂量的0.1、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0或5倍。所述抗生素或抗菌剂可在添加抗DNABII抗体之前、同时或之后添加。
在其它具体实施方式中，所述方法和组合物可与治疗细菌感染的抗体组合。可用于与本文所述的方法和组合物组合的抗体的例子是，抗不相关外膜蛋白的抗体（即OMPP5）。单独以该抗体处理不能压实体外的生物膜。以该抗体和生物膜还原剂组合治疗产生了比两种中任一试剂在相同浓度下单独使用所能获得的效果更大的效果。当与生物膜还原剂或减少生物膜的方法组合时可产生协同效应的其它抗体包括抗rsPilA、抗OMP26、抗OMP P2以及抗完整OMP制剂。
本文所述的组合物和方法可用于使涉及生物膜的细菌感染对治疗不具有生物膜的细菌感染有效、但在治疗涉及生物膜的细菌感染方面无效的常规治疗方法致敏。在其它具体实施方式中，本文所述的组合物和方法可用于与有效治疗涉及生物膜的细菌感染的治疗方法组合，但此类附加治疗剂与生物膜还原剂或方法的组合产生了协同效应，使得所述生物膜还原剂或附加治疗剂的有效剂量可以减小。在其它情况下，此类附加治疗剂和生物膜还原剂或方法的组合产生了使治疗增强的协同效应。治疗的增强可通过治疗感染所需时间更短来证实。
附加治疗可在用于减少所述生物膜的方法或组合物之前、同时或之后添加，并可包含在相同的剂型内或作为独立的剂型。
试剂盒
还要求了含有体外及体内实施本文所述方法所必需的试剂及说明书的试剂盒。相应地，本发明提供了用于实施这些方法的试剂盒，其可包含本发明的干扰剂以及用于执行本发明方法例如收集组织和/或实施筛选、和/或分析结果、和/或使用本文规定的有效剂量干扰剂的说明书。这些可以单独使用或与其它适宜的抗菌剂组合。
例如，试剂盒可包括或可选地主要包括或进一步包含一种或多种的分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或者其片段或等价物；分离或重组的表8、表9、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽或者其片段或等价物；分离或重组的SEQ ID NO.1-33的多肽或者其片段或等价物；分离或重组的SEQ ID NO.5-11、28、29或表8或表10所确定的C末端多肽或者其片段或等价物；与整合宿主因子竞争结合微生物DNA的多肽；类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；编码上面所提到的任一种多肽的分离或重组的多核苷酸；特异性识别或结合上面所提到的任一种多肽的抗体或者其等价物或抗体，或与DNABII蛋白或多肽竞争性结合微生物DNA小分子，以及使用说明书。所述试剂盒可进一步包含一个或多个佐剂、抗原肽或抗菌剂。载体的例子包括液体载体、药学上可接受的载体、固相载体、药学上可接受的载体、药学上可接受的多聚物、脂质体、胶束、植入物、支架、糊剂、凝胶剂、牙科植入物或医用植入物。
下述实施例旨在解释并且不限制本文所公开的发明。
实验
实验1
IHF抗体、蛋白质和多肽由Nash慷慨赠予。生产它们的方法是本领域技术人员公知的，例如Granston和Nash,(1993)J.Mol.Biol.,234:45-59;Nash等,(1987)Journal ofBacteriology,169(9):4124-4127;以及Rice等,(1996)Cell,87:1295-1306所记载的。简要地，为过量生产IHF-α，himA基因被插入到细菌质粒pAD284的PL启动子上游。已接受所需质粒的K5607株系转化体、C600himA42株系λ溶源体通过能够生长噬菌体Mu(13)的氨苄青霉素抗性转化体而鉴定。根据标准DNA分离技术由himA+转化体制备DNA，并且所述himA基因的起始通过限制性酶切确定。himA基因在正确起始通过PL启动子表达的pPLhimA-1质粒被转化进入N5271株系，其含有表达cI857热诱导抑制子的隐蔽λ噬菌体以产生K5770株系。
为过度生产IHF-β，应用了含有IHF-、噬菌体λPL启动子编码序列融合的pKT23-hip323质粒。pKT23-hip323被导入N5271以产生E443株系。为便于另一质粒存在下pKT23-hip323的选择，其可选择标志由氨苄青霉素抗性(bla+)转为氯霉素抗性(cat+)。含有cat的片段根据Flamm和Weisberg所述由pBR325质粒分离并插入bla内的独特的ScaI位点。连接的DNA被导入E403株系，其携带hip突变并合成温度敏感X抑制子，并在低温下选择氯霉素抗性转化体。一个这样的转化体(E735)是hip+并且氨苄青霉素敏感的，因而其似乎携带pKT23-hip323的bla cat+衍生物(pE735)。
为产生过度生产IHF的两个亚单位的株系，以pPLhimA-1质粒转化E735，选择已成为氨苄青霉素抗性以及保留氯霉素抗性的转化体(E738)。过度表达IHF两个亚单位的第二株系的生成依赖于pPLhip himA-5质粒的构建，其通过连接含有pheT和himA基因的钝（SstII限制性酶切位点）进入pKT23-hip323质粒制备。这进一步详细记载于Nash等,(1987)J.of Bacteriology,169(9):4124-4127。K5607株系的himA+转化体通过HimA+筛选鉴定，并且所述质粒DNA通过限制性消化分析。在所有质粒结构明显的情况下，两个拷贝的himA被连接作为进入载体的串联重复。不清楚该质粒上两个拷贝himA基因的存在是否是所述选择所要求的，但应该指出的是，质粒pPLhimA-1内的单拷贝himA基因足以补充himA突变。pPLhiphimA-5质粒用于转化N5271株系以产生K5746株系。
细胞在TBY培养基（每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物以及5g氯化钠）内31°C振荡水浴生长。在对数中期（在650nm的光密度，ca.0.6），所述细胞转移至42°C水浴并继续振荡。通常，离心300ml培养物并以含有20mM NaCl的0.6-0.9ml TEG(20mMTris盐酸(pH 7.4),1mM EDTA钠,10%甘油)悬浮。所述细胞以6个20s的超声脉冲破碎，每次脉冲之间间隔40s。超声提取物的一部分在Sorvall SS34转子中15,000rpm离心20分钟。
所述超声提取物的样品按照标准分子生物学技术通过十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳进行分析。
IHF纯化按照下述完成：3.6升一批次的细胞诱导3小时。所有后续步骤在0-4°C进行。来自3.3升的细胞沉淀以10ml含有20mM NaCl的TEG悬浮得到29ml的总体积；该悬浮液分为两批，每批接受通过90s间隔的6次脉冲的3分钟超声。所述超声提取物在15,000rpm离心20分钟，产生16.9ml的澄清提取物。10%(体积/体积)的聚乙烯亚胺(polymin P,BDH Chemicals Ltd.)溶液(1.1ml)被缓慢加入所述澄清提取物；在搅拌20分钟后，所述混合物在10,000rpm离心30分钟。获得的沉淀以10ml含有500mM NaCl的TEG悬浮；在搅拌15分钟后，所述混合物在12,000rpm离心20分钟。通过添加3.2g硫酸胺，所述上清(10.3ml)被调节至50%饱和，搅拌20分钟，并在15,000rpm离心15分钟。获得的上清通过添加1.64g硫酸铵调节至70%饱和，搅拌20分钟，并在15,000rpm离心15分钟。获得的沉淀以1ml TG(含有10%甘油的50mM Tris盐酸(pH 7.4))悬浮并透析两份变化的TG。上样所述透析物质(2.0ml)至1-ml(0.5×5.8cm)的以TG平衡的磷酸纤维素层析柱(P11;Whatman,Inc.)。所述层析柱以3ml的TG洗涤并以20ml的KCL线性梯度(0-1.2M)TG冲洗。收集0.5ml的分数，储存在-20°C，并分析IHF活性。
抗IHF多克隆抗体按如下方法制备。以250μg纯化IHF和完全弗氏佐剂注射兔子。250μgIHF和不完全弗氏佐剂的加强免疫在1、7以及12周后给予。如通过IHF免疫印迹法确定的，在初始注射13周后收集的血清具有高滴度的IHF反应性物质。所述动物保留数年，并且必要时给予进一步的加强免疫以保持其血清内的高滴度抗IHF。所述抗体不进一步纯化。原始血清在-70°C储存。
特异于每个亚单位的抗体通过应用相应于每个亚单位(SEQ ID Nos.34和35)的C末端最末20个氨基酸残基的合成多肽产生，以依据Ditto等,(1994)J.of Bacteriology,176(12):3738-3748免疫兔子。
实验2
该实验描述了8孔室玻片内已建立生物膜逆转的体外模型。用于该实验的物质是：巧克力琼脂；sBHI(具有2mg heme/mL以及2mg b-NAD/mL的BHI)；8孔室玻片(Nunc*Lab-Tek*Fisher catalog#12-565-18)；0.9%无菌生理盐水；LIVE/DEAD BacLight细菌存活试剂盒(Fisher catalog#NC9439023)以及福尔马林。
第一天，在巧克力琼脂上敲击(struck)NTHI用于分离。然后其在37°C及5%CO2孵育20小时。次日，细菌以5mL平衡(37°C,5%CO2)的sBHI悬浮，并在sBHI中调节光密度至OD490=0.65。细菌在平衡的sBHI中1:6稀释(1mL细菌悬液+5mL sBHI)。然后细菌在37°C  5%CO2下静止孵育3小时（OD490约为0.65）。接下来，所述细菌在平衡sBHI中1:2500重新稀释，并且将200mL的细菌稀释液添加至所述室玻片的每个孔。对于稀释，10μL细菌被添加至eppendorf管(ep管)内的990μL sBHI，以及8μL稀释液被添加至每个室内的192μL sBHI，并在37°C,5%CO2静态孵育。
第三天，在孵育16小时后，为了不干扰生物膜，通过从所述孔的角落吸取培养基而将培养基从室内吸走。然后200mL的平衡sBHI被添加至每个室并在37°C,5%CO2静态孵育8小时。8小时后，吸取所述培养基并给每个未处理室添加200mL平衡sBHI；并添加200mL以1:50sBHI稀释的干扰剂例如兔抗rsPilA以及200ML以1:50sBHI稀释的幼稚兔血清（或其它适宜的血清参照）。然后它们在37°C及5%CO2静态孵育。
第四天，在大约孵育16小时后，吸取sBHI并且以200mL无菌生理盐水洗涤所述生物膜两次。吸取所述生理盐水并添加200mL活/死细胞(Live/Dead)染料。接下来，添加1mL含有3mL组分A加3mL组分B的10mM磷酸盐缓冲液。然后在室温静态避光孵育15分钟。吸取染料并且以200mL无菌生理盐水洗涤生物膜两次。吸取生理盐水并添加200mL福尔马林以固定生物膜。然后在室温静态避光孵育15分钟。吸取福尔马林并以200mL无菌生理盐水洗涤生物膜两次。移除垫片并且将盖玻片放置在载玻片上；盖玻片以指甲油密封并且在通过激光共聚焦显微镜观看前干燥。
应用这种方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于鼻窦炎、支气管炎、中耳炎和慢性阻塞性肺疾病加重(COPD)的由流感嗜血杆菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有11.68μm平均厚度的4.24μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有1.31μm平均厚度的0.53μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度88.8%的减小以及生物量87.5%的减少。
根据标准技术应用纯化的整合宿主因子(IHF)在兔子中制备抗E.coli IHF的多克隆抗血清。实验1记载了来自E.coli的IHF的表达和纯化。
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于龋齿的由变形链球菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有5.43μm平均厚度的1.17μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有0.47μm平均厚度的0.1μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度91.3%的减小以及生物量91.6%的减少。体外生物膜测定在不同的日子重复3次。最大高度、平均厚度以及生物量的减小百分数如下表1所述。
表1
Figure BDA00002167913600751
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于局限性和弥漫性皮肤感染、慢性鼻窦炎以及院内感染的由金黄色葡萄球菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有2.2μm平均厚度和17.5μm生物膜高度的0.3μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有1.1μm平均厚度和8μm生物膜高度的0.3μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度48.8%的减小以及生物量2.7%的减少（图7）。
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于COPD加重以及中耳炎的由卡他莫拉菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有1.48μm平均厚度的0.72μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有0.65μm平均厚度的0.13μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度55.8%的减小以及生物量82.1%的减少。体外生物膜测定在不同的日子重复3次。最大高度、平均厚度以及生物量的减小百分数如下表2所述。
表2
Figure BDA00002167913600761
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于鼻窦炎、肺炎和中耳炎的由肺炎链球菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有3.99μm平均厚度的0.64μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有0.82μm平均厚度的0.14μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度79.5%的减小以及生物量78.6%的减少。体外生物膜测定在不同的日子重复3次。最大高度、平均厚度以及生物量的减小百分数如下表3所述。
表3
Figure BDA00002167913600762
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于囊性纤维化、肺炎、皮肤和软组织感染以及医疗设备上的由铜绿假单胞菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有25.70μm平均厚度和40μm生物膜高度的7.0μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有10.3μm平均厚度和27.5μm生物膜高度的3.4μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度60.1%的减小以及生物量50.8%的减少（图7）。
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了由淋病中的淋病奈瑟氏菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有22.02μm平均厚度和40μm生物膜高度的9.5μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有3.4μm平均厚度和27.5μm生物膜高度的0.8μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度84.5%的减小以及生物量92.1%的减少（图7）。
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于尿路感染的由尿路致病性大肠杆菌产生的生物膜。未经治疗的生物膜块测量为具有31.73μm平均厚度的1.75μm3/μm2。治疗后，所述生物膜块减小为具有1.62μm平均厚度的0.75μm3/μm2。因此，这显示了平均厚度94.9%的减小以及生物量56.9%的减少。体外生物膜测定在不同的日子重复3次。最大高度、平均厚度以及生物量的减小百分数如下表4所述。
表4
应用该方法和抗IHF抗体，申请人减小了多见于皮肤感染的由表皮葡萄球菌产生的生物膜。体外生物膜测定在不同的日子重复3次。最大高度、平均厚度以及生物量的减小百分数如下表5所述。
表5
Figure BDA00002167913600772
实验3
中耳感染（或中耳炎，OM）是一种全球普遍流行的疾病，每年困扰全球0.5-3.3亿儿童。OM的社会经济负担也很大，单在美国每年耗费估计50-60亿美元。已知OM的所有三种主要的细菌性病原体在体外和体内均形成生物膜，并且最近，临床医生们开始意识到OM的慢性及复发归结于（至少部分地）中耳腔内细菌生物膜的形成。在OM的南美栗鼠模型中，幼年南美栗鼠首先被给予病毒性“感冒”，一周后它们接受活细菌接种的滴鼻攻击。类似于人类的“我孩子患了感冒并且一周后得了耳部感染”的状况，南美栗鼠也在攻击后大约一周发展为细菌性OM，并在经历病毒性上呼吸道感染。一旦细菌获得进入中耳的途径（或者通过耳咽管的提升，或者随直接攻击至中耳空间），它们将形成强大的生物膜。申请人因而考虑并的确使用了本文所报告的南美栗鼠模型以证明快速地解决已存在生物膜的IHF免疫的保护性效果。该模型还可用于通过抗DNABII抗体的被动递送或通过已知结合IHF或其它DNABII家族成员的小分子或其它试剂的递送用于治疗途径。
因为南美栗鼠模型用于人类疫苗的开发和临床前测试，与人类宿主特别是儿童建立有意义的免疫相似之处十分重要。申请人已显示，因为NTHI，积液在具有AOM的儿童中恢复，并且具有实验性NTHI诱导OM的南美栗鼠中耳液在相似分层方式下识别OMP P5的免疫显性区域(参见例如.Novotny LA,等,(2000)Infect Immun.68(4):2119-28;Novotny LA,等,(2007)第九届分泌性中耳炎研究进展国际研讨会;St.Pete Beach,FL;Novotny LA,等,(2002)Vaccine 20(29-30):3590-97)。申请人还显示了具有实验性OM的南美栗鼠、具有自然OM的儿童以及具有COPD加重的成年人，均以高度类似的方式识别代表PilA的肽(参见例如.Adams LD,等,(2007)107th GeneralMeeting,American Society for Microbiology;2007;Toronto,ON;Adams LD,等,(2007)第九届分泌性中耳炎研究进展国际研讨会;St.Pete Beach,FL.)。因此，具有实验性OM的南美栗鼠以及具有自然疫源性疾病的儿童相似地免疫响应至少两种不相关的NTHI蛋白粘附分子。最近进行了这种对比的最终测试，其中南美栗鼠AV-NTHI超感染模型用于进行新的11价肺炎球菌多糖蛋白D缀合疫苗的临床药效试验。从南美栗鼠获得的数据预计为34%的疗效，而在儿童中测试时，获得的针对流感嗜血杆菌诱导的OM的疗效为35.6%(参见例如.Novotny LA,等,(2006)Vaccine 24(22):4804-11和Prymula R,等,(2006)Lancet.367(9512):740-8)，因而大力支持这个模型用于OM疫苗候选物的开发和测试的相关性。
申请人已显示在接受以IHF和粘膜/全身性佐剂递送的2周TC免疫后，南美栗鼠中耳内残留的预先形成的生物膜显著减少。
由Rauscher’s Chinchilla Ranch(LaRue,Ohio)订购了48只成年鼠，并在开始研究前适应所述生态饲养场7-10天。在TB（听泡或在中耳腔内直接攻击）攻击之前，进行基准耳镜检查和鼓室导抗，以及有限体积的前出血以收集血清。麻醉南美栗鼠，并且300μl含有约1000cfu的NTHI(株系#86-028NP)悬液通过听泡攻击导入中耳腔。使动物恢复，然后按IACUC接受的动物应用协议每天监测副反应。整个研究期间每2-3天进行常规的耳镜检查和鼓室导抗。
攻击之后四天(+4天)，麻醉南美栗鼠并进行CT扫描以显现存在于所述中耳内的生物膜并获得免疫前图像。清洁耳廓表面并通过以无菌无热原生理盐水润湿的无菌纱布垫擦拭而水化。2分钟后（以允许耳廓干燥），将50μl的dmLT,IHF(根据实验1纯化的E.coli IHF)+dmLT、或者IHF+rsPilA+dmLT溶液添加至所述耳廓并轻轻按摩。每队南美栗鼠处死三只，并收集组织/样品（在+4天，以及+11天）以开始检测作用机制。
攻击之后十一天（+11天），如上文所述进行第二次免疫，其中所述耳廓被清洁/水化并且局部给药免疫原。每队南美栗鼠处死三只，并收集组织/样品以开始检测作用机制。
攻击之后十八天（+18天），麻醉南美栗鼠并进行CT扫描以确定任意生物膜的存在，以及与免疫前CT扫描相比较。然后所述动物放血以收集血清并安乐死。解剖听泡并且无菌收集所存在的任何液体，然后打开所述听泡以显现内听泡以及存在的任意生物膜。收集图像并且所述听泡以1ml无菌生理盐水洗涤并重影像。从左听泡收集任意生物膜随之存在的粘膜并置于预称重管内。匀浆所述组织，连续稀释并制成平板以检测cfu NTHI/mg湿重组织。所述左听泡以OCT包埋并快速冷冻用于组化分析。
具有残留生物膜的左右中耳腔图像是无序的，并且每一动物的两幅图汇成了一个文件用于盲评排序。每个动物中耳内保留的生物质相对量通过双盲评审应用下表6所示的规格从0至4+级别排序。滴度ELISA、细胞因子阵列以及Biacore在血清和所收集的中耳积液上进行。OCT包埋的中耳的切片并染色基本的形态结构(H&E)或应用免疫组化和/或免疫荧光染色IHF的存在。
表6
Figure BDA00002167913600791
体内形成生物膜的冷冻切片的免疫荧光成像按照下面所述的进行。在解剖后，每只南美栗鼠的中耳以OCT包埋化合物(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)填充并在液氮中速冻。移除形成内听泡的骨骼以完整留下中耳粘膜和存在的生物膜。然后将获得的块一分为二以揭示生物膜的截面并重新包埋在OCT中。应用Microm rotary cryotom切割十微米的切片，粘附至玻璃载玻片(Mercedes Medical,Sarasota,FL)并在-80°C储存。之后染色切片以检测体内形成生物膜内的IHF掺入。简要地，风干载玻片，以冷丙酮固定，然后在缓冲液中平衡(0.05M Tris-HCl,0.15M NaCl以及0.05%Tween 20,pH 7.4)。切片以图像-iTFX增强子(分子探针,Eugene,OR)和按照制造商说明书的BackgroundSniper(BioCare Medical,Concord,CA)封闭。然后切片以1:200稀释的多克隆兔抗IHF在加湿室内4°C孵育过夜。进一步冲洗载玻片并以缀合AlexaFluor 594(Invitrogen)的山羊抗兔IgG在室温孵育30分钟。作为复染，切片与DAPI孵育并应用ProLong Goldantifade reagent(分子探针,Eugene,OR)封片。幼稚兔血清作为阴性对照。通过附着在Zeiss Axiovert 200倒置显微镜(Carl Zeiss Inc.,Thornwood,NY)的Zeiss LSM 510元共聚焦系统观察切片。
CFU/mg组织平均值与CFU NTHI/ml上清平均值之间的显著差异通过配对t检验检测。p值≤0.05被认为是显著性的。同队之间相对生物量的显著性通过未配对t检验评估。p值≤0.05被认为是显著性的。
如图9、A组所示，仅以佐剂免疫的南美栗鼠中耳内残留生物膜的平均分值为2.8，其提示残余疾病显著，并且在细菌攻击中耳18天后对大多数动物内预形成的生物质缺乏解决方案。作为对照，E.coli IHF+佐剂免疫的动物的平均分值为1.5。平均分值为+2.8以及平均分值为+1.5的剩余生物质的代表性图像如图9、B组所示。还有，如图10所示，所述疾病的解决通过中耳内生物质架构改变的组织学证据（参见A组）以及通过生物质的均质化测量并在巧克力琼脂上培养的残留生物质内负载细菌的统计学上的显著减少（参见组B）而另外测量。此外，所有以分离的E.coli IHF免疫的动物具有强烈的局部及全身性免疫应答，并且通过剖检注意到免疫结果是没有动物表现出明显的二次后遗症（未显示数据）。
当抗IHF用于体外消除生物膜、以及纯化的E.coli IHF在体内作为免疫原诱导能够解决持续的生物膜疾病的多克隆抗体形成时所观察到的显著效果，产生了一个难题：为什么哺乳动物宿主不能天然产生对与复发和/或慢性疾病状态的细菌生物膜内eDNA相关的DNABII蛋白的有效免疫应答。回顾已解决的IHF结合DNA时的结构(Rice等,(1996)Cell 87(7):1295-1306)，很清楚所述蛋白质结构的重要部分被结合DNA所封闭，提示了当结合细菌生物膜内的eDNA时，保护性表位或IHF和/或HU的结构域封闭的潜力。据推测，无DNA结合的天然IHF作为免疫原的应用可以提供克服这种封闭的机制并从而促进保护性抗体的生产。
为确定eDNA是否能够真正阻止针对DNABII家族成员的保护性抗体在免疫中发育而使用天然蛋白质是有效的，进行了第二项大规模群组研究，其中基本重复如前所详述的南美栗鼠研究。
对于第二次动物免疫研究，经声导抗测试和视频耳镜检查未显示中耳疾病的证据的20只成年南美栗鼠（体重在500-700g）入选，并分为四组，每组5只动物。所有动物以大约每听泡1000CFU的NTHI株系86-028NP重新跨听泡攻击。四天之后，在生物膜于这些动物的中耳腔内形成后，它们通过上述的经皮路径(TCI)免疫。制剂由任一种组成：10μgIHF与10μgdmLT混合，10μg预先结合DNA的IHF+dmLT，DNA+dmLT，或单独的10μgdmLT。
为确定当相同的核蛋白复合物经皮下(SQ)递送所诱导以及与IHF单独诱导时相比较，TCI和预结合DNA的IHF是否产生相似的免疫应答，两只成年南美栗鼠被免疫以产生抗血清。每只动物接受初始剂量后随30天间隔递送的两个相同的增强剂量。免疫原与单磷酸脂质A(MPL)(10μg/dose)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)佐剂混合，因其证明了在南美栗鼠宿主中强效的佐剂性质（参见例如Bakaletz等,(1999)Infect Immun.67(6):2746-2762和Kennedy的,(2000)Infect.Immun.68(5):2756-2765）。一只南美栗鼠以10μgIHF+MPL免疫，而其它的以10μg结合DNA的IHF+MPL免疫。所有剂量以200μl的总体积经皮下递送。在最后一次增强的十五天后，动物放血以搜集血清，并且经Western blot和ELISA分析血清以确定抗体滴度和抗体反应IHF的特异性。
继而在研究完成后，再次从0至4+对中耳进行疾病严重程度计分。为更好地确保IHF和DNA保留在复合物中用于免疫，应用了摩尔比为2:1[DNA(10μM)与IHF(5μM)]的与已公开共结晶研究(参见例如.Rice等,(1996)Cell 87(7):1295-1306)所应用的具有来源于噬菌体λ重组位点attP的高亲和力IHF结合位点相同合成寡核苷酸。这一数量是IHF结合该DNA靶标Kd值的至少三个数量级以上。如图11所示，如经过其在电泳迁移率变动中流动性减小所证明的，IHF确实结合dsDNA。
如图12所示，以分离的E.coli IHF免疫的动物显示了疾病状态的显著减少，与单独以佐剂免疫（生物质平均分值2.2）的对照或以与佐剂混合的DNA免疫（生物质平均分值2.8）相比，残留中耳生物质分值为0.9。有趣的是，那些以IHF-DNA复合物免疫的动物还证明了，具有显著残留细菌生物质的中耳产生了2.5的生物质平均分值，其与仅接受佐剂或与佐剂混合的DNA的群组不具有显著统计学差异。这个结果强烈提示如果存在足量的eDNA片段，作为一个假设情况是自然疾病期间，这种状况可导致用于产生中和抗体所需的关键性IHF表位封闭。
为确信所观察到的DNA封闭结果并不特异于经皮免疫途径的应用，重复了应用皮下(SQ)免疫途径以确保所述抗原递送给南美栗鼠宿主内的抗原呈递细胞的免疫。如图13所示，以分离的E.coli IHF皮下免疫控制对分离的IHF的强效免疫应答的产生，而以预结合过量DNA的E.coli IHF免疫无法诱导通过Western blot检测时识别IHF的可检测抗体。当通过ELISA检测时，对于预结合寡核苷酸的IHF免疫动物，抗体滴度相对于分离的IHF是1000，而对于以天然IHF免疫的动物是8000（两组动物对IHF的预免疫抗体滴度是100）。总体地，这些结果与我们猜想的IHF与eDNA结合是一致的，如同在自然疾病状态下发生的，具有封闭产生保护性获得性免疫应答所需的IHF表位或结构域的潜力。进一步的，天然IHF（未结合DNA）免疫显示出允许免疫应答有效导向保护性或中和性抗体的产生，如同本文所述的两种临床前南美栗鼠研究所证明了的。
实验4
许多口腔细菌（例如伴放线菌聚集杆菌，牙龈卟啉单胞菌）与炎性疾病例如牙周炎和植入体周炎的发病机制相关，所述疾病破坏牙槽骨和牙龈。这些细菌发病机制的调查因缺乏有效动物模型而受阻。调查特定细菌致病性的挑战之一是，当外源性细菌导入动物口腔时难以建立生物膜。尽管已开发了牙周炎的动物模型，很少从接种动物的口腔内回收到可培育的细菌。能评估特定细菌致病性的有效动物模型的开发将大大有助于阐明发病机制。
加工钛植入体(1.2x 4.5mm)的表面通过以AlO3(100m)喷砂以及HCl蚀刻(80oCpH 7.820分钟)修饰。加工的以及纳米纹理的植入体在以伴放线菌聚集杆菌(Aa)临床株系D7S接种的TSB基质内37°C孵育1-3天。植入体上的细菌生物膜通过SEM以及随
Figure BDA00002167913600821
BacLightTM染色的激光共聚焦扫描显微镜分析。建立或未建立Aa生物膜的植入体经粘膜置于雌性大鼠上颌骨的前臼齿和门齿区的牙槽骨内。为检测放置在体内的植入体上Aa生物膜的存在，两天后由唾液和口腔植入体表面收集细菌样品。通过培养以及PCR分析检测Aa。植入体周围骨骼以及粘膜组织的微型CT和组织学分析在植入六周后进行。
植入一天后，发现球形Aa细胞的团块遍布整个植入体。两天后，团块的数量和大小下降，并在球形状态的细菌之间观察到更多不同长度的细胞。孵育三天之后，团块基本消失了，而大面积的植入体表面被棒状形态的细菌覆盖，形成密密麻麻的生物膜。此种植入体上三天Aa生物膜的
Figure BDA00002167913600822
染色显示所有生物膜细菌的75-80%的绿色信号，提示活细胞具有无与伦比的细胞膜完整性。放置体内植入体上的Aa生物膜的微生物和PCR检测，植入体表面的样品是阳性的并且唾液样品以及对照植入体是阴性的。临床检测证明，与对照的未处理植入体相比，具有Aa生物膜的植入体周围有显著的植入体周围粘膜炎症。等待植入体周骨骼和粘膜组织的微型CT和组织学分析。纳米纹理植入体表面有利于Aa生物膜的建立并增加了植入体周围炎的风险。
实验5
该实验提供了用于临床前测试干扰剂治疗莱姆病的小鼠模型。参见Dresser等.Pathogens 5(12)e1000680,Epub 2009Dec.4。莱姆病是美国最为常见的蜱传染疾病。报道的兵力在1992-2006间增加了一倍多，2008年确诊了大约29,000新病例。据估计，流行地区莱姆病的实际例数可能超过所报道的6-12个点。根据定义，当人群持续地由城市移动到郊区及农村地区并且白尾鹿（其携带硬蜱蜱种）越来越多地在这些地区漫游，这些流行地区扩大了。莱姆病由一种螺旋菌微生物伯氏疏螺旋体引起。伯氏疏螺旋体经硬蜱蜱种叮咬传输并随后经血流传播至其它组织和器官。
在该动物模型中，C3H/HeN小鼠经背部皮下以及腹腔内注射或经静脉注射螺旋体。在感染大约7天后获取血液和活检标本用于评估微生物负载以及评价组织及器官内的病理。本发明的方法和组合物考虑到了开发减小和/或消除存在的伯氏疏螺旋体生物膜的治疗剂以及预防策略，所述生物膜在攻击后形成并确信有助于所述疾病的发病机理及长期性。
实验6
该实验提供了用于临床前测试治疗囊性纤维化的干扰剂的猪模型。参见Stoltz等.(2010)Science Translational Medicine 2(29):29ra31。囊性纤维化是一种归结于编码CF跨膜电导调节（称为CFTR）离子通道的基因突变的常染色体隐性疾病。在该模型中，已特异性繁殖携带称为“CFTR”基因缺陷的猪，并且所述CF猪自发形成了CF肺疾病的标志性特征，所述CF肺疾病包括多种细菌物种引起的下呼吸道感染。所述猪可以所述干扰机免疫，或者1）以多肽或其它免疫原性试剂免疫这些CF猪，从而诱导能够根除肺内细菌生物膜的抗体形成（类似于实验1所示的在主动免疫后，IHF的抗体如何根除驻留在南美栗鼠中耳内的生物膜），通过雾化吸入递送抗IHF（或其它干扰剂）至这些动物的肺脏以改善疾病和相关病症的迹象。
实验7
申请人还提供了肺结核(TB)的临床前模型。参见Ordway等.(2010)Anti.Agentsand Chemotherapy 54:1820。结核分枝杆菌微生物对全球疫病增长负责。当前数字提示，每年大约800万的TB新病例以及约270万人因TB死亡。该微生物除了与HIV共感染个体（在大约4500万HIV感染者中，估计有1/3还共感染结核分枝杆菌）的作用外，特别麻烦的是，所述分离物变得高度耐受多种药物，并且超过四分之一世纪以来没有新的针对TB的药物引入。在该动物模型中，SPF豚鼠被保留在阻菌屏障内，并经雾化喷雾感染递送约20cfu的结核分枝杆菌株系Erdman K01杆菌至其肺脏。攻击后第25、50、75、100、125和150天，在确定细菌负荷后处死动物，并回收组织用于组织病理检查。与小鼠不出现经典TB迹象不同，以此方式攻击的豚鼠出现了组织良好的中央坏死性肉芽肿，一种人类疾病的标志。并且，类似于人类，豚鼠出现了作为原发病灶综合体一部分的严重杓肉芽肿以及淋巴结的坏死性淋巴结炎。这个模型的应用提供了临床前筛选以确认和鉴定用于减小和/或消除产生的结核分枝杆菌生物膜的治疗及预防策略，所述生物膜被发现在攻击后形成于这些动物的肺脏内，并且据信有助于所述疾病的发病及慢性化。
实验8
已知导管/留置装置生物膜感染的多种动物模型。参见Otto(2009)Nature ReviewsMicrobiology,7:555。尽管通常被当作正常皮肤菌群，表皮葡萄球菌微生物已成为很多人认为的重要的条件致病菌，居院内感染病原体之首。主要地，这种细菌对在装置插入时被这种常见皮肤移民所污染的植入医疗设备上出现的大多数感染负责。尽管通常不是危及生命的，与这些生物膜感染治疗相关的困难与其出现频率组合，使得其成为严重的公共健康负担。当前，美国每年仅与归结于表皮葡萄球菌的血液感染相关的血管导管治疗相关费用为20亿美元。除表皮葡萄球菌外，在植入医疗设备上还发现了粪肠球菌和金黄色葡萄球菌。存在数种导管相关表皮葡萄球菌感染的动物模型包括兔子、小鼠、豚鼠以及大鼠，所有这些都用于研究发病的分子机制并使得它们用于预防和/或治疗的研究。大鼠颈静脉导管已用于评估干扰粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的治疗。生物膜减小通常以三种方式测量-(i)超声导管和计算的CFUs，(ii)导管切片或简单放置在平板上，并且评分，或者(iii)所述生物膜可用结晶紫或其它染料染色、洗脱并测量OD值作为CFUs的代理。
实验9
本文所述的方法可用于在人或动物中激发免疫应答。可在佐剂例如但不限于铝盐和脂质体的存在下给人类或动物受试者施用免疫原性组合物。本领域技术人员应当理解还可应用任意数量的药学上可接受的佐剂。免疫组合物可以通过肌肉内、皮下、鼻内或其它任意适合途径施用给人类或动物受试者。免疫原性组合物可通过与所选择的给药模式相一致的方式制备。免疫组合物可以采取多肽、核酸或其组合物的形式，并可包含全长或部分抗原。此外或可选地，免疫组合物可采用APCs加特定抗原、或以一个或多个编码特定抗原的多核苷酸转染的APCs的形式。给药可包括单剂量的免疫原性组合物、或后随一次或多次增强剂量的初始给药。增强剂量可每天、每两天、每三天、每周、每两周、每三周、一月、二月、三月、六月或十二个月提供，或在起始剂量之后的任何其它时间点。增强剂量可在受试者抗体滴度评估后给药。
实验10
本文所述的方法可用于赋予非免疫受试者被动免疫。针对给定抗原的被动免疫可通过特异识别或结合特定抗原的抗体或抗原结合片段的转移赋予。抗体的供者和受者可以是人类或非人类受试者。此外或可选地，所述抗体组合物可包含编码特异识别或结合特定抗原的抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸。
被动免疫可在免疫原性组合物给接受者带来风险的情况下赋予，所述接受者是免疫功能低下的，或所述接受者需要立即进行免疫。免疫原性组合物可以与所选择的给药模式相一致的方式制备。组合物可包含全抗体、抗原结合片段、多克隆抗体、单克隆抗体、体内产生的抗体、体外产生的抗体、纯化或部分纯化的抗体、或全血清。给药可包括单剂量的免疫原性组合物、或后随一次或多次增强剂量的初始给药。增强剂量可每天、每两天、每三天、每周、每两周、每三周、一月、二月、三月、六月或十二个月提供，或在起始剂量之后的任何其它时间点。增强剂量可在受试者抗体滴度评估后给药。
实验11
DNABII家族成员对于包括基因转录的多个核蛋白系统是高度多效的，并且另外，其通常因而是必不可少的。相比之下，HU和IHF突变体可在E.coli实验室株系中产生并广泛研究。未确定IHF和HU在eDNA形成中的作用，E.coli株系MG1655或其HU及IHF缺陷衍生物所形成的生物膜与抗IHF抗体（如Granston和Nash(1993)J.Mol.Biol.,234:45-59所述制备）孵育。如图8所示，尽管亲本分离物株系MG1655在体外产生了茁壮的生物膜（画面A），HU和IHF突变体株系没那么茁壮（分别为面画C和E）。HU缺陷突变体形成了大约1/2野生型生物膜高度的生物膜，尽管IHF缺陷株系产生了大约2/3亲本分离物高度的生物膜。这一结果提示两个蛋白均涉及E.coli生物膜EPS的产生和/或整合。在以抗IHF处理后，所述由野生型分离物形成的生物膜显示了显著的减积以及高度的58.1%平均百分数减少，生物质的73.1%百分数减少以及平均厚度的87%的减少（画面B），尽管HU突变体形成的生物膜没有表现出高度的减小并且仅有30.9%的生物量减少以及37.2%的平均厚度减少（画面D）。与之相比，在IHF突变体所形成的生物膜上未观察到高度（减小-3.4%）、生物量（减小-20.5%）、平均厚度（减小-19.8%）损失效果（画面F）。总体地，这些数据暗示对于这种E.coli株系，IHF很可能是应用抗IHF抗体所能靶向的惟一结构元素。由于至今在体内已形成的生物膜内仅看到高度结构化交织的eDNA，通过相应突变体的剩余DNABII家族成员表达的确认以及所得到DNA结构的任意改变有待体内免疫荧光分析。
实验12
尽管本申请已证明在体外及体内，抗IHF以及IHF作为免疫原的应用均显示了在生物膜减积和/或解决各自生物膜疾病中的用途，不清楚抗IHF的NTHI生物膜减积是否在于其它治疗治疗方法组合时也有协同作用。为此，当次优浓度的抗IHF与三种独特试剂中的每一种一起使用时，评估了诱导预形成NTHI生物膜的结构不稳定性增加的能力。这三种试剂包括1）已知能够在体外降解NTHI生物膜的DNA降解酶(DNaseI)（但在此应用次优浓度），2）单独使用时不能破坏预形成NTHI生物膜的针对外膜蛋白的抗血清(抗OMP P5)（未显示数据），以及3）通常在具有慢性和/或复发性OM的儿童中作为第一线选择但对驻留在生物膜群落内的细菌效果有限的抗生素（阿莫西林）。
图14A显示了以证明为次优浓度的DNase处理的NTHI生物膜有一个边际效应（参见4A II）。同样，1:200稀释的抗IHF对预形成的NTHI生物膜几乎不具有作用参见4AIII）。然而与之相比，当这两种试剂组合使用时，所述生物膜显著减少（参见14A IV）。通过该实验三次重复，我们发现生物膜减积的最显著协同效应测定为高度的减值。下表7描述了这些结果。
表7
这种结果的一个简单解释是，当DNABII蛋白被从生物膜外周中和时，eDNA更容易受到DNase的作用。
图14B显示了以抗OMP P5处理预形成NTHI生物膜的结果。尽管这种抗血清与分离的NTHI OMP P5（未显示数据）强烈作用并进一步的，分离OMP P5的主动免疫在调节针对南美栗鼠模型中实验性OM的重要保护中有效(参见例如.25.Bakaletz等,(1997)Vaccine 15(9):955-961;Bakaletz等,(1999)Infect Immun 67(6):2746-2762;Kennedy等,(2000)Infect Immun 68(5):2756-2765;Kyd JM,等,(2003)Infect Immun 71(8):4691-4699;Novotny LA,等,(2000)Infect Immun 68(4):2119-2128;Novotny LA,等,(2002)Vaccine 20(29-30):3590-3597和Novotny LA,等,(2003)J Immunol 171(4):1978-1983)，当这种抗血清以1:50稀释时不能诱导已在体外形成的NTHI生物膜结构完整性的改变（参见14B II）。观察到了类似于这些生物膜与次优稀释抗IHF（在此以1:100稀释）孵育时的边际效应（参见14B I）。然而，当抗P5加上抗IHF组合使用时，产生的生物膜高度减量超过这两种抗血清单独应用时的总量（参见14B III），因而提示协同作用的结果。因此，得出的结论是，破坏NTHI EPS基质的抗IHF的应用导致靶细菌细胞表面蛋白（例如OMP P5）的暴露，否则这些蛋白将被eDNA以及EPS的可能其它成分遮蔽，从而允许通过至今仍不清楚的机制免疫介导细菌清除。
最后，图14C显示了以阿莫西林处理预形成NTHI生物膜的结果。当以64μg/ml的浓度应用时，尽管有有限细菌细胞死亡的证据，阿莫西林在预形成的NTHI生物膜结构上没有可测量的效果（参见14C II）。1:50稀释的IHF抗血清处理如前所述显著降低了生物膜的高度（参见14C III）。然而令人感兴趣的是，当两种试剂一同使用时，不仅生物膜的高度存在显著降低（参见14C IV），并且活体染料提示大部分残留在生物膜内的细菌现在已死亡，如通过成像生物膜内的红色通道中的主要荧光所指出的。这种结果表明，抗IHF的生物膜减积可能足以暴露所述细菌以创造更接近敏感阿莫西林浓度的条件，所述浓度已知在测试针对浮游NTHI时有效。这种结果可以通过增加驻留生物膜基质内细菌对阿莫西林作用的物理暴露，和/或通过如我们早先显示的在生物膜减积期间发生的通过暴露于抗IHF抗体（参见图4）增加释放细菌进入浮游阶段来调节。
实验13
申请人已显示经皮免疫的抗IHF抗体诱导有效解决南美栗鼠中耳内由NTHI诱导的生物膜。还显示了幼稚IHF的应用对于保护性免疫应答的诱导是必不可少的，当其结合eDNA时，保护性表位表现为已被遮蔽，如TCI和SQ免疫之后所示。不过，可能具有广泛保护效果的疫苗候选物的合理设计要求详细了解所述蛋白的免疫显性和/或保护性表位，其可能既不明显也不一定是连续的。目前的疫苗候选物设计策略在方法上更为简单，并通常瞄准鉴定和应用诱导高亲和力以及保护性抗体必不可少的所述靶蛋白的部分。为此，完成了表位定位以确定最有效的免疫原。
表位定位可以如Novotny等,(2009)Vaccine 28:(1):279-289所记载的以及依据下述步骤进行。为产生免疫血清，南美栗鼠通过皮下(SQ)注射10μg幼稚IHF蛋白、具有IHFαC末端20个氨基酸的多肽、具有IHFβC末端20个氨基酸的多肽、或具有TBP-DNABII60-76位氨基酸的多肽与单磷酸脂质A(MPL;Corixa)佐剂混合或以MPL单独给药（只有佐剂的对照组）而胃肠道外免疫。两个相同的增强免疫可在21天间隔递送。血液血清可在接受最后一次免疫剂量10天后收集。可以进行南美栗鼠抗血清的酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫印迹。对于ELISA，可在抗所递送免疫原包被的96孔板中测试(0.2μg蛋白/孔)。滴度可定义为血清稀释度的倒数，其产生了比含有血清外所有成分的对照孔大0.1的OD450值。ELISA检测最少进行3次并且所述结果以几何平均数报告。免疫印迹可应用1:100稀释的免疫血清抗1μg相应抗原而进行，并且以HRP蛋白A(Zymed,SouthSan Francisco,CA)检测。以CN/DAB底物形成色彩(Pierce,Rockford,IL)。
为定位NTHI的IHF蛋白的表位，可合成一系列具有5个残基重叠的20-mer合成肽。所有合成肽的合成、纯化和序列确认可根据标准技术进行(参见例如.Bakaletz LO.等,(1997)Infect.Immun.71(8):4691-9和Bakaletz LO等,(2001)Vaccine 68(4):2119-28)。可应用氨基酸分析和质谱分析确定纯度、组合物以及每种肽的氨基酸序列。
可以如所记载的，应用Biacore 3000仪器研究分析合成肽和血清中抗体的相互作用，并且所有试剂均可从Biacore(Uppsala,Sweden)购买。简单地，肽可在应用胺偶联化学固定于活性试剂级CM5传感芯片表面之前悬浮于醋酸钠缓冲液中。对于相互作用分析，15μl血清（在1mg羧甲基葡聚糖/ml HBS-EP缓冲液中1:2稀释）可以以5μl/分钟的流速注射通过所述传感芯片表面。每个样品中抗原或免疫原特异性抗体的相对量可计算为每个样品注射前5秒和注射后45秒获得的谐振单元(RU)内的差异。所述传感芯片可在样品之间以25mM NaOH再生。与血清中抗体最强相互作用的合成肽可能是能够在体内诱导高亲和力保护性抗体的最有希望的候选物。
可产生针对来自表位定位的大多数免疫原性肽的兔多克隆抗血清。这种抗血清可用于通过柱层析从非中和性抗体中亲和纯化中和性抗体。要做到这一点，可应用兔及南美栗鼠多克隆抗血清（后者已显示为保护性的）。血清可在每次过柱之前及之后检测哪一种为幼稚IHF所结合或哪一种预混合DNA的IHF被结合。只有那些不结合DNA-IHF复合物的抗体是中和性的。所有流通和洗脱的抗血清然后将通过分析减积相对能力的体外生物膜和NTHI生物膜针对原抗血清池测试，以及通过ELISA、免疫印迹和生物传感器检测确定特异性和滴度。作为一种额外的测试，表位靶向的疫苗候选物可结合所述层析柱以确定他们是否能清除现已被证明是中和性的抗体。
应当理解，当本发明与上述实施方式配合使用时，前面的描述和实施例意在解释且不限制本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优势以及修改对于本发明所属领域技术人员是显而易见的。
除非本文另有所指，本文所应用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域技术人员所通常理解的相同的含义。本文提供的所有核苷酸序列是5’到3’方向的。
在此举例说明的发明可以适当地在缺乏任意一个或多个在此未特别公开的元素、限制的情况下实行。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等等应当扩张阅读且没有限制。此外，在此应用的术语和表述已用作说明书的术语并不具有限制，而且这些术语和表述的使用无意排除所显示和描述特征的等价物或其部分，但公认各种修正可能在本发明要求的范围内。
因此，应当理解尽管本发明已通过优选具体实施方式和可选特征具体公开，在此公开的发明体现的修改、改进及变化可通过本领域技术人员作出，并且此类修改、改进和变化被认为是在本发明的范围内。此处提供的物质、方法和实施例是代表性的优选具体实施方式，是示范的，并且无意作为本发明范围的限制。
已在此广泛和一般地描述本发明。落入一般披露内的每一种缩小物种以及亚属分组同样构成本发明的一部分。这包括了具有例外或由该属中排除任意题材的否定限定的本发明的一般性描述，不考虑所排除物质是否在此特别列举。
此外，当本发明的特征或方面以马库什组的方式记载时，本领域技术人员应当意识本发明也因而记载了马库什组的任意个体成员或分组成员。
在此提到的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考，通过引用整体明确地并入至每个通过单独引用并入的相同程度。在发生冲突的情况下，由本发明说明书包括定义决定。
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表9A1(续)
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表9A2
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表9A2(续)
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表9A3
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表9A3(续)
表9B
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表9B(续)
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表9B(续)
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Claims (146)

1.一种用于抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA结合的方法，包含所述DNABII多肽或蛋白质或所述微生物DNA与干扰剂的接触，从而抑制、竞争或中和所述DNABII蛋白质或多肽结合所述微生物DNA。
2.一种用于抑制、预防或分解微生物生物膜的方法，包括所述生物膜与干扰剂的接触，从而抑制、预防或分解所述微生物生物膜。
3.权利要求1或2的方法，其中所述接触是在体外或体内。
4.一种用于抑制、预防或分解受试者中生物膜的方法，包括给所述受试者施用有效量的干扰剂，从而抑制、预防或分解所述微生物生物膜。
5.一种用于抑制、预防或治疗在受试者中产生生物膜的微生物感染，包含给所述受试者施用有效量的干扰剂，从而抑制、预防或治疗在受试者中产生生物膜的微生物感染。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述干扰剂是下述组的：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)与整合宿主因子竞争性结合微生物DNA的多肽或多核苷酸；
(g)类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；
(h)编码(a)至(f)中任意一种的分离或重组的多核苷酸，或SEQ ID NO.36的分离或重组的多核苷酸或其等价物，或在严格条件下与所述多核苷酸杂交的多核苷酸、其等价物或互补分子；
(i)特异性识别或结合(a)至(f)中任一项的抗体或抗原结合片段，或其每种抗体或抗原结合片段的等价物或片段；
(j)编码(i)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸或其互补链；或
(k)与DNABII蛋白或多肽竞争性结合微生物DNA的小分子。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述干扰剂是分离或重组的DNABII多肽或其片段或等价物。
8.权利要求7的方法，其中所述DNABII多肽是IHF多肽或其片段、IHF多肽的C末端片段、或其等价物。
9.权利要求7的方法，其中所述DNABII多肽是HU多肽或其片段、HU多肽的C末端片段、或其等价物。
10.权利要求4-9任一项的方法，进一步包含给所述受试者施用有效量的一种或多种抗菌剂、DNA酶、抗体、抗原肽或佐剂。
11.权利要求4-10任一项的方法，其中所述受试者是非人类动物或人类患者。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述微生物DNA来自表8所确定的微生物。
13.权利要求4-12任一项的方法，其中所述试剂通过包括外敷、透皮、经皮、舌下、直肠、阴道、眼、皮下、肌肉内、腹膜内、尿道、鼻内、通过吸入或口服的方法给药。
14.权利要求4-12任一项的方法，其中所述受试者是儿科患者并且所述试剂以用于儿科患者的配方给药。
15.在有此需要的受试者体内诱导免疫应答或赋予被动免疫的方法，包括给所述受试者施用有效量的一种或多种下述组的试剂：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽，或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)编码(a)-(e)中任一项的分离或重组的多核苷酸或SEQ ID NO.36的分离或重组的多核苷酸或其等价物，或在严格条件下与所述多核苷酸杂交的多核苷酸、其等价物或其互补分子；
(g)特异性识别或结合(a)-(e)中任一项的抗体或抗原结合片段，或其等价物或片段；
(h)编码(g)中的所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸；
(i)以(a)-(e)中任一项冲击的抗原呈递细胞；以及
(i)以一种或多种编码(a)-(e)中任一项的多核苷酸转染的抗原呈递细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述试剂包含分离或重组的DNABII多肽或者其片段或等价物。
17.权利要求16的方法，其中所述DNABII多肽是IHF多肽或其片段、IHF多肽的C末端片段、或其等价物。
18.权利要求16的方法，其中所述DNABII多肽是HU多肽或其片段、HU多肽的C末端片段、或其等价物。
19.权利要求15-18任一项的方法，进一步包含给所述受试者施用有效量的一种或多种抗菌剂、DNA酶、抗体、抗原肽或佐剂。
20.权利要求15-19任一项的方法，其中所述受试者是非人类动物或人类患者。
21.权利要求15-20任一项的方法，其中所述分离或重组的多核苷酸来自表8所确定的微生物。
22.权利要求15-21任一项的方法，其中所述试剂通过包括外敷、透皮、经皮、舌下、直肠、阴道、眼、皮下、肌肉内、腹膜内、尿道、鼻内、通过吸入或口服的方法给药。
23.权利要求15-22任一项的方法，其中所述受试者是儿科患者并且所述试剂以用于儿科患者的配方给药。
24.基本由选自SEQ ID NO.1-5、或12-27、30-35、101-340的氨基酸序列或图6所确定的DNA结合肽或者其片段或等价物组成的分离或重组的多肽。
25.包含SEQ ID NO.1或2的分离或重组的多肽，条件是所述多肽不是SEQ ID NOS.6-11、28、29或42-100。
26.包含SEQ ID NO.3、4或5的分离或重组的多肽，条件是所述多肽不是SEQ IDNOS.6-11、28、29或42-100。
27.包含SEQ ID NO.12、14、16、18、20、22、24、26、30或32的分离或重组的多肽，条件是所述多肽不是SEQ ID NOS.6-11、28、29或42-100。
28.包含SEQ ID NO.13、15、17、19、21、23、25、27、31或33的分离或重组的多肽，条件是所述多肽不是SEQ ID NOS.6-11、28、29或42-100。
29.下述组的分离或重组的多肽：
具有SEQ ID NO.12和13的多肽；
具有SEQ ID NO.14和15的多肽；
具有SEQ ID NO.16和17的多肽；
具有SEQ ID NO.18和19的多肽；
具有SEQ ID NO.20和21的多肽；
具有SEQ ID NO.23和24的多肽；
具有SEQ ID NO.25和26的多肽；
具有SEQ ID NO.30和31的多肽；
具有SEQ ID NO.32和33的多肽；
具有SEQ ID NO.34和35的多肽；
具有SEQ ID NO.337和338的多肽；或
具有SEQ ID NO.339和340的多肽；
条件是所述多肽不是IHFα、IHFβ或SEQ ID NO.6至11、28、29，或42至100中任意一个的野生型。
30.下述组的分离或重组的多肽：
基本由SEQ ID NO.12和13组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.14和15组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.16和17组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.18和19组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.20和21组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.23和24组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.25和26组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.30和31组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.32和33组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.34和35组成的多肽；
基本由SEQ ID NO.337和338组成的多肽；或
基本由SEQ ID NO.339和340组成的多肽；
条件是所述多肽不是IHFα、IHFβ或SEQ ID NO.6至11、28、29，或42至100中任意一个的野生型。
31.权利要求24-30中任一项的分离或重组多肽的片段或等价物。
32.包含两种或多种的权利要求22-31中任一项的分离或重组多肽的分离或重组多肽。
33.编码权利要求24-32中任一项的多肽的分离或重组的多核苷酸或其互补分子。
34.包含权利要求33所述分离或重组的多核苷酸的载体。
35.包含权利要求24-32中任一项的分离或重组多肽、权利要求33的分离或重组多核苷酸或权利要求34的载体的分离的宿主细胞。
36.包含权利要求24-32中任一项分离或重组多肽的分离的抗原呈递细胞，其中所述多肽存在于所述细胞的表面。
37.权利要求36的分离的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞。
38.特异性识别或结合权利要求24-32中任一项的分离或重组多肽的抗体或抗原结合片段，或编码所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸。
39.权利要求34的抗体，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体衍生物、镶嵌抗体、双抗体、抗体衍生物、重组人类抗体、嵌合抗体或抗体片段。
40.权利要求39所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
41.生产权利要求40所述抗体的杂交瘤细胞系。
42.一种组合物，包含运载体以及一种或多种的：
(a)权利要求24-32中任一项的分离或重组的多肽；
(b)权利要求33所述的分离或重组的多核苷酸；
(c)权利要求34所述的载体；
(d)权利要求35-37中任一项的分离的宿主细胞；或
(e)权利要求38-40中任一项的抗体。
43.权利要求42所述的组合物，进一步包含一种或多种佐剂、抗原肽或抗菌剂。
44.权利要求42或43所述的组合物，其中所述运载体选自液体载体、药学上可接受的载体、固相载体、药学上可接受的多聚物、脂质体、胶束、植入物、支架、糊剂、凝胶剂、牙科植入物或医用植入物。
45.权利要求42-44中任一项的组合物，配制用于给药人类患者或非人类动物。
46.权利要求42-44中任一项的组合物，配制用于通过包括外敷、透皮、经皮、舌下、直肠、阴道、眼、皮下、肌肉内、腹膜内、尿道、鼻内、通过吸入或口服的方法给药。
47.权利要求42-46中任一项的组合物，配置用于儿童患者。
48.包含下述组中任一种或多种试剂的试剂盒：
(a)权利要求24-32中任一项的分离或重组的多肽；
(b)权利要求33所述的分离或重组的多核苷酸；
(c)权利要求34所述的载体；
(d)权利要求35-37中任一项的分离的宿主细胞；
(e)权利要求38-40中任一项的抗体；
(f)权利要求42所述的组合物；
(g)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或者其片段或等价物；
(h)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(i)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(j)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(k)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(l)与整合宿主因子竞争性结合微生物DNA的多肽；
(m)类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；
(n)编码(g)-(l)中任一项的分离或重组的多核苷酸；
(o)特异性识别或结合(g)-(l)中任一项的抗体或抗原结合片段，或者其等价物或片段；
(p)编码(o)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸；以及
(q)与DNABII蛋白或多肽竞争结合微生物DNA的小分子，及使用说明。
49.权利要求48所述的试剂盒，进一步包含一种或多种佐剂、抗原肽、DN酶、抗体或抗菌剂。
50.权利要求48或49的试剂盒，进一步包含选自液体载体、药学上可接受的载体、固相载体、药学上可接受的多聚物、脂质体、胶束、植入物、支架、糊剂、凝胶剂、牙科植入物或医用植入物的运载体。
51.鉴定调节DNABII蛋白质或多肽与含有相同微生物DNA样品中的微生物DNA相结合的试剂的方法，包括候选试剂与所述样品的接触并测试所述蛋白质或多肽与所述DNA的结合。
52.权利要求51所述的方法，其中所述试剂通过抑制、预防或中和DNABII蛋白质或多肽与微生物DNA的结合调节所述结合。
53.一种选自下组的试剂的应用：
(a)权利要求24-32中任一项的分离或重组的多肽；
(b)权利要求33所述的分离或重组的多核苷酸；
(c)权利要求34所述的载体；
(d)权利要求35-37中任一项的分离的宿主细胞；
(e)权利要求38-40中任一项的抗体；
(f)权利要求42所述的组合物；
(g)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或者其片段或等价物；
(h)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(i)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(j)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(k)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(l)与整合宿主因子竞争性结合微生物DNA的多肽；
(m)类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；
(n)编码(g)-(l)中任一项的分离或重组的多核苷酸；
(o)特异性识别或结合(g)-(l)中任一项的抗体或抗原结合片段，或者其等价物或片段；
(p)编码(o)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸；以及
(q)与DNABII蛋白或多肽竞争结合微生物DNA的小分子。
54.权利要求6或15的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
55.权利要求54所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段是人类抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、镶嵌抗体、修饰的抗体或抗体衍生物。
56.权利要求55所述的方法，其中所述抗体是通过VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内保守氨基酸突变修饰的。
57.权利要求55所述的方法，其中所述抗体是通过改变Fc铰链区域的半胱氨酸残基数量或通过Fc铰链区域的保守氨基酸突变修饰的。
58.权利要求55所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段是化学修饰的。
59.权利要求58所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段是聚乙二醇化的。
60.权利要求58所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段偶联血清蛋白。
61.权利要求60所述的方法，其中所述血清蛋白是人血清白蛋白。
62.权利要求55所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段偶联诊断试剂。
63.权利要求62所述的方法，其中所述诊断试剂选自酶、辅基复合物、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性的顺磁金属离子。
64.权利要求63所述的方法，其中所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶以及乙酰胆碱酯酶。
65.权利要求63所述的方法，其中所述辅基复合物选自链霉亲和素/生物素以及亲和素/生物素。
66.权利要求63所述的方法，其中所述荧光材料选自伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三唑嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和枣红蛋白。
67.权利要求63所述的方法，其中所述发光材料是鲁米诺。
68.权利要求63所述的方法，其中所述生物发光材料选自荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。
69.权利要求63所述的方法，其中所述放射性材料选自125I、131I、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199以及铅-211。
70.权利要求55所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段偶联治疗试剂。
71.权利要求70所述的方法，其中所述治疗试剂是抗菌剂。
72.权利要求70所述的方法，其中所述治疗试剂选自核糖核酸酶(RNase)、DNase I、反义核酸、抑制性RNA分子、免疫刺激核酸、适体、核酶、三链形成分子以及外部引导序列。
73.权利要求55所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段偶联或融合至少一种另外的功能性分子。
74.权利要求73所述的方法，其中所述另外的功能性分子是第二抗体。
75.权利要求38-40中任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
76.权利要求75所述的抗体，其中所述单克隆抗体或其片段是人类抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、镶嵌抗体、修饰的抗体或抗体衍生物。
77.权利要求76所述的抗体，其中所述抗体是通过VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内保守氨基酸突变修饰的。
78.权利要求76所述的抗体，其中所述抗体是通过改变Fc铰链区域的半胱氨酸残基数量或通过Fc铰链区域的保守氨基酸突变修饰的。
79.权利要求76所述的抗体，其中所述单克隆抗体或其片段是化学修饰的。
80.权利要求79所述的抗体，其中所述单克隆抗体或其片段是聚乙二醇化的。
81.权利要求79所述的抗体，其中所述单克隆抗体或其片段偶联血清蛋白。
82.权利要求81所述的抗体，其中所述血清蛋白是人血清白蛋白。
83.权利要求76所述的抗体，其中所述单克隆抗体或其片段偶联诊断试剂。
84.权利要求83所述的抗体，其中所述诊断试剂选自酶、辅基复合物、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性的顺磁金属离子。
85.权利要求84所述的抗体，其中所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶以及乙酰胆碱酯酶。
86.权利要求84所述的抗体，其中所述辅基复合物选自链霉亲和素/生物素以及亲和素/生物素。
87.权利要求84所述的抗体，其中所述荧光材料选自伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三唑嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和枣红蛋白。
88.权利要求84所述的抗体，其中所述发光材料是鲁米诺。
89.权利要求84所述的抗体，其中所述生物发光材料选自荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。
90.权利要求84所述的抗体，其中所述放射性材料选自125I、131I、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199以及铅-211。
91.权利要求76所述的抗体，其中所述单克隆抗体或其片段偶联治疗试剂。
92.权利要求91所述的抗体，其中所述治疗试剂是抗菌剂。
93.权利要求91所述的抗体，其中所述治疗试剂选自核糖核酸酶(RNase)、DNase I、反义核酸、抑制性RNA分子、免疫刺激核酸、适体、核酶、三链形成分子以及外部引导序列。
94.权利要求76所述的抗体，其中所述单克隆抗体或其片段偶联或融合至少一种另外的功能性分子。
95.权利要求94所述的抗体，其中所述另外的功能性分子是第二抗体。
96.权利要求48所述的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
97.权利要求96所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其片段是人类抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、镶嵌抗体、修饰的抗体或抗体衍生物。
98.权利要求97所述的试剂盒，其中所述抗体是通过VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内保守氨基酸突变修饰的。
99.权利要求97所述的试剂盒，其中所述抗体是通过改变Fc铰链区域的半胱氨酸残基数量或通过Fc铰链区域的保守氨基酸突变修饰的。
100.权利要求97所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其片段是化学修饰的。
101.权利要求100所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其片段是聚乙二醇化的。
102.权利要求100所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其片段偶联血清蛋白。
103.权利要求102所述的试剂盒，其中所述血清蛋白是人血清白蛋白。
104.权利要求97所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其片段偶联诊断试剂。
105.权利要求104所述的试剂盒，其中所述诊断试剂选自酶、辅基复合物、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性的顺磁金属离子。
106.权利要求105所述的试剂盒，其中所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶以及乙酰胆碱酯酶。
107.权利要求105所述的试剂盒，其中所述辅基复合物选自链霉亲和素/生物素以及亲和素/生物素。
108.权利要求105所述的试剂盒，其中所述荧光材料选自伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三唑嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和枣红蛋白。
109.权利要求105所述的试剂盒，其中所述发光材料是鲁米诺。
110.权利要求105所述的试剂盒，其中所述生物发光材料选自荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。
111.权利要求105所述的试剂盒，其中所述放射性材料选自125I、131I、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199以及铅-211。
112.权利要求97所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其片段偶联治疗试剂。
113.权利要求112所述的试剂盒，其中所述治疗试剂是抗菌剂。
114.权利要求97所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其片段偶联或融合至少一种另外的功能性分子。
115.权利要求114所述的试剂盒，其中所述另外的功能性分子是第二抗体。
116.权利要求53所述的在有此需要的受试者中接种疫苗的应用，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
117.权利要求116所述的应用，其中所述单克隆抗体或其片段是人类抗体、人源化抗体、重组抗体、嵌合抗体、镶嵌抗体、修饰的抗体或抗体衍生物。
118.权利要求117所述的应用，其中所述抗体是通过VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区域内保守氨基酸突变修饰的。
119.权利要求117所述的应用，其中所述抗体是通过改变Fc铰链区域的半胱氨酸残基数量或通过Fc铰链区域的保守氨基酸突变修饰的。
120.权利要求117所述的应用，其中所述单克隆抗体或其片段是化学修饰的。
121.权利要求120所述的应用，其中所述单克隆抗体或其片段是聚乙二醇化的。
122.权利要求120所述的应用，其中所述单克隆抗体或其片段偶联血清蛋白。
123.权利要求122所述的应用，其中所述血清蛋白是人血清白蛋白。
124.权利要求117所述的应用，其中所述单克隆抗体或其片段偶联诊断试剂。
125.权利要求124所述的应用，其中所述诊断试剂选自酶、辅基复合物、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性的顺磁金属离子。
126.权利要求125所述的应用，其中所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶以及乙酰胆碱酯酶。
127.权利要求125所述的应用，其中所述辅基复合物选自链霉亲和素/生物素以及亲和素/生物素。
128.权利要求125所述的应用，其中所述荧光材料选自伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三唑嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和枣红蛋白。
129.权利要求125所述的应用，其中所述发光材料是鲁米诺。
130.权利要求125所述的应用，其中所述生物发光材料选自荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。
131.权利要求125所述的应用，其中所述放射性材料选自125I、131I、铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199以及铅-211。
132.权利要求117所述的应用，其中所述单克隆抗体或其片段偶联治疗试剂。
133.权利要求132所述的应用，其中所述治疗试剂是抗菌剂。
134.权利要求132所述的应用，其中所述治疗试剂选自核糖核酸酶(RNase)、DNaseI、反义核酸、抑制性RNA分子、免疫刺激核酸、适体、核酶、三链形成分子以及外部引导序列。
135.权利要求117所述的应用，其中所述单克隆抗体或其片段偶联或融合至少一种另外的功能性分子。
136.权利要求135所述的应用，其中所述另外的功能性分子是第二抗体。
137.权利要求1-23、权利要求51-52或权利要求54-74所述的方法、权利要求24-33所述的分离或重组的多肽、权利要求34所述的载体、权利要求35-37所述的分离的细胞、权利要求38-40或75-95所述的抗体、权利要求41所述的杂交瘤细胞系、权利要求42-47所述的组合物、权利要求48-50或权利要求96-115所述的试剂盒、权利要求53或权利要求116-136所述的应用，其中所述重组多核苷酸的等价物包括在严格条件下与所述多核苷酸或其互补分子杂交的多核苷酸，其中所述严格条件包括约25°C至约37°C的孵育温度；约6xSSC至约10xSSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4xSSC至8xSSC的洗脱溶液。
138.用于鉴定抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质结合微生物DNA，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解受试者中生物膜，或抑制、预防或治疗在受试者产生生物膜的微生物感染的试剂的计算机实现方法，包括抗整合宿主因子(IHF)蛋白的候选试剂的立体结构定位，其中IHF蛋白质的立体结构是基于IHF和DNA复合物的晶体形式确定的X、Y、Z原子结构坐标，其中所述试剂与IHF在两个或多个选自如SEQ ID NO:42所示的T4、K5、A6、E28、Q43、K45、S47、G48、N51、R55、K57、R60、R63、N64、P65、K66、R76、T80、R82或Q85的IHF氨基酸或其等价物相互作用，鉴定所述试剂抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA的结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解生物膜，或抑制、预防或治疗产生生物膜的微生物感染。
139.权利要求138所述的方法，其中所述试剂与IHF在三个或多个选自如SEQ IDNO:42所示的T4、K5、A6、E28、Q43、K45、S47、G48、N51、R55、K57、R60、R63、N64、P65、K66、R76、T80、R82或Q85的IHF氨基酸或其等价物相互作用，鉴定所述试剂抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA的结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解生物膜，或抑制、预防或治疗产生生物膜的微生物感染。
140.权利要求138或139的方法，其中所述X、Y和Z原子结构坐标包括Protein DataBank所载登录号为1IHF的坐标。
141.一种定制的计算设备，包含：
至少一个处理器；
偶联所述至少一个处理器的存储器；
与所述存储器和至少一个处理器通讯的存储介质，所述存储介质含有一套处理器可执行指令，当其被配置处理器的定制计算设备执行以鉴定抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解受试者体内的生物膜，或抑制、预防或治疗在受试者体内产生生物膜的微生物感染的试剂，其中所述配置包括：
定位抗整合宿主因子(IHF)蛋白质立体结构的候选试剂的立体结构，其中IHF蛋白质的立体结构是基于IHF和DNA复合物的晶体形式确定的X、Y和Z原子结构坐标，其中所述试剂与IHF在两个或多个选自如SEQ ID NO:42所示的T4、K5、A6、E28、Q43、K45、S47、G48、N51、R55、K57、R60、R63、N64、P65、K66、R76、T80、R82或Q85的IHF氨基酸或其等价物相互作用，鉴定所述试剂抑制、竞争或中和DNABII多肽或蛋白质与微生物DNA的结合，抑制、预防或分解微生物生物膜，抑制、预防或分解生物膜，或抑制、预防或治疗产生生物膜的微生物感染。
142.鉴定调节DNABII蛋白质或多肽与含有相同微生物DNA样品中的微生物DNA相结合的试剂的方法，包括候选试剂与所述样品的接触并测试所述蛋白质或多肽与所述DNA的结合，其中所述试剂通过抑制、预防或中和DNABII蛋白质或多肽与微生物DNA的结合调节所述结合。
143.用于鉴定可通过给药干扰剂治疗或不可能治疗的具有微生物感染的患者的方法，包括检测来自具有所述感染的患者的样品内存在或缺乏DNABII多肽或蛋白质，其中DNABII多肽或蛋白质的存在确定为所述病人可通过给药所述干扰剂治疗，缺乏DNABII多肽或蛋白质确定为所述病人不能通过给药所述干扰剂治疗。
144.权利要求143所述的方法，其中DNABII多肽或蛋白质的存在确定为病人可通过施用干扰剂治疗。
145.权利要求144所述的方法，进一步包含给所述患者施用有效量的干扰剂。
146.权利要求145的方法，其中所述干扰剂是一种或多种的：
(a)分离或重组的整合宿主因子(IHF)多肽或其片段或等价物；
(b)分离或重组的来源于E.coli株系U93的组蛋白样蛋白(HU)多肽或其片段或等价物；
(c)分离或重组的表8、表9A、表9B、表10所确定的蛋白或多肽或图6所确定的DNA结合肽，或其片段或等价物；
(d)分离或重组的SEQ ID NO.1至340的多肽，或其片段或等价物；
(e)分离或重组的SEQ ID NO.6-11、28、29、42-100、表8的C末端多肽或表10所确定的那些C末端多肽或其片段或等价物；
(f)与整合宿主因子竞争性结合微生物DNA的多肽或多核苷酸；
(g)类似Holliday交叉的四路交叉多核苷酸，类似复制叉的三路交叉多核苷酸，具有固有柔性的多核苷酸或弯曲的多核苷酸；
(h)编码(a)至(f)中任意一种的分离或重组的多核苷酸，或SEQ ID NO.36的分离或重组的多核苷酸或其等价物，或在严格条件下与所述多核苷酸杂交的多核苷酸或其互补分子；
(i)特异性识别或结合(a)至(f)中任一项的抗体或抗原结合片段，或其每种抗体或抗原结合片段的等价物或片段；
(j)编码(i)中所述抗体或抗原结合片段的分离或重组的多核苷酸；或
(k)与DNABII蛋白或多肽竞争性结合微生物DNA的小分子。
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