KR20130040173A - 생물막의 제거를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

생물막의 제거를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20130040173A
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스티븐 디. 굿맨
로렌 오. 베이칼렛
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네이션와이드 칠드런스 하스피탈 인코포레이티드
유니버시티 오브 써던 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 만성/재발성 생물막 질병으로 고통받는 개인을 백신접종하는 데 사용되거나 또는 현존하는 감염을 갖는 개인의 치료제로서의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 계속해서 상기 개인의 면역시스템은 기능적 보호성 생물막의 구축 및 유지에 간섭하는 것에 의하여 숙주로부터 이들 박테리아를 예방하거나 또는 제거하는 항체들을 자연적으로 생성한다. 달리, 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 투여되어 감염을 치료하거나 또는 예방할 수 있다. 기능적 생물막을 형성할 수 없는 박테리아는 숙주 면역시스템의 잔여부(remainder)에 의하여 보다 쉽게 제거된다.

Description

생물막의 제거를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE REMOVAL OF BIOFILMS}
연관된 출원들의 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에서 2010년 3월 29일자로 출원된 미합중국 가특허출원 제61/318,743호, 2010년 3월 21일자로 출원된 동 제61/347,362호, 2010년 6월 16일자로 출원된 동 제61/397,891호 및 2011년 3월 21일자로 출원된 동 제61/454,972호들의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용들을 본 상세한 설명에 그의 전체로서 참조로 포함한다.
정부 지원의 선언
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)의 미국 구강 및 두개안면 연구원(National Institute of Dental and Craniofacial Research ; NIDCR)에 의해 지급된 계약번호 제5R01DE013230호 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 대체로 임상적 또는 산업적 박테리아성 생물막(bacterial biofilms)을 약화 및/또는 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
포유동물 신체 내의 생물막 내에 존속하는 박테리아는 모든 만성/재발성 질병(chronic/recurrent diseases)들의 약 3분의 2를 야기한다. 이들 생물막은 종종 DNA로 일차적으로 구성되는 외부 "슬라임(slime)"에 의해 보호되는 박테리아로 이루어져서 선천성 및 적응성 면역시스템(innate and adaptive immune systems), 항생제(antibiotics) 및 다른 항세균제(antibacterial agents)들이 상기 생물막 내의 상기 박테리아에 접근하는 것을 방해하여 상기 신체로부터 감염을 제거하는 것을 극히 어렵게 만든다. 더욱이, 상기 생물막은 종종 치명적인 결과를 가져오는 장래의 급성 감염에 대한 저장소(reservoir)로서 작용할 수 있다.
모든 공지된 진정세균(eubacteria) 내에서 단백질의 DNABII 패밀리(DNABII family)로부터의 적어도 하나의 단백질이 발견되었으며, 또한 상기 박테리아 세포의 외부에서 천연적으로 발견되었다. 비록 이들이 강한 선천적 면역반응(innate immune response)을 유발하기는 하나, 숙주 대상체는 감염의 결과로서 패밀리 멤버(family members)에 대한 특정의 항체를 천연적으로 생성하는 데는 실패한다. 박테리아성 생물막에 대한 주요 문제는 상기 생물막 내에 보호되는 상기 박테리아에로의 숙주 면역시스템 및/또는 항생제 및 다른 항세균제가 접근할 수 없다는 것이다.
생물막은 산업적 설비(industrial setting) 내에도 마찬가지로 존재한다. 예를 들면, 생물막은 생산현장(production field)으로부터 주유소 저장탱크(gas station storage tank)까지 광범위한 석유 가공 문제들에 연관된다. 현장에서, 황산염 환원 생물막 박테리아(sulfate reducing biofilm bacteria)가 황화수소(hydrogen sulfide)를 생성한다(산패된 오일(soured oil)). 가공 파이프라인(process pipelines)에서, 생물막 활성(biofilm activity)는 필터 및 오리피스를 폐색하는 슬라임을 발달시킨다. 생물막 및 생물막 유기체는 또한 파이프라인 및 석유 가공 설비(petroleum process equipment)의 부식을 야기한다. 이들 문제들은 오손(fouling) 및 부식성 생물막 유기체들이 심지어 최종 제품 저장 탱크의 표면 상에서 발견되는 지점까지 오일 및 연료 생산 설비 도처에서 현저할 수 있다.
가정에 있어서, 생물막은 미생물의 성장을 지지하는 임의의 표면 내 또는 표면상, 예를 들면, 배수구 내, 음식 준비 표면, 화장실 내 및 수영장과 스파(spa)에서 발견된다.
생물막은 가정용 및 산업용의 광범위한 수처리에서 연관된다. 이들은 가공 설비의 표면 상에서 성장할 수 있으며, 또한 열전달의 저하 또는 필터 및 막의 막힘(plugging) 등과 같이 상기 설비의 성능을 방해한다. 냉각탑 충진물(cooling tower fill) 상에서 성장하는 생물막은 상기 충진물의 붕괴를 야기하기에 충분한 중량을 부가할 수 있다. 생물막은 심지어 고도로 특화된 스테인레스강의 부식을 야기한다. 수처리에서의 생물막은 제지공정(paper process)에서의 생물막 오염 또는 심지어 실리콘칩(silicon chip) 상의 단일 세포의 부착 등과 같이 최종 제품의 가치를 저하시킬 수 있다. 음용수 분배 시스템(drinking water distribution system) 내에서 성장하는 생물막은 물의 에스테틱 품질(aesthetic quality)을 저하시키는 잠재적인 병원성 유기체(pathogenic organisms), 부식성 유기체 또는 박테리아의 은신처가 될 수 있다.
따라서, 연관된 박테리아성 감염을 치료하거나 또는 사멸시키고 그리고 이들을 표면으로부터 그리고 수계 내에서 제거하도록 생물막의 보호성 장벽을 돌파할 것이 요구되고 있다.
본 발명은 이러한 요구를 만족하고 그리고 마찬가지로 연관된 잇점들을 제공한다.
시퀀스 목록(sequence listing)
시퀀스 동정 번호 1(SEQ. ID NO. 1)
A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9
여기에서:
A1은 V 또는 I이고;
A2는 K, Q, E, A, V 또는 Y 중의 임의의 하나이고;
A3은 K, L, I, V 또는 F 중의 임의의 하나이고;
A4는 S, I, R 또는 V 중의 임의의 하나이고;
A5는 G 또는 S 중의 임의의 하나이고;
A6은 F이고;
A7은 G이고;
A8은 N 또는 S 또는 T 또는 K 중의 임의의 하나이고; 그리고
A9는 F이다.
시퀀스 동정 번호 2는 VKKSGFGNF이다.
시퀀스 동정 번호 3은 B1-B2-B3-B4-BS-BS-B6-B7이고,
여기에서:
B1은 부재(absent)이거나 또는 G 또는 K 중의 임의의 하나이고;
B2는 부재이거나 또는 R, I 또는 K 중의 임의의 하나이고;
B3는 N 또는 V이고;
B4는 P 또는 I이고;
B5는 K, Q, S 또는 G 중의 임의의 하나이고;
B6은 T, K 또는 S 중의 임의의 하나이고; 그리고
B7은 G, K, Q 또는 D 중의 임의의 하나이다.
시퀀스 동정 번호 4는 NP(K/Q)TG이다.
시퀀스 동정 번호 5는 GRNP(K/Q)TG이다.
시퀀스 동정 번호 6 전장 야생형(wild type ; wt) 86-028NP 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) IhfA; 젠뱅크 접근 번호(Genbank accession No.): AAX88425.1, 최종 접근(last accessed) 2011년 3월 21일: MATITKLDIIEYLSDKYHLSKQDTKNVVENFLEEIRLSLESGQDVKLSGFGNFELRDKSSRPGRNPKTGDVVPVSARRVVTFKPGQKLRARVEKTK
시퀀스 동정 번호 7 전장 야생형 86-028NP 해모필루스 인플루엔자에 HU, 젠뱅크 접근 번호: YP_248142.1, 최종 접근 2011년 3월 21일: MRFVTIFINHAFNSSQVRLSFAQFLRQIRKDTFKESNFLFNRRYKFMNKTDLIDAIANAAELNKKQAKAALEATLDAITASLKEGEPVQLIGFGTFKVNERAARTGRNPQTGAEIQIAASKVPAFVSGKALKDAIK
시퀀스 동정 번호 8 전장 야생형 R2846 해모필루스 인플루엔자에 IhfA, 젠뱅크 접근 번호: AD096375, 최종 접근 2011년 3월 21일: MATITKLDIIEYLSDKYHLSKQDTKNVVENFLEEIRLSLESGQDVKLSGFGNFELRDKSSRPGRNPKTGDVVPVSARRVVTFKPGQKLRARVEKTK
시퀀스 동정 번호 9 전장 야생형 Rd 해모필루스 인플루엔자에 IhfA; 젠뱅크 접근 번호: AAC229S9.1, 최종 접근 2011년 3월 21일: MATITKLDIIEYLSDKYHLSKQDTKNVVENFLEEIRLSLESGQDVKLSGFGNFELRDKSSRPGRNPKTGDVVPVSARRVVTFKPGQKLRARVEKTK;
시퀀스 동정 번호 10 전장 야생형 대장균(E . coli) K12 IhfA; 젠뱅크 접근 번호 : AAC74782.1, 최종 접근 2011년 3월 21일: MALTKAEMSEYLFDKLGLSKRDAKELVELFFEEIRRALENGEQVKLSGFGNFDLRDKNQRPGRNPKTGEDIPITARRVVTFRPGQKLKSRVENASPKDE; DNA 젠뱅크 번호 NC_000913
시퀀스 동정 번호 11 전장 야생형 슈도모나스 아에루기노사(P . aeruginosa) PA 01 IhfA; 젠뱅크 접근 번호: AAG06126.1, 최종 접근 2011년 3월 21일: MGALTKAEIAERLYEELGLNKREAKELVELFFEEIRQALEHNEQVKLSGFGNFDLRDKRQRPGRNPKTGEEIPITARRVVTFRPGQKLKARVEAYAGTKS
시퀀스 동정 번호 12 및 13: (IHFα)의 β-3 및 α-3 부분들(portions) 시퀀스 동정 번호 12: TFRPGQ 및 시퀀스 동정 번호 13: KLKSRVENASPKDE
시퀀스 동정 번호 14 및 15: (IHFβ)의 β-3 및 α-3 부분들 시퀀스 동정 번호 14: HFKPGK 및 시퀀스 동정 번호 15: ELRDRANIYG
시퀀스 동정 번호 16 및 17: 시퀀스 동정 번호 6의 β-3 및 α-3 부분들, SEQ ID NOS. 16: TFKPGQ 및 시퀀스 동정 번호 17: KLRARVEKTK
시퀀스 동정 번호 18 및 19: 2019 해모필루스 인플루엔자에 IhfA의 β-3 및 α-3 부분들, 시퀀스 동정 번호 18: TFKPGQ 및 시퀀스 동정 번호 19: KLRARVENTK
시퀀스 동정 번호 20 및 21: 시퀀스 동정 번호 8의 β-3 및 α-3 부분들, 시퀀스 동정 번호 20: TFKPGQ 및 시퀀스 동정 번호 21: KLRARVEKTK
시퀀스 동정 번호 22 및 23: 시퀀스 동정 번호 9의 β-3 및 α-3 부분들, 시퀀스 동정 번호 22: TFKPGQ 및 시퀀스 동정 번호 23: KLRARVEKTK
시퀀스 동정 번호 24 및 25: 시퀀스 동정 번호 10의 β-3 및 α-3 부분들, 시퀀스 동정 번호 24: TFRPGQ 및 시퀀스 동정 번호 25: KLKSRVENASPKDE
시퀀스 동정 번호 26 및 27: 시퀀스 동정 번호 11의 β-3 및 α-3 부분들, 시퀀스 동정 번호 26: TFRPGQ 및 시퀀스 동정 번호 27: KLKARVEAYAGTKS
시퀀스 동정 번호 28: 대장균 hupA, 젠뱅크 접근 번호: AP_003818, 최종 접근 2011년 3월 21일: MNKTQLIDVIAEKAELSKTQAKAALESTLAAITESLKEGDAVQLVGFGTFKVNHRAERTGRNPQTGKEIKIAAANVPAFVSGKALKDAVK
시퀀스 동정 번호 29: 대장균 hupB, 젠뱅크 접근 번호: AP_001090.1, 최종 접근 2011년 3월 21일: MNKSQLIDKIAAGADISKAAAGRALDAIIASVTESLKEGDDVALVGFGTFAVKERAARTGRNPQTGKEITIAAAKVPSFRAGKALKDAVN
시퀀스 동정 번호 30 및 31: 시퀀스 동정 번호 28의 β-3 및 α-3 부분들, 시퀀스 동정 번호 30: AFVSGK 및 시퀀스 동정 번호 31: ALKDAVK
시퀀스 동정 번호 32 및 33: 시퀀스 동정 번호 29의 β-3 및 α-3 부분들, 시퀀스 동정 번호 32: SFRAGK 및 시퀀스 동정 번호 33: ALKDAVN
시퀀스 동정 번호 34: 삽입숙주인자 α(IHF α)의 C-말단 20 아미노산: TFRPGQKLKSRVENASPKDE
시퀀스 동정 번호 35: 삽입숙주인자 β의 C-말단 20 아미노산: KYVPHFKPGKELRDRANIYG
시퀀스 동정 번호 36: DNABII 결합 공통 서열(DNABII binding consensus sequence): WATCAANNNNTTR 여기에서 W는 A 또는 T이고, N은 임의의 염기(base)이고 그리고 R은 퓨린(purine)이다
시퀀스 동정 번호 337: 대장균 삽입숙주인자 α: GRNPKTGEDIPI
시퀀스 동정 번호 338: 대장균 삽입숙주인자 β: GRNPKTGDKVEL
시퀀스 동정 번호 339: 대장균 HUα: GRNPQTGKEIKI
시퀀스 동정 번호 340: 대장균 HUβ: GRNPQTGKEITI
표들의 설명
표 1 내지 5들은 표시된 유기체 내의 생물막의 반전(reversal)의 시험관 내 생물검정(in vitro bioassay)의 결과들이다.
표 6은 중이염(otitis media ; OM)의 친칠라 모델(Chinchilla model)에서의 중이(middle ear) 내의 생물막의 상대적인 함량의 평점표(scoring scheme)이다.
표 7은 DNA분해효소(DNase)로의 치료에 의한 생물막의 반전의 시험관 내 생물검정의 결과들이다.
표 8은 본 명세서에서 제공된 방법들에서 사용될 수 있는 그램양성(gram(+)) 및 그램음성(gram(-)) 박테리아에 의해 생산된 DNA 결합 단백질의 비-제한의 요약(non-limited summary)이다.
표 9a는 본 발명의 여러 구체예들의 DNA 결합 단백질의 상대적인 부분들의 시퀀스 배치(sequence alignment)이다. 굵은 글자들은 공통으로 정확한 매치를 나타내고, 밝은 회색 글자(light gray lettering)는 보존적 아미노산 변화(conservative amino acid change)를 나타내고, 그리고 밝거나 어둡게 음영된 시퀀스(lightly or darkly shaded sequences)들은 종들을 가로질러 고도로 보존된 것들이다. 아미노 및/또는 카르복시-말단에서의 회색 음영된 미확인의 시퀀스들은 공통 서열(consenus sequence)을 공유하지 않는 미확인의 아미노산들이다. 표 9a는 문헌 Obeto et al. (1994) Biochimie 76:901-908에서 앞서 공개된 정보에 기초하고 있다. 표 9b는 문헌 Liu et al. (2008) Cell Microbiol. 10(1):262-276에 대한 16 아미노산 펩티드 모티브(motif)의 비교이다.
표 10은 상기 표시된 유기체로부터의 DNABII 단백질의 α, β, 및 C-말단 부분들의 목록(listing)이다.
박테리아 세포 내에서, 상기 DNABII 단백질은 결합(binding)에 의하여 DNA 기질(substrates)을 필수적으로 굴곡(bend)시키는 DNA 결합 단백질이다. 유사하게, 이미 굴곡된 형태에 있는 DNA는 굴곡에 요구되는 에너지가 불필요하기 때문에 선호되는 기질이다.
단백질의 상기 DNABII 패밀리는 상기 생물막 상태 내의 박테리아 세포들의 외부에서 발견된다. 본 출원인들은 이들 단백질들이 실제로는 임계의 분지된 접합(critical branched junctions)에 결합되어 있다는 것을 발견하였다. 하나의 관점에 있어서, 본 출원인들은 숙주를 특정의 항체들을 생성하는 폴리펩티드 및 단백질로 면역화(immunizing)시키는 것에 의하여 DNA-기반 격자(DNA-based lattice)가 충분히 교호되어 이제 숙주 면역시스템이 상기 생물막을 제거하는 것을 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
본 출원인들은 또한 DNABII 패밀리 멤버(대장균 삽입숙주인자, IHF)로의 여러 모드의 면역화에 의한 친칠라 숙주의 중이 내의 사전-형성된 비-피막형(non-typeable) 해모필루스 인플루엔자에 생물막의 제거를 입증하였다. 이러한 친칠라 중이 생물막 동물 시스템은 인간 중이염(또는 중이 감염)에 대하여 뛰어난 모델로서 이미 잘 기록되었다.
이러한 기술을 사용하기 위한 방법은 용이하다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 만성/재발성 생물막 질병에 대한 예방약(prophylactic)으로서 또는 현존하는 감염을 갖는 이들에 대한 치료제(therapeutic)로서 개인을 백신접종하는 데 사용되었다. 상기 개인의 면역시스템은 계속해서 기능적 보호성 생물막(functional protective biofilm)의 구축 및 또는 유지에 간섭하는 것에 의하여 숙주로부터 이들 박테리아를 예방하거나 또는 제거하는 항체를 자연적으로 생성할 것이다. 달리, 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 투여되어 감염을 치료하거나 또는 예방할 수 있다. 기능적 생물막을 형성할 수 없는 박테리아는 상기 숙주의 면역시스템의 잔여부(remainder)에 의하여 보다 용이하게 제거된다.
따라서, 하나의 관점에 있어서, 상기 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질 또는 미생물 DNA를 간섭제(interfering agent)와 접촉시키는 것을 포함하거나(comprising), 또는 달리 필수적으로 이루어지거나(consisting essentially) 또는 여전히 더욱 이루어지고, 그에 의하여 상기 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 상기 미생물 DNA에의 결합을 저해, 경쟁 또는 적정하는 것에 의하여 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해(inhibiting), 경쟁(competing) 또는 적정(titrating)하는 방법이 제공된다. 상기 접촉은 시험관 내 또는 생체 내(in vivo)에서 수행될 수 있다.
다른 관점에 있어서, 상기 생물막을 간섭제와 접촉시키는 것을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지고, 그에 의하여 상기 미생물의 생물막을 저해하거나 예방하거나 또는 파괴하는(breaking down) 미생물의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 방법이 제공된다. 상기 접촉은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
또 다른 관점에 있어서, 대상체에 유효량의 간섭제를 투여하는 것을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지고, 그에 의하여 상기 미생물의 생물막을 저해하거나 예방하거나 또는 파괴하는 대상체 내의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 방법이 제공된다.
또 다른 관점에 있어서, 대상체 내에서 생물막을 생성하는 미생물의 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상체에 유효량의 간섭제를 투여하고, 그에 의하여 대상체 내에서 상기 생물막을 생성하는 미생물의 감염을 저해거나, 예방하거나 또는 치료하는 것을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
본 명세서에서 기술되는 바와 같은 방법에 대하여는, 상기 미생물 DNA의 상기 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합을 간섭하거나 또는 방해하는 임의의 시약(agent)이 본 발명의 관점에 속하는 것으로 의도된다. 간섭제들의 비-제한적인 예들에는:
(a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편(fragment) 또는 등가물(equvalent);
(b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질(histone-like protein) 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(f) 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드;
(g) 홀리데이 접합(Holliday junction) 유사 4방 접합(four-way junction) 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래(replication fork) 유사 3방 접합(three-way junction) 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성(inherent flexibility)을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드(bent polynucleotide);
(h) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 인코딩(encoding)하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 시퀀스 동정 번호 36의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이들 각각의 등가물 또는 엄중 조건(stringent condition) 하에서 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화(hybridizes)하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 등가물 또는 그의 보체(complement);
(i) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이들 항체 또는 항원 결합 단편 각각의 등가물 또는 단편;
(j) (i)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 그의 보체; 또는
(k) 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 소분자(small molecule)
들이 포함된다.
또한 본 명세서에서
(a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(f) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 시퀀스 동정 번호 36의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이들 각각의 등가물 또는 엄중 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 등가물 또는 그의 보체;
(g) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이들 각각의 등가물 또는 단편;
(h) (g)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
(i) (a) 내지 (e)의 어느 하나와 펄스화된 항원 제공 세포; 및
(j) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 항원 제공 세포
의 군의 하나 또는 그 이상의 시약의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 면역 반응을 유발하거나 또는 수동 면역(passive immunity)을 부여하는 것을 필요로 하는 대상체에 대하여 면역 반응을 유발하거나 또는 수동 면역을 부여하는 방법이 제공된다.
이러한 면역 반응을 필요로 하는 대상체에는 미생물의 생물막을 생성하는 감염의 위험에 있거나 또는 그로부터 고통받는 대상체들이 포함된다.
본 명세서에서는 상기한 방법에서 사용되는 조성물들이 제공되며, 그의 비-제한적인 예들이 이하에서 기술된다.
하나의 관점에 있어서, 시퀀스 동정 번호 1 내지 5 또는 12 내지 27, 30 내지 35, 101 내지 340으로부터 선택되는 아미노산 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물로부터 선택되는 아미노산을 포함하거나, 또는 달리 필수적으로 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
다른 관점에 있어서, 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 1 또는 2를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서, 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 3, 4 또는 5를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서, 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30 또는 32를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서, 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 31 또는 33을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서, 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 337, 338, 339 또는 340을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서, 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 12 및 13 또는 14 및 15 또는 16 및 17 또는 18 및 19 또는 20 및 21 또는 22 및 23 또는 24 및 25, 또는 26 및 27 또는 30 및 31 또는 32 및 33을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서, 적어도 10 또는 달리 적어도 15 또는 달리 적어도 20 또는 달리 적어도 25 또는 달리 적어도 30을 포함하는 C-말단 부위, DNABII 폴리펩티드, IHF 폴리펩티드, HU 폴리펩티드, 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29의 군의 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 또는 표 8, 표 10에서 동정된 것들 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서,
상기 폴리펩티드가 IHF α, IHF β 또는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 중의 임의의 하나의 야생형이 아니라는 단서 하에
시퀀스 동정 번호 12 및 13을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 14 및 15를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 16 및 17을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 18 및 19를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 20 및 21을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 23 및 24를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 25 및 26을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 30 및 31을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 32 및 33을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 34 및 35를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 337 및 338을 포함하는 폴리펩티드; 또는
시퀀스 동정 번호 339 및 340을 포함하는 폴리펩티드;
의 군의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
하나의 관점에 있어서,
상기 폴리펩티드가 IHF α, IHF β 또는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 중의 임의의 하나의 야생형이 아니라는 단서 하에
시퀀스 동정 번호 12 및 13으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 14 및 15로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 16 및 17로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 18 및 19로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 20 및 21로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 23 및 24로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 25 및 26으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 30 및 31로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 32 및 33으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 34 및 35로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 337 및 338로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드; 또는
시퀀스 동정 번호 339 및 340으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
의 군의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다.
또한, 그의 단편 및 등가물을 포함하여 상기 동정된 단리된 폴리펩티드의 2 또는 그 이상 또는 3 또는 그 이상 또는 4 또는 그 이상 또는 다수개들을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드가 제공된다. 이러한 것들의 예들에는 시퀀스 동정 번호 1 내지 4 및/또는 12 내지 29 및/또는 30 내지 33 및/또는 30 내지 35, 예를 들면, 시퀀스 동정 번호 1 및 2 또는 달리 1 및 3 또는 달리 1 및 4 또는 달리 2 및 3 또는 달리 시퀀스 동정 번호 1, 2 및 3 또는 달리 2, 3 및 4 또는 달리 1, 3 및 4 또는 등가의 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드가 포함되며, 이들의 예들을 표 9에 나타내었다. 상기 폴리펩티드는 임의의 배향(orientation), 예를 들면, 시퀀스 동정 번호 1, 2 및 3 또는 시퀀스 동정 번호 3, 2 및 1 또는 달리 시퀀스 동정 번호 2, 1 및 3, 또는 달리 3, 1 및 2, 또는 달리 11 및 12, 또는 달리 1 및 12, 또는 달리 2 및 12, 또는 달리 1 및 12, 또는 달리 2 및 13, 또는 달리 12, 16 및 1, 또는 달리 1, 16 및 12로 존재할 수 있다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 시퀀스 동정 번호 1 또는 2 및 3 또는 4를 포함하는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 해모필루스 인플루엔자에 IHF α 또는 IHF β 미생물의 β-3 및/또는 α-3 등과 같은 DNABII 단백질의 단편에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 이들의 비-제한적인 예들에는 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 또는 상기 폴리펩티드 각각의 단편 또는 등가물이 포함되며, 그의 예들을 표 9에 나타내었다. 하나의 관점에 있어서, 단리된 야생형 폴리펩티드는 예를 들면 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11 또는 표 8에서 동정된 야생형 시퀀스가 아닌 것이 특별히 배제된다. 이 구체예에 있어서, 그의 비-제한적인 실시예들에 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 및 30 내지 33 또는 이들 각각의 등가물이 포함되는 시퀀스 동정 번호 1 또는 2 또는 IHF α 또는 IHF β 미생물의 β-3 및/또는 α-3 단편에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 폴리펩티드는 상향류(upstream) 또는 시퀀스 동정 번호 3 또는 4 또는 그의 단편 또는 등가물로부터의 아미노 말단에 위치된다. 다른 관점에 있어서, 그의 비-제한적인 실시예들에 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 또는 이들의 등가물이 포함되는 시퀀스 동정 번호 3 또는 4 또는 IHF α 또는 IHF β 미생물의 β-3 및/또는 α-3 단편에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리된 폴리펩티드는 상향류 또는 시퀀스 동정 번호 1 또는 2 또는 그의 등가물에 대한 아미노 말단에 위치된다.
상기 구체예들 중의 임의의 것에 있어서, 상기 폴리펩티드, 그의 단편 또는 등가물의 N-말단 또는 C-말단에 펩티드 연결체가 더 첨가될 수 있다. 하나의 관점에 있어서, 상기 연결체는 본 발명의 상기 폴리펩티드, 예를 들면, 시퀀스 동정 번호 1 내지 4, 28, 29, 34, 또는 35 또는 30 내지 33, 34, 또는 35 또는 IHF α 또는 IHF β 미생물의 β-3 및/또는 α-3 단편에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리된 폴리펩티드를 연결하며, 그의 비-제한적인 예들에 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 또는 이들 각각의 등가물이 포함된다. "연결체(linker)" 또는 "펩티드 연결체(peptide linker)"는 폴리펩티드 시퀀스의 N-말단 또는 C-말단 둘 중의 어느 하나에 연결되는 펩티드 시퀀스를 나타낸다. 하나의 관점에 있어서, 상기 연결체는 약 1 내지 약 20의 아미노산 잔기(residues) 길이 또는 달리 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 5의 아미노산 잔기 길이이다. 펩티드 연결체의 하나의 예는 Gly-Pro-Ser-Leu-Lys-Leu(시퀀스 동정 번호: 37)이다.
더욱이, 상기 동정된 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드의 2 또는 그 이상을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 상기 동정된 폴리펩티드의 임의의 하나의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드의 단편 또는 등가물이 제공된다.
여전히 상기 미생물 DNA의 폴리펩티드 또는 이들의 단편 또는 등가물, 예를 들면, 시퀀스 동정 번호 36, 또는 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드; 상기 기술된 폴리펩티드 또는 이들의 항체 또는 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드와의 결합을 방해하는 폴리뉴클레오티드가 더욱 제공되며, 이들은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현(expression) 및/또는 복제(replication)에 필수적인 조절요소(regulatory elements)에 작동가능하게(operatively) 연결될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터(vector) 내에 포함될 수 있다.
또한 상기 기술된 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드; 상기 기술된 바와 같은 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 상기 기술된 바와 같은 벡터를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리된 숙주 세포가 제공된다.
하나의 관점에 있어서 상기 세포는 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 단리된 항원 제공 세포이다. 다른 관점에 있어서, 상기 폴리펩티드는 수지상세포(dendritic cell) 등과 같은 상기 세포의 표면 상에 존재한다. 또 다른 관점에 있어서, 상기 항원 제공 세포는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된다.
상기 폴리펩티드의 단편 또는 등가물을 포함하여 상기 기술된 바와 같은 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 특별히 인식하고 그리고 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이 더욱 제공된다. 항체의 비-제한적인 예들에는 폴리클로날 항체(polyclonal antibody), 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody), 항체 유도체(antibody derivative), 베니어드 항체(veneered antibody), 다이어바디(diabody), 키메라 항체(chimeric antibody), 항체 유도체, 재조합 인간 항체(recombinant human antibody) 또는 항체 단편(antibody fragment) 들이 포함된다. 특정한 관점에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 여전히, 상기 모노클로날 항체를 생성하는 혼성세포주(hybridoma cell line)가 또한 제공된다.
본 발명은 또한 상기 동정된 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 항체 또는 단편들 중의 하나 또는 그 이상을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 더욱 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 단리된 폴리펩티드인 하나의 관점에 있어서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 다시스트론성 벡터(polycistronic vector) 내에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 하나 또는 그 이상의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 상기벡터들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 단리된 숙주세포가 더욱 제공된다. 하나의 관점에 있어서 상기 단리된 숙주세포는, 항원 제공 세포, 예를 들면, 수지상세포 등과 같은 원핵세포(prokaryotic cell) 또는 진핵세포(eukaryotic cell)이다.
상기 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, 항원 결합 단편, 벡터 또는 숙주세포들은 검출가능한 표지(detectable label)을 더 포함할 수 있다.
담체(carrier) 및 본 발명의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 본 발명의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 단리된 숙주세포 또는 본 발명의 항체들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 상기 담체는 고체 지지체(solid support), 스텐트(stent) 또는 치아 임플란트(dental implant) 또는 약제학적으로 수용가능한 담체 등과 같은 액체들 중의 하나 또는 그 이상이 될 수 있다. 상기 조성물은 부형제(adjuvant), 항생제(antimicrobial) 또는 항원성 펩티드(antigenic peptide)를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물은 별도의 생물학적으로 활성인 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 것의 비-제한적인 예들은 표면 항원(surface antigens), 예를 들면, OMP P5, rsPilA, OMP 26, OMP P2 또는 IV형 필린 단백질(Type IV Pilin protein)(문헌 Jurcisek and Bakaletz (2007) J. of Bacteriology 189(10):3868-3875 및 Murphy, TF, Bakaletz, LO 및 Smeesters, PR (2009) The Pediatric Infectious Disease Journal, 28:S121-S126을 참조하시오) 등과 같은 다른 백신 성분(즉, 항원성 펩티드) 및 항생제(antimicrobial agents) 등과 같은 항균제이다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건들 하에서 상기 기술된 바와 같은 항원성 펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 성장 또는 배양(culturing)시키는 것에 의하여 항원성 펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법에 의하여 생산된 상기 폴리펩티드는 시험관 내 또는 생체 내 사용을 위하여 더욱 단리될 수 있다.
상기 기술한 바와 같은 조성물 및 사용을 위한 지시서(instructions)를 포함하는 진단 또는 치료용 키트(kit)가 또한 제공된다. 본 명세서에서 제공된 바와 같은 새로운 약물(drugs) 및/또는 조합요법(combination therapies)을 스크리닝(screen)을 수행하기 위한 키트가 또한 제공된다.
도 1a는 NTHI 균주 86-028NP에 의해 친칠라 중이 내에 형성되고 그리고 이중가닥 DNA(double stranded DNA ; dsDNA)(이 이미지(image)의 전경(foreground) 내에서 간헐적인 단괴(intermittent clumps)를 갖는 물질의 짙은 회색의 중첩되는 가닥 및 덩어리(bundles)로 나타남)의 표지화를 위한 DAPI로 표지된 것과 마찬가지로 NTHI Tfp 필린 단백질(이 이미지의 배경(background)에서 옅은 회색의 작은 반점(speckles) 및 작은 군집(clusters)으로 나타남)로 표지된 생물막이다. 이 사진은 문헌 Jurcisek and Bakaletz (2007) J. of Bacteriology 189(10):3868-3875으로부터 재생되었다. 도 1b는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)을 앓는 어린이의 폐로부터의 기관지 폐포 세척 종괴(bronchoalveolar lavage ; BAL)의 면역표지이다. 낭포성 섬유증을 앓는 어린이의 폐를 BAL을 통하여 세척해내고 그리고 상기 세척으로부터의 입자성 물질(particulate matter)을 면역표지화를 위하여 동결시키고 그리고 슬라이드로 고정시켰다. 동결된 입자성 물질을 항-IHF 항체로 면역표지화시켰다. 인간 낭포성 섬유증 환자의 상기 생물막 내의 IHF 양성 초점들(IHF positive foci)의 존재는 인간 낭포성 섬유증의 병인(etiology)이 상기 dsDNA의 정점(vertices)들에서 IHF를 갖는 생물막을 포함한다는 것을 예시하고 있다. 도 1c는 부비강(sinus) 수술 시 수집되고 그리고 OCT 동결 배지(OCT freezing medium ; 최적 절단 온도 배지(Optimal Cutting Temperature medium), Fisher Scientific Cat. No. 14-373-65로부터 상용적으로 획득가능함) 내에서 포매(embedded)시킨 인간 부비강으로부터의 분비물(secretions)을 나타내고 있다. 10㎛ 동결 절편(frozen sections)들을 절단해내고 그리고 항IHF로 표지화시켰다(회색 군집들로 나타남). 상기 샘플 내의 dsDNA는 형광염색(fluorescent stain) DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen으로부터 상용적으로 획득가능함)로 염색시켰다. 부비동염(sinusitis) 환자의 생물막 내의 IHF 양성 초점들의 존재는 인간 부비동염의 병인이 상기 dsDNA의 정점들에서 IHF를 갖는 생물막을 포함한다는 것을 예시하고 있다.
도 2는 친칠라의 중이 내에 형성된 NTHI 생물막 내의 이중가닥 DNA(이 이미지에서는 백색의 가닥으로서 나타남)의 면역조직화학적 표지화(immunohistochemical labeling)이다. IHF에 대한 양성 표지화(positive labeling)(이 3-패널의 이미지의 중간 패널 내의 초점을 강조하기 위하여 화살표에 의해 표시된 것으로서)는 dsDNA에 의해 형성된 정점들의 거의 100%로 관측되었다. 정점들 사이의 평균거리는 대략 6㎛이거나 또는 하나의 정점이 B-형태의 DNA에 대한 DNA의 염기 당 0.34㎚로 가정하는 경우 각 정점 사이는 대략 18kb이었다. 우리가 알고 있는 한에서는, 항-IHF와 교차-반응(cross-react)하는 에피토프(epitopes)를 지니는 유일한 단백질은 HU 및 IHF들이다. 따라서, 이들 관측들에 기초하여, 상기 NTHI 생물막 매트릭스(matrix) 내에 세포외 DNABII 단백질들이 존재할 뿐만 아니라 보다 중요하게는 이들 단백질들이 형태에 있어서 십자형 구조(cruciform structures)를 닮은 eDNA 가닥 상에 배타적으로 위치되는 것으로 나타났으며(도 1, 패널 B, 바닥부), 따라서 그 결과의 상기 eDNA의 굽혀진 형태를 매개함에 있어서 중요한 역할을 강하게 암시하는 것으로 나타났다.
도 3은 IHF에 대하여 유도된 항체들이 챔버 슬라이드(chamber slide) 내에 형성된 구축된 NTHI 생물막을 역전시키는 것을 나타내고 있다. 도 3a는 비-특이적 항체로 처리된 생물막을 나타내고 있다. 도 3b는 순수한 토끼 혈청(naive rabbit serum)으로 처리된 생물막을 나타내고 있다. 풍부한 타워를 갖는 건장한 NTHI 생물막(백색 내지 밝은 회색의 군집된 부위으로 나타남) 및 수분통로(water channels)(흑색 공간들)를 주목하시오. 도 3c는 항-IHF로 처리된 생물막이다. 항-IHF로 처리된 이후 생물막 구조의 근절(eradication)을 주목하시오. 개개 NTHI(작은 강조된 백색 내지 밝은 회색 점들로 나타남) 및 희박한, 짧은 타워(sparse, short towers)(보다 짙은 백색 내지 밝은 회색의 군집된 부위으로 나타남)들이 잔류하고 있다. 도 3d 및 3e들은 IHF에 대하여 유도된 항체들이 구축된 NTHI 생물막을 역전시키는 것을 더욱 묘사하고 있다. 도 3(패널 E)에 나타난 바와 같이, 순수한 혈청과 함께 배양된 생물막(도 3, 패널 D)와 바교할 때 상기 생물막은 3-차원의 구조의 극적인 손실을 나타내었다. 다중 복제 검정(multiple replicate assays)의 COMSTAT 분석을 통하여, 생물막 높이, 생물량(biomass) 및 생물막 두께의 측정된 매개변수들이 항-IHF와의 배양에 의하여 80% 이상의 평균으로 모두 감소되었다.
도 4a 및 도 4b들은 NTHI에 의해 형성된 구축된 생물막의 항-IHF로의 처리가 상청액(supernatant) 내로 방출된 보다 많은 NTHI의 결과를 가져온다는 것을 나타내는 그래프들이다. 챔버 슬라이드들 내에서 16시간 성장시킨 NTHI 생물막들을 멸균 배지(sterile medium ; sBHI)로 거짓 처리(sham treated)하거나 또는 순수한 토끼 혈청 또는 토끼 항-IHF로 처리하였다. 6시간 후(도 4a) 또는 10시간 후(도 4b), 상청액들을 수집하고 그리고 분석하였다. 항-IHF로의 처리 이후 상청액 내에 보다 많은 수의 NTHI를 주목하시오. 항-IHF와의 배양이 대략 6시간 이내에서 상기 챔버 슬라이드 내의 배지로부터의 배양물에 대하여 획득가능한 부유성 박테리아(planktonic bacteria)에서 뚜렷한 증가의 결과를 가져왔으며, 10시간의 배양에서 뚜렷하게 증가하였다. 이들 결과들은 상기 생물막 매트릭스로부터의 박테리아의 방출을 암시한다.
도 5는 IHF로의 경피적 면역화(transcutaneous immunization)가 중이 내에 구축된 생물막을 감소시키는 결과들을 나타내고 있다. 소낭(bullae)들을 상대적인 잔여 생물막 덩어리(biofilm mass)의 0 내지 4+의 척도 상에 맹목적으로 순서를 정하였음을 주목하시오.
도 6a는 IHF-IHF 다이머(dimmer) 내의 다른 IHF와 상호작용하거나 또는 이와 결합하거나(상위 수준에서 삼각형들로 표시됨) 또는 DNA와 상호작용하거나 또는 이와 결합하는(하위 수준에서 삼각형들로 표시됨) IHF의 아미노산 잔기들을 나타내는 지도(map)이다. 상기 펩티드는 짧은 수직 막대들에 의하여 3개의 아미노산들을 갖는 부위들로 나뉘어진다. 도 6b는 미생물 DNA의 IHF와의 상호작용을 도식적으로 묘사하고 있다.
도 7은 순수한 토끼 혈청과의 배양에 비교하여 토끼 항-IHF와의 배양에 의하여 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 나이세리아 고노로에아에(N gonorrhoeae) 및 슈도모나스 아에루기노사에 의해 형성된 생물막들의 감소를 묘사하고 있다.
도 8은 대장균에 의하여 시험과 내에 형성된 생물막들의 순수한 혈청 또는 항-IHF 혈청과의 배양의 효과를 나타내고 있다. 생물막들의 대표적인 이미지들을 각 이미지의 우측에 나타낸 개개 생물막의 높이들과 함께 패널 A 내지 F에 나타낸 반면에, 항-IHF와의 배양에 의해 매개된 것으로서의 생물막 높이, 생물량 및 평균 두께에서의 감소율의 관점들에서의 평균값들을 표들 내에서 각 열(row)의 말단에 나타내었다. 패널 A 및 B - 부모 균주(parental strain) MG1655; 패널 C 및 D - HU-결핍 hupA , hubB 이중 돌연변이(double mutant); 패널 E 및 F - IHF-결핍 himD , himA 이중 돌연변이. 생물막을 감소시키는 항-IHF 혈청의 능력은 상기 부모 분리주(parental isolate) 또는 상기 HU-결핍 돌연변이에 의해 유도되나, 상기 IHF-결핍 균주는 기대된 바와 같이 그러하지 아니하였다.
도 9a는 경피적 전달 경로(trancutaneous delivery route)를 통한 IHF로의 면역화가 친칠라의 중이 내에 거주하는 NTHI 유발 생물막의 생물량을 뚜렷하게 감소시킨 항체들의 형성을 유발하였다는 것을 입증하고 있다(p<O.OOl). 도 9b는 부형제 단독으로 면역화된 동물 대 IHF + 부형제로 면역화된 동물의 귀 내에 잔류하는 생물량들의 대표적인 이미지들을 묘사하고 있다. 도 9b에서의 마지막 행(column)은 본 명세서에서 사용된 점수 체계(scoring system)의 극치(extremes)들에서의 생물량들의 이미지들을 나타내고 있다. 상부의 이미지는 4+의 점수를 받은 생물량을 포함하는 중이의 이미지인 반면에 하부 이미지는 생물량이 없음을 나타내는 0의 점수를 받은 건강한 중이의 이미지이다.
도 10a는 TCI를 통하여 부형제 단독으로의 면역화 대 IHF + 부형제로의 면역화된 친칠라의 중이로부터 회수된 생물막의 동결 절편의 H&E 염색(H&E staining)을 나타내고 있다. 부형제 단독으로 면역화된 것과 비교하여 IHF + 부형제로 면역화된 동물로부터 회수된 생물막의 농축되고 그리고 붕괴된 외양을 주목하시오. 패널 A에 나타낸 상들은 2개의 대표적인 생물량들 사이의 높이와 밀도에서의 차이를 나타내기 위하여 동일한 배율(magnifications)들로 나타내었다. 도 10b는 부형제 단독으로 면역화된 동물 대 IHF + 부형제로 면역화된 동물들의 중이 내에 존재하는 박테리아 하중(bacterial load)의 뚜렷한 감소가 존재하는 것을 입증하고 있다(p<0.05).
도 11은 IHF가 친칠라의 면역화에 사용된 조건들 하에서 dsDNA와 함께 특정의 복합체(complexes)를 형성하였다는 것을 입증하는 전기영동이동도 전이 분석(electrophoretic mobility shift assay)을 묘사하고 있다.
도 12는 천연의 IHF + 부형제로의 경피적 면역화가 부형제 단독(p < 0.017), dsDNA 단독(p < 0.003) 또는 dsDNA가 이미 결합된 IHF + 부형제(p< 0.001)를 받은 동물과 비교하여 친칠라의 중이 내에 거주하는 생물막을 뚜렷하게 감소시킨 항체들의 형성을 유발하였다는 것을 도식적으로 나타내고 있다. 이러한 결과는 천연의 IHF에의 dsDNA의 결합이 이러한 DNABII 패밀리 멤버의 보호성 에피토프들을 마스킹하였다는 것을 암시하였다.
도 13은 IHF 또는 dsDNA가 결합된 IHF로의 피하 면역화 이후 혈청 내의 항체에 의한 IHF(화살표)의 인식을 묘사하고 있다.
도 14는 항-IHF 혈청의 차선의 농도(sub-optimal concentration ; 1:200)와 DNAseI 각각; 계속해서 위 둘의 혼합(도 14a); 항-IHF의 차선의 농도(1:100)와 항-외부막 단백질 P5 혈청(anti-outer membrane protein P5 serum ; OMP P5) 각각; 계속해서 위 둘의 혼합(도 14b);의 시너지효과, 또는 항-IHF의 유효 희석(effective dilution)(생물막의 탈벌크화(debulking)의 관점이기는 하나 박테리아 세포 사멸을 유도하지는 않는)과 아목시실린(amoxicillin) 각각, 계속해서 위 둘의 혼합(도 14c)의 시너지효과를 입증하고 있다. 이들 상황들 각각에서, 임의의 시약이 항-IHF와 결합된 경우, 관측된 상기 생물막 탈벌크화 및/또는 사멸 효과는 임의의 단일의 시약이 단독으로 사용된 경우에서 언급된 것 보다 더 컸었다. 주의: 생물막 높이(미크론 단위)는 각 이미지 아래에 나타내었다.
도 15는 순수한 토끼 혈청 또는 토끼 항-IHF 혈청으로 처리되거나(이미지들의 상부 열; 순수한 집쥐(rat) 혈청 또는 집쥐 항-HNS 혈청으로 처리되거나(이미지들의 중간 열); 또는 순수한 생쥐(mouse) 혈청 또는 생쥐 항-DPS 혈청으로 처리된(이미지들의 하부 열) 대장균의 비교이다. 항-IHF 혈청으로의 처리 이후의 생물량에서 뚜렷한 감소를 주목하여야 하나, 그러나 항-HNS 또는 항-PBS 혈청들 중 어느 것도 본 명세서에서 사용된 바와 같은 생물량에서의 감소를 유발하지 않았다. 항-IHF로의 처리는 상기 생물막 높이에서 48.2%의 감소, 상기 생물막 평균 두께에서의 81%의 감소 및 상기 생물량에서의 64.5%의 감소의 결과를 가져왔다. 대조적으로 항-HNS 또는 항-DPS로의 처리는 각각 0.7% 및 4.2%의 명목상의 높이 감소, 각각 5.8% 및 6.4%의 평균 두께의 감소 및 각각 0.3% 및 -17.4%의 생물량의 감소의 결과를 가져왔다.
도 16은 숙주 유기체로부터 또는 생물막 내에서 조직화된 경우 박테리아로부터의 DNA의 상대적인 공간 분포(spatial distribution)을 입증하기 위한 현장혼성화(in situ hybridization)를 나타내고 있다. 각 환경에 있어서, DNA는 이들 흑백 이미지들의 전경 내에서 보다 밝고, 보다 하얀 부위들로서 나타난다. 숙주로부터의 DNA가 상부의 오른손 이미지 내에서 보다 진하게 표지화되어 상기 생물막의 외부주변 상에 보다 중하게 분포되고 있음을 입증하고 있는 반면에, 박테리아로부터의 DNA는 이 4-패널 조성의 왼손 이미지 내에서 보다 진하게 표지화되어 그에 의하여 상기 생물막의 내부 도달 이내의 보다 진한 분포를 입증하고 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 이 발명이 속하는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 제공된 모든 뉴클레오티드 시퀀스들은 5' 내지 3' 방향 내에 존재한다. 비록 본 명세서에서 기술된 것들과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법들, 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있기는 하나, 바람직한방법들, 장치들 및 물질들이 이하에서 기술된다. 본 명세서에서 언급된 모든 기술 공보들 및 특허 공보들은 그들 전체를 참조로서 본 명세서에서 인용된다. 선행의 발명의 덕분으로 본 발명이 이러한 기술을 선행한다는 자격이 없다는 것을 승인하는 것으로 이해되어야 할 것은 없다.
본 발명의 실시는, 달리 표시하지 않는 한, 조직배양(tissue culture), 면역학(immunology), 분자생물학(molecular biology), 미생물학(microbiology), 세포생물학(cell biology) 및 재조합 DNA(recombinant DNA)의 통상적인 기술들을 사용할 수 있으며, 이들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 속하는 것들이다. 하기의 문헌들, 예를 들면, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology을 참조하시오.
범위들을 포함하여 모든 숫자 지정들, 예를 들면, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량들은 적절하게는 1.0 또는 0.1의 증분(increments)으로 또는 달리 +/-15%, 또는 달리 10% 또는 달리 5% 또는 달리 2%의 변화로 (+) 또는 (-)로 변하는 근사값(approximations)들이다. 비록 항상 명쾌하게 언급되지는 않으나, 모든 숫자 지정들은 "약(about)"이라는 용어가 선행되어야 함은 이해되어야 한다. 또한, 비록 항상 명쾌하게 언급되지는 않으나, 본 명세서에서 기술되는 시약(reagents)들은 단순히 예시적인 것이며, 이러한 것들의 등가물들이 당해 기술분야에서 공지되었다는 점은 이해되어야 한다.
본 상세한 설명 및 특허청구범위들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"들에는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조들을 포함한다. 예를 들면, 용어 "폴리펩티드(a polypeptide)"에는 이들의 혼합물들을 포함하여 복수의 폴리펩티드들을 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)"은 조성물 및 방법이 언급된 구성요소들을 포함하고, 다른 것들을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 한정하는 데 사용되는 경우, "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 목적하는 용도를 위한 조합에 대하여 임의의 필수적인 중요한 다른 요소들을 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 구성요소들로 필수적으로 이루어지는 조성물은 단리 및 정제방법으로부터의 흔적량의 오염물(trace contaminants) 및 인산염 완충 염수(phosphate buffered saline), 보존제(preservatives) 등과 같은 약제학적으로 수용가능한 담체(carriers)들을 배제하지 않는다. "이루어지는(consisting of)"은 다른 성분의 흔적량 요소들 및 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계들 이상을 배제하는 것을 의미한다. 이들 전개 용어(transition terms)들 각각에 의해 한정된 구체예들은 본 발명의 관점 내에 속하는 것이다.
"생물막"은 미생물이 분비하거나 및/또는 방출하는 DNA 등과 같은 중합체들과 함께 유기물 또는 무기물일 수 있는 구조물(structure)의 표면에 때로 부착되는 미생물들의 조직화된 생활군(community)을 의미한다. 상기 생물막은 미생물 제제(microbiotics agents) 및 항균제에 대하여 고도로 내성이다. 이들은 치은조직(gingival tissue), 치아 및 복원물(teeth and restorations)에 생존하여 또한 치주 치태 질환(periodontal plaque disease)으로도 알려진 우식증(caries) 및 치주 질환(periodontal disease)의 원인이 된다. 이들은 또한 만성 중이 감염의 원인이 된다. 생물막은 또한 치아 임플란트(dental implants), 스텐트(stents), 카테터 라인(catheter lines) 및 콘택트렌즈(contact lenses)의 표면 상에 형성될 수 있다. 이들은 심박조절기(pacemakers), 심장판막치환체(heart valve replacements), 인공관절(artificial joints) 및 다른 외과적 임플란트(surgical implants) 상에서 성장한다. 질병관리본부(Centers for Disease Control)는 65% 이상의 병원내감염(nosocomial(hospital-acquired) infections)이 생물막에 의해 야기되는 것으로 추정하고 있다. 이들은 불완전 면역시스템(hobbled immune systems)을 갖는 사람들에서 만성 질감염(chronic vaginal infections)을 야기하고 그리고 생명을 위협하는 전신성 감염으로 이어진다. 생물막은 또한 여러 질병들에 관여된다. 예를 들면, 낭포성 섬유증 환자는 종종 항생제 저항 생물막의 결과를 가져오는 슈도모나스 감염(Pseudomonas infections)을 갖는다.
용어 "저해하는(inhibiting), 경쟁하는(competing) 또는 적정하는(titrating)"은 미생물 생물막의 구성성분인 DNA/단백질 매트릭스(예를 들면 도 1에 나타낸 바와 같은)의 형성에서의 감소를 의미한다.
"DNABII 폴리펩티드 또는 단백질(DNABII polypeptide or protein)"은 DNA-결합 도메인(DNA-binding domains)으로 이루어지며 따라서 미생물 DNA에 대하여 특이적이거나 또는 일반적인 친화성(affinity)을 갖는 DNA 결합 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 하나의 관점에 있어서, 이들은 작은 홈(minor grove) 내의 DNA를 결합한다. DNABII 단백질의 비-제한적인 예들은 삽입숙주인자(IHF) 단백질 및 대장균 균주 U93(HU)으로부터의 히스톤유사 단백질들이다. 상기 생물막과 연관될 수 있는 다른 DNA 결합 단백질에는 DPS(젠뱅크 접근 번호: CAA49169), H-NS(젠뱅크 접근 번호: CAA47740), Hfq(젠뱅크 접근 번호: ACE63256), CbpA(젠뱅크 접근 번호: BAA03950) 및 CbpB(젠뱅크 접근 번호: NP_418813)들이 포함된다.
"IHF" 단백질의 "삽입숙주인자"는 박테리오파지(bacteriophages)에 의하여 이들의 DNA를 상기 숙주 박테리아 내로 삽입하는 데 사용되는 박테리아성 단백질이다. 이들은 또한 세포외 미생물 DNA를 결합한다. 대장균 내에서 상기 IHF 단백질 서브유닛(subunits)을 인코딩하는 유전자들은 himA 유전자(젠뱅크 접근 번호: POA6X7.1) 및 himD 유전자(POA6Y1.1)들이다. 이들 유전자들에 대한 상동체(homologs)들이 다른 유기체들에서 발견되었으며, 다른 유기체들로부터의 이들 유전자들에 대응하는 펩티드들은 표 10에서 찾을 수 있다.
"HMGB1"은 DNA에 결합하고 그리고 DNA의 작은 홈(minor groove)을 왜곡(distort)시키는 것을 보고된 고이동기상자(high mobility group box ; HMGB)이며, 간섭제의 한 예이다. 재조합 또는 단리된 단백질 및 폴리펩티드는 아트젠글로벌(Atgenglobal), 프로스펙바이오(ProSpecBio), 프로테인 원 앤드 애브노바(Protein 1 and Abnova)로부터 상용적으로 획득가능하다.
"HU" 또는 "대장균 균주 U93으로부터의 히스톤유사 단백질"은 전형적으로 대장균과 연관되는 헤테로이량체성 단백질(heterodimeric proteins)의 클래스(class)를 의미한다. HU 단백질은 DNA 접합들에 결합하는 것으로 알려져 있다. 연관된단백질들이 다른 미생물들로부터 단리되었다. 대장균 HU의 완전 아미노산 시퀀스(complete amino acid sequence)는 문헌 Laine et al. (1980) Eur. J. Biochem. 103(3):447-481에 의해 보고되었다. 상기 HU 단백질에 대한 항체는 애브캠(Abcam)으로부터 상용적으로 획득가능하다. 대장균 내의 HU 단백질 서브유닛들을 인코딩하는 유전자들은 각각 시퀀스 동정 번호 29 및 30에 대응하는 hupA 및 hupB 들이다. 이들 유전자들에 대한 상동체들은 다른 유기체들 내에서 발견되었으며, 다른 유기체들로부터의 이들 유전자들에 대응하는 펩티드들은 표 10에서 찾을 수 있다.
용어 "표면 항원(surface antigens)" 또는 "표면 단백질(surface proteins)"은 박테리아 세포 등과 같은 세포의 표면 상의 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 표면 항원들의 예들로는 OMP P5(젠뱅크 접근 번호: YP_004139079.1), OMP P2(젠뱅크 접근 번호: ZZX87199.1), OMP P26(젠뱅크 접근 번호: YP_665091.1), rsPilA 또는 재조합 가용성 PilA(recombinant soluble PilA ; 젠뱅크 접근 번호: EFU96734.1) 및 IV형 필린(Type IV Pilin ; 젠뱅크 접근 번호: YP_003864351.1)등과 같은 외부막 단백질(Outermembrane proteins)들이 있다.
용어 "해모필루스 인플루엔자에"는 예를 들면 귀의 감염(ear infections), 눈의 감염 및 부비동염 등과 같은 많은 서로 다른 감염들을 야기할 수 있는 병원성 박테리아를 의미한다. 해모필루스 인플루엔자에의 많은 서로 다른 균주들이 단리되었으며, IhfA 유전자 또는 단백질을 갖는다. 해모필루스 인플루엔자에의 서로 다른 균주들의 일부 비-제한적인 예들에는 Rd KW20, 86-028NP, R2866, PittGG, PittEE, R2846 및 2019들이 포함된다.
"미생물 DNA(microbial DNA)"는 생물막을 생성하는 미생물로부터의 단일가닥 또는 이중가닥 DNA를 의미한다.
생물막을 "저해하는(inhibiting), 예방하는(preventing) 또는 파괴하는(breaking down)"은 생물막의 구조에서의 예방적 또는 치료적인 감소를 의미한다. 생물막을 파괴하는 또는 감소하는 예가 도 5에 나타나 있다.
"간섭제"는 미생물 DNA에 대하여 IHF 등과 같은 DNABII 폴리펩티드를 경쟁하거나, 저해하거나, 예방하거나, 적정하는 또는 미생물의 생물막을 파괴하는 하나 또는 그 이상의 시약을 의미한다. 이는 화학적 또는 생물학적 분자의 하나 또는 그 이상이 될 수 있다. 예를 들면, IHF는 DNA 함유 4방 접합 함유 DNA, 시스-플라티늄 부가물(cis-platinum adducts), DNA 루프(DNA loop) 또는 염기 벌지(base bulges) 등과 같이 DNA 구조를 특이적으로 결합하거나, 굽히거나 또는 왜곡시킬 수 있다. 이러한 시약들의 예들에는, 제한 없이, (1) IHF의 DNA-결합 활성을 저해하는 소분자(small molecules), (2) DNA 결합에서 IHF와 경쟁하는 폴리아민(polyamines) 및 스페르민(spermine) 등과 같은 소분자, (3) DNA 결합에서 IHF와 경쟁하는 IHF의 펩티드 단편 등과 같은 폴리펩티드, (4) IHF에로 지향되는 그의 항체 또는 단편, 또는 (5) IHF-결합에서 경쟁하는 굽혀지거나 또는 왜곡된 DNA 구조를 포함하는 4방 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드 또는 다른 형태의 폴리뉴클레오티드들이 포함된다. "핵산에의 IHF의 결합을 저해하는 소분자(small molecule that inhibits the binding of an IHF to a nucleic acid)"는 상기 (1) 또는 (2)를 의미하며 작은 홈 내의 DNA를 결합하는 것들, 즉 작은 홈 결합 분자를 포함한다. "4방 폴리뉴클레오티드(four-way polynucleotide)"는 홀리데이 접합으로도 알려진 DNA의 4개의 가닥들 사이의 4방 접합을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"굽혀진 폴리뉴클레오티드(bent polynucleotide)"는 다른 가닥과 쌍(pair)을 이루지 않는 하나의 가닥 상의 작은 루프(small loop)를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 루프는 1 내지 20개의 염기 길이, 또는 달리 2 내지 약 15개의 염기 길이, 또는 달리 약 3 내지 약 12개의 염기 길이, 또는 달리 약 4 내지 약 10개의 염기 길이이거나, 또는 달리 약 4, 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개의 염기들을 갖는다.
"DNA 결합에서 IHF와 경쟁하는 폴리펩티드"는 결합하거나 굽혀지거나 또는 왜곡된 DNA 구조들에서 IHF와 경쟁하나 그러나 DNA를 갖는 생물막을 형성하지는 않는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 예들에는, 제한 없이, 상기 IHF의 하나 또는 그 이상의 DNA 결합 도메인들을 포함하는 IHF의 단편 또는 그의 생물학적 등가물들이 포함된다. DNA 결합 도메인들은 도 6에 나타내었다.
진단 또는 치료(treatment)의 "대상체(subject)"는 세포 또는 포유동물이나 인간 등과 같은 동물이다. 진단 또는 치료에 적용되는 비-인간(non-human) 동물들 그리고 감염에 적용되는 동물 모델들은, 예를 들면, 유인원(simians), 집쥐, 생쥐 등과 같은 쥣과의 동물(murines), 친칠라, 개 등과 같은 갯과의 동물(canine), 토끼 등과 같은 토끼과의 동물(leporids), 가금류, 스포츠 동물 및 애완동물들이다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"들은 상호호환적으로 사용되며, 이들의 가장 넓은 의미에서 2 또는 그 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체(amino acid analogs) 또는 펩티도미메틱(peptidomimetics)의 화합물을 의미한다. 상기 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 서브유닛은 다른 결합, 예를 들면, 에스테르, 에테르 등의 결합에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함하여야 하며, 단백질의 시퀀스 또는 펩티드의 시퀀스 내에 포함될 수 있는 아미노산들의 최대 갯수에 대한 제한은 가해지지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 글리신(glycine) 및 D형 및 L형의 광학이성질체들, 아미노산 유사체들 및 펩티도미메틱을 포함하여 천연 및/또는 비천연의 또는 합성의 아미노산들을 의미한다.
"C-말단 폴리펩티드(C-terminal polypeptide")는 적어도 10개, 또는 달리 적어도 15개, 또는 달리 적어도 20개, 또는 달리 적어도 25개의 C-말단 아미노산들 또는 달리 폴리펩티드의 절반을 의미한다. 다른 관점에 있어서, 90개의 아미노산들을 포함하는 폴리펩티드에 대하여는, 상기 C-말단 폴리펩티드는 46 내지 90개의 아미노산을 포함할 수 있다. 하나의 관점에 있어서, 상기 용어는 카르복시 말단(carboxy terminus)로부터의 C-말단 20개의 아미노산들을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"들은 상호호환적으로 사용되며, 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 또는 이들의 유사체들 중의 하나인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태(polymeric form)을 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 또는 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기의 것들은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 실시예들이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들면, 탐침(probe), 프라이머(primer), EST 또는 SAGE 태그), 엑손(exons), 인트론(introns), 메신저 RNA(mRNA), 전이 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보자임(ribozymes), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드(branched polynucleotides), 플라스미드(plasmids), 벡터(vectors), 임의의 시퀀스의 단리된 DNA, 임의의 시퀀스의 단리된 RNA, 핵산 탐침(nucleic acid probes) 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드(methylated nucleotides) 및 뉴클레오티드 유사체 등과 같은 변성된 뉴클레오티드(modified nucleotides)를 포함할 수 있다. 만일 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변성은 상기 폴리뉴클레오티드의 조립(assembly) 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 시퀀스는 비-뉴클레오티드 성분(non-nucleotide components)에 의해 중단(interrupt)될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 성분(labeling component)와의 공액화(conjugation) 등과 같이 중합 이후에 더욱 변형될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중가닥 분자 및 단일가닥 분자들 둘 다를 의미한다. 달리 특정되건나 또는 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구체예는 이중가닥 형태 및 상기 이중가닥 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 또는 예견된 2개의 상보적 단일가닥 형태(complementary single-stranded forms)들 모두를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 4개의 뉴클레오티드 염기들: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 상기 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 티민 대신 우라실의 특정의 시퀀스로 이루어진다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 시퀀스"는 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳적 표현(alphabetical representation)이다. 이 알파벳적 표현은 중앙처리장치를 갖는 컴퓨터 내에 입력될 수 있고 그리고 기능유전체학(functional genomics) 및 상동성 검색 등과 같은 생물정보학(bioinformatics)에 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA 등과 같은 핵산에 대하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "단리된" 또는 "재조합"은 각각 폴리펩티드와 마찬가지로 거대분자(macromolecule)의 천연의 공급원(natural source) 내에 존재하는 다른 DNA들 및 RNA들로부터 분리된 분자들을 의미한다. 용어 "단리되거나 또는 재조합 핵산(isolated or recombinant nucleic acid)"은 단편들로서 천연적으로 발생하지 않고 그리고 천연의 상태(natural state)에서 발견되지 않는 핵산 단편들을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 본 명세서에서 다른 세포내 단백질로부터 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 단백질을 의미하는 것으로 사용되며, 정제된 그리고 재조합 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 것을 의미한다. 다른 구체예들에 있어서, 용어 "단리되거나 또는 재조합"은 구성성분(constituents), 세포 및 다른, 여기에서는 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편들로부터 분리된 것을 의미하며, 이들은 통상적으로는 천연적으로 연관된다. 예를 들면, 단리된 세포는 다른 표현형(phenotype) 또는 유전자형(genotype)의 조직 또는 세포로부터 분리되는 세포이다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 대개는 그의 원래(native)의 또는 천연의 환경, 예를 들면, 염색체 상에서 대체로 연관되는 3' 및 5' 인접 뉴클레오티드(contiguous nucleotides)로부터 분리된다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 분명한 바와 같이, 비천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편들은 이를 그의 천연적으로 발생하는 상대(counterpart)와 구별하기 위하여 "단리(isolation)"를 요구하지 않는다.달리 명백한 언급이 없거나 달리 의도되지 않는 한 본 발명이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체에 연관되는 경우, 이러한 것들의 등가물 또는 생물학적 등가물(biologically equivalents)들이 본 발명의 관점 내에 속하는 것으로 의도되는 것으로 고려된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "그의 생물학적 등가물(biological equivalent thereof)"은 최소의 상동성을 갖는 한편으로 여전히 원하는 구조 또는 기능성을 유지하는 것들을 의미하는 것으로 기준 단백질, 항체, 단편, 폴리펩티드 또는 핵산에 대하여 언급하는 경우, "그의 등가물"과 동의어가 되는 것을 의미한다. 본 명세서에서 달리 특별히 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 언급된 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 그의 등가물들을 포함하는 것으로 고려된다. 하나의 관점에 있어서, 등가의 폴리뉴클레오티드는 엄중 조건들 하에서 상기 기술된 방법들에서 사용되기 위하여 본 명세서에서 기술된 바와 같은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 관점에 있어서, 등가의 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드는 기준 항체 또는 항원 결합 단편에 적어도 70%, 또는 달리 적어도 75%, 또는 달리 적어도 80%, 또는 달리 적어도 85%, 또는 달리 적어도 90%, 또는 달리 적어도 95% 친화성 또는 보다 높은 친화성으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드이다. 다른 관점에 있어서, 그의 등가물은 경쟁적 효소면역분석법(competitive ELISA assay) 하에서 그의 항원에 항체 또는 항원 결합 단편의 결합과 경쟁한다. 다른 관점에 있어서, 등가물은 적어도 약 80%의 상동성(homology) 또는 동질성(identity) 및 달리, 적어도 약 85%, 또는 달리 적어도 약 90%, 또는 달리 적어도 약 95%, 또는 달리 98% 상동성 또는 동질성을 의미하고 그리고 기준 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산에 대하여 실질적으로 등가의 생물학적 활성을 나타낸다. 생물학적으로 등가의 폴리펩티드의 예들이 표 9에 제공되었으며, 이들은 바람직한 아미노산 시퀀스에 대한 보존적 아미노산 치환체(conservative amino acid substitutions)들로 동정된다.
다른 시퀀스에 대하여 "시퀀스 동질성"의 특정의 백분율(예를 들면, 80%, 85%, 90% 또는 95%)을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 부위(polynucleotide region)(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 부위)은, 정렬되는 경우, 염기들(또는 아미노산들)의 백분율이 상기 2개의 시퀀스들의 비교에서 동일하다는 것을 의미한다. 정렬(alignment) 및 상동성 백분율 또는 시퀀스 동질성은 당해 기술분야에서 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, 문헌 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에서 기술된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 매개변수(default parameters)들이 정렬을 위하여 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수들을 사용하는 BLAST이다. 특히 바람직한 프로그램들은 하기의 디폴트 매개변수들을 사용하는 BLASTN 및 BLASTP들이다: 유전자코드(Genetic code) = 표준(standard); 필터(filter) = 없음(none); 가닥(strand) = 둘 다(both); 컷오프(cutoff) = 60; 기대치(expect) = 10; 매트릭스(Matrix) = BLOSUM62; 상세(Descriptions) = 50시퀀스(sequences); 소트(sort by) = 하이스코어(HIGH SCORE); 데이터베이스(Databases) = 비-초과의(non-redundant), GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램들의 상세한 설명들은 하기의 인터넷 주소들에서 발견될 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/BLAST. 시퀀스 동질성 및 동질성 백분율은 clustalW(웹주소: llalign.genome.jp/, 최종 접근 2011년 3월 7일) 내로 삽입시키는 것에 의해 결정되었다.
"상동성" 또는 "동질성" 또는 "유사성(similarity)"는 2개의 펩티드들 사이 또는 2개의 핵산 분자들 사이의 시퀀스 유사성을 의미한다. 상동성은 비교를 목적으로 정렬될 수 있는 각 시퀀스 내의 위치를 비교하는 것에 의해 결정될 수 있다. 비교된 시퀀스 내의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산으로 차지된 경우, 상기 분자들은 그 위치에서 상동적이다. 시퀀스들 사이의 상동성의 정도는 매칭(matching)되는 수 또는 상기 시퀀스들에 의해 공유되는 상동적인 위치들의 함수이다. "연관되지 않은(unrelated)" 또는 "비-상동적인(non-homologous)" 시퀀스는 본 발명의 상기 시퀀스들 중의 하나와 40% 이하의 동질성, 또는 달리 25% 이하의 동질성을 공유한다.
"상동성" 또는 "동질성" 또는 "유사성"은 또한 엄중 조건들 하에서 혼성화되는 2개의 핵산 분자들을 의미할 수 있다.
"혼성화"는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드가 반응하여 상기 뉴클레오티드 잔기들의 염기들 사이의 수소 결합을 통하여 안정와되는 복힙체를 형성하는 반응을 의미한다. 상기 수소결합은 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing), 훅스타인 결합(Hoogstein binding) 또는 임의의 다른 시퀀스-특이적인 방법(sequence-specific manner)에 의하여 일어날 수 있다. 상기 복합체는 2중조직(duplex structure)을 형성하는 2개의 가닥들, 다중-가닥 복합체(multi-stranded complex)를 형성하는 3 또는 그 이상의 가닥들, 하나의 자가혼성화 가닥(self hybridizing strand) 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 중합효소연쇄반응(PCR reaction)의 개시 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소개열(enzymatic cleavage) 등과 같은 보다 광범위한 공정에서의 하나의 단계를 구성할 수 있다.
엄중 혼성화 조건(stringent hybridization conditions)의 예들에는 약 25℃ 내지 약 37℃의 배양 온도; 약 6배량 SSC(6x SSC) 내지 약 10배량 SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드(foramide) 농도; 및 약 4배량 SSC 내지 약 8배량 SSC의 세척 용액;들이 포함된다. 중등 혼성화 조건(moderate hybridization conditions)의 예들에는 약 40℃ 내지 약 50℃의 배양 온도; 약 9배량 SSC 내지 약 2배량 SSC의 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5배량 SSC 내지 약 2배량의 세척 용액;들이 포함된다. 고엄중조건의 예들에는 약 55℃ 내지 약 68℃의 배양 온도; 약 1배량 SSC 내지 약 0.1배량 SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1배량 SSC 내지 약 0.1배량 SSC의 세척 용액;들이 포함된다. 일반적으로, 혼성화 배양시간은 1, 2 또는 그 이상의 세척단계들을 수반하며 5분 내지 24시간이고, 세척 배양시간(wash incubation times)은 약 1분, 2분 또는 15분이다. SSC는 0.15몰(M) NaCl과 15밀리몰(mM) 시트르산염 완충제이다. 다른 완충제 시스템을 사용하는 SSC의 등가물들이 사용될 수 있음은 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "발현(expression)"은 그에 의하여 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 번역(translate)되는 공정 및/또는 그에 의하여 번역된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 공정을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드가 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 유도된 경우, 발현은 진핵세포 내에서의 mRNA의 스플라이싱(splicing ; 이어맞추기)을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 적용되는 바와 같은 용어 "인코딩(encode)"은 그의 원래의 상태에서 또는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 알려진 방법에 의하여 조작되는 경우에서 폴리뉴클레오티드가 전사(transcribed)되거나 및/또는 번역되어 폴리펩티드 및/또는 그의 단편을 위한 mRNA를 생성할 수 있는 경우, 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 "인코딩"한다고 말할 수 있다는 것을 의미한다. 항감작 가닥(antisense strand)은 이러한 핵산의 보체이며, 상기 인코딩 시퀀스는 그들로부터 유추될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는(treating)", "치료(treatment)" 등은 본 명세서에서는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 그 효과는 그의 장애(disorder), 징후(sign) 또는 증후군(symptom)을 전체적으로 또는 부분적으로 방지하는 관점에서 예방적이 될 수 있고, 및/또는 장애 및/또는 장애에 기여하는 부작용(adverse effect)에 대한 부분적이거나 또는 완전한 치료(cure)의 관점에서 치료적이 될 수 있다.
방지하는 것은 장애 또는 영향(effect)에 취약한 시스템 또는 대상체 내에서 시험관 내 또는 생체 내에서의 장애 또는 영향을 방지하는 것을 의미한다. 이러한 것들의 예는 생물막을 생성하는 것으로 알려진 미생물로 감염된 시스템 내의 생물막의 형성을 방지하는 것이다.
"조성물(composition)"은 활성제(active agent)와 부형제 등과 같은 비활성(예를 들면, 검출가능한 시약 또는 표지) 또는 활성의 다른 화합물 또는 조성물의 조합을 의미하는 것으로 의도된다.
"약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 활성제와 시험관 내 또는 생체 내 또는 생체 외(ex vivo)에서 진단 또는 치료용으로 적절한 조성물을 만드는 비활성 또는 활성의 담체의 조합을 포함하는 것으로 의도된다.
"약제학적으로 수용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carriers)"는 본 발명의 상기 조성물에서 사용될 수 있는 임의의 희석제(diluents), 첨가제(excipients) 또는 담체들을 의미한다. 약제학적으로 수용가능한 담체들에는 이온교환제(ion exchangers), 알루미나(alumina), 스테아린산알루미늄(aluminum stearate), 레시틴(lecithin), 인간 혈청 알부민(human serum albumin) 등과 같은 혈청 단백질(serum proteins), 인산염 등과 같은 완충제 물질(buffer substances), 글리신, 소르빈산(sorbic acid), 소르빈산 나트륨(potassium sorbate), 포화 식물성 지방산(saturated vegetable fatty acids)의 부분 글리세리드 혼합물( partial glyceride mixtures), 물, 프로타민황산염(protamine sulfate), 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 인산수소칼륨(potassium hydrogen phosphate), 염화나트륨(sodium chloride), 아연염(zinc salts) 등과 같은 염(salts) 및 전해질(eletrolytes), 콜로이드성 실리카(colloidal silica), 마그네슘트리실리케이트(magnesium trisilicate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 셀룰로오스 기반 물질(cellulose based substances), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 소듐카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 왁스(waxes), 폴리에틸렌-폴리프로필렌-블록공중합체(polyethylene-polyoxypropylene-block polymers), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 및 양모지(wool fat) 들이 포함된다. 적절한 약제학적 담체들은 이 분야에서의 표준 문헌인 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company에서 기술되어 있다. 이들은 바람직하게는 목적하는 투여의 형태, 즉, 경구 정제(oral tablets), 캡슐(capsules), 엘릭서(elixirs), 시럽(syrups) 등에 따라 그리고 통상의 약제학적 실무에 일치하여 선택된다.
"생물학적 활성제(biologically active agent)" 또는 본 발명의 활성제는 하나 또는 그 이상의 단리되거나 재조합 폴리펩티드, 단리되거나 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 단리된 숙주세포 또는 항체와 마찬가지로 이들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물이다.
"투여(administration)"는 치료의 과정을 통하여 연속적으로 또는 간헐적으로 단위투여량(dose)에서 영향을 줄 수 있다. 투여량의 가장 효과적인 수단 및 용법(dosage)을 결정하는 방법은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지된 것이고, 그리고 치료(theraphy)를 위하여 사용된 조성물, 치료의 목적, 치료되는 표적 세포 및 치료되는 대상체에 따라 변할 수 있다. 치료하는 의사에 의해 선택되는 투여량 수준 및 패턴에 따라 단일 또는 다중 투여(multiple administrations)들이 실행될 수 있다. 적절한 투여량 제형(dosage formulations) 및 시약을 투여하는 방법들은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 투여의 경로 또한 결정될 수 있으며, 투여의 가장 효과적인 경로를 결정하는 방법은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지되어 있으며, 또한 치료에 사용되는 조성물, 치료의 목적, 치료되는 대상체의 건강 상태 또는 질병 단계(disease stage) 및 표적 세포 또는 조직에 따라 변할 수 있다. 투여의 경로의 비-제한적인 예들에는 경구 투여(oral administration), 경비투여(nasal administration), 주사(injection) 및 국소적용(topical application)들이 포함된다.
본 발명의 시약은 임의의 적절한 투여 경로에 의하여 치료를 위하여 투여될 수 있다. 바람직한 경로가 수령인(recipient)의 상태(condition) 및 연령 그리고 치료되는 질병에 따라 변할 수 있음은 또한 이해될 수 있는 것이다.
용어 "유효량(effective amount)"은 원하는 효과를 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 치료 및 예방용의 맥락에 있어서는, 상기 유효량은 문제가 되는 상태의 형태 및 중증도(severity) 및 종합적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약제학적 조성물에 대한 내성(tolerance) 등과 같은 개개 대상자의 특성들에 의존적일 수 있다. 면역원성 조성물(immunogenic composition)의 문맥에 있어서는, 일부 구체예들에 있어서, 상기 유효량은 병원체(pathogen)에 대한 보호반응(protective response)에서의 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 다른 구체예들에 있어서, 면역원성 조성물의 유효량은 항원에 대한 항체 생성의 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 유효량은 필요로 하는 대상체에 대하여 수동면역을 부여하는 데 요구되는 양이다. 면역원성 조성물에 대하여는, 일부 구체예들에 있어서, 상기 유효량은 앞서 기술된 인자(factors)들에 더하여 목적하는 용도, 특정의 항원성 화합물의 면역원성의 정도 및 대상체의 면역시스템의 건강/반응성(responsiveness)에 의존적일 수 있다. 숙련된 기술자(skilled artisan)는 이들 및 다른 인자들에 따라 적절한 양을 결정할 수 있을 것이다.
시험관 내 적용의 경우에 있어서, 일부 구체예들에 있어서, 상기 유효량은 문제의 적용의 크기 및 속성(nature)에 의존적일 수 있다. 이는 또한 용도에 있어서의 시험관 내 표적의 속성 및 민감도(sensitivity) 및 방법에 의존적일 수 있다. 숙련된 기술자는 이들 및 다른 고려들에 기초하여 상기 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 상기 유효량은 상기 구체예에 따른 조성물의 하나 또는 그 이상의 투여들을 포함할 수 있다.
용어 "공액화된 부분(conjugated moiety)"은 키메라 폴리펩티드(chimeric polypeptide)와 공유결합(covalent bond)을 형성하는 것에 의하여 단리된 키메라 폴리펩티드에 첨가될 수 있는 부분을 의미한다. 상기 부분은 상기 키메라 폴리펩티드의 잔기와 직접적으로 결합할 수 있거나 또는 상기 키메라 폴리펩티드의 잔기와 순차로 공유결합을 형성하는 연결체(linker)와 공유결합을 형성할 수 있다.
"펩티드 공액(peptide conjugate)"은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드와 다른 화학물질(chemicals) 또는 생물학적 화합물(biological compound)의 공유적 또는 비공유적 결합에 의한 화합(association)을 의미한다. 비-제한적인 예에 있어서, 폴리펩티드의 화합물(chemical compound)의 "공액"은 그의 의도된 목적에 대하여 상기 폴리펩티드의 개선된 안정성 또는 효능(efficacy)의 결과를 가져온다. 하나의 구체예에 있어서, 펩티드는 담체와 공액화되며, 여기에서 상기 담체는 리포좀(liposome), 미셀(micelle) 또는 약제학적으로 수용가능한 중합체이다.
"리포좀"은 동심의 지질 이중층(concentric lipid bilayers)으로 이루어지는 미세한 소포(microscopic vesicles)이다. 구조적으로, 리포좀은 수 백 옹스트롬 내지 1밀리미터의 분율(fractions)의 규모를 가지며, 크기 및 형상에 있어 긴 튜브 내지 구에 걸친다. 소포 형성 지질은 외층의 지질 조성을 제공하는 최종 착체의 특정의 정도의 유동성(fluidity) 또는 강성율(rigidity)을 달성하도록 선택된다. 이들은 중성(콜레스테롤) 또는 양극성(bipolar)이며, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine ; PC), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine ; PE), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol ; PI) 및 스핑고미엘린(sphingomyelin ; SM) 등과 같은 인지질(phospholipids) 및 포화되거나 또는 하나 또는 그 이상의 이중의 C=C 결합들을 가지며 14 내지 22개의 범위의 탄화수소쇄 길이(hydrocarbon chain length)를 갖는 디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine ; DOPE)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 형태의 양극성 지질들이 포함된다. 단독 또는 다른 지질 성분들과 함께 안정한 리포좀을 생성할 수 있는 지질의 예들로는 수소화 대두 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine ; HSPC) 등과 같은 인지질(phospholipids), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴(lysolecithin), 라이소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanol-amine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린(cephalin), 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티딘산(phosphatidic acid), 세레브로사이드(cerebrosides), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethan-olamine ; DSPE), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine ; DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine ; DPPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine ; POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine ; POPE) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(dioleoylphosphatidylethanolamine 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate ; DOPE-mal) 들이 있다. 리포좀 내로 포함될 수 있는 부가의 비-인함유지질(non-phosphorous containing lipids)에는 스테아릴아민(stearylamine), 도데실아민(dodecylamine), 헥사데실아민(hexadecylamine), 이소프로필미리스테이트(isopropyl myristate), 트리에탄올아민-라우릴설페이트(triethanolamine-lauryl sulfate), 알킬-아릴설페이트(alkyl-aryl sulfate), 아세틸팔미테이트(acetyl palmitate), 글리세롤리시놀레이트(glycerol ricinoleate), 헥사데실스테아레이트(hexadecyl stereate), 양쪽성 아크릴 중합체(amphoteric acrylic polymers), 폴리에틸옥실화 지방산 아미드(polyethyloxylated fatty acid amides) 및 앞서 언급한 양이온성 지질들(DDAB, DODAC, DMRIE, DMTAP, DOGS, DOTAP(DOTMA), DOSPA, DPTAP, DSTAP, DC-Chol) 들이 포함된다. 음으로 하전된 지질에는 소포를 형성할 수 있는 포스파티딘산(PA), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol ; DPPG), 디올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol ; DOPG) 및 디세틸포스페이트(dicetylphosphate) 들이 포함된다. 전형적으로, 리포좀은 그들의 전체 크기 및 층상구조(lamellar structure)의 속성에 기초하여 3가지의 범주(categories)로 나뉘어질 수 있다. 뉴욕 아카데미 사이언스 회의(New York Academy Sciences Meeting, "Liposomes and Their Use in Biology and Medicine," December 1977)에 의해 개발된 바와 같이, 상기 3가지의 분류들은 다층 소포(multi-lamellar vesicles ; MLVs), 작은 단층 소포(all uni-Iamellar vesicles ; SUVs) 및 큰 단층 소포(large unilamellar vesicles ; LUVs)들이다. 상기 생물학적 활성제는 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 투여하도록 캡슐화(encapulated)될 수 있다.
"미셀"은 액체 콜로이드(liquid colloid) 내에 분산된 계면활성제 분자들의 응집물(aggregate)이다. 수성 용액 내의 전형적인 미셀은 미셀 중심 내의 소수성 테일 부위(tail regions)을 차단하며, 주변의 용매와 접촉하는 친수성의 "헤드(head)" 부위를 갖는 응집물을 형성한다. 이러한 미셀의 형태는 정상 미셀(normal phase micelle ; 수중유 미셀(oil-in-water micelle))로 알려져 있다. 역미셀(inverse micelles)은 밖으로 연장되는 꼬리를 가지며 중심에서 헤드군들을 갖는다(유중수(water-in-oil micelle)). 미셀은 본 명세서에서 기술된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 또는 조성물을 표적 세포 또는 조직에의 효율적인 전달을 용이하게 하기 위하여 부착하는 데 사용될 수 있다.
구절 "약제학적으로 수용가능한 중합체(pharmaceutically acceptable polymer)"는 본 명세서에서 기술된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드에 공액될 수 있는 화합물의 군을 의미한다. 중합체의 폴리펩티드에로의 공액이 생체 내 및 시험관 내에서의 상기 폴리펩티드의 반감기(half-life)를 연장할 수 있음이 고려된다. 비-제한적인 예들에는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycols), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidones), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohols), 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylates), 당(sugars), 폴리올(polyols) 및 이들의 혼합물들이 포함된다. 상기 생물학적 활성제는 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 투여하기 위하여 약제학적으로 수용가능한 중합체에 공액화될 수 있다.
"유전자 전달 비히클(gene delivery vehicle)"은 삽입된 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 운반할 수 있는 임의의 분자로서 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예들로는 리포좀, 미셀, 천연의 중합체 및 합성 중합체들을 포함하여 생체적합성 중합체(biocompatible polymers); 지방단백질(lipoproteins); 폴리펩티드; 다당류(polysaccharides); 지질다당류(lipopolysaccharides); 인공 바이러스 밀봉체(artificial viral envelopes); 금속입자(metal particles); 및 바큘로바이러스(baculovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus), 박테리오파지, 코스미드(cosmid), 플라스미드(plasmid), 매개진균(fungal vectors) 등과 같은 박테리아 또는 바이러스 및 다양한 진핵 및 원핵 숙주들 내에서의 발현에 대하여 이미 기술된 당해 기술분야에서 전형적으로 사용되는 다른 재조합 비히클들이 있으며, 단순한 단백질 발현과 마찬가지로 유전자 치료를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 세포 또는 조직에로 전달될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유전자 전달(gene delivery)", "유전자 도입(gene transfer)" "형질도입(transducing)" 등은 도입을 위하여 사용된 방법과는 무관하게 외인성 폴리뉴클레오티드(exogenous polynucleotide ; 때로 "전이유전자(trans gene)"으로 언급됨)의 숙주 세포 내로의 도입을 언급하는 용어들이다. 이러한 방법에는 "노출된(naked)" 폴리뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하는 기술(전기천공법(electroporation), "유전자 총(gene gun)" 전달 및 폴리뉴클레오티드의 도입을 위하여 사용되는 여러 다른 기술들)과 마찬가지로 벡터-매개 유전자 도입(vector-mediated gene transfer ; 예를 들면, 바이러스 감염/형질주입(transfection) 또는 다양한 다른 단백질-기반 또는 지질-기반 유전자 전달 복합체에 의한) 등과 같은 다양한 공지의 기술들이 포함된다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 안정적으로 그리고 일시적으로 상기 숙주 세포 내에서 유지될 수 있다. 안정한 유지는 전형적으로 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 상기 숙주 세포와 양립할 수 있는 복제시발점(origin of replication)을 포함하거나 또는 염색체외 복제단위(extrachromosomal replicon ; 예를 들면, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아염색체(nuclear or mitochondrial chromosome) 등과 같은 상기 숙주 세포의 복제단위 내로 통합되는 것이 요구된다. 당해 기술분야에서 공지되고 그리고 본 명세서에서 기술된 바와 같이 다수의 벡터가 유전자들의 표유동물 세포들에로의 전달을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "eDNA"는 병원성 생물막에 대한 구성요소로서 발견된 세포외 DNA를 의미한다.
"플라스미드"는 독립적으로 염색체 DNA를 복제할 수 있는 염색체 DNA로부터 분리된 염색체외 DNA 분자이다. 많은 경우들에 있어서, 이는 원형 및 이중-가닥이다. 플라스미드는 미생물(microbes)의 개체군(population) 내에서의 수평적 유전자 전이에 대한 메카니즘(mechanism)을 제공하고 그리고 전형적으로 주어진 환경 상태 하에서 선택이익(selective advantage)을 제공한다. 플라스미드가 경쟁적 환경적 적소(competitive environmental niche) 내에서 천연적으로 발생하는 항생물질에 대한 저항성을 제공하는 유전자를 전달하거나 또는 달리 생성된 단백질이 유사한 환경 하에서 독소(toxins)로서 작용할 수 있다.
유전공학에서 사용되는 "플라스미드"는 "플라스미드 벡터(plasmid vectors)"로 불리운다. 많은 플라스미드들이 이러한 용도들을 위하여 상용적으로 획득가능하다. 대체되어야 할 유전자는 세포를 특정의 항생물질 및 여러 제한효소 자리(multiple cloning site ; MCS, 또는 폴리링커(polylinker))에 대하여 저항성으로 만드는 유전자를 함유하는 플라스미드의 사본(copies)들 내로 삽입되며, 이는 이 위치에서의 DNA 단편의 용이한 삽입을 허용하는 여러 개의 공통적으로 사용되는 제한부위(restriction sites)를 함유하는 짧은 부위이다. 플라스미드의 다른 주요 용도는 단백질을 대량으로 만드는 것이다. 이 경우에서, 연구자(본 발명자)들은 대상의 유전자를 보유하는 플라스미드를 함유하는 박테리아를 성장시키고 있다. 박테리아가 그의 항생물질 저항성을 부여하는 단백질을 생성하는 것처럼, 이는 또한 상기 삽입된 유전자로부터 대량의 단백질을 생성하도록 유도될 수 있다. 이는 유전자 또는 단백질의 대량 생산 및 계속해서 이를 코딩하는 저렴하고 용이한 방법이다.
"인공효모염색체(yeast artificial chromosome)" 또는 "YAC"는 큰 DNA 단편(100kb 보다 더 크고 그리고 3000kb 이상)을 복제(clone)하는데 사용된 벡터를 의미한다. 이는 인공적으로 구축된 염색체이고 그리고 효모 세포 내에서의 복제 및 보존에 필요한 텔로머의(telomeric), 동원체의(centromeric) 그리고 복제시발점 시퀀스(replication origin sequences)를 포함한다. 초기 원형 플라스미드를 사용하여 구축되면, 이들은 제한효소(restriction enzymes)를 사용하는 것에 의하여 선형화되고 그리고 계속해서 부착말단(cohesive ends)을 사용하는 것에 의하여 DNA 연결효소(DNA ligase)가 대상의 시퀀스 또는 유전자를 상기 선형의 분자 내에 부가할 수 있다. 효모 자체가 진핵세포이기 때문에 번역후 수정(posttranslational modifications)을 갖는 진핵 단백질 생성물(eukaryotic protein products)을 얻을 수 있는 바와 같이 YACs, YIps(효모통합플라스미드(yeast integrating plasmid)) 및 YEps(효모에피솜유사플라스미드(yeast episomal plasmid)) 등과 같은 효모발현벡터들이 극히 유용하나, 그러나, YACs는 키메라 효과를 생성하는 BACs 보다 덜 안정적인 것이라는 것이 발견되었다.
"바이러스 벡터(viral vector)"는 생체 내 생체 외 또는 시험관 내에서 숙주 세포 내로 전달되어야 할 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합적으로 생산된 바이러스 또는 바이러스 입자(viral particle)로 한정된다. 바이러스 벡터의 예들에는 레트로바이러스 벡터(retroviral vectors), 아데노바이러스 벡터(adenovirus vectors), 아데노-연관 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 알파바이러스(alphavirus vectors) 등이 포함된다. 전염성 담배모자이크 바이러스-기반 벡터(Infectious tobacco mosaic virus (TMV)-based vectors)가 단백질을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 담배잎에서 그리피트신(Griffithsin)을 발현하는 것으로 보고되었다(문헌 O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104). 셈리키 포레스트 바이러스-기반 벡터(Semliki Forest virus-based vectors) 및 신드비스 바이러스-기반 벡터(Sindbis virus-based vectors) 등과 같은 알파바이러스 벡터가 또한 유전자 치료 및 면역치료(immunotherapy)에 사용하기 위하여 개발되었다. 문헌 Schlesinger & Dubensky (1999) Curro Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827들을 참고하시오). 유전자 전이가 레트로바이러스 벡터에 의해 매개되는 경우의 관점에서, 벡터 구조체(vector construct)는 상기 레트로바이러스 게놈(genome) 또는 그의 일부와 치료학적 유전자(therapeutic gene)를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "레트로바이러스 매개 유전자 도입(retroviral mediated gene transfer)" 또는 "레트로바이러스 형질도입"은 동일한 의미를 수반하며, 바이러스가 세포로 진입하고 그리고 그의 게놈을 상기 숙주 세포 게놈 내로 통합하는 덕분으로 유전자 또는 핵산 시퀀스들이 안정적으로 상기 숙주 세포 내로 도입되는 공정을 의미한다. 상기 바이러스는 그의 감염의 정상 메카니즘을 통하여 상기 숙주 세포 내로 진입하거나 또는 다른 숙주 세포 표면 수용기(host cell surface receptor) 또는 리간드에 결합하여 상기 세포로 진입하도록 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 또는 바이러스-유사 진입 메카니즘을 통하여 외인성 핵산을 세포 내로 도입할 수 있는 바이러스 입자를 의미한다.
레트로바이러스는 RNA의 형태의 그들의 유전정보를 전달하나; 그러나, 일단 상기 바이러스가 세포를 감염시키면, 상기 RNA는 DNA 형태로 역전사되며(reverse-transcribed), 이는 감염된 세포의 게놈 DNA 내로 통합된다. 통합된 DNA 형태는 프로바이러스(provirus)라고 불리운다.
유전자 도입이 아데노바이러스(Ad) 또는 아데노-연관 바이러스(AAV) 등과 같은 DNA 바이러스 벡턱에 의해 매개되는 경우의 관점에 있어서, 벡터 구조물은 바이러스 게놈 또는 그의 일부 및 전이유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 아데노바이러스(Ads)들은 50개 이상의 혈청형(serotype)을 포함하는 상대적으로 바이러스의 잘 특정된, 균질한 군이다. 예를 들면, 국제특허출원 공개공보 제WO 95/27071호를 참조하시오. 아데노바이러스들은 상기 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 요구하지 않는다. 재조합 아데노바이러스 유도 벡터, 특히 야생형 바이러스의 재조합 및 생성의 잠재성을 감소시키는 재조합 아데노바이러스 유도 벡터들이 또한 구축되었다. 국제특허출원 공개공보 제WO 95/00655호 및 동 제WO 95/11984호들을 참조하시오. 야생형 아데노-연관 바이러스는 상기 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 높은 전염성 및 특이도(specificity)를 갖는다. 문헌 Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 및 Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996을 참조하시오.
프로모터(promoter) 및 그에 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결되는 제한효소 자리 둘 다를 포함하는 벡터는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 벡터는 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA를 전사할 수 있으며, 스트라타젠(Stratagene ; 미합중국 캘리포니아주 라졸라(La Jolla, CA) 소재) 및 프로메가 바이오텍(Promega Biotech ; 미합중국 위스콘신주 매디슨(Madison, WI) 소재). 발현 및/또는 시험관 내 전사를 최적화하기 위하여, 클론(clones)의 5' 및/또는 3' 미번역 부분(untranslated portions)을 제거하거나, 부가하거나 또는 변경하여 별도의, 잠재적인 부적절한 선택적 번역 개시 코돈(alternative translation initiation codons) 또는 전사나 번역의 수준에서 발현을 간섭하거나 또는 감소시킬 수 있는 다른 시퀀스들을 제거하는 것이 필요할 수 있다. 달리, 공통 리보솜 결합좌(consensus ribosome binding sites)들이 상기 개시 코돈의 5'에 직접적으로 삽입되어 발현을 향상시킬 수 있다.
유전자 전달 비히클은 또한 DNA/리포좀 복합체(DNA/liposome complexes), 미셀 및 표적화된 바이러스 단백질-DNA 복합체(targeted viral protein-DNA complexes)들을 포함한다. 표적하는 항체 또는 그의 단편을 또한 포함하는 리포좀은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 세포 또는 세포 개체군에로의 전달에 더하여, 단백질 형질감염의 비-제한적인 기술에 의하여 본 명세서에서 기술된 단백질의 세포 또는 세포 개체군에로의 직접적인 도입이 수행될 수 있으며, 달리 본 발명의 상기 단백질의 활성을 발현을 향상시키거나 및/또는 촉진할 수 있는 배양 조건들이 다른 비-제한적인 기술들이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체", "항체들" 및 "면역글로불린(immunoglobulin)"에는 전체 항체들 및 임의의 항원 결합 단편 또는 그의 단쇄(single chain)들이 포함된다. 따라서 용어 "항체"에는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드 함유 분자들이 포함된다. 용어 "항체", "항체들" 및 "면역글로불린"들에는 또한 임의의 아이소타입(isotype)의 면역글로불린, Fab, Fab', F(ab)2, Fv, scFv, dsFv, Fd 단편, dAb, VH, VL, VhH 및 V-NAR 도메인; 미니바디(minibodies), 다이어바디(diabodies), 트라이어바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies) 및 카파 바디(kappa bodies); 항체 단편으로부터 형성되고 그리고 하나 또는 그 이상의 단리된 다특이성 항체 단편(multispecific antibody fragments) 들을 포함하나 이들에 제한되지 않는 항원에의 특이적 결합을 보유하는 항체의 단편들이 포함된다. 이러한 것들의 예들에는 중쇄(heavy chain) 또는 경쇄(light chain)의 상보적 결정 영역(complementarity determining region ; CDR) 또는 그의 리간드 결합부(ligand binding portion), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역(variable region), 중쇄 또는 경쇄 불변 영역(constant region), 프레임워크(framework ; FR) 영역, 또는 이들의 임의의 부분, 결합 단백질(binding protein), 키메라 항체(chimeric antibodies), 인간화 항체(humanized antibodies), 단일-쇄 항체(single-chain antibodies) 및 항체의 항원-결합부분과 비-항체 단백질(non-antibody protein)을 포함하는 융합 단백질(fusion proteins)의 적어도 일부들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역글로불린 분자의 상기 중쇄 및 경쇄의 상기 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 항체(Abs)의 상기 불변 영역은 숙주 조직에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 단백질명 앞에 사용되는 경우에, 용어 "항-(anti-)", 예를 들면, 항-IHF, 항-HU, 항-OMP P5는 특정의 단백질에 결합하거나 및/또는 친화성을 갖는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 의미한다. 예를 들면, "항-IHF"는 IHF 단백질에 결합하는 항체를 의미한다. 상기 특이적 항체는 그것이 대향해서 발생되는 단백질 이외의 단백질에 친화성을 갖거나 결합할 수 있다. 예를 들면, 항-IHF는 상기 IHF 단백질에 대향하여 특이적으로 발생되는 한편으로 또한 시퀀스 상동성(sequence homology)를 통하거나 또는 구조 상동성(structure homology)를 통하여 연관되는 다른 단백질들과 결합할 수 있다.
상기 항체는 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한에서는 폴리클로날, 모노클로날, 다특이성(예를 들면, 양특이성 항체) 및 항체 단편들이 될 수 있다. 항체는 임의의 적절한 생물학적 공급원(biological source), 예를 들면, 집쥐, 생쥐, 양 및 개로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종의 항체 개체군으로부터 수득되는 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 각 모노클로날 항체가 상기 항원 상의 단일의 결정기(single determinant)에 대향하기 때문에 고도로 특이성이다. 상기 항체는, 예를 들면, 방사성 동위원소(radioisotope), 검출가능한 생성물을 생성하는 효소, 형광 단백질(fluorescent protein) 등으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 상기 항체는 특정의 결합쌍(binding pairs)의 구성원, 예를 들면, 비오틴(biotin ; 비오틴-아비딘 특이성 결합쌍(biotin-avidin specific binding pair)의 구성원) 등과 같은 다른 부분들에 더욱 공액화될 수 있다. 상기 항체는 또한 폴리스티렌 플레이트(polystyrene plates) 또는 비드(beads) 등을 포함하나 이들에 제한되지 않는 고체 지지체에 결합될 수 있다.
모노클로날 항체는 당해 기술분야에서 공지된 하이브리도마 기술(hybridoma techniques) 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 하이브리도마(hybridoma)는 항체-생성 림프구(antibody-producing lymphocyte)와 비-항체 생성 암세포(non-antibody producing cancer cell), 대개는 골수종(myeloma)과 림프종(lymphoma)의 융합으로부터 실험실에서 생성되는 세포이다. 하이브리도마는 증식하고 그리고 특정의 모노클로날 항체의 연속 사이플(continuous syple)을 생성한다. 항체를 생성하거나 또는 선택하는 대안의 기술에는 대상의 항원에 림프구를 시험관 내 노출 및 세포, 파지 또는 유사한 시스템 내의 항체 디스플레이 라이브러리(antibody display libraries)를 스크리닝하는 것이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체(human antibody)"는 인간 생식세포계 면역글로불린 시퀀스(human germline immunoglobulin sequences)으로부터 유도되는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체들을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 상기 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 시퀀스(예를 들면, 시험관 내 무작위(random) 또는 위치선택적 돌연변이(site-specific mutagenesis)에 의하거나 또는 생체 내 체세포 돌연변이(somatic mutation)에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 생쥐 등과 같은 다른 포유동물종들의 생식세포계로부터 유도된 CDR 시퀀스들이 인간 프레임워크 시퀀스들 상으로 분지된 항체들을 포함하는 것을 의미하는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 상기 단백질(예를 들면, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들면, CH1, CH2, CH3), 힌지(hinge), (VL, VH))의 실질적으로 모든 부분이 단지 소수의 시퀀스 변화(minor sequence changes) 및 변형(variations)들 만을 갖는 인간 내에서 실질적으로 비-면역원성(non-immunogenic)인 항체를 의미한다. 유사하게, 영장류(primate)(원숭이(monkey), 개코원숭이(baboon), 침팬지(chimpanzee) 등), 설치류(rodent)(생쥐(mouse), 집쥐(rat), 토끼(rabbit), 기니피그(guinea pig), 햄스터(hamster) 등) 및 다른 포유동물로 지정된 항체들은 이러한 종(species), 아속(sub-genus), 속(genus), 아과(sub-family), 과(family) 특이적 항체들을 나타낸다. 더욱이, 키메라항체는 상기한 것들의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 변화 및 변형은 선택적으로 그리고 바람직하게는 비-변성된 항체들에 비해 인간 또는 다른 종들에서의 면역원성을 보류하거나 또는 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와 구별된다. 인간 항체가 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비-인간 동물(non-human animal) 또는 원핵세포 또는 진핵세포에 의해 생성될 수 있음이 지적된다. 더욱이, 인간 항체가 단쇄 항체인 경우, 이는 자연의 인간 항체들에서는 발견되지 않는 연결체 펩티드(linker peptide)를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fv는 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기 등과 같은 연결체 펩티드를 포함할 수 있으며, 이는 상기 중쇄의 가변 영역과 상기 경쇄의 가변 영역을 연결한다. 이러한 연결체 펩티드는 인간 유래(human origin)인 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 인간 항체는, 상기 항체가 예를 들면 인간 면역글로불린 유전자를 수반하는 형질전환된 생쥐(transgenic mouse)를 면역화하는 것에 의하거나 또는 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리(human immunoglobulin gene library)를 스크리닝(screening) 하는 것에 의하여 인간 면역글로불린 시퀀스를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우, 특정의 생식세포계 시퀀스"로부터 유래된(derived from)" 것이다. 인간 생식세포계 면역글로불린 시퀀스"로부터 유래된" 인간 항체는 보통 말하는 상기 인간 항체의 아미노산 시퀀스를 인간 생식세포계 면역글로불린의 아미노산 시퀀스와 비교하는 것에 의하여 동정될 수 있다. 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 시퀀스에서 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되고 그리고 다른 종들의 생식세포계 면역글로불린 아미노산 시퀀스(예를 들면, 쥣과의 생식세포계 시퀀스)와 비교할 때 상기 인간 항체가 인간인 것으로서 동정되는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 시퀀스에 적어도 90% 동등하다. 특정의 경우들에 있어서, 인간 항체는 아미노산 시퀀스에 있어서 상기 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동등한 것일 수 있다. 전형적으로, 특정의 인간 생식세포계 시퀀스로부터 유도된 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 시퀀스로부터 10개 미만의 차이를 나타낼 수 있다. 특정의 경우들에 있어서, 상기 인간 항체는 상기 생식세포계 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 시퀀스로부터 5개 미만, 또는 심지어 4, 3, 2개 미만 또는 1개의 차이를 나타낼 수 있다.
"인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포계 면역글로불린 시퀀스로부터 유도된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성(single binding specificity)을 나타내는 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 재조합 인간 항체를 의미한다. 이들 항체들을 제조하는 방법이 본 명세서에서 기술된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체"는 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조되는 하이브리도마에 대한 형질전환된 또는 트랜스염색체화된(transchromosomal) 동물(예를 들면, 생쥐)로부터 단리된 항체, 예를 들어 형질전환종(transfectoma)으로부터의 항체, 재조합으로부터 단리된 항체, 조합 인간 항체 라이브러리(combinatorial human antibody library)를 발현하도록 형질변형된(transformed) 숙주 세포로부터 단리된 항체 및 인간 면역글로불린 유전자 시퀀스의 다른 DNA 시퀀스에로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체 등과 같은 재조합 수단들에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 모든 인간 항체들을 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 시퀀스로부터 유래된 가변영역 및 불변영역들을 갖는다. 그러나, 특정의 구체예들에 있어서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이(또는 인간 면역글로불린(Ig) 시퀀스에 대하여 동물 형질전환이 사용되는 경우, 생체 내 체세포 돌연변이)에 적용될 수 있으며, 따라서 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역들의 아미노산 시퀀스는 인간 생식세포계 VH 및 VL 시퀀스로부터 유도되고 그리고 그에 연관되는 한편으로 생체 내 인간 항체 생식세포계 레퍼토리(repertoire) 내에 천연적으로 존재하지 않는 시퀀스이다. 이들 항체들을 제조하는 방법이 본 명세서에서 기술된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 그의 경쇄 및 중쇄들이 전형적으로는 유전공학에 의하여 다른 종에 속하는 항체 가변 영역 및 불변 영역 유전자로부터 구축된 항체이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체(humanized antibody)" 또는 "인간화 면역글로불린(humanized immunoglobulin)"은 비인간의 면역글로불린으로부터 유도된 최소의 시퀀스를 포함하는 인간/비인간 키메라 항체를 의미한다. 대개, 인간화 항체는 수령인의 가변 영역으로부터의 잔기가 생쥐, 집쥐, 토끼 또는 원하는 특이성, 친화도 및 능력(capacity)을 갖는 비인간의 영장류 등과 같은 비인간의 종(공여자 항체(donor antibody))의 가변 영역으로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수령인 항체)이다. 인간화 항체는 수령인 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린, 프레임워크 영역 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 비인간 항체, 인간 항체로부터 대응되게 위치된 아미노산으로 치환된 불변영역 또는 CDR의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 동일한 항체의 비인간화 버전(non-humanized version)에 비하여 인간 숙주 내에서 감소된 면역반응(immune response)를 생성할 것으로 기대된다. 인간화 항체는 항원 결합 또는 다른 항체 기능들에 대하여 실질적으로 아무런 영향이 없는 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 보존적 치환(conservative substitutions) 군집(groopings)에는 글리신-알라닌, 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 세린-트레오닌 및 아스파라긴-글루타민들이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리클로날 항체(polyc1onal antibody)" 또는 "폴리클로날 항체 조성물(polyc1onal antibody composition)"은 다른 B-세포주(B-cell lines)로부터 유도된 항체의 제조를 의미한다. 이들은 각각이 다른 에피토프를 인식하는 특정의 항원에 대하여 분비된 면역글로불린 분자들의 혼합물이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 유도체(antibody derivative)"는 전장의 항체(full-length antibody) 또는 항체의 단편을 포함하며, 여기에서 상기 아미노산들 중의 하나 또는 그 이상은 예를 들면 상기 항체를 제2의 분자에 결합하기 위한 알킬화(alkylation), 페길화(pegylation), 아실화(acylation), 에스테르 형성(ester formation) 또는 아미드 형성(amide formation)에 의하여 화학적으로 변성된다. 여기에는 페길화 항체(pegylated antibodies), 시스테인 페길화 항체(cysteine-pegylated antibodies), 이들의 변종들을 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표지(label)"는 검출되어야 할 조성물에 직접적으로 또는 간접적으로 공액화되는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 화합물 또는 조성물, 예를 들면, N-말단 히스타딘 태그(N-terminal histadine tags ; N-His), 자기적으로 활성인 동위원소(magnetically active isotopes), 예를 들면, 115Sn, 117Sn 및 119Sn, 13C 및 15N 등과 같은 비방사성 동위원소, "표지된" 조성물을 생성하도록 하는 것과 같은 항체 등과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 단백질들을 의미한다. 상기 용어는 또한 녹색형광단백질(green fluorescent protein ; GFP) 등과 같이 삽입된 시퀀스의 발현에 의하여 신호(signal)를 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 공액화된 시퀀스를 포함한다. 상기 표지는 그 자체로서(예를 들면, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 또는 효소표지(enzymatic label)의 경우, 기질 화합물(substrate compound) 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변형(chemical alteration)을 촉매할 수 있다. 상기 표지들은 소규모 검출에 적절하거나 또는 고-출력 스크리닝(high-throughput screening)에 더욱 적절할 수 있다. 마찬가지로, 적절한 표지들에는 자기적으로 활성인 동위원소, 비방사성 동위원소, 방사성 동위원소, 형광색소(fluorochromes), 화학발광 화합물(chemiluminescent compounds), 염료(dyes) 및 효소를 포함하여 단백질들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 표지는 단순히 검출가능한 것이 되거나 또는 이는 정량화(quantified)될 수 있다. 단순히 검출되는 반응에는 단순히 그의 존재가 확인되는 반응이 포함되는 반면에, 정량화되는 반응은 일반적으로 세기(intensity), 편극화(polarization) 및/또는 다른 특성 등과 같은 정량화가 가능한(예를 들면 수치적으로 보고될 수 있는) 값(value)을 갖는 반응이 포함된다. 발광(luminescence) 또는 형광(fluorescence) 분석에 있어서, 상기 검출가능한 반응은 실제로 결합에 포함되는 분석 성분(assay component)와 연관되는 발광단(luminophore) 또는 형광단(fluorophore)를 사용하여 직접적으로 또는 다른 성분(예를 들면, 리포터(reporter) 또는 인디케이터(indicator))과 연관되는 발광단 또는 형광단을 사용하여 간접적으로 생성될 수 있다. 신호를 생성하는 발광 표지의 예들에는 생물발광(bioluminescence) 및 화학발광(chemiluminescence)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 검출가능한 발광 반응은 일반적으로 발광 신호에서의 변화 또는 발생을 포함한다. 발광 표지 분석 성분들에 대해 적절한 방법 및 발광단들은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며 또한 예를 들면 문헌 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)에서 기술된다. 발광 탐침(luminescent probes)의 예들에는 에쿼린(aequorin) 및 루시퍼라아제(luciferases)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역공액화(immunoconjugate)"는 세포독성제(cytotoxic agent), 검출가능한 시약(detectable agent), 방사성 시약(radioactive agent), 표적화제(targeting agent), 인간 항체(human antibody), 인간화 항체, 키메라 항체(chimeric antibody), 합성 항체(synthetic antibody), 반합성 항체(semisynthetic antibody) 또는 다특이성 항체(multispecific antibody) 등과 같은 제2 시약에 연관되거나 또는 결합된 항체 또는 항체 유도체를 포함한다. 적절한 형광 표지의 예에는 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 에오신(eosin), 에리트로신(erythrosin), 쿠마린(coumarin), 메틸-쿠마린(methyl-coumarins), 피렌(pyrene), 말라사이트 그린(Malacite green), 스틸벤(stilbene), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 캐스케이드 블루™(Cascade Blue™) 및 텍사스 레드(Texas Red) 들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 다른 적절한 광학적 염료들이 문헌 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)에서 기술되어 있다.
다른 관점에 있어서, 상기 형광 표지는 세포 또는 세포 표면 표지자(cellular surface markder) 내에 또는 그 위에 존재하는 세포 성분에 공유적으로 부착되는 것을 용이하게 하도록 관능화(functionalized)된다. 적절한 관능기들에는 이소시아네이트기(isothiocyanate groups), 아미노기(amino groups), 할로아세틸기(haloacetyl groups), 말레이미드기(maleimides), 숙신이미딜에스테르(succinimidyl esters) 및 설포닐할라이드(sulfonyl halides)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니며, 이들 모두는 제2 분자에 상기 형광 표지를 부착시키는 데 사용될 수 있다. 상기 형광 표지의 상기 관능기의 선택은 연결체, 상기 시약, 상기 표지자 또는 제2 표지화제(second labeling agent)에의 부착의 위치에 의존적일 수 있다.
"진핵세포"는 원핵생물계를 제외한 생물왕국(life kingdoms)의 모두를 포함한다. 이들은 막-결합 핵(membrane-bound nucleus)을 통하여 쉽게 구별될 수 있다. 동물, 식물, 균류(fungi) 및 원생생물(protists)들은 진핵생물체(eukaryotes) 또는 그의 세포들이 내부막과 세포골격(cytoskeleton)에 의한 복합 구조(complex structures)로 조직되는 유기체들이다. 가장 특징적인 막-결합 구조는 상기 핵이다. 특별히 언급되지 않는 한, 용어 "숙주"에는 예를 들어 효모(yeast), 고등 식물(higher plant), 곤충(insect) 및 포유동물 세포들이 포함된다. 진핵세포 또는 숙주의 비-제한적인 예들에는 유인원, 소(bovine), 돼지(porcine), 쥣과 동물(murine), 집쥐, 조류(avian), 파충류(reptilian) 및 인간이 포함된다.
핵 또는 임의의 다른 막-결합 세포소기관(organelles)을 결여하는 "원핵세포"는 박테리아와 고세균류(archaea)의 두 도메인(domains)들로 나뉘어진다. 염색체 DNA에 더하여, 이들 세포들은 또한 에피좀(episome)이라고 불리우는 원형 루프(circular loop) 내에 유전정보를 포함할 수 있다. 박테리아 세포는 매우 작은, 대략 동물 미토콘드리아(animal mitochondrion)의 크기(약 1 내지 2㎛의 직경 및 10㎛의 길이)이다. 원핵세포는 3가지의 형태; 즉, 막대형(rod shaped), 구형(spherical) 및 나선형(spiral)을 특징으로 한다. 진핵생물과 같은 정교한 복제 과정을 통해서 진행하는 대신, 박테리아 세포는 2분열(binary fission)에 의해 나뉘어진다. 예들에는 바실러스 박테리아(Bacillus bacteria), 대장균(E. coli bacterium) 및 살모넬라균(Salmonella bacterium)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
"원래의" 또는 "천연의" 항원은 폴리펩티드, 단백질 또는 에피토프를 포함하는 단편이며, 이는 천연의 생물학적 근원으로부터 단리되며, 또한 이는 항원 수용기, 특히 대상체 내에서의 T세포 항원 수용기(T cell antigen receptor ; TCR)에 특이적으로 결합할 수 있다.
용어 "항원" 및 "항원의(antigenic)"는 항체에 의해 인식되거나 또는 항체-리간드 쌍(antibody-ligand pair)의 구성원으로서 작용할 수 있는 능력을 갖는 분자를 의미한다. "특이적 결합(specific binding)"은 항원과 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 상호작용을 의미한다. 항체-항원 결합(antibody-antigen binding)은 생체 내 또는 시험관 내에서 일어날 수 있다. 숙련된 기술자는 단백질, 핵산, 지방산(fatty acids), 리피드(lipids), 지질다당류(lipopolysaccharides) 및 다당류를 포함하는 거대분자(macromolecules)는 항원으로 작용하는 잠재성을 갖는 것으로 이해될 수 있다. 숙련된 기술자는 또한 항체 리간드로서 작용하는 잠재성을 갖는 단백질을 인코딩하는 핵산이 필수적으로 항원을 인코딩하는 것은 이해할 수 있는 것이다. 상기 기술자는 또한 항원들이 전장 분자로 한정되는 것은 아니며, 또한 부분적인 분자를 포함할 수 있다는 것은 이해할 수 있는 것이다. 용어 "항원의"는 항원의 특성을 갖는 분자에 대한 형용사적 참조(adjectival reference)이다. 상기 용어는 면역원성인 물질, 즉 면역원(immunogens)과 마찬가지로 면역무반응(immunological unresponsiveness) 또는 면역성 결여(anergy)를 유도하는 물질, 즉 아네르겐(anergens)을 포함한다.
"변형된 항원(altered antigen)"은 대응하는 야생형 항원의 시퀀스와 다른 1차 시퀀스(primary sequence)를 갖는 것이다. 변형된 항원은 합성 또는 재조합 방법들에 의해 만들어질 수 있으며, 전사 동안 또는 그 이후에 별도로, 예를 들면, 포스포릴화(phosphorylation), 글리코실화(glycosylation), 가교화(cross-linking), 아실화(acylation), 단백질분해적 개열(proteolytic cleavage), 항체 분자, 막 분자(membrane molecule) 또는 다른 리간드에의 결합에 의하여 변형되는 항원의 펩티드를 포함하나 이들에 제한되지는 않는다. (문헌 Ferguson et al. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:285-320 참조). 본 발명의 합성 또는 변형 항원은 천연 에피토프와 동일한 TCR에 결합하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 또한 천연 또는 야생형 항원으로서 언급되는 "자가-항원(self-antigen)"은 상기 항원에 대한 자가-내성(self-tolerance)로 인하여 대상체 내에서의 면역 반응이 거의 유발하지 않거나 전혀 유발하지 않는 항원 펩티드이다. 자가-항원의 예는 흑색종 특이성 항원 gp 100(melanoma specific antigen gp 100)이다.
용어 "주조직적합성복합체(major histocompatibility complex)" 또는 "MFC"는 T세포에의 항원 제공을 위하여 그리고 빠른 이식편 거부 반응(rapid graft rejection)을 위하여 필요한 세포-표면 분자를 인코딩하는 유전자의 복합체를 의미한다. 인간에 있어서, 상기 MHC는 또한 "인간 백혈구 항원" 또는 "HLA" 복합체로서 알려져 있다. 상기 MHC에 의해 인코딩된 단백질은 "MHC 분자"로 알려져 있으며, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 분류된다. 클래스 I MHC에는 β2-마이크로글로불린과 비공유적으로 연결된 MHC 내에서 인코딩된 쇄로 이루어지는 막헤테로이량체성 단백질(membrane heterodimeric proteins)이 포함된다. 클래스 I MHC 분자는 거의 모든 유핵세포에 의해 발현되고 그리고 CD8+ T세포에의 항원 제공에서 기능하는 것으로 나타났다. 클래스 I 분자에는 인간에 있어서 HLA-A, B 및 C들이 포함된다. 클래스 II MHC 분자에는 또한 비공유적으로 연관된 α 및 β쇄들로 이루어지는 막헤테로이량체성 단백질이 포함된다. 클래스 II MHC 분자는 또한 CD4+ T세포에서 기능하는 것으로 알려져 있으며, 인간에 있어서 HLA-DP, -DQ 및 DR들이 포함된다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명 조성물 및 리간드는 임의의 HLA 형태의 MHC 분자와 복합화될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들은 상기 HLA의 혈청형 및 유전자형에 친숙하다. 홈페이지 bimas.dcrt.nih.gov/cgi-binlmolbio/hla coefficient viewing page, 문헌 Rammensee H. G., Bachmann J., and Stevanovic S. MHC Ligands and Peptide Motifs (1997) Chapman & Hall Publishers; Schreuder G. M. Th. et al. The HLA dictionary (1999) Tissue Antigens 54:409-437을 참조하시오.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "항원-제공 매트릭스(antigen-presenting matrix)"는 상기 항원이 T세포의 표면 상에서 T-세포 항원 수용기에 의해 결합될 수 있는 방법으로 항원을 제공할 수 있는 분자 또는 분자들을 의미한다. 항원-제공 매트릭스는 항원제공세포(antigen presenting cell ; APC)의 표면 상, APC의 소포 제제(vesicle preparation) 상에 존재하거나 또는 비드 또는 플레이트 등과 같은 고체 지지체 상의 합성 매트릭스의 형태로 존재할 수 있다. 합성 항원-제공 매트릭스의 예들로는 P2-마이크로글로불린에 복합체화된 정제된 MHC 클래스 I 분자, 이러한 정제된 MHC 클래스 I 분자의 복합체(multimers), 정제된 MHC 클래스 II 분자 또는 고체 지지체 상에 부착된 이들의 관능적 부분들이 있다.
용어 "항원 제공 세포(APC)"는 면역시스템의 특이적 효과기 세포에 의해 인식될 수 있으며, 그에 의하여 상기 항원 또는 제공되는 항원에 대한 효과적인 세포 면역 반응을 유도하는 항원-MHC 복합체 형태의 하나 또는 그 이상의 항원을 제공할 수 있는 부류의 세포를 의미한다. 비록 많은 형태의 세포들이 T-세포 인식을 위하여 그들의 세포 표면 상에 항원을 제공할 수 있기는 하나, 단지 전문적인 APCs만이 유효한 양의 항원을 제공하고 또한 세포독성 T-림프구 반응(cytotoxic T-lymphocyte (CTL) responses)을 위하여 T-세포를 활성화시키는 능력을 갖는다. APCs는 마크로파지, B-세포 및 수지상세포(dendritic cells) 등과 같은 온전한 전세포(intact whole cells); 또는 β2-마이크로글로불린에 복합체화된 정제된 MHC 클래스 I 분자 등과 같은 다른 천연적으로 발생하거나 또는 합성 분자가 될 수 있다.
용어 "수지상세포(DCs)"는 다양한 림프 모양(lymphoid) 및 비-림프 모양의 조직들에서 발견되는 형태학상(morphologically)으로 유사한 세포 형태의 다양한 개체군을 의미한다(문헌 Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296을 참조하시오). 수지상세포는 가장 잠재적이고 그리고 바람직한 포유동물의 APCs를 구성한다. 전부는 아니지만, DCs의 부분집합(subset)은 골수 조상 세포(bone marrow progenitor cells)로부터 유도되고, 말초혈액 내에서 소수로 순환하고 그리고 미성숙의 랑게르한스 세포(immature Langerhans' cells) 또는 최종분화 성숙 세포(terminally differentiated mature cells)로서 발견된다. 비록 DCs가 단핵구로부터 유도될 수 있기는 하나, 이들은 구별되는 표현형을 소유한다. 예를 들면, 특정의 분화되는 마커(marker), CD14 항원은 수지상세포 내에서 발견되지는 않으나 그러나 단핵구에 의하여 단핵구 내에서 매우 높은 수준으로 발현된다. 예를 들면, 문헌 Jersmann et al., (2005) Immunol. Cell Biol. 83:462을 참조하시오.
또한, 성숙 수지상세포는 식세포(phagocytic)는 아니지만, 반면에 상기 단핵구는 강하게 식균하는 세포이다. 성숙 단핵구 및 DCs는 서로 다른 메카니즘을 통하여 물질을 흡수한다(endocytose). 단핵구는 식균작용의 수단에 의하여 에워싸는 반면에, DCs는 거대음세포작용(macropinocytosis)을 활용한다. 따라서, DCs는 일반적으로 단핵구 보다 더 작은 크기의 화물(cargo)을 에워싼다(예를 들면, 문헌 Conner and Schmid, (2003) Nature 433:37-44을 참조하시오). DCs가 다른 항원 제공 세포들과 마찬가지로 식균작용적으로 활성이며, T세포 활성화 및 증식을 위하여 필요한 신호들 전부를 제공한다(예를 들면, 문헌 Levine and Chain, (1992) ONAS 89(17):8342을 참조하시오).
용어 "항원 제공 세포 동원 인자(antigen presenting cell recruitment factors)" 또는 "APC 동원 인자"는 온전한, 전세포들과 마찬가지로 항원을 제공하는 세포를 동원할 수 있는 다른 분자를 포함한다. 적절한 APC 동원 인자의 예들에는 인터류킨 4(interleukin 4 ; IL4), 과립세포 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor ; GM-CSF), 세프라겔(Sepragel) 및 대식세포 염증단백질 3α(macrophage inflammatory protein 3 alpha ; MIP3a) 등과 같은 분자들이 포함된다. 이들은 Immunex, Schering-Plough and R&D Systems (미합중국 미네소타주 미네아폴리스(Minneapolis, Minn.) 소재)로부터 획득가능하다. 이들은 또한 문헌 Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds. (1987))에서 기술된 방법을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 앞서-언급한 인자들과 동일한 생물학적 활성을 갖는 펩티드, 단백질 및 화합물들이 본 발명의 범주 내에 포함된다.
용어 "면역 효과기 세포(immune effector cells)"는 항원과 결합하고 그리고 면역 반응을 매개할 수 있는 세포를 의미한다. 이들 세포들에는 T세포, B세포, 단핵구, 대식세포, NK세포(NK cells) 및 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes ; CTLs) 예를 들면 CTL 세포주(CTL lines), CTL 클론(CTL clones) 및 종양, 감염 또는 다른 관여자(infiltrates)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 특정의 질병에 걸린 조직은 특정의 항원을 발현하고 그리고 이들 항원들에 대하여 특이적인 CTLs가 동정되었다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "면역 효과기 분자(immune effector molecule)"는 항원 특이적 결합을 할 수 있는 분자를 의미하고 그리고 항체, T세포 항원 수용기, B세포 항원 수용기 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자들이 포함된다.
"순수한" 면역 효과기 세포는 그 세포를 활성화할 수 있는 항원에 노출된 적이 없는 면역 효과기 세포이다. 순수한 면역 효과기 T세포의 활성화는 증식하고 그리고 항원-특이적 무장 효과기 T세포로 분화하기 위하여 상기 항원:MHC 복합체의 인식 및 전문적인 APC에 의한 공동자극 신호(costimulatory signal)의 동시적인 전달을 요구한다. 계속해서 활성화된 T세포는 공동자극 신호를 제공하는 것에 의한 면역학적 시냅스들(immunological synapses)을 통한 특이적 B세포를 활성화할 수 있다. 활성화된 B세포는 후속하여 특정의 항원으로 지향되는 항체를 생성한다. 순전한 B세포는 또한 T세포-비의존적 메카니즘(T cell-independent mechanisms)에 의하여 활성화될 수 있다. 이는 항원이 B세포 수용기에 결합하고 그리고 공동자극 신호를 생성할 수 있는 것인 때에 발생한다.
"면역 반응"은 광범위하게는 외래 물질(foreign substances)에 대한 림프구의 항원-특이적 반응을 의미한다. 용어 "면역원" 및 "면역원성"은 면역 반응을 이끌어내는 능력을 갖는 분자를 의미한다. 모든 면역원들은 항원들이나, 그러나, 모든 항원들이 면역원성인 것은 아니다. 본 발명의 면역 반응은 체액성(humoral)(항체 활성을 통한)이거나 또는 세포-매개(T세포 활성을 통한)가 될 수 있다. 상기 반응은 생체 내 또는 시험관 내에서 일어날 수 있다. 숙련된 기술자는 단백질, 핵산, 지방산, 지질, 지질다당류 및 다당류들을 포함하여 다양한 거대분자들이 면역원성이 될 수 있는 잠재성을 갖는다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 숙련된 기술자는 또한 필수적으로 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 분자를 인코딩하는 핵산이 면역원을 인코딩한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 상기 기술자는 또한 면역원이 전장의 분자로 제한되지 않으나, 그러나 부분적인 분자를 포함할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
용어 "수동 면역"은 항체의 전달을 통하여 하나의 대상체로부터 다른 대상체로의 면역력(immunity)의 전달을 의미한다. 모(母)의 항체(maternal antibodies)들이 태아(fetus)에로 전달되는 경우와 마찬가지로 수동 면역은 자연적으로 일어날 수 있다. 수동 면역은 또한 항체 조성물을 비-면역의 대상체에로 투여하는 경우와 마찬가지로 인공적으로 일어날 수 있다. 항체 공여자 및 수령자들은 인간 또는 비인간의 대상체가 될 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이 될 수 있고, 시험관 내 또는 생체 내에서 생성될 수 있고, 그리고 구체예에 따라 정제되거나, 부분적으로 정제되거나 또는 미정제될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 일부 구체예들에 있어서, 수동 면역은 특정의 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 투여를 통하여 면역을 필요로 하는 대상체에 부여된다. 일부 구체예들에 있어서, 수동 면역은 특정의 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 투여를 통하여 부여된다.
본 발명의 문맥에 있어서, "리간드"는 폴리펩티드이다. 하나의 관점에 있어서, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "리간드"는 다른 분자 상의 특정의 자리에 결합하는 임의의 분자를 의미한다. 다른 말로는, 상기 리간드는 면역 효과기 세포 또는 항체와의 반응에서 단백질에 대한 단백질 또는 단백질에 대한 DNA의 특이성을 부여한다. 하나의 관점에 있어서, 이는 면역 효과기 세포 상의 상보적 결합 자리(complementary binding site)와 직접적으로 결합하는 단백질 내의 리간드 자리이다.
하나의 관점에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 리간드는 항체 또는 T세포 수용기(TCR) 등과 같은 면역 효과기 세포 상의 항원 결정기(antigenic determinant) 또는 에피토프에 결합한다. 리간드는 본 발명의 항원, 펩티드, 단백질 또는 에피토프가 될 수 있다.
다른 관점에 있어서, 리간드는 항체 상의 수용기에 결합할 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 리간드는 길이에 있어서 약 4 내지 약 8개의 아미노산이다.
다른 관점에 있어서, 리간드는 MHC 클래스 I 분자 상의 수용기에 결합할 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 리간드는 길이에 있어서 약 7 내지 약 11개의 아미노산이다.
또 다른 관점에 있어서, 리간드는 MHC 클래스 II 분자 상의 수용기에 결합할 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 리간드는 약 10 내지 약 20개의 아미노산의 길이이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단련된, 항원-특이성 면역 효과기 세포(educated, antigen-specific immune effector cell)"는 앞서 정의된 바와 같은 면역 효과기 세포이며, 이는 앞서 항원과 조우(encountered)되었다. 그의 순수한 대응물(naive counterpart)과는 대조적으로, 단련된 항원-특이성 면역 효과기 세포의 활성화는 공동자극 신호를 필요로 하지 않는다. 상기 펩티드:MHc 복합체의 인식으로 충분하다.
T세포와 관련하여 사용되는 경우, "활성화된(activated)"은 상기 세포가 더 이상 G0상(G0 phase) 내에 존재하지 않고, 그리고 세포 형태(예를 들면, CD8+ 또는 CD4+)의 특성인 하나 또는 그 이상의 세포독성, 사이토카인(cytokines) 및 다른 연관된 막-연관 단백질(membrane-associated proteins)을 생성하는 것을 의미하고, 그의 표면 상의 특정의 항원을 나타내는 임의의 표적 세포를 인식하고 그리고 그에 결합하고 그리고 그의 효과기 분자를 방출할 수 있다.
용어 "교차-반응(cross-reactive)"은 기능적으로 중첩(overlapping)되는 본 발명의 화합물을 기술하는 데 사용된다. 특히, 원래의 리간드 및/또는 그에 의하여 활성화된 면역 효과기 세포들의 면역원성 특성들은 변형된 리간드(altered ligand)가 원래의 리간드 및/또는 그에 의하여 활성화된 면역 효과기 tpv들에 대하여 "교차-반응"이 되도록 상기 변형된 리간드에 의해 특정한 정도까지 공유(shared)된다. 본 발명의 목적을 위하여는, 교차-반응성은 여러 수준들: 즉 (i) 리간드 수준, 예를 들면, 상기 변형된 리간드가 TCR과 결합하고 그리고 원래의 리간드 CTLs를 활성화시킬 수 있는 수준으로; (ii) T세포 수준, 즉, 본 발명의 변형된 리간드가 TCR과 결합하고 그리고 T세포의 개체군(원래의 리간드 CTLs와는 구별되는)을 활성화시키고 이는 상기 원래의 리간드를 나타내는 세포들을 효과적으로 표적으로 하고 그리고 이 세포들을 용해시키는 수준으로; 그리고 (iii) 항체 수준으로, 예를 들면, "항"-변형된 리간드 항체("anti"-altered ligand antibodies)가 상기 원래의 리간드를 검출하고, 인식하고 그리고 결합할 수 있으며 또한 극단적으로 상기 숙주로부터 상기 원래의 리간드를 제거하는 결과를 가져오는 면역 반응에서의 효과기 메카니즘을 개시하는 수준으로 조작된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체에서의 면역 반응을 유도(inducing an immune response in a subject)"는 당해 기술분야에서는 잘 이해되는 용어이고 그리고 대상체 내로 항원(또는 에피토프)을 도입한 이후에 상기 대상체 내로 상기 항원(또는 에피토프)를 도입하기 이전의 면역 반응(존재하는 경우)에 비하여 항원(또는 에피토프)에 대한 면역 반응에서 적어도 약 2배, 보다 바람직하게는 적어도 약 5배, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배, 보다 바람직하게는 적어도 약 100배, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 500배, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 약 1000배 또는 그 이상의 증가가 검출되거나 또는 측정될 수 있는 것을 의미한다. 항원(또는 에피토프)에 대한 면역 반응에는 항원-특이적(또는 에피토프-특이적) 항체의 생성 및 그의 표면에 항원(또는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 분자를 발현하는 면역 세포의 생성들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 주어진 항원(또는 에피토프)에 대한 면역 반응이 유도되었는 지의 여부를 결정하는 방법은 당해 기술분야에서는 잘 알려져 있다. 예를 들면, 항원-특이성 항체는 효소면역분석법을 포함하나 이에 제한되지 않는 당해 기술분야에서 공지된 다양한 면역분석법(immunoassays)들 중의 임의의 분석법을 사용하여 검출될 수 있으며, 여기에서, 예를 들면, 샘플 내의 항체의 부동화된(immobilized) 항원(또는 에피토프)에의 결합이 검출가능하게-표지된 2차 항체(예를 들면, 효소-표지된 생쥐 항-인간 면역글로불린 항체)로 검출된다.
"공동-자극 분자(co-stimulatory molecules)"는 항원 제공 세포의 표면 상에 발현된 수용기-리간드 쌍과 T세포 사이의 상호작용에 포함된다. 지난 수 년간 축적된 연구들에서 휴면 중의 T세포는 사이토카인 유전자 발현의 유도 및 증식을 위하여 적어도 2개의 신호들을 요구한다는 것이 확고하게 입증되었다(문헌들 Schwartz (1990) Science 248:1349-1356 및 Jenkins (1992) Immunol. Today 13:69-73을 참조하시오). 특이성을 부여하는 신호인 하나의 신호는 TCR/CD3 복합체와 적절한 MHC/펩티드 복합체 간의 상호작용에 의하여 생성될 수 있다. 두 번째 신호는 항원 특이적이 아니며, "공동-자극" 신호로 정의된다. 이 신호는 원래 소위 "전문적인" APCs로 불리우는 대식세포 및 수지상세포 등과 같은 골수-유도 부세포(bone-marrow-derived accessory cells)에 의해 제공된 활성으로 정의된다. 여러 분자들이 공동-자극 활성을 강화시키는 것으로 나타났다. 이들은 내열성 항원(heat stable antigen ; HSA)(문헌 Liu et al. (1992) J. Exp. Med. 175:437-445 참조), 콘드로이친 황산염-변성 MHC 불변쇄(chondroitin sulfate-modified MHC invariant chain ; Ii-CS)(문헌 Naujokas et al. (1993) Cell 74:257-268 참조), 세포내 부착 분자 1(intracellular adhesion molecule 1 ; ICAM-1)(문헌 Van (1992) Cell 71:1065-1068 참조)들이다. 이들 분자들 각각은 상기 T세포에 대한 이들 연관된 리간들과의 상호작용에 의하여 공동-자극을 보조하는 것으로 여겨진다. 공동-자극 분자는 공동-자극 신호(들)을 매개하며, 이는, 정상적인 생리학적 조건들 하에서, 순수한 T세포의 완전한 활성화를 달성하는 데 필수적이다. 하나의 예시적인 수용기-리간드 쌍은 APCs의 표면 상의 B7 공동-자극 분자들 및 T세포 상의 그의 상대-수용기(counter-receptor) CD28 또는 CTLA-4들이다(문헌들 Freeman et al. (1993) Science 262:909-911; Young et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:229 및 Nabavi et al. (1992) Nature 360:266-268을 참조하시오). 다른 중요한 공동-자극 분자들은 CD40, CD54, CD80 및 CD86들이다. 용어 "공동-자극 분자"는, T세포의 표면 상의 TCR에 의하여 결합된 펩티드/MHC 복합체와 함께 작용하는 경우, 상기 펩티드를 결합하는 상기 T세포의 활성화를 달성하는 공동-자극 효과를 제공하는 임의의 단일 분자 또는 이들 분자들의 조합을 포함한다. 따라서 상기 용어는 펩티드/MHC 복합체와 함께 연관된 리간드에 결합하고 그리고 상기 T세포의 표면 상의 상기 TCR이 상기 펩티드에 특이적으로 결합하는 경우에 상기 T세포의 활성화의 결과를 가져오는 APC, 그의 단편들(단독, 다른 분자(들)과 복합화 또는 융합 단백질의 일부로서) 등과 같은 항원-제공 매트릭스에 대한 B7 또는 다른 공동자극 분자(들)을 포함한다. 공동-자극 분자는 예를 들면 베크만 쿨터 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc. 미합중국 캘리포니아주 풀러톤(Fullerton, Calif.) 소재)를 포함하여 다양한 공급원들로부터 상용적으로 획득가능하다. 비록 항상 명쾌하게 언급되지는 않음에도 불구하고, 야생형 또는 정제된 공동자극 분자들(예를 들면, 재조합적으로 생산되거나 또는 그의 돌연변이단백질(muteins)들과 유사한 생물학적 활성을 갖는 분자들이 본 발명의 정신 및 관점의 범위 내에서 사용되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상호호환적으로 사용되는 "고체상 지지체(solid phase support)" 또는 "고체 지지체(solid support)"는 지지체의 특정한 형태로 제한되는 것은 아니다. 오히려 다수의 지지체들이 획득가능하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 공지된 것이다. 고체상 지지체들에는 실리카겔(silica gels), 수지(resins), 피복 플라스틱 필름(derivatized plastic films), 글래스비드(glass beads), 면(cotton), 플라스틱비드(plastic beads), 알루미나겔(alumina gels) 들이 포함된다. 적절한 고체상 지지체는 원하는 최종 용도 및 여러 프로토콜(protocols)에 대한 적합성(suitability)의 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 펩티드 합성을 위해서는, 고체상 지지체로는 폴리스티렌(polystyrene ; 예를 들면, 바켐 인코포레이티드(Bachem Inc.), 페닌슐라 라보레토리즈(Peninsula Laboratories) 등으로부터 수득되는 PAM-수지), POLYHIPE.RTM. 수지(캐나다 아미노테크(Aminotech, Canada)로부터 수득됨), 폴리아미드 수지(페닌슐라 라보레토리즈로부터 수득됨), 폴리에틸렌글리콜로 분지된 폴리스티렌 수지(polystyrene resin grafted with polyethylene glycol ; TentaGel.RTM., 독일 튜빙겐(Tubingen, Germany) 소재의 랩 폴리미어(Rapp Polymere)) 또는 폴리디메틸아크릴아미드 수지(polydimethylacrylamide resin ; 미합중국 캘리포니아주 소재 밀리겐/바이오서치(Milligen/Biosearch)로부터 수득됨) 등과 같은 수지들이 언급될 수 있다.
고체상 지지체의 예들에는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란(dextran), 나일론, 아밀라제(amylases), 천연 및 변성된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드(polyacrylamides), 반려암(gabbros) 및 마그네타이트(magnetite) 들이 포함된다. 담체의 속성은 어느 정도 가용적성 또는 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 짝지워진 분자(coupled molecule)가 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체에의 결합이 가능한 한 실질적으로 임의의 가능한 구조상의 구성(structural configuration)를 가질 수 있다. 따라서, 상기 지지체 구성은 비드와 같은 구형, 또는 시험간의 내부 표면과 같은 원통형, 또는 봉의 전체 표면이 될 수 있다. 달리, 상기 표면은 시트(sheet), 시험지(test strip) 등과 같이 편평하거나 또는 달리 폴리스티렌 비드가 될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 항체 또는 항워을 결합하기 위한 많은 다른 적절한 담체들을 잘 알 수 있거나 또는 반복되는 실험에 의하여 동일한 것을 알아낼 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "면역조절제(immunomodulatory agent)"는 면역 반응을 조절하는 분자, 거대분자 복합체 또는 세포이며, 본 발명의 합성 항원성 펩티드 단독 또는 본 명세서에서 기술된 다양한 제형들 중의 임의의 것; 본 발명의 합성 항원성 펩티드를 포함하는 폴리펩티드; 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; APC 및 합성 항원-제공 매트릭스(공동-자극 분자(들)의 존재 또는 부재중에서)를 포함하여 항원-제공 매트릭스 상의 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자에 결합된 본 발명의 합성 항원성 펩티드; 다른 분자(들) 또는 거대분자 구조에 공유적으로 또는 비공유적으로 복합체화된 본 발명의 합성 항원성 펩티드; 및 본 발명의 펩티드에 대하여 특이적인, 단련된, 항원-특이적 면역 효과기 세포들이 포함한다.
용어 "면역 반응을 조절(modulate an immune response)"하는 것에는면역 반응을 유도(증가, 이끌어냄); 및 면역 반응을 감소(저해)하는 것이 포함된다. 면역조절 방법(또는 프로토콜)은 대상체 내에서의 면역 반응을 조절하는 방법이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 세포에 대한 다양한 영향을 발휘, 예를 들면, 성장 또는 증식을 유도하는 다수의 인자들 중의 임의의 하나를 의미한다. 본 발명의 실시에서 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 사이토카인의 비-제한적인 예들에는 인터류킨-2(interleukin-2 ; IL-2), 줄기세포 인자(stem cell factor ; SCF), 인터류킨 3(interleukin 3 ; IL-3), 인터류킨 6(interleukin 6 ; IL-6), 인터류킨 12(interleukin 12 ; IL-12), G-CSF, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor ; GM-CSF), 인터류킨-1 알파(interleukin-1 alpha ; IL-1α), 인터류킨-11(interleukin-11 ; IL-11), MIP-11, 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor ; LIF), c-킷트 리간드(c-kit ligand), 트롬보포이에틴(thrombopoietin ; TPO) 및 flt3 리간드(flt3 ligand) 들이 포함된다. 본 발명에는 또한 하나 또는 그 이상의 사이토카인이 배지로부터 특이적으로 배제되는 배양 조건들이 포함된다. 사이토카인은 예를 들면 젠자임(Genzyme ; 미합중국 매사츄세츠주 프래밍햄(Framingham, Mass.) 소재), 제넨테크(Genentech ; 미합중국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코(South San Francisco, Calif.) 소재), 암겐(Amgen ; 미합중국 캘리포니아주 싸우전드 오크스(Thousand Oaks, Calif.) 소재), 알앤디 시스템즈(R&D Systems ; 미합중국 미네소타주 미니아폴리스(Minneapolis, Minn.) 소재) 및 임뮤넥스(Immunex ; 미합중국 워싱턴주 시애틀(Seattle, Wash.) 소재) 등과 같은 여러 판매회사들로부터 상용적으로 획득가능하다. 비록 항상 명쾌하게 언급되지는 않으나, 야생형 또는 정제된 사이토카인(예를 들면, 재조합적으로 생산되거나 또는 그의 돌연변이단백질)과 유사한 생물학적 활성을 갖는 분자들이 본 발명의 정신 및 범주 내에서 사용되는 것으로 의도된다.
진단 및 치료 방법들
DNABII 폴리펩티드 또는 단백질 또는 미생물 DNA를 간섭제와 접촉시키고, 그에 의하여 상기 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 상기 미생물 DNA에의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는 것에 의하여 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 미생물 DNA에의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하기 위한 방법이 제공된다. 다른 관점에 있어서, 상기 DNABII 폴리펩티드와 상기 미생물 DNA들은 예를 들면 서로 긴밀하게 접촉하는 경우에 신호를 방출할 수 있는 발광 분자로 검출가능하게 표지된다. 상기 접촉은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
다른 관점에 있어서, 생물막을 간섭제와 접촉시키고 그에 의하여 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 것에 의하여 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 방법이 제공된다. 또 다른 관점에 있어서, 상기 DNABII 폴리펩티드와 상기 미생물 DNA들은 예를 들면 서로 긴밀하게 접촉하는 경우에 신호를 방출할 수 있는 발광 분자로 검출가능하게 표지된다. 상기 접촉은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
시험관 내에서 실시되는 경우, 상기 방법들은 본 발명의 상기 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체, 숙주 세포, 소분자 및 조성물들과 동일하거나, 유사하거나 또는 반대되는 능력을갖는 간섭제들을 스크리닝하거나 또는 확인하는 데 유용하다. 달리, 이들은 간섭제가 미생물 감염을 치료하는 데 가장 적절한 것인지를 동정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 DNABII 폴리펩티드와 미생물 DNA 및 시약을 포함하는 샘플들이 시험되도록 하는 것에 의하여 신규한 시약 또는 조합 요법(combination therapies)들을 스크리닝할 수 있다. 제2 샘플은 상기 DNABII 폴리펩티드와 미생물 DNA 및 활성에 대해 공지된 시약, 예를 들면, 양성 대조(positive control)로서 기능하는 항-IHF 항체 또는 소분자를 포함한다. 또 다른 관점에 있어서, 여러 샘플들이 제공되고 그리고 상기 간섭제들이 증가하는 희석으로 상기 시스템에 첨가되어 임상적 설정(clinical setting)에서 대상체를 치료하는 데 효과적일 것으로 여겨지는 최적의 투여량(optimal dose)을 결정하도록 한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 명백한 바와 같이, 상기 DNABII 폴리펩티드 및 상기 미생물 DNA를 포함하는 음성 대조가 제공될 수 있다. 또 다른 관점에 있어서, 상기 DNABII 폴리펩티드와 상기 미생물 DNA들은 예를 들면 서로 긴밀하게 접촉하는 경우에 신호를 방출할 수 있는 발광 분자로 검출가능하게 표지된다. 상기 샘플들은 유사한 조건들 하에서 상기 DNABII 폴리펩티드와 미생물 DNA 사이의 상호작용을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하기에 유효한 시간 동안 포함되고 그리고 계속해서 상기 샘플은 상기 발광 분자로부터의 신호의 방출에 대하여 분석된다. 만일 상기 샘플이 신호를 방출하는 경우, 그때에는 상기 시약은 결합을 저해하는데 효과적이지 않다.
다른 관점에 있어서, 상기 시험관 내 방법은 소형화된 챔버 슬라이드 시스템(miniaturized chamber slide system) 내에서 실시되며, 여기에서 감염을 야기하는 상기 미생물(박테리아 등과 같은) 분리균은 인간/동물로부터 단리되고 계속해서 이것이 시험관 내에서 생물막으로 성장하도록 배양된다. 예를 들면, 하기 실시예 1번을 참조하시오. 상기 간섭제(항-IHF 항체 등과 같은) 또는 잠재적인 간섭제 생물막이 단독으로 또는 다른 시약과 함께 항-IHF(또는 다른 항체, 소분자, 시약 등) 등과 같은 잠재적인 간섭제 또는 간섭제의 희석이 증가하거나 또는 증가하지 않도록 하여 상기 배양물에 첨가되어 감염이 존재하는 대상체에 전달되는 경우에 환자를 치료하는 데 유효할 것으로 여겨지는 최적의 투여량을 찾도록 한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백한 바와 같이, 양성 및 음성 대조는 동시적으로 수행될 수 있다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 방법은 플로우셀(flow cell) 내에 상기 간섭제(항-IHF 항체 등과 같은) 및/또는 잠재적인 간섭제(단독 또는 다른 시약과 함께)를 갖는 고출력 플랫폼(high throughput platform) 내에서 수행된다. 상기 간섭제(항-IHF 항체 등과 같은) 또는 잠재적인 간섭제 생물막이 단독으로 또는 다른 시약과 함께 항-IHF(또는 다른 항체, 소분자, 시약 등) 등과 같은 잠재적인 간섭제 또는 간섭제의 희석이 증가하거나 또는 증가하지 않도록 하여 상기 배양물에 첨가되어 감염이 존재하는 대상체에 전달되는 경우에 환자를 치료하는 데 유효할 것으로 여겨지는 최적의 투여량을 찾도록 한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백한 바와 같이, 양성 및 음성 대조는 동시적으로 수행될 수 있다. 생물막 분리균들은 음파처리되어(sonicated) 미생물 DNA에 부착된 IHF 등과 같은 DNABII 폴리펩티드로부터 생물막 박테리아를 분리한다. 상기 DNABII 폴리펩티으-DNA 복합체들은 상기 플랫폼 상의 상기 항-IHF 항체의 덕분으로 단리된다. 계속해서 상기 미생물 DNA는 예를 들면 염세척(salt wash)으로 방출되고 그리고 첨가된 상기 생물막 박테리아를 동정하는 데 사용된다. 계속해서 상기 유리된 DNA(freed DNA)는 예를 들면 시퀀스화된 중합효소연쇄반응에 의하여 동정된다. 만일 DNA가 유리되지 않는 경우, 계속해서 상기 간섭제(들)을 연속적으로 수행하거나 또는 상기 미생물 DNA를 결합한다. 만일 상기 샘플 내에서 DNA가 발견되는 경우,계속해서 상기 시약은 DNABII 폴리펩티드-미생물 DNA 결합을 간섭하지 않는다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백한 바와 같이, 양성 및 음성 대조는 동시적으로 수행될 수 있다.
상기한 방법은 또한 이것이 주어진 박테리아 종이 하나의 시약 또는 그 이상의 다른 시약에 의하여 그의 생물막의 제거에 더 낫게 반응할 수 있다는 것이 가능하기 때문에 진단 시험(diagnostic test)으로서 사용될 수 있으며, 이러한 고속 고출력 분석 시스템은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 일단의 가능한 항-IHF-유사 시약들을 분석하여 상기 군의 가장 효과적인 시약을 동정하도록 할 수 있다. 이들 방법들의 잇점은 병원 내의 대부분의 임상미생물학 실험실(clinical microbiology labs)들이 이미 액체 배양물(또는 플랑크톤)을 사용하는 이러한 종류의 분석(즉, MIC, MBC 값들의 결정)을 수행하도록 구비되어 있다는 것이다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백한 바와 같이, 박테리아는 일반적으로 이들이 질병을 야기하는 경우에는 플랑크톤과 같이 성장되지는 않는다. 대신 이들은 안정한 생물막으로서 성장되고 그리고 이들 생물막들은 명백하게도 항생제, 항체 또는 다른 치료제들로 처리하는 데 더욱 저항성이다. 이러한 저항성이 대부분의 MIC/MBC 값들이 생체 내에서의 효능을 예측하는 데 실패하는 이유이다. 따라서, 시약의 어느 "투여량"이 시험관 내의 박테리아 생물막을 제거할 수 있는 지를 결정하는 것에 의하여 출원인들의 전-임상 분석(pre-clinical assay)이 보다 신뢰할 수 있는임상적 효능, 심지어 개인화된 약물(personalized medicine)의 적용으로서의 의 예보인자(predictor)가 될 수 있다. 임상적 설정에 더하여, 상기 방법들은 감염을 야기하는 미생물을 동정하거나 및/또는 산업적 설정(industrial setting)에서의 유효한 간섭제를 확인하는 데 사용될 수 있다. 상기한 방법들의 또 다른 관점에 있어서, 내재하는 감염(underlying infection)의 성장을 저해하는 것으로 알려진 항생제 또는 항균제가 연속적으로 또는 동시적으로 첨가되어 상기 감염이 저해될 수 있는 지를 결정한다. 생물막 저해에 대하여 분석하는 손실된 복합체를 첨가하기 이전에 상기 간섭제를 상기 미생물 DNA 또는 DNABII 폴리펩티드에 첨가하는 것이 또한 가능하다.
친칠라 등과 같은 비-인간 동물 내에서 생체 내에서 실시하는 경우, 상기 방법은 생물막을 파괴하기 위하여 단독으로 또는 다른 시약들과 함께 사용될 수 있는 간섭제들을 동정하기 위한 전임상 스크리닝을 제공한다. 이러한 방법의 예들을 하기 실시예 번호 2 내지 7에 나타내었다.
다른 관점에 있어서, 본 명세서에서는 대상체에 유효량의 간섭제를 투여하고 그에 의하여 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 것에 의하여 대상체에서의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 방법이 제공된다. 이러한 방법의 예들을 하기 실시예 번호 2 내지 7에 나타내었다.
시험관 내 그리고 생체 내 방법에 있어서 상기 언급한 목적을 위하여, 상기 간섭제는
(a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(f) 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드;
(g) 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드;
(h) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 시퀀스 동정 번호 36의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이들 각각의 등가물 또는 엄중 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 등가물 또는 그의 보체;
(i) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이들 항체 또는 항원 결합 단편 각각의 등가물 또는 단편;
(j) (i)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 그의 보체; 또는
(k) 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 소분자
의 군의 시약이다.
본 명세서에서는
본 명세서에서
(a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(f) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 시퀀스 동정 번호 36의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이들 각각의 등가물 또는 엄중 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 등가물 또는 그의 보체;
(g) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이들 각각의 등가물 또는 단편;
(h) (g)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
(i) (a) 내지 (e)의 어느 하나와 펄스화된(pulsed) 항원 제공 세포; 및
(j) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 항원 제공 세포
의 군의 하나 또는 그 이상의 시약의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 면역 반응을 유발하거나 또는 수동 면역을 부여하는 것을 필요로 하는 대상체에 대하여 면역 반응을 유발하거나 또는 수동 면역을 부여하는 방법이 제공된다.
하나의 특정한 관점에 있어서, 상기 간섭제는 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들의 단편, IHF 폴리펩티드의 C-말단 단편 또는 이들 각각의 등가물이다. 다른 특정한 관점에 있어서, 상기 간섭제는 단리되거나 또는 재조합 HU 폴리펩티드 또는 이들의 단편, HU 폴리펩티드의 C-말단 단편 또는 이들 각각의 등가물이다. 이러한 비-제한적인 실시예들은 IHF 또는 HU 알파 또는 베타 폴리펩티드; IHF 폴리펩티드; 모락셀라 아카타르할리스 HU(Moraxella acatarrhalis HU); 대장균 HupA, HupB, himA, himD; 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis HU ; V583 등과 같은), HMGB1(고이동기상자 1, 유사한 DNA 결합 및 DNA 기질 특이성을 가지나 그러나 단백질의 상기 DNABII 패밀리에 대한 1차 아미노산시퀀스 내에 있지 않은 ; 기능적 오소로그(orthologue ; 서로 다른 종간에서 같은 기능을 하는 유전자)) 및 표 8 또는 표 10에서 동정된 것들이다. 또 다른 관점에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에 항균제, 항원성 펩티드 또는 부형제 중의 하나 또는 그 이상의 유효량을 투여하는 것을 더 포함하거나, 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
항생제의 비-제한적인 예들로는 표면 항원, 예를 들면, OMP P5, rsPilA, OMP 26, OMP P2 또는 IV형 필린 단백질(문헌 Jurcisek and Bakaletz (2007) J. of Bacteriology 189(10):3868-3875 및 Murphy, TF, Bakaletz, LO and Smeesters, PR (2009) The Pediatric Infectious Disease Journal, 28:S121-S126을 참조하시오) 등과 같은 다른 백신 성분들이 있다.
본 발명의 상기 시약 및 조성물은 다른 항생제 및/또는 표면 항원들과 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 하나의 특정한 관점에 있어서, 투여는 예를 들면 직접적인 주사에 의하거나 또는 흡입(inhalation)에 의하여 감염의 자리에 국소적으로 이루어진다. 투여의 다른 비-제한적인 예들에는 경피로(transdermally), 요도로(urethrally), 설하로(sublingually), 직장으로(rectally), 질동맥으로(vaginally), 눈으로(ocularly), 피하로(subcutaneous), 근육내로(intramuscularly), 복막내로(intraperitoneally), 코안으로(intranasally), 흡입에 의하거나 또는 경구로의 투여들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 방법에 의한 것들이 포함된다.
본 발명의 상기 방법들에 의하여 치료될 수 있는 미생물 감염 및 질병에는 실험 번호 1 내에 그리고 표 8에 동정된 유기체들, 예를 들면, 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 트레포네메스(Treponemes), 덴티콜라(denticola), 팔리듐(pallidum), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 또는 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)에 의한 감염들이 포함된다. 하나의 관점에 있어서, 상기 미생물 감염은 해모필루스 인플루엔자에(비피막형), 모락셀라 아카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 슈도모나스 아에루기노사, 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)들 중의 하나 또는 그 이상의 감염이다. 이들 미생물 감염들은 상부(upper), 중부(mid) 및 하부(lower) 기도(airway) 내에 존재할 수 있다(이염(otitis), 부비동염, 기관지염, 또한, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease ; COPD), 만성 기침(chronic cough), 낭포성 섬유증(CF)의 합병증 및/또는 주요 원인 및 공동체성 폐염(community acquired pneumonia ; CAP)). 따라서, 본 발명의 생체 내 방법을 실시하는 것에 의하여, 이들 감염들로부터의 이들 질병들 및 합병증들이 또한 예방되거나 또는 치료될 수 있다.
감염들은 또한 구강(oral cavity) 내에서 일어날 수 있으며(우식증(caries), 치주염(periodontitis)), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 아이(Aggregatibacter actinomycetemcomitansI)에 의하여 야기된다. 감염들은 또한 피부에 국소화될 수 있으며(종기(abscesses), '스타필로코커스' 감염('staph' infections), 농가진(impetigo), 화상의 2차 감염, 라임병(Lyme disease)), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 보렐리아 부르도르페리(Borrelia burdorferi)에 의하여 야기된다. 요도관의 감염(infections of the urinary tract ; UTI) 또한 치료될 수 있으며, 전형적으로 대장균에 의하여 야기된다. 위장관의 감염(infections of the gastrointestinal tract ; GI)(설사(diarrhea), 콜레라(cholera), 담석증(gall stones), 위궤양(gastric ulcers))들이 전형적으로 살모넬라 엔테리카 세로바(Salmonella enterica serovar), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 및 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)들에 의해 야기된다. 생식관(genital tract)의 감염이 포함되고 그리고 전형적으로 나이세리아 고노로에아에에 의하여 야기된다. 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)에 의해 야기되는 방광(bladder)의 또는 유치 기구(indwelling device)의 감염이 있을 수 있다. 전형적으로 다양한 박테리아에 의하여 야기되는 인공 고관절(artificial hip) 또는 무릅 치환물(knee replacements) 또는 치아 임플란트(dental implants) 등과 같은 이식된 보철 기구들 또는 펌프, 카테터, 스텐트 또는 감시 시스템 등과 같은 의료 장치들과 연관된 감염들이 본 발명의 상기 방법에 의하여 치료될 수 있다. 이들 기구들은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 시약으로 코팅되거나 또는 공액화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 생체 내 방법들을 실시하는 것에 의하여, 이들 감염들로부터의 이들 질병들 및 합병증들이 또한 예방되거나 또는 치료될 수 있다.
스트렙토코커스 아갈락티아에에 의하여 야기되는 감염들이 또한 본 발명의 상기 방법들에 의하여 치료될 수 있으며, 이는 신생아(newborns)들에서의 세균성 폐혈증(bacterial septicemia)의 주요 원인이다. 뇌수막염(meningitis)을 야기할 수 있는 나이세리아 메닝기티디스에 의하여 야기되는 감염들이 또한 치료될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법들에 적용가능한 투여의 경로들에는 코안으로, 근육내로, 요도로, 기관종양내로(intratracheal), 피하로, 피내로(intradermal), 국소적 적용으로(topical application), 정맥내로(intravenous), 직장으로, 코로(nasal), 경구로(oral), 흡입으로 그리고 다른 경장(enteral) 및 비경구적(parenteral routes) 경로들의 투여들이 포함된다. 투여의 경로들은, 원하는 경우, 결합되거나 또는 상기 시약 및/또는 원하는 효과에 따라 조정될 수 있다. 활성제는 단일 투여량(single dose)으로 또는 다중 투여량(multiple doses)들로 투여될 수 있다. 전달을 위하여 적절한 이들 방법들 및 경로들의 구체예들에는 전신적(systemic) 또는 국소적 경로(localized routes)들이 포함된다. 대체로, 본 발명의 상기 방법들에 적절한 투여의 경로들에는 직접적인 주사, 경장, 비경구적 또는 흡입적인 경로들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
흡입 투여 이외의 투여의 다른 비경구적 경로에는 국소, 경피, 피하, 근육내, 채혈(intraorbital), 관절내(intracapsular), 척수내(intraspinal), 흉골내(intrasternal) 그리고 정맥내 경로들, 즉 소화관(alimentary canal)을 통하는 것 이외의 임의의 투여의 경로들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 비경구적 투여는 상기 저해제의 효과적인 전신적 또는 국소적 전달을 수행할 수 있다. 전신적 전달을 원하는 경우, 투여는 전형적으로 약제학적 제제(pharmaceutical preparations)들의 침습적(invasive) 또는 전신적으로 흡수되는 국소적 또는 점막 투여(mucosal administration)들을 포함한다.
본 발명의 상기 간섭제는 또한 경장 투여(enteral administration)에 의하여 대상체에 전달될 수 있다. 투여의 경장 경로들에는 경구 전달 및 직장 전달(예를 들면, 좌약(suppository)을 사용)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 피부 또는 점막을 통한 활성제의 투여의 방법들에는 적절한 약제학적 제제의 국소적 적용, 경피 전달(transcutaneous transmission), 경피 전달(transdermal transmission), 주사 및 상피 투여(epidermal administration)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 경피 전달을 위하여는, 흡수촉진제(absorption promoters) 또는 이온삼투요법(iontophoresis)들이 적절한 방법들이다. 이온삼투 전달(iontophoretic transmission)은 수 일 또는 그 이상의 기간 동안 미파괴의 피부를 통한 전기 펄스를 통하여 이들 제품을 전달하는 상용적으로 획득가능한 "패치(patches)"를 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 상기 방법들의 여러 구체예들에 있어서, 상기 간섭제는 흡입, 주사 또는 경구로 연속적으로, 일일 기반(daily basis)으로, 적어도 1일 1회(QD) 그리고 여러 구체예들로 매일 2회(BID), 3회(TID) 또는 심지어 4회 투여될 수 있다. 전형적으로, 치료학적으로 유효한 일일 투여량(daily dose)은 적어도 약 1㎎, 또는 적어도 약 10㎎, 또는 적어도 약 100㎎, 또는 약 200 내지 약 500g, 그리고 때로는 화합물에 따라서는 약 1g 내지 약 2.5g 이상이 될 수 있다. 캡슐, 정제, 경구 현탁액(oral suspension), 근육내 주사용 현탁액, 정맥 내 주입용 현탁액(suspension for intravenous infusion), 국소 적용을 위한 겔(gel) 또는 크림(cream) 또는 관절내 주사용 현탁액(suspension for intra-articular injection)을 사용하는 본 발명의 상기 방법들에 따라 투여가 수행될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 조성물들의 투여량, 독성 및 치료학적 효과는 세포 배양 또는 실험 동물에서, 예를 들면, LD50(개체군의 50%에 이르는 치사량(dose lethal)) 및 ED50(개체군의 50%에서의 치료학적으로 유효한 투여량)을 결정하기 위한 표준 약제학적 절차들에 의하여 결정될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 투여량비(dose ratio)가 치료지수(therapeutic index)이며, 이는 LD50/ED50의 비로 표현될 수 있다. 높은 치료지수를 나타내는 조성물들이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물들이 사용될 수 있기는 하나, 미감염된 세포들에의 잠재적인 손상을 최소화하기 위하여 감염된 조직의 자리에로 이러한 화합물들을 표적으로 하고 그에 의하여 부작용을 감소시키는 전달시스템(delivery system)을 설계함에 있어서 주의가 요구된다. 상기 세포 배양 분석 및 동물 연구들로부터 수득된 데이터가 사용되어 인간에서의 사용을 위한 투여량의 범위를 조성할 수 있다. 이러한 화합물들의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 상기 ED0을 포함하는 순환 농도(circulating concentrations)의 범위 이내에 놓인다. 상기 투여량은 이러한 범위 내에서 사용된 투여량 형태(dosage form) 및 활용되는 투여의 경로에 따라 변할 수 있다. 상기 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대하여, 상기 치료학적으로 유효한 투여량은 초기에 세포 배양 분석으로부터 예측될 수 있다. 세포 배양에서 결정된 바와 같은 상기 IC50(즉, 증후군의 절반-최대 저해(half-maximal inhibition)를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위(circulating plasma concentration range)를 달성하기 위하여 동물 모델에서 투여량이 제형화(formulated)될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서의 유용한 투여량들을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 혈장 내 수준들이 측정될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 치료학적 또는 예방의학적 효과를 달성하기에 충분한 조성물의 유효량은 투여 당 체중 1㎏당 약 0.000001㎎ 내지 체중 1㎏당 약 10,000㎎의 범위이다. 적절하게는, 상기 투여량 범위는 투여 당 체중 1㎏당 약 0.0001㎎ 내지 체중 1㎏당 약 100㎎ 이다. 투여는 초기 투여량(initial dose)으로서 후속하여 하나 또는 그 이상의 "촉진" 투여량("booster" doses)으로 제공될 수 있다. 촉진 투여량은 초기 투여량 이후 1일, 2일, 3일, 1주, 2주 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 12개월에 제공될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 촉진 투여량은 투여에 앞서 대상체의 반응의 평가 이후에 투여된다.
숙련된 기술자는 질병 또는 장애의 중증도(severity), 이전의 치료, 종합적인 건강 및/또는 대상체의 연령 및 다른 질병의 존재들을 포함하나, 이들에 제한되지 않는 특정의 인자들이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 요구되는 투여량 및 투여시기에 영향을 줄 수 있음은 이해할 수 있을 것이다. 더욱이, 본 발명에서 기술된 치료학적 조성물의 치료학적으로 유효량으로의 대상체의 치료에는 단독 치료 또는 일련의 치료들이 포함될 수 있다.
폴리펩티드
본 명세서에서 기술된 방법들에서 사용하기 위한 간섭제 및 조성물이 본 명세서에서 제공되며, 여기에서 상기 간섭제는
(a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
(f) 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드;
의 군의 간섭제이다.
하나의 특정한 관점에 있어서, 상기 간섭제는 단리되거나 또는 재조합 DNABII 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물이다. 이러한 것들의 비-제한적인 예들로는 IHF 또는 HU 알파 또는 베타 폴리펩티드; IHF α 폴리펩티드; 모락셀 아카타르할리스 HU(Moraxell acatarrhalis HU); 대장균 HupA, HupB, himA, himD; 엔테로코커스 페칼리스(V583 등과 같은), HMGB1 및 표 8에서 동정된 것들이 있다.
다른 관점에 있어서, 상기 간섭제는 시퀀스 동정 번호 1 내지 5 또는 12 내지 27, 30 내지 35, 101 내지 340들 또는 도 6에 동정된 DNA 결합 펩티드로부터 선택되는 아미노산 시퀀스로 필수적으로 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드이다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 1 또는 2를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 3, 4 또는 5를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30 또는 32를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 31, 33, 34 또는 35를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 IHF 알파, IHF 베타 또는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 중의 임의의 하나의 야생형이 아니라는 단서 하에
시퀀스 동정 번호 12 및 13을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 14 및 15를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 16 및 17을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 18 및 19를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 20 및 21을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 23 및 24를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 25 및 26을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 30 및 31을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 32 및 33을 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 34 및 35를 포함하는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 337 및 338을 포함하는 폴리펩티드; 또는
시퀀스 동정 번호 339 및 340을 포함하는 폴리펩티드;
의 군의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드가 IHF 알파, IHF 베타 또는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 중의 임의의 하나의 야생형이 아니라는 단서 하에
시퀀스 동정 번호 12 및 13으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 14 및 15로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 16 및 17로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 18 및 19로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 20 및 21로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 23 및 24로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 25 및 26으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 30 및 31로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 32 및 33으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 34 및 35로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
시퀀스 동정 번호 337 및 338로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드; 또는
시퀀스 동정 번호 339 및 340으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
의 군의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드이다.
본 발명의 상기 방법들에서 사용되기 위한 시약들로서 앞서 기술된 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드의 단편 또는 등가물이 더욱 제공된다. 단편의 예로는 C-말단 폴리펩티드가 있다. 다른 관점에 있어서, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드에는 앞서 기술된 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다.
예를 들면, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리펩디드는 시퀀스 동정 번호 1 내지 6, 12 내지 27 또는 30 내지 33 또는 단편 또는 등가의 폴리펩티드를 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지며, 그의 예들을 표 8 내에 동정하거나 또는 표 9a, 표 9b 또는 표 10에 나타내었다. 하나의 관점에 있어서, 단리된 야생형 폴리펩티드는 배제되고, 즉, 상기 폴리펩티드는 표 8에 동정되거나 또는 표 9a에 나타난 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 야생형 시퀀스가 아니다.
하나의 관점에 있어서, 본 발명은 시퀀스 동정 번호 1 내지 6, 12 내지 27 또는 30 내지 35, 1 내지 6 및 13 내지 35의 군의 아미노산 시퀀스로 필수적으로 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 그의 비-제한적인 예들로서 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 또는 이들 각각의 단편 또는 그의 등가물을 포함하는 해모필루스 인플루엔자에 IHF α 또는 IHF β의 β-3 및/또는 α-3 단편들에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 관점에 있어서, 본 발명은 시퀀스 동정 번호 1 내지 4의 군의 아미노산 시퀀스 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물을 포함하거나 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 비-제한적인 예들로서 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 독립적으로 적어도 2, 또는 달리 적어도 3, 또는 달리 적어도 4, 또는 달리 적어도 5, 또는 달리 적어도 6, 또는 달리 적어도 7, 또는 달리 적어도 8, 또는 달리 적어도 9, 또는 달리 적어도 10개의 아미노산들을 포함하는 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 또는 그의 단편 또는 그의 생물학적 등가물을 포함하는 해모필루스 인플루엔자에 IHF α 또는 IHF β의 β-3 및/또는 α-3 단편들에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 관점에 있어서, 단리된 야생형 DNA 결합 폴리펩티드는 배제되고, 즉, 상기 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 또는 표 8에 기재되거나 또는 표 9a에 나타난 단리된 야생형 폴리펩티드 시퀀스가 아니다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 시퀀스 동정 번호 1 또는 2 단독으로 또는 그의 비-제한적인 예들이 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 또는 이들 각각의 단편 또는 생물학적 등가물을 포함하는 해모필루스 인플루엔자에 IHF α 또는 IHF β의 β-3 및/또는 α-3 단편들에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 폴리펩티드와 함께 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 관점에 있어서, 단리된 야생형 DNA 결합 폴리펩티드는 배제되고, 즉, 상기 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 또는 표 8에 기재되거나 또는 표 9a에 나타난 단리된 야생형 폴리펩티드 시퀀스가 아니다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 시퀀스 동정 번호 3 또는 4 단독으로 또는 그의 비-제한적인 예들이 시퀀스 동정 번호 12 내지 27 및 34 내지 35 또는 이들 각각의 생물학적 등가물을 포함하는 해모필루스 인플루엔자에 IHF α 또는 IHF β의 β-3 및/또는 α-3 단편들에 대응하는 아미노산을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 폴리펩티드와 함께 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 관점에 있어서, 단리된 야생형 DNA 결합 폴리펩티드는 배제되고, 즉, 상기 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 또는 표 8에 기재되거나 또는 표 9a에 나타난 단리된 야생형 폴리펩티드 시퀀스가 아니다.
본 발명은 또한 상기 단리된 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물의 14가지 전부들 중의 2 또는 그 이상, 또는 3 또는 그 이상, 4 또는 그 이상, 5 또는 그 이상, 6 또는 그 이상, 7 또는 그 이상, 8 또는 그 이상, 9 또는 그 이상, 10 또는 그 이상, 11 또는 그 이상, 12 또는 그 이상, 13 또는 그 이상을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 예들에는 시퀀스 동정 번호 1 내지 4, 예를 들면, 시퀀스 동정 번호 1 및 2, 또는 달리 1 및 3 또는 달리 1 및 4 또는 달리 2 및 3 또는 달리 시퀀스 동정 번호 1, 2 및 3 또는 달리 2, 3 및 4, 또는 달리 1, 3 및 4를 포함하는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드들이 포함된다. 상기 폴리펩티드는 임의의 배향(orientation), 예를 들면, 시퀀스 동정 번호 1, 2 및 3 또는 시퀀스 동정 번호 3, 2 및 1 또는 달리 2, 1 및 3 또는 달리 3, 1 및 2가 될 수 있다. 본 발명에는 상기 시퀀스들이 표 8 및 9에 동정된 것 등과 같은 단리된 야생형 시퀀스들을 포함하지 않는다는 단서 하에 이들 폴리펩티드의 생물학적 등가물들이 더 포함된다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 5 내지 10이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 1 또는 2 및 3 또는 4 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 이들은 시퀀스 동정 번호 11 내지 26, 예를 들면, 11 및 12, 또는 달리 1 및 11, 또는 달리 2 및 11, 또는 달리 1 및 12, 또는 달리 2 및 12 또는 달리 11, 12 및 1, 또는 달리 2, 11 및 12들 중의 어느 하나 또는 그 이상을 더 포함할 수 있다. 이 구체예에 있어서, 시퀀스 동정 번호 1 또는 2는 상기 아미노산 시퀀스가 단리된 야생형 폴리펩티드, 예를 들면, 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28 및 29가 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 3 또는 4로부터의 상향류 또는 아민 말단에 위치된다. 다른 관점에 있어서, 상기 단리된 폴리펩티드는 시퀀스 동정 번호 1 또는 2에 대한 상향류 또는 아미노 말단에 위치되는 시퀀스 동정 번호 3 또는 4를 포함한다. 상기 시퀀스가 단리된 야생형 폴리펩티드를 포함하지 않는다는 단서 하에 본 발명에는 이들 폴리펩티드들의 단편 생물학적 등가물들이 더 포함된다.
하나의 구체예에 있어서, 상기 야생형 폴리펩티드 또는 문헌 Pedulla et al. (1996) PNAS 93: 15411-15416에서 기술된 폴리펩티드들에 대해 시퀀스 동등성(sequence identity)을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질이 본 발명으로부터 배척된다.
상기 구체예들 중의 임의의 것에 있어서, 펩티드 연결체가 상기 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 첨가될 수 있다. "연결체" 또는 "펩티드 연결체"는 폴리펩티드 시퀀스의 상기 N-말단 또는 상기 C-말단에 연결되는 폴리펩티드 시퀀스를 의미한다. 하나의 관점에 있어서, 상기 연결체는 약 1 내지 약 20개의 아미노산 잔기 길이 또는 달리 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 5개의 아미노산 잔기 길이이다. 펩티드 연결체의 하나의 예는 Gly-Pro-Ser-Leu-Lys-Leu(SEQ 동정 번호: 37)이다. 다른 실시예들에는 Gly-Gly-Gly; Gly-Pro-Ser-Leu(SEQ 동정 번호: 38); Gly-Pro-Ser; Pro-Ser-Leu-Lys(시퀀스 동정 번호: 39); Gly-Pro-Ser-Leu-Lys(시퀀스 동정 번호: 40) 및 Ser-Leu-Lys-Leu(시퀀스 동정 번호: 41)들이 포함된다.
본 발명의 상기 단리된 폴리펩티드들은 단리된 야생형 및 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 원핵 및 진핵 숙주 세포들로부터의 단백질과 마찬가지로 이들의 돌연변이단백질, 유사체 및 단편들을 포함하는 것으로 의도되며, 그러한 세포들의 예들은 앞서 기술되었다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 용어는 또한 본 명세서에서 기술된 바와 같은 항체 및 항-유전자형 항체(anti-idiotypic antibodies)를 포함한다. 이러한 폴리펩티드들은 당해 기술분야에서 공지되고 그리고 본 명세서에서 간략하게 기술된 방법들을 사용하여 단리되거나 또는 생산될 수 있다.
상기 야생형 폴리펩티드 또는 단백질의 기능상 등가물(functional equivalents) 또는 변종(variants)들, 예를 들면, 상기 아미노산들의 보존적 아미노산 치환체들을 갖는 것들이 또한 본 발명의 관점 내에 속하는 것이다. 예를 들면, 표 9를 참조하시오. 다른 유사체들에는 항원 제공 매트릭스에 결합된 폴리펩티드를 포함할 수 있는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질들이 포함된다.
또 다른 관점에 있어서, 상기 폴리펩티드는 검출가능한 표지에 공액화되거나 또는 연결된다. 적절한 표지들은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 본 명세서에서 기술되었다.
또 다른 관점에 있어서, 검출가능한 표지를 갖거나 또는 갖지 않는 상기 폴리펩티드는 수지상세포 등과 같은 숙주 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 표면 상에 포함되거나 또는 그 위에서 발현될 수 있다.
상기 단백질 및 폴리펩티드는 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 다수의 공정들에 의하여 수득될 수 있으며, 이들에는 정제, 화학적 합성 및 재조합 방법들이 포함된다. 폴리펩티드는 항체로의 면역침강(immunoprecipitation) 및 겔여과크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 역상크로마토그래피 및 친화성크로마토그래피 등과 같은 표준 기술들에 의하여 숙주 세포 시스템 등과 같은 제제들로부터 단리될 수 있다. 이러한 방법론에 대하여는, 예를 들면, 문헌 Deutscher et al. (1999) Guide To Protein Purification: Methods In Enzymology (Vol. 182, Academic Press)을 참조하시오. 따라서, 본 발명은 또한 이들 폴리펩티드들과 마찬가지로 이들 공정들에 의하여 수득가능하고 그리고 수득되는 생성물들을 얻기 위한 공정들을 제공한다.
상기 폴리펩티드는 또한 미합중국 캘리포니아주 포스터 시티(Foster City, CA, USA) 소재 퍼킨/엘머/어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드 모델 430A 또는 431A(Perkin/Elmer/Applied Biosystems, Inc., Model 430A or 431A) 등과 같은 상용적으로 획득가능한 자동화된 펩티드 합성기(peptide synthesizer)를 사용하는 화학적 합성에 의하여 수득될 수 있다. 상기 합성된 폴리펩티드는 침강되고 그리고 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography ; HPLC)에 의하여 더욱 정제된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 단백질의 시퀀스와 아미노산 및 효소 등과 같은 시약들을 제공하고 그리고 상기 아모니산들을 적절한 배향 및 선형 시퀀스로 서로 연결하는 것에 의하여 본 발명의 상기 단백질을 화학적으로 합성하는 공정을 제공한다.
달리, 상기 단백질 및 폴리펩티드는 예를 들면 본 명세서에서 기술되는 숙주 세포와 벡터 시스템들을 사용하여 상기 문헌 Sambrook et al. (1989)에 기술된 바와 같은 잘 알려진 재조합 방법에 의하여 수득될 수 있다.
진단 방법에서 사용하기 위한 검출가능한 시약과 공액화된 본 명세서에서 기술된 상기 폴리펩티드들이 또한 본 발명에 의하여 제공된다. 예를 들면, 검출가능하게 표지된 폴리펩티드는 컬럼(column)에 결합되어 항체들의 검출 및 정제를 위하여 사용될 수 있다. 이들은 또한 이하에서 기술되는 바와 같은 항체들의 생산을 위한 면역원으로서 유용하다. 본 발명의 상기 폴리펩티드는 세포상 공정들을 매개하는 시약 및 약물들에 대한 스크리닝을 위한 시험관 내 분석 시스템(in vitro assay system)에서 유용하다.
본 발명의 상기 폴리펩티드에 대하여 변형이 이루어져서 이들에 변형된 특성을 제공하도록 하는 것이 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 잘 알려진 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 글리신 및 D형 및 L형 광학이성질체 둘 다 그리고 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱들을 포함하여 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산들을 포함한다. 상기 펩티드쇄가 짧은 경우, 3개 또는 그 이상의 아미노산들의 펩티드를 통상적으로 올리고펩티드라고 부른다. 상기 펩티드쇄가 긴 경우, 상기 펩티드를 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질이라고 부른다.
본 발명의 펩티드는 비천연의 아미노산들을 포함하도록 변형될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드는 D-아미노산, D- 및 L-아미노산들의 조합 및 여러 "디자이너(designer)" 아미노산(예를 들면, 베타-메틸아미노산, C-알파-메틸아미노산 및 N-알파-메틸아미노산 등)을 포함하여 펩티드에 특정의 특성들을 운반하도록 할 수 있다. 더욱이, 특정의 결합 단계들에서 특정의 아미노산들을 할당(assigning)하는 것에 의하여 .알파.-헬릭스.베타. 턴,. 베타. 시트, .감마.-턴(.alpha.-helices.beta. turns, .beta. sheets, .gamma.-turns)를 갖는 펩티드 및 고리 펩티드(cyclic peptides)를 생산할 수 있다. 일반적으로, .알파.-헬리칼 2차 구조(.alpha.-helical secondary structure) 또는 무작위 2차 구조(random secondary structure)가 바람직한 것으로 여겨진다.
본 발명의 상기 폴리펩티드는 또한 임플란트, 스텐트, 페이스트(paste), 겔, 치아 임플란트 등과 같은 여러 고체상 지지체, 또는 비드, 멸균 또는 수성 용액, 약제학적으로 수용가능한 담채, 약제학적으로 수용가능한 중합체, 리포좀, 미셀, 현탁액 및 에멀젼 등과 같은 의료용 임플란트 또는 액체상 담체들과 결합될 수 있다. 비-수성의 용매들의 예들에는 프로필에틸렌글리콜(propyl ethylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 및 식물성 오일(vegetable oils)들이 포함된다. 항체들을 제조하거나 또는 생체 내 면역 반응을 유도하기 위하여 사용되는 경우, 상기 담체들은 또한 특정의 면역 반응을 비-특이적으로 증가시키는데(augment) 유용한 부형제들이 포함될 수 있다. 숙련된 기술자들에게는 부형제가 요구되는 지의 여부 및 그를 선택하는 것은 쉽게 결정될 수 있다. 그러나, 단지 설명의 목적을 위해서는, 적절한 부형제들에는 프룬드 완전 및 불완전 배지(Freund's Complete and Incomplete), 광물염(mineral salts) 및 폴리뉴클레오티드들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 다른 적절한 부형제들에는 모노포스포릴리피드 A(monophosphoryllipid A ; MPL), 대장균의 열민감성 엔테로톡신(heat labile enterotoxin)의 돌연변이 유도체, 콜레라 독소(cholera toxin)의 돌연변이 유도체, CPG 올리고뉴클레오티드 및 스쿠알렌(squalene)으로부터 유도된 부형제들이 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드, 유사체, 돌연변이단백질 또는 단편들 중의 임의의 것을 단독으로 또는 서로 조합하거나 또는 항생제 및 수용가능한 담체 또는 고체지지체 등과 같은 다른 시약들과 조합하여 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 약제학적 조성물을 제공한다. 이들 조성물들은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 여러 진단 및 치료방법들을 위하여 사용된다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 상기 동정된 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 및 그들 개개의 상보적 가닥(complementary strand)의 하나 또는 그 이상을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 그의 예들이 당해 기술분야에서 공지되어 있고 그리고 본 명세서에서 간략하게 기술된 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터들이 또한 제공된다. 하나의 관점에 있어서 하나 이상의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드가 단일 유닛(single unit)으로서 발현되어야 하는 경우, 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드는 다시스트론성 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, mRNA 또는 siRNA, miRNA 또는 dsRNA 등과 같은 간섭 RNA(interfering RNA)가 될 수 있다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 미생물 생물막 내의 폴리펩티드 또는 단백질에의 상기 DNA의 결합을 간섭하는 폴리뉴클레오티드, 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 미생물 DNA에로의 결합으로부터 DNABII 폴리뉴클레오티드를 치료 또는 저해할 수 있는 것과 마찬가지로 생물막 형성 및 연관된 감염 및 장애들을 치료하거나, 예방하거나 또는 저해하는 굽혀진 폴리뉴클레오티드인 간섭제를 제공한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 본 명세서에서 제공되는 정보 및 당해 기술분야에서 숙련된 자의 지식을 사용하여 이러한 폴리뉴클레오티드를 만들 수 있다. 문헌 Goodman and Kay (1999) J. Biological Chem. 274(52):37004-37011 및 Kamashev and Rouviere-Yaniv (2000) EMBO J. 19(23):6527 -6535을 참조하시오.
본 발명은 RNA 전사의 프로모터와 마찬가지로 DNA 또는 RNA의 복제 및/또는 일시적이거나 또는 안정한 발현을 위한 다른 조절시퀀스(regulatory sequences)에 작동가능하게 연결되는 상기 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 더 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"은 상기 프로모터가 DNA 분자로부터 이격된 RNA를 직접 전사할 수 있도록 하는 방법으로 위치되는 것을 의미한다. 이러한 프로모터의 예들로는 SP6, T4 및 T7들이 있다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 삽입된 폴리뉴클레오티드의 세포-특이적 발현을 위하여 세포-특이적 프로모터들이 사용된다. 종결코돈(termination codons) 및 선택가능한 마커 시퀀스와 마찬가지로 그에 DNA의 삽입된 조각이 그 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 제한효소 자리를 가지며, 프로모터 또는 프로모터/인핸서(promoter/enhancer)를 포함하는 벡터가 당해 기술분야에서는 공지되어 있고 그리고 상용적으로 획득가능하다. 일반적인 방법론 및 복제 전략(cloning strategies)에 대하여는 문헌 Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press, Inc. (1991), 그리고 여기에서 언급된 참조문헌들 및 Vectors: Essential Data Series (Gacesa and Ramji, eds., John Wiley & Sons, N.Y. (1994)) 이는 지도(maps), 관능적 특성들, 상용적인 공급업자들 및 여러 적절한 벡터들에 대한 GenEMBL 접근 번호들에 대한 참조들을 포함함)을 참조하시오.
하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드로부터 유도되는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 진단 및 치료적 효용(utilities) 및 마찬가지로 존재하거나 또는 존재하지 않는 상기 단백질의 전사물을 동정하기 위한 탐침(probes)들을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 이들 핵산 단편들은, 예를 들면, 보다 큰 폴리뉴클레오티드의 제한 효소 소화(restriction enzyme digestion) 및 계속해서 검출가능한 마커로의 표지화에 의하여 제조될 수 있다. 달리, 무작위 단편들은 상기 분자의 틈번역(nick translation)을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 단편들의 제조 및 표지화를 위한 방법론에 대하여는 상기 문헌 Sambrook, et al. (1989)을 참조하시오.
이들 핵산들을 포함하는 발현 벡터는 단백질 및 폴리펩티드를 생산하기 위한 숙주 벡터 시스템(host vector systems)을 수득하는 데 유용하다. 이들 발현 벡터들이 에피좀으로서 또는 염색체 DNA의 일체부(integral part)로서 상기 숙주 유기체 내에서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적절한 발현 벡터의 비-제한적인 예들에는 플라스미드, 효모 벡터, 바이러스 벡터 및 리포좀들이 포함된다. 아데노바이러스 벡터의 높은 발현 수준 및 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 세포들의 충분한 형질전환으로 인하여 유전자를 생체 내 조직 내로 도입하는 데 아데노바이러스 벡터(adenoviral vectors)들이 특히 유용하다. 핵산이 적절한 숙주 세포, 예를 들면, 원핵 또는 진핵 세포 내로 삽입되고 그리고 상기 숙주 세포가 복제되는 경우, 상기 단백질이 재조합적으로 생산될 수 있다. 적절한 숙주 세포들은 상기 벡터에 의존적일 수 있으며, 공지의 방법을 사용하여 구축된 포유동물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 유인원 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 박테리아 세포들이 포함될 수 있다. 상기 문헌 Sambrook, et al. (1989)을 참조하시오. 세포 내로의 외인성 핵산의 도입을 위한 바이러스 벡터의 사용에 더하여, 상기 핵산은 박테리아 세포에 대한 형질전환; 포유동물 세포에 대한 인산칼슘 침강(calcium phosphate precipitation)을 사용하는 형질감염; 또는 DEAE-덱스트란; 전기천공; 또는 현미주입법(microinjection) 등과 같이 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의하여 상기 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 방법론에 대하여는 위의 문헌 Sambrook et al. (1989)을 참고하시오. 따라서, 본 발명은 또한 단백질 또는 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포, 예를 들면, 포유동물 세포, 동물 세포(집쥐 또는 생쥐), 인간 세포, 또는 박테리아 세포 등과 같은 원핵 세포를 제공한다.
폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 등과 같은 변성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 만일 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변성은 상기 폴리뉴클레오티드의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 상기 핵산의 시퀀스는 비-뉴클레오티드 성분(non-nucleotide components)들에 의하여 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 성분과의 공액화에 의하는 것과 같이 중합 이후 더욱 변형될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중-가닥 및 단일-가닥 분자들 둘 다를 의미한다. 달리 특정되거나 또는 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구체예는 상기 이중-가닥 형태 및 상기 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 또는 예상되는 2개의 상보적 단일-가닥 형태들을 포함한다.
생체 내 또는 생체 외 유전자 요법을 위하여 상기 벡터가 사용되는 경우, 복제-비경쟁(replication-incompetent) 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 등과 같은 약제학적으로 수용가능한 벡터가 바람직하다. 본 발명의 상기 핵산을 포함하는 약제학적으로 수용가능한 벡터는 삽입된 폴리뉴클레오티드의 일시적 또는 안정한 발현을 위하여 더욱 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적으로 수용가능한 벡터(pharmaceutically acceptable vector)"에는 선택적으로 표적화하고 그리고 나뉘어지는 세포 내로 상기 핵산을 도입할 수 있는 능력을 갖는 벡터 또는 전달 비히클(delivery vehicle)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 이러한 벡터의 하나의 예는 상기 감염된 숙주 세포 내에서의 상기 벡터의 확산을 못하게 하는 바이러스 단백질을 생성하기에 불능인 것으로 정의되는 "복제-비경쟁(replication-incompetent)" 벡터이다. 복제-비경쟁 레트로바이러스 벡터의 하나의 예는 LNL6 (문헌 Miller et al. (1989) BioTechniques 7:980-990을 참조하시오)이다. 유전자 마커의 레트로바이러스-매개 유전자 전달을 위한 복제-비경쟁 레트로바이러스를 사용하는 방법론은 이미 구축되어 있다. (문헌 Bordignon (1989) PNAS USA 86:8912-8952; Culver (1991) PNAS USA 88:3155; 및 Rill (1991) Blood 79(10):2694-2700을 참조하시오).
본 발명은 또한 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 및/또는 발현하는 유전적으로 변형된 세포를 제공한다. 상기 유전적으로 변형된 세포는 프로모터 또는 유전자 활성화제(gene activators) 등과 같은 상향류 조절 시퀀스(upstream regulatory sequences)의 삽입에 의하여 생성될 수 있다(미합중국 특허 제5,733,761호를 참조하시오).
상기 폴리뉴클레오티드는 핵산 및/또는 세포 내에서의 상기 유전자의 발현의 검출을 위한 검출가능한 마커, 예를 들면, 효소 표지 또는 방사성 동위원소에 공액화될 수 있다. 형광체, 방사성 동위원소, 아비딘/비오틴 등과 같은 효소 리간드 또는 다른 리간드를 포함하여 다양한 적절한 검출가능한 마커들이 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 이들은 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 하나의 관점에 있어서, 방사성 동위원소 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않은 시약들 대신 형광체 표지 또는 요소가수분해효소(urease), 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase) 또는 과산화효소(peroxidase)를 사용하는 것을 원할 수 있다. 효소 태그(enzyme tags)들의 경우에 있어서는, 비색 표시기 재료(calorimetric indicator substrates)를 사용하여 육안(human eye) 또는 분광분석적으로(spectrophotometrically) 가시화될 수 있는 수단을 제공하여 상보적 핵산-함유 샘플과의 특정한 혼성화를 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상보적 단일-가닥 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 허용하는 조건들(바람직하게는 중등 엄중(moderately stringent) 혼성화 조건들) 하에서, 또는 보다 바람직하게는 고엄중 혼성화 조건들 하에서 표적 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드의 일부인 표지된, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드(탐침)과 접촉시키는 것에 의하여 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 또는 그의 보체를 검출하는 방법을 제공한다. 혼성화된 폴리뉴클레오티드 쌍들은 혼성화되지 않은, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드들로부터 분리된다. 상기 혼성화된 폴리뉴클레오티드 쌍들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지되고 그리고, 예를 들면, 상기 문헌 Sambrook et al. (1989)에 규정된 방법들을 사용하여 검출된다.
본 발명에 포함된 상기 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 복제 방법, 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성의 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 본 명세서에서 상세하게 기술할 필요는 없다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 본 명세서에서 제공된 시퀀스 데이터를 사용하여 DNA 합성기 또는 상업 서비스(commercial service)에 주문하는 것에 의하여 원하는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다.
본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 중합효소연쇄반응을 사용하여 단리되거나 또는 복제될 수 있다. 상기 중합효소연쇄반응은 미합중국 특허 제4,683,195호; 동 제4,800,159호; 동 제4,754,065호; 및 동 제4,683,202호의 주제(subject matter)이며, 문헌 PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al. eds., Birkhauser Press, Boston (1994)) 또는 MacPherson et al. (1991) 및 (1995) 상기 문헌 및 이들에 언급된 참조문헌들에 기술되어 있다. 달리, 당해 기술분야에서 숙련된 자는 본 명세서에서 제공된 상기 시퀀스 및 상용적인 DNA 합성기를 사용하여 상기 DNA를 복제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 적절한 프라이머 분자의 선형 시퀀스 및 효소 등과 같은 화학약품들 및 이들의 복제에 대한 지시들을 제공하고 그리고 적절한 배향 내에서 상기 뉴클레오티드를 화학적으로 복제하거나 또는 연결하여 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 것에 의하여 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드를 수득하는 공정을 제공한다. 별도의 구체예에 있어서, 이들 폴리뉴클레오티드는 더욱 단리된다. 또한, 당해 기술분야에서 숙련된 자는 상기 폴리뉴클레오티드를 적절한 복제 벡터(replication vector) 내로 삽입하고 그리고 복제 및 증폭을 위하여 상기 벡터를 적절한 숙주 세포(원핵 또는 진핵) 내로 삽입할 수 있다. 그렇게 증폭된 상기 DNA는 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 방법에 의하여 상기 세포로부터 단리될 수 있다. 이 방법에 의하여 폴리뉴클레오티드를 수득하는 공정과 마찬가지로 그렇게 수득된 상기 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에서 더욱 제공된다.
먼저 DNA 폴리뉴클레오티드를 적절한 숙주 세포 내로 삽입하는 것에 의하여 RNA가 수득될 수 있다. 상기 DNA는 임의의 적절한 방법, 예를 들면, 적절한 유전자 전달 비히클(예를 들면, 리포좀, 플라스미드 또는 벡터)의 사용에 의하거나 또는 전기천공에 의하여 유도될 수 있다. 상기 세포가 복제되고 그리고 상기 DNA가 RNA 내로 전사되는 경우; 계속해서 상기 RNA는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 방법, 예를 들면, 상기 문헌 Sambrook et al. (1989)에서 규정된 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌 Sambrook et al. (1989)에서 규정된 절차들에 따라 여러 용균효소(lytic enzyme) 또는 화학용액들을 사용하여 mRNA가 단리되거나 또는 제조업자들에 의하여 제공된 수반되는 지시들에 따fms 핵산-결합 수지들에 의하여 추출될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에 대한 시퀀스 상보성(complementarity) 또는 동종성을 나타내는 폴리뉴클레오티드가 혼성화 탐침으로서 또는 본 명세서에서 동정된 특정의 폴리뉴클레오티드의 등가물로서 유용하다. 상기 전사물의 전장 코딩 시퀀스(full coding sequence)가 공지되어 있기 때문에, 이 시퀀스 또는 동종의 시퀀스들의 임의의 부분이 본 발명의 방법들에서 사용될 수 있다.
"완전하게 매칭된(perfectly matched)" 탐침은 특정의 혼성화에 대하여 요구되지 않는다는 것이 당해 기술분야에서는 공지되어 있다. 작은 수의 염기들의 치환(substitution), 탈락(deletion) 또는 삽입(insertion)에 의하여 성취되는 탐침 시퀀스에서의 소폭 변화(minor changes)가 혼성화 특이성(hybridization specificity)에 영향을 주지는 않는다. 일반적으로 20%까지의 염기-쌍 미스매치(base-pair mismatch)(적절하게 정렬된 경우)는 용인될 수 있다. 바람직하게는, 앞서 언급한 mRNA를 검출하는 데 유용한 탐침은 상기 동종성 영역에 적어도 약 80% 동등하다. 보다 바람직하게는, 상기 탐침은 상기 동종성 영역의 정렬 이후의 대응하는 유전자 시퀀스에 대하여 85% 동일하거나; 심지어 보다 바람직하게는 이는 90% 동종성을 나타낸다.
이들 탐침들은 이들 세포들을 포함하는 여러 세포들 또는 조직들을 검출하거나, 예후하거나(prognose), 진단하거나(diagnose) 또는 감시(monitor)하기 위하여 방사성 분석(radioassays ; 예를 들면, 사우던 및 노던 블럿 분석(Southern and Northern blot analysis)에서 사용될 수 있다. 상기 탐침은 또한 고체 지지체 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 대응하는 유전자의 발현을 검출하기 위한 고출력 스크리닝 분석(high throughput screening assays)에서 사용하기 위한 칩(chip) 등과 같은 어레이(array)에 부착될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 고출력 스크린에서 사용하기 위한 고체 지지체에 부착된, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 등가물 또는 이의 보체 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이에 대응하는 탐침을 제공한다.
단편의 총 크기와 마찬가지로 상기 상보적 스트레치(complementary stretches)의 크기는 특정한 핵산 단편의 목적하는 용도 또는 응용예에 의존적이다. 보다 작은 단편은 일반적으로 혼성화 구체예들에서 용도를 발견할 수 있으며, 여기에서 상기 상보적 영역(complementary region)의 길이는 적어도 5 내지 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 심지어 검출하기를 원하는 상보적 시퀀스에 따른 전장(full length) 등과 같이 변할 수 있다.
길이에 있어서 5 내지 10개의 뉴클레오티드 보다 더 큰 스트레치에 걸친 상보적 시퀀스를 갖는 뉴클레오티드 탐침이 일반적으로 바람직하며, 그에 따라 혼성체(hybrid)의 안정성 및 선택성을 증가시키고 그리고 그에 의하여 수득된 특정의 혼성체 분자의 특이성을 개선시키도록 한다. 보다 바람직하게는, 길이에 있어서 10 또는 그 이상 또는 50개 이상 또는 심지어 원하는 경우 더 긴 뉴클레오티드의 유전자-상보적 스트레치들을 갖는 폴리뉴클레오티드를 설계할 수 있다. 이러한 단편들은, 예를 들면, 화학적 수단에 의하여 상기 단편을 직접적으로 합성하는 것에 의하거나, 미합중국 특허 제4,603,102호에서 기술된 바와 같은 2개의 시동 올리고뉴클레오티드(priming oligonucleotides)를 수반하는 중합효소연쇄반응 등과 같은 핵산 재생산기술의 적용에 의하거나, 또는 재조합 생산을 위한 재조합 벡터 내로 선택된 시퀀스를 도입하는 것에 의하여 쉽게 제조될 수 있다. 하나의 관점에 있어서, 탐침은 약 50 내지 75개 또는 달리 50 내지 100개의 뉴클레오티드의 길이이다.
본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 기술되는 세포들 내에서 발현되는 유전자 또는 유전자 전사물의 검출을 위한 프라이머로서 기능할 수 있다. 이러한 문맥에 있어서, 증폭은 상당한 정확도로 표적 유전자를 복제할 수 있는 프라이머-의존적 중합효소(primer-dependent polymerase)를 사용하는 임의의 방법을 의미한다. 증폭은 T7 DNA 중합효소(T7 DNA polymerase), 대장균 DNA 중합효소의 클레노프 단편(Klenow fragment) 및 역전사 효소(reverse transcriptase) 등과 같은 천연 또는 재조합 DNA-중합효소에 의해 수행될 수 있다. 단지 설명을 위한 목적으로, 프라이머는 탐침에 대하여 동정된 것과 동일한 길이이다.
폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 하나의 방법은 중합효소연쇄반응이고 그리고 중합효소연쇄반응 증폭을 위한 킷트는 상용적으로 획득가능하다. 증폭 후, 그 결과의 DNA 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들면, 아가로스 겔 전기영동에 의하여 그리고 후속하는 브롬화 에티듐 염색(ethidium bromide staining) 및 자외선 조명으로의 가시화(visualization)에 의하여 검출될 수 있다.
세포에의 유전자 전달 벡터 또는 비히클의 유효한 양의 투여를 위한 방법은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지되어 있으며 본 명세서에서 기술된다. 세포 내에서의 유전자 발현을 검출하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, DNA 마이크로어레이(DNA microarrays)로의 혼성화에서와 같은 현장 혼성화(in situ hybridization), 중합효소연쇄반응, RNA 분해효소 보호 분석(RNase protection assays) 및 노던 블럿 분석 등과 같은 기술들이 포함된다. 이러한 방법들은 세포 내에서의 상기 유전자의 발현을 검출하고 그리고 정량하는 데 유용하다. 달리 인코딩된 폴리펩티드의 발현이 여러 방법들에 의하여 검출될 수 있다. 특히, 상기 표적 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들을 제조하는 데 유용하다. 이러한 항체들은 면역조직학(immunohistology), 효소면역분석법(ELISA) 및 웨스턴 블럿팅(Western blotting) 등과 같은 기술들을 사용하여 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포를 가시화시키는 데 유용하다. 이들 기술들은 상기 발현된 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 결정하는 데 사용될 수 있다.
항체 및 이들의 유도체들
본 발명은 또한 본 발명의 상기 방법들에서 사용하기 위한 단리된 폴리펩티드를 결합하거나 및/또는 특이적으로 인식하고 그리고 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 본 명세서에서 기술되는 여러 항체들 중의 임의의 것이 될 수 있으며, 이러한 것들의 비-제한적인 예들에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 베니어드 항체, 다이어바디, 인간화 항체, 항체 유도체, 재조합 인간화 항체 또는 이들 각각의 유도체 또는 단편들이 포함된다. 하나의 관점에 있어서, 상기 단편에는 상기 항체의 상기 CDR을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어진다. 하나의 관점에 있어서, 상기 항체는 직접적으로 표지화되거나 또는 더욱 그에 공액화되는 검출가능한 표지를 포함한다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주가 또한 제공된다. 상기한 구체예들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어지는 조성물들이 본 명세서에서 더욱 제공된다. 상기 항체들 및 단편들의 상기 아미노산 시퀀스를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 마찬가지로 상기 항체 폴리펩티드 및 그의 단편들을 재조합적으로 생산하거나 또는 화학적으로 합성하는 방법들이 또한 제공된다. 상기 항체 폴리펩티드는 진핵세포 또는 원핵세포 내에서 또는 당해 기술분야에서 공지되고 그리고 본 명세서에서 기술된 다른 방법들에 의하여 생산될 수 있다.
항체는 당해 기술분야에서 공지되고 그리고 상기 문헌 내에서 잘 기술된 통상의 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 폴리클로날 항체의 생산에 대하여 여러 방법론들이 존재한다. 예를 들면, 폴리클로날 항체는 전형적으로 닭, 염소, 기니피그, 햄스터, 말, 생쥐, 집쥐 및 토끼 등과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 적절한 포유동물의 면역화에 의하여 생산된다. 항원이 상기 포유동물 내로 주사되고, 이는 상기 항원에 대하여 특이적인 면역글로불린을 생성하는 상기 B-림프구를 유도한다. 면역글로불린은 상기 포유동물의 혈청으로부터 정제될 수 있다. IHFα 및 IHFβ에 특이적인 항체들은 IHFα 및 IHFβ의 서로 다른 에피토프들에 대응하는 폴리펩티드의 주입에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 항체는 IHFα를 위한 TFRPGQKLKSRVENASPKDE(시퀀스 동정 번호 34) 및 IHFβ를 위한 KYVPHFKPGKELRDRANIYG(시퀀스 동정 번호 35) 등과 같은 각 서브유닛의 20개의 아미노산들을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 방법의 변형들에는 최적의 생산 및 상기 동물의 인도적인 처치를 위한 부형제, 투여의 경로 및 자리, 자리 당 주사 용적 및 동물 당 자리들의 수의 변경이 포함된다. 예를 들면, 부형제는 전형적으로 항원에 대한 면역 반응을 개선하거나 또는 강화시키도록 사용된다. 대부분의 부형제들은 주사 자리 항원 저장고(injection site antigen depot)으로 제공되며, 이는 배액림프절(draining lymph nodes) 내로의 항원의 서방출(slow release)을 허용한다. 다른 부형제에는 넓은 표면에 걸친 단백질 항원 분자의 농도 및 동시적으로 분자를 증진시키는 계면활성제가 포함된다. 폴리클로날 항체 생산을 위한 부형제들의 비-제한적인 예들에는 프룬드 부형제(Freund's adjuvants), 리비 부형제 시스템(Ribi adjuvant system) 및 타이터맥스(Titermax)들이 포함된다. 폴리클로날 항체는 당해 기술분야에서 공지되고 그리고 그의 일부가 미합중국 특허 제7,279,559호; 동 제7,119,179호; 동 제7,060,800호; 동 제6,709,659호; 동 제6,656,746호; 동 제6,322,788호; 동 제5,686,073호; 및 동 제5,670,153호들에서 기술된 방법들을 사용하여 생성될 수 있다.
모노클로날 항체는 당해 기술분야에서 공지되고 그리고 상기 문헌에서 잘 기술된 통상의 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 하이브리도마는 적절한 불멸세포주(immortal cell line ; 예를 들면, Sp2/0, Sp2/o-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SSl, Sp2 SA5, U397, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/0) 등, 또는 헤테로골수종(heteromyelomas), 이들의 융합 생성물들, 또는 이들로부터 유도되는 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 당해 기술분야에서 공지된 바와 같은 임의의 다른 적절한 세포주(하기의 웹주소, 예를 들면, atcc.org, lifetech.com.에 있는 것들을 참조하시오, 2007년 11월 26일 최종 접근)들을 단리되거나 또는 복제된 비장(spleen), 말초혈액, 림프, 편도(tonsil), 또는 다른 면역 또는 B세포 함유 세포들, 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 시퀀스들을 발현하는 임의의 다른 세포들, 또는 내인성(endogenous) 또는 이종기원(heterologous)의 핵산으로서, 또는 재조합 또는 내인성으로서, 바이러스, 박테리아, 조류(algal), 원핵세포, 양서류(amphibian), 곤충, 파충류(reptilian), 어류, 포유동물, 설치류, 말(equine), 양(ovine), 염소, 면양(sheep), 영장류, 진핵세포, 유전체 DNA, eDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체(chloroplast) DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일가닥, 이중가닥 또는 삼중가닥, 혼성화된 세포 또는 이들의 임의의 조합 등과 같은 그러나 이들에 제한되지 않는 세포들을 생성하는 항체와 융합시키는 것에 의해 생성된다. 항체 생성 세포들은 또한, 인간 또는 대상의 상기 항원으로 면역화된 다른 적절한 동물들의 말초혈액, 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 수득될 수 있다. 임의의 다른 적절한 숙주 세포가 또한 본 발명의 항체, 이들의 특정화된 단편 또는 변종을 인코딩하는 이종기원 또는 내인성 핵산을 발현하는 데 사용될 수 있다. 선택배양조건(selective culture conditions) 또는 다른 적절한 공지된 방법들을 사용하여 융합된 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포들이 단리되고 그리고 한계희석(limiting dilution) 또는 세포분류(cell sorting) 또는 다른 공지된 방법들에 의하여 복제될 수 있다.
당해 기술분야에서 공지된 방법들을 사용하여 펩티드 또는 단백질 라이브러리(예를 들면, 박테리오파지, 리보좀, 올리고뉴클레오티드, RNA, eDNA 등이나 이들에 제한되지 않는 디스플레이 라이브러리(display library); 예를 들면, 몰포시스(MorphoSys ; 미합중국 델라웨어주 마틴스라이드/플래네그(Martinsreid/Planegg, Del.) 소재), 바이오인벤트(BioInvent ; 스웨덴 룬트(Lund, Sweden) 소재), 어피테크(Affitech ; 노르웨이 오슬로(Oslo, Norway) 소재) 등과 같은 여러 상업적 공급자(commercial vendors)들로부터 획득가능한 것으로서)로부터 재조합 항체를 선택하는 방법을 포함하나 이들에 제한되지 않는, 필요 특이성(requisite specificity)을 갖는 항체를 생산하거나 또는 단리하는 다른 적절한 방법들이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 공지된 방법들이 미합중국 특허 제4,704,692호; 동 제5,723,323호; 동 제5,763,192호; 동 제5,814,476호; 동 제5,817,483호; 동 제5,824,514호; 동 제5,976,862호들을 포함하는 특허 문헌에서 기술되어 있다. 다른 방법들은 당해 기술분야에서 공지되고 및/또는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 인간 항체들의 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환된 동물(예를 들면, SCID 생쥐, 문헌 Nguyen et al. (1977) Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnoi. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunoi. 93: 154-161 참조)의 면역화에 의존하고 있다. 이러한 기술들에는 리보좀 디스플레이(ribosome display ; 문헌 Hanes et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 14130-14135 참조); 단세포 항체 생성 기술(예를 들면, 선택림프구항체법(selected lymphocyte antibody method ; "SLAM" ; 미합중국 특허 제5,627,052호, 문헌 Wen et al. (1987) J. Immunoi. 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93 :7843-7848 참조); 겔마이크로 점 및 유세포게수법(gel micro droplet and flow cytometry ; 문헌 Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass).; Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182: 155-163; 및 Kenny et al. (1995) Bio. Technol. 13:787-790 참조); B-세포 선택법(B-cell selection ; 문헌Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 참조). 들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 그들의 우유(milk)에서 항체들이 생성되는 염소, 소, 말, 양 등과 같은 형질전환 동물 또는 포유동물을 제공하도록 적절한 숙주에 전달하는 것에 의하여 본 발명의 항체 유도체가 또한 제조될 수 있다. 이들 방법들은 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, 미합중국 특허 제5,827,690호; 동 제5,849,992호; 동 제4,873,316호; 동 제5,849,992호; 동 제5,994,616호; 동 제5,565,362호; 및 동 제5,304,489호들에서 기술되었다.
용어 "항체 유도체"는 상기 항체 또는 단편의 선형 폴리펩티드 시퀀스로의 번역후 수정을 포함한다. 예를 들면, 미합중국 특허 제6,602,684 B1호에 전 항체 분자, 항체 단편 또는 강화된 Fc-매개 세포 독성을 갖는 면역글로불린의 상기 Fc 영역에 등가의 영역을 포함하는 융합 단백질 및 그렇게 생성된 당단백질들을 포함하여 항체들의 변성된 글리콜-형태들의 생성을 위한 방법이 기술되어 있다.
본 발명의 상기 항체는 또한 공유적 부착(covalent attachment)가 상기 항체가 항-유전자형 반응(anti-idiotypic response)을 생성하는 것을 방해하지 않도록 하는 방법으로의 임의의 형태의 분자의 상기 항체로의 공유적 부착에 의해 변성된 유도체들을 포함한다. 항체 유도체들에는 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화(amidation), 공지의 보호/차단기(protecting/blocking groups), 단백질가수분해적 개열(proteolytic cleavage), 세포상 리간드 또는 다른 단백즐에의 연결 등에 의하여 변성되는 항체들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 게다가, 상기 유도체들은 하나 또는 그 이상의 비-고전적인 아미노산(non-classical amino acids)들 중의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
형질전환 식물 및 배양된 식물 세포(예를 들면, 담배, 옥수수(maize) 및 좀개구리밥(duckweed)들, 이들에 제한되는 것은 아님)를 제공하도록 전달하여 이들로부터 배양된 식물 부분들 내 또는 세포들 내에서 이러한 항체, 특정화된 단백질 또는 변종을 생성하도록 하는 것에 의하여 항체 유도체들이 또한 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 및 그 안에 언급된 문헌들은, 예를 들면, 유도 프로모터(inducible promoter)를 사용하여 대량의 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 담뱃잎의 생산을 기술하고 있다. 다른 재조합 시스템 생산되거나 또는 천연의 공급원으로부터 정제된 것들에 대해 등가의 생물학적 활성도를 갖는 상용적인 생산 수준으로 포유동물 단백질을 발현하는 데 형질전환된 옥수수가 사용되었다. 예를 들면, 문헌 Hood et al. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 및 그 안에 언급된 문헌들을 참조하시오. 담배씨(tobacco seeds) 및 감자 괴경(potato tubers)을 포함하여 단쇄 항체(single chain antibodies ; scFv's) 등과 같은 항체 단편을 포함하는 형질전환된 식물의 씨로부터 항체 유도체가 대량으로 생성되었다. 예를 들면, 문헌 Conrad et al.(1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 및 그 안에 언급된 문헌들을 참조하시오. 따라서, 공지된 방법에 따라 형질전환된 식물을 사용하여 항체들이 또한 생성될 수 있다.
예를 들면, 외인성 시퀀스를 첨가하여 면역원성을 변경시키거나 또는 결합(binding), 친화성, 온율(on-rate), 오프율(off-rate), 결합활성(avidity), 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적절한 특성들을 변경시키는 것에 의하여 항체 유도체들이 또한 생산될 수 있다. 일반적으로 상기 가변영역 및 불변영역의 상기 비-인간 시퀀스들이 인간 또는 다른 아미노산들로 치환되는 동안 상기 비-인간 또는 인간 CDR 시퀀스의 일부 또는 전부가 유지된다.
일반적으로, 상기 CDR 잔기들은 직접적으로 그리고 거의 실질적으로 항원 결합에 영향을 준다. 인간화(humanization)되거나 또는 가공된(engineering) 항체들은 미합중국 특허 제5,723,323호; 동 제5,976,862호; 동 제5,824,514호; 동 제5,817,483호; 동 제5,814,476호; 동 제5,763,192호; 동 제5,723,323호; 동 제5,766,886; 동 제5,714,352호; 동 제6,204,023호; 동 제6,180,370호; 동 제5,693,762호; 동 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,225,539호; 및 동 제4,816,567호에서 기술된 것과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 임의의 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 키메라, 인간화 또는 영장류화(primatized) 항체들은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조된 기준 모노클로날 항체의 시퀀스에 기초하여 제조될 수 있다. 상기 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-기준(예를 들면, 인간) 면역글로불린 시퀀스를 포함하는 대상이나 포함하도록 가공된 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위하여, 당해 기술분야에서 공지된 방법(미합중국 특허 제4,816,567호)을 사용하여 상기 쥣과 동물의 가변영역들을 인간 불변영역에 연결시킬 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위하여, 당해 기술분야에서 공지된 방법(미합중국 특허 제5,225,539호 및 동 제5,530,101호; 동 제5,585,089호; 동 제5,693,762호 및 동 제6,180,370호)을 사용하여 상기 쥣과의 CDR 영역을 인간 프레임워크 내로 삽입시킬 수 있다. 유사하게, 영장류화 항체를 생성하기 위하여, 당해 기술분양서 공지된 방법(국제공개특허 제WO 93102108호 및 동 제WO 99/55369호)을 사용하여 쥣과의 CDR 영역이 영장류 프레임워크 내로 삽입될 수 있다.
부분적으로 내지 완전히 인간 항체를 만들기 위한 기술들은 당해 기술분야에서 공지되어 있고 그리고 임의의 그러한 기술들이 사용될 수 있다. 하나의 구체예에 따르면, 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 가공된 형질전환 생쥐에서 완전한 인간 항체 시퀀스가 만들어진다. 서로 다른 클래스의 항체들을 생성할 수 있는 이러한 형질전환 생쥐들의 다중 스트레인들이 만들어졌다. 원하는 항체를 생산하는 형질전환 생쥐로부터의 B세포가 융합되어 상기 원하는 항체의 연속적인 생산을 위한 하이브리도마 세포주를 만들 수 있다. (예를 들면, 문헌들 Russel et al. (2000) Infection and Immunity April 2000:1820-1826; Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540; Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23; Yang et al. (1999A) J. of Leukocyte Biology 66:401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6):1236-1243; Jakobovits (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42; Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614; Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421; Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14); Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Jakobovits (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566; Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307; Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763; Arbones et al. (1994) Immunity 1(4):247-260; Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258; Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555; 및 미합중국 특허 제6,075,181호를 참조하시오)
본 발명의 상기 항체는 또한 키메라 항체를 생성하도록 변형될 수 있다. 키메라 항체는 상기 항체들의 중쇄 및 경쇄들의 여러 도메인들이 하나의 종 이상으로부터의 DNA에 의하여 코딩되는 것들이다. 예를 들면, 미합중국 특허 제4,816,567호를 참조하시오.
달리, 본 발명의 상기 항체는 또한 베니어드 항체를 생성하도록 변형될 수 있다. 베니어드 항체는 하나의 종의 상기 항체의 외부 아미노산 잔기가 제2의 종들로 주의깊게 대체되거나 또는 "베니어드(veneered ; 덧대어짐)"되어 상기 제1의 종의 상기 항체가 상기 제2의 종 내에서 면역원성이 되지 않도록 하고 그에 의하여 상기 항체의 면역원성을 감소시키도록 한다. 단백질의 항원성이 일차적으로 그의 표면의 속성에 의존적이기 때문에, 다른 포유동물 종 항체에서 일반적으로 발견되는 것과는 다른 노출된 잔기를 치환하는 것에 의하여 항체의 면역원성이 감소될 수 있다. 외부 잔기의 이러한 주의깊은 치환은 내부 도메인에 대하여 또는 도메인간 접촉(interdomain contacts)에 대하여 거의 영향이 없거나 또는 전혀 영향이 없어야 한다. 따라서, 리간드 결합 특성은 가변영역 프레임워크 잔기로 한정되는 변경의 결과로서 영향을 받지 않아야 한다. 단지 상기 항체의 외부 표면 또는 피부(skin)가 변경되고, 지지하는 잔기(supporting residues)가 방해받지 않고 잔류하기 때문에 이러한 공정은 "베니어링(veneering ; 덧댐)"으로 언급된다.
"덧댐"을 위한 절차는 문헌 Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health에 의해 편집된 인간 항체 가변영역에 대한 획득가능한 시퀀스 데이터, 이 데이터베이스의 업데이트 및 다른 접근가능한 미합중국 및 외국의 데이터베이스(둘 다 핵산 및 단백질)을 이용한다. 베니어드 항체들을 생성하는 데 사용된 상기 방법들의 비제한적인 예들에는 유럽특허 제EP 519596호; 미합중국 특허 제6,797,492호들이 포함되며, 또한 문헌 Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498에 기술된다.
용어 "항체 유도체"는 또한 2개의 항원-결합 자리를 갖는 작은 항체 단편인 "다이어바디"를 포함하며, 여기에서 단편은 동일한 폴리펩티드쇄 내에서 경쇄가변영역(VL)에 연결된 중쇄가변영역(VH)을 포함한다. (예를 들면, 유럽특허 제EP 404,097호; 국제공개특허공보 제WO 93/11161호; 및 문헌 Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448을 참조하시오) 동일한 쇄 상의 2개의 도메인들 사이의 짝지음(pairing)을 허용하기에는 너무 짧은 연결체를 사용하는 것에 의하여, 상기 도메인들은 다른 쇄 상의 상보적 도메인들과 짝지어져서 2개의 항원-결합 자리들을 생성하도록 강요된다. (또한, 부모 항체의 초가변영역(hypervariable region) 내로 삽입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 및 상기 항원에 대한 상기 부모 항체의 결합 친화성 보다 적어도 약 2배 더 강한 표적 항원에 대한 결합 친화성(binding affinity)을 갖는 항체 변종들을 기술하는, 첸(Chen)과 그의 동료들에 허여된 미합중국 특허 제6,632,926호를 참조하시오)
용어 "항체 유도체"는 scFv, dAbs, 나노바디(nanobodies), 미니바디(minibodies), 유니바디(Unibodies) 및 어피바디(Affibodies ; 문헌 Holliger & Hudson (2005) Nature Biotech 23(9): 1126-36; 미합중국 공개특허 제US 200610211088호; 국제공개특허 제W020071059782호; 미합중국 특허 제5,831,012호) 등과 같은 가공된 항체 분자, 단편 및 단일 도메인들이 더 포함된다.
용어 "항체 유도체"는 "선형 항체(linear antibodies)"를 더 포함한다. 선형 항체를 제조하기 위한 절차는 당해 기술분야에서 공지되어 있으며, 문헌 Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062에 기술되어 있다. 간략하게, 이들 항체들은 한 쌍의 항원결합영역들을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 세그먼트(tandem Fd segments ; VH-CH1-VH-CH1)를 포함한다. 선형 항체들은 양특이성 또는 단특이성(monospecific)이 될 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 단백질 A 정제(protein A purification), 황산암모늄 또는 에탄올 침강(ammonium sulfate or ethanol precipitation), 산 추출(acid extraction), 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피(anion or cation exchange chromatography), 포스포셀룰로오스 크로마토그래피(phosphocellulose chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxylapatite chromatography) 및 렉틴 크로마토그래피(lectin chromatography)를 포함하나 이들에 제한되지 않는 공지의 방법들에 의하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 그리고 정제될 수 있다. 고성능 액체크로마토그래피가 또한 정제를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체에는, 예를 들면, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포들을 포함하는 진핵 숙주로부터 또는 달리 앞서 기술한 바와 같은 원핵 숙주로부터 천연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물 및 재조합 기술에 의하여 생성된 생성물들이 포함된다. 다수의 항체 생산 시스템들이 문헌 Birch & Radner (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58: 671-685에 기술되어 있다.
시험되는 항체가 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 경우, 계속해서 시험되는 상기 항체 및 본 발명에 의하여 제공되는 상기항체들은 등가이다. 과도한 실험 없이, 상기 항체가 정상적으로 반응하는 단백질 또는 폴리펩티드를 본 발명의 항체가 결합하는 것을 시험되는 항체가 방해하는 지의 여부를 결정하는 것에 의하여 어느 항체가 본 발명의 상기 항체와 동일한 특이성을 갖는 지의 여부를 결정하는 것이 또한 가능하다. 본 발명의 상기 모노클로날 항체에 의하여 결합에서의 감소로 나타나는 바와 같이 시험되는 상기 항체가 본 발명의 상기 항체와 경쟁하는 경우, 계속해서 상기 2개의 항체들은 동일하거나 또는 긴밀하게 연관되는 에피토프와 결합할 가능성이 있다. 달리, 본 발명의 상기 항체를 그와 정상적으로 반응하는 단백질과 함께 사전배양하고 그리고 시험되는 상기 항체가 상기 항원에 결합하는 그의 능력을 저해하는 지의 여부를 결정할 수 있다. 만일 시험되는 상기 항체가 저해되는 경우, 십중팔구, 이는 본 발명의 상기 항체와 동일하거나 또는 긴밀하게 연관되는 에피토프 특이성을 갖는다.
용어 "항체"는 또한 모든 면역글로불린 아이소타입 및 서브클래스의 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 모노클로날 항체의 특정한 아이소타입은 초기 융합으로부터 선택하는 것에 의하여 직접적으로, 또는 문헌 Steplewski et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653 또는 Spira et al. (1984) J. Immunol. Methods 74:307에서 기술된 절차를 사용하여 클래스 스위치 변종들을 단리시키는 친계 선발(sib selection) 기술을 이용하는 것에 의하여 서로 다른 아이소타입의 모노클로날 항체를 분비하는 부모 하이브리도마로부터 2차적으로 제조될 수 있다. 달리, 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 상기 모노클로날 항체의 상기 특이성을 갖는 다른 모노클로날 항체의 단리는 또한 항-유전자형 항체들을 생성하는 것에 의하여 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의하여 수행될 수 있다. 문헌 Herlyn et al. (1986) Science 232: 100을 참조하시오. 항-유전자형 항체는 대상의 상기 모노클로날 항체 상에 존재하는 독특한 결정기를 인식하는 항체이다.
본 발명의 일부 관점들에 있어서, 상기 항체를 검출가능하거나 또는 치료학적으로 표지하는 것이 유용할 수 있다. 적절한 표지들은 위에서 기술되어 있다. 이들 시약들에 항체들을 공액화시키는 방법들은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 단지 설명의 목적을 위하여, 항체는 방사성 원자, 발색단(chromophore), 형광단 등과같은 검출가능한 부분으로 표지될 수 있다. 이러한 표지된 항체는 생체 내 또는 단리된 시험 샘플 내 둘 다에서 진단기술에 사용될 수 있다. 항체의 저분자량 햅텐(haptens)에의 항체의 결합은 분석에서의 상기 항체의 민감도를 증가시킬 수 있다. 계속해서 상기 햅텐은 2차반응의 수단에 의하여 특이적으로 검출될 수 있다. 예를 들면, 아비딘과 반응하는 비오틴 또는 디니트로페놀, 피리독살 및 특이적 항-햅텐 항체와 반응할 수 있는 플루오레세인 등과 같은 햅텐을 사용하는 것은 통상적인 것이다. 상기 문헌 Harlow and Lane (1988)을 참조하시오.
본 발명의 상기 항체의 상기 가변영역은 상기 항체의 하나 또는 그 이상의 결합 특성(예를 들면, 친화성)들을 개선시키기 위하여 상기 VH 및/또는 VL CDR 1, CDR 2 및/또는 CDR 3 영역들 내의 아미노산 잔기들을 돌연변이시키는 것에 의하여 변형될 수 있다. 자리-지향적 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 또는 중합효소연쇄반응-매개 돌연변이유발에 의해 돌연변이들이 도입될 수 있고, 그리고 항체 결합 또는 대상의 다른 기능적 특성에 대한 효과가 적절한 시험관 내 또는 생체 내 분석에 평가될 수 있다. 바람직하게는 보존적 변형들이 도입되고 그리고 전형적으로 CDR 영역 내의 하나 이상, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개 이하의 잔기들이 변경된다. 돌연변이는 아미노산 치환(substitutions), 부가(additions) 또는 탈락(deletions)이 될 수 있다.
예를 들면, 하나 또는 그 이상의 프레임워크 잔기들을 대응하는 생식세포계 시퀀스로 "복귀돌연변이(backmutating)"시키는 것에 의하여 면역원성을 감소시키도록 상기 항체에 대하여 프레임워크 변형이 이루어질 수 있다.
게다가, 본 발명의 상기 항체는 혈청 반감기, 보체고정(complement fixation), Fc 수용기 결합 및/또는 항원-의존성 세포상 세포독성(antigen-dependent cellular cytotoxicity) 등과 같은 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 특성을변경하도록 상기 Fc 영역 내의 변형을 포함하도록 본 발명의 항체가 가공될 수 있다. 이러한 변경에는 상기 경쇄 및 중쇄의 조립(assembly)을 용이하게 하기 위하여 또는 상기 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위하여 힌지 영역(hinge region) 내의 시스테인 잔기의 수를 변경하는 것(미합중국 특허 제5,677,425호); 및 상기 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위하여 상기 Fc 힌지 영역 내의 아미노산 돌연변이(미합중국 특허 제6,165,745호)가 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
게다가, 본 발명의 상기 항체는 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 항원에 대한 상기 항체의 친화성을증가시키기 위하여 상기 항체 시퀀스 내의 글리코실화의 하나 또는 그 이상의 자리들을 변형시키는 것에 의하여 항체의 글리코실화를 변경시킬 수 있다(미합중국 특허 제5,714,350호 및 동 제6,350,861호). 달리, 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 증가시키기 위하여, 변경된 글리코실화 메카니즘을 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시키는 것에 의하여 감소된 양의 푸코실(fucosyl) 잔기를 갖는 하이포푸코실화된 항체(hypofucosylated antibody) 또는 증가된 2등분 GlcNac 구조(bisecting GlcNac structures)를 갖는 항체가 수득될 수 있다(문헌들 Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180을 참조하시오).
본 발명의 상기 항체는 하나 또는 그 이상의 PEG기들이 상기 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건들 하에서 상기 항체 또는 그의 단편을 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol ; PEG) 또는 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시키는 것에 의하여 페길화되어 생물학적 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응(acylation reaction) 또는 알킬화 반응(alkylation reaction)에 의하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌글리콜"은 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜-말레이미드(polyethylene glycol-maleimide) 등과 같이 다른 단백질로 유도체화하는 데 사용되는 PEG의 임의의 형태들을 포함하는 것으로 의도된다. 페길화될 상기 항체는 글리코실화된 항체(aglycosylated antibody)가 될 수 있다. 단백질을 페길화하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 공지이며, 본 발명의 상기 항체에 적용될 수 있다(유럽특허 제EP 0 154 316호 및 동 제EP 0401 384호).
게다가, 그 결과의 분자의 반감기를 증가시키기 위하여 인간 혈청 알부민 등과 같은 혈청 단백질에 상기 항체의 항원결합영역을 공액화시키거나 또는 융합시키는 것에 의하여 항체가 화학적으로 변성될 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들면 유럽특허 제EP 0322094호 및 동 제EP 0 486 525호에 기술되어 있다.
본 발명의 상기 항체 또는 그의 단편은 진단시약(diagnostic agent)와 공액화되고 그리고 진단학적으로, 예를 들면, 질병의 발달(development) 또는 진전(progression)을 감시하고 그리고 주어진 치료 요법(treatment regimen)의 효능을 결정하는 데 사용될 수 있다. 진단시약의 예들에는 효소, 보결분자단(prosthetic groups), 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성물질, 여러 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomographies)을 이용하는 양전자 방출 금속(positron emitting metals) 및 비방사성 상자성 금속 이온(nonradioactive paramagnetic metal ions)들이 포함된다. 상기 검출가능한 재료는 상기 항체 또는 그의 단편에 직접적으로 또는 당해 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 연결체를 통하여 간접적으로 결합되거나 또는 공액화될 수 있다. 적절한 효소의 예들에는 고추냉이과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산가수분해효소, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)들이 포함된다. 적절한 보결분자단 복합체에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴들이 포함된다. 적절한 형광물질의 예들에는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 댄실 염화물(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin) 들이 포함된다. 발광물질의 예에는 루미놀(luminol)이 포함된다. 생물발광물질의 예들에는 루시퍼라아제, 루시페린(luciferin) 및 에쿼린들이 포함된다. 적절한 방사성물질의 예들에는 125I, 131I, 인듐-111(Indium-1ll), 루테튬-171(Lutetium-171), 비스무트-212(Bismuth-212), 비스무트-213, 아스타틴-211(Astatine-211), 동-62, 동-64, 동-67, 이트륨-90(Yttrium-90), 요오드-125(Iodine-125), 요오드-131, 인-32(Phosphorus-32), 인-33, 스칸듐-47(Scandium-47), 은-111(Silver-1ll), 갈륨-67(Gallium-67), 프라세오디뮴-142(Praseodymium-142), 사마륨-153(Samarium-153), 테르븀-161(Terbium-161), 디스프로슘-166(Dysprosium-166), 홀뮴-166(Holmium-166), 레늄-186(Rhenium-186), 레늄-188, 레늄-189, 연-212(Lead-212), 라듐-223(Radium-223), 악티늄-225(Actinium-225), 철-59(Iron-59), 셀레늄-75(Selenium-75), 비소-77(Arsenic-77), 스트론튬-89(Strontium-89), 몰리브덴-99(Molybdenum-99), 로듐-105(Rhodium-105), 팔라듐-109(Palladium-109), 프라세오디뮴-143(Praseodymium-143), 프로메튬-149(Promethium-149), 에르븀-169(Erbium-169), 이리듐-194(Iridium-194), 금-198(Gold-198), 금-199 및 연-211들이 포함된다. 모노클로날 항체는 상기 항체에 공유적으로 결합되는 이관능성 킬레이트화제(bifunctional chelating agents)의 사용을 통하여 방사성금속 이온과 간접적으로 공액화될 수 있다. 킬레이트화제는 아민(문헌 Meares et al., 1984 Anal. Biochem. 142: 68-78 참조); 아미노산 잔기의 설프히드릴기(sulfhydral groups ; 문헌 Koyama 1994 Chern. Abstr. 120: 217262t 참조) 및 카르보하이드레이트기(carbohydrate groups ; 문헌들 Rodwell et al. 1986 PNAS USA 83: 2632-2636; Quadri et al. 1993 Nucl. Med. Biol. 20: 559-570 참조)을 통하여 부착될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 상기 항체 또는 그의 단편은 치료제에 공액화될 수 있다. 적절한 치료제들에는 택솔(taxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 브롬화 에티움(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디히드록시안트라센디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디히드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로포라놀올(propranolol) 및 푸로마이신(puromycin), 대사길항물질(antimetabolites ; 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 플루다라빈(fludarabin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 디카바진(decarbazine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 아스파라기나아제(asparaginase), 젬시타빈(gemcitabine), 클라드리빈(cladribine) 등과 같은), 알킬화제(메클로르에타민(mechlorethamine), 티오에파(thioepa), 클로르암부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카무스틴(carmustine ; BSNU), 로무스틴(lomustine ; CCNU), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 다카바진(dacarbazine ; DTIC), 프로카바진(procarbazine), 미토마이신 C(mitomycin C), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin) 등과 같은 다른 백금 유도체(platinum derivatives)), 항생제(닥티노마이신(dactinomycin ; 이전의 악티노마이신), 블레오마이신(bleomycin), 다우노루비신(이전의 다우노마이신(daunomycin)), 독소루비신, 이다루비신(idarubicin), 미트라마이신, 미토마이신, 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 안트라마이신(anthramycin ; AMC) 등과 같은), 디프테리아 독소(diphtheria toxin) 및 연관된 분자(디프테리아 A쇄(diphtheria A chain) 및 그의 활성 단편 및 하이브리드 분자 등과 같은), 리신 독소(ricin toxin ; 리신 A(ricin A) 또는 탈글리코실화 리신 A쇄 독소(deglycosylated ricin A chain toxin) 등과 같은), 콜레라 독소(cholera toxin), 시가-양 독소(Shiga-like toxin ; SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT 독소(LT toxin), C3 독소(C3 toxin), 시가 독소(Shiga toxin), 백일해 독소(pertussis toxin), 파상풍 독소(tetanus toxin), 대두 바우만-버크 단백질분해효소 저해제(soybean Bowman-Birk protease inhibitor), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 알로린(alorin), 사포린(saporin), 모덱신(modeccin), 젤라닌(gelanin), 아브린 A쇄(abrin A chain), 모덱신 A쇄(modeccin A chain), 알파-사르신(alpha-sarcin), 유동나무 단백질(Aleurites fordii proteins), 디안틴 단백질(dianthin proteins), 미국자리공 단백질(Phytolacca americana proteins ; PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 저해제(momordica charantia inhibitor), 쿠르친(curcin), 크로틴(crotin), 사포나리아 오피시날리스 저해제(sapaonaria officinalis inhibitor), 젤라닌, 미토젤린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신 독소(enomycin toxins) 및 혼합 독소(mixed toxins) 들이 포함된다.
별도의 적절한 공액화된 분자들에는 RNA 분해효소(ribonuclease ; RNase), DNA 분해효소 I(DNase I), 항감작 핵산(antisense nucleic acid), siRNA 분자 등과 같은 저해성 RNA 분자(inhibitory RNA molecule), 면역자극 핵산(immunostimulatory nucleic acid), 압타머(aptamers), 리보자임, 3중 형성 분자(triplex forming molecules) 및 외부 안내 시퀀스(external guide sequences) 들이 포함된다. 압타머는 가지와 고리 모양(stem-loops) 또는 G-쿼테트(G-quartets) 등과 같은 한정된 2차 및 3차 구조로 절첩된, 길이에 있어서 15 내지 50개의 염기들의 범위의 작은 핵산이며, 역전사 효소(미합중국 특허 제5,786,462호) 및 트롬빈(thrombin ; 미합중국 특허 제5,543,293호) 등과 같은 대분자와 마찬가지로 ATP(미합중국 특허 제5,631,146호) 및 테오필린(theophiline ; 미합중국 특허 제5,580,737호) 등과 같은 소분자들과 결합할 수 있다. 리보자임은 분자간 또는 분자내 화학반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 후속하는 개열을 통하여 핵산 기질을 개열시킨다. 3중 형성 기능 핵산 분자(triplex forming function nucleic acid molecules)는 3중구조(triplex)를 형성하는 것에 의하여 이중-가닥 또는 단일 가닥 핵산과 상호작용할 수 있으며, 여기에서 DNA의 3개의 가닥들은 왓슨-크릭 및 후그스틴 염기-쌍짓기(Hoogsteen base-pairing) 둘 다에 따라 복합체를 형성한다. 3중 분자(triplex molecules)는 높은 친화성 및 특이성으로 표적 영역과 결합할 수 있다.
기능성 핵산 분자는 표적 분자가 보유하는 특정의 활성의 효과기, 저해제, 조절제(modulators) 및 자극제(stimulators)로서 작용할 수 있거나, 또는 상기 기능성 핵산 분자는 임의의 다른 분자들과 무관한 새로운 활성을 보유할 수 있다. 상기 치료제는 직접적으로 또는 임의의 다수의 획득가능한 방법들을 사용하여 간접적으로 상기 항체에 연결될 수 있다. 예를 들면, N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinyl 3-(2-pyridyldithio )proprionate ; SPDP)를 사용하는 디술피드 결합 형성(disulfide bond formation)을 통하거나 또는 상기 항체의 상기 Fc 영역 내의 카르보하이드레이트 부분(carbohydrate moiety)을 통하여(문헌들 Yu et al. 1994 Int. J. Cancer 56: 244; Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)을 참조)를 통하여 감소된 항체 성분의 상기 힌지 영역에 부착될 수 있다.
치료제를 항체에 공액화시키기 위한 기술들은 공지되어 있다(문헌들 Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al . (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" 1982 Immunoi. Rev. 62: 119-58을 참조하시오).
본 발명의 상기 항체 또는 그의 항원-결합 영역은 다른 항체 또는 수용기에 대한 리간드에 연결되어 적어도 2개 또는 그 이상의 서로 다른 결합 자리 또는 표적 분자들에 결합하는 양-특이성 또는 다-특이성 분자를 생성할 수 있다. 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 미메틱(binding mimetic) 등과 같은 하나 또는 그 이상의 다른 결합 분자에의 상기 항체의 연결은, 예를 들면, 화학적 결합, 유전적 융합 또는 비공유적 화합에 의하여 수행될 수 있다. 다-특이성 분자는 제1 표적 에피토프 및 제2 표적 에피토프에 더해 제3의 결합 특이성을 더욱 포함할 수 있다.
양-특이성 및 다-특이성 분자는 당해 기술분야에서 공지된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 양-특이성 분자의 각 결합 유닛은 별도로 생성되고 그리고 계속해서 다른 하나에 공액화될 수 있다. 상기 결합 분자가 단백질 또는 펩티드인 경우, 공유적 공액화(covalent conjugation)를 위하여 다양한 결합제 또는 가교화제(cross-linking agents)가 사용될 수 있다. 가교화제의 예들에는 단백질 A, 카르보디이미드(carbodiimide), N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate ; SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산(5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid ; DTNB), o-페닐렌디말레이미드(o-phenylenedimaleimide ; oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate ; SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이디도메틸) 사이클로헥산-I-카르복실레이트(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohaxane-I-carboxylate ; sulfo-SMCC)(문헌들 Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., 1985 Proc. NatI. Acad. Sci. USA 82:8648 참조)들이 포함된다. 상기 결합 분자가 항체인 경우, 이들은 상기 2개의 중쇄들의 C-말단 힌지 영역들의 설프히드릴 결합에 의하여 공액화될 수 있다.
본 발명의 상기 항체 또는 그의 단편은 상기 항체가 결합되어 "파괴(depleting)" 항체를 형성하는 세포에 대하여 독성인 부분에 연결될 수 있다. 이들 항체들은 NK 세포를 파괴하기를 원하는 응용예에서 특히 유용하다. 본 발명의 상기 항체는 또한 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이들은 특히 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 유용하다. 이러한 고체 지지체들에는 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리염화비닐 또는 폴리프로필렌들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체는 또한 많은 서로 다른 담체들에 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 항체 및 활성이거나 비활성인 다른 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 잘 알려진 담체의 예들에는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변성 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트들이 포함된다. 상기 담체의 속성은 본 발명의 목적을 위하여 가용성이거나 또는 불용성이 될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들은 모노클로날 항체를 결합하기 위한 다른 적절한 담체를 알 수 있거나 또는 반복되는 실험을 사용하여 그러한 것을 알아낼 수 있을 것이다.
수지상세포를 포함하는 APCs 의 단리, 배양 및 확장
본 발명은 또한 본 발명의 하나 또는 그 이상의 단리된 폴리펩티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 하나의 관점에 있어서, 상기 단리된 숙주 세포는 항원제공세포(APC), 예를 들면, 수지상세포 등과 같은 진핵세포이다. 다른 관점에 있어서, 상기 단리된 숙주 세포는 원핵세포이다. 하나의 관점에 있어서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 촉진하는 조건들 하에서 배양된 단리된 숙주 세포이다. 본 발명은 또한 상기 숙주 세포, 발현 시스템 및 상기 발현 시스템에 의하여 생산된 폴리펩티드를 제공한다.
이하는 APC의 단리를 위한 2가지의 기본적인 접근법의 간략한 설명이다. 이들 접근법들은 (1) 혈액으로부터 골수 전구체 세포(bone marrow precursor cells ; CD34+)를 단리시키고, 이를 APC로 분화시키는 것 또는 (2) 말초혈액으로부터 선처리된 APC(precommitted APC)를 수집하는 것을 포함한다. 상기 첫 번째의 접근법에서, 환자는 GM-CSF 등과 같은 사이토카인으로 처리하여 말초혈액 내에서 순환하는 CD34+ 줄기세포의 수를 촉진하여야 한다.
APCs를 단리하기 위한 상기 두 번째의 접근법은 이미 상기 혈액 내에서 순환하는 상대적으로 큰 수의 선처리된 APCs를 수집하는 것이다. 인간 말초혈액으로부터 처리된 APCs(committed APCs)를 단리하기 위한 선행하는 기술에는 메트리즈아미드 경사(metrizamide gradients)와 고착/비고착 단계(adherence/nonadherence steps)(문헌 ; Freudenthal et al. (1990) PNAS 87:7698-7702 참조); 퍼콜경사 분리(Percoll gradient separations)(문헌 Mehta-Damani et al. (1994) J. Immunol. 153:996-1003 참조); 및 형광 활성화 세포 분류기술(fluorescence activated cell sorting techniques)(문헌 Thomas et al. (1993) J. Immunol. 151:6840-52 참조) 등과 같은 물리적인 절차들의 조합이 연관된다.
다량의 세포를 다른 하나로부터 분리하기 위한 하나의 기술은 향류 원심분리 분급(countercurrent centrifugal elutriation ; CCE)으로 알려진 것이다. 세포 샘플은 특정한 분급 회전자(elutriation rotor) 내에 위치된다. 계속해서, 상기 회전자는 예를 들면 3000rpm의 일정 속도로 회전된다. 일단 상기 회전자가 원하는 속도에 도달하면, 가압된 공기가 세포의 흐름속도(flow rate)를 제어하는 데 사용된다. 분급기(elutriator) 내의 세포는 동시적인 원심분리와 흐름속도에서 일정하게 증가하는 완충제의 세척제거 흐름(washout stream)에 적용된다. 이는 절대적은 아니지만 세포 크기에서의 차이에 대해 크게 기초하는 부분적인 세포 분리의 결과를 가져온다.
본 발명의 하나의 관점에 있어서, 상기 APC는 쥣과의 동물, 유인원 또는 인간 등과 같은 포유동물의 백혈구 분획으로부터 단리될 수 있는 선처리되거나 도는 성숙한 수지상세포이다(예를 들면, 국제공개특허 제WO 96/23060호를 참조하시오). 상기 백혈구 분획은 상기 포유동물의 말초혈액으로부터 올 수 있다. 이 방법은 하기의 단계들 즉 (a) 백혈구 성분 채집(leukapheresis) 등과 같이 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의하여 포유동물 공급원으로부터 수득된 백혈구 세포 분획을 제공하는 단계; (b) 향류 원심분리 분급에 의하여 단계 (a)의 상기 백혈구 분획을 4 또는 그 이상의 아분획(sub fractions)으로 분리하는 단계, (c) 세포를 칼슘이온통로구(calcium inonphore), GM-CSF와 IL-13 또는 GM-CSF와 IL-4와 접촉시키는 것에 의하여 단계 (b)로부터의 하나 또는 그 이상의 분획들 내의 단핵구의 수지상세포로의 전환을 자극하는 단계, (d) 단계 (c)로부터의 상기 수지상세포-풍부화 분획(dendritic cell-enriched fraction)을 동정하는 단계 및 (e) 바람직하게는 약 4℃에서 단계 (d)의 상기 풍부화 분획을 수집하는 단계들을 포함한다. 상기 수지상세포-풍부화 분획을 동정하는 하나의 방법은 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting)에 의하는 것이다. 상기 백혈구 세포 분획은 재조합 (rh) rhIL-12, rhGM-CSF 또는 rhIL-4 등과 같은 다른 사이토카인의 존재 중에서 칼슘이온통로구로 처리될 수 있다. 상기 백혈구 세포 분획의 세포들은 완충제 내에서 세척되고 그리고 분리단계에 앞서 무-Ca++/Mg++ 배지(Ca++/Mg++ free media) 내에 현탁될 수 있다. 상기 백혈구 세포 분획은 백혈구 성분 채집에 의하여 수득될 수 있다. 상기 수지상세포는 하기의 마커들 즉, HLA-DR, HLA-DQ 또는 B7.2 중의 적어도 하나의 존재 및 하기의 마커 즉, CD3, CD16, CD56, CD57 및 CD19, CD20의 동시적인 부재에 의하여 동정될 수 있다. 이들 세포 표면 마커들에 특이적인 모노클로날 항체는 상용적으로 획득가능하다.
특히, 상기 방법은 백혈구 성분 채집으로부터의 백혈구 및 혈소판(platelets)의 풍부화된 수집(enriched collection) 및 계속해서 향류 원심분리 분급(CCE)에 의한 분획화를 필요로 한다(문헌 Abrahamsen et al. (1991) J. Clin. Apheresis. 6:48-53 참조). 이 기술에 있어서, 세포는 동시적인 원심분리와 흐름속도에서 일정하게 증가하는 완충제의 세척제거 흐름에 적용된다. 상기 완충제의 일정하게 증가하는 향류 흐름은 세포 크기에 크게 의존하는 분획적인 세포 분리를 야기한다.
APC 특히 DC 수집의 품질 관리(quality control) 및 배양물 내에서의 이들의 성공적인 활성화의 확인(confirmation)은 가능한 오염 T 림프구와 마찬가지로 단핵구 및 상기 수지상세포 아개체군(subpopulation) 둘 다를 감시하는 동시적인 다색 FACS 분석 기술(multi-color FACS analysis technique)에 의존한다. 세포 분류는 CD3(T 세포), CD16/CD56/CD57(NK/LAK 세포) 및 CD19/CD20(B세포)을 포함하는 세포 표면 마커의 차별 발현(differential expression)에 기초하고 있다. DCs는 CD14의 수준에 부분적으로 기초하여 단핵구로부터 구별가능하며, 이는 DCs에 비하여 단핵구 내에서 매우 높은 수준으로 발현된다. DCs는 이들이 혈액 내에서 순환하는 때에 HLA-DR, 명백하게는 HLA-DQ 및 B7.2(그러나 B7.1은 거의 없거나 전혀 없음)의 높은 수준의 발현을 나타내고 있다(거기에 더해, 이들은 단핵구 및 호중구(neutrophils)에 의해 발현되는 골수 마커(myeloid markers)인 Leu M7 및 M9를 발현한다).
사멸세포(dead cells)의 분석을 위한 제3의 색소시약(color reagent)과 결합되는 경우, 이는 모든 세포 아개체군의 양성 동정(positive identification)을 가능하게 한다.
수집 시에서의 FACS 분석의 목표는 상기 DCs가 기대되는 분획으로 풍부화되었는 지를 확인하고, 호중구 오염을 감시하고 그리고 적절한 마커들이 발현되었는 지를 확실하게 하는 것이다. 임상적 응용들에 적절한 인간 말초혈액으로부터의 풍부화된 DCs의 신속한 벌크 수집(bulk collection)은 절대적으로 품질관리에 대해 앞서 기술된 분석적 FACS 기술에 의존적이다. 필요하면, 성숙 DCs가 이 시점에서 "혼합 음성(cocktail negative)" 세포에 대한 형광 분류에 의하여 단핵구로부터 즉시적으로 분리될 수 있다. 상기 단핵 자체가 여전히 배양물 내에서 DCs 또는 기능상 DC-유사 세포로의 분화가 가능하기 때문에 단핵구로부터 DCs를 반복적으로 분리할 필요는 없을 수 있다.
일단 수집되면, 상기 DC 풍부/단핵구 APC 분획(대개 150 내지 190)은 후속하는 사용을 위하여 수집되고(pooled) 그리고 저온보존(cryopreserved) 되거나 또는 즉시적으로 단기간 배양에 위치된다.
달리, 수지상세포를 상향조절(upregulating ; 활성화(activating))하고 그리고 단핵구를 활성화된 수지상세포 표현형으로 전환시키는 방법이 보고되었다. 이 방법은 상기 배양물 배지에의 칼슘 이온통로구의 첨가가 단핵구를 활성화된 수지상세포로 전환시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 24 내지 48시간 배양의 시작에서의 상기 칼슘 이온통로구 A23187의 첨가는 균일한 활성화 및 수집된 "단핵구 + DC" 분획의 수지상세포 표현형으로의 전환의 결과를 가져오고: 특징적으로, 상기 활성화된 개체군은 균일하게 CD14(Leu M3) 음성으로 되고 그리고 HLA-DR, HLA-DQ, ICAM-l, B7.1, 및 B7.2를 상향조절한다. 더욱이, 이 활성화된 벌크 개체군은 더욱 정제하는 것 보다는 소량에 대하여 기능하는 것이 더 낫다.
사이토카인의 특정한 조합(들)이 칼슘 이온통로구에 대하여 달성된 활성화/전환을 증폭하는 데 성공적으로 사용되었으며: 이들 사이토카인들에는 정제되거나 또는 재조합 ("rh") rhGM-CSF, rhIL-2 및 rhIL-4를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 단독으로 주어지는 경우 각 사이토카인은 적절한 상향조절에 부적절하다.
상기 APC 에의 항원의 제공
면역화의 목적을 위하여, 상기 폴리펩티드(예를 들면, 시퀀스 동정 번호 1 내지 33)는 단백질/펩티드로서 또는 상기 단백질/펩티드를 인코딩하는 cDNA의 형태로 항원-제공 세포에 전달될 수 있다. 항원-제공세포(APCs)는 수지상세포(DCs), 단핵구/대식세포, 상기 필요한 MHC/공동자극 분자를 발현하는 B 림프구 또는 다른 세포형(들)로 이루어질 수 있다. 이하에서 기술되는 방법은 1차적으로는 가장 잠재적인, DCs, 바람직하게는 APCs에 대하여 촛점을 맞추고 있다.
APCs를 본 발명의 상기 항원성 단백질 또는 폴리펩티드에 노출시키는 것에 의하여 시험관 내/생체 외 펄싱(pulsing)이 수행된다. 상기 단백질 또는 펩티드(들)는 대략 3시간 동안 1 내지 10㎛의 농도로 APCs에 첨가된다. 항원 또는 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로의 APCs의 형질감염은 APCs를 양이온성 지질(cationic lipids)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당해 기술분야에서 공지된 형질감염제(transfection agents)의 존재 중에서의 상기 핵산에 APCs를 노출시키는 것에 의하여 수행된다. 형질감염되거나 또는 펄싱된 APCs는 후속적으로 정맥내, 피하, 코안, 근육내 또는 복막내 전달 경로를 통하여 숙주에 투여될 수 있다.
단백질/펩티드 항원은 또한 부형제와 함께 정맥내, 피하, 코안, 근육내 또는 복막내 전달 경로를 통하여 생체 내로 전달될 수 있다.
포스터 항원 제공 세포( Foster Antigen Presenting Cells )
포스터 항원 제공 세포는 표적 세포로서 특히 유용하다. 포스터 APCs는 Tw로서 언급되는 인간 세포주 174X CEM.T2로부터 파생되며, 이는 그의 항원 가공 경로(antigen processing pathway) 내에 내인성 펩티드의 세포 표면 MHC 클래스 I 분자와의 화합을 제한하는 돌연변이를 포함한다(문헌 Zweerink et al. (1993) J. Immunol. 150:1763-1771 참조). 이는 유전자 TAP1, TAP2, LMP1 및 LMP2들을포함하는 상기 MHC 클래스 II 영역 내에서의 대규모 동형소실(homozygous deletion)로 인한 것이며, 이는 MHC 클래스 I-제한 CD8+ CTLs에의 항원 제공에 요구된다. 사실상, 단지 "비어 있는(empty)" MHC 클래스 I 분자가 이들 세포들의 표면 상에 제공된다. 상기 펩티드가 대립유전자-특이적 결합 모티프(allele-specific binding motif)를 포함한다는 단서 하에 상기 배양 배지에 첨가된 외인성 펩티드는 이들 MHC 분자에 결합한다. 이들 T2 세포는 본 명세서에서는 "포스터(foster)" APCs로 언급한다. 이들은 본 발명과 함께 사용되어 항원(들)을 제공할 수 있다.
특이적 재조합 MHC 대립유전자로의 T2 세포의 형질도입은 상기 MHC 제한 프로파일(MHC restriction profile)의 방향수정(redirection)을 허용한다. 앵커 잔기(anchor residues)가 상기 내인성 대립유전자에로의 효율적인 결합을 방해할 수 있기 때문에 이들에 의하여 상기 재조합 대립유전자에 대하여 재단된 라이브러리가 우선적으로 제공될 수 있다.
MHC 분자의 고수준의 발현은 상기 CTLs에 대해 상기 APC가 보다 가시적이 되도록 만든다. 강력한 전사 프로모터(transcriptional promoter ; 예를 들면, CMV 프로모터)를 사용하는 T2 세포 내에서의 대상 MHC 대립유전자를 발현하는 것은 보다 반응성인 APC(아마도 상기 세포 표면 상의 반응성 MHC-펩티드 복합체의 높은 농도에 기인함)라는 결과를 가져온다.
면역 효과기 세포의 확장
본 발명은 이들 APCs를 사용하여 항원-특이적 면역 효과기 세포의 풍부화된개체군의 생성을 자극한다. 상기 항원-특이적 면역 효과기 세포는 상기 APCs의 덕분으로 확장되고, 이들은 상기 배양물 내에서 사멸한다. 순수한 면역 효과기 세포가 다른 세포에 의하여 단련되는방법이 근본적으로 문헌 Coulie (1997) Molec. Med. Today 3:261-268에서 기술되었다.
상기에서 기술된 바와 같이 제조된 상기 APCs는 순수한 면역 효과기 세포와 혼합된다. 바람직하게는, 상기 세포는 사이토카인, 예를 들면, IL2의 존재 중에서 배양될 수 있다. 수지상세포가 IL12 등과 같은 잠재적인 면역자극 사이토카인을 분비하기 때문에, 확장의 제1라운드 및 후속 라운드 동안에 추가 사이토카인을 첨가할 필요는 없을 수 있다. 아무튼, 상기 배양 조건들은 상기 항원-특이적 면역 효과기 세포가 상기 APCs 보다 훨씬 더 높은 비율로 확장(즉, 증식)되도록 하는 것이다. APCs 및 선택적 사이토카인의 다중 융합이 항원-특이적 세포의개체군을 더욱 확장시키도록 수행될 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는 T세포이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 면역 효과기 세포는, 예를 들면, IL-2, IL-11 또는 IL-13을 코딩하는 전이유전자(transgene)으로의 형질도입에 의하여 유전적으로 변성될 수 있다. 시험관 내, 생체 외 및 생체 내에서 전이유전자를 형질도입하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다.
항체에 대한 기능성 분석( Functional Analysis with Antibodies )
본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 정제하고 그리고 생물학적 등가의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 동정하는 데 사용될 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 상기 폴리펩티드의 기능을 변성하는 시약을 동정하는 데 사용될 수 있다. 이들 항체들에는 폴리클로날 항혈청(polyclonal antisera), 모노클로날 항체 및 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 친숙하고 그리고 상기 기술된 이들 제제들로부터 유도되는 여러 시약들이 포함된다.
동정된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 중성화시키는 항체가 또한 생체 내 및 시험관 내에서 사용되어 이러한 중성화 항체를 생체 내 및 시험관 내 시험 시스템(test systems)에 첨가하는 것에 의하여 기능을 입증할 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 의약(pharmaceutical agents)으로서 유용하다.
여러 항체 제제가 또한 상기 동정된 유전자에 의하여 인코딩된 단백질의 시험관 내 또는 생체 내 시험 세포에 의한 발현을 입증하기 위한 효소면역분석 또는 웨스턴 블럿 등과 같은 분석방법에서 사용될 수 있다. 대사 동안 단백질분해효소 분해에 의해 생성된 이러한 단백질의 단편이 또한 적절한 폴리클로날 항혈청을 실험 샘플로부터 유도된 샘플과 함께 사용하는 것에 의하여 동정될 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 단독으로 또는 펩티드 또는 단백질-기반 백신 또는 수지상-세포기반 백신과 함께 백신화를 위하여 또는 백신화를 촉진시키기 위하여 사용될 수 있다.
조성물
조성물이 더욱 제공된다. 상기 조성물은 담체 및 본 발명의 단리된 폴리펩티드, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 단리된 숙주 세포, 본 발명의 소분자 또는 항체들 중의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 상기 담체는 고체 지지체 또는 약제학적으로 수용가능한 담체들 중의 하나 또는 그 이상이 될 수 있다. 상기 조성물은 부형제 또는 백신으로서 투여하기에 적절한 다른 성분을 더 포함할 수 있다. 하나의 관점에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 수용가능한 첨가제, 희석제, 담체 및/또는 부형제들 중의 하나 또는 그 이 상으로 제형화될 수 있다. 게다가, 본 발명의 상기 조성물의 구체예는 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 수용가능한 보조물질(auxiliary substances)로 제형화된 본 발명의 단리된 폴리페티드, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 소분자 및 단리된 숙주 세포 또는 본 발명의 항체를 포함한다.
경구용 제제를 위하여는, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 벡터, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 단리된 숙주 세포, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 소분자 또는 항체들 중의 어느 하나 또는 그 이상이 단독으로 또는 정제, 과립 또는 캡슐로 만들기 위한 적절한 첨가제와 함께, 예를 들면, 락토오즈(lactose), 만니톨(mannitol), 옥수수 녹말(corn starch) 또는 감자 녹말(potato starch) 등과 같은 통상의 첨가제와 함께; 결정 셀룰로오스(crystalline cellulose), 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 아카시아(acacia), 옥수수 녹말 또는 젤라틴(gelatins) 등과 같은 결합제(binders)와 함께; 옥수수 녹말, 감자 녹말 또는 소듐카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose) 등과 같은 붕해제(disintegrators)와 함께; 활석(talc) 또는 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate) 등과 같은 활제(lubricants)와 함께; 그리고 원하는 경우, 희석제, 완충제, 습윤제(moistening agents), 보존제(preservatives) 및 착향료(flavoring agents)와 함께 상기 화합물을 포함하거나 또는 필수적으로 이루어지는 본 발명의 약제학적 제형 내에서 사용될 수 있다. 약제학적으로 호환가능한 결합제 및/또는 부형제 재료들이 상기 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 상기 정제, 알약(pills), 캡슐, 트로키(troches) 등은 하기의 성분들 또는 유사한 속성의 화합물들 중의 어느 하나를 포함할 수 있다: 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 트라가간트 검(gum tragacanth) 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 녹말 또는 락토오스 등과 같은 부형제, 알긴산(alginic acid), 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 녹말 등과 같은 붕해제; 마그네슘스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes) 등과 같은 활제; 콜로이드성 이산화규소(colloidal silicon dioxide) 등과 같은 활택제(glidant); 자당(sucrose) 또는 사카린(saccharin) 등과 같은 감미제(sweetening agent); 또는 페퍼민트(peppermint), 메틸살리실레이트(methyl salicylate) 또는 오렌지향(orange flavoring) 등과 같은 착향료.
경구 투여에 적절한 약제학적 제형 및 단위 투여량 형태(unit dose forms)는 만성의 상태, 감염의 치료 및 환자가 약물을 자기-관리(self-administers)하는 치료에 특히 유용하다. 하나의 관점에 있어서, 상기 제형은 소아 투여(pediatric administration)에 특이적이다.
본 발명은 약제학적 제형을 제공하며, 여기에서 본 발명의 단리된 폴리펩티드, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 단리된 숙주 세포 또는 본 발명의 항체들 중의 하나 또는 그 이상이 이들을 식물유 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글리세리드(aliphatic acid glycerides), 고급 지방산의 에스테르 또는 프로필렌글리콜 등과 같은 수성 또는 비수성의 용매 내에 그리고 원하는 경우, 가용화제(solubilizers), 등장화제(isotonic agents), 현탁제(suspending agents), 에멀젼화제(emulsifying agents), 안정화제(stabilizers) 및 보존제 또는 다른 항생제들과 함께 용해, 현탁 또는 에멀젼화시키는 것에 의하여 본 발명에 따른 주사용 제제로 제형화될 수 있다.
이러한 것들의 비-제한적인 예들은 표면 항원, 예를 들면, OMP P5, rsPilA, OMP 26, OMP P2 또는 IV형 필린 단백질(문헌들 Jurcisek and Bakaletz (2007) J. of Bacteriology 189(10):3868-3875 및 Murphy, TF, Bakaletz, LO and Smeesters, PR (2009) The Pediatric Infectious Disease Journal, 28:S121-S126) 등과 같은 다른 백신 성분 등과 같은 항균제 및 항세균제이다. 정맥내 투여를 위해서는, 적절한 담체에 생리식염수(physiological saline), 정균수(bacteriostatic water), 크레모포어 ELTM(미합중국 뉴저지 주 파르시파니(Parsippany, N.J.) 소재, 바스프(BASF) 또는 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline ; PBS)들이 포함된다. 모든 경우들에서, 비경구적 투여를 위한 조성물은 멸균이어야 하고 그리고 용이한 주사가능성(syringability)이 존재하는 정도까지의 액체이어야 한다.
본 발명에 의해 제공되는 에어로졸 제형은 흡입을 통하여 투여될 수 있으며, 추진제 기반 또는 비-추진제 기반이 될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약제학적 조성물의 구체예는 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 프로판(propane), 질소(nitrogen) 등과 같은 가압된 수용가능한 추진제 내로 제형화된 본 발명의 화합물을 포함한다. 흡입에 의하여 투여를 위하여는, 상기 화합물은 가압된 용기 또는 적절한 추진제, 예를 들면, 이산화탄소를 포함하는 분배기(dispenser) 또는 분무기(nebulizer)로부터의 에어로졸 분무(aerosol spray)의 형태로 전달될 수 있다. 비추진제의 비-제한적인 예는 기계적인 힘에 의하여(즉, 사람의 손가락으로 피스톤을 밀어내리거나 또는 용기 벽에 적용되는 압축력 또는 벽 자체에 의하여 발휘되는 탄성력(예를 들면, 탄성의 주머니(elastic bladder)에 의하는 것과 같이 용기의 압축에 의하여) 밀폐된 용기로부터 방출되는 펌프 분무(pump spray)이다.
본 발명의 좌약은 본 발명의 화합물을 에멀젼화 베이스(emulsifying bases) 또는 수용성 베이스(water-soluble bases) 등과 같은 다양한 베이스들 중의 어느 하나와 혼합하는 것에 의하여 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물의 이 약제학적 제형의 구체예는 좌약을 통하여 직장으로 투여될 수 있다. 상기 좌약은 코코아 버터(cocoa butter), 카보왁스(carbowaxes) 및 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 비히클을 포함할 수 있으며, 이는 체온에서 용융되나, 실온에서 고화된다.
시럽, 엘릭서 및 현탁액 등과 같은 경구 또는 직장 투여의 단위 투여량 형태들이 제공되며, 여기에서 각 투여량 단위, 예를 들면, 찻숟가락으로 하나의 양(teaspoonful), 식탁 숟가락으로 하나의 양(tablespoonful), 정제 또는 좌약은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 조성물의 소정의 양을 포함한다. 유사하게, 주사 또는 정맥 내 투여를 위한 단위 투여량 형태는 멸균수(sterile water), 통상의 염수(normal saline) 또는 다른 약제학적으로 수용가능한 담체 내의 용액으로서의 조성물 내의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약제학적 제형들의 구체예들에는 본 발명의 단리된 폴리펩티드, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명에서 사용되기 위한 소분자, 본 발명의 단리된 숙주 세포 또는 본 발명의 항체들 중의 하나 또는 그 이상이 주사가능한 조성물로 제형화된 것들이 포함된다. 본 발명의 주사가능한 약제학적 제형들은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 또는 주사에 앞서 액체 비히클 내의 용액 또는 현탁액에 사용하기에 적절한 고체 형태로서 제조된다. 상기 제제는 또한 본 발명의 상기 약제학적 제형들의 다른 구체예들에 따라 에멀젼화되거나 또는 리포좀 비히클 내에 캡슐화(encapsulated)될 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터, 본 발명의 단리된 숙주 세포 또는 본 발명의 항체들 중의 하나 또는 그 이상이 연속적 전달 시스템에 의하여 전달되도록 제형화된다. 용어 "연속적 전달 시스템(continuous delivery system)"은 본 명세서에서는 "제어된 전달 시스템(controlled delivery system)"과 상호호환적으로 사용되며, 카테터, 주사 장치 등과 함께 연속적(예를 들면, 제어된) 전달 장치(예를 들면, 펌프)를 포함하며, 이들의 다양한 예들이 당해 기술분야에서 공지되어 있다.
기계식 또는 전기기계식(electromechanical) 주입 펌프(infusion pump)가 또한 본 상세한 설명에 대하여 사용하기에 적절할 수 있다. 이러한 장치의 예들에는 예를 들면, 미합중국 특허 제4,692,147호; 동 제4,360,019호; 동 제4,487,603호; 동 제4,360,019호; 동 제4,725,852호; 동 제5,820,589호; 동 제5,643,207호; 동 제6,198,966호;등에 기술된 것들이 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 전달은 다양한 재충전가능한 펌프 시스템들 중의 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 펌프는 시간에 걸쳐 일정한, 제어된 방출을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 화합물은 약물-불투과성 저장기(drug-impermeable reservoir) 내의 액체 제형이며, 연속적인 방식으로 개체에 전달된다.
하나의 구체예에 있어서, 상기 약물 전달 시스템은 적어도 부분적으로는 이식가능한 장치(implantable device)이다. 상기 이식가능한 장치는 당해 기술분야에서 공지된 방법 및 장치를 사용하여 임의의 적절한 이식 자리(implantation site)에 이식될 수 있다. 이식 자리는 약물 전달 장치가 도입되고 그리고 위치되는 대상체의 신체 내의 하나의 자리이다. 이식 자리들에는 표층하(subdermal), 피하, 근육내 또는 대상체의 신체 내의 다른 적절한 자리들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 약물 전달 장치의 이식 및 제거에서의 편의성으로 인하여 피하 이식 자리가 일부 구체예들에서 사용된다.
본 상세한 설명에서 사용하기에 적절한 약물 전달 장치는 다양한 작동 모드들 중의 임의의 것에 기초할 수 있다. 예를 들면, 상기 약물 전달 장치는 확산 시스템(diffusive system), 전달 시스템(convective system) 또는 침식 시스템(erodible system ; 예를 들면, 침식-기반 시스템)에 기초할 수 있다. 예를 들면, 상기 약물 전달 장치는 전기화학펌프(electrochemical pump), 삼투펌프(osmotic pump), 전기삼투펌프(electroosmotic pump), 증기압펌프(vapor pressure pump) 또는 예를 들어 약물이 중합체 내포되어 있고 그리고 상기 중합체가 약물-함침 중합체성 물질(에를 들면, 생분해성의 약물-함침 중합체성 물질)의 분행 수반되어 약물 제형의 방출을 제공하는 삼투방출매트릭스(osmotic bursting matrix)가 될 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 약물 방출 장치는 전기확산시스템(electrodiffusion system), 전해펌프(electrolytic pump), 기포성펌프(effervescent pump), 압전펌프(piezoelectric pump), 가수분해시스템(hydrolytic system) 등에 기초한다.
기계식 또는 전기기계식 주입 펌프에 기초하는 약물 방출 장치는 또한 본 상세한 설명에 대하여 사용하기에 적절할 수 있다. 이러한 장치의 예들에는 예를 들면 미합중국 특허 제4,692,147호; 동 제4,360,019호; 동 제4,487,603호; 동 제4,360,019호; 동 제4,725,852호 등에 기술된 것들이 포함된다. 일반적으로, 대상체 치료 방법은 다양한 충진가능한, 비-교환가능한 펌프 시스템(refillable, non-exchangeable pump systems)들 중의 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로 시간에 걸친 보다 일정하고, 제어된 방출로 인하여 펌프 및 다른 전달 시스템들이 일반적으로 선호된다. 삼투펌프는 보다 일정하게 제어된 방출과 상대적으로 작은 크기의 복합 잇점들로 인하여 일부 구체예들에서 사용된다(예를 들면, 국제공개특허공보 제WO 97/27840호 및 미합중국 특허 제5,985,305호 및 동 제5,728,396호를 참조하시오). 본 명세서에서 사용하기에 적절한 예시적인 삼투압적으로-구동되는 장치에는 미합중국 특허 제3,760,984호; 동 제3,845,770호; 동 제3,916,899호; 동 제3,923,426호; 동 제3,987,790호; 동 제3,995,631호; 동 제3,916,899호; 동 제4,016,880호; 동 제4,036,228호; 동 제4,111,202호; 동 제4,111,203호; 동 제4,203,440호; 동 제4,203,442호; 동 제4,210,139호; 동 제4,327,725호; 동 제4,627,850호; 동 제4,865,845호; 동 제5,057,318호; 동 제5,059,423호; 동 제5,112,614호; 동 제5,137,727호; 동 제5,234,692호; 동 제5,234,693호; 동 제5,728,396호; 등에 기술된 것들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 상세한 설명에 적용될 수 있는 다른 예시적인 장치는 싱크로메드 주입 펌프(Synchromed infusion pump ; 메드트로닉사(Medtronic))이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 약물 전달 장치는 이식가능한 장치이다. 상기 약물 전달 장치는 당해 기술분야에서 잘 알려진 방법 및 장치를 이용하여 임의의 적절한 이식 자리에 이식될 수 있다. 본 명세서에서 언급한 바와 같이, 이식 자리는 약물 전달 장치가 도입되고 그리고 위치되는 대상체의 신체 내의 자리이다. 이식 자리들에는 표층하, 피하, 근육내 또는 대상체의 신체 내의 다른 적절한 자리들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물에 대한 적절한 부형제 비히클은 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 이들의 조합들이다. 게다가, 원하는 경우, 상기 비히클은 적심제, 에멀젼화제 또는 pH완충제(pH buffering agents)등과 같은 소량의 보조 물질을 포함할 수 있다. 이러한 투여량 형태들을 제조하는 방법은 공지되어 있거나 또는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 본 상세한 설명을 고려하는 것에 의하여 명백하게 될 것이다. 예를 들면, 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985을 참조하시오. 아무튼, 투여될 조성물 또는 제형은 치료되는 대상체 내에서 원하는 상태를 달성하기에 적절한 양의 상기 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 지효성(sustained-release) 또는 제어 방출 매트릭스(controlled release matrix)를 포함하는 것들을 포함한다. 게다가, 본 발명의 구체예들은 지효성 제형들을 사용하는 다른 치료들과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 지효성 매트릭스(sustained-release matrix)는 대개는 중합체인, 효소 또는 산-기반의 가수분해에 의하거나 또는 용해에 의하여 분해되는 물질로 만들어진 매트릭스이다. 일단 신체 내로 삽입되면, 상기 매트릭스는 효소 및 체액(body fluids)에 의하여 작용하게 된다. 지효성 매트릭스는 바람직하게는 리포좀, 폴리락타이드(polylactides ; 폴리락트산(polylactic acid)), 폴리글리콜리드(polyglycolide ; 글리콜산의 중합체), 폴리락티드 공-글리콜리드(polylactide co-glycolide ; 락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리(오르토)에스터(poly(ortho)esters), 폴리펩티드, 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate), 카르복실산(carboxcylic acids), 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 다당류, 핵산, 폴리아미노산(polyamino acids), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 이소류신(isoleucine) 등과 같은 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐프로필렌(polyvinyl propylene), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 및 실리콘(silicone) 등과 같은 생체적합성 물질로부터 선택된다. 설명을 위한 생분해성 매트릭스(biodegradable matrices)들에는 폴리락타이드 매트릭스, 폴리글리콜리드 매트릭스 및 폴리락타이드 공-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 매트릭스들이 포함된다.
다른 구체예에 있어서, 상기 간섭제(마찬가지로 조합 조성물)는 제어 방출 시스템 내에서 전달된다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 정맥내 주입, 이식가능한 삼투펌프, 경피패치(transdermal patch), 리포좀 또는 다른 투여 모드를 사용하여 투여될 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌들 Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 다른 구체예에 있어서, 중합체성 물질이 사용된다. 또 다른 구체예에 있어서 제어 방출 시스템이 치료 표적(therapeutic target) 즉, 간의 근처에 위치되고, 따라서 전신 투여량(systemic dose)의 단지 일부만을 필요로 하게 된다. 또 다른 구체예에 있어서, 제어 방출 시스템이 치료 표적 근처에 위치되고, 따라서 전신 투여량의 단지 일부만을 필요로 하게 된다. 다른 제어 방출 시스템이 문헌 Langer (1990) Science 249:1527-1533에 의한 검토에서 논의되었다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물(별도로 또는 함께로의 조합 조성물과 마찬가지로)은 상기 조성물을 전달하기 위하여 봉합사(sutures), 밴드(bandages) 및 거즈(gauze) 등과 같은 흡수성 재료 내로의 본 명세서에서 기술된 억제제의 함침(impregnation) 또는 수술 스테이플(surgical staples), 지퍼(zippers) 및 카테터 등과 같은 고상 재료의 표면 상으로의 코팅에 의해 형성된 것들을 포함한다. 이러한 형태의 다른 전달 시스템은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 본 상세한 설명의 관점에서 쉽게 명백하게 될 것이다.
본 발명은 미생물 감염의 치료를 위하여 하나 또는 그 이상의 간섭제의 숙주(예를 들면, 인간)에의 투여를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 여러 구체예들에 있어서, 본 발명의 이들 방법들은 전신적 및 국부화된 투여의 경로들과 마찬가지로 생체 내 및 생체 외 방법들을 포함하여 약물 전달을 위한 임의의 적절한 방법 및 경로의 거의 모두에로 확장된다.
스크리닝 분석( Screening Assays )
본 발명은 본 명세서에서 기술된 것과 같은 폴리클로날 항체에 대하여 등가의 모노클로날 항체 등과 같은 등가의 시약 및 본 발명의 상기 활성제들 및 약제학적 조성물들의 활성 또는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드 생성물의 기능을 조절하는 시약을 스크리닝 하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 목적을 위하여는, "시약(agent)"는 단일 또는 복합 유기 또는 무기 분자, 펩티드, 단백질(예를 들면, 항체), 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 항-감작) 또는 리보자임 등과 같은 생물학적 또는 화학적 화합물을 포함하는 것으로 의도되나, 그러나 이들에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 등과 같은 중합체들 및 여러 핵심 구조(core structures)에 기초하는 합성 유기 화합물들의 광범위한 집합체(vast array)의 화합물들이 합성될 수 있으며, 이들은 또한 용어 "시약" 내에 포함된다. 게다가, 여러 천연의 공급원들이 식물 또는 동물 추출물 등과 같은 스크리닝을 위한 화합물을 제공할 수 있다. 비록 항상 명쾌하게 언급되지는 않으나, 상기 시약이 단독으로 또는 본 발명의 스크리닝에 의하여 동정된 상기 시약과 동일하거나 서로 다른 생물학적 활성을 갖는 다른 시약과 함께 사용된다는 것은 이해되어야 한다.
하나의 구체예는 상기 DNA-DNABII(예를 들면, IHF) 상호작용과 상호작용하거나 결합하거나 또는 저해할 수 있는 시약을 스크리닝하기 위한 방법이다. 본 발명은 도 6b에서 상기 미생물 DNA 및 IHF의 3차원 구조를 제공한다. 따라서, 본 상세한 설명은 컴퓨터이용(computer-aided), 인실리코 설계(컴퓨터 시뮬레이션과 같은 가상 환경에서의 설계 ; in silico design) 또는 모델링으로도 알려진 가상설계기술(virtual design techniques)을 사용하여 상기 DNA-DNABII(예를 들면, IHF) 상호작용과 상호작용하거나 결합하거나 또는 저해할 수 있는 시약을 설계하고, 선택하고 그리고 합성하는 것을 허용한다. 결과적으로, 후보 시약들이 본 명세서에서 기술된 바와 같은 생물막 및 연관된 질병 또는 상태(의료, 산업 또는 수의(vetranary))의 치료에서 유효하게 될 수 있다. 따라서, 본 상세한 설명은 또한 상기 인실리코 방법(in silico methods)에 의하여 동정되거나 또는 설계된 시약을 제공한다.
IHF-DNA 복합체의 3차원 구조가 도 6b에 묘사되어 있으며, X, Y 및 Z의 좌표를 갖는 그 대표적인 구조가 단백질 데이터 뱅크 접근 번호(Protein Data Bank Accession Number): 1IHF에 제공되어 있으며, 그 연관된 상세가 문헌 Rice et al. Cell 87:1295-1306 (1996)에 제공되어 있다. 상기 IHF-DNA 복합체 내의 상기 IHF 단백질의 3차원 구조는 상기 스크리닝법을 위하여 사용될 수 있다. 적절한 시약은 DNA와의 상호작용에 포함되는 것으로 동정된 상기 아미노산 잔기들 중의 적어도 하나 또는 달리 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯, 또는 일곱, 또는 여덟, 또는 아홉, 또는 적어도 열개와의 상호작용을 갖는 상기 IHF-DNA 복합체 내의 상기 IHF 단백질 구조에 연과되어 위치될 수 있는 것이다.
도 6a는 예로서 대장균 IHF 시퀀스(시퀀스 동정 번호:42)를 사용하여 IHF-DNA 상호작용에 포함되는 상기 아미노산 잔기를 나타내고 있다. 도 6a에서 하위 수준의 화살표들로 표시된 이러한 아미노산 잔기는 이하에서 굵고 밑줄 친 글자들로 표시되어 기술되어 있다. 즉, 대장균 IHF에 대하여, DNA 결합에 포함되는 상기 아미노산들은 T4, K5, A6, E28, Q43, K45, S47, G48, N51, R55, K57, R60, R63, N64, P65, K66, R76, T80, R82 또는 Q85들이다.
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따라서, 본 상세한 설명의 하나의 구체예는 삽입숙주인자(IHF) 단백질의 3차원 구조에 대하여 후보 시약의 3차원 구조를 위치시키는 것을 포함하는, 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 대상체 내의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 대상체 내에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하기 위한 컴퓨터 구현 방법(computer-implemented method)을 제공하며, 여기에서 상기 IHF 단백질의 상기 3차원 구조는 IHF 및 DNA 복합체의 결정 형태로부터 결정되는 X, Y 및 Z 원자 구조 배위(atomic structure coordinates)에 기초하고, 여기에서 시퀀스 동정 번호: 42로 표시된 바와 같은 T4, K5, A6, E28, Q43, K45, S47, G48, N51, R55, K57, R60, R63, N64, P65, K66, R76, T80, R82 또는 Q85 또는 각각의 등가물로부터 선택되는 2 또는 그 이상의 IHF 아미노산에서 상기 시약의 상기 IHF와의 상호작용이 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정한다.
하나의 관점에 있어서, 후보 시약은 아미노산 63, 64, 65 또는 66들 중의 적어도 하나, 둘 또는 세개에서 상기 IHF 단백질과 상호작용한다. 하나의 관점에 있어서, 후보 시약은 R63, N64, P65, K66들 중의 적어도 하나, 둘 또는 세개에서 상기 IHF 단백질과 상호작용한다. 다른 관점에 있어서, 후보 시약은 63 또는 66 중의 적어도 하나에서 상기 IHF 단백질과 상호작용한다. 다른 관점에 있어서, 후보 시약은 R63 또는 K66 중의 적어도 하나에서 상기 IHF 단백질과 상호작용한다.
정확한 위치 및 아미노산 잔기가 상기 IHF 시퀀스에 크게 의존적이라는 것은 당해 기술분야에서는 이해될 수 있는 것이다. 그러나, 당해 기술분야에서 숙련된 자는 상기 시퀀스에 기초하여 이러한 위치 및 아미노산 잔기를 쉽게 동정할 수 있다. 예를 들면, 도 9에 묘사한 바와 같이, 대장균(시퀀스 동정 번호:42)의 상기 IHF 시퀀스에 대하여 정렬되어 DNA와 상호작용하는 대장균 IHF 내의 아미노산들에 대응하는 것이 노출되도록 할 수 있다. 유사하게, IHF-DNA 복합체 내의 이러한 IHF 시퀀스의 3차원 구조가 스크리닝에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 바와 같은 컴퓨터 구현 방법에 더하여, 본 상세한 설명은 또한, 예를 들면, 상기 방법을 수행하기 위한 적절한 컴퓨터 프로그램 또는 코드를 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체(nontransitory computer readable medium) 등과 같은 컴퓨터 판독가능 매체와 마찬가지로 상기 방법을 수행하기 위한 연산장치(processor), 기억장치(memory) 및/또는 프로그램을 포함하는 맞춤형 컴퓨터 시스템(custom computer system)을 제공한다.
따라서, 다른 구체예는
적어도 하나의 연산장치;
상기 적어도 하나의 연산장치에 결합된 기억장치;
상기 기억장치 및 상기 적어도 하나의 연산장치와 통신하는 저장매체를 포함하며, 상기 저장매체가 상기 연산장치에 의하여 실행되는 경우에 맞춤형 전산 장치의 환경을 설정하여 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 대상체 내의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 대상체 내에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는 한 세트의 연산장치 실행가능 지시(processor executable instructions)를 포함하며, 여기에서 상기 환경이 삽입숙주인자(IHF) 단백질의 3차원 구조에 대하여 후보 시약의 3차원을 위치시키는 것을 포함하고, 여기에서 상기 IHF 단백질의 상기 3차원 구조가 IHF 및 DNA 복합체의 결정 형태로부터 결정되는 X, Y 및 Z 원자 구조 배위에 기초하고, 여기에서 시퀀스 동정 번호: 42로 표시된 바와 같은 T4, K5, A6, E28, Q43, K45, S47, G48, N51, R55, K57, R60, R63, N64, P65, K66, R76, T80, R82 또는 Q85 또는 각각의 등가물로부터 선택되는 2 또는 그 이상의 IHF 아미노산에서 상기 시약의 상기 IHF와의 상호작용이 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는 맞춤형 전산 장치(custom computing apparatus)를 제공한다.
또 다른 구체예는 연산장치에 의하여 실행되는 경우에 삽입숙주인자(IHF) 단백질의 3차원 구조에 대하여 후보 시약의 3차원을 위치시키는 것을 포함하여, 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 대상체 내의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 대상체 내에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는 한 세트의 연산장치 실행가능 지시를 포함하며, 여기에서 상기 IHF 단백질의 상기 3차원 구조가 IHF 및 DNA 복합체의 결정 형태로부터 결정되는 X, Y 및 Z 원자 구조 배위에 기초하고, 여기에서 시퀀스 동정 번호: 42로 표시된 바와 같은 T4, K5, A6, E28, Q43, K45, S47, G48, N51, R55, K57, R60, R63, N64, P65, K66, R76, T80, R82 또는 Q85 또는 각각의 등가물로부터 선택되는 2 또는 그 이상의 IHF 아미노산에서 상기 시약의 상기 IHF와의 상호작용이 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는 비일시적 컴퓨터 매체를 제공한다.
인실리코 분자 또는 약물 설계의 방법은 당해 기술분야에서는 잘 알려져 있으며, 일반적으로 문헌 Kapetanovic (2008) Chern Biol. Interact., 171(2): 165-76을 참조하시오. 요약하면, 상기 3차원 구조의 원자 좌표들을 컴퓨터 내로 입력하여 상기 구조의 상(images)들 및 여러 매개변수들이 디스플레이 상에 나타나도록 한다. 상기한 설계는 전형적으로 상기 표적 분자의 3차원 구조에 대하여 3차원구조를 위치시키는 것을 포함한다. 상기 위치시키기(positioning)는 컴퓨터 그래픽 인터페이스로부터 도움을 받아 사용자에 의하여 제어될 수 있으며, 잠재적인 양호한 매칭을 검색하는 컴퓨터 알고리즘(computer algorithm)에 의하여 더욱 안내될 수 있다. 위치시키기는 또한 상기 3차원 구조들 중의 어느 하나 또는 둘 다를 임의의 차원에서 주위로 이동시키는 것을 포함한다.
계속해서, 그 결과의 데이터를 가상 화합물(virtual compound) 및/또는 시약 라이브러리로 입력한다. 가상 라이브러리가 DOCK-4(Kuntz, UCSF) 등과 같은 가상 스크리닝 소프트웨어 내에 포함되어 있기 때문에, 상기 기술된 데이터는 이러한 소프트웨어 내로 입력될 수 있다. 후보 시약들은 MDDR(스페인 소재 프로우스 사이언스사(Prous Science)) 등과 같은 가상 또는 비-가상(non-virtual) 약물 후보 화합물들의 3차원 구조 데이터베이스를 사용하여 검색될 수 있다.
상기 후보 시약 사이 그리고 어느 하나 또는 둘 다에서 원하는 상호작용이 발견되는 경우, 하나의 후보 시약이 DNA 및/또는 DNABII 단백질에 결합할 수 있다는 것이 발견된다. 상기 상호작용은 정량적(예를 들면, 상호작용의 강도 및/또는 상호작용 자리들의 수) 또는 정성적(예를 들면, 상호작용 또는 상호작용의 결여)이 될 수 있다. 따라서, 상기 방법의 출력은 정량적 또는 정성적이 될 수 있다. 따라서, 하나의 관점에 있어서, 본 상세한 설명은 또한 상기 DNA와 단백질 사이의 상기 상호작용을 저해하지 않거나 또는 달리 강화하는 시약을 동정하는 방법을 제공한다.
소분자 화합물 등과 같은 시약의 잠재적인 저해 또는 결합 효과(즉, 상호작용 또는 화합)가 그의 실제의 합성 및 시험에 앞서 컴퓨터 모델링 기술의 사용에 의하여 분석될 수 있다. 주어진 화합물의 이론적인 구조가 상기 생물막 및/또는 DNABII 단백질 내의 이것과 미생물 DNA 사이의 불충분한 상호작용 및 화합물을 암시하는 경우, 상기 시약의 합성 및 시험은 배제될 수 있다. 그러나, 컴퓨터 모델링이 강한 상호작용을 나타내는 경우, 계속해서 그 시약은 합성되고 그리고 시험관 내 또는 생체 내 실험 등과 같은 여러 방법들을 사용하여 상기 상호작용에 결합하거나 또는 저해할 수 있는 그의 능력이 시험될 수 있다. 단독으로 또는 다른시약과 함께 생물막을 저해하거나 또는 적정하는 시약의 능력을 시험하는 방법이 본 명세서에서 기술된다. 이러한 방법에 있어서, 제대로 작동하지 않는 시약 및 화합물의 합성이 회피될 수 있다.
당해 기술분야에서 숙련된 자는 DNABII 또는 미생물 DNA과, 특히 특이적인 결합 자리들과 화합하는 그들의 능력에 대하여 화학적 또는 생물학적 독립체(entities)들 또는 단편들을 스크리닝하는 여러 방법들 중 임의의 것을 사용할 수 있을 것이다. 계속해서 선택된 단편 또는 화학적 독립체들은 DNA 또는 DNABII 폴리펩티드의 개별적인 결합자리 내로 여러 배향들로 위치되거나 또는 도킹될 수 있다. 도킹(docking)은 QUANTA, SYBYL 등과 같은 소프트웨어를 사용하여 그리고 후속하여 에너지 최소화(energy minimization) 및 CHARMM 및 AMBER 등과 같은 표준 분자 기법 역장(standard molecular mechanics forcefields)들을 갖는 분자 동력학을 사용하여 수행될 수 있다.
상용적인 컴퓨터 프로그램들이 또한 인실리코 설계용으로 획득가능하다. 예들에는 비제한적으로 GRID(영국 옥스포드 소재, 옥스포드 유니버시티(Oxford University ; Oxford, UK), MCSS(미합중국 매샤츄세츠 벌링턴 소재, 몰레큘라 시뮬레이션즈 ; Molecular Simulations, Burlington, Mass.), AUTODOCK0(미합중국 캘리포니아 라졸라 소재 스크립스 리서치 인스티튜트 ; Scripps Research Institute, La Jolla, Calif.), DOCK(미합중국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재, 유니버시티 오브 캘리포니아 ; University of California, San Francisco, Calif.), GLIDE(슈뢰딩거 인코포레이티드 ; Schrodinger Inc.), FlexX(트리포스 인코포레이티드 ; Tripos Inc.) 및 GOLD(캠브리지 크리스탈로그래픽 데이터 센터 ; Cambridge Crystallographic Data Centre)들이 포함된다.
상기 방법들에 의하여 일단 시약 또는 화합물이 설계되거나 또는 선택되면, 컴퓨터 평가(computational evaluation)에 의하여 시약 또는 화합물이 서로에 대하여 결합할 수 있는 효율이 시험되고 그리고 최적화될 수 있다. 예를 들면, 유효한 DNABII 단편 또는 바람직하게는 그의 결합 상태와 유리 상태들 사이의 에너지에 있어서의 상대적으로 작은 차이(즉, 결합의 작은 변형 에너지)를 입증한다.
설계되거나 또는 선택된 화합물은 더욱 컴퓨터상으로 최적화되어 그의 결합 상태에서 바람직하게는 상기 표적 단백질에 대하여 척력의 정전기 상호작용(repulsive electrostatic interaction)이 결여될 수 있다. 이러한 비-상보적(예를 들면, 정전기적) 상호작용들에는 척력의 하전-하전(charge-charge), 쌍극자-쌍극자(dipole-dipole) 및 하전-쌍극자(charge-dipole) 상호작용들이 포함된다. 특히, 상기 시약 또는 화합물이 시약에 결합되는 경우 상기 생물막 내의 상기 시약과 DNABII 및/또는 미생물 DNA 사이의 모든 정전기적 상호작용들의 합이 바람직하게는 중성이 되거나 또는 결합의 엔탈피(enthalpy)에의 선호적인 기여를 이룬다.
컴퓨터 소프트웨어는 또한 화합물 변형 에너지 및 정전기적 상호작용을 평가하기 위하여 당해 기술분야에서 획득가능하다. 예들에는 비제한적으로 Gaussian 92[미합중국 펜실베니아주 피츠버그 소재 가우시안 인코포레이티드 ; Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa.]; AMBER[미합중국 샌프란시스코 소재 유니버시티 오브 캘리포니아 ; University of Califomia at San Francisco]; QUANTA/CHARMM[미합중국 매사츄세츠 벌링턴 소재 몰레큘라 시뮬레이션즈 인코포레이티드 ; Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass.]; 및 Insight II/Discover[미합중국 캘리포니아주 샌디아고 소재 바이오시즘 테크놀로지스 인코포레이티드 ; Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif.]들이 포함된다.
앞서 기술한 바와 같이, 일단 결합 시약이 적절하게 선택되거나 또는 설계되면, 계속해서 그의 결합 특성들을 개량하거나 또는 변경시키기 위하여 그의 원자들 또는 측기(side groups)들 중의 일부에서 치환들이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 초기 치환들은 보존적, 즉, 대체기(replacement group)가 본래의 기와 대략적으로 동일한 크기, 형태, 소수성 및 하전을 가질수 있다. 물론, 형태를 변형시키는 당해 기술분야에서 알려진 구성성분들이 회피될 수 있다는 것은 이해되어야 한다. 계속해서 이러한 치환된 화학적 화합물은 앞서 상세하게 기술된 동일한 컴퓨터 방법들에 의하여 상기 생물막 내의 상기 DNABII 단백질 및/또는 미생물 DNA에의 적합의 효율성에 대하여 분석될 수 있다.
하나의 바람직한 구체예는 본 발명의 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용 할 수 있는 소분자를 스크리닝하기 위한 방법이다. 본 발명의 목적을 위하여는, "소분자"는 하나의 구체예에 있어서 대상의 단백질에 결합하고 그에 의하여 상기 단백질의 기능을 변형시킬 수 있는 저분자량(low molecular weights(MW))을 갖는 분자이다. 바람직하게는 소분자의 분자량은 1,000 이하이다. 단백질 기능을 변형시킬 수 있는 소분자를 스크리닝하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 세포 내에서 소분자-단백질 상호작용을 검출하기 위한 소형화된 집합화 분석(miniaturized arrayed assay)이 문헌 You et al. (1997) Chem. Biol. 4:961-968에 의하여 논의되었다.
시험관 내에서 상기 스크리닝 방법을 실행하기 위하여는, 치료되어야 할 상기 미생물로 감염된 적절한 세포 배양물 또는 조직이 먼저 제공된다. 상기 세포들이 조건들(온도, 성장 또는 배양 배지 및 가스(CO2)) 하에서 그리고 적절한 시간 동안 배양되어 밀도 의존적 제한(density dependent constraints) 없이 기하급수적 증식(exponential proliferation)을 이루도록 한다. 대조로서 감염되지 않은 부가적인 별도의 세포 배양을 유지하는 것이 또한 바람직하다.
당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백한 바와 같이, 마이크로-적정 플레이트(micro-titer plates) 내에서 적절한 세포들이 배양될 수 있으며, 유전자형의 변화(genotypic changes), 표현형의 변화(phenotypic changes) 또는 미생물 적정(microbial titer)에서의 감소를 표시하는 것에 의하여 여러 시약들이 동시에 분석될 수 있다.
상기 시약이 앞서 기술한 바와 같은 소분자 등과 같이 DNA 또는 RNA 이외의 조성물인 경우, 상기 시약은 부가를 위하여 직접적으로 상기 세포 배양물에 첨가되거나 또는 배양 배지에 첨가될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백한 바와 같이, "유효한" 양이 첨가되어야 하며 이는 경험적으로 결정될 수 있다.
상기 시약이 항체 또는 항원 결합 단편인 경우, 경쟁적 효소면역분석을 수행하기 위한 조건들 하에서 상기 시약은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 상기 표적 항원 및 폴리클로날 항체와 접촉되거나 또는 배양될 수 있다. 이러한 방법들은 숙련된 기술자에게는 공지된 것이다.
상기 분석은 또한 대상체 내에서 수행될 수 있다. 상기 대상체가 집쥐, 친칠라, 생쥐 또는 유인원 등과 같은 동물인 경우, 상기 방법은 인간 환자에서의 시약의 임상적 시험에 앞서 사용될 수 있는 편리한 동물 모델 시스템을 제공한다. 이 시스템에 있어서, 각각이 동일한 감염을 갖는 미치료된 동물과 비교하여 상기 질병 또는 미생물 감염의 증후군이 감소되거나 또는 제거되는 경우, 후보 시약은 잠재적인 약물이 된다. 건강하거나 치료되지 않은 세포 또는 동물의 별도의 음성대조군을 갖는 것이 또한 유용할 수 있으며, 이는 비교의 기본을 제공한다.
상기 시약 및 조성물은 약물의 제조에서 그리고 약제학적 조성물 내의 활성성분 등과 같이 통상적인 절차에 따른 투여에 의하여 인간 및 다른 동물의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
조합 요법( Combination Therapy )
본 발명의 상기 조성물 및 연관된 방법은 다른 치료법의 투여와 조합하여 사용될 수 있다. 이들에는 DNA분해효소, 항생제, 항균제 또는 다른 항체들의 투여가 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 방법 및 조성물에는 항-DNABII 항체와 함께 상승작용적으로 작용하는 디옥시리보뉴클레아제(DNase) 효소가 포함된다. DNase는 DNA 백본(DNA backbone) 내의 포스포디에스터 연결(phosphodiester linkages)의 개열을 촉매하는 임의의 효소이다. 십자형 구조 뿐만 아니라 또한 DNA의 다양한 2차구조를 표적하는 것으로 알려진 DNase 효소의 3가지 비제한적인 예들에는 DNAse I, T4 엔도 VII(T4 Endo VII) 및 T7 엔도 I(T7 Endo I)들이 포함된다. 특정의 구체예에 있어서, 상기 생물막을 불안정화(destabilize)하는 데 필요한 항-DNABII 항체의 유효량은 DNase와 결합되는 경우에 감소된다. 시험관 내에 투여되는 경우, 상기 DNase는 분석에 직접적으로 또는 상기 효소를 안정화시키는 것으로 알려진 적절한 완충제 내에서 첨가될 수 있다. DNase의 유효한 단위투여량 및 분석 조건들은 변할 수 있으며, 당해 기술부냥에서 공지된 절차에 따라 최적화될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 방법 및 조성물은 항생제 및/또는 항균제와 결합될 수 있다. 항균제는 박테리아, 균류(fungi) 또는 원생동물(protozoans) 등과 같은 미생물을 사멸시키거나 또는 그 성장을 저해하는 물질이다. 비록 생물막이 일반적으로 항생제의 작용에 대하여 저항성이기는 하나, 본 명세서에서 기술된 조성물 및 방법은 생물막을 포함하는 감염을 감염을 치료하기 위한 전통적인 치료법에 대하여 민감하게 만드는 데 사용될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물과의 조합으로의 항생제 또는 항균제의 사용이 항균제 및/또는 생물막 감소제(biofilm reducing agent)의 유효량을 감소시키는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 방법과 조합하여 사용할 수 있는 항균제 및 항생제의 일부 비제한적인 예들에는 아목시실린(amoxicillin), 아목시실린-클라블라네이트(amoxicillin-clavulanate), 세프디니르(cefdinir), 아지트로마이신(azithromycin) 및 설파메톡사졸에트리메토프림(sulfamethoxazoletrimethoprim)들이 포함된다. 상기 생물막 감소제와 조합하는 상기 항균제 및/또는 항생제의 치료적으로 유효한 투여량은 전통적인 방법에 의하여 쉽게 결정될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 상기 생물막 감소제와 조합하는 상기 항균제의 투여량은 다른 박테리아 감염, 예를 들면, 감염의 병인이 생물막을 포함하지 않는 박테리아 감염에서 유효한 것으로 나타난 평균 유효투여량이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 투여량은 상기 평균 유효투여량의 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0 또는 5배이다. 상기 항-DNABII 항체의 첨가에 앞서, 함께 또는 후속하여 항생제 또는 항균제가 첨가될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법 및 조성물은 상기 박테리아 감염을 치료하는 항체와 조합될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 상기 방법 및 조성물과 조합하는 데 유용한 항체의 하나의 실시예는 미연관의 외측 막 단백질에 대향하는 항체(즉, OMP P5)이다. 이 항체 단독으로의 치료는 시험관 내에서 생물막을 제거(debulk)하지 못한다. 이러한 항체 및 생물막 감소제와의 조합요법은 동일한 농도에서 단독으로 사용된시약에 의해 달성될 수 있는 것 보다 더 큰 효과의 결과를 가져온다. 생물막 감소제 또는 생물막을 감소시키는 방법들과 조합되는 경우 상승작용적 효과를 제공할 수 있는 다른 항체들에는 항-rsPilA, 항-OMP26, 항-OMP P2 및 항-전 OMP 제제들이 포함된다.
본 명세서에서 기술된 상기 조성물 및 방법은 생물막을 포함하는 박테리아 감염을 생물막을 갖지 않으나 그러나 달리는 생물막을 포함하는 박테리아 감염을 치료하는 데 효과적이지 않은 통상의 치료 양상(therapeutic modalities)들에 민감하게 만드는 데 사용될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 본 명세서에서 기술된 상기 조성물 및 방법은 생물막을 포함하는 박테리아 감염을 치료하는 데 효과적이나 그러나 이러한 부가의 치료법과 생물막 감소제 또는 방법과의 조합이 상기 생물막 감소제 또는 부가의 치료제의 유효투여량이 감소될 수 있도록 하는 상승작용적 효과를 생성하는 치료 양상과 조합하여 사용될 수 있다. 다른 경우들에 있어서, 이러한 부가의 치료 및 생물막 감소제 또는 방법의 조합은 상기 치료가 강화되도록 상승작용적 효과를 생성한다. 치료의 강화는 상기 감염을 치료하는 데 요구되는 시간이 더 짧아지는 것으로 입증될 수 있다.
상기 부가의 치료법은 상기 생물막을 감소시키는 데 사용된 방법 또는 조성물에 앞서, 동시에 또는 후속하여 첨가될 수 있으며, 동일한 제형 내에 또는 별도의 제형으로서 포함될 수 있다.
킷트( Kits )
본 명세서에서 기술된 바와 같은 시험관 내 및 생체 내 방법을 수행하는 데 필요한 시약 및 지시사항을 포함하는 킷트가 또한 청구된다. 따라서, 본 발명은 조직을 수집하고 및/또는 스크리닝을 수행하고 및/또는 그 결과를 분석하고 및/또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 간섭제의 유효량의 투여 등과 같은 본 발명의 방법을 실행하기 위한 지시사항과 마찬가지로 본 발명의 간섭제를 포함할 수 있는 이들 방법을 수행하기 위한 킷트를 제공한다. 이들은 단독으로 또는 다른 적절한 항생제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 킷트는 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물; 표 8, 표 9, 표 10에서 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 폴리펩티드 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물; 시퀀스 동정 번호 1 내지 33의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물; 시퀀스 동정 번호 5 내지 11, 28, 29의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 8, 표 10에서 동정된 것들 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물; 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드; 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드; 상기 언급된 폴리펩티드들 중의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드; 상기 언급한 폴리펩티드들 중의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 그의 등가물 또는 단편; 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 소분자의 군의 하나 또는 그 이상의 시약 및 사용을 위한 지시사항들을 포함하거나 또는 달리 필수적으로 이루어지거나 또는 여전히 더욱 이루어질 수 있다. 상기 킷트는 하나 또는 그 이상의 부형제, 항원성 펩티드 또는 항균제를 더 포함할 수 있다. 담체들의 예들에는 액체 담체, 약제학적으로 수용가능한 담체, 고체상 담체, 약제학적으로 수용가능한 담체, 약제학적으로 수용가능한 중합체, 리포좀, 미셀, 임플란트, 스텐트, 페이스트, 겔, 치아 임플란트 또는 의료용 임플란트들이 포함된다.
하기의 실시예들은 본 명세서에서 기술된 발명을 설명하기 위한 것이며 제한을 위한 것이 아니다.
실험
실시예 1
IHF 항체, 단백질 및 폴리펩티드들은 나쉬(Nash)의 관대한 기부로 얻었다. 이들을 생성하는 방법들은 숙련된 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌들 Granston and Nash, (1993) J. Mol. Biol., 234:45-59; Nash et al., (1987) Journal of Bacteriology, 169(9):4124-4127; 및 Rice et al., (1996) Cell, 87:1295-1306들에서 기술된 바와 같다. 요약하면, IHF-α를 과생성(overproduce)하기 위해서는, 상기 himA 유전자를 상기 박테리아 플라스미드 pAD284 내의 상기 PL 프로모터로부터 하향류(downstream)로 삽입하였다. 소정의 플라스미드를 수용한 균주 C600himA42의 람다 결손용해균(lambda lysogen)인 균주 K5607의 형질전환체를 박테리로파지 Mu를 성장시키는 능력에 대하여 암피실린-저항성 형질전환체(ampicillin-resistant transformants)를 스크리닝하는 것에 의하여 동정하였다(13). 표준 DNA 단리 기술에 따라 himA + 형질전환체로부터 DNA를 제조하였으며, 상기 himA 유전자의 배향을 제한효소 개열에 의하여 결정하였다. PL 프로모터에 의한 발현을 위한 적절한 배향 내에 상기 himA 유전자를 갖는 플라스미드 pPLhimA-1을 균주 N5271 내로 형질전환시켰으며, 이는 cI857 열유도 리프레서(thermoinducible repressor)을 발현하는 은성 람다 프로파지(cryptic lambda prophage)를 포함하여 균주 K5770을 수득한다.
IHF-β를 과생성하기 위하여, 박테리오파지 람다 PL 프로모터에 대한 IHF-,-코딩 시퀀스의 융합물을 포함하는 플라스미드 pKT23-hip323을 사용하였다. pKT23-hip323을 N5271 내로 도입시켜 균주 E443을 수득하였다. 다른 플라스미드의 존재 중에서 pKT23-hip323의 선택을 용이하게 하기 위하여, 암필리신 저항성(bla +)으로부터 클로람페니콜 저항성(chloramphenicol resistance ; cat +)으로 그의 선택가능한 마커를 변화시켰다. 문헌 Flamm and Weisberg에 의하여 기술된 바와 같이 cat-함유 단편을 플라스미드 pBR325로부터 단리하고 그리고 bla 내의 독특한 ScaI 자리 내로 삽입시켰다. hip 돌연변이를 수반하고 그리고 온도-민감성 X 리프레서(temperature-sensitive X repressor)를 합성하는 균주 E403 내로 결찰된 DNA를 도입시키고, 저온에서 클로람페니콜-저항성 형질전환체를 선택하였다. 이러한 형질전환체의 하나(E735)는 hip + 및 암피실린 민감성이었으며; 따라서 이는 pKT23-hip323의 bla cat 유도체(PE735)를 수반하는 것으로 나타났다.
IHF의 두 서브유닛을 과생성하는 균주를 생성하기 위하여, E735를 플라스미드 pPLhimA-1으로 형질전환시키고, 암피실린 저항성으로 되고 그리고 클로람페니콜 저항성을 보유하는 형질전환체(E738)를 선택하였다. IHF의 서브유닛 둘 다를 과생성하는 제2 균주의 생성은 플라스미드 pPLhip himA-5의 구성에 의존적이며, 이는 pheT 및 himA 유전자들을 포함하는 둔화시킨 (SstII 제한효소 자리)를 pKT23-hip323 플라스미드 내로 결찰시키는 것에 의하여 만들어졌다. 이는 문헌 (Nash et al., (1987) J. of Bacteriology , 169(9): 4124-4127에서 보다 상세하게 기술되었다. 균주 K5607의 himA + 형질전환체를 HimA+에 대하여 스크리닝하는 것에 의하여 동정되었고, 그리고 플라스미드 DNA를 제한 소화(restriction digestion)에 의하여 분석하였다. 플라스미드 구조가 명백한 모든 경우들에서, himA의 2개의 사본들을 벡터 내로 탠덤 직렬 반복(tandem direct repeat)으로서 결찰시켰다. 이 플라스미드에 대한 상기 himA 유전자의 2개의 사본들의 존재가 선택에 의하여 요구되는 것인지의 여부는 알려지지 않았으나, 그러나 플라스미드 pPLhimA-1 내의 상기 himA 유전자의 하나의 사본이 himA 돌연변이를 보완하는 데 충분하다는 것은 상기하여야 한다. 플라스미드 pPLhiphimA-5를 사용하여 균주 N5271을 형질전환시켜 균주 K5746을 수득하였다.
세포들을 TBY 배지(lOg의 트립톤(tryptone), 5g의 효모 추출물 및 1ℓ 당 5g의 염화나트륨) 내에서 31℃에서 진탕되는 수욕(shaking water bath) 내에서 성장시켰다. 중기-대수기(mid-log phase ; 650㎚에서의 광학 밀도, 약 0.6)에서, 상기 세포들을 42℃ 수욕으로 옮기고 그리고 진탕을 지속시켰다. 전형적으로, 300㎖의 배양물을 원심분리시키고 그리고 20mM NaCl을 함유하는 0.6 내지 0.9㎖의 TEG(20mM 트리스 염산염(Tris hydrochloride ; pH 7.4), 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산나트륨(sodium EDTA), 10% 글리세롤) 내에 현탁시켰다. 상기 세포들을 각 폭발(burst) 사이가 40초로 6회의 20-초의 폭발의 음파처리(sonication)로 파괴시켰다. 상기 음파처리 추출물의 일부를 Sorvall SS34 회전자(Sorvall SS34 rotor) 내에서 15,000rpm에서 20분간 원심분리시켰다. 상기 음파처리 추출물의 샘플을 표준 분자 생물학 기술에 따라 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate ; SDS) 겔 전기영동(gel electrophoresis)에 의하여 분석하였다.
IHF의 정제를 하기에 따라 수행하였다: 3.6ℓ의 세포들의 배치를 3시간 동안 유도시켰다. 모든 후속의 단계들을 0 내지 4℃에서 수행하였다. 3.3ℓ로부터의 세포 펠릿(cell pellet)을 20mM NaCl을 함유하는 10㎖의 TEG 냉 현탁시켜 29㎖의 총용적을 수득하였으며; 이 현탁액을 각각이 90초의 시간 간격(intervals)으로 구분된 6회의 3분의 음파처리를 수용하는 2개의 배치들 내에서 파괴시켰다. 음파처리 추출물을 15,000rpm에서 20분간 원심분리시켜 16.9㎖의 정화된 추출물을 수득하였다. 폴리민 피(polymin P ; 비디에이취 케미칼즈 리미티드(BDH Chemicals Ltd.))의 10%(용적/용적) 용액(1.1㎖)을 상기 정화된 추출물에 천천히 첨가하고; 20분간 교반시킨 후, 그 혼합물을 10,000rpm에서 30분간 원심분리시켰다. 그 결과의 펠릿을 500mM NaCl을 함유하는 TEG 10㎖에 현탁시키고; 15분간 교반시킨 후, 그 혼합물을 12,000rpm에서 20분간 원심분리시켰다. 그 상청액(supernatant)(10.3㎖)을 3.2g의 황산암모늄(ammonium sulfate)의 첨가에 의하여 50% 포화로 조정하고, 20분간 교반시키고 그리고 15,000rpm에서 15분간 원심분리시켰다. 그 결과의 상청액을 1.64g의 황산암모늄의 첨가에 의하여 70% 포화로 조정하고, 20분간 교반시키고 그리고 15,000rpm에서 15분간 원심분리시켰다. 그 결과의 펠릿을 1㎖의 TG(10%의 글리세롤을 함유하는 50mM 트리스 염산염(pH 7.4)) 내에 현탁시키고 그리고 2가지의 TG의 변화들에 대하여 투석시켰다. 상기 투석된 물질(2.0㎖)을 TG로 평형화시킨 포스포셀룰로오스(phosphocellulose)의 1㎖ 컬럼(0.5*5.8㎝)(Pll ; 와트만 인코포레이티드(Whatman, Inc.)) 상에 적하(loaded)시켰다. 상기 컬럼을 3㎖의 TG로 세척하고 그리고 TG 내의 KCI의 20㎖의 선형 경사(linear gradient ; (0 내지 1.2M)로 전개시켰다. 0.5㎖의 분획을 수집하고, -20℃에서 저장하고 그리고 IHF 활성에 대하여 분석하였다.
폴리클로날 항-IHF를 다음과 같이 준비하였다. 프룬드 완전 부형제(Freund's complete adjuvant)와 함께 250㎍의 정제된 IHF를 토끼들에 주사하였다. 프룬드 불완전 부형제(Freund's incomplete adjuvant)와 함께 250㎍의 IHF의 부스터 면역화(booster immunizations)가 1주, 7주 및 12주 후에 주어졌다. IHF의 면역블럿(immunoblotting)에 의하여 결정된 바와 같이, 초기 주사 13주 후에 수집된 혈청들은 높은 역가(high titer)의 IHF-반응성 물질(IHF-reactive material)을 가졌다. 상기 동물들을 수년간 유지시켰으며, 필요한 경우 그들의 혈청들 내에서 높은 역가의 항-IHF를 유지하도록 후속되는 부스터 면역화가 주어졌다. 상기 항체는 더 이상 정제하지 않았다. 조혈청(crude sera)들을 -70℃에서 저장하였다.
각 서브유닛(시퀀스 동정 번호 34 및 35)의 가장 C-말단의 20개의 아미노산 잔기들에 대응하는 합성 폴리펩티드를 사용하여 문헌 Ditto et al., (1994) J. of Bacteriology, 176(12):3738-3748에 따라 토끼들을 면역화시키는 것에 의하여 각 서브유닛에 대하여 특이적인 항체들을 생성시켰다.
실시예 2
이 실험은 8-웰 챔버 슬라이드(8-well chamber slide) 내에 구축된 생물막의 반전에 대한 시험관 내 모델을 기술하고 있다. 이 실험에서 사용된 물질들은 초콜렛 아가(Chocolate Agar; sBHI(2㎎ 헴(heme)/㎖ 및 2㎎ b-NAD/㎖을 갖는 BHI); 8-웰 챔버 슬라이드(Nunc* Lab-Tek* 피셔 카탈로그 #12-565-18); 멸균 0.9% 식염수; 라이브/데드 백라이트 박테리아 생존성 킷트(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit ; 피셔 카탈로그 #NC9439023) 및 포르말린(Formalin) 들이었다.
1일차에서, 초콜렛 아가 상에서 NTHI 분리를 진행시켰다. 계속해서 이를 37℃ 및 5% CO2에서 20시간 동안 배양시켰다. 다음 날, 박테리아를 5㎖의 평형화된(37℃, 5% CO2) sBHI 내에 현탁시키고 그리고 광학 밀도를 sBHI 내에서의 OD490 = 0.65로 조정하였다. 박테리아를 평형화된 sBHI 내에서 1:6으로 희석(1㎖ 박테리아 + 5㎖ sBHI)시켰다. 계속해서 박테리아를 37℃에서 5% CO2 내에서 정적인 상태에서 3시간 동안 배양시켰다(OD490은 대략 0.65가 되어야 한다). 다음으로, 상기 박테리아를 평형화된 sBHI 내에서 다시 1:2500으로 희석시키고 그리고 200㎖의 상기 박테리아 현탁액을 상기 챔버 슬라이드의 각 웰에 첨가하였다. 희석에 대해서는, 10㎕의 박테리아를 에펜도르프 시험관(eppendorf tube) 내의 990㎕의 sBHI에 첨가하고, 8㎕의 희석액을 각 챔버 내의 192㎕의 sBHI에 첨가하고 그리고 37℃에서 5% CO2 내에서 정적인 상태에서 배양시켰다.
3일차에서 (배양 16시간 이후 상기 웰의 구석으로부터 배지를 흡인해내어 생물막이 파괴되지 않도록 하는 것에 의하여 챔버로부터 배지를 흡인해내었다. 계속해서 200㎖의 평형화된 sBHI를 각 챔버에 첨가하고 그리고 37℃에서 5% CO2 내에서 정적인 상태에서 8시간 동안 배양시켰다. 8시간 후, 상기 배지를 흡인해내고 그리고 200㎖의 평형화된 sBHI를 각 미처리된 챔버 내에 첨가하고; 그리고 토끼 항-rsPilA 등과 같은 200㎖의 간섭제; sBHI 내에서 1 : 50으로 희석된 것 그리고 sBHI 내에서 1 : 50으로 희석된 200㎖의 순수한 토끼 혈청(또는 다른 적절한 혈청 대조)을 첨가하였다. 계속해서 이들을 37℃에서 5% CO2 내에서 정적인 상태에서 배양시켰다.
4일차에서, 배양의 대략 16시간 이후, 흡인 sBHI를 흡인해내고 그리고 상기 생물막을 200㎖ 멸균 식염수로 2회 세척하였다. 상기 식염수를 흡인해내고 그리고 200㎖의 라이브/데드 염색제(Live/Dead stain)를 첨가하였다. 다음으로, 1㎖ 멸균 10mM 인산염 완충된 식염수 내의 3㎖의 성분 A + 3㎖의 성분 B를 첨가하였다. 계속해서 이를 실온에서 정적인 상태에서 광으로부터 보호하면서 15분간 배양시켰다. 염색제를 흡인해내고 그리고 생물막을 200㎖ 멸균 식염수로 2회 세척하였다. 식염수를 흡인해내고 그리고 200㎖ 포르말린을 첨가하여 생물막을 고정시켰다. 계속해서 이를 실온에서 정적인 상태에서 광으로부터 보호하면서 15분간 배양시켰다. 포르말린을 흡인해내고 그리고 생물막을 200㎖ 멸균 식염수로 2회 세척하였다. 가스켓(gasket)을 제거하고 그리고 커버슬립(coverslip)을 슬라이드 상에 위치시키고; 커버슬립을 매니큐어(nail polish)로 밀봉하고 그리고 건조시킨 후 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관측하였다.
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 부비동염, 기관지염, 이염 배지(otitis media) 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 악화(exacerbations)에서 만연하는 해모필루스 인플루엔자에에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리(untreated biofilm mass)는 11.68㎛의 평균 두께의 4.24㎛3/㎛2이 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 1.31㎛의 평균 두께의 0.53㎛3/㎛2으로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 88.8% 감소 및 생물량에서의 87.5%의 감소를 나타내고 있다.
정제된 삽입숙주인자(IHF)를 사용하여 표준 기술에 따라 토끼들에서 대장균 IHF에 대향하는 폴리클로날 항혈청들을 제조하였다. 실시예 1은 대장균으로부터의 IHF의 발현 및 정제를 기술하고 있다.
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 치아 우식증의 초기 및 진전에서 만연하는 스트렙토코커스 뮤탄스에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리는 5.43㎛의 평균 두께의 1.17㎛3/㎛2이 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 0.47㎛의 평균 두께의 0.1㎛3/㎛2으로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 91.3% 감소 및 생물량에서의 91.6%의 감소를 나타내고 있다. 다른 날들에서 시험관 내 생물막 분석을 3회 반복하였다. 최대 높이, 평균 두께 및 생물량에서의 감소 백분율을 하기 표 1에 나타내었다.

스트렙토코커스
뮤탄스		 분석 1 분석 2 분석 3
최대 높이(㎛) 56 24 41
평균 두께(㎛) 65 65 67
생물량(㎛3/㎛2) 37 58 66
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 국부화되고 그리고 확산하는 피부 감염, 만성 코부비동염(chronic rhinosinusitis) 및 병원내감염에서 만연하는 스타필로코커스 아우레우스에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리는 2.2㎛의 평균 두께의 0.3㎛3/㎛2 그리고 17.5㎛의 생물막 높이가 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 1.1㎛의 평균 두께의 0.3㎛3/㎛2 그리고 8㎛의 생물막 높이로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 48.8% 감소 및 생물량에서의 2.7%의 감소를 나타내고 있다(도 7).
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 악화(exacerbation) 및 이염 배지에서 만연하는 모락셀라 카타르할리스에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리는 1.48㎛의 평균 두께의 0.72㎛3/㎛2이 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 0.65㎛의 평균 두께의 0.13㎛3/㎛2으로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 55.8% 감소 및 생물량에서의 82.1%의 감소를 나타내고 있다. 다른 날들에서 시험관 내 생물막 분석을 3회 반복하였다. 최대 높이, 평균 두께 및 생물량에서의 감소 백분율을 하기 표 2에 나타내었다.

모락셀라
카타르할리스		 분석 1 분석 2 분석 3
최대 높이(㎛) 61 33 36
평균 두께(㎛) 92 34 84
생물량(㎛3/㎛2) 92 35 92
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 부비동염, 폐렴 및 이염 배지에서 만연하는 스트렙토코커스 뉴모니아에에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리는 3.99㎛의 평균 두께의 0.64㎛3/㎛2이 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 0.82㎛의 평균 두께의 0.14㎛3/㎛2으로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 79.5% 감소 및 생물량에서의 78.6%의 감소를 나타내고 있다. 다른 날들에서 시험관 내 생물막 분석을 3회 반복하였다. 최대 높이, 평균 두께 및 생물량에서의 감소 백분율을 하기 표 3에 나타내었다.

스트렙토코커스
뉴모니아에		 분석 1 분석 2 분석 3
최대 높이(㎛) 49 51 44
평균 두께(㎛) 25 64 79
생물량(㎛3/㎛2) 51 61 79
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 낭포성 섬유증, 폐염, 피부 및 연조직(soft tissue) 감염 및 의료기구 상에서 만연하는 슈도모나스 아에루기노사에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리는 25.70㎛의 평균 두께의 7.0㎛3/㎛2 그리고 40㎛의 생물막 높이가 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 10.3㎛의 평균 두께의 3.4㎛3/㎛2 그리고 27.5㎛의 생물막 높이로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 60.1% 감소 및 생물량에서의 50.8%의 감소를 나타내고 있다(도 7).
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 임질 내에 존재하는 나이세리아 고노로에아에에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리는 22.02㎛의 평균 두께의 9.5㎛3/㎛2 그리고 40㎛의 생물막 높이가 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 3.4㎛의 평균 두께의 0.8㎛3/㎛2 그리고 27.5㎛의 생물막 높이로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 84.5% 감소 및 생물량에서의 92.1%의 감소를 나타내고 있다(도 7).
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 요로감염증에서 만연하는 우로패소게닉 이. 콜라이(Uropathogenic E. coli ; 요로감염 대장균)에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 미치료된 생물막 덩어리는 31.73㎛의 평균 두께의 1.75㎛3/㎛2이 되는 것으로 측정되었다. 치료 후, 상기 생물막 덩어리는 1.62㎛의 평균 두께의 0.75㎛3/㎛2으로 감소되었다. 따라서, 이는 평균 두께에서의 94.9% 감소 및 생물량에서의 56.9%의 감소를 나타내고 있다. 다른 날들에서 시험관 내 생물막 분석을 3회 반복하였다. 최대 높이, 평균 두께 및 생물량에서의 감소 백분율을 하기 표 4에 나타내었다.

우로페소게닉
이.콜라이		 분석 1 분석 2 분석 3
최대 높이(㎛) 69 65 76
평균 두께(㎛) 97 33 95
생물량(㎛3/㎛2) 98 96 57
이 방법 및 항-IHF 항체를 사용하여, 본 출원인들은 피부 감염에서 만연하는 스타필로코커스 에피데르미디스에 의해 생성된 생물막을 감소시켰다. 다른 날들에서 시험관 내 생물막 분석을 3회 반복하였다. 최대 높이, 평균 두께 및 생물량에서의 감소 백분율을 하기 표 5에 나타내었다.

스타필로코커스
에피데르미디스		 분석 1 분석 2 분석 3
최대 높이(㎛) 42 38 56
평균 두께(㎛) 62 71 92
생물량(㎛3/㎛2) 62 76 88
실시예 3
중이 감염(middle ear infection ; 또는 이염 배지(OM))은 전 세계적으로 매년 50,000,000 내지 330,000,000(50 - 330 million)명의 어린이들이 고통받는 전 세계적으로 고도로 만연하는 질병이다. 매년 미합중국에서만 5십억 내지 6십억(5 - 6billion) 달러 사이의 비용으로 예측되어 OM의 사회경제적 부담이 또한 매우 크다. OM의 3가지 지배적인 박테리아 병원균들 모두 시험관 내 그리고 생체 내 둘 다에서 생물막을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 임상의는 상기 OM의 만성(chronicity)과 재발(recurrence)이 적어도 부분적으로는 중이강(middle ear cavity) 내에서의 박테리아 생물막의 형성으로 인한 것이라는 것이 임상의들에는 인식되고 있는 것이다. OM의 하나의 친칠라 모델에서, 어린 친칠라들에 먼저 바이러스 '감기'가 주어지고, 후속하여 1주 후, 코 안으로 생균(viable bacteria)의 접종원(inoculum)으로 접종시켰다. "우리 아이가 감기에 걸렸고 일주일 후에 귀가 감염되었어요"라는 인간 상태와 유사하게 친칠라는 또한 접종 일주일 후 박테리아 OM을 발달시킬 것이며, 한편으로는 바이러스 상기도 감염(viral upper respiratory tract infection)을 경험할 것이다. 일단 박테리아가 상기 중이에 접근하면(유스타키오관(Eustachian tube)의 상승을 통하거나 또는 상기 중이의 공동에로의 직접적인 접종을 통하여), 이들은 강인한 생물막을 형성할 것이다. 따라서 본 출원인들은 생각하고 그리고 본 명세서에서 보고된 바와 같은 친칠라 모델을 사용하여 현존하는 생물막의 신속한 분해(rapid resolution)의 결과를 가져오는 IHF 면역화의 보호 효능을 입증하였다. 이 모델은 또한 항-DNABII 항체의 수동 전달(passive delivery)를 통하거나 또는 IHF 또는 다른 DNABII 패밀리 멤버에 결합하는 것으로 알려진 소분자 또는 다른 시약의 전달을 통한 치료학적 접근법에 유용하다.
상기 친칠라 모델이 인간 백신의 개발 및 전-임상 시험(pre-clinical testing)을 위하여 사용되기 때문에, 인간 숙주, 특히 어린아이와 의미있는 면역학적 평행(immunological parallels)을 구축하는 것이 중요하다. 본 출원인들은 NTHI로 인한 AOM을 앓는 어린아이로부터 회수된 유출물(effusions) 및 실험적 NTHI 유도 OM을 앓는 친칠라의 중이액(middle ear fluids)들이 유사한 계층적 추정기법(hierarchical manner)에서 OMP P5의 면역우성의 영역(immunodominant regions)들을 인식한다는 것을 밝혔다(예를 들면, 문헌들 Novotny LA, et al., (2000) Infect Immun. 68(4):2119-28; Novotny LA, et al., (2007) 9th International Symposium on Recent Advances in Otitis Media; St. Pete Beach, FL; Novotny LA, et al., (2002) Vaccine 20(29-30):3590-97을 참조하시오). 본 출원인들은 또한 실험 OM을 앓는 친칠라, 자연적인 OM을 앓는 어린아이 그리고 COPD가 악회된 성인들 모두가 고도로 유사한 방법으로 PilA를 대표하는 펩티드를 인식한다는 것을 발혔다(예를 들면, 문헌들 Adams LD, et al., (2007) 107th General Meeting, American Society for Microbiology; 2007; Toronto, ON; Adams LD, et al., (2007) 9th International Symposium on Recent Advances in Otitis Media; St. Pete Beach, FL. 을 참조하시오). 따라서, 실험 OM을 앓는 친칠라와 자연적인 질병을 앓는 어린아이들은 적어도 2개의 연관되지 않은 NTHI 단백질 부착소(adhesins)들에 대하여 유사하게 면역학적으로 반응한다. 이러한 평행은 상기 친칠라 AV-NTHI 중복감염(superinfection) 모델이 신규한 11-가의 단백질 D-뉴모코칼 다당류 공액 백신(novel l1-valent Protein D-pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine)의 전-임상 효능 시험을 수행하는 데 사용되는 경우에서 최근 궁극의 시험으로 되었다. 상기 친칠라에서 수득된 데이터는 34%의 효능을 예측하고 있는 반면에, 어린아이에서 시험된 경우, 해모필루스 인플루엔자에-유도 OM에 대하여 수득된 효능은 35.6%이었다(예를 들면, 문헌들 Novotny LA, et al., (2006) Vaccine 24(22):4804-11 및 Prymula R, et al., (2006) Lancet. 367(9512):740-8을 참조), 따라서 OM 백신 후보들의 개발 및 시험을 위한 이 모델의 적합성의 강한 증거를 부여할 수 있다.
본 출원인들은 점막/전신 부형제와 함께 전달된 IHF로의 TC 면역화 2주 후 친칠라의 중이 내에 잔류하는 사전-형성된 생물막에서의 극적인 감소를 밝혀냈다.
48개체의 성년 친칠라들을 라우처 친칠라 랜치(Rauscher's Chinchilla Ranch ; 미합중국 오하이오주 라루에(LaRue, Ohio) 소재)에 주문하였으며, 연구의 시작에 앞서 7 내지 10일 동안 동물 사육장(vivarium)에 순응시켰다. TB 접종[중이강 내로의 경소낭(transbullar) 또는 직접적인 접종]에 앞서, 혈청을 수집하기 위한 제한된 용적의 전출혈(prebleed)와 마찬가지로 기저선 이경검사(baseline otoscopy) 및 고막기능검사(tympanometry)를 수행하였다.
친칠라들을 마취시키고 그리고 대략 1000cfu를 포함하는 300㎕의 NTHI(균주 #86-028NP) 현탁액을 경소낭 접종을 통하여 중이의 공간 내로 도입시켰다. 동물들이 회복되도록 허용하고, 계속해서 IACUC 수용 동물 사용 프로토콜(IACUC accepted animal use protocols)에 따라 부작용을 매일 감시하였다. 전 연구를 통하여 매 2 내지 3일 마다 반복적인 이경검사 및 고막기능검사를 수행하였다.
접종 4일 후(+4일), 친칠라들을 마취시키고 그리고 CT 스캔을 수행하여 중이 내에 존재하는 생물막을 가시화하고 그리고 면역화-이전 이미지(pre-immunization images)들을 수득하였다. 귓바퀴(pinnae)의 표면을 세척하고 그리고 멸균의 무발열원 식염수(sterile pyrogen free saline)으로 습윤화시킨 멸균 거즈 패드로 닦아내는 것에 의하여 수화시켰다. 약 2분(상기 귓바퀴가 건조되도록 허용되는 시간) 후, dmLT, IHF(실시예 1에 따라 정제된 대장균 IHF) 둘 중의 어느 하나 + dmLT 또는 IHF + rsPilA + dmLT 용액들 중 어느 하나의 50㎕ 용액을 귓바퀴에 첨가하고 그리고 부드럽게 맛사지해 줄 수 있다. 집단(cohot) 당 3개체의 친칠라들을 희생시키고 그리고 조직/샘플을 수집하여(+4일차 및 +11일차) 작용의 메카님즘의 결정을 개시하였다.
접종 11일 후(+11일), 상기 귓바퀴가 세척되고/수화되고 그리고 면역원들이 국부적으로 투여되는 앞서 기술한 바와 같은 2차 면역화를 수행하였다. 집단 당 3개체의 친칠라들을 희생시키고 그리고 조직/샘플을 수집하여 작용의 메카니즘의 결정을 개시하였다.
접종 18일 후(+18일), 친칠라들을 마취시키고 그리고 CT 스캔을 수행하여 임의의 생물막의 존재를 동정하는 것과 마찬가지로 면역화-이전 CT 스캔들과 비교하였다. 계속해서 상기 돔루들을 출혈시켜 혈청을 수집하고 그리고 안락사시켰다. 소낭들을 절개해내고 그리고 존재하는 임의의 액체들을 무균수집(aseptically collected)하고, 계속해서 상기 소낭들을 개방하여 소낭 내부 및 존재하는 임의의 생물막을 가시화시켰다. 이미지들을 수집하고 그리고 소낭들을 1㎖의 멸균식염수로 세척하고 그리고 재-이미지화(re-imaged) 시켰다. 존재하는 임의의 생물막과 함께 상기 점막을 우측 소낭으로부터 수집하고 그리고 사전평량된 시험관(preweighed tube)에 위치시켰다. 이들 조직들을 균질화시키고, 순차적으로 희석시키고, 그리고 플레이팅시켜 cfu NTHI/㎎ 습윤중량 조직(wet weight tissue)을 결정하였다. 좌측 소낭을 OCT 화합물로 충진시키고 그리고 조직학적 분석(histological analysis)을 위해 급속 동결(snap frozen) 시켰다.
거주하는 생물막들과 함께 좌측 및 우측 중이강의 이미지들을 뒤섞고 그리고 매 동물 마당 2개의 이미지들을 단일의 파일 내로 편집하여 맹검 평가자(blinded evaluators)로 하여금 순위매기기(ranking)를 하였다. 각 동물의 중이 내에 잔류하는 생물량의 상대적인 양을 하기 표 6에 나타낸 단위를 사용하여 맹검 평가자로 하여금 0 내지 4+의 단위로 순위매기기를 하였다. 상기 수집된 중이 유출물에 대한 것과 마찬가지로 혈청에 대하여 적정 효소면역분석법(Titer ELISAs), 사이토카인 어레이(cytokine arrays) 및 바이어코어(Biacore)를 수행하였다. 상기 OCT 포매 중이(OCT embedded middle ears)들을 절단하고 그리고 기본 형태학 및 구성(basic morphology and architecture ; H&E)을 위하거나 또는 면역조직학 및/또는 면역형광을 사용하는 IHF의 존재를 위하여 염색시켰다.
점수 기준
0 생물량의 증거 없음.
1+ 생물량이 중이의 공간의 25% 이하를 채움. 골중격(bony septa)의 접합부 아래에 소낭이 보임.
2+ 생물량이 중이의 공간의 25% 초과 50% 이하를 채움. 소낭 아래 어디에서 골중격이 만나는 지를 가시화하는 것이 불가능함.
3+ 생물량이 중이의 공간의 50% 초과 75% 이하를 채움. 생물량이 골중격의 길이의 50%를 초과하여 덮음.
4+ 생물량이 중이의 공간의 75%를 초과함. 골중격이 보이지 않음; 생물막으로 보기 어려워짐.
생체 내에서 형성된 생물막의 동결 절편들의 면역형광 이미지화가 하기에 따라 수행되었다. 절개 후, 각 친칠라의 중이를 OCT 포매 화합물(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 미합중국 필라델피아주 피츠버그(Pittsburgh, PA) 소재)로 채우고 그리고 액체 질소 상에서 급속 동결(flash frozen)시켰다. 소낭 하부를 구성하는 뼈를 제거하여 중이 점막과 존재하는 생물막을 손상 없이 남겨두었다. 계속해서 그 결과의 블럭(block)을 절개하여 상기 생물막의 단면을 노출시키고 그리고 OCT 내에서 재포매시켰다. 마이크롬 로터리 크라이오톰(Microm rotary cryotome)을 사용하여 10미크론의 연속 절편들을 절단하고, 유리슬라이드(glass slide ; 메르세데스 메디컬(Mercedes Medical), 미합중국 플로리다주 사라소타(Sarasota, FL) 소재)에 고착시키고 그리고 -80℃에서 저장하였다. 후에 절편들을 염색시켜 생체 내에서 형성된 생물막 내로의 IHF의 상대적인 포합(relative incorporation)을 결정하였다. 요약하면, 슬라이드들을 공기-건조시키고, 냉 아세톤 내에서 고정시키고, 계속해서 완충제(0.05M 트리스 염산염, 0.15M NaCl 및 0.05% 트윈 20, pH 7.4) 내에서 평형화시켰다.
절편들을 제조업자들의 지시사항들에 따라 이미지-iT FX 시그널 인핸서(image-iT FX signal enhancer ; 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 미합중국 오레건주 유진(Eugene, OR) 소재)로 그리고 백그라운드 스나이퍼(Background Sniper ; 바이오케어 메디칼(BioCare Medical), 미합중국 캘리포니아주 콩코드(Concord, CA) 소재)로 블록킹시켰다. 계속해서 절편들을 폴리클로날 토끼 항-IHF의 1:200의 희석액과 함께 습윤실(humidified chamber) 내에서 40℃에서 밤새도록 배양시켰다. 슬라이드들을 더 린스해내고 그리고 알렉사플루오어 594(AlexaFluor 594 ; 인비트로겐(Invitrogen))에 공액화된 염소 항-토끼 IgG와 함께 실온에서 30분간 배양시켰다. 대비염색(counterstain)으로서, 절편들을 DAPI와 함께 배양시키고 그리고 프롤롱 골드 안티페이드 시약(ProLong Gold antifade reagent ; 몰레큘라 프로브스, 미합중국 오레건주 유진 소재)을 사용하여 커버슬립시켰다. 순수한 토끼 혈청이 음성 대조로서 기능하였다. 절편들을 자이스 액시오버트 200 역전 현미경(Zeiss Axiovert 200 inverted microscope ; 칼 자이스 인코포레이티드(Carl Zeiss Inc.), 미합중국 뉴욕주 쏜우드(Thornwood, NY) 소재)에 부착된 자이스 LSM 510 메타 공초점 시스템(Zeiss LSM 510 Meta confocal system)으로 관측하였다.
평균 CFU/㎎ 조직 및 평균 CFU NTHI/㎖ 상청액에서의 명백한 차이들이 대응 t-검정(paired t-test)에 의해 결정되었다. 0.05 이하의 p-값(p-value≤0.05)을 명백한 것으로 간주하였다. 군들 중에서의 상대적 생물량에서의 유의성(significance)을 미-대응 t-검정(unpaired t-test)에 의해 평가되었다. 0.05 이하의 p-값을 유의성 있는 것으로 간주하였다.
도 9에서 나타난 바와 같이, 부형제로 면역화된 친칠라의 중이 내에 잔류하는 생물량에 대한 평균 점수인 패널 A는 2.8이었으며, 이는 중이의 박테리아 접종 18일 후에 대부분의 동물들에서 명백하게 잔류하는 질병 및 사전-형성된 생물막의 분해의 불충분함을 나타내었다. 대조적으로, 대장균 IHF + 부형제 면역화된 동물에 대한 평균 점수는 1.5이었다. +2.8의 평균 점수를 받은 잔존 생물량 및 +1.5의 평균 점수를 받은 잔존 생물량의 대표적인 이미지들을 도 9, 패널 B에 나타내었다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 초콜렛 아가 상의 생물량 및 배양물의 균질화에 의하여 측정된 바와 같이 잔류하는 생물량 내에 존재하는 박테리아 하중의 통계학적으로 유의성 있는 감소(패널 B 참조)와 마찬가지로 중이 내의 변형된 생물량 구조의 면역학적 증거(패널 A 참조)에 의하여 질병 분해(disease resolution)를 부가적으로 측정하였다. 더욱이, 단리된 대장균 IHF로 면역화된 모든 동물들이 강한 국부적 및 전신적 면역 반응을 뒷받침하였으며, 부검에 의하여 언급된 바와 같은 면역화의 결과로서의 명백한 2차 후유증을 나타내는 동물은 없었다(데이터는 나타내지 않음).
항-IHF 및 또한 정제된 대장균 IHF가 시험관 내에서 생물막을 탈벌크시키는데 사용되는 경우, 면역원으로서 생체 내에서 진행중인 생물막 질병을 분해할 수 있는 폴리클로날 항체의 형성을 유도하는 데 사용되는 경우 뚜렷하게 관측된 효능은 왜 포유동물 숙주가 재조합 및/또는 만성 질병 상태의 박테리아 생물막 내의 eDNA와 연관되는 DNABII 단백질에 대하여 천연적으로 유효한 면역 반응을 뒷받침하지 못하는 지에 대한 난문제(conundrum)를 만들었다. IHF가 DNA에 결합된 경우의 해석된 구조의 검토에서(문헌 Rice et al., (1996) Cell 87(7): 1295-1306 참조), 상기 단백질 구조의 유의한 부분이 결합된 DNA에 의하여 장애가 된다는 것이 명백하고, 이는 박테리아 생물막 내의 eDNA에 결합되는 경우 IHF 및/또는 HU의 도메인들의 보호 에피토프의 장애(occlusion)의 잠재성을 암시하고 있다. 면역원으로서 DNA가 결합되지 않은 순수한 IHF의 사용이 이러한 장애를 극복하고 그리고 그에 의하여 보호 항체의 포스터 생산(foster production)을 제공할 수 있다는 가설이 성립된다.
eDNA가 결국 면역화에 의하여 DNABII 패밀리 멤버에 eeogid하는 보호 항체의 발달을 예방할 수 있는 지, 반면에 순수한 단백질의 사용이 유효한 지의 여부를 결정하기 위하여, 두 번째로 큰 군의 연구가 수행되었으며 여기에서 앞서 상세가헥 기술한 바와 같은 상기 친칠라 연구가 필수적으로 반복되었다.
제2의 동물 면역화 연구를 위하여, 고막기능검사 및 비디오 이경검사에 의하여 중이 질병의 증거가 없음을 나타낸 12개체의 성년 친칠라(500 내지 700g의 체중)들을 등록하고 그리고 각 5개체의 동물의 4개의 군으로 구분하였다. 모든 동물들을 다시 경소낭으로 소낭 당 대략 1000CFU NTHI 균주 86-028NP로 접종시켰다. 4일 후, 이들 동물들의 중이강 내에 생물막이 형성된 후, 이들을 앞서 기술한 바와 같이 경피 경로(transcutaneous route ; TCI)로 면역화시켰다. 제형들은 dmLT 10㎍과 혼합된 IHF 10㎍, DNA에 사전-결합된 IHF + dmLT 10㎍ 또는 dmLT 단독 10㎍으로 이루어졌다.
DNA에 사전-결합된 IHF를 갖는 TCI가 동일한 핵단백질 복합체(nucleoprotein complex)가 피하(SQ)로 전달되는 경우에서 유도되는 것 및 IHF 단독으로 유도된 것과 비교하여 동일한 면역 반응의 결과를 가져오는 지의 여부를 결정하기 위하여, 2개체의 성년 친칠라들을 면역화시켜 항혈청을 생산하였다. 각 동물은 시동용량(priming dose)을 수령하고 후속하여 2가지의 동일한 촉진제가 30일 간격으로 전달되었다. 친칠라 숙주 내에서의 그의 입증된 강력한 부형제 특성들로 인하여, 면역원들을 부형제 모노포스포릴리피드 A(monophosphoryllipid A (MPL)(10㎍/투여량)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미합중국 미주리주 세인트루이스(St. Louis, MO) 소재)와 혼합하였다(예를 들면, 문헌들 Bakaletz et al., (1999) Infect Immun. 67(6):2746-2762 및 Kennedy et al., (2000) Infect. Immun. 68(5):2756-2765을 참조하시오). 한 개체의 친칠라를 10㎍의 IHF + MPL로 면역화시키고, 그리고 다른 개체는 DNA에 결합된 IHF + MPL 10㎍을 수령하였다. 모든 투여량들을 총 용적 200㎕로 피하로 전달하였다. 최종 촉진제를 수령한 15일 후, 동물들을 채혈하여 혈청을 확보하고 그리고 혈청들을 웨스턴 블럿 및 효소면역분석법을 통하여 분석하여 상호간의 역가 및 IHF에 대한 항체 반응성의 특이성 둘 다를 결정하였다.
중이들을 다시 후속적으로 상기 연구의 완료에 의한 질병 중증도에 대하여 0 내지 4+로 점수를 내었다. 면역화를 위한 복합체 내에 잔류하는 상기 IHF 및 DNA를 더 잘 확증하기 위하여, 2:1의 몰비(molar ratio)[IHF(5μM)에 대하여 DNA(10μM)]에서의 박테리오파지 람다 재조합 자리 attP(bacteriophage lambda recombination site attP)로부터의 고 친화성 IHF 결합 자리의 공개된 공-결정화 연구(예를 들면, 문헌 Rice et al., (1996) Cell 87(7): 1295-1306을 참조하시오)에서 사용된 것들과 동일한 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 이 양은 크기에서 이 DNA 표적에 결합된 IHF의 Kd의 적어도 3배이다. 도 11에서 나타난 바와 같이, 결국 IHF는 전기영동 이동성 전이 분석에서 그의 감소된 이동성(mobility)으로 증명된 바와 같이 dsDNA와 결합하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 단리된 대장균 IHF로 면역화된 동물들은 부형제 단독으로 면역화된 대조들(평균 생물량 점수 = 2.2) 또는 부형제와 혼합된 DNA로 면역화된 대조들(평균 생물량 점수 = 2.8)과 비교하여 0.9의 평균 잔류 중이 생물량 점수로 질병 상태에서 극적인 감소를 나타내었다. 흥미롭게도, IHF-DNA 복합체로 면역화된 이들 동물들은 또한 중이들이 상기 부형제 단독 또는 부형제와 혼합된 DNA를 수령한 군들로부터 통계학적으로 유의성 있게 다르지 않은 2.5의 평균 생물량 점수를 얻어 유의성 있는 잔존 박테리아 생물량을 갖는 것을 입증하였다. 이러한 결과는, 자연적인 질병 중의 케이스가 될수 있다는 것으로 가설을 세울 수 있는 것과 같이, 충분한 eDNA 단편들이 존재하는 경우, 이러한 상황은 중화 항체의 생성을 위한 임계적 IHF 에피토프의 장애의 결과를 가져올 수 있다는 것을 강하게 암시한다.
관측된 DNA 장애 결과가 경피 면역화 경로의 사용에 특이적이지 않다는 것을 확실하게 하기 위하여, 친칠라 숙주 내의 항원 제공 세포에로의 항원의 전달을 확실하게 하기 위한 피하(SQ) 면역화 경로를 사용하여 이들 면역화를 반복하였다. 도 13에 나타난 바와 같이, 단리된 대장균 IHF로의 SQ 면역화가 단리된 IHF에 대한 강한 면역 반응의 생성의 결과를 가져온 데 비하여, 과량의 DNA에 사전-결합된 대장균 IHF로의 면역화는 웨스턴 블럿으로 분석하는 경우 IHF를 인식하는 항체를 검출가능하게 유도하는 데 실패하였다. 효소면역분석법으로 분석하는 경우, 단리된 IHF에 대한 상호 역가가 올리고뉴클레오티드에 사전-결합된 IHF로 면역화된 동물에 대하여 1000이었던 데 비해, 천연의 IHF로 면역화된 동물에 대한 상호 역가는 8000이었다(IHF에 대한 두 동물들의 사전-면역 상호 역가는 100이었다). 종합적으로, 이들 결과들은, 천연의 질병 상테 동안에 일어날 수 있는 바와 같은, eDNA에의 IHF의 결합이 잠재적으로 보호 후천성 면역 반응(protective acquired immune response)의 생성에 필요한 IHF의 에피토프 또는 도멘인을 블록킹할 수 있다는 우리의 가설과 일치하였다. 더욱이, 본 명세서에서 기술된 두 전-임상 친칠라 연구에서 입증된 바와 같이, 천연의 IHF(그에 DNA가 결합되지 않은)로의 면역이 보호 또는 중화하는 항체들의 생성 쪽으로의 면역 반응의 효과적인 지향을 허용하는 것으로 나타났다.
실시예 4
다수의 구강 박테리아(예를 들면, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스, 포르피로모나스 긴기발리스)가 치주염 및 임플란트 주위염(peri-implantitis) 등과 같은 염증성 질환의 발병과 연관되었으며, 이들은 치조골(alveolar bone) 및 잇몸(gingiva)을 파괴한다. 이들 박테리들의 발병의 조사는 유효한 동물 모델의 결여로 장애를 받았다. 특정의 박테리아의 발병을 조사하는 시도들 중의 하나는 외인성 박테리아가 동물의 구강(oral cavity) 내로 도입되는 경우 생물막을 구축하는 데 어려움이 있다. 비록 치주염의 동물 모델이 개발되었음에도 불구하고, 접종된 동물의 구강으로부터 배양가능한 박테리아가 거의 회수되지 않았다. 특정의 박테리아의 발병을 평가할 수 있는 유효한 동물 모델의 개발은 그들의 발병 메카니즘을 설명하는 데 크게 도움이 될 수 있다.
가공된 티타늄 치아 이식물(1.2 x 4.5㎜)의 표면을 AlO3(100㎛)로의 그리트 블라스팅(grit blasting) 및 염산 에칭(HCl etching ; pH 7.8에서 80℃에서 20분간)에 의하여 개질시켰다. 가공되고 그리고 나노-질감화시킨 임플란트(machined and nano-textured implants)를 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aa)의 D7S 임상 균주(D7S clinical strain)로 접종시킨 TSB 배지 내에서 37℃에서 1 내지 3일간 배양시켰다. 상기 임플란트 상의 박테리아 생물막을 라이브/데드?바크라이트™(LIVE/DEAD?BacLight™)으로 염색한 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscopy)과 마찬가지로 SEM으로 분석하였다. 구축된 Aa 생물막을 갖거나 갖지 않는 임플란트들을 턱의 소구치(premolar)와 절치(incisor) 영역 사이에서 경점막으로(transmucosally) 암컷 집쥐(female rats)들의 치조골 내로 위치시켰다. 생체 내에 위치된 임플란트 상의 Aa 생물막의 존재를 검출하기 위하여, 2일 후, 박테리아 샘플들을 타액(saliva)과 임플란트의 구강 표면들로부터 수집하였다. 중합효소연쇄반응 분석과 마찬가지로 배양에 의하여 Aa를 검출하였다. 이식 6주 후 임플란트 주위 뼈와 점막 조직의 마이크로-CT 및 조직학적 분석을 수행하였다.
배양 1일 후, 구형 Aa 세포(coccoid-shaped Aa cells)들의 집합체(agglomerates)가 상기 임플란트 전체에 걸쳐 산포되어 발견되었다. 2일 후, 집합체들의 갯수 및 크기가 감소하고 그리고 변화하는 길이의 보다 많은 세포들이 구형 형태(coccoid morphology)를 갖는 박테리아들 사이에 걸쳐서 관측되었다. 배양 3일 후, 상기 집합체들이 거의 사라진 한편으로, 임플란트 표면의 큰 면적들이 막대형 형태(rod-shaped morphology)를 갖는 박테리아로 피복되어 밀집되게 채워진 생물막을 형성하였다. 이러한 3일 차의 임플란트 상의 Aa 생물막의 라이브/데드? 염색이 모든 생물막 박테리아의 75 내지 80%에 대하여 녹색 신호를 나타내어 면역반응이 제대로 이루어지는 막 온전성(uncompromised membrane integrity)을 갖는 살아 있는 세포들을 나타내었다. 생체 내에 위치되는 임플란트 상의 Aa 생물막의 미생물학적 및 중합효소연쇄반응 검출이 상기 임플란트 표면으로부터의 샘플에 대하여는 양성이었으며, 대조 임플란트와 마찬가지로 타액 샘플에 대하여는 음성이었다. 임상 실험은 Aa 생물막을 갖는 임플란트 주위에 대조의 미처리된 임플란트와 비교하여 유의성 있는 임플란트 주위 점막 염증(peri-implant mucosal inflammation)을 입증하였다. 임플란트 주변 뼈 및 점막 조직의 마이크로-CT 및 조직학적 분석이 진행 중이다. 나노-질감화시킨 임플란트 표면들은 Aa 생물막의 구축에서 더욱 선호적이며 임플란트 주위 염증의 위험을 증가시킨다.
실시예 5
이 실험은 라임병을 치료하기 위한 간섭제의 전-임상 시험을 위한 생쥐 모델을 제공한다. 문헌 Dresser et al. Pathogens 5(12)e1000680, Epub 2009 Dec. 4을 참조하시오. 라임병은 미합중국 내에서 가장 흔한 진드기-매개 질병(tick-borne disease)이다. 1992년과 2006년 사이에 보고된 사례들이 배 이상 증가하였으며, 대략 29,000건의 새로운 사례들이 2008년에 확인되었다. 라임병의 케이스의 실제의 수는 풍토병 영역에서의 6 내지 12의 인자로 보고된 케이스들을 초과할 수 있다. 의미상, 이들 풍토병 영역들은 개체군들이 시에서 교외 및 농촌 지역으로의 이사하는 것을 지속함에 따라 그리고 흰꼬리 사슴(whitetail deer ; 이는 진드기 종 이속데스(Ixodes)를 운반함)이 이들 영역들을 배회하는 것이 증가함에 따라 확장되고 있다.
라임병은 스피로헤타(spirochete)인 미생물 보렐리아 부르그도르페리에 의하여 야기된다. 보렐리아 부르그도르페리는 이속데스가 무는 것을 통하여 전달되고 그리고 후속하여 혈류를 통하여 다른 조직 및 기관에로 분산된다.
이 동물 모델에서, C3H/HeN 생쥐들에 등쪽 피하 및 복강내 주사를 통하거나 또는 정맥내 주사를 통하여 스피로헤타를 주사하였다. 주사 7일 후, 미생물 부담(microbial burden)의 측정 및 조직과 기관 내의 병리학의 평가를 위하여 혈액 및 부검 시편들을 회수하였다. 본 발명의 방법 및 조성물은 그 결과의 접종에 후속하여 형성되는 보렐리아 부르그도르페리 생물막의 감소 및/또는 제거를 위한 예방적 전략(preventative strategies)과 마찬가지로 치료제로 발전되는 것으로 고려되고 그리고 발병 및 상기 질병의 만성적 속성에 기여하는 것으로 여겨진다.
실시예 6
이 실험은 낭포성 섬유증에 대한 간섭제의 전-임상 시험을 위한 돼지 모델을 제공한다. 문헌 Stoltz et al. (2010) Science Translational Medicine 2(29): 29ra31을 참조하시오. 낭포성 섬유증은 CF 막투과 조절자(CF transmembrane conductance regulator ; CFTR이라고 부름) 음이온 채널을 인코딩하는 유전자에서의 돌연변이로 인한 상염색체열성 질병(autosomal recessive disease)이다. 이 모델에서, "CFTR"이라 불리우는 유전자들에서의 결핍을 수반하는 특별히 사육된 돼지들을 동시적으로 다중의 박테리아 종들에 의한 하부 기도(lower airway)의 감염을 포함하는 CF vP 질환의 전형적인 특징을 발달시킨다. 상기 돼지는 1) 이들 CF 돼지들을 폴리펩티드로 또는 다른 면역원성 시약으로 면역화시키고 그에 의하여 폐 안에서 박테리아 생물막을 근절시킬 수 있는 항체의 형성을 유도하는(항체가 어떻게 IHF가 실시예 1에서 나타난 바와 같은 활성 면역화에 따라 친칠라의 중이 내에 거주하는 생물막을 근절시키는 지와 유사하게 간섭제로 면역화시켜 분무화에 의하여 이들 동물들의 폐에 항-IHF(또는 다른 간섭제)를 전달하여 질병 및 연관된 병리학의 징후들의 회복을 평가하도록 할 수 있다.
실시예 7
본 출원인들은 또한 결핵(tuberculosis ; TB)에 대한 전-임상 모델을 제공한다. 문헌 Ordway et al. (2010) Anti. Agents and Chemotherapy 54: 1820을 참조하시오. 미생물 마이코박테리움 투베르큘로시스가 전 세계적 유행병을 성장시키는 원인이 된다. 현재의 수치들은 연간으로 대략 8,000,000명의 TB의 신규한 사례 및 약 27,000,000명의 TB로 인하여 사망한다고 암시하고 있다. HIV를 앓는 개인의 공-감염(co-infection)으로서의 이 미생물의 역할에 더하여(HIV로 감염된 약 45,000,000 중에서 약 1/3이 또한 마이코박테리움 투베르큘로시스로 공-감염된 것으로 추정됨), 분별되는 그의 특별한 골칫거리는 여러 약물들에 대하여 고도로 내성이 되었다는 것과 4반세기(quarter of a century) 동안 TB에 대한 새로운 약물이 도입되지 않았다는 것이다. 이 동물 모델에서, SPF 기니피그(SPF guinea pigs)들이 장벽 콜로니(barrier colony) 내에서 유지되고 그리고 에어로졸화된 스프레이(aerosolized spray)를 통하여 약 20cfu의 마이코박테리움 투베르큘로시스 균주 에르드만 K01 간균(M. tuberculosis strain Erdman K01 bacilli)을 그들의 폐 내로 전달하여 감염시켰다. 동물들을 희생시켜 접종 후 25, 50, 75, 100, 125 및 150엘에서의 박테리아 하중 및 조직병리학적 평가에 대한 조직들의 회복을 결정하였다. TB의 전통적인 징후들을 발달시키지 않는 생쥐들과는 달리, 이러한 방법으로 접종된 기니피그들은 인간 질병의 전형적인 특징(hallmark)인 잘 구축된 중심성 괴사(central necrosis)를 수반하는 육아종을 발달시킨다. 더욱이, 인간과 유사하게, 기니피그들은 원발소 합병증(primary lesion complex)의 일부로서 중증 화농육아종(pyogranulomatous) 및 배액림프절의 괴사성 림프절염(necrotizing lymphadenitis)을 발달시킨다. 이러한 모델의 사용은 접종에 후속하여 이들 동물들의 폐 내에서 형성되는 것을 관측된 결과의 마이코박테리움 투베르큘로시스 생물막의 감소 및/또는 제거를 위한 예방적 전략과 마찬가지로 치료제를 확인하고 그리고 동정하는 전-임상 스크리닝을 제공할 수 있고 그리고 발병 및 상기 질병의 만성적 속성에 기여하는 것으로 여겨진다.
실시예 8
카테터/유치 장치 생물막 감염의 여러 동물들이 알려져 있다. 문헌 Otto (2009) Nature Reviews Microbiology, 7:555을 참조하시오. 비록 통상의 스킨 플로라(skin flora)가 전형적으로 고려되기는 하나, 미생물 스타필로코커스 에피데르미디스가 미생물 감염의 병인(causative agents)들 중의 첫 번째로 위치되는 핵심의 기회주의적인 병원균(opportunistic pathogen)으로서 고려될 수 있는 것이 되었다. 주로, 이 박테리아는 장치 삽입 동안에 통상의 피부 이주종(skin colonizer)에 의하여 오염되는 유치 의료 장치 상에서 발달하는 감염의 대부분의 원인이다. 비록 전형적으로 생명을 위협하는 것은 아니지만, 이들의 빈도와 함께 이들 생물막 감염의 치료와 연관되는 난점은 이들이 심각한 공중위생의 부담이 될 수 있다는 것이다. 스타필로코커스 에피데르미디스로 야기되는 혈관 카테터 연관 혈류 감염(bloodstream infections) 만의 치료와 연관된 현재의 비용이 미합중국 내에서 연간 2,000,000,000불($2 billion)에 달한다. 스타필로코커스 에피데르미디스에 더해, 엔테로코커스 페칼리스 및 스타필로코커스 아우레우스들이 또한 유치 의료 장치 상에서 발견되는 오염들이다. 모두 발병의 분자 메카니즘을 연구하는 데 사용되고 그리고 예방 및/또는 치료의 연구에 제공되는 토끼, 생쥐, 기니피그 및 집쥐들을 포함하여 카테터-연관 스타필로코커스 에피데르미디스 감염의 여러 동물 모델들이 존재한다. 집쥐 목정맥(jugular vein) 카테터를 사용하여 엔테로코커스 페칼리스, 스타필로코커스 아우레우스 및 스타필로코커스 에피데르미디스 생물막 형성을 간섭하는 치료법을 평가하였다. 생물막 감소는 종종 3가지 방법 즉 - (i) 카테터를 음파처리하거나, (ii) 카테터의 절단 슬라이스(cut slices) 또는 단순히 플레이트 상에 올려놓고 점수를 매기거나 또는 (iii) 생물막을 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 또는 다른 염료로 염색하고, 용리시키고 그리고 CFUs들에 대한 프록시(proxy)로서 OD를 측정하는 것으로 측정된다.
실시예 9
본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 인간 및 동물들 내에서 면역 반응을 이끌어내었다. 알루미늄염 및 리포좀 등과 같은 그러나 이들에 제한되지 않는 부형제의 존재 중에서 인간 및 동물 대상체에 면역원성 조성물이 투여될 수 있다. 임의의 수의 약제학적으로 수용가능한 부형제들이 또한 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 이해될 수 있는 것이다. 면역원성 조성물은 근육내로, 표층하로, 코안으로 또는 임의의 다른 적절한 경로로 인간 또는 동물 대상체에 투여될 수 있다. 면역원성 조성물은 선택된 투여의 모드와 일치하는 방법으로 제조될 수 있다. 면역원성 조성물은 폴리펩티드, 핵산 또는 이들의 조합의 형태를 취할 수 있으며, 전장 또는 부분 항원들을 포함할 수 있다. 달리 또는 대안으로, 면역원성 조성물은 특정의 항원으로 펄스화된 APCs 또는 특정의 항원을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 APCs의 형태를 취할 수 있다. 투여는 면역원성의 조성물의 단일의 투여량 또는 초기 투여에 후속하여 하나 또는 그 이상의 촉진투여량을 포함할 수 있다. 촉진투여량은 초기 투여 이후 1일, 2일, 3일, 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 12개월 또는 임의의 다른 시점에서 제공될 수 있다. 촉진투여량은 상기 대상체의 항체 역가의 평가 이후에 투여될 수 있다.
실시예 10
본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 면역성이 없는 대상체(non-immune subject)에 대한 수동 면역을 부여할 수 있다. 주어진 항원에 대한 수동 면역은 특정의 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 전달하는 것을 통하여 부여될 수 있다. 항체 공여자(antibody donors) 및 수령자(recipients)는 인간 또는 비-인간의 대상체가 될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 상기 항체 조성물은 특정의 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
수동 면역은 면역원성 조성물의 투여가 수령 대상체에 대하여 위험을 부과하는 경우에서 부여될 수 있으며, 상기 수령 대상체는 면역무방비(immunocompromised)이거나 또는 상기 수령 대상체는 즉각적인 면역을 필요로 한다. 면역원성 조성물은 선택된 투여의 모드와 일치하는 방법으로 제조될 수 있다. 조성물은 전 항체, 항원 결합 단편, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 생체 내 생성 항체, 시험관 내 생성 항체, 정제되거나 부분적으로 정제된 항체 또는 전 혈청(whole serum)을 포함할 수 있다. 투여는 항체 조성물의 단일의 투여량 또는 초기 투여에 후속하여 하나 또는 그 이상의 촉진투여량을 포함할 수 있다. 촉진투여량은 초기 투여 이후 1일, 2일, 3일, 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 12개월 또는 임의의 다른 시점에서 제공될 수 있다. 촉진투여량은 상기 대상체의 항체 역가의 평가 이후에 투여될 수 있다.
실시예 11
상기 DNABII 패밀리의 멤버들은 유전자 전사를 포함하여 다중의 핵단백질 시스템에 대하여 고도로 다면발현성(pleioptropic)이며, 따라서 종종 필수적이다. 대조적으로, HU 및 IHF 둘 다는 대장균의 균주는 실험실에서 생성되었으며, 집중적으로 연구되었다. IHF 및 HU들이 eDNA 형성에서 어떤 역할을 하는 지를 결정하기 위하여, 대장균 균주 MG1655 또는 그의 HU 및 IHF 결핍 유도체들에 의하여 형성된 생물막들을 항-IHF(문헌 Granston and Nash (1993) J Mol . Biol ., 234:45-59에서 기술된 바와 같이 제조됨)와 함께 배양시켰다. 도 8에 나타난 바와 같이, 부모로부터 단리된 균주 MG 1655가 시험관 내에서 강인한 생물막을 생성함에 비하여(패널 A), HU 및 IHF 돌연변이 균주들 둘 다는 덜 강인하였다(각각 패널 C 및 E). HU 결핍 돌연변이가 야생형 생물막의 높이의 대략 1:2인 생물막을 수득하는 데 비하여, IHF 결핍 균주는 부모로부터의 단리물의 높이의 대략 2/3인 생물막을 생성하였다. 이러한 결과는 두 단백질들이 대장균 생물막 EPS의 생성 및/또는 세기 둘 다에 관여한다는 것을 암시한다. 항-IHF로 치료한 후, 야생형 단리물에 의해 형성된 생물막이 뚜렷한 탈벌크화 및 높이에서의 58.1%의 평균 백분율 감소, 생물량에서의 73.1%의 감소 및 평균 두께에서의 87%의 감소를 나타낸 데 비해(패널 B), HU 돌연변이에 의해 형성된 생물막은 높이에 있어서 감소가 없었고, 단지 생물량에 대하여 30.9%의 감소 및 평균 두께에 대하여 37.2%의 감소를 나타내었다(패널 D). 대조적으로, IHF 돌연변이에 의해 형성된 생물막에 대하여는 높이(-3.4% 감소), 생물량(-20.5% 감소) 또는 평균 두께(-19.8% 감소)의 손실의 관점에서 효과가 관측되지 않았다(패널 F). 종합적으로, 이들 데이터는 이 대장균의 균주에 대하여 IHF가 항-IHF 항체의 사용에 의하여 표적화될 수 있는 유일한 구조적 구성요소인 것으로 여겨진다. 지금까지는 단지 생체 내에서 형성된 생물막 내의 고도로 구조화된 교차된 eDNA(interwoven eDNA) 만이 관찰되었기 때문에, 각 개개 돌연변이에 의한 잔존하는 DNABII 패밀리 멤버의 발현의 확증 및 그 결과의 DNA 구조에서의 임의의 변화는 생체 내 면역형광분석을 기다리게 된다.
실시예 12
본 출원에서는 시험관 내 및 생체 내에서 항-IHF 및 면역원으로서의 IHF의 사용이 각각 생물막의 탈벌크화에서의 활용 및/또는 생물막 질병을 분해하는 것을 나타낸다는 것이 입증되었음에 비하여, 항-IHF를 갖는 NTHI 생물막의 탈벌크화가 또한 다른 치료 양상과 조합하여 사용하는 경우에서 상승작용을 허용하는 지의 여부는 알려지지 않았다. 이러한 목적을 위하여, 항-IHF의 차선의 농도가 3가지의 독특한 시약들 각각의 어느 하나와 함께 사용되는 경우에 사전-형성된 NTHI 생물막의 증가된 구조적 불안정화를 유도하는 능력이 평가되었다. 이들 3가지의 시약들에는 1) 시험관 내에서 NTHI 생물막을 분해할 수 있는 것으로 알려진 DNA 분해 효소(DNaseI)(그러나 본 명세서에서는 차선의 농도에서 사용됨), 2) 단독으로 사용되는 경우에 사전-형성된 NTHI 생물막을 불안정화하지 못하는 NTHI의 외부막 단백질에 대한 항혈청(항-OMP P5)(데이터는 나타내지 않음) 및 3) 만성 및/또는 재발 OM을 앓는 어린아이에서 제1선의 선택으로서 전형적으로 사용되나 그러나 생물막 군집(biofilm community) 내에 거주하는 박테리아에 대하여는 제한된 효과를 갖는 항생제(아목시실린)들이 포함된다.
도 14a는 차선인 것으로 밝혀진 DNase의 농도로의 NTHI 생물막의 처리가 한계효과를 갖는다는 것을 나타내고 있다(도 14a II를 참조하시오). 유사하게, 항-IHF의 1:200 희석이 사전-형성된 NTHI 생물막에 대하여 거의 효과를 나타내지 않았다(도 14a III을 참조하시오). 그러나, 대조적으로, 이들 두 시약들이 함께 사용되는 경우, 상기 생물막은 뚜렷하게 감소되었다(도 14a IV를 참조하시오). 이 실험의 3회 반복에 의하여, 본 발명자들은 상기 생물막의 탈벌크화의 가장 뚜렷한 상승작용적 효과가 높이에서의 감소로서 측정되었다는 것을 발견하였다. 하기 표 7에는 이들 결과들을 나타내었다.
DNase 항-IHF DNase + 항-IHF
최대 높이(㎛) 3.9 37.3 51.0 분석 1
최대 높이(㎛) -11.5 16.4 37.7 분석 2
최대 높이(㎛) -1.6 19.4 38.7 분석 3
이러한 결과에 대한 하나의 단순한 설명은 상기 DNABII 단백질이 상기 생물막의 주변으로부터 떨어져서 적정되기 때문에 상기 eDNA는 상기 DNase의 작용에 대하여 더욱 접근하기 쉽다는 것이다.
도 14b는 사전-형성된 NTHI 생물막에 대한 항-OMP P5로의 처리의 결과들을 나타내고 있다. 비록 이 항혈청이 단리된 NTHI OMP P5와 강하게 반응하고(데이터는 나타내지 않음) 그리고 더욱 단리된 OMP P5에 대한 활성 면역화가 친칠라 모델에서의 실험적 OM에 대하여 유의적인 보호를 매개하는 데 효과적이기는 하나(예를 들면, 문헌들 25.Bakaletz et al., (1997) Vaccine 15(9): 955-961; Bakaletz et al., (1999) Infect Immun 67(6): 2746-2762; Kennedy et al., (2000) Infect Immun 68(5): 2756-2765; Kyd JM, et al., (2003) Infect Immun 71(8): 4691-4699; Novotny LA, et al., (2000) Infect Immun 68(4): 2119-2128; Novotny LA, et al., (2002) Vaccine 20(29-30): 3590-3597 및 Novotny LA, et al., (2003) J Immunol 171(4): 1978-1983을 참조하시오), 이러한 항혈청은 1:50의 희석에서 사용된 경우 시험관 내에 형성된 NTHI 생물막의 구조적 온전성에서의 변화를 유도하지 못하였다(도 14b II를 참조하시오). 유사하게 이들 생물막들이 차선의 항-IHF의 희석물(본 명세서에서는 1:100의 희석에서 사용됨)과 함께 배양시키는 경우 한계효과가 관측되었다(도 14b I을 참조하시오). 그러나, 결합된 경우, 항-P5 + 항-IHF의 사용은 단독으로 사용되는 경우의 두 항원들의 합을 초과하는 생물막의 높이에서의 감소의 결과를 가져왔으며(도 14b III을 참조하시오), 따라서 상승작용적 결과를 나타내었다. 따라서, 상기 NTHI EPS 매트릭스를 불안정화시키기 위한 항-IHF의 사용이 표적화된 박테리아 세포 표면 단백질(예를 들면, OMP P5)의 노출에서 EPS의 다른 구성성분들과 마찬가지로 달리 eDNA에 의해 장애가 될 수 있는 결과를 가져왔으며, 따라서 아직 알려지지 않은 메카니즘에 의하여 면역 매개 박테리아 제거를 허용한다는 결론이었다.
마지막으로, 도 14c는 사전-형성된 NTHI 생물막을 아목시실린으로 처리한 결과들을 나타내고 있다. 64㎍/㎖의 농도에서 사용된 경우, 아목시실린은 한정된 박테리아 세포 사멸의 증거에도 불구하고 사전-형성된 NTHI 생물막의 구조에 대한 측정가능한 효과를 나타내지 않았다(도 14c II를 참조하시오). 1:50 희석에서의 IHF 항혈청으로의 처리는 앞서 나타낸 바와 같이 상기 생물막의 높이를 실질적으로 감소시켰다(도 14c III을 참조하시오). 그러나, 흥미롭게도, 상기 두 시약들이 동시적으로 사용되는 경우, 상기 생물막의 높이에서의 극적인 감소가 있었을 뿐만 아니라(도 14c IV를 참조하시오), 생체염료(vital dye)의 사용이 이미지화된 생물막 내의 적색 채널(red channel) 내에서의 두드러진 형광에 의해 주목되는 바와 같이 상기 생물막 내에 잔존하는 상기 박테리아의 대부분이 이제 사멸되었음을 나타내고 있다. 이러한 결과는 항-IHF로의 상기 생물막의 탈벌크화는 상기 박테리아를 충분히 노출시켜 플랑크톤 NTHI에 대하여 분석할 때 효과적인 것으로 알려진 아목시실린 농도들에 대한 민감성에 보다 더 유사한 상태들을 생성하도록 하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 아목시실린의 작용에의 잔류하는 생물막 매트릭스 내의 박테리아의 증가된 물리적 노출 및/또는 앞서 본 발명자들이 보여준 바와 같이 항-IHF 항체들에의 노출에 의한 생물막 탈벌크화 동안에 플라크톤 상으로의 박테리아의 증가된 방출이 일어날 수 있도록 하는 것을 통하여 중재될 수 있다(도 4를 참조하시오).
실시예 13
본 출원인은 경피적 면역화에 의한 항-IHF 항체의 유도가 상기 친칠라 중이 내의 NTHI 유도 생물막을 분해하는 데 효과적이라는 것을 나타내었다. 이것이 eDNA에 결합되는 경우와 마찬가지로 순수한 IHF가 보호적 면역 반응의 유도에 필수적이라는 것을 나타내었으며, 보호적 에피토프들이 TCI 및 SQ 면역화 둘 다에 후속하여 나타난 바와 같이 가리워진 것으로 여겨진다. 그렇더라도, 광범위한 보호 효능을 가질 것 같은 백신 후보들의 합리적인 설계는 그 단백질의 면역우성(immunodominant) 및/또는 보호 에피토프의 상세한 이해를 필요로 하며, 이는 실제로는 자명한 것일 뿐만 아니라 필수적으로 연속적이어야 할 것이다. 현재의 백신 후보 설계 전략가들은 그들의 접근법에 있어서 환원주의자(reductionist)이며, 종종 단지 높은 친화성 및 보호 항체의 유도에 절대적으로 필요한 표적화된 단백질의 부분을 동정하고 그리고 사용하는 것을 목표로 한다. 이러한 목적을 위하여, 에피토프 맵핑(epitope mapping)이 수행되어 가장 효과적인 면역원을 결정하였다.
에피토프 맵핑은 문헌 Novotny, et al., (2009) Vaccine 28:(1):279-289에 기술된 바와 같이 그리고 하기의 절차에 따라 수행될 수 있다. 면역 혈청을 생성하기 위하여 부형제 모노포스포릴리피드 에이(MPL ; 코릭사(Corixa))와 또는 MPL 단독(부형제-단독 대조군)과 공-혼합되어 투여되는 10㎍의 상기 순수한 IHF 단백질, IHFα의 C-말단의 20개의 아미노산의 폴리펩티드, IHFβ의 C-말단의 20개의 아미노산의 폴리펩티드 또는 TBP-DNABII의 60 내지 76개의 아미노산의 폴리펩티드의 피하(SQ) 주사에 의하여 친칠라를 비경구적으로 면역화시킬 수 있다. 2개의 동일한 촉진제(boosts)들이 21일의 간격으로 전달될 수 있다. 혈청을 위한 혈액이 최종 면역화 투여량의 수령 10일 후에 수집될 수 있다. 친칠라 항혈청의 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay ; ELISA) 및 웨스턴 블럿팅이 수행될 수 있다. 효소면역분석을 위하여는, 혈청이 전달된 면역원에 대한 96-웰 플레이트 포맷(96-well plate format)(0.2㎍ 단백질/웰) 내에서 분석될 수 있다. 역가는 혈청을 제외한 모든 성분들을 포함하는 대조웰(control wells)들에 비해 더 큰 0.1의 OD450값을 수득하는 혈청 희석물의 역수로서 정의될 수 있다. 효소면역분석은 최소 3회 수행될 수 있고 그리고 결과들을 기하평균(geometric mean)으로 보고된다. 웨스턴 블럿팅은 1:100으로 희석된 면역 혈청을 사용하여 1㎍의 개개 면역원에 대하여 수행될 수 있으며 HRP-단백질 A(자이메드(Zymed), 미합중국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코(South San Francisco, CA) 소재)로 검출될 수 있다. 색상은 CN/DAB 기질(피어스(Pierce), 미합중국 일리노이주 록포드(Rockford, IL) 소재)로 전개되었다.
NTHI의 IHF 단백질을 에피토프 맵핑하기 위하여 5-잔기 오버랩(5-residue overlap)을 수반하는 일련의 20-mer 합성 펩티드가 합성될 수 있다. 모든 합성 펩티드의 합성, 정제 및 시퀀스 확인은 표준 기술에 따라 수행될 수 있다(예를 들면, 문헌들 Bakaletz LO. et al., (1997) Infect . Immun . 71(8):4691-9 및 Bakaletz LO., et al., (2001) Vaccine 68(4):2119-28을 참조하시오). 아미노산 분석 및 질량분석법(mass spectral analysis)이 수행되어 각 펩티드의 순도, 조성 및 아미노산 시퀀스를 확인할 수 있다.
합성 펩티드와 혈청 내에 존재하는 항체 사이의 상호작용의 분석은 기술된 바와 같이 바이어코어 3000 기기(Biacore 3000 instrument)를 사용하여 검사될 수 있으며, 모든 시약들은 바이어코어(스웨덴 웁살라(Uppsala, Sweden) 소재)로부터 구입할 수 있다. 요약하면, 펩티드는 소듐아세테이트 완충제(sodium acetate buffer) 내에 현탁된 후, 아민 결합 화학을 사용하여 활성화된 시약급 CM5 센서칩(reagent grade CM5 sensor chip)의 표면에 부동태화시킬 수 있다. 상호작용 분석을 위하여는, 15㎕의 혈청(HBS-EP 완충제 + 1㎎ 카르복시메틸덱스트란/㎖ 내에 희석된)을 상기 센서칩 표면을 가로질러 5㎕/분(min)의 유속으로 주입될 수 있다. 각 샘플 내의 항원- 또는 면역원-특이적 항체의 상대량은 각 샘플이 주입될 수 있기 이전 5초 및 이후 45초에서 수득된 공진 단위(resonance units ; RU)에서의 차이로서 계산될 수 있다. 상기 센서칩 표면은 샘플들 사이에서 25mM NaOH로 재생될 수 있다. 상기 혈청 내에 존재하는 상기 항체에 대하여 가장 강한 상호작용을 갖는 합성 펩티드가 생체 내에서 높은 친화성의 보호 항체를 유도할 수 있는 보호 에피토프의 가장 장래가 기대되는 후보가 될 수 있다.
토끼 폴리클로날 항혈청은 다시 상기 에피토프 맵핑으로부터 가장 면역원성인 펩티드에 대하여 생성될 수 있다. 이 항혈청은 컬럼 크로마토그래피에 의하여 비-중화 항체(non-neutralizing antibodies)로부터 중화 항체(neutralizing antibodies)를 친화성 정제(affinity purify)하는 데 사용될 수 있다. 그렇게 하기 위해서는, 토끼와 친칠라 폴리클로날 항혈청 둘 다(후자가 더 보호적인 것으로 나타남) 사용될 수 있다. 혈청은 그에 순수한 IHF가 결합되거나 또는 그에 DNA와 사전-혼합된 IHF가 결합된 컬럼에 대하여 각각 구동한 후와 마찬가지로 구동하기 전 둘 다에서 분석될 수 있다. 단지 상기 DNA-IHF 복합체에 결합하지 않는 항체가 중화될 수 있다. 계속해서 통과되고(flow-through) 그리고 용리된 항혈청 모두는 특이성 및 역가를 결정하기 위한 효소면역분석, 웨스턴 블럿 및 바이오센서 분석을 통하는 것과 마찬가지로 NTHI 생물막을 탈벌크하는 상대적인 능력에 대한 본 발명자들의 시험관 내 생물막 분석을 통한 원래의 항혈청 풀(original antiserum pools)에 대하여 분석될 것이다. 부가의 시험으로서, 에피토프-표적화 백신 후보들은 상기 컬럼에 부착되어 이들이 이제 중화하는 것으로 입증된 항체를 제거할 수 있는 지를 결정할 수 있다.
비록 본 발명이 상기한 구체예들에 대하여 기술되기는 하였으나, 앞서의 상세한 설명 및 실시예들은 설명하기 위하여 의도된 것이고 그리고 본 발명의 관점을 제한하는 것이 아님은 이해되어야 한다. 본 발명의 관점 내의 다른 관점들, 잇점들 및 변형들은 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 명백할 수 있다.
달리 한정하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 제공된 모든 뉴클레오티드 시퀀스들은 5'로부터 3'로의 배향 내에 제공된다.
본 명세서에서 설명적으로 기술된 본 발명은 본 명세서에서 특별히 기술되지 않은 임의의 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들 없이도 적절하게 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 등은 제한 없이 확장가능하게 판독되어야 한다. 게다가, 본 명세서에서 사용된 용어들 및 표현들은 설명의 개념이며 제한이 없이 사용된 것이며, 또한 이러한 용어들 및 표현들의 사용은 표시되고 그리고 기술된 특징들 및 그들의 부분들의 임의의 등가물들을 배제하는 것을 의도하는 것이 아니며, 여러 변형들이 청구된 본 발명의 관점 내에서 가능함은 이해되어야 한다.
따라서, 비록 본 발명이 바람직한 구체예들 및 선택적인 특징들로 특별히 기술되기는 하였으나, 본 명세서에서 기술된 그 안에 포함되는 본 발명의 변형, 개량 및 변형이 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 의존될 수 있으며(최후의 수단이 될 수 있으며), 이러한 변형들, 개량들 및 변경들은 본 발명의 관점 내에 속하는 것으로 고려된다. 본 명세서에서 제공된 물질, 방법 및 실시예들은 바람직한 구체예들을 대표하는 것이고, 예시적인 것이고, 그리고 본 발명의 관점을 제한하는 것으로 의도되는 것이 아니다.
본 발명은 본 명세서에서 광의로 그리고 일반적으로 기술되었다. 포괄적인 개시 내에 속하는 보다 협의의 종들 및 속포괄적인 그룹화(sub generic groupings)들 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 본 명세에서 특별한 물질이 본 명세서에서 특별히 언급되었는 지 그렇지 않은 지에 무관하게 종(genus)으로부터 임의의 대상체 물건을 제거하는 단서를 달거나 또는 부정적인 제한을 갖는 본 발명의 포괄적인 개시를 포함한다.
게다가, 본 발명의 특징들 또는 관점들이 마커쉬 그룹의 개념으로 기술되는 경우, 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 본 발명이 또한 그에 의해서 마커쉬 그룹의 임의의 개개 멤버 또는 하위그룹(subgroup)의 개념에서 기술되는 것이라는 것을 인식할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물들, 특허 출원들, 특허들 및 다른 참고문헌들은 특별히 그들 전체로서 각각이 개별적으로 참고로 포함되는 경우와 동일한 정도까지 참고로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의들을 포함하여 본 명세서가 통제할 것이다.
[표 8]
Figure pct00002
[표 8 계속]
Figure pct00003
[표 8 계속]
Figure pct00004
[표 8 계속]
Figure pct00005
[표 9a1]
Figure pct00006
[표 9a1 계속]
Figure pct00007
[표 9a2]
Figure pct00008
[표 9a2 계속]
Figure pct00009
[표 9a3]
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[표 9a3 계속]
Figure pct00011
[표 9b]
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[표 9b 계속]
Figure pct00013
[표 9b 계속]
Figure pct00014
[표 10]
Figure pct00015
[표 10 계속]
Figure pct00016
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF SOUTHERN CALIFORNIA NATIONWIDE CHILDREN'S HOSPITAL, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE REMOVAL OF BIOFILMS <130> 064189-3860 <140> <141> <150> 61/454,972 <151> 2011-03-21 <150> 61/397,891 <151> 2010-06-16 <150> 61/347,362 <151> 2010-05-21 <150> 61/318,743 <151> 2010-03-29 <160> 340 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace="Ile" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="Gln" or "Glu" or "Ala" or "Val" or "Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Leu" or "Ile" or "Val" or "Phe" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="Ile" or "Arg" or "Val" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace="Ser" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> /note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations 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pseudomallei <400> 52 Thr Ser Ala Gly Asp Thr Pro Thr Leu Thr Lys Ala Glu Leu Ala Glu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Asp Ser Val Gly Leu Asn Lys Arg Glu Ala Lys Asp Met 20 25 30 Val Glu Ala Phe Phe Glu Val Ile Arg Asp Ala Leu Glu Asn Gly Glu 35 40 45 Ser Val Lys Leu Ser Gly Phe Gly Asn Phe Gln Leu Arg Asp Lys Pro 50 55 60 Gln Arg Pro Gly Arg Asn Pro Asn Thr Gly Glu Ala Ile Pro Ile Ala 65 70 75 80 Ala Arg Arg Val Val Thr Phe His Ala Ser Gln Lys Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Val Glu Asn Gly Ala Glu Pro Asp Leu Ala Arg 100 105 <210> 53 <211> 113 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 53 Met Gly Thr Thr Met Leu Ala Glu Pro Arg Thr Leu Thr Lys Ala Glu 1 5 10 15 Leu Ala Glu Leu Leu Phe Glu Arg Val Gly Leu Asn Lys Arg Glu Ala 20 25 30 Lys Asp Ile Val Asp Thr Phe Phe Glu Glu Ile Arg Asp Ala Leu Ala 35 40 45 Arg Gly Asp Ser Val Lys Leu Ser Gly Phe Gly Asn Phe Gln Val Arg 50 55 60 Asp Lys Pro Pro Arg Pro Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly Glu Thr Ile 65 70 75 80 Pro Ile Ala Ala Arg Arg Val Val Thr Phe His Ala 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85 90 <210> 74 <211> 90 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 74 Met Asn Lys Thr Gln Leu Val Glu Gln Ile Ala Ala Asn Ala Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ala Ser Ala Gly Arg Ala Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Val 20 25 30 Ser Gly Thr Leu Gln Ser Gly Asp Gln Val Ala Leu Val Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Phe Ser Val Arg Thr Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Lys 50 55 60 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Ile Ala Glu Ala Lys Val Pro Ser Phe Lys 65 70 75 80 Ala Gly Lys Ala Leu Lys Asp Ala Cys Asn 85 90 <210> 75 <211> 90 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 75 Met Asn Lys Ser Gln Leu Ile Asp Lys Ile Ala Ala Gly Ala Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ala Ala Ala Gly Arg Ala Leu Asp Ala Ile Ile Ala Ser Val 20 25 30 Thr Glu Ser Leu Lys Glu Gly Asp Asp Val Ala Leu Val Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Phe Ala Val Lys Glu Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln 50 55 60 Thr Gly Lys Glu Ile Thr Ile Ala Ala Ala Lys Val Pro Ser Phe Arg 65 70 75 80 Ala Gly Lys Ala Leu Lys Asp Ala Val Asn 85 90 <210> 76 <211> 90 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 76 Met Asn Lys Ser Glu Leu Val Asp Ser Ile Ala Gln Ser Ala Gly Leu 1 5 10 15 Thr Lys Glu Gln Ala Ala Lys Ala Val Asn Ala Phe Thr Glu Ser Val 20 25 30 Gln Gly Ala Leu Gln Arg Gly Asp Asp Val Val Leu Val Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Phe Ser Val Lys Glu Arg Ala Ala Arg Met Gly Arg Asn Pro Lys 50 55 60 Thr Gly Glu Ala Ile Gln Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ser Phe Lys 65 70 75 80 Ala Gly Lys Val Leu Lys Glu Ser Val Asn 85 90 <210> 77 <211> 90 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 77 Met Asn Lys Thr Glu Leu Ile Asp His Ile Ala Ser Lys Ala Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ala Ala Ala Gly Arg Ser Leu Asp Ala Leu Ile Gly Ala Val 20 25 30 Lys Thr Thr Leu Lys Lys Gly Gly Thr Val Thr Leu Val Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Phe Ala Val Ser Ala Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Arg 50 55 60 Thr Gly Glu Thr Ile Lys Ile Lys Lys Ala Lys Val Pro Lys Phe Arg 65 70 75 80 Pro Gly Lys Ala Leu Lys Asp Ala Val Asn 85 90 <210> 78 <211> 99 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 78 Met Gln Ala Val Ile Asn Lys Ser Asn Leu Ile Ala Asn Leu Ala Ser 1 5 10 15 Val Cys Glu Glu Leu Glu Glu Asp Val Val Asp Glu Ala Val Arg Leu 20 25 30 Met Ile Ala Met Met Val Asn Glu Leu Val Tyr Asp Gly Arg Ile Glu 35 40 45 Val Arg Gly Phe Gly Ser Phe Cys Leu His His Arg Ser Ala Arg Ile 50 55 60 Ala Arg Asn Pro Arg Thr Gly Glu Ser Val Ser Val Lys Ala Lys Ala 65 70 75 80 Thr Pro Tyr Phe Lys Pro Gly Lys Ala Leu Arg Glu Ser Val Asn Leu 85 90 95 Val Asn Asp <210> 79 <211> 91 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 79 Met Asn Lys Thr Glu Leu Ile Glu Lys Ile Ala Ala Asn Ala Glu Val 1 5 10 15 Ser Lys Ala Ala Ala Lys Lys Ala Leu Asp Ala Thr Thr Glu Ala Ile 20 25 30 Lys Glu Ala Leu Ala Ala Gly Asp Lys Val Gln Leu Val Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Phe Ala Thr Thr Glu Arg Pro Ala His Glu Gly Ile Asn Pro Arg 50 55 60 Ser Lys Glu Lys Ile Lys Ile Ala Ala Lys Lys Val Ala Lys Phe Lys 65 70 75 80 Ala Gly Ala Glu Leu Ala Asp Ala Val Asn Lys 85 90 <210> 80 <211> 91 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 80 Met Asn Lys Thr Glu Leu Ile Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ser Lys Ala Asp Ser Lys Lys Ala Leu Asp Ala Met Thr Ala Ala Ile 20 25 30 Lys Glu Ala Leu Val Ala Gly Asp Lys Val Gln Leu Val Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Tyr Ser Val Thr Glu Arg Pro Ala His Glu Gly Ile Asn Pro Ala 50 55 60 Thr Lys Gln Lys Ile Gln Ile Ala Ala Lys Lys Val Ala Lys Phe Lys 65 70 75 80 Pro Gly Ala Glu Leu Ala Asp Ala Val Asn Ala 85 90 <210> 81 <211> 106 <212> PRT <213> Treponema denticola <400> 81 Met Lys Gln Lys Arg Ser Lys Ile Asp Ile Ile Asp Ser Val Tyr Arg 1 5 10 15 Asn Asn Pro Gln Tyr Gln Leu Lys Gln Ile Asn Ala Ile Ala Asn Leu 20 25 30 Phe Leu Asp Glu Leu Ser Val Leu Leu Gln Gln Gly Ile Pro Val Glu 35 40 45 Ile Arg Gly Leu Gly Ser Phe Asp Phe Ala Val Leu His Gly Arg Lys 50 55 60 Asn Ala Arg Asn Pro Lys Thr Gly Glu Ala Val Leu Thr Ala Asp Arg 65 70 75 80 Cys Lys Val Arg Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Lys Glu Ala Leu His 85 90 95 Lys Ile Asp Thr Gln Glu Leu Ile Glu Ser 100 105 <210> 82 <211> 88 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 82 Met Asn Lys Thr Asp Phe Ile Ala Ala Val Ala Glu Lys Ala Asn Leu 1 5 10 15 Thr Lys Ala Asp Ala Gln Arg Ala Val Asn Ala Phe Ala Glu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gln Met Asn Ala Gly Glu Lys Ile Ala Leu Ile Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Phe Ser Val Ser Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Ile Asn Pro Lys 50 55 60 Thr Lys Lys Ser Ile Ser Ile Pro Ala Arg Lys Val Val Arg Phe Lys 65 70 75 80 Pro Gly Ser Thr Leu Glu Leu Lys 85 <210> 83 <211> 94 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 83 Met Asn Lys Ala Glu Phe Ile Asp Leu Val Lys Glu Ala Gly Lys Tyr 1 5 10 15 Asn Ser Lys Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ile Ser Ala Phe Thr Leu Ala 20 25 30 Val Glu Thr Ala Leu Ser Lys Gly Glu Ser Val Glu Leu Ile Gly Phe 35 40 45 Gly Lys Phe Glu Thr Ala Glu Gln Lys Gly Lys Glu Gly Lys Val Pro 50 55 60 Gly Ser Asp Lys Thr Tyr Lys Thr Glu Asp Lys Arg Val Pro Lys Phe 65 70 75 80 Lys Phe Gly Lys Thr Leu Lys Gln Lys Val Glu Glu Gly Lys 85 90 <210> 84 <211> 92 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 84 Met Thr Lys Ala Asp Ile Ile Asn Glu Ile Ala Thr Ser Thr Gly Ile 1 5 10 15 Ala Lys Lys Asp Val Ser Ala Val Val Glu Ser Phe Met Glu Thr Ile 20 25 30 Lys Asp Ser Leu Leu Glu Lys Lys Glu Asn Val Tyr Leu Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ile Val Lys His Arg Ala Glu Lys Thr Ala Arg Asn Ile 50 55 60 Ser Lys Asn Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ala His Asp Phe Pro Ser Phe 65 70 75 80 Lys Pro Ala Lys Thr Phe Ile Glu Asp Met Lys Lys 85 90 <210> 85 <211> 92 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 85 Met Thr Lys Ala Asp Ile Ile Asn Glu Ile Ala Ser Ser Thr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Lys Lys Asp Val Ser Ala Val Val Glu Ser Phe Met Asp Ala Ile 20 25 30 Lys Asp Ser Leu Leu Glu Asn Lys Glu Asn Val Tyr Leu Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ile Val Lys His Arg Ala Glu Lys Thr Ala Arg Asn Ile 50 55 60 Ser Lys Asn Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ala His Asp Phe Pro Ser Phe 65 70 75 80 Lys Pro Ala Lys Thr Phe Ile Glu Asp Met Lys Lys 85 90 <210> 86 <211> 92 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 86 Met Thr Lys Ala Asp 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88 Met Asn Lys Ala Glu Leu Ile Asp Val Leu Thr Thr Lys Met Gly Thr 1 5 10 15 Asp Arg Arg Gln Ala Thr Ala Ala Val Glu Asn Val Val Asp Thr Ile 20 25 30 Val Arg Ala Val His Lys Gly Asp Ser Val Thr Ile Thr Gly Phe Gly 35 40 45 Val Phe Glu Gln Arg Arg Arg Ala Ala Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg 50 55 60 Thr Gly Glu Thr Val Lys Val Lys Pro Thr Ser Val Pro Ala Phe Arg 65 70 75 80 Phe Gly Ala Gln Phe Lys Ala Val Ile Ser Gly Ala Gln Lys Leu Pro 85 90 95 Ala Asp Gly Pro 100 <210> 89 <211> 94 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 89 Met Thr Lys Ser Glu Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr Gln Gln Ser His 1 5 10 15 Ile Pro Ala Lys Thr Val Glu Asp Ala Val Lys Glu Met Leu Glu His 20 25 30 Met Ala Ser Thr Leu Ala Gln Gly Glu Arg Ile Glu Ile Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg Thr Gly Arg Asn Pro 50 55 60 Lys Thr Gly Asp Lys Val Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Val Pro His Phe 65 70 75 80 Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Ala Asn Ile Tyr Gly 85 90 <210> 90 <211> 94 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 90 Met Thr Lys Ser Glu Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr Gln Gln Ser His 1 5 10 15 Ile Pro Ala Lys Ala Val Glu Asp Ala Val Lys Glu Met Leu Glu His 20 25 30 Met Ala Ser Thr Leu Ala Gln Gly Glu Arg Ile Glu Ile Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg Thr Gly Arg Asn Pro 50 55 60 Lys Thr Gly Asp Lys Val Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Val Pro His Phe 65 70 75 80 Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Ala Asn Ile Tyr Gly 85 90 <210> 91 <211> 92 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 91 Met Thr Lys Ser Glu Leu Ile Glu Arg Leu Cys Ala Glu Gln Thr His 1 5 10 15 Leu Ser Ala Lys Glu Ile Glu Asp Ala Val Lys Asn Ile Leu Glu His 20 25 30 Met Ala Ser Thr Leu Glu Ala Gly Glu Arg Ile Glu Ile Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ser Leu His Tyr Arg Glu Pro Arg Val Gly Arg Asn Pro 50 55 60 Lys Thr Gly Asp Lys Val Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Val Pro His Phe 65 70 75 80 Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asn Leu 85 90 <210> 92 <211> 94 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 92 Met Thr Lys Ser Glu Leu Ile Glu Arg Ile Val Thr His Gln Gly Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ala Lys Asp Val Glu Leu Ala Ile Lys Thr Met Leu Glu Gln 20 25 30 Met Ser Gln Ala Leu Ala Thr Gly Asp Arg Ile Glu Ile Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg Val Gly Arg Asn Pro 50 55 60 Lys Thr Gly Glu Ser Val Arg Leu Asp Gly Lys Phe Val Pro His Phe 65 70 75 80 Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Val Asn Glu Pro Glu 85 90 <210> 93 <211> 94 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 93 Met Thr Lys Ser Glu Leu Met Glu Lys Leu Ser Ala Lys Gln Pro Thr 1 5 10 15 Leu Pro Ala Lys Glu Ile Glu Asn Met Val Lys Gly Ile Leu Glu Phe 20 25 30 Ile Ser Gln Ser Leu Glu Asn Gly Asp Arg Val Glu Val Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ser Leu His His Arg Gln Pro Arg Leu Gly Arg Asn Pro 50 55 60 Lys Thr Gly Asp Ser Val Asn Leu Ser Ala Lys Ser Val Pro Tyr Phe 65 70 75 80 Lys Ala Gly Lys Glu Leu Lys Ala Arg Val Asp Val Gln Ala 85 90 <210> 94 <211> 95 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 94 Met Thr Lys Ser Glu Leu Ile Glu Leu Leu Val Gln Lys Asn Ser Asn 1 5 10 15 Ile Pro Val Lys His Val Glu Glu Ala Val Lys Ala Ile Leu Glu Gln 20 25 30 Met Ser Tyr Val Leu Glu His Gly Glu Arg Ile Glu Val Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Ser Leu His Cys Arg Gln Pro Arg Ile Gly Arg Asn Pro 50 55 60 Lys Thr Gly Glu Gln Val Lys Leu Asp Ala Lys Cys Val Pro Tyr Phe 65 70 75 80 Lys Ala Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Val Tyr Ala Ala 85 90 95 <210> 95 <211> 98 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 95 Met Val Arg Leu Ala Glu Val Phe Ala Ala Lys Asn Gly Thr His Leu 1 5 10 15 Leu Ala Lys Asp Val Glu Tyr Ser Val Lys Val Leu Val Asp Thr Met 20 25 30 Thr Arg Ser Leu Ala Arg Gly Gln Arg Ile Glu Ile Arg Gly Phe Gly 35 40 45 Ser Phe Asp Leu Asn His Arg Pro Ala Arg Ile Gly Arg Asn Pro Lys 50 55 60 Thr Gly Glu Arg Val Glu Val Pro Glu Lys His Val Pro His Phe Lys 65 70 75 80 Pro Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Leu Ala Leu Lys Glu Asn 85 90 95 Ala Asn <210> 96 <211> 104 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 96 Met Thr Lys Ser Glu Leu Met Val Arg Leu Ala Glu Val Phe Ala Ala 1 5 10 15 Lys Asn Gly Thr His Leu Leu Ala Lys Asp Val Glu Tyr Ser Val Lys 20 25 30 Val Leu Val Asp Thr Met Thr Arg Ser Leu Ala Arg Gly Gln Arg Ile 35 40 45 Glu Ile Arg Gly Phe Gly Ser Phe Asp Leu Asn His Arg Pro Ala Arg 50 55 60 Ile Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly Glu Arg Val Glu Val Pro Glu Lys 65 70 75 80 His Val Pro His Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp 85 90 95 Leu Ala Leu Lys Glu Asn Ala Asn 100 <210> 97 <211> 107 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 97 Met Thr Lys Ser Glu Leu Val Ala Gln Leu Ala Ser Arg Phe Pro Gln 1 5 10 15 Leu Val Leu Lys Asp Ala Asp Phe Ala Val Lys Thr Met Leu Asp Ala 20 25 30 Met Ser Asp Ala Leu Ala Lys Gly His Arg Ile Glu Ile Arg Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Phe Gly Leu Asn Arg Arg Pro Ala Arg Val Gly Arg Asn Pro 50 55 60 Lys Ser Gly Glu Lys Val Gln Val Pro Glu Lys Phe Val Pro His Phe 65 70 75 80 Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Gly Arg 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<210> 117 <211> 16 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 117 Lys Val Gln Ala Val Lys Pro Arg Glu Ser Val Asn Val Asn Thr Gly 1 5 10 15 <210> 118 <211> 16 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 118 Lys Val Gln Ala Val Lys Pro Arg Glu Ser Val Asn Val Asn Thr Gly 1 5 10 15 <210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 119 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 120 Lys Val Asn His Arg Ala Glu Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 121 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 122 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 122 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus pyogeneses <400> 123 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 124 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus gallolyticus <400> 124 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 125 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 125 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 126 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 126 Glu Val Arg Glu Arg Ala Glu Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus gordonii <400> 127 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 128 <211> 16 <212> PRT <213> Streptococcus mutans <400> 128 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 129 <211> 16 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 129 Glu Val Arg Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 130 <211> 16 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 130 Lys Val Asn Glu Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 131 Lys Val Asn His Arg Ser Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 132 <211> 16 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 132 Ala Val Ser Ala Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Arg Thr Gly 1 5 10 15 <210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 133 Ala Val Lys Glu Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 134 <211> 16 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 134 Ser Val Arg Thr Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 135 <211> 16 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 135 Ala Thr Thr Glu Arg Pro Ala His Glu Gly Ile Asn Pro Arg Ser Lys 1 5 10 15 <210> 136 <211> 16 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 136 Ser Val Thr Glu Arg Pro Ala His Glu Gly Ile Asn Pro Ala Thr Lys 1 5 10 15 <210> 137 <211> 16 <212> PRT <213> Treponema denticola <400> 137 Phe Ala Val Leu His Gly Arg Lys Asn Ala Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 138 <211> 16 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 138 Ser Val Ser Glu Arg Ala Ala Arg Lys Gly Ile Asn Pro Lys Thr Lys 1 5 10 15 <210> 139 <211> 16 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 139 Glu Thr Ala Glu Gln Lys Gly Lys Glu Gly Lys Val Pro Gly Ser Asp 1 5 10 15 <210> 140 <211> 17 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 140 Phe Ile Val Lys His Arg Ala Glu Lys Thr Ala Arg Asn Ile Ser Lys 1 5 10 15 Asn <210> 141 <211> 17 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 141 Phe Ile Val Lys His Arg Ala Glu Lys Thr Ala Arg Asn Ile Ser Lys 1 5 10 15 Asn <210> 142 <211> 16 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 142 Ile Val Lys Glu Arg Ala Glu Lys Thr Ala Arg Asn Ile Ser Lys Gln 1 5 10 15 <210> 143 <211> 16 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 143 Glu Gln Arg Arg Arg Ala Ala Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg Thr Gly 1 5 10 15 <210> 144 <211> 16 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 144 Glu Gln Arg Arg Arg Ala Ala Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg Thr Gly 1 5 10 15 <210> 145 <211> 16 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 145 Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg Thr Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 146 <211> 16 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 146 Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg Thr Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 147 <211> 16 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 147 Ser Leu His Tyr Arg Glu Pro Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 148 <211> 16 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 148 Ala Val Lys Glu Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly 1 5 10 15 <210> 149 <211> 16 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 149 Ser Val Lys Glu Arg Ala Ala Arg Met Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 150 <211> 16 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 150 Ser Leu His Tyr Arg Ala Pro Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 151 <211> 16 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 151 Ser Leu His His Arg Gln Pro Arg Leu Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 152 <211> 16 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 152 Ser Leu His Cys Arg Gln Pro Arg Ile Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 153 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 153 Asp Leu Asn His Arg Pro Ala Arg Ile Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 154 <211> 16 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 154 Asp Leu Asn His Arg Pro Ala Arg Ile Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly 1 5 10 15 <210> 155 <211> 16 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 155 Gly Leu Asn Arg Arg Pro Ala Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 156 <211> 16 <212> PRT <213> Burkholderia pseudomallei <400> 156 Gly Leu Asn Arg Arg Pro Ala Arg Val Gly Arg Asn Pro Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 157 <211> 16 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 157 Ser Leu Ser Gln Arg Ser Pro Arg Ile Gly Arg Asn Pro Lys Ser Gly 1 5 10 15 <210> 158 <211> 16 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 158 Cys Leu His His Arg Ser Ala Arg Ile Ala Arg Asn Pro Arg Thr Gly 1 5 10 15 <210> 159 <211> 17 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 159 Glu Val Arg Lys Arg Lys Gly Arg Leu Asn Ala Arg Asn Pro Gln Thr 1 5 10 15 Gly <210> 160 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus pyogeneses <400> 160 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 161 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus pyogeneses <400> 161 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 162 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus pyogeneses <400> 162 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 163 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus gallolyticus <400> 163 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 164 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus gallolyticus <400> 164 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 165 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus gallolyticus <400> 165 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 166 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 166 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 167 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 168 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <400> 168 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 169 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 169 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 170 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 170 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 171 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 171 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 172 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 172 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 173 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 173 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 174 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 174 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 175 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus gordonii <400> 175 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus gordonii <400> 176 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 177 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus gordonii <400> 177 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 178 <211> 6 <212> PRT <213> Streptococcus mutans <400> 178 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 179 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus mutans <400> 179 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 180 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus mutans <400> 180 Ile Lys Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 181 <211> 6 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 181 Ala Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 182 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 183 <211> 20 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 183 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Pro Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 184 <211> 6 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 184 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 185 <211> 7 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 185 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 186 <211> 20 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 186 Ile Pro Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 187 <211> 6 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 187 Ala Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 188 <211> 7 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 188 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 189 <211> 20 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 189 Ile Pro Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 190 <211> 6 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 190 Ala Phe Val Ser Gly Lys 1 5 <210> 191 <211> 7 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 191 Ala Leu Lys Asp Ala Ile Lys 1 5 <210> 192 <211> 20 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 192 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Val Ser Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Ile Lys 20 <210> 193 <211> 6 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 193 Ala Phe Val Ser Gly Lys 1 5 <210> 194 <211> 7 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 194 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 195 <211> 20 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 195 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ala Phe Val Ser Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 196 <211> 6 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 196 Ala Phe Val Ala Gly Lys 1 5 <210> 197 <211> 7 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 197 Ala Leu Lys Asp Ala Ile Lys 1 5 <210> 198 <211> 20 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 198 Ile Ala Ala Ala Asn Val Pro Ala Phe Val Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Ile Lys 20 <210> 199 <211> 6 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 199 Ala Phe Val Ser Gly Lys 1 5 <210> 200 <211> 7 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 200 Ala Leu Lys Asp Ala Val Lys 1 5 <210> 201 <211> 20 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 201 Ile Ala Ala Ala Asn Val Pro Ala Phe Val Ser Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Lys 20 <210> 202 <211> 6 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 202 Gly Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 203 <211> 7 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 203 Ala Leu Lys Asp Ala Val Asn 1 5 <210> 204 <211> 20 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 204 Ile Ala Ala Ala Lys Ile Pro Gly Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Asn 20 <210> 205 <211> 6 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 205 Ser Phe Arg Ala Gly Lys 1 5 <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 206 Ala Leu Lys Asp Ala Val Asn 1 5 <210> 207 <211> 20 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 207 Ile Ala Ala Ala Lys Val Pro Ser Phe Arg Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Asn 20 <210> 208 <211> 6 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 208 Ser Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 209 <211> 7 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 209 Ala Leu Lys Asp Ala Cys Asn 1 5 <210> 210 <211> 20 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 210 Ile Ala Glu Ala Lys Val Pro Ser Phe Lys Ala Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Cys Asn 20 <210> 211 <211> 6 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 211 Lys Phe Arg Pro Gly Lys 1 5 <210> 212 <211> 7 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 212 Ala Leu Lys Asp Ala Val Asn 1 5 <210> 213 <211> 20 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 213 Ile Lys Lys Ala Lys Val Pro Lys Phe Arg Pro Gly Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ala Val Asn 20 <210> 214 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 214 Lys Phe Lys Ala Gly Ala 1 5 <210> 215 <211> 8 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 215 Glu Leu Ala Asp Ala Val Asn Lys 1 5 <210> 216 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 216 Ala Ala Lys Lys Val Ala Lys Phe Lys Ala Gly Ala Glu Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Val Asn Lys 20 <210> 217 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 217 Lys Phe Lys Pro Gly Ala 1 5 <210> 218 <211> 8 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 218 Glu Leu Ala Asp Ala Val Asn Ala 1 5 <210> 219 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 219 Ala Ala Lys Lys Val Ala Lys Phe Lys Pro Gly Ala Glu Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Val Asn Ala 20 <210> 220 <211> 6 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 220 Ser Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 221 <211> 7 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 221 Val Leu Lys Glu Ser Val Asn 1 5 <210> 222 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 222 Ile Ala Ala Ser Lys Val Pro Ser Phe Lys Ala Gly Lys Val Leu Lys 1 5 10 15 Glu Ser Val Asn 20 <210> 223 <211> 6 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 223 Arg Phe Lys Pro Gly Ser 1 5 <210> 224 <211> 5 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 224 Thr Leu Glu Leu Lys 1 5 <210> 225 <211> 20 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 225 Ile Ser Ile Pro Ala Arg Lys Val Val Arg Phe Lys Pro Gly Ser Thr 1 5 10 15 Leu Glu Leu Lys 20 <210> 226 <211> 6 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 226 Lys Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 227 <211> 10 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 227 Thr Leu Lys Gln Lys Val Glu Glu Gly Lys 1 5 10 <210> 228 <211> 20 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 228 Lys Arg Val Pro Lys Phe Lys Pro Gly Lys Thr Leu Lys Gln Lys Val 1 5 10 15 Glu Glu Gly Lys 20 <210> 229 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 229 Ser Phe Lys Pro Ala Lys 1 5 <210> 230 <211> 8 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 230 Thr Phe Ile Glu Asp Met Lys Lys 1 5 <210> 231 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 231 Pro Ala His Asp Phe Pro Ser Phe Lys Pro Ala Lys Thr Phe Ile Glu 1 5 10 15 Asp Met Lys Lys 20 <210> 232 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 232 Ser Phe Lys Pro Ala Lys 1 5 <210> 233 <211> 8 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 233 Thr Phe Ile Glu Asp Met Lys Lys 1 5 <210> 234 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 234 Pro Ala His Asp Phe Pro Ser Phe Lys Pro Ala Lys Thr Phe Ile Glu 1 5 10 15 Asp Met Lys Lys 20 <210> 235 <211> 6 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 235 Ala Phe Lys Pro Ser Lys 1 5 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 236 Ile Phe Met Ser Gln Met Lys Gln Asp 1 5 <210> 237 <211> 20 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 237 Lys Arg Asn Ile Pro Ala Phe Lys Pro Ser Lys Ile Phe Met Ser Gln 1 5 10 15 Met Lys Gln Asp 20 <210> 238 <211> 6 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 238 Ala Phe Arg Pro Gly Ala 1 5 <210> 239 <211> 22 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 239 Gln Phe Lys Ala Val Val Ser Gly Ala Gln Arg Leu Pro Ala Glu Gly 1 5 10 15 Pro Ala Val Lys Arg Gly 20 <210> 240 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 240 Ala Lys Arg Pro Ala Thr Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Lys 20 <210> 241 <211> 6 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 241 Ala Phe Arg Pro Gly Ala 1 5 <210> 242 <211> 22 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 242 Gln Phe Lys Ala Val Ile Ser Gly Ala Gln Lys Leu Pro Ala Asp Gly 1 5 10 15 Pro Ala Val Lys Arg Gly 20 <210> 243 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 243 Thr Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys 1 5 10 15 Lys Gly Arg Arg 20 <210> 244 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 244 Asn Phe Lys Pro Ala Ala 1 5 <210> 245 <211> 14 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 245 Thr Ile Lys Gly His Val Arg Lys Gly Gly Gln Asp Asn Gly 1 5 10 <210> 246 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 246 Asn Phe Lys Pro Ala Ala Thr Ile Lys Gly His Val Arg Lys Gly Gly 1 5 10 15 Gln Asp Asn Gly 20 <210> 247 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 247 Asn Phe Arg Ala Thr Ala 1 5 <210> 248 <211> 12 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 248 Ser Val Lys Glu Lys Leu Lys Lys Gly Gly Ala Glu 1 5 10 <210> 249 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 249 Val Leu Asn Phe Arg Ala Thr Ala Ser Val Lys Glu Lys Leu Lys Lys 1 5 10 15 Gly Gly Ala Glu 20 <210> 250 <211> 6 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 250 Thr Phe Arg Pro Gly Gln 1 5 <210> 251 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 251 Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Asn Ala Ser Pro Lys Asp Glu 1 5 10 <210> 252 <211> 20 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 252 Thr Phe Arg Pro Gly Gln Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Asn Ala Ser 1 5 10 15 Pro Lys Asp Glu 20 <210> 253 <211> 6 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 253 Thr Phe Arg Pro Gly Gln 1 5 <210> 254 <211> 14 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 254 Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Asn Ala Ser Pro Lys Glu Glu 1 5 10 <210> 255 <211> 20 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 255 Thr Phe Arg Pro Gly Gln Lys Leu Lys Ser Arg Val Glu Asn Ala Ser 1 5 10 15 Pro Lys Glu Glu 20 <210> 256 <211> 6 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 256 Thr Phe Arg Pro Gly Gln 1 5 <210> 257 <211> 13 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 257 Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Asn Ile Lys Val Glu Lys 1 5 10 <210> 258 <211> 20 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 258 Val Thr Phe Arg Pro Gly Gln Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Asn Ile 1 5 10 15 Lys Val Glu Lys 20 <210> 259 <211> 6 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 259 Thr Phe Arg Pro Gly Gln 1 5 <210> 260 <211> 14 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 260 Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala Gly Thr Lys Ser 1 5 10 <210> 261 <211> 20 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 261 Thr Phe Arg Pro Gly Gln Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Gly Thr Lys Ser 20 <210> 262 <211> 6 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 262 Thr Phe His Ala Ser Gln 1 5 <210> 263 <211> 11 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 263 Lys Leu Lys Ala Leu Val Glu Asn Gly Ala Glu 1 5 10 <210> 264 <211> 20 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 264 Arg Val Val Thr Phe His Ala Ser Gln Lys Leu Lys Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Asn Gly Ala Glu 20 <210> 265 <211> 6 <212> PRT <213> Burkholderia pseudomallei <400> 265 Thr Phe His Ala Ser Gln 1 5 <210> 266 <211> 16 <212> PRT <213> Burkholderia pseudomallei <400> 266 Lys Leu Lys Ala Leu Val Glu Asn Gly Ala Glu Pro Asp Leu Ala Arg 1 5 10 15 <210> 267 <211> 20 <212> PRT <213> Burkholderia pseudomallei <400> 267 His Ala Ser Gln Lys Leu Lys Ala Leu Val Glu Asn Gly Ala Glu Pro 1 5 10 15 Asp Leu Ala Arg 20 <210> 268 <211> 6 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 268 Thr Phe His Ala Ser Gln 1 5 <210> 269 <211> 19 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 269 Lys Leu Lys Ser Val Val Glu Gln Pro Asn Ser Pro Pro Asp Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ala Glu <210> 270 <211> 20 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 270 Gln Lys Leu Lys Ser Val Val Glu Gln Pro Asn Ser Pro Pro Asp Pro 1 5 10 15 Ala Ser Ala Glu 20 <210> 271 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 271 Thr Phe His Ala Ser Gln 1 5 <210> 272 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 272 Lys Leu Lys Gly Met Val Glu His Tyr Tyr Asp Lys Gln Arg 1 5 10 <210> 273 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 273 Thr Phe His Ala Ser Gln Lys Leu Lys Gly Met Val Glu His Tyr Tyr 1 5 10 15 Asp Lys Gln Arg 20 <210> 274 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 274 Thr Phe His Ala Ser Gln 1 5 <210> 275 <211> 14 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 275 Lys Leu Lys Ser Met Val Glu His Tyr Tyr Asp Lys Gln Arg 1 5 10 <210> 276 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 276 Thr Phe His Ala Ser Gln Lys Leu Lys Ser Met Val Glu His Tyr Tyr 1 5 10 15 Asp Lys Gln Arg 20 <210> 277 <211> 6 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 277 Thr Phe Lys Pro Gly Gln 1 5 <210> 278 <211> 10 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 278 Lys Leu Arg Ala Arg Val Glu Lys Thr Lys 1 5 10 <210> 279 <211> 20 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 279 Arg Arg Val Val Thr Phe Lys Pro Gly Gln Lys Leu Arg Ala Arg Val 1 5 10 15 Glu Lys Thr Lys 20 <210> 280 <211> 6 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 280 Val Phe Lys Pro Gly Gln 1 5 <210> 281 <211> 13 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 281 Lys Leu Arg Asn Arg Val Glu Lys Val Lys Pro Lys Ala 1 5 10 <210> 282 <211> 20 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 282 Val Val Phe Lys Pro Gly Gln Lys Leu Arg Asn Arg Val Glu Lys Val 1 5 10 15 Lys Pro Lys Ala 20 <210> 283 <211> 6 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 283 Thr Phe Lys Ala Gly Gln 1 5 <210> 284 <211> 12 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 284 Lys Leu Arg Gly Trp Ile Asp Ser Gln Asn Glu Gly 1 5 10 <210> 285 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 285 Val Val Thr Phe Lys Ala Gly Gln Lys Leu Arg Gly Trp Ile Asp Ser 1 5 10 15 Gln Asn Glu Gly 20 <210> 286 <211> 6 <212> PRT <213> Treponema palladium <400> 286 Val Phe Arg Pro Ser Lys 1 5 <210> 287 <211> 17 <212> PRT <213> Treponema palladium <400> 287 Arg Leu Lys Ser Ala Val Arg Gly Tyr Arg Ser Gly Glu Val Gly Ala 1 5 10 15 Asp <210> 288 <211> 20 <212> PRT <213> Treponema palladium <400> 288 Pro Ser Lys Arg Leu Lys Ser Ala Val Arg Gly Tyr Arg Ser Gly Glu 1 5 10 15 Val Gly Ala Asp 20 <210> 289 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 289 Ser Phe Thr Pro Asp Thr 1 5 <210> 290 <211> 22 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 290 Val Met Lys Glu Leu Val Asn Lys Pro Phe Ser Gln Phe Glu Thr Val 1 5 10 15 Val Ile Asn Asp Gly Val 20 <210> 291 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella melaninogenica <400> 291 Met Gln Ala Gly Asp Thr Met Lys Val Pro Lys Val Glu Leu Arg Pro 1 5 10 15 Glu Tyr Arg Lys 20 <210> 292 <211> 6 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 292 Ser Phe Thr Pro Asp Ala 1 5 <210> 293 <211> 22 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 293 Thr Met Lys Glu Leu Val Asn Lys Pro Phe Ala Gln Phe Glu Thr Val 1 5 10 15 Val Leu Asn Asp Gly Val 20 <210> 294 <211> 20 <212> PRT <213> Prevotella intermedia <400> 294 Ser Ala Gly Asp Thr Met Lys Val Pro Lys Val Glu Leu Arg Pro Gln 1 5 10 15 Tyr Arg Thr Lys 20 <210> 295 <211> 6 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 295 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 296 <211> 10 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 296 Glu Leu Arg Asp Arg Ala Asn Ile Tyr Gly 1 5 10 <210> 297 <211> 20 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 297 Lys Tyr Val Pro His Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Ala 1 5 10 15 Asn Ile Tyr Gly 20 <210> 298 <211> 6 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 298 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 299 <211> 10 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 299 Glu Leu Arg Asp Arg Ala Asn Ile Tyr Gly 1 5 10 <210> 300 <211> 20 <212> PRT <213> Salmonella enterica <400> 300 Lys Tyr Val Pro His Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Ala 1 5 10 15 Asn Ile Tyr Gly 20 <210> 301 <211> 6 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 301 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 302 <211> 8 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 302 Glu Leu Arg Glu Arg Val Asn Leu 1 5 <210> 303 <211> 20 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 303 Glu Gly Lys Tyr Val Pro His Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Glu 1 5 10 15 Arg Val Asn Leu 20 <210> 304 <211> 6 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 304 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 305 <211> 10 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 305 Glu Leu Arg Asp Arg Val Asn Glu Pro Glu 1 5 10 <210> 306 <211> 20 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 306 Lys Phe Val Pro His Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Asp Arg Val 1 5 10 15 Asn Glu Pro Glu 20 <210> 307 <211> 6 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 307 Tyr Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 308 <211> 10 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 308 Glu Leu Lys Ala Arg Val Asp Val Gln Ala 1 5 10 <210> 309 <211> 20 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 309 Lys Ser Val Pro Tyr Phe Lys Ala Gly Lys Glu Leu Lys Ala Arg Val 1 5 10 15 Asp Val Gln Ala 20 <210> 310 <211> 6 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 310 Tyr Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 311 <211> 11 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 311 Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Val Tyr Ala Ala 1 5 10 <210> 312 <211> 20 <212> PRT <213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans <400> 312 Cys Val Pro Tyr Phe Lys Ala Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp 1 5 10 15 Val Tyr Ala Ala 20 <210> 313 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 313 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 314 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 314 Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Leu Ala Leu Lys Glu Asn Ala Asn 1 5 10 15 <210> 315 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 315 Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Leu Ala Leu Lys 1 5 10 15 Glu Asn Ala Asn 20 <210> 316 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 316 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 317 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 317 Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Leu Ala Leu Lys Glu Asn Ala Asn 1 5 10 15 <210> 318 <211> 20 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 318 Phe Lys Pro Gly Lys Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Leu Ala Leu Lys 1 5 10 15 Glu Asn Ala Asn 20 <210> 319 <211> 6 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 319 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 320 <211> 23 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 320 Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Gly Arg Ala Gly Glu Pro Leu Lys Ala 1 5 10 15 Asp Asp Pro Asp Asp Asp Arg 20 <210> 321 <211> 20 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 321 Glu Arg Val Asp Gly Arg Ala Gly Glu Pro Leu Lys Ala Asp Asp Pro 1 5 10 15 Asp Asp Asp Arg 20 <210> 322 <211> 6 <212> PRT <213> Burkholderia pseudomallei <400> 322 His Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 323 <211> 23 <212> PRT <213> Burkholderia pseudomallei <400> 323 Glu Leu Arg Glu Arg Val Asp Gly Arg Ala Gly Glu Pro Leu Lys Asn 1 5 10 15 Asp Glu Pro Glu Asp Ala Gln 20 <210> 324 <211> 20 <212> PRT <213> Burkholderia pseudomallei <400> 324 Glu Arg Val Asp Gly Arg Ala Gly Glu Pro Leu Lys Asn Asp Glu Pro 1 5 10 15 Glu Asp Ala Gln 20 <210> 325 <211> 6 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 325 His Phe Lys Ala Gly Lys 1 5 <210> 326 <211> 22 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 326 Glu Leu Arg Glu Trp Val Asp Leu Val Gly Asn Asp Gln Gly Asp Asp 1 5 10 15 Ser Ser Asn Gly Ser Ser 20 <210> 327 <211> 20 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 327 Asp Ser Ser Asn Gly Ser Ser Asp Pro Leu Gln Ser Val Met Asp Met 1 5 10 15 His Ala Met His 20 <210> 328 <211> 6 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 328 Tyr Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 329 <211> 11 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 329 Ala Leu Arg Glu Ser Val Asn Leu Val Asn Asp 1 5 10 <210> 330 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 330 Ala Thr Pro Tyr Phe Lys Pro Gly Lys Ala Leu Arg Glu Ser Val Asn 1 5 10 15 Leu Val Asn Asp 20 <210> 331 <211> 6 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 331 Tyr Phe Arg Pro Gly Lys 1 5 <210> 332 <211> 11 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 332 Asp Leu Lys Glu Arg Val Trp Gly Ile Lys Gly 1 5 10 <210> 333 <211> 20 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 333 His Val Ala Tyr Phe Arg Pro Gly Lys Asp Leu Lys Glu Arg Val Trp 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly 20 <210> 334 <211> 6 <212> PRT <213> Treponema denticola <400> 334 Arg Phe Lys Pro Gly Lys 1 5 <210> 335 <211> 17 <212> PRT <213> Treponema denticola <400> 335 Glu Leu Lys Glu Ala Leu His Lys Ile Asp Thr Gln Glu Leu Ile Glu 1 5 10 15 Ser <210> 336 <211> 20 <212> PRT <213> Treponema denticola <400> 336 Pro Gly Lys Glu Leu Lys Glu Ala Leu His Lys Ile Asp Thr Gln Glu 1 5 10 15 Leu Ile Glu Ser 20 <210> 337 <211> 12 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 337 Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly Glu Asp Ile Pro Ile 1 5 10 <210> 338 <211> 12 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 338 Gly Arg Asn Pro Lys Thr Gly Asp Lys Val Glu Leu 1 5 10 <210> 339 <211> 12 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 339 Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly Lys Glu Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 340 <211> 12 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 340 Gly Arg Asn Pro Gln Thr Gly Lys Glu Ile Thr Ile 1 5 10

Claims (146)

  1. DNABII 폴리펩티드 또는 단백질 또는 미생물 DNA를 간섭제와 접촉시키고, 그에 의하여 상기 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드가 상기 미생물 DNA에 부착되는 것을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는 것을 포함하는 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 미생물 DNA에의 부착을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는 방법.
  2. 생물막을 간섭제와 접촉시키고, 그에 의하여 상기 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 것을 포함하는 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 접촉이 시험관 내 또는 생체 내에서 이루어지는 방법.
  4. 대상체에 유효량의 간섭제를 투여하고, 그에 의하여 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 것을 포함하는 대상체 내의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는 방법.
  5. 대상체에 유효량의 간섭제를 투여하고, 그에 의하여 대상체 내에 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 것을 포함하는 대상체 내에 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    간섭제가
    (a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (f) 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드;
    (g) 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드;
    (h) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 시퀀스 동정 번호 36의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이들 각각의 등가물 또는 엄중 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 등가물 또는 그의 보체;
    (i) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이들 항체 또는 항원 결합 단편 각각의 등가물 또는 단편;
    (j) (i)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 그의 보체; 또는
    (k) 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 소분자
    의 군의 간섭제인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    간섭제가 단리되거나 또는 재조합 DNABII 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 DNABII 폴리펩티드가 IHF폴리펩티드 또는 그의 단편, IHF 폴리펩티드의 C-말단 단편 또는 이들 각각의 등가물인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 DNABII 폴리펩티드가 HU폴리펩티드 또는 그의 단편, HU 폴리펩티드의 C-말단 단편, 또는 이들 각각의 등가물인 방법
  10. 제 4 항 내지 제 9 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    대상체에 항생제, DNase, 항체, 항원성 펩티드 또는 부형제들 중의 어느 하나 또는 그 이상의 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  11. 제 4 항 내지 제 9 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 비-인간 동물 또는 인간 환자인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물 DNA가 표 8에서 동정된 미생물로부터 유래된 것인 방법.
  13. 제 4 항 내지 제 12 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    시약이 국부적으로, 경피로, 경피로, 설하로, 직장으로, 질동맥으로, 눈으로, 피하로, 근육내로, 복막내로, 요도로, 코안으로 흡입 또는 경구적으로 투여되는 방법.
  14. 제 4 항 내지 제 12 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 소아 환자이고 그리고 시약이 소아 환자용 제형으로 투여되는 방법.
  15. 대상체에 하기 군의 하나 또는 그 이상의 시약의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 면역 반응을 유도하거나 또는 수동 면역을 부여하는 것이 필요한 대상체에 면역 반응을 유도하거나 또는 수동 면역을 부여하는 방법:
    (a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (f) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 시퀀스 동정 번호 36의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이들 각각의 등가물 또는 엄중 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 등가물 또는 그의 보체;
    (g) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이들 각각의 등가물 또는 단편;
    (h) (g)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
    (i) (a) 내지 (e)의 어느 하나와 펄스화된 항원 제공 세포; 및
    (j) (a) 내지 (e)의 어느 하나를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 항원 제공 세포.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 시약이 단리되거나 또는 재조합 DNABII 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 등가물을 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 DNABII 폴리펩티드가 IHF 폴리펩티드 또는 그의 단편, IHF 폴리펩티드의 C-말단 단편 또는 이들 각각의 등가물인 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 DNABII 폴리펩티드가 HU 폴리펩티드 또는 그의 단편, HU 폴리펩티드의 C-말단 단편 또는 이들 각각의 등가물인 방법.
  19. 제 15 항 내지 제 18 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    대상체에 항생제, DNase, 항체, 항원성 펩티드 또는 부형제들 중의 어느 하나 또는 그 이상의 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  20. 제 15 항 내지 제 19 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 비-인간 동물 또는 인간 환자인 방법.
  21. 제 15 항 내지 제 20 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드가 표 8에서 동정된 미생물로부터 유도된 것인 방법.
  22. 제 15 항 내지 제 21 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    시약이 국부적으로, 경피로, 경피로, 설하로, 직장으로, 질동맥으로, 눈으로, 피하로, 근육내로, 복막내로, 요도로, 코안으로 흡입 또는 경구적으로 투여되는 방법.
  23. 제 15 항 내지 제 22 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 소아 환자이고 그리고 시약이 소아 환자용 제형으로 투여되는 방법.
  24. 시퀀스 동정 번호 1 내지 5 또는 12 내지 27, 30 내지 35, 101 내지 340으로부터 선택되는 아미노산 시퀀스 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물로 필수적으로 이루어지는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  25. 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 1 또는 2를 포함하는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  26. 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 3, 4 또는 5를 포함하는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  27. 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30 또는 32를 포함하는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  28. 폴리펩티드가 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100이 아니라는 단서 하에 시퀀스 동정 번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 31 또는 33을 포함하는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  29. 폴리펩티드가 IHF 알파, IHF 베타 또는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 중의 임의의 하나의 야생형이 아니라는 단서 하에
    시퀀스 동정 번호 12 및 13을 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 14 및 15를 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 16 및 17을 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 18 및 19를 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 20 및 21을 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 23 및 24를 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 25 및 26을 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 30 및 31을 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 32 및 33을 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 34 및 35를 포함하는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 337 및 338을 포함하는 폴리펩티드; 또는
    시퀀스 동정 번호 339 및 340을 포함하는 폴리펩티드;
    의 군의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  30. 폴리펩티드가 IHF 알파, IHF 베타 또는 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29 또는 42 내지 100 중의 임의의 하나의 야생형이 아니라는 단서 하에
    시퀀스 동정 번호 12 및 13으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 14 및 15로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 16 및 17로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 18 및 19로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 20 및 21로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 23 및 24로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 25 및 26으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 30 및 31로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 32 및 33으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 34 및 35로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    시퀀스 동정 번호 337 및 338로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드; 또는
    시퀀스 동정 번호 339 및 340으로 필수적으로 이루어지는 폴리펩티드;
    의 군의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  31. 청구항 제 24항 내지 제 30항들 중의 어느 한 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드의 단편 또는 등가물.
  32. 청구항 제 22 항 내지 제 31 항들 중의 어느 한 항에 따른 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상을 포함하는 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드.
  33. 청구항 제 24 항 내지 제 32 항들 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 그의 보체.
  34. 청구항 제 33 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  35. 청구항 제 24 항 내지 제 32 항들 중의 어느 한 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 청구항 제 33 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 제 34 항의 벡터를 포함하는 단리되된 숙주 세포.
  36. 청구항 제 24 항 내지 제 32 항들 중의 어느 한 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 상기 폴리펩티드가 세포의 표면 상에 존재하는 단리된 항원 제공 세포.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 항원 제공 세포가 수지상 세포인 단리된 항원 제공 세포.
  38. 청구항 제 24 항 내지 제 32 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 또는 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  39. 제 34 항에 있어서,
    상기 항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 유도체, 베니어드 항체, 다이어바디, 항체 유도체, 재조합 인간 항체, 키메라 항체 또는 항체 단편의 군으로부터 선택되는 항체.
  40. 제 39 항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
  41. 제 40 항의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
  42. 담체 및
    (a) 청구항 제 24 항 내지 제 32 항들 중의 어느 한 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드;
    (b) 청구항 제 33 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
    (c) 청구항 제 34 항의 벡터;
    (d) 청구항 제 35 항 내지 제 37 항들 중의 어느 한 항의 단리된 숙주 세포; 또는
    (e) 청구항 제 38 항 내지 제 40 항들 중의 어느 한 항의 항체
    들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서,
    부형제, 항원성 펩티드 또는 항생제들 중의 하나 또는 그 이상을 더 포함하는 조성물.
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서,
    담체가 액체 담체, 약제학적으로 수용가능한 담체, 고체상 담체, 약제학적으로 수용가능한 중합체, 리포좀, 미셀, 임플란트, 스텐트, 페이스트, 겔, 치아 임플란트 또는 의료용 임플란트의 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  45. 제 42 항 내지 제 44 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    인간 환자 또는 비-인간 동물에의 투여용으로 제형화되는 조성물.
  46. 제 42 항 내지 제 44 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    흡입 또는 경구에 의하여 국부적으로, 경피로, 경피로, 설하로, 직장으로, 질동맥으로, 눈으로, 피하로, 근육내로, 복막내로, 요도로, 코안으로를 포함하는 하나 또는 그 이상의 방법에 의한 투여용으로 제형화되는 조성물.
  47. 제 42 항 내지 제 46 항 들 중의 어느 한 항에 있어서,
    소아 환자용으로 제형화되는 조성물.
  48. (a) 청구항 제 24 항 내지 제 32 항들 중의 어느 하나의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드;
    (b) 제 33 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제 34 항의 벡터;
    (d) 제 35 항 내지 제 37 항들 중의 어느 하나의 단리된 숙주 세포;
    (e) 제 38 항 내지 제 40 항들 중의 어느 하나의 항체;
    (f) 청구항 제 42 항의 조성물;
    (g) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (h) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (i) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (j) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (k) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (l) 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드;
    (m) 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드;
    (n) (g) 내지 (l)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
    (o) (g) 내지 (l)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 이들의 등가물 또는 단편;
    (p) (o)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드; 또는
    (q) 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 소분자 및
    사용을 위한 지시서의 군 중의 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 킷트.
  49. 제 48 항에 있어서,
    부형제, 항원성 펩티드, DNase, 항체 또는 항생제들 중의 하나 또는 그 이상을 더 포함하는 킷트.
  50. 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서,
    담체가 액체 담체, 약제학적으로 수용가능한 담체, 고체상 담체, 약제학적으로 수용가능한 중합체, 리포좀, 미셀, 임플란트, 스텐트, 페이스트, 겔, 치아 임플란트 또는 의료용 임플란트의 군으로부터 선택되는 담체를 더 포함하는 킷트.
  51. 후보 시약을 샘플과 접촉시키고, 그리고
    DNA에의 단백질 또는 폴리펩티드의 결합에 대하여 분석하는 것을 포함하는 미생물 DNA를 포함하는 샘플 내에서의 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합을 조절하는 시약을 동정하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 시약이 상기 미생물 DNA에의 상기 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합을 저해하거나, 예방하거나 또는 적정하는 것에 의하여 결합을 조절하는 방법.
  53. (a) 청구항 제 24 항 내지 제 32 항들 중의 어느 하나의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드;
    (b) 제 33 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
    (c) 제 34 항의 벡터;
    (d) 제 35 항 내지 제 37 항들 중의 어느 하나의 단리된 숙주 세포;
    (e) 제 38 항 내지 제 40 항들 중의 어느 하나의 항체;
    (f) 청구항 제 42 항의 조성물;
    (g) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (h) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (i) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (j) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (k) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (l) 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드;
    (m) 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드;
    (n) (g) 내지 (l)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드;
    (o) (g) 내지 (l)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 이들의 등가물 또는 단편;
    (p) (o)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드; 또는
    (q) 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 소분자
    의 군의 시약의 용도.
  54. 제 6 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 인간 항체, 인간화된 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 베니어드 항체, 변성된 항체 또는 항체 유도체인 방법.
  56. 제 55 항에 있어서,
    상기 항체가 VH 및/또는 VL CDR 1, CDR 2 및/또는 CDR 3 영역들 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변성되는 방법.
  57. 제 55 항에 있어서,
    상기 항체가 다수의 시스테인 잔기들 또는 Fc 힌지 영역 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변경되는 것에 의하여 변성되는 방법.
  58. 제 55 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체가 또는 그의 단편이 키메라 변성된 것인 방법.
  59. 제 58 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 페길화되는 것인 방법.
  60. 제 58 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 혈청 단백질에 공액화되는 것인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 혈청 단백질이 인간 혈청 알부민인 방법.
  62. 제 55 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 진단시약에 공액화되는 것인 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    상기 진단시약이 효소, 보결분자단 복합체, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성물질, 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 제 63 항에 있어서,
    상기 효소가 고추냉이과산화효소, 알칼리성 인산가수분해효소, 베타-갈락토시다아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  65. 제 63 항에 있어서,
    상기 보결분자단 복합체가 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 제 63 항에 있어서,
    상기 형광물질이 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인, 댄실 염화물 및 피코에리트린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  67. 제 63 항에 있어서,
    상기 발광물질이 루미놀인 방법.
  68. 제 63 항에 있어서,
    상기 생물발광물질이 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿼린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. 제 63 항에 있어서,
    상기 방사성물질이 125I, 131I, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무트-212, 비스무트-213, 아스타틴-211, 동-62, 동-64, 동-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 연-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브덴-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199 및 연-211들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제 55 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 치료제와 공액화되는 것인 방법.
  71. 제 70 항에 있어서,
    상기 치료제가 항생제인 방법.
  72. 제 70 항에 있어서,
    상기 치료제가 RNA 분해효소(RNase), DNase I, 항감작 핵산, 저해성 RNA 분자, 면역자극 핵산, 압타머, 리보자임, 3중 형성 분자 및 외부 안내 시퀀스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  73. 제 55 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 적어도 하나의 부가의 관능성 분자에 공액화되거나 또는 융합되는 것인 방법.
  74. 제 73 항에 있어서,
    상기 부가의 관능성 분자가 2차 항체인 방법.
  75. 제 38 항 내지 제 40 항들 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 항체.
  76. 제 75 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 인간 항체, 인간화된 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 베니어드 항체, 변성된 항체 또는 항체 유도체인 항체.
  77. 제 76 항에 있어서,
    상기 항체가 VH 및/또는 VL CDR 1, CDR 2 및/또는 CDR 3 영역들 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변성되는 항체.
  78. 제 76 항에 있어서,
    상기 항체가 다수의 시스테인 잔기들 또는 Fc 힌지 영역 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변경되는 것에 의하여 변성되는 항체.
  79. 제 76 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 화학적으로 변성되는 항체.
  80. 제 79 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 페길화된 항체.
  81. 제 79 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 혈청 단백질에 공액화되는 항체.
  82. 제 81 항에 있어서,
    상기 혈청 단백질이 인간 혈청 알부민인 항체.
  83. 제 76 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 진단시약에 공액화되는 것인 항체.
  84. 제 83 항에 있어서,
    상기 진단시약이 효소, 보결분자단 복합체, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성물질, 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  85. 제 84 항에 있어서,
    상기 효소가 고추냉이과산화효소, 알칼리성 인산가수분해효소, 베타-갈락토시다아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  86. 제 84 항에 있어서,
    상기 보결분자단 복합체가 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  87. 제 84 항에 있어서,
    상기 형광물질이 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인, 댄실 염화물 및 피코에리트린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  88. 제 84 항에 있어서,
    상기 발광물질이 루미놀인 항체.
  89. 제 84 항에 있어서,
    상기 생물발광물질이 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿼린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  90. 제 84 항에 있어서,
    상기 방사성물질이 125I, 131I, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무트-212, 비스무트-213, 아스타틴-211, 동-62, 동-64, 동-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 연-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브덴-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199 및 연-211들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  91. 제 76 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 치료제와 공액화되는 것인 항체.
  92. 제 91 항에 있어서,
    상기 치료제가 항생제인 항체.
  93. 제 91 항에 있어서,
    상기 치료제가 RNA 분해효소(RNase), DNase I, 항감작 핵산, 저해성 RNA 분자, 면역자극 핵산, 압타머, 리보자임, 3중 형성 분자 및 외부 안내 시퀀스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  94. 제 76 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 적어도 하나의 부가의 관능성 분자에 공액화되거나 또는 융합되는 것인 항체.
  95. 제 94 항에 있어서,
    상기 부가의 관능성 분자가 2차 항체인 항체.
  96. 제 48 항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 킷트.
  97. 제 96 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 인간 항체, 인간화된 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 베니어드 항체, 변성된 항체 또는 항체 유도체인 킷트.
  98. 제 97 항에 있어서,
    상기 항체가 VH 및/또는 VL CDR 1, CDR 2 및/또는 CDR 3 영역들 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변성되는 킷트.
  99. 제 97 항에 있어서,
    상기 항체가 다수의 시스테인 잔기들 또는 Fc 힌지 영역 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변경되는 것에 의하여 변성되는 킷트.
  100. 제 97 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 화학적으로 변성되는 킷트.
  101. 제 100 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 페길화된 킷트.
  102. 제 100 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 혈청 단백질에 공액화되는 킷트.
  103. 제 102 항에 있어서,
    상기 혈청 단백질이 인간 혈청 알부민인 킷트.
  104. 제 97 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 진단시약에 공액화되는 것인 킷트.
  105. 제 104 항에 있어서,
    상기 진단시약이 효소, 보결분자단 복합체, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성물질, 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 킷트.
  106. 제 105 항에 있어서,
    상기 효소가 고추냉이과산화효소, 알칼리성 인산가수분해효소, 베타-갈락토시다아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 킷트.
  107. 제 105 항에 있어서,
    상기 보결분자단 복합체가 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 킷트.
  108. 제 105 항에 있어서,
    상기 형광물질이 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인, 댄실 염화물 및 피코에리트린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 킷트.
  109. 제 105 항에 있어서,
    상기 발광물질이 루미놀인 킷트.
  110. 제 105 항에 있어서,
    상기 생물발광물질이 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿼린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 킷트.
  111. 제 105 항에 있어서,
    상기 방사성물질이 125I, 131I, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무트-212, 비스무트-213, 아스타틴-211, 동-62, 동-64, 동-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 연-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브덴-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199 및 연-211들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 킷트.
  112. 제 76 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 치료제와 공액화되는 것인 킷트.
  113. 제 112 항에 있어서,
    상기 치료제가 항생제인 킷트.
  114. 제 97 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 적어도 하나의 부가의 관능성 분자에 공액화되거나 또는 융합되는 것인 킷트.
  115. 제 114 항에 있어서,
    상기 부가의 관능성 분자가 2차 항체인 킷트.
  116. 제 53 항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 백신화를 필요로 하는 대상체를 백신접종하는 용도.
  117. 제 116 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 인간 항체, 인간화된 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 베니어드 항체, 변성된 항체 또는 항체 유도체인 용도.
  118. 제 117 항에 있어서,
    상기 항체가 VH 및/또는 VL CDR 1, CDR 2 및/또는 CDR 3 영역들 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변성되는 것인 용도.
  119. 제 117 항에 있어서,
    상기 항체가 다수의 시스테인 잔기들 또는 Fc 힌지 영역 내의 보존적 아미노산 돌연변이들에 의해 변경되는 것에 의하여 변성되는 것인 용도.
  120. 제 117 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 화학적으로 변성되는 것인 용도.
  121. 제 120 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 페길화된 것인 용도.
  122. 제 120 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 혈청 단백질에 공액화되는 것인 용도.
  123. 제 122 항에 있어서,
    상기 혈청 단백질이 인간 혈청 알부민인 용도.
  124. 제 117 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 진단시약에 공액화되는 것인 용도.
  125. 제 124 항에 있어서,
    상기 진단시약이 효소, 보결분자단 복합체, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성물질, 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  126. 제 125 항에 있어서,
    상기 효소가 고추냉이과산화효소, 알칼리성 인산가수분해효소, 베타-갈락토시다아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  127. 제 125 항에 있어서,
    상기 보결분자단 복합체가 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  128. 제 125 항에 있어서,
    상기 형광물질이 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민플루오레세인, 댄실 염화물 및 피코에리트린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  129. 제 125 항에 있어서,
    상기 발광물질이 루미놀인 용도.
  130. 제 125 항에 있어서,
    상기 생물발광물질이 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿼린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  131. 제 125 항에 있어서,
    상기 방사성물질이 125I, 131I, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무트-212, 비스무트-213, 아스타틴-211, 동-62, 동-64, 동-67, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111, 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 연-212, 라듐-223, 악티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 비소-77, 스트론튬-89, 몰리브덴-99, 로듐-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 금-199 및 연-211들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  132. 제 117 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 치료제와 공액화되는 것인 용도.
  133. 제 132 항에 있어서,
    상기 치료제가 항생제인 용도.
  134. 제 132 항에 있어서,
    상기 치료제가 RNA 분해효소(RNase), DNase I, 항감작 핵산, 저해성 RNA 분자, 면역자극 핵산, 압타머, 리보자임, 3중 형성 분자 및 외부 안내 시퀀스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  135. 제 117 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그의 단편이 적어도 하나의 부가의 관능성 분자에 공액화되거나 또는 융합되는 것인 용도.
  136. 제 135 항에 있어서,
    상기 부가의 관능성 분자가 2차 항체인 용도.
  137. 재조합 폴리뉴클레오티드의 등가물이 엄중 조건들 하에서 폴리뉴클레오티드 또는 그의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 엄중 조건이 약 25℃ 내지 약 37℃의 온도; 약 6배량 SSC 내지 약 10배량 SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4배량 SSC 내지 약 8배량 SSC의 세척 용액;에서의 배양을 포함하는, 제 1 항 내지 제 23 항, 제 51 항 내지 제 52 항 또는 제 54 항 내지 제 74 항의 방법, 제 24 항 내지 제 33 항의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드, 제 34 항의 벡터, 제 35 항 내지 제 37 항의 단리된 세포, 제 38 항 내지 제 40 항 또는 제 75 항 내지 제 95 항의 항체, 제 41 항의 하이브리도마 세포주, 제 42 항 내지 제 47 항의 조성물, 제 48 항 내지 제 50 항 또는 제 96 항 내지 제 115 항의 킷트, 제 53 항 또는 제 116 항 내지 제 136 항의 용도.
  138. 삽입숙주인자(IHF) 단백질의 3차원 구조에 대하여 후보 시약의 3차원 구조를 위치시키는 것을 포함하며, 여기에서 IHF 단백질의 상기 3차원 구조는 IHF 및 DNA 복합체의 결정 형태로부터 결정되는 X, Y 및 Z 원자 구조 배위에 기초하고, 여기에서 시퀀스 동정 번호: 42로 표시된 바와 같은 T4, K5, A6, E28, Q43, K45, S47, G48, N51, R55, K57, R60, R63, N64, P65, K66, R76, T80, R82 또는 Q85 또는 각각의 등가물로부터 선택되는 2 또는 그 이상의 IHF 아미노산에서 상기 시약의 상기 IHF와의 상호작용이 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는, 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 대상체 내의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 대상체 내에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하기 위한 컴퓨터 구현 방법.
  139. 제 138 항에 있어서,
    상기 시퀀스 동정 번호: 42로 표시된 바와 같은 T4, K5, A6, E28, Q43, K45, S47, G48, N51, R55, K57, R60, R63, N64, P65, K66, R76, T80, R82 또는 Q85 또는 각각의 등가물로부터 선택되는 3 또는 그 이상의 IHF 아미노산에서 상기 시약의 상기 IHF와의 상호작용이 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는 방법.
  140. 제 138 항 또는 제 139 항에 있어서,
    상기 X, Y 및 Z 원자 구조 배위가 단백질 데이터 뱅크(PDB) 접근 번호 : 1IHF에서 규정된 바와 같은 배위를 포함하는 방법.
  141. 적어도 하나의 연산장치;
    상기 적어도 하나의 연산장치에 결합된 기억장치;
    상기 기억장치 및 상기 적어도 하나의 연산장치와 통신하는 저장매체를 포함하며, 상기 저장매체가 상기 연산장치에 의하여 실행되는 경우에 맞춤형 전산 장치의 환경을 설정하여 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 대상체 내의 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 대상체 내에서 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는 한 세트의 연산장치 실행가능 지시를 포함하며, 여기에서 상기 환경이
    삽입숙주인자(IHF) 단백질의 3차원 구조에 대하여 후보 시약의 3차원을 위치시키는 것을 포함하고, 여기에서 상기 IHF 단백질의 상기 3차원 구조가 IHF 및 DNA 복합체의 결정 형태로부터 결정되는 X, Y 및 Z 원자 구조 배위에 기초하고, 여기에서 시퀀스 동정 번호: 42로 표시된 바와 같은 T4, K5, A6, E28, Q43, K45, S47, G48, N51, R55, K57, R60, R63, N64, P65, K66, R76, T80, R82 또는 Q85 또는 각각의 등가물로부터 선택되는 2 또는 그 이상의 IHF 아미노산에서 상기 시약의 상기 IHF와의 상호작용이 미생물 DNA에의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 결합을 저해하거나, 경쟁하거나 또는 적정하는, 미생물 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 생물막을 저해하거나, 예방하거나 또는 파괴하는, 또는 생물막을 생성하는 미생물 감염을 저해하거나, 예방하거나 또는 치료하는 시약을 동정하는 맞춤형 전산 장치.
  142. 후보 시약을 샘플과 접촉시키고, 그리고
    DNA에의 단백질 또는 폴리펩티드의 결합에 대하여 분석하는 것을 포함하며,
    여기에서 상기 시약이 상기 미생물 DNA에의 상기 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합을 저해하거나, 예방하거나 또는 적정하는 것에 의하여 상기 결합을 조절하는 미생물 DNA를 포함하는 샘플 내에서의 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합을 조절하는 시약을 동정하는 방법.
  143. 환자로부터 단리되고 그리고 감염을 포함하는 샘플 내의 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 존재가 간섭제의 투여에 의하여 치료될 것은 환자를 동정하고, 그리고 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 부재가 상기 간섭제의 투여에 의하여 치료되지 않을 것 같은 환자를 동정하는, 간섭제의 투여에 의하여 치료되거나 치료되지 않을 것 같은 미생물 감염을 갖는 환자를 동정하는 방법.
  144. 제 143 항에 있어서,
    상기 DNABII 폴리펩티드 또는 단백질의 존재가 상기 간섭제의 투여에 의하여 치료될 것 같은 환자를 동정하는 방법.
  145. 제 144 항에 있어서,
    상기 간섭제의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  146. 제 145 항에 있어서,
    상기 간섭제가
    (a) 단리되거나 또는 재조합 삽입숙주인자(IHF) 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (b) 대장균 균주 U93(HU) 폴리펩티드로부터의 단리되거나 또는 재조합 히스톤유사 단백질 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (c) 표 8, 표 9a, 표 9b, 표 10에 동정된 단리되거나 또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 도 6에서 동정된 DNA 결합 펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (d) 시퀀스 동정 번호 1 내지 340의 단리되거나 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (e) 시퀀스 동정 번호 6 내지 11, 28, 29, 42 내지 100, 표 8의 단리되거나 또는 재조합 C-말단 폴리펩티드 또는 표 10에서 동정된 이들의 C-말단 폴리펩티드 또는 이들 각각의 단편 또는 등가물;
    (f) 미생물 DNA에의 결합에 대하여 삽입숙주인자와 경쟁하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드;
    (g) 홀리데이 접합 유사 4방 접합 폴리뉴클레오티드, 복제 갈래 유사 3방 접합 폴리뉴클레오티드, 고유의 유연성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 굽혀진 폴리뉴클레오티드;
    (h) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 시퀀스 동정 번호 36의 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이들 각각의 등가물 또는 엄중 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 등가물 또는 그의 보체;
    (i) (a) 내지 (f)의 어느 하나를 특이적으로 인식하거나 또는 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이들 항체 또는 항원 결합 단편 각각의 등가물 또는 단편;
    (j) (i)의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리되거나 또는 재조합 폴리뉴클레오티드; 또는
    (k) 미생물 DNA에의 DNABII 단백질 또는 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 소분자
    들 중의 하나 또는 그 이상인 방법.
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