JP2023033394A - バイオフィルム関連障害の処置のための抗体断片 - Google Patents

バイオフィルム関連障害の処置のための抗体断片 Download PDF

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Lauren O Bakaletz
ディー． グッドマン スティーブン
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Abstract

【課題】バイオフィルム関連障害の処置のための抗体断片の提供。【解決手段】本開示は、バイオフィルムの形成を特徴とする既存の感染を有するもののための治療薬として有用である抗体断片および抗体断片を含む単離されたポリペプチドを提供する。抗体断片および抗体断片を含む単離されたポリペプチドを投与して、感染を検出、処置または予防でき、かつ／またはバイオフィルムを治療できる。機能的バイオフィルムを形成できない細菌は、宿主の免疫系の残部および／または従来の抗生物質によってより容易に除去される。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１７年２月２日に出願された同６２／４５３，９２１、および２０１７年１月４日に出願された同６２／４４２，３０７に対する利益を主張し、上記の米国仮出願の各内容は、その全容が参考として本明細書に援用される。
政府権利についての陳述
本開示は、一部、米国国立衛生研究所により与えられる認可番号ＮＩＨ Ｒ０１ ＤＣ１１８１８のもとで政府支援を受けて行われた。政府は本開示に一定の権利を有する。
分野
本開示は、一般には、新規抗体断片およびこれらの断片を含有する組成物を使用して、細菌バイオフィルムを減らし、かつ／またはなくし、そしてバイオフィルムに関連する疾患または障害を処置するための方法および組成物に関する。
背景
公知の真正細菌全てにおいてタンパク質のＤＮＡＢＩＩファミリーからの少なくとも１つのタンパク質が見いだされ、細菌細胞の外側に天然に見いだされる。このファミリーにより、強力な自然免疫応答が引き出されるが、宿主対象は感染の結果として、ファミリーメンバーに対する特異的な保護的抗体を天然に生じることができない。ＤＮＡＢＩＩタンパク質および細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）は、「バイオフィルム」の格子構造に寄与する。細菌バイオフィルムに伴う主要な問題は、宿主免疫系および／または抗生物質および他の抗菌薬が、バイオフィルム内に保護された細菌に近づくことができないことである。
バイオフィルムは、工業の場にも存在する。例えば、バイオフィルムは、生産現場からガソリンスタンドの貯蔵タンクまでの広範囲の石油の加工問題に関係づけられる。現場では、硫酸還元性バイオフィルム細菌が硫化水素を産生する（サワー・オイル（ｓｏｕｒｅｄ ｏｉｌ））。加工パイプラインでは、バイオフィルム活性によりスライムが発生し、それがフィルターおよび開口部の邪魔になる。バイオフィルムおよびバイオフィルム生物は、パイプラインおよび石油加工装置の腐食も引き起こす。これらの問題は、油またはガスの生産設備全体を通して、汚損および腐食性のバイオフィルム生物が貯蔵タンクの最終製品の表面に見いだされるまで顕在化し得る。
家庭では、バイオフィルムは、微生物の成長を支持する任意の表面の中またはその上、例えば、排水管の中、調理台の上、トイレの中、およびスイミングプールおよびスパの中に見いだされる。バイオフィルムは、家庭用と工業用の両方の広範囲の水の加工に関係づけられる。バイオフィルムは、加工装置の表面上で成長し、熱伝達の効率低下、またはフィルターおよび膜を塞ぐなど、装置の性能を害する可能性がある。冷却塔充填材上で成長しているバイオフィルムにより、充填材の崩壊を引き起こすのに十分な重量が加わる可能性がある。バイオフィルムは、高度に特殊化されたステンレス鋼でさえも腐食させる。水の加工におけるバイオフィルムにより、例えば、紙加工におけるバイオフィルムの汚染、またはシリコンチップ上への単一の細胞の付着でさえ、最終製品の価値を下げる可能性がある。飲料水の配水系統において成長しているバイオフィルムは、水の美的品質を劣化させる潜在的な病原生物、腐食性の生物体または細菌を有し得る。
部分配列表
配列番号１：全長野生型（ｗｔ）８６－０２８ＮＰ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＸ８８４２５．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
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配列番号２：全長野生型（ｗｔ）８６－０２８ＮＰ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＸ８８６９９．１（２０１５年５月１３日が最近のアクセスである）：
ＭＴＫＳＥＬＭＥＫＬＳＡＫＱＰＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱＳＬＥＮＧＤＲＶＥＶＲＧＦＧＳＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶＮＬＳＡＫＳＶＰＹＦＫＡＧＫＥＬＫＡＲＶ ＤＶＱＡ．
配列番号３：全長ｗｔ８６－０２８ＮＰ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿２４８１４２．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
ＭＲＦＶＴＩＦＩＮＨＡＦＮＳＳＱＶＲＬＳＦＡＱＦＬＲＱＩＲＫＤＴＦＫＥＳＮＦＬＦＮＲＲＹＫＦＭＮＫＴＤＬＩＤＡＩＡＮＡＡＥＬＮＫＫＱＡＫＡＡＬＥＡＴＬＤＡＩＴＡＳＬＫＥＧＥＰＶＱＬＩＧＦＧＴＦＫＶＮＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩＱＩＡＡＳＫＶＰＡＦＶＳＧＫＡＬＫＤＡＩＫ．
配列番号４：全長ｗｔ Ｒ２８４６ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＤＯ９６３７５（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳＫＱＤＴＫＮＶＶＥＮＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶＰＶＳＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ．
配列番号５：全長ｗｔ Ｒｄ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＣ２２９５９．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳＫＱＤＴＫＮＶＶＥＮＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶＰＶＳＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ．
配列番号６：全長ｗｔ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＣ７４７８２．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
ＭＡＬＴＫＡＥＭＳＥＹＬＦＤＫＬＧＬＳＫＲＤＡＫＥＬＶＥＬＦＦＥＥＩＲＲＡＬＥＮＧＥＱＶＫＬＳＧＦＧＮＦＤＬＲＤＫＮＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＤＩＰＩＴＡＲＲＶＶＴＦＲＰＧＱＫＬＫＳＲＶＥＮＡＳＰＫＤＥ； ＤＮＡ Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ． ＮＣ＿０００９１３．
配列番号７：全長ｗｔ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＩｈｆＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＡ３５６５６（２０１５年５月１９日が最近のアクセスである）：
ＭＴＫＳＥＬＩＥＲＬＡＴＱＱＳＨＩＰＡＫＴＶＥＤＡＶＫＥＭＬＥＨＭＡＳＴＬＡＱＧＥＲＩＥＩＲＧＦＧＳＦＳＬＨＹＲＡＰＲＴＧＲＮＰＫＴＧＤＫＶＥＬＥＧＫＹＶＰＨＦＫＰＧＫＥＬＲＤＲＡＮＩＹＧ．
配列番号８：Ｅ． ｃｏｌｉ ｈｕｐＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００３８１８（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
ＭＮＫＴＱＬＩＤＶＩＡＥＫＡＥＬＳＫＴＱＡＫＡＡＬＥＳＴＬＡＡＩＴＥＳＬＫＥＧＤＡＶＱＬＶＧＦＧＴＦＫＶＮＨＲＡＥＲＴＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩＫＩＡＡＡＮＶＰＡＦＶＳＧＫＡＬＫＤＡＶＫ．
配列番号９：Ｅ． ｃｏｌｉ ｈｕｐＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００１０９０．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
ＭＮＫＳＱＬＩＤＫＩＡＡＧＡＤＩＳＫＡＡＡＧＲＡＬＤＡＩＩＡＳＶＴＥＳＬＫＥＧＤＤＶＡＬＶＧＦＧＴＦＡＶＫＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩＡＡＡＫＶＰＳＦＲＡＧＫＡＬＫＤＡＶＮ．
配列番号１０：全長ｗｔ Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ ０１ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＧ０６１２６．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
ＭＧＡＬＴＫＡＥＩＡＥＲＬＹＥＥＬＧＬＮＫＲＥＡＫＥＬＶＥＬＦＦＥＥＩＲＱＡＬＥＨＮＥＱＶＫＬＳＧＦＧＮＦＤＬＲＤＫＲＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＥＩＰＩＴＡＲＲＶＶＴＦＲＰＧＱＫＬＫＡＲＶＥＡＹＡＧＴＫＳ．
配列番号１１：全長ｗｔ Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ ０１ ＩｈｆＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＦ７２９５０．１（２０１５年５月１９日が最近のアクセスである）：
ＭＴＫＳＥＬＩＥＲＩＶＴＨＱＧＱＬＳＡＫＤＶＥＬＡＩＫＴＭＬＥＱＭＳＱＡＬＡＴＧＤＲＩＥＩＲＧＦＧＳＦＳＬＨＹＲＡＰＲＶＧＲＮＰＫＴＧＥＳＶＲＬＤＧＫＦＶＰＨＦＫＰＧＫＥＬＲＤＲＶＮＥＰＥ．
配列番号１２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ－３断片：
ＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦ．
配列番号１３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ５断片：
ＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶＰＶＳＡＲＲＶＶ．
配列番号１４：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ， Ａ５断片：ＲＴＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩＱＩＡＡＳＫＶＰ．
配列番号１５：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ２断片：
ＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱ．
配列番号１６：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ４断片：
ＲＧＦＧＳＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫ．
配列番号１７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂ４ （ｍＢ４）断片：
ＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶ．
配列番号１８：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ－１断片：
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳ．
配列番号１９：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ２断片：
ＫＹＨＬＳＫＱＤＴＫＮＶＶＥＮＦＬＥＥＩ．
配列番号２０：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ４断片
ＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮ．
配列番号２１：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ６断片：
ＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ．
配列番号２２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ１断片：
ＭＴＫＳＥＬＭＥＫＬＳＡＫＱＰＴＬＳＡＫ．
配列番号２３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ３断片：
ＥＦＩＳＱＳＬＥＮＧＤＲＶＥＶＲＧＦＧＳ．
配列番号２４：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ５断片：
ＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶＮＬＳＡＫＳＶＰＹＦ．
配列番号２５：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ６断片：
ＳＶＰＹＦＫＡＧＫＥＬＫＡＲＶＤＶＱＡ．
配列番号２６：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ先端断片：
ＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶ．
配列番号２７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ先端断片：
ＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶＮＬ．
配列番号２８：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
ＭＮＫＴＤＬＩＤＡＩＡＮＡＡＥＬＮＫＫＱＡＫ．
配列番号２９：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
ＫＫＱＡＫＡＡＬＥＡＴＬＤＡＩＴＡＳＬＫＥＧ．
配列番号３０：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
ＳＬＫＥＧＥＰＶＱＬＩＧＦＧＴＦＫＶＮＥＲＡ．
配列番号３１：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
ＶＮＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩＱＩＡＡ．
配列番号３２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
ＩＱＩＡＡＳＫＶＰＡＦＶＳＧＫＡＬＫＤＡＩＫ．
配列番号３３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片、Ａ３断片：
ＫＫＱＡＫＡＡＬＥＡＴＬＤＡＩＴＡＳＬＫＥＧ．
配列番号３４：ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０：
ＡＰＴＫＡＰＤＶＦＰＩＩＳＧＣＲＨＰＫＤＮＳＰＶＶＬＡＣＬＩＴＧＹＨＰＴＳＶＴＶＴＷＹＭＧＴＱＳＱＰＱＲＴＦＰＥＩＱＲＲＤＳＹＹＭＴＳＳＱＬＳＴＰＬＱＱＷＲＱＧＥＹＫＣＶＶＱＨＴＡＳＫＳＫＫＥＩＦＲＷＰＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＧＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ．
配列番号３５：ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ．
配列番号３６：ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ．
配列番号３７：ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ．
配列番号３８：ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１：
ＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＬＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ．
配列番号３９：ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ．
配列番号４０：ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６：
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＣＳＴＱＰＤＧＮＶＶＩＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＧＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＬＡＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ．
配列番号４１：ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７：
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＤＳＴＰＱＤＧＮＶＶＶＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＮＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＰＤＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＭＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ．
配列番号４２：ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４：
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ．
配列番号４３：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬＫＬ．
配列番号４４：非限定的な例示的リンカー：ＧＧＧ．
配列番号４５：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬ．
配列番号４６：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳ．
配列番号４７：非限定的な例示的リンカー：ＰＳＬＫ．
配列番号４８：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬＫ．
配列番号４９：非限定的な例示的リンカー：ＳＬＫＬ．
配列番号５０：非限定的な例示的重鎖可変領域ヌクレオチド配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＡＡＴＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ．
配列番号５１：非限定的な例示的重鎖可変領域アミノ酸配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＴＰＳＱＳＬＳＭＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＳＹＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＳＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＤＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＲＥＤＳＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ．
配列番号５２：非限定的な例示的重鎖可変領域ヌクレオチド配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＧＧＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣ．
配列番号５３：非限定的な例示的重鎖可変領域アミノ酸配列、ＩｈｆｍＢ４断片：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＲＳＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹＶＰＫＦＱＧＫＡＳＭＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＧＡＹＷＧＱＧＴＬＶ．
配列番号５４：非限定的な例示的軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＡＣＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ．
配列番号５５：非限定的な例示的軽鎖可変領域アミノ酸配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＹＮＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ．
配列番号５６：非限定的な例示的軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＴＴＡＣＣＡＴＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ．
配列番号５７：非限定的な例示的軽鎖可変領域アミノ酸配列、ＩｈｆｍＢ４断片：
ＤＶＶＭＴＱＩＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬＮＷＬＦＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＷＱＳＴＨＦＰＨＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ．
配列番号５８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＦＳＬＴＳＹＳ。
配列番号５９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＦＳＬＴＳＹＳＶ．
配列番号６０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＦＳＬＴＳＹＳＶＨ．
配列番号６１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＧＦＳＬＴＳＹＳ．
配列番号６２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＩＷＡＧＧＳＴ．
配列番号６３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＶＩＷＡＧＧＳＴ．
配列番号６４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＧＶＩＷＡＧＧＳＴ．
配列番号６５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴ．
配列番号６６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴ．
配列番号６７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＩＷＡＧＧＳＴＮ．
配列番号６８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＶＩＷＡＧＧＳＴＮ．
配列番号６９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ．
配列番号７０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ．
配列番号７１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ．
配列番号７２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＩＷＡＧＧＳＴＮＹ．
配列番号７３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ．
配列番号７４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ．
配列番号７５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ．
配列番号７６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ．
配列番号７７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ３配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＲＥＤＳ．
配列番号７８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ３配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＡＲＥＤＳ．
配列番号７９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ１配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＱＮＶＧＴＮ．
配列番号８０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ１配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＱＮＶＧＴＮＶ．
配列番号８１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ１配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＱＮＶＧＴＮＶＡ．
配列番号８２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＳＡＳ．
配列番号８３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＹＳＡＳ．
配列番号８４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＩＹＳＡＳ
配列番号８５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＬＩＹＳＡＳ．
配列番号８６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＡＬＩＹＳＡＳ．
配列番号８７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＳＡＳＹ．
配列番号８８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＹＳＡＳＹ．
配列番号８９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＩＹＳＡＳＹ．
配列番号９０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＬＩＹＳＡＳＹ．
配列番号９１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＡＬＩＹＳＡＳＹ．
配列番号９２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＳＡＳＹＲ．
配列番号９３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＹＳＡＳＹＲ．
配列番号９４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＩＹＳＡＳＹＲ．
配列番号９５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＬＩＹＳＡＳＹＲ．
配列番号９６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＡＬＩＹＳＡＳＹＲ．
配列番号９７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＳＡＳＹＲＹ．
配列番号９８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＹＳＡＳＹＲＹ．
配列番号９９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：
ＩＹＳＡＳＹＲＹ．
配列番号１００：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：ＬＩＹＳＡＳＹＲＹ．
配列番号１０１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：ＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹ．
配列番号１０２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：ＳＡＳＹＲＹＳ．
配列番号１０３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：ＹＳＡＳＹＲＹＳ．
配列番号１０４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：ＩＹＳＡＳＹＲＹＳ．
配列番号１０５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：ＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳ．
配列番号１０６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆＡ５断片：ＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳ．
配列番号１０７：非限定的な例示的リンカー：ＧＧＳＧＧＳ．
配列番号１０８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ３配列、ＩｈｆＡ５断片：ＱＱＹＮＳＹＰ．
配列番号１０９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ３配列、ＩｈｆＡ５断片：ＱＱＹＮＳＹＰＴ．
配列番号１１０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＦＮＩＫＤＹＹ．
配列番号１１１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＦＮＩＫＤＹＹＭ．
配列番号１１２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＦＮＩＫＤＹＹＭＨ．
配列番号１１３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ１配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＧＦＮＩＫＤＹＹ．
配列番号１１４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＤＰＥＮＤＤＴ．
配列番号１１５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＩＤＰＥＮＤＤＴ．
配列番号１１６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ．
配列番号１１７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ．
配列番号１１８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ．
配列番号１１９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＤＰＥＮＤＤＴＥ．
配列番号１２０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ．
配列番号１２１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ．
配列番号１２２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ．
配列番号１２３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ．
配列番号１２４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ．
配列番号１２５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ．
配列番号１２６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ．
配列番号１２７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ．
配列番号１２８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ．
配列番号１２９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＨ３配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＴＥＬＧＡＹ．
配列番号１３０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ１配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹ．
配列番号１３１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ１配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬ．
配列番号１３２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ１配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬＮ．
配列番号１３３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＶＳ．
配列番号１３４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＹＬＶＳ．
配列番号１３５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＹＬＶＳ．
配列番号１３６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＩＹＬＶＳ．
配列番号１３７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＲＬＩＹＬＶＳ．
配列番号１３８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＶＳＫ．
配列番号１３９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＹＬＶＳＫ．
配列番号１４０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＹＬＶＳＫ．
配列番号１４１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＩＹＬＶＳＫ．
配列番号１４２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＲＬＩＹＬＶＳＫ．
配列番号１４３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＶＳＫＬ．
配列番号１４４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＹＬＶＳＫＬ．
配列番号１４５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＹＬＶＳＫＬ．
配列番号１４６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＩＹＬＶＳＫＬ．
配列番号１４７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＲＬＩＹＬＶＳＫＬ．
配列番号１４８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＶＳＫＬＤ．
配列番号１４９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＹＬＶＳＫＬＤ．
配列番号１５０：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＹＬＶＳＫＬＤ．
配列番号１５１：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＩＹＬＶＳＫＬＤ．
配列番号１５２：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤ．
配列番号１５３：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＶＳＫＬＤＳ
配列番号１５４：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＹＬＶＳＫＬＤＳ．
配列番号１５５：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＩＹＬＶＳＫＬＤＳ．
配列番号１５６：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳ．
配列番号１５７：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ２配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳ．
配列番号１５８：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ３配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＱＳＴＨＦＰＨ．
配列番号１５９：非限定的な例示的部分ＣＤＲＬ３配列、ＩｈｆｍＢ４断片：ＷＱＳＴＨＦＰＨＴ．
表の説明
表１は、非限定的な例示的抗体を産生するハイブリドーマについての列挙である。
表２は、例示的抗体およびそれらの対応するＣＤＲについての非限定的なリストである。
表３は、例示的抗体ならびにそれらの対応する重鎖可変領域および軽鎖可変領域についての非限定的なリストである。
表４は、粘膜バイオマススコアを作製するための実施例３の中耳炎モデルで使用されるスコアリング法についての概要である。
表５は、無傷のウサギポリクローナルＩｇＧおよびマウスモノクローナルＩｇＧに対するＩｇＧ Ｆａｂ断片の効力の概要である。
細菌細胞内では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、結合すると、ＤＮＡ基質を必然的に屈曲させるＤＮＡ結合性タンパク質である。同様に、既に屈曲した立体構造のＤＮＡは、屈曲させるために必要なエネルギーが不必要となるので、例示的な基質である。
ＤＮＡＢＩＩファミリーは、細胞内の細菌性核封入体を部分的に形作る細菌性タンパク質である、核封入体関連タンパク質（ＮＡＰ）と称するタンパク質のクラスのメンバーである（Browningら（２０１０年）、Curr. Opin. Microbiol.、１３巻：７７３～７８０頁）。加えて、このファミリーは、遍在性であり、事実上全ての真正細菌が発現する。現時点で特徴づけられている全てのファミリーメンバーは、サブユニットのホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとして機能する。ファミリーは、ＨＵ（ヒストン様タンパク質）およびＩＨＦ（組込み宿主因子）の２つの種類に分けられている。これらのファミリーメンバーの間の主要な区別は、ＨＵが、ＤＮＡに配列非依存的に結合するのに対し、ＩＨＦは、属にわたり保存されている、コンセンサス配列（ＷＡＴＣＡＡＮＮＮＮＴＴＲ［配列中、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｒは、プリンであり、Ｎは、任意の塩基である］（配列番号１６０））に結合するということである（Swingerら（２００４年）、Curr. Opin.
Struct. Biol.、１４巻：２８～３５頁）。全てのＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＤＮＡに結合し、これを大きく屈曲させる、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＩＨＦは、ＤＮＡを、事実上のＵ字型ターンに屈曲させることができる（Riceら（１９９６年）、Cell、８７巻：１２９５～１３０６頁）。加えて、全てのファミリーメンバーは、あらかじめ屈曲または湾曲したＤＮＡ構造、例えば、ＤＮＡの組換えに中心的な、ホリデイ接合部、十字型様構造を取る可能性が高い。実際、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、遺伝子の発現、組換え、修復、および複製を含む、細胞内の全てのＤＮＡ機能を容易とするアクセサリー因子として機能する（Swingerら（２００４年）、Curr. Opin. Struct. Biol.、１４巻：２８～３５
頁)。
本開示の一態様では、出願人らは、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドに特異的である抗体または抗体の抗原結合性断片を提供する。抗体または抗原結合性断片は、宿主に投与されると、既存のまたはあらかじめ形成されたバイオフィルムを低減または根絶する。したがって、一態様では、本開示は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドと特異的に結合する、１つまたは複数の抗体または抗原結合性断片およびｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるバイオフィルムの分解、治療（remediating）または破壊におけるそれらの使用に関する。
別の態様では、抗体または抗原結合性断片は、任意の適切な生物によって産生されるＤＮＡＢＩＩ結合性ポリペプチド、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩＨＦアルファ、ＩＨＦベータまたはＨＵポリペプチドの立体構造先端部領域を特異的に認識し、それに特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離されたポリペプチドとして記載される。このようなものの非限定的な例は、設計された立体構造先端部領域の群、Ａ５またはｍＢ４ペプチド断片またはその各々の等価物から選択される。一態様では、断片は、ｍＩｈｆＢ４ＮＨＴＩ抗体またはその抗体の等価物に由来する。一態様では、断片は、ＩＨＦ Ａ５抗体またはその抗体の等価物に由来する。
ある特定の態様では、本開示は、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ抗体またはＡ５抗体のＦａｂ断片またはこれらの各ポリペプチドの等価物を含む、または代替的にそれから本質的になる単離されたポリペプチドに関する。他の態様では、本開示は、ＩＨＦ断片Ｂ４、ｍＩｈｆＢ４またはＡ５抗体のＦａｂ断片または各ポリペプチドの等価物から本質的になる単離されたポリペプチドに関する。一部の実施形態では、抗体断片または抗原結合性断片は、ポリクローナル血清に由来する。他の態様では、抗体断片または抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体に由来しない。一部の実施形態では、抗体断片または抗原結合性断片は、モノクローナル抗体に由来する。表１は、本開示の断片および断片を含有するポリペプチドを誘導し得る非限定的な例示的モノクローナル抗体ならびにそれらを産生するハイブリドーマを列挙する。例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩｈｆＡ断片であるＡ５（配列番号１３）またはＩｈｆＢ断片であるＢ４（配列番号１６）およびＩｈｆＢ断片であるｍＢ４（配列番号１７）を特異的に認識し、それに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１５年７月３０日に、ブダペスト条約の規定に従い、表１に列挙される受託番号下、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された。さらなる非限定的な例示的抗体は、ハイブリドーマ細胞株であるＩｈｆＡ３ ＮＴＨＩ ９Ｂ１０．Ｆ２．Ｈ３、ＩｈｆＢ２ ＮＴＨＩ ７Ａ４．Ｅ４．Ｇ４、およびＩｈｆＢ２ ＮＴＨＩ ７Ａ４．Ｅ４．Ｇ１１（２０１６年８月１日に、ブダペスト条約の規定に従い、表１に列挙される受託番号下、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された）により産生されたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩｈｆＡ断片であるＡ３（配列番号１２）またはＩｈｆＢ断片であるＢ２（配列番号１５）を特異的に認識し、それに特異的に結合するものと；配列番号３１、配列番号３３、アミノ酸配列ＮＰＸＴ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であるか、あるいは、Ｘは、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、ＳもしくはＴから選択される）を含むＤＮＡ ＢＩＩポリペプチド、またはそれらのそれぞれの等価物の群から選択されるポリペプチドを含むポリペプチドを特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体とを含む。
本開示の抗体および抗体に由来する断片は、哺乳動物ポリクローナル抗体に由来し得る。別の態様では、哺乳動物ポリクローナル抗体は、ウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体、ウマポリクローナル抗体、イヌポリクローナル抗体またはヒトポリクローナル抗体の群から選択される。別の態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様では、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。別の態様では、哺乳動物モノクローナル抗体は、ウサギモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒツジモノクローナル抗体、ウマモノクローナル抗体またはイヌモノクローナル抗体の群から選択される。別の態様では、抗体は、表１に列挙されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である。抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧのものであり得る。
別の態様では、単離された抗体断片は、検出可能な標識および／または精製標識を含む。
さらなる態様において、本明細書に記載のポリペプチドおよびキャリアを含む、それから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組成物がまた提供され、キャリアの非限定的な例として、保存剤または安定化剤が挙げられる。一態様では、組成物は、輸送の容易性、例えば、凍結乾燥のために処理される。
別の態様では、本明細書に記載の抗体断片またはポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供される。別の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む。別の態様では、検出可能な標識は、コンジュゲートされた天然に存在する蛍光（flourescnet）ポリヌクレオチドではない。別の
態様では、単離されたポリヌクレオチドは、複製および／または発現のために１つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結され、これが、必要に応じて発現ベクターまたは宿主細胞内に含有される。
別の態様では、本明細書において記載されたような単離されたポリヌクレオチドおよびキャリアを含む、それから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組成物も提供される。別の態様では、キャリアは、保存剤または安定化剤を含む。
別の態様では、必要に応じて、本明細書に記載の発現ベクターまたは複製ベクターを含む、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターおよび／または宿主細胞も提供される。一態様では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり、このようなものの非限定的な例は、本明細書に開示されている。
別の態様では、本明細書に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、本明細書において開示された単離された宿主細胞を、ポリヌクレオチドのポリペプチドへの発現を可能にする条件下で培養するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法が提供される。別の態様では、方法は、宿主細胞または細胞培養培地からポリペプチドから発現されたポリペプチドを単離するステップをさらに含む。宿主細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。
別の態様では、産業プロセスと関連するバイオフィルムの形成を防止する、またはバイオフィルムを破壊する方法であって、バイオフィルムに対して感受性の表面またはバイオフィルムを含有する表面を、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを用いて処置するステップを含む方法が提供される。
別の態様では、バイオフィルムを破壊する結合性部分、例えば、抗体、抗原結合性断片、小分子または他の作用剤を同定する方法であって、候補結合性部分を、バイオフィルム構成成分、および本明細書に記載の少なくとも１種のポリペプチドと接触させるステップと、結合性部分の、バイオフィルム中のＤＮＡＢＩＩとの結合について、本明細書に記載のポリペプチドの、バイオフィルム中のＤＮＡＢＩＩとの結合と比較してアッセイするステップとを含み、ポリペプチドの結合と比較して実質的に同一またはより強い結合を有する結合性部分が、バイオフィルムを破壊する結合性部分である方法が提供される。
別の態様では、複数の細菌種において薬物耐性を逆転させる作用剤、例えば、抗体、抗原結合剤、小分子、ポリヌクレオチドまたはその他の治療剤または診断剤を同定する方法であって、作用剤を複数の種によって産生されたバイオフィルムを破壊する活性について評価するステップを含み、本明細書において記載される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドと実質的に等しい活性を有する作用剤であってバイオフィルムを破壊する作用剤（および必要に応じて、多数の前記タンパク質と結合する作用剤）が、薬物耐性を逆転させる作用剤と同定される、方法が提供される。一態様では、作用剤は、グラム陽性種およびグラム陰性種を含む少なくとも２種の細菌種に由来するバイオフィルムに対して有効であり、このような細菌種の非限定的な例にはＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａが挙げられる。
別の態様では、対象におけるバイオフィルムの形成を特徴とする状態を処置し、かつ／または対象におけるバイオフィルムの形成を検出する方法であって、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片もしくはポリペプチドを用いて、それを必要とする対象に投与するステップ、またはそれを必要とする対象を処置するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法が提供される。投与されるべき量は、バイオフィルム（biofilim）を破壊または検出するのに有効な量でなくてはならない。一態様では、バイオフィルムを検出しようとする場合、方法は、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを含有する組成物の投与の前、その間およびその後の、対象におけるバイオフィルム形成および／または破壊をイメージングおよび／またはモニタリングするステップをさらに含む。一態様では、バイオフィルムを検出しようとする場合、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、化学修飾されている。一態様では、バイオフィルムを検出しようとする場合、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、診断剤または検出可能な標識または作用剤にコンジュゲートされている。一態様では、バイオフィルムを検出しようとする場合、方法は、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドの、存在する任意のバイオフィルムとの複合体形成を観察するステップをさらに含む。一態様では、処置されるべき状態は、静脈性潰瘍および糖尿病性足部潰瘍、耳感染症、副鼻腔感染症、尿路感染症、肺感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、植え込まれたプロテーゼに関連する感染症、または歯周病を含む慢性非治癒創傷の群から選択される。
別の態様では、対象におけるバイオフィルムの形成を特徴とする状態の発生または進行をモニタリングする方法であって、対象を処置するステップまたは、対象に、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを投与するステップを含む方法が提供される。一態様では、方法は、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドの、存在する任意のバイオフィルムとの複合体形成を観察するステップをさらに含む。一態様では、ポリペプチドは、化学修飾されている。一態様では、ポリペプチドは、診断剤または検出可能な標識または作用剤にコンジュゲートされている。
別の態様では、対象におけるバイオフィルムの形成を特徴とする状態の処置をモニタリングする方法であって、対象に、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを投与するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法が提供される。一態様では、方法は、対象におけるバイオフィルム形成および／または破壊をイメージングおよび／またはモニタリングするステップをさらに含む。一態様では、ポリペプチドは、化学修飾されている。一態様では、ポリペプチドは、検出可能な標識または診断剤にコンジュゲートされている。
別の態様では、バイオフィルムの形成防止またはバイオフィルムの破壊を必要とする対象におけるバイオフィルムの形成を防止する、またはバイオフィルムを破壊する方法であって、対象に、有効量の本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを投与するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法が提供される。
別の態様では、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドでコーティングされた非生理学的表面が提供され、必要に応じて、表面は、パイプ中などの産業的環境にある。
一態様では、バイオフィルムを産生する生物に感染した対象を処置するための、対象においてバイオフィルムを破壊するための、および／またはバイオフィルムの存在と関連している状態に苦しむ対象を処置するためなどの１つまたは複数の方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを投与するステップであって、さらに、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドが、対象における抗炎症性サイトカインの産生を誘導するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法が本明細書において提供される。別の態様では、抗炎症性サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３またはＩＬ－１０のうち１つまたは複数を含む。別の態様では、対象は、哺乳動物である。別の態様では、哺乳動物は、ヒトである。さらにもう１つの態様では、対象は、小児患者である。
別の態様では、上記の方法は、有効量の抗生物質の投与と組み合わされる。別の態様では、方法は、有効量の本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを投与することによって、抗生物質の効力を増加させるために提供される。
本明細書に記載の単離された抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドおよび使用のための指示を含むキットも提供される。一態様では、キットは、診断的使用または治療的使用のために使用されてもよく、したがって、本明細書に記載の単離された抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドおよび使用のための指示を含む。別の態様では、キットは、バイオフィルム形成および／または破壊をモニタリングするために使用され得る。別の態様では、キットは、有効量の検出可能な標識または診断用標識および／または抗生物質をさらに含む。
図１は、モノクローナル抗体の消化によるＦａｂの作製を描示する。Ｆａｂ断片を、マウスモノクローナル抗体の、システインの存在下でのフィシンを用いる消化によって作製した（Marianiら、A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab)2 suitable for clinical use from mouse IgGl、Molec. Immunol. （１９９１年）１月～２月、２８巻（１～２号）：６９～７７頁、ＰＭＩＤ：２０１１１３０を参照のこと）。Ｆａｂ断片を精製し、１０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）およびＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅを使用して各調製物の純度を評価した。
図２は、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂ（本開示においてＩＨＦ ｍＢ４と、または代替としてｍＢ４とも呼ばれる）とのインキュベーションによる、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰによって形成されたバイオフィルムの破壊を描示する。ＮＴＨＩバイオフィルムを、培地（対照）、ｍＡｂ ＩｇＧ１ Ｆａｂ（対照）、ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂおよびｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂと共にインキュベートした。
図３は、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂとのインキュベーションによる、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ２９２１３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２７８５３およびＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｋ５６－２によって形成されたバイオフィルムの破壊を描示する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ２９２１３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２７８５３およびＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｋ５６－２によって形成されたバイオフィルムを、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ１ Ｆａｂ、ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよびｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂと共にインキュベートした。
図４は、成体チンチラの中耳における、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ） ８６－０２８ＮＰによって形成されたバイオフィルムの破壊が解析された方法を描示する。０日目（０）に、１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰを、成体チンチラの中耳に接種した。示されるように、４日目に、８３～１００％の耳が、粘膜バイオフィルムを発生する。４および５日目に、Ｆａｂ断片を、中耳中への直接送達によって投与した（３４２ｎＭ）。６日目に、耳鏡検査、粘膜バイオフィルムのイメージング、中耳液、中耳粘膜および接着した細菌バイオフィルムの収集、細菌負荷の列挙および中耳液中のサイトカインレベルの評価を使用して解析を実施して、バイオフィルムを評価した。実験は、マウスｍＡｂ ＩｇＧ１ Ｆａｂ断片（４匹のチンチラ）、マウスｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ断片（４匹のチンチラ）およびマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂ断片（４匹のチンチラ）を使用するコホートを含んでいた。
図５（Ａ）は、ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかを投与されたチンチラについての、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４、５および６日目の平均耳鏡検査スコアを描示する。ＷｅｌｃｈＡｌｌｙｎ ＭａｃｒｏＶｉｅｗ耳鏡を使用して、各動物の鼓膜を可視化し、０～４＋スケールで盲検的にランク付けし、≧２．０のスコアは、中耳腔内の流体の存在、すなわち、中耳炎の存在を示した（Novotnyら、（２００６年） Vaccine２４巻：４８０４頁）。ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの投与は、対照ＩｇＧ１ ＦａｂおよびＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂと比較して、より低い平均耳鏡検査スコアを実証した。Ｐ値が示されている：＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１。図５（Ｂ）は、ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラについてのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の０日目、４日目および６日目の代表的な耳鏡検査画像を示す。４日目に、鼓膜の後ろに中耳液が見られる。６日目に、ＩｇＧ１ Ｆａｂ（対照）を投与されたチンチラにおいて中耳液が見られ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂを投与されたチンチラにおいて、鼓膜の肥厚が見られることもあり、これは、これらの動物における中耳炎の存在を示す。６日目に、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを投与されたチンチラにおいて、非炎症鼓膜が見られる。 図５（Ａ）は、ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかを投与されたチンチラについての、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４、５および６日目の平均耳鏡検査スコアを描示する。ＷｅｌｃｈＡｌｌｙｎ ＭａｃｒｏＶｉｅｗ耳鏡を使用して、各動物の鼓膜を可視化し、０～４＋スケールで盲検的にランク付けし、≧２．０のスコアは、中耳腔内の流体の存在、すなわち、中耳炎の存在を示した（Novotnyら、（２００６年） Vaccine２４巻：４８０４頁）。ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの投与は、対照ＩｇＧ１ ＦａｂおよびＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂと比較して、より低い平均耳鏡検査スコアを実証した。Ｐ値が示されている：＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１。図５（Ｂ）は、ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラについてのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の０日目、４日目および６日目の代表的な耳鏡検査画像を示す。４日目に、鼓膜の後ろに中耳液が見られる。６日目に、ＩｇＧ１ Ｆａｂ（対照）を投与されたチンチラにおいて中耳液が見られ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂを投与されたチンチラにおいて、鼓膜の肥厚が見られることもあり、これは、これらの動物における中耳炎の存在を示す。６日目に、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを投与されたチンチラにおいて、非炎症鼓膜が見られる。
図６（Ａ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後のＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける粘膜バイオフィルムのミリグラム（ｍｇ）あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰの定量を示す。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後（処置は、４および５日目に実施した）の６日目に実施した。
図６（Ｂ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後のＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける中耳液のミリグラム（ｍｇ）あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰの定量を示す。
図７（Ａ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラから集められた中耳粘膜および粘膜バイオフィルムの量（mass）（グラム、ｇ）の定量を示す。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後（処置は、４および５日目に実施した）の６日目に実施した。図７（Ｂ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラから回収された中耳液（ＭＥＦ）の容量（マイクロリットル、ｍＬ）の定量を示す。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後（処置は、４および５日目に実施した）の６日目に実施した。 図７（Ａ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラから集められた中耳粘膜および粘膜バイオフィルムの量（mass）（グラム、ｇ）の定量を示す。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後（処置は、４および５日目に実施した）の６日目に実施した。図７（Ｂ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラから回収された中耳液（ＭＥＦ）の容量（マイクロリットル、ｍＬ）の定量を示す。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後（処置は、４および５日目に実施した）の６日目に実施した。
図８（Ａ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラについての７名の個人によって盲検的によく調べられた粘膜バイオマススコアを示す。粘膜バイオフィルムスコアスケールを使用して中耳腔内の残存するバイオフィルムをランク付けした。確立された規程を使用して、０～４のスコアを以下の通りに各画像に割り当てた：ゼロ（０）：見ることができるバイオフィルムなし、１：バイオフィルムが中耳腔の＞０～≦２５％を満たす、２：バイオフィルムが中耳腔の＞２５％～≦５０％を満たす、３：バイオフィルムが、中耳腔の＞５０％～≦７５％を満たす、４：バイオフィルムが、中耳腔の＞７５％～≦１００％を満たす。ＩｇＧ１ Ｆａｂ対照またはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照が投与されたチンチラと比較して、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置したチンチラにおいて、有意に低い粘膜バイオマススコアが観察された。Ｐ値が示されている：＊Ｐ≦０．０５および＊＊＊Ｐ≦０．００１。図８（Ｂ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後のＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの最終用量の受容１日後の耳鏡検査によって得られた代表的な中耳画像を描示する。 図８（Ａ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラについての７名の個人によって盲検的によく調べられた粘膜バイオマススコアを示す。粘膜バイオフィルムスコアスケールを使用して中耳腔内の残存するバイオフィルムをランク付けした。確立された規程を使用して、０～４のスコアを以下の通りに各画像に割り当てた：ゼロ（０）：見ることができるバイオフィルムなし、１：バイオフィルムが中耳腔の＞０～≦２５％を満たす、２：バイオフィルムが中耳腔の＞２５％～≦５０％を満たす、３：バイオフィルムが、中耳腔の＞５０％～≦７５％を満たす、４：バイオフィルムが、中耳腔の＞７５％～≦１００％を満たす。ＩｇＧ１ Ｆａｂ対照またはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照が投与されたチンチラと比較して、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置したチンチラにおいて、有意に低い粘膜バイオマススコアが観察された。Ｐ値が示されている：＊Ｐ≦０．０５および＊＊＊Ｐ≦０．００１。図８（Ｂ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後のＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの最終用量の受容１日後の耳鏡検査によって得られた代表的な中耳画像を描示する。
図９は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける、清澄化中耳液中の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネル（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１２ｐ７０およびＴＮＦ）の相対量を示す。定量は、ミリリットル（ｍｌ）ＭＥＦあたりのピコグラム（ｐｇ）サイトカインを提供するように実施した。
図１０は、チンチラにおける中耳の組織学的解析を示す。左側の画像は、マウスＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照を投与された動物に由来する中耳を示す。右側の画像は、マウスｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂが投与された動物に由来する中耳を示す。染色は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて実施した。画像は、１０Ｘ対物レンズを使用して入手した。スケールバーは、１００μｍに相当する。
図１１は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰにより形成されたバイオフィルムの破壊が、成体チンチラの中耳において、ポリクローナルウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよびナイーブウサギ血清から生成したＦａｂ断片を使用して分析された方法を示す。実験は、ナイーブウサギ血清ＩｇＧＦａｂ断片、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ断片およびウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂ断片を使用するコホートを含んだ。ゼロ（０）日目に、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰをチンチラの中耳に接種した。その後、４および５日目（２用量実験）または４、５および６日目（３用量実験）のいずれかに、Ｆａｂ断片を中耳に直接送達によって投与した（３４２ｎＭ）。４および５日目に投与したものについては、６日目または１２日目のいずれかにコホート１つ当たり３（３）匹のチンチラを屠殺した。４、５および６日目に投与したものについては、１３日目に１つコホート当たり３（３）匹のチンチラを屠殺した。屠殺後、チンチラをイメージングし、中耳粘膜を収集し、接着したバイオフィルムを評価し、中耳液を収集し、細菌の定量を実施し、中耳液はサイトカイン多重アッセイを使用して評価した。１０％ビス－トリスＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）およびＳＹＰＲＯオレンジタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって裏付けられたように、各Ｆａｂ調製物の純度も示す（３つの別々の調製物：ナイーブ、ＩｈｆＢ２およびｍＩｈｆＢ４）。
図１２は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ウサギＩｇＧ１Ｆａｂ、ウサギＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂまたはウサギｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける粘膜バイオフィルムの１ミリグラム（ｍｇ）当たりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を示す。定量は、以下の通りの３つの異なる実験で実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。Ｐ値を示す：＊＊Ｐ≦０．０１。
図１３は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ウサギＩｇＧ１Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける中耳液の１ミリリットル（ｍｌ）当たりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を示す。定量は、以下の通りの３つの異なる実験で実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。Ｐ値を示す：＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１。
図１４は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ウサギＩｇＧ１Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂのいずれかを投与されたチンチラの平均粘膜バイオフィルムスコア（７人の盲検検査者）を示す。定量は、以下の通りの３つの異なる実験で実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。粘膜バイオフィルムスコアスケールは、中耳腔内に残存するバイオフィルムをランク付けするために使用した。確立された規程を使用して、以下の通りに０から４までのスコアを各画像に割り当てた：ゼロ（０）：見ることができるバイオフィルムはない；１：バイオフィルムは中耳腔の＞０から≦２５％を満たす；２：バイオフィルムは中耳腔の＞２５％から≦５０％を満たす；３：バイオフィルムは中耳腔の＞５０％から≦７５％を満たす；および４：バイオフィルムは中耳腔の＞７５％から１００％を満たす。Ｐ値を示す：＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１。
図１５は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ナイーブウサギＩｇＧＦａｂ、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＩｇＧＦａｂまたはウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＩｇＧＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける清澄化した中耳液における炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネルの相対量を示す。測定された炎症誘発性サイトカインには、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦおよびＩＦＮγが含まれた。測定された抗炎症性サイトカインには、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３が含まれた。
詳細な説明
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で提供される全てのヌクレオチド配列は、５’から３’への方向で提示される。本開示の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の、任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、特定の、非限定的で、例示的な方法、デバイス、および材料について記載する。本明細書で引用される全ての技術的刊行物および特許公開は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示が、先行発明として、このような開示に先行する権利がないことの容認とはみなされないものとする。
本開示の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡについての従来の技法を利用する。例えば、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ編（２０１２年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」、４版；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２０１５年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（２０１５年）、「ＰＣＲ １： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ内、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５年）、「ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（２００６年）、「ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ」、（Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編（２０１４年）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１０年）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、６版；Ｇａｉｔ編（１９８４年）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編（２００５年）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」；ＢｕｚｄｉｎおよびＬｕｋｙａｎｏｖ編（２００７年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６年））；Ｇｒａｎｄｉ編（２００７年）、「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、２版；Ｇｕｉｓａｎ編（２００６年）、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ」；Ｐｅｒｂａｌ（１９８８年）、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、２版；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７年）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３年）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＭａｃｄｏｎａｌｄ編（２０１０年）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、４版；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６年）、「Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、５版を参照されたい。
範囲を含めた全ての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は近似であり、１．０または０．１単位で、必要に応じて、またはその代わりに、＋／－１５％、あるいは１０％あるいは５％あるいは２％の変動で（＋）または（－）に変動する。必ずしも明記されているとは限らないが、全ての数字表示に「約」という用語が先行することが理解されるべきである。本明細書に記載の試薬はただ単に例示的なものであり、その等価物が当技術分野で公知であることも、必ずしも明記されているとは限らないが、理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「ポリペプチド」という用語は、複数のポリペプチドを、それらの混合物を含めて包含する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味するものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、意図された使用のための組合せのための任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味するべきである。したがって、本明細書で定義されている要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法由来の微量汚染物質および薬学的に許容されるキャリア、例えば、リン酸生理食塩水、保存料（例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムおよびヒドロキシ安息香酸メチル）などを排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量要素および本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法のステップ以上のものを排除することを意味するべきである。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「バイオフィルム」とは、微生物が分泌および／または放出するＤＮＡなどのポリマーと一緒になった、有機体または無機体であり得る構造物の表面に時折接着する微生物の組織化された群集を意図する。バイオフィルムは、微生物（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）および抗菌剤に対して非常に耐性である。バイオフィルムは、歯肉組織、歯および修復物に生息し、歯周プラーク疾患としても公知の齲歯および歯周病を引き起こす。バイオフィルムは、中耳感染症も引き起こす。バイオフィルムは、歯科インプラント、ステント、カテーテル線およびコンタクトレンズの表面上にも形成され得る。バイオフィルムは、ペースメーカー、心臓弁置換物、人工関節および他の外科用インプラントの上で成長する。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、院内の感染（ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（院内感染（ｈｏｓｐｉｔａｌ－ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））の６５％超はバイオフィルムによって引き起こされると推定している。バイオフィルムは、膣感染症を引き起こし、免疫系が妨げられている人において生命にかかわる全身感染症を導く。バイオフィルムはまた、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えば、Ｂ３１）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、Ｔｏｈａｍａ Ｉ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（例えば、６６８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ（例えば、ＨＩ２４２４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、Ｋ１２ ＭＧ１６５５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（例えば、Ｖ５８３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、Ｒｄ ＫＷ２０）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば、２６６９５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、ＲＨ４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（例えば、ＭＣ２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＣＤＣ１５５１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（例えば、ＦＡ１０９０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、ＭＣ５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（例えば、Ｗ８３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（例えば、１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）２５８４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＭＷ２）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（例えば、ＲＰ６２Ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えば、２６０３Ｖ／Ｒ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（例えば、ＮＣＴＣ ７８６８ （Ｃｈａｌｌｉｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、Ｒ６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＭＧＡＳ１０２７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（例えば、６７１５）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（例えば、ｔｙｐｈｉ、ＣＴ１８）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）３５４０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｕｍ（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（例えば、Ｅｌ Ｔｏｒ、Ｎ１６９６１）により引き起こされる疾患を含むがこれらに限定されない、多数の疾患にも関与する。バイオフィルムと関連する、かつ／またはこれを形成することが公知の、さらなる生物は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むがこれらに限定されない。例えば、嚢胞性線維症患者は、抗生物質耐性バイオフィルムを結果としてもたらすことが多い、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症を有する。バイオフィルムと関連する他の疾患は、嚢胞性線維症患者の肺感染症、中耳炎、鼓膜切開後耳漏（ｐｏｓｔ－ｔｙｍｐａｎｏｓｔｏｍｙ
ｔｕｂｅ ｏｔｔｏｒｈｅａ）、慢性化膿性中耳炎、自然弁感染性心内膜炎（ｎａｔｉｖｅ ｖａｌｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、骨髄炎、鼻副鼻腔炎（ｒｈｉｎｏｓｉｎｏｓｉｔｉｓ）、前立腺炎、尿路感染症、創傷、齲歯、および歯周炎を含むがこれらに限定されない。上記で列挙した生物（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ
ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）のうちの一部などであるがこれらに限定されない食品媒介性病原体もまた、それらが汚染する食品上で、バイオフィルムを形成しうる。動物において疾患を引き起こすバイオフィルム（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種）はまた、下流のヒト宿主における食品汚染および／または疾患も引き起こしうる。さらに、バイオフィルムは、１つの均質な微生物集団である必要はなく、他の病原体を組み込む場合があり、宿主細胞であってもなお組み込む場合がある。疾患（院内およびその他の両方における）および食品汚染と関連することに加えて、バイオフィルムはとりわけ、プロセス水およびそれとの接触表面と関連する工業汚染の原因であることが多い。工業汚染物質としての、バイオフィルムを形成する生物に関与する問題は、バイオフィルム形成の結果としての、生物腐食、生物付着（ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ）、および装置破損を含むがこれらに限定されない。工業の場における非限定的な例示的、バイオフィルムと関連する生物は、Ｆｅｒｒｅｒａら（２０１５年）、Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ、３１巻（２号）：１７３～１８０頁において開示されている生物と、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種とを含む。バイオフィルムに関するさらなる詳細は、例えば、Ｄｏｎｌａｎ（２００２年）、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、８巻（９号）：８８１～８９０頁において見出すことができる。
用語「の形成を防止すること」または「バイオフィルムを破壊すること」とは、微生物バイオフィルムの構成成分であるＤＮＡ／タンパク質マトリックスの形成の防止、低減もしくは破壊または該ＤＮＡ／タンパク質マトリックスの構造の防止、低減もしくは破壊を意味する。
本明細書で使用される「核封入体関連タンパク質」または「ＮＡＰ」という用語は、原核細胞の核封入体内の核酸の動的な空間組織化に影響を与えるタンパク質のクラスを指す。これらのタンパク質は、ＤＮＡの屈曲、結合、および凝集の実行を介して、ゲノムを組織化する。ある特定のＮＡＰは、ＤＮＡ結合性タンパク質であり、ＤＮＡＢＩＩタンパク質、ＤＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４９１６９）、Ｈ－ＮＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４７７４０）、Ｈｆｑ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＣＥ６３２５６）、ＣｂｐＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＡ０３９５０）、およびＣｂｐＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１８８１３）を含むバイオフィルムと関連しうる。ＮＡＰのうち、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、別個のものであり、アルファへリックス二量体化ドメインとの強力な配列同一性を全般的に有し、アンチパラレルベータリボンを含むことがあり、これは、ＤＮＡの副溝と結合し、その中に挿入し、それを屈曲させる、先端部を含む
Figure 2023033394000001
 ［配列中、Ｘは、任意のアミノ酸であるか、またはアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、ＳもしくはＴから選択され得る］を有することが多い。機能的プロトマーは、同一または相同サブユニットの二量体である。
「ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはＤＮＡＢＩＩタンパク質」とは、ＤＮＡ結合性ドメインで構成され、したがって、微生物ＤＮＡに対して特異的または一般的な親和性を有するＤＮＡ結合性のタンパク質またはポリペプチドを意味する。一態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＤＮＡに、副溝において結合する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質の非限定的な例は、組込み宿主因子（ＩＨＦ）タンパク質およびヒストン様タンパク質（ＨＵ）である。
「組込み宿主因子」または「ＩＨＦ」タンパク質は、バクテリオファージがそのＤＮＡを宿主細菌に組み入れるために使用する細菌のタンパク質である。これらは、細胞外の微生物ＤＮＡにも結合する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＩＨＦタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、ｈｉｍＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＰＯＡ６Ｘ７．１）およびｈｉｍＤ遺伝子（ＰＯＡ６Ｙ１．１）である。これらの遺伝子に対するホモログは他の生物体において見いだされ、他の生物由来のこれらの遺伝子に対応するペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，２９１号の表１０において見いだされ得る。
「ＨＭＧＢ１」は、ＤＮＡの副溝に結合する、およびそれを歪めると報告されている高移動度群ボックス（ＨＭＧＢ）１タンパク質であり、作用剤の一例である。組換えの、または単離されたタンパク質およびポリペプチドは、Ａｔｇｅｎｇｌｏｂａｌ、ＰｒｏＳｐｅｃＢｉｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ１およびＡｂｎｏｖａから市販されている。
「ＨＵ」または「ヒストン様タンパク質」とは、一般にはＥ．ｃｏｌｉに付随するヘテロ二量体タンパク質のクラスを指す。ＨＵタンパク質は、ＤＮＡ接合部に結合することが公知である。他の微生物から関連するタンパク質が単離されている。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＵの完全なアミノ酸配列は、Ｌａｉｎｅら（１９８０年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０３巻（３号）：４４７～４８１頁によって報告された。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＵタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、それぞれ配列番号８および９に対応するｈｕｐＡおよびｈｕｐＢである。分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）に由来するＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのホモログは、配列番号３に対応する。これらの遺伝子のホモログは、他の生物において見出され、他の生物に由来するこれらの遺伝子に対応するペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，２９１号の表１０に見出すことができる。
用語「表面抗原」または「表面タンパク質」とは、細胞外環境に対して少なくとも部分的に曝露されている細菌細胞などの細胞の表面上のタンパク質またはペプチドを指す。表面抗原の例として、ＯＭＰ Ｐ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿００４１３９０７９．１）、ＯＭＰ Ｐ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＺＺＸ８７１９９．１）、ＯＭＰ Ｐ２６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿６６５０９１．１）、ｒｓＰｉｌＡまたは組換え可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型Ｐｉｌｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）などの外膜タンパク質がある。
用語「Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ」とは、例えば、耳感染症、目感染症、および副鼻腔炎などの多くの異なる感染症を引き起こすことが可能な病原性細菌を指す。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの多くの異なる株が単離されており、それはＩｈｆＡ遺伝子またはタンパク質を有する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの異なる株のいくつかの非限定的な例としては、Ｒｄ ＫＷ２０、８６－０２８ＮＰ、Ｒ２８６６、ＰｉｔｔＧＧ、ＰｉｔｔＥＥ、Ｒ２８４６、および２０１９が挙げられる。
「微生物ＤＮＡ」は、バイオフィルムを生じる微生物由来の一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを意味する。
ポリペプチドの「立体構造先端ドメイン」とは、構造が、典型的にプロリン残基に媒介される急旋回をする逆平行ベータリボンを有する一次アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
「バイオフィルムを阻害または予防すること」とは、バイオフィルムの構造を治療的に低減させることまたは予防することを意味する。
「感染症を処置すること」とは、バイオフィルムの形成と関連する、微生物、例えば、細菌の数の低減を意図する。当技術分野では、微生物の数が低減されたのかどうかを決定する方法が公知であり、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイおよびｅｘ ｖｉｖｏアッセイ、ならびに感染症の臨床症状の軽減を含む。細菌は、バイオフィルムにより保護されるため、細菌は、抗菌薬の使用に対して耐性となる。バイオフィルムを破壊することにより、抗菌薬および他の作用剤に対する細菌の耐性を低減または阻害することができ、ならびに細菌感染を処置することができる。
「屈曲したポリヌクレオチド」とは、他の鎖と対にならない１本の鎖上に小さなループを含有する二本鎖ポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、ループは、１塩基から約２０塩基までの長さ、あるいは２塩基から約１５塩基までの長さ、あるいは約３塩基から約１２塩基までの長さ、あるいは約４塩基から約１０塩基までの長さである、あるいは、約４塩基、５塩基、または６塩基、または７塩基、または８塩基、または９塩基、または１０塩基を有する。
「ＤＮＡへの結合においてＤＮＡＢＩＩタンパク質と競合するポリペプチド」とは、屈曲したＤＮＡ構造または歪んだＤＮＡ構造への結合においてＩＨＦまたはＨＵと競合するが、ＤＮＡとバイオフィルムを形成しないタンパク質またはペプチドを意味する。例としては、これらに限定することなく、ＩＨＦの１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインを含むＩＨＦの断片、またはその生物学的等価物が挙げられる。
本明細書で使用された、「～を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する」という用語は、作用剤、例えば、Ｆａｂ（抗原結合性断片（fragment antigen binding））またはモノクローナル抗体の、意図されるその標的または結合パートナーへの結合が、非結合より可能性が高いことを意図する。
診断または処置の「対象」は、細胞または動物、例えば、哺乳動物またはヒトなどである。非ヒト動物は、診断または処置に供され、感染を受けやすい動物または動物モデル、例えば、サル、ラット、マウス、チンチラなどのネズミ（murine）、イヌなどのイヌ（canine）、ウサギなどのウサギ（leporid）、家畜、スポーツ動物、およびペットである。
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、それらの最も広範な意味では、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸の類似体またはペプチド模倣薬の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル結合、エーテル結合などによって連結されていてよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、アミノ酸の最大数に対する制限はなく、タンパク質の配列またはペプチドの配列を含んでよい。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体の両方、アミノ酸の類似体およびペプチド模倣薬を含める。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、任意の長さのポリマーの形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してよく、公知または未知の任意の機能を果たし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴタグまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリヌクレオチドの組立ての前に、またはその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド構成成分で遮ることができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識化構成成分とコンジュゲートすることによってさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に開示される任意の実施形態は、二本鎖の形態と、二本鎖の形態を成すことが公知であるまたは予測される２つの相補的な一本鎖の形態のそれぞれの両方を包含する。
ポリヌクレオチドは、特異的な配列の４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）で構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力し、バイオインフォマティクスの適用、例えば、機能ゲノム科学および相同性検索などのために使用することができる。
「単離された」または「組換え型の」という用語は、本明細書において核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどに関して使用される場合、それぞれ、巨大分子ならびにポリペプチドの天然の供給源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。「単離されたかまたは組換え型の核酸」という用語は、断片として天然に存在せず、自然の状態で見いだされない核酸断片を含むものとする。「単離された」という用語は、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質を指すためにも使用され、精製されたポリペプチドと組換え型のポリペプチドの両方を包含するものとする。他の実施形態では、「単離されたかまたは組換え型の」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）が天然で通常付随する構成成分、細胞および他の物から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、そのネイティブな環境または天然の環境、例えば、染色体上では通常付随する３’および５’の連続したヌクレオチドから分離されている。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）は、その天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。
明示的な列挙がなくとも、また別段の意図がなければ、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、本開示の範囲内でその等価物または生物学的等価物が意図されることが推定されるべきである。本明細書で使用される場合、「生物学的なその等価物」は、参照のタンパク質、抗体、断片、ポリペプチドまたは核酸について言及される場合、「その等価物」という用語と同義であるものとし、所望の構造または機能性を依然として維持しながら最小の相同性を有するものを意味する。本明細書において具体的に列挙されていなければ、本明細書で言及されているポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はいずれも、その等価物も包含すると考えられる。一態様では、等価なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で本明細書記載の、記載されている方法において使用するためのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの相補物とハイブリダイズするポリヌクレオチドである。別の態様では、等価な抗体または抗原結合性ポリペプチドとは、参照抗体または参照抗原結合性断片またはＦａｂ（抗原結合性断片）と、少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％の親和性またはそれを超える親和性で結合する抗体または抗原結合性ポリペプチドを意味する。別の態様では、その等価物は、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗体または抗原結合性断片の、その抗原への結合と競合する。別の態様では、等価物とは、少なくとも約８０％の相同性または同一性、あるいは、少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは９８％の相同性または同一性の百分率を意味し、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照核酸と実質的に等しい生物活性を示す。生物学的に等価のポリペプチドの例は、開示されるアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を同定する、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，２９１号の表９に提供されている。
別の配列に対して特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（または、ポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、アラインメントすると、その百分率の塩基（またはアミノ酸）が、比較している２つの配列において同じであることを意味する。アラインメントおよび相同性または配列同一性の百分率は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）付録３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載のものを使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、アラインメントのために初期状態のパラメータが使用される。非限定的な例示的アラインメントプログラムは、初期状態のパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。具体的には、例示的プログラムは、以下の初期状態のパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを含む：遺伝暗号（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ）＝標準；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見いだすことができる：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。配列同一性および同一性の百分率は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷに取り込むことによって決定した（ウェブアドレス：ｇｅｎｏｍｅ．ａｌｉｇｎ．ｊｐ（２０１１年３月７日に最終アクセス）において利用可能。
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較するためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、それらの分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、それらの配列が共有する、一致するまたは相同である位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子を指す場合もある。
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的な様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成している２つの鎖、複数鎖複合体を形成している３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ性（ｓｅｌｆ－ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセスのステップ、例えば、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などを構成し得る。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液の濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液の濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液の濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分から２４時間の間であり、１つ、２つ、またはそれ以上の洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は約１分、２分、または１５分である。ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を用いた同等のＳＳＣを使用することができることが理解される。
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでよい。
「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、そのネイティブな状態にある場合、または当業者に周知の方法によって操作される場合、転写および／または翻訳してポリペプチドおよび／またはその断片に対するｍＲＮＡを作製することができるポリペプチドを「コードする」と考えられているポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補物であり、それからコード配列を推定することができる。
本明細書で使用される場合、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、本明細書では、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、障害またはその徴候または症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であってよい、および／または、障害および／または障害に起因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点で治療的であってよい。当技術分野では、処置が行われたのかどうかを決定する方法が公知であり、本明細書でも略述される。
予防するとは、障害または影響の素因がある系または対象において障害または影響をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで予防することを意味する。その例は、バイオフィルムを生じることが公知の微生物に感染した系においてバイオフィルムの形成を予防することである。
「組成物」は、活性作用剤、および不活性な別の化合物または組成物（例えば、検出可能な作用剤または標識）または活性な別の化合物または組成物、例えば、アジュバントなどの組合せを意味するものとする。
「医薬組成物」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または治療における使用に適した組成物を成す活性作用剤と不活性または活性なキャリアの組合せを含むものとする。
「薬学的に許容されるキャリア」とは、本明細書で開示される組成物中で使用しうる任意の希釈剤、賦形剤、またはキャリアを指す。薬学的に許容されるキャリアは、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、マイクロスフェア、マイクロ粒子、またはナノ粒子（例えば、Ｐｏｌｙ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）など生体分解性ポリマーを含む）、および羊毛脂を含む。適切な医薬キャリアは、この分野における標準の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。適切な医薬キャリアは、意図された投与形態、すなわち、経口錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップ剤などに関して選択すること、および従来の医薬の実施と一致し得る。
本明細書に開示される「生物学的に活性な作用剤」または活性作用剤とは、単離されたかまたは組換え型のポリペプチド、単離されたかまたは組換え型のポリヌクレオチド、ベクター、単離された宿主細胞、または抗体、ならびにそれらのうちの１つまたは複数を含有する組成物のうちの１つまたは複数を意味する。
治療薬または他の作用剤の「投与」または「送達」は、処置の過程全体を通して、１回用量で、連続的に、または断続的に実施することができる。最も有効な手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、療法に使用される組成物、療法の目的、処置されている標的細胞、および処置されている対象によって変動する。単回投与または多数回の投与は、処置にあたっている医師によって選択された用量のレベルおよびパターンを用いて行うことができる。適切な投薬の処方および作用剤を投与する方法は当技術分野で公知である。投与経路を決定することができ、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者に公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置されている対象の健康状態または疾患の病期、および標的細胞または組織によって変動する。投与経路の非限定的な例は、経口投与、経鼻投与、吸入、注射、および局所塗布を含む。投与は、工業適用ならびに治療適用における使用のための投与でありうる。
本開示の作用剤（抗体もしくはその断片、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは細胞）は、任意の適切な投与経路によって治療のために投与することが可能である。最適経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置されている疾患により変動することも理解されたい。作用剤は産業環境においておよび動物の処置のために使用してもよい。産業環境において使用される場合、バイオフィルムは作用剤、例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合（fragment antigen binding））または抗体と接触させる。
用語「有効量」とは、所望の効果を達成するのに十分な量を指す。治療または予防的使用という文脈では、有効量は問題の状態のタイプおよび重症度ならびに健康全般、年齢、性別、体重、種、および医薬組成物に対する耐性などの個々の対象の特徴に依存する。本開示の文脈では、一部の実施形態では、有効量は、バイオフィルム塊の低減またはバイオフィルムの分解をもたらすのに十分な量である。他の態様では、その量は、対象においてバイオフィルムに関連する細菌感染を処置するのに効果的である。他の実施形態では、Ｆａｂ（断片抗原結合）または抗体という文脈では、有効量はバイオフィルムを分解する、減らすまたは破壊するのに十分な量である。他の実施形態では、作用剤または免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体産生をもたらすのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、受動免疫の付与を必要とする対象に受動免疫を与えるのに必要な量である。組成物に関しては、一部の実施形態では、上記の要因に加えて、有効量は、意図されている使用、対象の免疫系の健康／応答性に依存する。当業者であれば、これらのおよび他の要因に応じて、適切な量を決定することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用の場合では、いくつかの実施形態では、有効量は、問題の適用のサイズおよび性質に左右される。有効量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける標的および使用されている方法の性質および感受性にも左右される。当業者は、これらおよび他の考察に基づいて有効量を決定することができる。有効量は、実施形態に応じて、組成物を１回または複数回投与することを含んでよい。
抗生物質などの薬物の効力に関係する用語「効力」とは、所与の強度の効果を生じるのに必要な量という点から表される薬物活性の尺度を指す。高効力薬物は低濃度で所与の応答を誘起し、効力がもっと低い薬物はもっと高い濃度でのみ同じ応答を誘起する。効力は、親和性と有効性の両方に依存する。
「コンジュゲートした部分」という用語は、単離されたキメラポリペプチドに、キメラポリペプチドの残基と共有結合を形成することによって付加することができる部分を指す。部分は、キメラポリペプチドの残基と直接結合させることができる、または、リンカーとの共有結合を形成し、次にリンカーとキメラポリペプチドの残基の共有結合を形成することができる。「ペプチドコンジュゲート」とは、１つまたは複数のポリペプチドの、および別の化学化合物もしくは生物化合物との共有結合または非共有結合による会合を指す。非限定的例では、ポリペプチドと化学化合物との「コンジュゲーション」により、その意図された目的のためのポリペプチドの安定性または有効性が改善される。一実施形態では、本開示のポリペプチドはキャリアにコンジュゲートされ、キャリアはリポソーム、ミセル、または薬学的に許容されるポリマーである。
「リポソーム」は、同心脂質二重層からなる顕微鏡レベルの小胞である。リポソームは、キャリア、例えば、薬学的に許容されるキャリアの例である。構造的に、リポソームは、数百オングストロームから数分の１ミリメートルまでの寸法を有する長い管から球体まで、サイズおよび形状に幅がある。小胞形成性脂質は、外層の脂質組成物をもたらす最終的な複合体の特定の程度の流動性または剛性が達成されるように選択する。これらは、中性（コレステロール）または双極性であり、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）など、およびこれらに限定されないが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含めた他の種類の双極性の脂質を含み、炭化水素の鎖長は１４～２２の範囲内であり、飽和型であるまたは１つまたは複数のＣ＝Ｃ２重結合を有する。単独で、または他の脂質構成成分と組み合わせて安定なリポソームを作製することができる脂質の例は、リン脂質、例えば、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎ）－オラミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオテオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＰＯＰＥ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミド－トリエチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）などである。さらなるリポソームに組み入れることができる、リンを含有しない脂質としては、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリールスルフェート、アセチルパルミテート（ａｃｅｔｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、グリセロールリシノレエート（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ヘキサデシルステアレート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒｅａｔｅ）、両性のアクリルポリマー、ポリエチルオキシレート化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｏｘｙｌａｔｅｄ）脂肪酸アミド、および上記のカチオン性脂質（ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）が挙げられる。負に荷電した脂質としては、小胞を形成することができるホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオテオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＯＰＧ）、およびジセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が挙げられる。一般には、リポソームは、それらの全体的なサイズおよびラメラ構造の性質に基づいて３つのカテゴリーに分けることができる。Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、１９７７年１２月によって開発された３つの分類は、多層状の小胞（ＭＬＶ）、小さな単層の小胞（ＳＵＶ）および大きな単層の小胞（ＬＵＶ）である。生物活性のある作用剤を、本明細書に記載の方法に従って投与するためにそのようなものに封入することができる。
「ミセル」は、液体コロイド中に分散した界面活性物質分子の凝集体である。典型的な水溶液中ミセルは、周囲の溶媒と接触した親水性の「頭部」領域を有し、ミセルの中心に疎水性の尾部領域が隔離された凝集体を形成する。この種類のミセルは、順相ミセル（水中油ミセル）として公知である。逆ミセルは、頭部基を中心に有し、尾部が突き出している（油中水ミセル）。ミセルは、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または組成物を付着させて、標的の細胞または組織への効率的な送達を容易にするために使用することができる。
「薬学的に許容されるポリマー」という句は、本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチドまたは抗体とコンジュゲートすることができる化合物の群を指す。ポリマーをポリペプチドまたは抗体とコンジュゲートすることにより、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリペプチドの半減期を延長することができると考えられる。非限定的な例としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、糖、ポリオールならびにそれらの混合物が挙げられる。生物活性のある作用剤は、本明細書に記載の方法に従って投与するために、薬学的に許容されるポリマーとコンジュゲートすることができる。
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内に運ぶことができる任意の分子と定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含めた生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、またはウイルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなど、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌のベクター、ならびに、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における発現について記載されており、遺伝子療法のために、ならびに単純なタンパク質の発現のために使用することができる、当技術分野で一般に使用される他の組換え型ビヒクルである。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「形質導入」などは、本明細書で使用される場合、導入するために使用する方法に関係なく、外因性のポリヌクレオチド（時には「導入遺伝子」と称される）を宿主細胞に導入することに関する用語である。そのような方法としては、種々の周知の技法、例えば、ベクターに媒介される遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）、ならびに、「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技法などが挙げられる（例えば、電気穿孔、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドを導入するために使用する種々の他の技法など）。導入したポリヌクレオチドは、宿主細胞内で安定にまたは一過性に維持することができる。安定に維持するためには、一般には、導入したポリヌクレオチドが宿主細胞と適合する複製開始点を含有すること、または、宿主細胞のレプリコン、例えば、染色体外のレプリコン（例えば、プラスミド）または核内染色体またはミトコンドリア染色体などに組み込まれることが必要である。当技術分野で公知であり、また本明細書に記載されている通り、いくつものベクターが、遺伝子の哺乳動物の細胞への移入を媒介することができることが公知である。
本明細書で使用される場合「ｅＤＮＡ」という用語は、病原性のバイオフィルムに対する構成成分として見いだされる細胞外のＤＮＡを指す。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡと独立して複製することができる、染色体ＤＮＡから分離される染色体外のＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは環状の二本鎖である。プラスミドにより、微生物の集団内に水平に遺伝子移入するための機構がもたらされ、また、一般には、所与の環境状態下で選択的な利点がもたらされる。プラスミドは、競合的な環境的ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子を保有してよい、あるいは、産生されるタンパク質は同様の状況の下で毒素としての機能を果たし得る。
遺伝子工学において使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と称される。そのような使用のための多くのプラスミドが市販されている。複製しようとする遺伝子を、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子およびＤＮＡ断片をこの場所に容易に挿入することを可能にするいくつかの一般に使用される制限部位を含有する短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含有するプラスミドのコピーに挿入する。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質を生産することである。この場合、研究者は、目的の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を成長させる。細菌はタンパク質を産生してその抗生物質耐性を付与するのと同じように、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導することもできる。これは、遺伝子、または次にそれがコードするタンパク質を大量生産する安価かつ容易なやり方である。
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」とは、大きなＤＮＡ断片（１００ｋｂよりも大きく、最大３０００ｋｂ）をクローニングするために使用されるベクターを指す。これは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞において複製および保存されるために必要なテロメア配列、セントロメア配列、および複製開始点配列を含有する。最初の環状のプラスミドを使用して築き、制限酵素を使用することによって直線化し、次いでＤＮＡリガーゼにより、突出末端を使用することによって目的の配列または遺伝子を線形の分子内に付加することができる。酵母発現ベクター、例えば、ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組込みプラスミド）、およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）などは、酵母はそれ自体が真核細胞であるので、翻訳後修飾された真核生物のタンパク質産物を得ることができるので非常に有用であるが、ＹＡＣはＢＡＣよりも不安定であり、キメラ的な影響を生じることが見いだされている。
「ウイルスベクター」は、宿主細胞に送達しようとするポリヌクレオチドを含む、ｉｎ
ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで組換えによって作製されるウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。感染性のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースのベクターは、タンパク質の製造に使用することができ、タバコの葉においてＧｒｉｆｆｉｔｈｓｉｎを発現することが報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（２００９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０６巻（１５号）：６０９９～６１０４頁）。アルファウイルスベクター、例えば、セムルキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターなどが、遺伝子療法および免疫療法において使用するために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５巻：４３４～４３９頁およびＹｉｎｇら（１９９９年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５巻（７号）：８２３～８２７頁を参照されたい。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物とは、レトロウイルスのゲノムまたはその一部、および治療的な遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子移入における使用のための最新のベクター法についてのさらなる詳細は、例えばＫｏｔｔｅｒｍａｎら（２０１５年）、「Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｌｏｏｋ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、１７頁において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス媒介性遺伝子移入」または「レトロウイルスの形質導入」は同じ意味を有し、ウイルスが細胞に侵入し、そのゲノムを宿主細胞ゲノム内に組み込むことによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、その通常の感染機構によって宿主細胞に侵入することができる、または、細胞に侵入するために異なる宿主細胞の表面受容体またはリガンドに結合するように修飾することができる。本明細書で使用される場合、レトロウイルスベクターとは、ウイルスまたはウイルス様の侵入機構によって外因性の核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
レトロウイルスは、それらの遺伝情報をＲＮＡの形態で保有する；しかし、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡの形態に逆転写され、感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと称されている。
遺伝子移入が、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクター構築物とは、ウイルスゲノムまたはその部分、およびトランス遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を超えるセロタイプを含む、比較的よく特徴付けられている歴史的相同の（homogenous）ウイルス群である。例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９５／２７０７１号を参照されたい。Ａｄは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成の潜在性を低下させるものも構築されている。ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９５／００６５５号および同第ＷＯ９５／１１９８４号を参照されたい。野生型ＡＡＶは宿主細胞のゲノムへの組込みに高い感染性および特異性を有する。Hermonat&Muzyczka（１９８４年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８１巻
：６４６６～６４７０頁およびLebkowskiら（１９８８年）Mol.Cell.Biol.８巻：３９８
８～３９９６頁を参照されたい。
プロモーターと、ポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位の両方を含有するベクターは当技術分野で周知である。そのようなベクターはＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）などの供給源から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’非翻訳部分および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで発現に干渉するまたは発現を低下させる可能性がある余分の潜在的な不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を排除することが必要であり得る。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’側に挿入することができる。
遺伝子送達ビヒクルは、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよびターゲティングされたウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体も包含する。本明細書に開示される方法では、ターゲティング抗体またはその断片も含むリポソームを用いることができる。タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法により、ポリヌクレオチドを細胞または細胞集団に送達することに加えて、本明細書に記載のタンパク質を細胞または細胞集団に直接導入することができる、あるいは発現を増強し、かつ／または本明細書に開示されるタンパク質の活性を促進する培養条件が他の非限定的な技法である。
本明細書で使用される場合、「抗体」、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片またはその単鎖を含む。したがって、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを包含する。「抗体」、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの免疫グロブリン、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ－ＮＡＲドメインを含めた、抗原への特異的な結合を保持する抗体の断片；ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）およびカッパ抗体（ｋａｐｐａ ｂｏｄｙ）；抗体断片から形成された多特異性の抗体断片および１つまたは複数の単離されたものも包含する。そのようなものの例としては、これらに限定されないが、重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合性部分、重鎖または軽鎖の可変領域、重鎖または軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、または任意のその部分、結合性タンパク質の少なくとも１つの部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、種化抗体（ｓｐｅｃｉｅｓ－ｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体、および抗体の抗原結合性部分を含む融合タンパク質および非抗体タンパク質が挙げられる。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織への結合を媒介することができる。「抗」という用語は、タンパク質の名称の前に使用される場合、例えば、抗ＩＨＦ、抗ＨＵ、抗ＯＭＰ Ｐ５は、特定のタンパク質に結合し、かつ／またはそれに対する親和性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。例えば、「抗ＩＨＦ」とは、ＩＨＦタンパク質に結合する抗体を指す。特異的な抗体は、それが生じた対象のタンパク質以外のタンパク質に対する親和性を有し得る、またはそれに結合し得る。例えば、抗ＩＨＦは、ＩＨＦタンパク質に対して特異的に生じたが、配列相同性または構造相同性によって関連する他のタンパク質にも結合し得る。
抗体は、それらが所望の生物活性を示す限りは、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、および抗体断片であってよい。抗体は、任意の適切な生物学的な供給源、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジおよびイヌから単離することができる。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は、そのそれぞれが抗原上の単一の決定因子に指向されるので、高度に特異的である。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などを用いて検出可能に標識化することができる。抗体は、さらに他の部分、例えば、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などとコンジュゲートすることができる。抗体は、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含むがこれらに限定されない固体支持体に結合させてもよい。
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ法を用いて生成することができる。ハイブリドーマは、研究室において、抗体産生リンパ球と非抗体産生癌細胞、通常、骨髄腫またはリンパ腫を融合させることで作製される細胞である。ハイブリドーマは、増殖し、特異的なモノクローナル抗体の連続的なサンプルを産生する。抗体を生成または選択するための代替の技法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球を目的の抗原に曝露させること、および細胞、ファージ、または同様の系において抗体ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが挙げられる。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本明細書に開示されるヒト抗体としては、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を挙げることができる。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含まないものとする。したがって、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的に全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬドメイン、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、軽微な配列の変化または変異のみを伴う抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、など）および他の哺乳動物に指定された抗体は、そのような種、亜属、属、サブファミリー、ファミリーに特異的な抗体を示す。さらに、キメラ抗体は、上記の任意の組合せを含む。そのような変化または変異は、場合によって、ヒトまたは他の種において、修飾されていない抗体と比較して、免疫原性を保持する、または免疫原性が低い。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核細胞または真核細胞によって作製することができることが指摘されている。さらに、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、ヒト抗体は、ネイティブなヒト抗体においては見いだされないリンカーペプチドを含んでよい。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域をつなぐリンカーペプチド、例えば、２個～約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基などを含んでよい。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源のものであるとみなされる。
本明細書で使用される場合、ヒト抗体は、抗体が、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫化することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによってヒト免疫グロブリン配列を用いて系から得られる場合、特定の生殖系列配列「に由来する」。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較することによって、そのようなものとして同定することができる。選択されたヒト抗体は、一般には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、マウス生殖系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較してヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。ある場合では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％、または、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも、アミノ酸配列が同一である。一般には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と１０アミノ酸以下の差異を示す。ある場合では、ヒト抗体は、５以下、または、さらには４以下、３以下、２以下、１以下までの、生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とのアミノ酸の差異を示し得る。
「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。この用語は、組換えヒト抗体も意味する。これらの抗体を作製する方法は、本明細書に記載されている。
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製した、発現させた、創出した、または単離したヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたは染色体導入体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）またはそれから調製されるハイブリドーマから単離された抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、組換え型の、コンビナトリアルなヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングして他のＤＮＡ配列にすることを伴う任意の他の手段によって調製した、発現させた、創出した、または単離した抗体などの全てを包含する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞の変異誘発）に供することができ、したがって、組換え型の抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それと関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパートリーに天然に存在しない可能性がある配列である。これらの抗体を作製する方法は、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、一般には、遺伝子工学によって、異なる種に属する抗体可変性領域遺伝子および抗体定常領域遺伝子から構築された抗体である。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体を指す。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギなど、または非ヒト霊長類の可変領域由来の残基と交換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。ヒト化抗体は、場合によって、一般にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含んでよい。非ヒト抗体は、フレームワーク領域、定常領域またはＣＤＲに、ヒト抗体由来の同様に位置づけされたアミノ酸と置換されている１つまたは複数のアミノ酸を含有する。一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化型と比較して、ヒト宿主において生じる免疫応答を低減することが予測される。ヒト化抗体は、抗原結合性または他の抗体機能に対する影響を実質的に有さない保存されたアミノ酸置換を有し得る。保存された置換のグループ分けとしては、グリシン－アラニン、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、セリン－トレオニンおよびアスパラギン－グルタミンが挙げられる。「種化された」という用語は、非ヒト種に向けても、同じまたは同様の形で修飾された抗体を指す。
「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、異なるＢ細胞系に由来する抗体の調製物を指す。これらは、それぞれが異なるエピトープを認識する、特異的な抗原に対して分泌される免疫グロブリン分子の混合物である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体ではない。
本明細書で使用される場合、「抗体誘導体」という用語は、例えば、第２の分子に対する抗体を連結するために、アミノ酸の１つまたは複数がアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって化学修飾されている全長の抗体または抗体の断片を含む。抗体誘導体としては、これらに限定されないが、ペグ化された抗体、システイン－ペグ化された抗体、およびその改変体が挙げられる。本開示は、抗体断片の抗体誘導体、例えば、別の分子、例えば、ＰＥＧにコンジュゲートされているまたはアシル化によりさらに改変されているポリペプチドも提供した。
本明細書で使用される場合、用語「免疫コンジュゲート」は、細胞傷害性薬剤、検出可能な薬剤、放射性薬剤、ターゲティング剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体、または多特異性抗体などの第２の薬剤に会合しているまたは連結されている抗体、抗体断片または抗体誘導体を含む。本開示は、１つの構成成分として、本明細書に記載のとおりの抗体ポリペプチドを含む免疫コンジュゲートを提供する。
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「標識化された」組成物を生成するために、検出しようとする組成物に直接または間接的にコンジュゲートした、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気的に活性な同位元素、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、非放射性同位元素、例えば、１３Ｃおよび１５Ｎなど、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば抗体などを意味する。この用語は、ポリヌクレオチドとコンジュゲートした、挿入配列が発現されるとシグナルをもたらす配列、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）なども包含する。この用語は、混合集団からの生体材料の単離を助ける精製タグまたは標識も含む。「標識」という用語は一般に、検出される組成物に共有結合により付着させた組成物を意図するが、一態様では、「標識」という用語は具体的に、その天然環境において、ポリヌクレオチド内またはタンパク質内に配置された場合、特定の条件（例えば、温度、ｐＨなど）下で蛍光発光することが公知である、天然に存在するヌクレオシドおよびアミノ酸を除外し、一般に、検出される組成物内に存在しうる、任意の天然蛍光も除外する。標識は、それ自体で検出可能な場合（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）もあり、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変更を触媒する場合もある。標識は、小規模な検出に適していてよい、またはハイスループットなスクリーニングのためにより適していてよい。そのように、適切な標識としては、これらに限定されないが、磁気的に活性な同位元素、非放射性同位元素、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含めたタンパク質が挙げられる。標識は、単に検出することができる、または、数量化することができる。単に検出する反応は、一般には、ただ単にその存在が確認される反応を含み、一方、数量化する反応は、一般には、数量化できる（例えば、数値で報告することができる）値、例えば、強度、偏光、および／または他の性質などを有する反応を含む。発光アッセイまたは蛍光アッセイでは、検出可能な反応を、実際に結合に関与するアッセイの構成成分と結びつけた発光団またはフルオロフォアを使用して直接生成する、または別の構成成分（例えば、レポーターまたは指示薬）と結びつけた発光団またはフルオロフォアを使用して間接的に生成することができる。シグナルを生じる発光標識の例としては、これらに限定されないが、生物発光および化学発光が挙げられる。検出可能な発光反応は、一般には、発光シグナルの変化または出現を含む。発光標識化アッセイの構成成分のための適切な方法および発光団は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．（１９９６年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版）に記載されている。発光プローブの例としては、これらに限定されないが、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられる。
適切な蛍光標識の例としては、これらに限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（商標）、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。他の適切な光学色素は、Haugland, Richard P.（１９９６年）Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（第６版）に記載されている。
別の態様では、蛍光標識に官能性をもたせて、細胞または組織の内部または表面上に存在する細胞の構成成分、例えば、細胞表面マーカーなどへの共有結合性の付着を容易にする。これらに限定されないが、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルを含めた適切な官能基は全て、蛍光標識を第２の分子に付着させるために使用することができる。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、作用剤、マーカー、または第２の標識化作用剤のいずれかに付着させる部位に左右される。
「真核細胞」は、モネラ界を除いた生物界の全てを含む。真核生物は、膜に結合した核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、その細胞が内部の膜および細胞骨格によって複雑な構造に組織化された真核生物または生物体である。最も特徴的な膜に結合した構造は核である。特に列挙がなければ、「宿主」という用語は、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含めた真核生物の宿主を包含する。真核細胞または宿主の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類およびヒトが挙げられる。
「原核細胞」は、通常、核または任意の他の膜に結合した細胞小器官を欠き、２つのドメイン、細菌および古細菌に分けられる。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞は、エピソームと称される環状のループ内に遺伝情報も含有し得る。細菌細胞は、非常に小さく、およそ動物ミトコンドリアのサイズである（直径約１～２μｍ、長さ１０μｍ）。原核細胞は、３つの主要な形状：ロッド形状、球状、およびスパイラルを特徴とする。真核生物のような精巧な複製プロセスを行う代わりに、細菌細胞は二分裂によって分裂する。例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌が挙げられる。
「ネイティブな」または「天然の」抗原は、エピトープを含有する、天然の生物学的な供給源から単離された、かつ対象において抗原受容体、具体的には、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合することができるポリペプチド、タンパク質または断片である。
「抗原」および「抗原性」という用語は、抗体によって認識されるか、さもなければ抗体－リガンド対のメンバーとして働く能力を有する分子を指す。「特異的な結合」とは、抗原と免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の相互作用を指す。抗体－抗原結合は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含めた巨大分子は、抗原としての機能を果たす潜在性を有することを理解されよう。当業者は、さらに、抗体リガンドとしての機能を果たす潜在性を有するタンパク質をコードする核酸は、必ず抗原をコードすることを理解されよう。当業者は、さらに、抗原は、全長の分子に限定されず、部分的な分子も含んでよいことを理解されよう。「抗原性」という用語は、抗原の性質を有する分子に対する形容詞的参照である。この用語は、免疫原性である物質、すなわち免疫原、ならびに免疫学的不応答性、またはアネルギーを誘導する物質、すなわちアネルゲン（ａｎｅｒｇｅｎ）を包含する。
「変化した抗原」は、対応する野生型抗原の一次配列とは異なる一次配列を有する抗原である。ポリペプチドｍＢ４（配列番号１７）は変化した抗原（配列番号１６）の例である。変化した抗原は、合成方法または組換え方法によって作出することができ、それらとしては、これらに限定されないが、翻訳の間に、または翻訳後に、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解性の切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドへの連結によって示差的に修飾された抗原性ペプチドが挙げられる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（１９８８年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７巻：２８５～３２０頁）。本明細書に開示される合成抗原または変化した抗原は、天然のエピトープと同じＴＣＲに結合するものとする。
本明細書ではネイティブな抗原または野生型抗原とも称される「自己抗原」は、対象において、抗原に対する自己寛容に起因して、免疫応答をわずかに誘導する、または全く誘導しない抗原性ペプチドである。自己抗原の例は、黒色腫特異的抗原ｇｐ１００である。
「免疫応答」とは、広範には、外来物質に対するリンパ球の抗原特異的な応答を指す。「免疫原」および「免疫原性」という用語は、免疫応答を引き出す能力を持つ分子を指す。免疫原は全て抗原であるが、全ての抗原が免疫原性なのではない。本明細書に開示される免疫応答は体液性（抗体活性による）または細胞媒介性（Ｔ細胞の活性化による）であってよい。応答は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含めた種々の巨大分子が免疫原性である潜在性を有することを理解されよう。当業者は、さらに、免疫応答を引き出すことができる分子をコードする核酸は必ず免疫原をコードすることを理解されよう。当業者は、さらに、免疫原は、全長の分子に限定されず、部分的な分子を含んでよいことを理解されよう。
「受動免疫」という用語は、ある対象から別の対象への、抗体の伝達を通じた免疫の伝達を指す。受動免疫は、母親の抗体が胎児に伝達される場合など、天然に起こり得る。受動免疫は、抗体組成物を非免疫の対象に投与する場合など、人工的にも起こり得る。抗体のドナーおよびレシピエントはヒト対象または非ヒト対象であってよい。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生成することができ、また、実施形態に応じて、精製されていてよい、部分的に精製されていてよい、または精製されていなくてよい。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、受動免疫は、それを必要とする対象に、特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに結合する抗体または抗原結合性断片を投与することによって付与される。いくつかの実施形態では、受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片をコードする、単離されたかまたは組換え型のポリヌクレオチドを投与することによって付与される。
本明細書で使用される場合、「対象において免疫応答を誘導すること」という用語は、当技術分野ではよく理解されている用語であり、対象に抗原（またはエピトープ）を導入した後、対象に抗原（またはエピトープ）を導入する前の免疫応答（もしあれば）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍またはそれを超える抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答の増加を検出または測定することができることを意味する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答としては、これらに限定されないが、抗原特異的な（またはエピトープ特異的な）抗体の産生、およびその表面上に抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子を発現している免疫細胞の産生が挙げられる。所与の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されたかどうかを決定する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗原特異的な抗体は、これに限定されないが、ＥＬＩＳＡを含めた、当技術分野で公知の種々の免疫測定法のうちの任意のものを用いて検出することができ、例えば、試料中の抗体の、固定した抗原（またはエピトープ）への結合を、検出可能に標識化した第２の抗体（例えば、酵素標識したマウス抗ヒトＩｇ抗体）を用いて検出する。
本明細書で使用される場合、用語「抗炎症性サイトカイン」は、炎症誘発性サイトカイン応答を制御する免疫調節分子を含む。サイトカインは特定のサイトカイン阻害剤および可溶性サイトカイン受容体と一緒に作用してヒト免疫応答を調節する。主要な抗炎症性サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）－１受容体アンタゴニスト、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１およびＩＬ－１３を含む。ＩＬ－１、腫瘍壊死因子アルファおよびＩＬ－１８に対する特定のサイトカイン受容体も炎症誘発性サイトカイン阻害剤として機能する。抗炎症性サイトカインレベルを含むサイトカインレベルを測定する方法は、当技術分野では周知である。例えば、血清サイトカインレベルは、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して測定することが可能である。
「有効量」という用語は、所望の効果を達成するために十分な量を指す。治療的または予防的な適用の状況では、有効量は、問題の状態の種類および重症度ならびに個々の対象の特性、例えば、全体的な健康、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する寛容性に左右される。免疫原性組成物の文脈における一部の実施形態では、有効量とは、病原体に対する保護的応答をもたらすのに十分な量である。他の実施形態では、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすために十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、受動免疫の付与を必要とする対象に受動免疫を付与するために必要な量である。免疫原性組成物に関して、一部の実施形態では、有効量は、上記の因子に加えて、意図された使用、特定の抗原性化合物の免疫原性の程度、および対象の免疫系の健康／応答性に左右される。当業者は、これらおよび他の因子に応じて適量を決定することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用の場合には、一部の実施形態では、有効量は、問題の適用のサイズおよび性質に左右される。それは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける標的および使用されている方法の性質および感受性にも左右される。当業者は、これらおよび他の考察に基づいて有効量を決定することができる。有効量は、実施形態に応じて、組成物を１回または複数回投与することを含んでよい。
本明細書で使用される場合、「固相支持体」または「固体支持体」は互換的に使用され、特定の種類の支持体に限定されない。それどころか、多数の支持体が利用可能であり、当業者に公知である。固相支持体としては、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが挙げられる。本明細書で使用される場合、「固体支持体」は、合成の抗原提示マトリックス、細胞、およびリポソームも包含する。適切な固相支持体は、所望の最終用途および種々のプロトコールに対する適合性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成に関しては、固相支持体は、樹脂、例えば、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから得られるＰＡＭ－樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｎａｄａから得られる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｃａｌｉｆ．から得られる）を指し得る。
固相支持体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース、修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、いくらかの程度まで可溶性であってよい、または不溶性であってよい。支持材料は、カップリングされた分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体に結合することができる限りは、実質的にいかなる可能性のある構造上の構成を有してもよい。したがって、支持体の構成は、ビーズのように球状であってよい、または、試験管の内側表面、またはロッド外面のように円柱状であってよい。あるいは、表面は、例えばシート、試験紙など平らであってよい、あるいはポリスチレンビーズであってよい。当業者は、抗体または抗原に結合する多くの他の適切なキャリアを知っている、または常套的な実験を使用することによってそれらを確認することができるであろう。
発明を実施するための形態
抗体断片およびその誘導体
本開示は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片または抗原結合性断片）を提供する。本開示はまた、Ｆａｂ断片または抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）のアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離されたポリペプチドを提供し、断片もしくはポリペプチドは、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび／またはＤＮＡＢＩＩタンパク質もしくはポリペプチドを含むバイオフィルム構成成分と結合する、および／またはそれを特異的に認識する。
抗体断片を含む、それから本質的になる、またはなおさらにそれからなる抗体断片または単離されたポリペプチドは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニア化抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、抗体誘導体または組換えヒト化抗体に由来するＦａｂ断片のいずれかであり得る。抗体は、任意の適切な種、例えば、哺乳動物種、例えば、マウス、ネコ、イヌ、ウサギまたはヒトに由来し得る。Ｆａｂ抗体断片を調製する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書において手短に記載されている。１つの例示的方法は、図１に概説されている。
抗体断片は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を特異的に認識し、それに特異的に結合する抗体に由来する、またはそれから生成され、このような抗体断片の非限定的な例には、ＩＨＦアルファ、ＩＨＦベータおよびＨＵが含まれる。このようなポリペプチドおよびこのようなポリペプチドと結合する抗体の非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，２９１号に提供される。一態様では、抗体は、立体構造エピトープを含有するＤＮＡＢＩＩポリペプチドの「先端部ドメイン（tip domain）」と特異的に
結合する。一態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチド（polyeptide）は、配列番号１～３３のうち１つを含む、または本質的にそれからなる、またはなおさらにそれからなる。例示的ＤＮＡＢＩＩポリペプチドのさらなる非限定的な例には、例えば、配列番号１３、１４、１７、２６～３２に提供される、例えば、ＩＨＦアルファ、ＩＨＦベータまたはＨＵの先端部ドメイン内の立体構造エピトープが含まれる。一態様では、配列番号１３、１４、１７および２６～３２は、一態様では、野生型天然ポリペプチド、例えば、配列番号１～１１ではない大きなポリペプチド内に含有される。より大きなポリペプチドは、アミン末端および／またはカルボキシ末端にさらなるアミノ酸を、例えば、一方または両方の末端に少なくとも３または４または５または１０または１５または２０個またはそれより多いアミノ酸を含有し得る。
加えて、抗体は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質の「先端部」領域であって、一態様では、アンチパラレルのベータリボンのターンおよび／または配列
Figure 2023033394000002
 ［配列中、「Ｘ」は、任意のアミノ酸を指すか、あるいは、Ｘは、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、ＳもしくはＴから選択される］を含有する、またはそれを含有するように変更された「先端部」領域に対して生成させることもできる。このような抗体は、必要に応じて、この配列の片側または両側における、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６アミノ酸の間のアミノ酸が隣接した、
Figure 2023033394000003
 配列を含むＤＮＡＢＩＩタンパク質の断片を使用して生成させることができる。このようなものの非限定的な例、すなわち、コンセンサスアミノ酸配列
Figure 2023033394000004
 を有するものが、本明細書において開示される。別の態様では、抗体は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質の先端部領域であって、コンセンサス配列
Figure 2023033394000005
 ［配列中、「Ｘ」は、任意のアミノ酸である、または代替的に、Ｘは、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される］をもたらす先端部領域に対して生成される。当業者は、これらの配列のうちの任意の１つでは、Ｘ位における残基を、任意のアミノ酸、例えば、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴで置換し得ることを十分に理解する。例は、：
配列番号１３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａ５断片：
Figure 2023033394000006
 配列番号１４：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ、Ａ５断片：
Figure 2023033394000007
 配列番号１７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、修飾Ｂ４（ｍＢ４）断片：
Figure 2023033394000008
 配列番号２６：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａ先端部断片：
Figure 2023033394000009
 配列番号２７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、Ｂ先端部断片：
Figure 2023033394000010
 配列番号３１ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ、断片：
Figure 2023033394000011
 を含む。
一部の実施形態では、
Figure 2023033394000012
 を含むポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸の長さであり、
Figure 2023033394000013
 は、配列内の中心にある。このような配列の非限定的な例は、配列番号１３、１４、および３１を含む。代替的に、１つまたは複数のアミノ酸の置換または欠失のいずれかにより
Figure 2023033394000014
 モチーフを除去するように、
Figure 2023033394000015
 モチーフ（例えば、上記で言及した）を有するポリペプチドを修飾することもでき、これらのポリペプチドに対して、モノクローナル抗体を生じさせることもできる。出願人らは、
Figure 2023033394000016
 モチーフを欠くＤＮＡＢＩＩポリペプチドに対して生じる抗体のＦａｂ断片が、バイオフィルムの形成および／または破壊をイメージングおよびモニタリングする診断法において有用であると決定した。一態様では、
Figure 2023033394000017
 モチーフを有するＤＮＡＢＩＩに対して生じた、またはこれに結合する抗体のＦａｂ断片と、
Figure 2023033394000018
 モチーフを欠くＤＮＡＢＩＩ（例えば、修飾ポリペプチドまたは天然に存在するポリペプチド）に対して生じた、またはこれに結合する抗体のＦａｂ断片とを含むキットも提供される。例えば、キットは、ポリペプチドＡ５、Ｂ４、またはｍＢ４を認識し、それに結合する抗体を含み得（治療的）、キット中で、ポリペプチドＡ３またはＢ２を認識し、それに結合する抗体のＦａｂ断片と組み合わせてもよい（診断的）。キットは、バイオフィルム処置の診断、処置、およびモニタリングに有用である。
一態様では、単離されたポリペプチドは、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ抗体のＦａｂ断片またはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ抗体の等価物を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなり、このようなものの例は、本明細書に提供されている。
別の態様では、Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株、例えば、表１において列挙されるハイブリドーマによって産生される抗体から調製される。
Figure 2023033394000019
上記で言及したように、本開示はまた、表１に開示される抗体、例えば、ＩｈｆｍＢ４ＮＴＨＩ抗体または抗体の等価物のＦａｂ断片を含む、または本質的にそれからなる、なおまたはそれからなる抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドも提供する。別の態様では、単離されたポリペプチドは、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ抗体または抗体の等価物のＦａｂ断片を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
さらなる態様において、本開示は、表１に開示された単離された抗体または表１に開示された、もしくは（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６により産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２により産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５により産生された抗体からなる群より選択される抗体に由来する抗体断片に対して少なくとも８５％同一である、代替的に少なくとも９０％、もしくは代替的に少なくとも９５％、もしくは代替的に少なくとも１００％同一である表１に開示された抗体の抗原結合性断片を提供する。
一態様では、本開示は、（ｉ）表１に開示されるハイブリドーマ細胞株、例えば、ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６により産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２により産生された抗体、または（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５により産生された抗体のＣＤＲを含む単離された抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを提供する。一態様では、本開示は、（ｉ）表１に開示されるハイブリドーマ、例えば、細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６により産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２により産生された抗体、または（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５により産生された抗体と少なくとも８５％、もしくは代替的に少なくとも９０％、もしくは代替的に少なくとも９５％、もしくは代替的に少なくとも１００％同一であるＣＤＲを有する抗体に由来する単離された抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを提供する。
本明細書において提供される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドの一部の態様では、このようなものを提供する抗体のＨＣ可変ドメイン配列は、（ｉ）表１に開示されるハイブリドーマ細胞株、例えば、ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体または（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＭＩｈｆＢ４
ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体のＨＣ可変ドメイン配列を含み、および／またはＬＣ可変ドメイン配列は、表１に開示される抗体、例えば、（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体または（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体のＬＣ可変ドメイン配列を含む。
本明細書において提供される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドの一部の態様では、このような配列を提供する抗体のＨＣ可変ドメイン配列は、表１に開示される抗体、例えば、（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体のＨＣ可変ドメイン配列に対して少なくとも８５％同一である、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも１００％同一であるＨＣ可変ドメイン配列を含み、および／またはＬＣ可変ドメイン配列は、表１に開示される抗体、例えば、（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体のＬＣ可変ドメイン配列に対して少なくとも８５％同一、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも１００％同一であるＬＣ可変ドメイン配列を含む。
一態様では、本開示は、Ｆａｂ断片であって、重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列を含み、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のエピトープと結合する抗原結合性部位を形成するＦａｂ断片を提供する。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種のＣＤＲＨ１を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種のＣＤＲＨ２を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種のＣＤＲＨ３を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種の重鎖可変領域配列を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種のＣＤＲＬ１を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種のＣＤＲＬ２を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種のＣＤＲＬ３を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：表１に開示される抗体、例えば（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生される抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生される抗体および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ
１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生される抗体またはそれらの各々の等価物のうちいずれか１種の軽鎖可変領域配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＦＳＬＴＳＹＳ（配列番号５８）を含むアミノ酸配列であって、ＦＳＬＴＳＹＳＶ（配列番号５９）、ＦＳＬＴＳＹＳＶＨ（配列番号６０）、ＧＦＳＬＴＳＹＳ（配列番号６１）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＦＮＩＫＤＹＹ（配列番号１１０）を含むアミノ酸配列であって、ＦＮＩＫＤＹＹＭ（配列番号１１１）、ＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号１１２）、ＧＦＮＩＫＤＹＹ（配列番号１１３）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号６２）を含むアミノ酸配列であって、ＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号６３）、ＧＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号６４）、ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号６５）、ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号６６）、ＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号６７）、ＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号６８）、ＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号６９）、ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号７０）、ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号７１）、ＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号７２）、ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号７３）、ＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号７４）、ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号７５）、ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号７６）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号１１４）を含むアミノ酸配列であって、ＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号１１５）、ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号１１６）、ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号１１７）、ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号１１８）、ＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号１１９）、ＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号１２０）、ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号１２１）、ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号１２２）、ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号１２３）、ＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号１２４）、ＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号１２５） ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号１２６）、ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号１２７）、ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号１２８）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＲＥＤＳ（配列番号７７）を含むアミノ酸配列であって、ＡＲＥＤＳ（配列番号７８）またはその等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＴＥＬＧＡＹ（配列番号１２９）またはその等価物を含むアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＡＡＴＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号５０）またはその等価物によってコードされるポリペプチドを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＴＰＳＱＳＬＳＭＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＳＹＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＳＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＤＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＲＥＤＳＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号５１）またはその等価物を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＧＧＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣ（配列番号５２）またはその等価物によってコードされるポリペプチドを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＲＳＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹＶＰＫＦＱＧＫＡＳＭＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＥＬＧＡＹＷＧＱＧＴＬＶ（配列番号５３）またはその等価物を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＱＮＶＧＴＮ（配列番号７９）を含むアミノ酸配列であって、ＱＮＶＧＴＮＶ（配列番号８０）、ＱＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号８１）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹ（配列番号１３０）を含むアミノ酸配列であって、ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬ（配列番号１３１）、ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬＮ（配列番号１３２）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＳＡＳ（配列番号８２）を含むアミノ酸配列であって、ＹＳＡＳ（配列番号８３）、ＩＹＳＡＳ（配列番号８４）、ＬＩＹＳＡＳ（配列番号８５）、ＡＬＩＹＳＡＳ（配列番号８６）、ＳＡＳＹ（配列番号８７）、ＹＳＡＳＹ（配列番号８８）、ＩＹＳＡＳＹ（配列番号８９）、ＬＩＹＳＡＳＹ（配列番号９０）、ＡＬＩＹＳＡＳＹ（配列番号９１）、ＳＡＳＹＲ（配列番号９２）、ＹＳＡＳＹＲ（配列番号９３）、ＩＹＳＡＳＹＲ（配列番号９４）、ＬＩＹＳＡＳＹＲ（配列番号９５）、ＡＬＩＹＳＡＳＹＲ（配列番号９６）、ＳＡＳＹＲＹ（配列番号９７）、ＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号９８）、ＩＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号９９）、ＬＩＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号１００）、ＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号１０１）、ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１０２）、ＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１０３）、ＩＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１０４）、ＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１０５）、ＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１０６）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＬＶＳ（配列番号１３３）を含むアミノ酸配列であって、ＹＬＶＳ（配列番号１３４）、ＩＹＬＶＳ（配列番号１３５）、ＬＩＹＬＶＳ（配列番号１３６）、ＲＬＩＹＬＶＳ（配列番号１３７）、ＬＶＳＫ（配列番号１３８）、ＹＬＶＳＫ（配列番号１３９）、ＩＹＬＶＳＫ（配列番号１４０）、ＬＩＹＬＶＳＫ（配列番号１４１）、ＲＬＩＹＬＶＳＫ（配列番号１４２）、ＬＶＳＫＬ（配列番号１４３）、ＹＬＶＳＫＬ（配列番号１４４）、ＩＹＬＶＳＫＬ（配列番号１４５）、ＬＩＹＬＶＳＫＬ（配列番号１４６）、ＲＬＩＹＬＶＳＫＬ（配列番号１４７）、ＬＶＳＫＬＤ（配列番号１４８）、ＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号１４９）、ＩＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号１５０）、ＬＩＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号１５１）、ＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号１５２）、ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号１５３）、ＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号１５４）、ＩＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号１５５）、ＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号１５６）、ＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号１５７）、またはそれらのそれぞれの等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＱＱＹＮＳＹＰ（配列番号１０８）を含むアミノ酸配列であって、ＱＱＹＮＳＹＰＴ（配列番号１０９）、またはその等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＷＱＳＴＨＦＰＨ（配列番号１５８）を含むアミノ酸配列であって、ＷＱＳＴＨＦＰＨＴ（配列番号１５９）またはその等価物で始まる、それで終わる、またはそれから本質的になるアミノ酸配列などであるがこれらに限定されないアミノ酸配列を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＡＣＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ（配列番号５４）またはその等価物によってコードされるポリペプチドを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＹＮＳＹＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５５）またはその等価物を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＴＴＡＣＣＡＴＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号５６）またはその等価物によってコードされるポリペプチドを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
ＤＶＶＭＴＱＩＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬＮＷＬＦＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＷＱＳＴＨＦＰＨＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５７）またはその等価物を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドが由来する、開示されたＣＤＲ配列ならびに重鎖および軽鎖可変配列を含む例示的抗体は、表２および表３にそれぞれ開示されている。代替的なＣＤＲ予測は、重鎖配列および／または軽鎖配列に基づき、行うことができる（例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｌｏｔｈｉａの定義、ＡｂＭの定義、またはＣＤＲ特異性についての接触定義（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）に基づく；当技術分野では、これらのＣＤＲ予測法についての詳細が公知であり（例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄを参照されたい）、かつ／または市販されてもいる）。表２に開示されるものは、Ｏｆｒａｎ Ｌａｂにより提供されているＣＤＲ予測アルゴリズム（ｏｆｒａｎｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｂｉｕ．ａｃ．ｉｌ／ｓｉｔｅ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐａｒａｔｏｍｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにおいて入手可能なＰａｒａｔｏｍｅ）およびＧｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’ ＣＤＲ予測プログラムを活用する結果である。
Figure 2023033394000020
Figure 2023033394000021
一態様では、本開示は、表１に開示される抗体、例えば、Ｉｈｆ Ａ５、Ｉｈｆ ｍＢ４またはそれらの各々の生物学的等価物からなる群から選択される抗体に対して少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％または１００％同一である単離された抗体の抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）を提供する。
一態様では、本開示は、Ｉｈｆ Ａ５のＣＤＲを含む単離された抗体断片を提供する。一態様では、本開示は、Ｉｈｆ Ａ５またはその生物学的等価物に対して、少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または１００％同一である抗体の単離された抗体断片を提供する。
一態様では、本開示は、Ｉｈｆ ｍＢ４のＣＤＲを含む単離された抗体断片を提供する。一態様では、本開示は、Ｉｈｆ ｍＢ４またはその生物学的等価物に対して、少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または１００％同一である単離された抗体の単離された抗体断片を提供する。
本明細書において提供される抗体断片の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ Ａ５の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ Ａ５の可変ドメイン配列を含む。
本明細書において提供される抗体断片の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ ｍＢ４の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ ｍＢ４の可変ドメイン配列を含む。
本技術の別の態様では、抗体断片は、以下の特徴：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または１００％同一な、１つまたは複数のＣＤＲを含むこと；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと、少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または１００％同一な、１つまたは複数のＣＤＲを含むこと；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインと、少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または１００％同一であること；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインと、少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または１００％同一であること；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のいずれかが結合するエピトープと重複するエピトープに結合すること
のうち１つまたは複数を含む。
本明細書において提供される抗体の態様の一部では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質と１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍまたは１０－１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。本明細書において提供される抗体断片またはポリペプチドの態様の一部では、抗原結合性部位は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質と特異的に結合する。別の態様では、抗体または抗原結合性断片の親和性は、１０００ピコモル（ｐＭ）、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、約１００ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭおよび８ｐＭ未満または約１０００ピコモル（ｐＭ）、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、約１００ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭおよび８ｐＭである。
本明細書で提供される抗体についての態様のうちの一部では、抗体断片または抗原結合性断片は、可溶性Ｆａｂである。別の態様では、ポリペプチドは、本明細書において開示される抗体の可溶性Ｆａｂまたは可溶性Ｆａｂの等価物を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
本明細書で提供される抗体についての態様のうちの一部では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドが由来する抗体は、ウサギ抗体である。本明細書で提供される抗体についての態様のうちの一部では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドが由来する抗体は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体である、またはヒトにおいて非免疫原性である。
本明細書で提供される抗体についての態様のうちの一部では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドが由来する抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域を含む（例えば、ヒト化抗体）。本明細書において提供される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドが由来する抗体の一部の態様では、抗体は、サル、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、またはヒツジなど、非ヒト種に由来する抗体フレームワーク領域を含む。抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドが由来する抗体の一部の態様では、抗体は、キメラ抗体である。これらの態様のうちのいずれか１つまたは複数では、抗体は、本明細書で開示されるＣＤＲ領域ならびに／または重鎖および／もしくは軽鎖のうちの１つまたは複数をさらに含み得る。
他の態様では、本明細書で提供される抗体のＣＤＲ内の、１つまたは複数の残基を、別のアミノ酸と置換する。置換は、同じアミノ酸ファミリー内の置換であるという意味で、「保存的」でありうる。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けることができ、保存的置換は、これらのファミリー内で生じるであろう。
１）塩基性側鎖のあるアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン。
２）酸性側鎖のあるアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸。
３）非電荷極性側鎖のあるアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン。
４）非極性側鎖のあるアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
別の態様では、１つまたは複数の残基を、抗体の１つまたは複数のＣＤＲに付加する、またはこれから欠失させる。このような付加または欠失は、ＣＤＲのＮ末端もしくはＣ末端またはＣＤＲ内の位置において生じる。
抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、アミノ酸の付加、欠失、または置換により変化させることにより、標的抗原に対する結合親和性の増加など、多様な効果を得ることができる。
ＣＤＲ配列のこのような変動を含む本開示の抗体もなお、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に、開示される抗体と同様の特異性および感受性プロファイルで結合することを認識されたい。これは、結合アッセイにより調べることができる。
また、抗体の定常領域も変化させることができる。例えば、任意のアイソタイプ：ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、またはＩｇＭのＦｃ領域を伴う抗体を提供することができる。さらに、抗体の定常領域は、例えば、Iraniら（２０１５年）、Molecular Immunol.６７巻：１７１～１８２頁の教示に従い、具体的な治療適応に適合させることもできる。
Iraniら（２０１５年）において言及されている通り、Ｆｃ操作は、強力で特異的な活
性を伴い、したがって、投与量および潜在的な副作用の両方を低減する治療的抗体を開発するのに重要である。Ｆｃ操作では、ＩｇＧサブクラスにわたる差違についての理解が使用されており、研究は、１つのサブクラスに由来する特異的残基を、別のサブクラス導入することにより、他のエフェクター機能を保持しながら、ある特定のエフェクター機能を変換し得ることを示している（Armourら（１９９９年）、Eur. J. Immunol.、２９巻：２６１３～２６２４頁；Armourら（２００３年）、Mol. Immunol.、４０巻：５８５～５９３頁；Hessellら（２００７年）、Nature、４４９巻：１０１～１０４頁；Redpathら（１９９８年）、Hum. Immunol.、５９巻：７２０～７２７頁；Vafaら（２０１４年）、Methods(San Diego、CA)、６５巻：１１４～１２６頁）。これらのＦｃ操作法は、感染性
疾患の文脈において、特異的抗体のエフェクター機能が、病原体の効率的な除去において極めて重要なことが多いので、適切である。
ＩｇＧサブクラスの構造的特性および機能的な特性は、異なる感染性疾患に対するそれらの応答プロファイルと同様に様々であり、これらの差違を、有効な治療用抗体の開発において活用することができる（Carter（２００６年）、Nat. Rev. Immunol.、６巻：３４３～３５７頁；Jefferis（２０１２年）、Arch. Biochem. Biophys.、５２６巻：１
５９～１６６頁）。重鎖は、ＩｇＧサブクラスにわたり、９０％を超える配列同一性を共有するが（RispensおよびVidarsson（２０１４年）、Nimmerjahn、M.E.A.（編）、９章、Human IgG Subclasses、Academic Press. Boston、１５９～１７７頁）、定常（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）ドメイン上の、表面に露出された残基には差違があるほか、ヒンジ領域内でも、実質的な変動がある。安定性、可撓性、および２つのＦａｂおよび随伴するＦｃが広がる（spanned）距離など、各ＩｇＧサブクラスに固有の特性の多くを付
与するのは、ヒンジ構造である（LiuおよびMay（２０１２年）、mAbs、４巻：１７～２３頁；Rouxら（１９９７年）、J.Immunol.（Baltimore、MD：１９５０）、１５９巻：３３
７２～３３８２頁；Tianら（２０１４年）、Pharm. Sci.、１０３巻：１７０１～１７１０頁）。ＩｇＧサブクラスの間で異なる、Ｆｃおよびヒンジの一部の領域が、活性化および阻害性Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）の両方、ＩｇＧに対する胎児性受容体（neonatal receptor for IgG）（ＦｃＲｎ）、および補体成分Ｃ１ｑへの結合に関与することが公知の残基と明らかに重複することは重要なことである。これらのエフェクター分子の結合性部位内の、鍵となるアミノ酸の差違の発生は、ＩｇＧサブクラスのエフェクター特性において観察される差違を説明する一助となる。この構造的情報および分子的情報は、治療用抗体のサブクラス骨格を選び出す場合、または具体的目的で、抗体を調整するように、鍵となるアミノ酸の変化を導入する場合に重要である。
定常領域配列の非限定的な例は以下を含む：
ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０ 配列番号３４：
ＡＰＴＫＡＰＤＶＦＰＩＩＳＧＣＲＨＰＫＤＮＳＰＶＶＬＡＣＬＩＴＧＹＨＰＴＳＶＴＶＴＷＹＭＧＴＱＳＱＰＱＲＴＦＰＥＩＱＲＲＤＳＹＹＭＴＳＳＱＬＳＴＰＬＱＱＷＲＱＧＥＹＫＣＶＶＱＨＴＡＳＫＳＫＫＥＩＦＲＷＰＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＧＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ．
ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７ 配列番号３５：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ．
ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９ 配列番号３６：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ．
ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０ 配列番号３７：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ．
ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１ 配列番号３８：
ＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＬＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ．
ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１ 配列番号３９：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ．
ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６ 配列番号４０：
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＣＳＴＱＰＤＧＮＶＶＩＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＧＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＬＡＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ．
ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７ 配列番号４１：
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＤＳＴＰＱＤＧＮＶＶＶＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＮＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＰＤＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＭＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ．
ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４ 配列番号４２：
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ．
一部の実施形態では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、ＩｈｆＡ断片
Ａ５（配列番号１３）に対して特異的な抗体に由来し、ＩｇＧ２などであるがこれらに限定されない（ある特定の態様では、ＩｇＧ２ａである）ＩｇＭまたはＩｇＧに由来する定常領域を含む。親抗体が、モノクローナル抗体である場合、例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＤ、ならびにＩｇＥを含むがこれらに限定されず、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むことが好ましい場合がある。モノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスは、例えば、オクタロニー試験、ＥＬＩＳＡ、またはラジオイムノアッセイ（本明細書の以下では、「ＲＩＡ」と称する）により決定することができる。同定のための市販のキット（例えば、Ｍｏｕｓｅ Ｔｙｐｅｒ Ｋｉｔ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＲＡＴ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＴＥＳＴ ＫＩＴ：ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）を使用することができる。
一部の実施形態では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、ＩｈｆＢ断片であるｍＢ４（配列番号１７）に特異的な抗体またはその等価物に由来し、ＩｇＧ１などであるがこれらに限定されないＩｇＧに由来する定常領域を含む。
一部の態様では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６により産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２により産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５により産生された抗体またはそれらのそれぞれの等価物のうちの任意の１つの重鎖定常領域配列と、少なくとも８０％同一な、または代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも１００％同一な重鎖定常領域を含む抗体に由来する。
一部の態様では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、以下の親抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６により産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２により産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５により産生された抗体またはそれらのそれぞれの等価物のうちの任意の１つの軽鎖定常領域配列と、少なくとも８０％同一の、または代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも１００％同一な軽鎖定常領域を含む抗体に由来する。
本明細書で提供される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチド由来の抗体についての一部の態様では、親抗体またはＦａｂ（断片抗原結合）断片は、ＤＮＡＢＩＩ抗体が結合するエピトープに結合する。
本明細書で提供される親抗体についての一部の態様では、抗体断片は、迅速な結合ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐放出を容易にする構造的修飾を含有する。
抗体断片、抗原結合性断片およびポリペプチドおよびそれらの等価物を、検出可能な標識または精製標識および／またはキャリア、例えば、薬学的に許容されるキャリアまたは他の作用剤と組み合わせて、使用および／または貯蔵のための製剤をもたらすことができる。
抗体産生のための方法
当技術分野では、抗体の一般的構造が、公知であり、ここでは、簡単にまとめるにとどめる。免疫グロブリンの単量体は、ジスルフィド結合により接続された、２つの重鎖と、２つの軽鎖とを含む。各重鎖を、ジスルフィド結合を介してそれを直接結合させる軽鎖のうちの１つと対合させる。各重鎖は、定常領域（抗体のアイソタイプに応じて変動する）と、可変領域とを含む。可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と表記され、フレームワーク領域内で支持されている、３つの超可変領域（または相補性決定領域）を含む。各軽鎖は、定常領域と、可変領域とを含み、可変領域は、重鎖の可変領域と同様に、フレームワーク領域により支持されている、３つの超可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と表記される）を含む。
重鎖と軽鎖との各対の超可変領域は、相互に協同して、標的抗原に結合することが可能な抗原結合性部位をもたらす。重鎖と軽鎖との対の結合特異性は、重鎖および軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列により規定される。したがって、特定の結合特異性をもたらす、ＣＤＲ配列のセット（すなわち、重鎖および軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列）を決定したら、同じ抗原結合特異性を伴う異なる抗体をもたらすために、原則として、ＣＤＲ配列のセットを、任意の抗体の定常領域と連結された、他の任意の抗体フレームワーク領域内の、適切な位置に挿入することができる。
Ｆａｂ断片の産生のための抗体は、当技術分野で公知の、文献において十分に記載されている従来技術を使用して作製することができる。ポリクローナル抗体の産生のためのいくつかの方法論が存在する。例えば、ポリクローナル抗体は、通常、限定されるものではないが、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、ウマ、イヌ、マウス、ラットおよびウサギなどの適した哺乳動物の免疫によって産生される。抗原を哺乳動物に注射すると、これが、Ｂリンパ球を誘導して、この抗原に特異的な免疫グロブリンを産生させる。免疫グロブリンは、哺乳動物の血清から精製することができる。ＩＨＦαサブユニットおよび／またはＩＨＦβサブユニットに特異的な抗体は、ＩＨＦαおよびＩＨＦβの異なるエピトープに対応するポリペプチドを注射することにより生成させることができる。例えば、ＩＨＦαには、配列番号１２および１３（それぞれ、ＩＨＦの断片Ａ３およびＡ５）、ＨＵには、配列番号１４（ＨＵの断片Ａ５）、ＩＨＦβには、配列番号１５から１７まで（ＩＨＦの断片Ｂ２、Ｂ４、およびｍＢ４）など、各サブユニットの２０アミノ酸を使用して、抗体を生成させることができる。
この方法の変化形には、産生を最適化し、動物を人道的に取り扱うための、アジュバント、投与経路および投与部位、部位１カ所当たりの注射容量および動物１匹当たりの部位数の改変が含まれる。例えば、抗原に対する免疫応答を改善または増強するために、アジュバントを用いることが典型的である。大半のアジュバントは、注射部位における抗原貯留をもたらし、それにより、抗原の排出リンパ節内への緩徐な（ｓｔｏｗ）放出が可能となる。他のアジュバントには、タンパク質抗原分子の濃縮を広大な表面積にわたり促進する界面活性剤、および免疫賦活性分子が含まれる。ポリクローナル抗体を生成させるためのアジュバントの非限定的な例は、フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバント系、ＭＰＬに由来するアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシン（例えば、ｄｍＬＴ＝二重変異体不安定毒素）に由来するアジュバント、およびＴｉｔｅｒｍａｘを含む。ポリクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて産生することができ、それらのうちの一部は、米国特許第７，２７９，５５９号；同第７，１１９，１７９号；同第７，０６０，８００号；同第６，７０９，６５９号；同第６，６５６，７４６号；同第６，３２２，７８８号；同第５，６８６，０７３号；および同第５，６７０，１５３号において説明されている。
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知であり、文献中で十分に説明されている従来のハイブリドーマ法を用いて産生することができる。例えば、ハイブリドーマは、適切な不死細胞株（例えば、Ｓｐ２／０細胞、Ｓｐ２／０－ＡＧ１４細胞、ＮＳＯ細胞、ＮＳ１細胞、ＮＳ２細胞、ＡＥ－１細胞、Ｌ．５細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３細胞、Ｓｐ２ ＳＡ３細胞、Ｓｐ２ ＭＡＩ細胞、Ｓｐ２ ＳＳ１細胞、Ｓｐ２ ＳＡ５細胞、Ｕ３９７細胞、ＭＩＡ １４４細胞、ＡＣＴ ＩＶ細胞、ＭＯＬＴ４細胞、ＤＡ－１細胞、ＪＵＲＫＡＴ細胞、ＷＥＨＩ細胞、Ｋ－５６２細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＡＪＩ細胞、ＮＩＨ ３１３細胞、ＨＬ－６０細胞、ＭＬＡ １４４細胞、ＮＡＭＡＩＷＡ細胞、ＮＥＵＲＯ ２Ａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＰｅｒＣ．６細胞、ＹＢ２／Ｏ細胞などであるがそれらに限定されない骨髄腫細胞株）など、あるいはヘテロ骨髄腫、これらの融合産生物、またはそれらに由来する任意の細胞もしくは融合細胞、あるいは当技術分野において公知の他の任意の適切な細胞株（以下のウェブアドレス、例えば、２００７年１１月２６日に最終アクセスされたａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．における細胞株を参照されたい）を、単離されたかまたはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃腺、または他の免疫細胞もしくはＢ細胞を含有する細胞、あるいは組換えまたは内因性のウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはミトコンドリアＲＮＡ、クロロプラストＤＮＡもしくはクロロプラストＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖核酸、二本鎖核酸、または三本鎖核酸、ハイブリダイズした核酸など、あるいはそれらの任意の組合せの核酸としての内因性核酸または異種核酸としての、重鎖定常配列もしくは重鎖可変配列もしくは重鎖フレームワーク配列もしくは重鎖ＣＤＲ配列または軽鎖定常配列もしくは軽鎖可変配列もしくは軽鎖フレームワーク配列もしくは軽鎖ＣＤＲ配列を発現する他の任意の細胞などであるがそれらに限定されない抗体産生細胞と融合させることにより産生する。抗体産生細胞はまた、目的の抗原で免疫化したヒトまたは他の適切な動物の末梢血、または特定の実施形態では、脾臓もしくはリンパ節から得ることもできる。また、他の任意の適切な宿主細胞も、本開示の抗体、指定された断片、またはそれらの改変体をコードする異種核酸または内因性核酸を発現させるのに用いることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択培養条件または他の適切な公知の方法を用いて単離することができ、限界希釈法、もしくは細胞分取法、または他の公知の方法を介してクローニングすることができる。本明細書で開示される一部の実施形態は、ＩＨＦ断片に対するモノクローナル抗体を産生する特異的ハイブリドーマに関し、非限定的な例は、ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６（ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ－１２２３３４）、ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２（ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ－１２２３３６）、ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５（ＡＴＣＣ番号：ＰＴＡ－１２２３３５）を含む。
ペプチドライブラリーまたはタンパク質ライブラリー（例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、オリゴヌクレオチドディスプレイライブラリー、ｃＤＮＡディスプレイライブラリーなどであるがそれらに限定されないライブラリー；例えば、当技術分野において公知の方法を用いる、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｄｅｌ．）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ａｆｆｉｔｅｃｈ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）など、各販売元から市販されているライブラリー）から組換え抗体を選択する方法が含まれるがそれらに限定されない、必須の特異性を有する抗体を産生または単離する他の適切な方法を用いることができる。当技術分野で公知の方法は、特許文献において説明されており、それらのうちの一部には、米国特許第４，７０４，６９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８２４，５１４号；同第５，９７６，８６２号が含まれる。代替的な方法は、トランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス； Ｎｇｕｙｅｎら（１９７７年）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４１巻：９０１～９０７頁（１９９７年）；Ｓａｎｄｈｕら（１９９６年）、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：９５～１１８頁；Ｅｒｅｎら（１９９８年）、Ｍｕｍｍａ、９３巻：１５４～１６１頁の免疫化に依存し、それにより、当技術分野において公知であり、かつ／または本明細書でも説明されるヒト抗体のレパートリーを産生することが可能である。このような技法には、リボソームディスプレイ（例えば、Ｗａｎｅｓら（１９９７年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９４巻：４９３７～４９４２頁；Ｈａｎｅｓら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：１４１３０～１４１３５頁）、単一細胞による抗体産生法（例えば、選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎら（１９８７年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻：８８７～８９２頁；Ｂａｂｃｏｏｋら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：７８４３～７８４８頁）、ゲルマイクロ液滴およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら（１９９０年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻：３３３～３３７頁；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）；Ｇｒａｙら（１９９５年）、Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈ．、１８２巻：１５５～１６３頁；ならびにＫｅｎｎｙら（１９９５年）、Ｂｉｏ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１３巻：７８７～７９０頁）、Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら（１９９４年）、Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９巻：１２５～１３４頁）が含まれるがそれらに限定されない。さらなる方法は、当技術分野で公知の技術を使用するヒト血清からのヒト抗体の単離に依拠する、米国特許第７，９３９，３４４号を参照されたい。
抗体はまた、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏの産生を誘導することにより産生することもでき、組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合性試薬のパネルをスクリーニングすることにより生成することもできる（Orlandiら（１９８９年）
、PNAS、８６巻：３８３３～３８３７頁；Winterら（１９９１年）、Nature、３４９巻：２９３～２９９頁）。
代替的に、単鎖抗体を産生するための技法も使用することができる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（約５から２５アミノ酸までの長さであることが典型的である）により接続された、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを含む。ｓｃＦｖ内では、重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体に由来する場合もあり、異なる抗体に由来する場合もある。ｓｃＦｖは、組換え技術を使用して、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主生物において、ｓｃＦｖをコードするベクターの発現により合成することができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、鋳型として、上記で言及された抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、その軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡとから選択されるＤＮＡのうち、アミノ酸配列の全体または所望のアミノ酸配列をコードする部分ＤＮＡを使用して、その両方の末端を規定するプライマー対を使用するＰＣＲによる増幅を実施し、ポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡと、その両方の末端を規定するプライマー対とを組み合わせる増幅をさらに実施して、該リンカーの両方の末端を該重鎖および該軽鎖のそれぞれにライゲートすることにより得ることができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターと、発現ベクターで形質転換された宿主は、当技術分野で公知の従来の方法に従い得ることができる。
抗原結合性断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により生成させることができ、Ｆａｂ断片はＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成させることができる。Ｆａｂ断片、特に、マウスモノクローナル抗体から生成されたマウスＦａｂ断片も、システインの存在下での抗体のチオールプロテアーゼフィシンを用いる消化によって生成させることができる。Ｆａｂ断片、特に、ウサギポリクローナル抗体から生成されたウサギＦａｂ断片もまた、システイン－ＨＣｌの存在下での抗体のプロテアーゼパパインを用いる消化によって生成させることができる。代替的に、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して所望の特異性を伴うモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とすることができる（Huseら（１９８９年）、Science、２５６巻：１
２７５～１２８１頁）。断片を生成すると、従来技術を使用して断片を単離し、シーケンシングでき、アミノ酸配列が決定される。
本開示の抗体誘導体はまた、本明細書に開示されるとおりの抗体断片、抗原結合断片またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなど、それらのミルク中にこのような抗体を産生するトランスジェニック動物またはトランスジェニック哺乳動物を提供するように、適切な宿主に送達することにより調製することもできる。当技術分野ではこれらの方法が公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号；および同第５，３０４，４８９号において説明されている。
「抗体誘導体」という用語は、抗体または断片の直鎖状ポリペプチド配列に対する翻訳後修飾を包含する。例えば、米国特許第６，６０２，６８４Ｂ１号は、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を包含し、Ｆｅを介する細胞傷害作用が増強されている全抗体分子、抗体断片、または融合タンパク質を含めた抗体の修飾グリコール形態を産生する方法、およびこのようにして産生された糖タンパク質について説明している。
本明細書で開示される抗体断片、抗原結合性断片およびポリペプチド由来の親抗体はまた、任意の種類の分子を抗体に共有結合させることにより修飾した誘導体を含み、それにより、抗体が抗イディオタイプ応答を引き起こすことを共有結合が妨げることはない。抗体誘導体には、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）を介する誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞内リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾されている抗体が含まれるがそれらに限定されない。本明細書で想定される修飾抗体の非限定的な例は、グリコシル化されていない、全抗体分子、抗体断片、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質である。このような非グリコシル化形態は、例えば、タンパク質を、Ｎ結合型グリカンで修飾する能力を欠く宿主細胞内で生成させることもでき、目的の抗体上の、Ｎ結合型コンセンサス部位を変異させることにより生成させることもできる。加えて、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。
親抗体の抗体誘導体はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを送達して、このような抗体、指定された部分、または改変体を、植物部分またはそれらに由来して培養された細胞において産生する、トランスジェニック植物および培養植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、およびウキクサであるがこれらに限定されない）を作製することにより調製することもできる。例えば、Ｃｒａｍｅｒら（１９９９年）、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０巻：９５～１１８頁、およびこの文献において引用された参考文献は、例えば、誘導性プロモーターを用いる、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックのタバコ葉の産生について説明している。トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系で産生されたまたは天然の供給源から精製された哺乳動物タンパク質と等価の生物学的活性を伴う哺乳動物タンパク質を、商業的生産レベルで発現させるのに用いられている。例えば、Ｈｏｏｄら（１９９９年）、Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．、４６４巻：１２７～１４７頁、およびこの文献において引用された参考文献を参照されたい。抗体誘導体はまた、タバコの種子および馬鈴薯の塊茎を含め、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を包含するトランスジェニック植物の種子からも大量に産生されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄら（１９９８年）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８巻：１０１～１０９頁、およびこの文献において引用された参考文献を参照されたい。したがって、抗体はまた、公知の方法に従いトランスジェニック植物を用いても産生することができる。
親抗体の抗体誘導体はまた、例えば、外因性配列を付加して、免疫原性を修飾する、または結合、親和性、オン速度、オフ速度、アビディティ、特異性、半減期、もしくは他の任意の適切な特徴を低減、増強、もしくは修飾することにより産生することもできる。一般に、可変領域および定常領域の非ヒト配列をヒトアミノ酸または他のアミノ酸で置換しながら、非ヒトＣＤＲ配列またはヒトＣＤＲ配列のうちの一部または全部を維持する。
抗体のヒト化または操作は、米国特許第５，７２３，３２３号；同第５，９７６，８６２号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７６３，１９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６６，８８６号；同第５，７１４，３５２号；同第６，２０４，０２３号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；および同第４，８１６，５６７号において説明されている方法などであるがそれらに限定されない任意の公知の方法を用いて実施することができる。
本明細書において記載されるように検出可能な標識または精製標識をさらに含む、本明細書で開示されるＦａｂ断片または抗原結合性断片またはポリペプチドを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離されたポリペプチドがさらに提供される。
本開示の抗体断片、抗原結合性断片もしくはポリペプチドの、キメラ親抗体、ヒト化親抗体、または霊長類化親抗体は、標準的な分子生物学の技法を用いて調製される基準のモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。このような抗体を使用して、本開示の抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片または抗原結合性断片）を生成してもよい。
重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を用いて、基準以外の（例えば、ヒトの）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野において公知の方法（米国特許第４，８１６，５６７号）を用いて、マウス可変領域を、ヒト定常領域に連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当技術分野において公知の方法（米国特許第５，２２５，５３９号、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号）を用いて、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワーク内に挿入することができる。同様に、霊長類化抗体を創出するには、当技術分野において公知の方法（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ９３／０２１０８およびＷＯ９９／５５３６９）を用いて、マウスＣＤＲ領域を、霊長類フレームワーク内に挿入することができる。
当技術分野では、部分ヒト抗体～完全ヒト抗体を作製する技法が公知であり、任意のこのような技法を用いることができる。一実施形態によれば、トランスジェニックマウスにおいて完全ヒト抗体配列を作製し、ヒト重鎖抗体遺伝子およびヒト軽鎖抗体遺伝子を発現させるように操作する。異なるクラスの抗体を産生させ得る、複数のこのようなトランスジェニックマウス系統が作製されている。所望の抗体を産生しているトランスジェニックマウスに由来するＢ細胞を融合させて、所望の抗体を持続的に産生するためのハイブリドーマ細胞株を作製することができる（例えば、Ｒｕｓｓｅｌら（２０００年）、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０００年４月：１８２０～１８２６頁；Ｇａｌｌｏら（２０００年）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．、３０巻：５３４～５４０頁；Ｇｒｅｅｎ（１９９９年）、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：１１～２３頁；Ｙａｎｇら（１９９９年Ａ）、Ｊ． ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻：４０１～４１０頁；Ｙａｎｇ（１９９９年Ｂ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９巻（６号）：１２３６～１２４３頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８年）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ、３１巻：３３～４２頁；ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８年）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８８巻（３号）：４８３～４９５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８年）、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ、７巻（４号）：６０７～６１４頁；Ｔｓｕｄａら（１９９７年）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４２巻：４１３～４２１頁；Ｓｈｅｒｍａｎ－Ｇｏｌｄ（１９９７年）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、１７巻（１４号）；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻：１４６～１５６頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９６年）、「Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ」、ＩＶ巻、１９４．１～１９４．７頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９５年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：５６１～５６６頁；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９５年）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２６巻：２９４～３０７頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９４年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻（８号）：７６１～７６３頁；Ａｒｂｏｎｅｓら（１９９４年）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１巻（４号）：２４７～２６０頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻（６４１７号）：２５５～２５８頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、９０巻（６号）：２５５１～２５５５頁；および米国特許第６，０７５，１８１号を参照されたい）。
本明細書に開示される抗体はまた、キメラ抗体を創出するように修飾することもできる。キメラ抗体とは、抗体の重鎖および軽鎖の多様なドメインが、複数の種に由来するＤＮＡによりコードされる抗体である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
代替的に、本明細書に開示される抗体はまた、ベニア化抗体を創出するように修飾することもできる。ベニア抗体とは、第１の種の抗体が、第２の種において免疫原性とならず、それにより、この抗体の免疫原性を低減するように、１つの種の抗体の外部のアミノ酸残基を、第２の種の外部のアミノ酸残基で慎重に置換または「ベニア化」された抗体である。タンパク質の免疫原性は、主に、その表面の性質に依存するので、別の哺乳動物種の抗体中に通常見いだされる残基とは異なる露出残基を置換することによれば、抗体の免疫原性を低減し得るであろう。このように外部残基を慎重に置換すれば、内部ドメインまたはドメイン間の接触にはほとんどまたは全く影響が及ばないはずである。したがって、可変領域のフレームワーク残基に限定される変更の結果として、リガンドの結合特性に影響が及ぶことはないはずである。変更するのは抗体の外面またはスキン（ｓｋｉｎ）だけであり、支持残基は攪乱されずに維持されるので、この工程を、「ベニア化」と称する。
「ベニア化」の手順は、Ｋａｂａｔら（１９８７年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、４版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによりコンパイルされたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データ、このデータベースに対する更新、ならびに米国および海外の他のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質両方のデータベース）を活用する。ベニア化抗体を産生するのに用いられる方法の非限定的な例には、ＥＰ５１９５９６、米国特許第６，７９７，４９２号が含まれ、Ｐａｄｌａｎら（１９９１年）、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻（４～５号）：４８９～４９８頁においても説明されている。
本明細書に開示されるとおりの抗体断片、抗原結合断片およびポリペプチドは、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれるがそれらに限定されない公知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。精製にはまた、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も用いることができる。
本開示の抗体断片、抗原結合断片または の調製のための抗体には、天然の精製産生物、化学合成手順の産生物、ならびに、例えば、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含めた真核生物宿主に由来する組換え法、または、代替的に、上記で説明した原核生物宿主に由来する組換え法を介して産生される産生物が含まれる。ＢｉｒｃｈおよびＲａｄｎｅｒ（２００６年）、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、５８巻：６７１～６８５頁では、多くの抗体産生系が説明されている。
被験抗体断片が、タンパク質またはポリペプチドと結合すれば、被験抗体断片と本開示により提供される（sprovided）抗体断片とは等価である。また、本開示の抗体断片が、
抗体断片が通常反応性であるタンパク質またはポリペプチドに結合することを、被験抗体が妨げるかどうかを決定することにより、ある抗体断片が、本明細書に開示される抗体断片と同じ特異性を有するかどうかを、過度の実験なしに決定することも可能である。本明細書に開示される抗体断片による結合の低下により示される通り、被験抗体断片が、本明細書に開示される抗体断片と競合する場合は、２つの抗体断片が、同じエピトープまたは近縁のエピトープに結合する可能性がある。代替的に、本明細書に開示される抗体断片を、それが通常反応性であるタンパク質と共にプレインキュベートして、被験抗体断片が、抗原に結合するその能力を阻害されるかどうかを決定することができる。被験抗体断片が阻害されれば、この抗体は、ほぼ確実に、本明細書に開示される抗体断片と同じエピトープ特異性または近縁のエピトープ特異性を有する。
「抗体」および「抗体断片」という用語はまた、全ての免疫グロブリンアイソタイプおよび免疫グロブリンサブクラスの抗体を包含することも意図する。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、最初の融合体から選択することにより直接調製することもでき、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：８６５３頁、またはＳｐｉｒａら（１９８４年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、７４巻：３０７頁において説明されている手順を用いてクラススイッチ改変体を単離するためのｓｉｂ選択法を用いることにより、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することもできる。代替的に、組換えＤＮＡ法も用いることができる。
また、本明細書で説明されるモノクローナル抗体の特異性を伴う抗体断片、抗原結合断片およびポリペプチドを作製する際に使用するための他のモノクローナル抗体の単離も、抗イディオタイプ抗体を産生することを介して、当業者により達成され得る（Ｈｅｒｌｙｎら（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：１００頁）。抗イディオタイプ抗体とは、目的のモノクローナル抗体において存在する固有の決定基を認識する抗体である。
本明細書に開示される一部の態様では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを検出可能に、または治療的に標識することが有用である。適切な標識については、本明細書に記載されている。当技術分野では、抗体およびポリペプチドを、これらの作用剤とコンジュゲートする方法が公知である。例示だけを目的として述べると、例えば、放射性原子、発色団、フルオロフォアなどの検出可能な部分で抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを標識することができる。このような標識抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたは単離された被験試料のいずれかにおける診断技法に用いることができる。
抗体、断片およびポリペプチドを、低分子量のハプテンにカップリングすることにより、アッセイにおける抗体 断片またはポリペプチドの感度を増大させることができる。次いで、第２の反応により、ハプテンを特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特定の抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェノール、ピリドキサール、およびフルオレセインなどのハプテンを用いることが一般的である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、前出を参照されたい。
ＶＨ ＣＤＲ １領域および／もしくはＶＬ ＣＤＲ １領域、ＶＨ ＣＤＲ ２領域および／もしくはＶＬ ＣＤＲ ２領域、ならびに／またはＶＨ ＣＤＲ ３領域および／もしくはＶＬ ＣＤＲ ３領域内のアミノ酸残基を変異させて、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することにより、本開示の親抗体の可変領域を修飾することができる。変異は、部位指向性変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発を介して導入することができ、抗体の結合または目的の他の機能的特性に対する効果は、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて評価することができる。ある特定の実施形態では、保存的修飾を導入し、典型的にＣＤＲ領域内の１、２、３、４、または５つ以下の残基を変化させる。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であり得る。
例えば、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列の配列へと「復帰変異」させることにより、抗体にフレームワーク修飾を施し、免疫原性を低下させることができる。
加えて、本明細書に開示される抗体断片、抗原結合断片またはポリペプチドを操作して、Ｆｃ領域内に、血清半減期（ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｆｉｆｅ）、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞傷害作用など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を変化させる修飾を包含させることもできる。このような修飾には、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易にする、または抗体の安定性を増大させる、もしくは減少させる、ヒンジ領域におけるシステイン残基数の変化（米国特許第５，６７７，４２５号）、ならびに抗体の生物学的半減期を短縮する、Ｆｃヒンジ領域におけるアミノ酸の変異（米国特許第６，１６５，７４５号）が含まれるがそれらに限定されない。
加えて、本明細書に開示される抗体断片は、化学修飾することもできる。例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を修飾して、抗原に対する抗体の親和性を増大させることにより、抗体のグリコシル化を変化させることができる（米国特許第５，７１４，３５０号；および同第６，３５０，８６１号）。代替的に、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を増大させるには、グリコシル化機構を変化させた宿主細胞内で抗体を発現させることにより、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体、またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体を得ることもできる（Ｓｈｉｅｌｄｓら、（２００２年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７７巻：２６７３３～２６７４０頁；Ｕｍａｎａら、１９９９年、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻：１７６～１８０頁）。
本明細書に開示される抗体またはその断片を、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基がこの抗体または抗体断片に結合する条件下で、ＰＥＧまたはＰＥＧの反応性エステルもしくはＰＥＧのアルデヒド誘導体と反応させることにより、これらの抗体断片、抗原結合断片またはポリペプチドをペグ化して、生物学的半減期を延長することができる。ペグ化は、反応性のＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施することができる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意図する。ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体であり得る。当技術分野では、タンパク質をペグ化する方法が公知であり、本明細書に開示される抗体に適用することができる（ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４）。
加えて、抗原結合領域を、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質とコンジュゲートする、または融合させることにより、抗体結合断片、抗原結合断片またはポリペプチドを化学修飾して、結果として得られる分子の半減期を延長することもできる。このような手法は、例えば、ＥＰ０３２２０９４およびＥＰ０４８６５２５において説明されている。
本明細書に開示されるとおりの抗体断片、抗原結合断片またはポリペプチドを、診断薬とコンジュゲートして診断に用い、例えば、疾患の発症または増悪をモニタリングし、所与の処置レジメンの有効性を決定することができる。診断薬の例には、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、各種の陽電子放射トモグラフィーを用いる陽電子放出性金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、抗体またはその断片に直接的にカップリングまたはコンジュゲートすることもでき、当技術分野で公知の技法を用いるリンカーを介して、抗体またはその断片に間接的に連結またはコンジュゲートすることもできる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれる。発光材料の例には、ルミノールが含まれる。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、インジウム１１１、ルテチウム１７１、ビスマス２１２、ビスマス２１３、アスタチン２１１、銅６２、銅６４、銅６７、イットリウム９０、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、リン３２、リン３３、スカンジウム４７、銀１１１、ガリウム６７、プラセオジム１４２、サマリウム１５３、テルビウム１６１、ジスプロシウム１６６、ホルミウム１６６、レニウム１８６、レニウム１８８、レニウム１８９、鉛２１２、ラジウム２２３、アクチニウム２２５、鉄５９、セレン７５、ヒ素７７、ストロンチウム８９、モリブデン９９、ロジウム１１０５、パラジウム１０９、プラセオジム１４３、プロメチウム１４９、エルビウム１６９、イリジウム１９４、金１９８、金１９９、および鉛２１１が含まれる。モノクローナル抗体は、これらの抗体に共有結合する二官能性のキレート化剤を用いることにより、放射性金属イオンと間接的にコンジュゲートすることができる。キレート化剤は、アミン（ａｍｉｔｉｅｓ）（Ｍｅａｒｅｓら、（１９８４年）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４２巻：６８～７８頁）、アミノ酸残基のスルフヒドラール基（Ｋｏｙａｍａ（１９９４年）Ｃｈｅｍ． Ａｂｓｔｒ．、１２０巻：２１７２６２ｔ）、および炭水化物基（Ｒｏｄｗｅｌｌら、（１９８６年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８３巻：２６３２～２６３６頁；Ｑｕａｄｒｉら、（１９９３年）、Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．、２０巻：５５９～５７０頁）を介して結合させることができる。
さらに、本開示の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、治療薬とコンジュゲートすることもできる。適切な治療薬には、抗生物質または例えば、抗微生物薬、または宿主防御ペプチド（例えば、特異的にターゲティングされた抗微生物ペプチド（ＳＴＡＭＰ））が含まれる。
追加的な適切なコンジュゲートされた分子には、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ分子などの阻害性ＲＮＡ分子、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列が含まれる。アプタマーとは、ステムループまたはＧカルテットなど、規定の二次構造および三次構造へとフォールディングされる、１５～５０塩基の範囲の長さの小型核酸であり、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小分子のほか、逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの大型分子にも結合し得る。リボザイムとは、化学反応を分子内的にまたは分子間的に触媒することが可能な核酸分子である。リボザイムは、その後に切断される標的基質を認識し、それに結合することにより、核酸基質を切断することが典型的である。三重鎖形成機能を有する核酸分子は、三重鎖を形成することにより二本鎖核酸と相互作用する場合もあり、一本鎖核酸と相互作用する場合もあり、この場合、ＤＮＡの三本鎖は、ワトソン－クリックによる塩基対合およびフーグスティーンによる塩基対合の両方に依存して複合体を形成する。三重鎖分子は、高度な親和性および特異性により、標的領域と結合し得る。適切なコンジュゲート分子は、バイオフィルムアーキテクチャーを生み出しもも安定化もせず、このようなタンパク質の少なくともサブセットが、本明細書で開示される作用剤についての結合の動態を促進し得ると想定されるという条件で、ＤＮＡに結合する、任意のタンパク質をさらに含み得る。
機能性核酸分子は、標的分子により保有される特異的活性のエフェクター、阻害剤、調節剤、および刺激剤として作用する場合もあり、他の分子には依存しない新規の活性を保有する場合もある。
利用可能な多数の方法のうちのいずれかを用いて、治療薬を、直接的にまたは間接的に、断片またはポリペプチドに連結することができる。例えば、作用剤を、還元した抗体成分のヒンジ領域に、Ｎ－スクシニル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの架橋形成剤を用いるジスルフィド結合形成を介して結合させることもでき、抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して結合させることもできる（Ｙｕら（１９９４年）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、５６巻：２４４頁；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」内の「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｂｉｒｃｈら（編）、１８７～２３０頁（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９５年）；Ｐｒｉｃｅ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」内の「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、６０～８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年））。
治療薬を抗体および抗体断片とコンジュゲートする技法は、周知である（Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」内の「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３～５６頁（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、１９８５年）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（２版）内の「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３～５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」内の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５～５０６頁（１９８５年）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ」内の「Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３～１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）；およびＴｈｏｒｐｅら（１９８２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、６２巻：１１９～５８頁）。
断片またはポリペプチドは、別の抗体または受容体のリガンドなど、別の機能性分子に連結して、少なくとも２種以上の異なる結合部位または標的分子に結合する、二重特異性分子または多特異性分子を産生することができる。抗体を、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体など、１種または複数種の他の結合分子に連結することは、例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合的会合を介して行うことができる。多特異性分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに包含し得る。
当技術分野で公知の方法を用いて、二重特異性分子および多特異性分子を調製することができる。例えば、二重特異性分子（ｈｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の各結合単位を個別に産生し、次いで、これらを互いとコンジュゲートすることができる。結合分子がタンパク質またはペプチドである場合は、各種のカップリング剤または架橋形成剤を、共有結合的コンジュゲーションに用いることができる。架橋形成剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（２－ｎｉｔｒｏｂｅｒｉｚｏｉｃ ａｃｉｄ））（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－Ｉ－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら（１９８４年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６０巻：１６８６頁；Ｌｉｕら（１９８５年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：８６４８頁）が含まれる。結合分子が抗体である場合は、２つの重鎖のＣ末端のヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることにより、それらをコンジュゲートすることができる。
本明細書に開示されるとおりの抗体断片、抗原結合断片またはポリペプチドはまた、固体支持体に結合させることもでき、これはイムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれるがそれらに限定されない。
抗体断片、抗原結合断片またはポリペプチドはまた、多くの異なるキャリアにも結合させることができる。したがって、本開示はまた、抗原またはポリペプチドおよび活性または不活性な別の物質を含有する組成物も提供する。周知のキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。キャリアの性質は、本明細書に開示される目的に応じて、可溶性の場合もあり、不溶性の場合もある。当業者は、モノクローナル抗体を結合させるのに適する他のキャリアについても承知している、または日常的な実験を用いて、このようなキャリアを確認し得るであろう。
上記の実施形態のうち１つまたは複数を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組成物が、本明細書においてさらに提供される。抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのほか、断片およびポリペプチドを組換えにより産生するまたは化学合成する方法もさらに提供される。抗体ポリペプチドおよび断片は、真核細胞においてまたは原核細胞において産生することもでき、当技術分野で公知であり、本明細書でも略述される、他の方法により産生することもできる。
本明細書に開示される断片を含む断片および単離されたポリペプチドは、それらが、バイオフィルムに対する、高レベルのエピトープ結合特異性および高結合親和性を有するように選択することができる。一般に、抗体または抗体断片または抗体断片を含む単離されたポリペプチドの結合親和性が大きいほど、イムノアッセイにおいて、よりストリンジェントな洗浄条件を実施して、標的を除去せずに、非特異的に結合した物質を除去することができる。したがって、開示される方法において有用な本技術の抗体断片を含む断片および単離されたポリペプチドは通例、少なくとも１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、または１０－１２Ｍの結合親和性を有する。ある特定の態様では、抗体断片を含む断片および単離されたポリペプチドは、標準的な条件下、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分間で、平衡に達するのに十分な動力学的結合速度（kinetic on-rate）を有する。別の態様では、抗体または抗原結合性断片の親和性は、１０００ピコモル（ｐＭ）未満または約１０００ピコモル（ｐＭ）、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、もしくは約１０ｐＭ、もしくは約９ｐＭ、もしくは約８ｐＭ、もしくは代替的に、約４ｐＭ未満、もしくは代替的に、約２ｐＭ未満である。
上記の実施形態のいずれにおいても、本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片、またはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にペプチドリンカーを付加することができる。「リンカー」または「ペプチドリンカー」とは、ポリペプチド配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結したペプチド配列を指す。一態様では、リンカーは、約１アミノ酸残基から約２０アミノ酸残基までの長さ、またはあるいは２アミノ酸残基から約１０アミノ酸残基まで、約３アミノ酸残基から約５アミノ酸残基までの長さである。ペプチドリンカーの例は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（配列番号４３）である。他の例は、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号４４）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ（配列番号４５）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号４６）；Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号４７）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号４８）、およびＳｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（配列番号４９）を含む。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本明細書ではさらに、上記で言及した抗体断片、抗原結合性断片およびポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、ならびにそれらを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびに、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される組換え細胞系を使用して、ポリペプチドを組換えにより産生するための方法も提供される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである場合も、ＲＮＡである場合もある。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの組換え再生（recombinant reproduction）および／またはポリペプチド（polyepeptides）の組換え産生のために、調節配列、プロモーター、エンハンサーなどに作動的に連結することができる。ポリヌクレオチドを、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）に挿入することができ、また組換え再生または発現のために適当な宿主細胞（真核生物または原核生物）中に挿入することができる。したがって、宿主細胞をポリヌクレオチドの発現のための条件下で培養することによって、抗体断片またはポリペプチドを組換えによって産生することができる。一態様では、ポリペプチドは、細胞または培養培地から単離される。また、本出願によって、診断法において使用するための、検出可能な作用剤にコンジュゲートされた本明細書に記載のポリヌクレオチドも提供される。
単離されたまたは組換えのポリヌクレオチドを含むベクターまたは抗体がさらに提供され、その例は当技術分野では公知であり本明細書では手短に記載されている。１つよりも多い単離されたまたは組換えポリヌクレオチドが単一ユニットとして発現されることになる一態様では、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドはポリシストロン性ベクター内に含有され得る。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡであり得る。
本開示はさらに、ＲＮＡ転写のプロモーター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一過性発現もしくは安定的発現のための他の調節配列に作動可能に連結した、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチドも提供する。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、プロモーターが、ＤＮＡ分子からＲＮＡの転写を導くように位置づけられていることを意味する。このようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、およびＴ７である。ある特定の実施形態では、挿入されたポリヌクレオチドを細胞特異的に発現させるために、細胞特異的なプロモーターを使用する。当技術分野では、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーを、終結コドンおよび選択マーカー配列、ならびに、挿入されるＤＮＡの小片をそのプロモーターに作動可能に連結しうるクローニング部位と共に含有するベクターが公知であり、市販されている。一般的な方法およびクローニング戦略については、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９１年））およびそこで引用されている参照文献、ならびに種々の適切なベクターについてのマップ、機能的特性、販売元、およびＧｅｎＥＭＢＬ受託番号の参照を含有する、「Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｉｅｓ」（ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４年））を参照されたい。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに由来するポリヌクレオチドでは、本明細書で記載される、診断的有用性および治療的有用性を有するポリペプチドまたはタンパク質、ならびに、存在する場合もあり、存在しない場合もある、タンパク質の転写物を同定するためのプローブをコードする。これらの核酸断片は、例えば、より大型のポリヌクレオチドを制限酵素消化することにより調製することができ、次いで、検出可能なマーカーで標識することができる。代替的に、分子のニックトランスレーションを使用してランダムな断片を生成させることもできる。そのような断片を調製および標識するための方法については、Sambrookら（１９８９年）、前出を参照されたい。
これらの核酸を含有する発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を得るために有用である。これらの発現ベクターは宿主生物体において、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な一部として複製可能でなければならないことが示されている。適切な発現ベクターの非限定的な例は、プラスミド、酵母ベクター、ウイルスベクターおよびリポソームを含む。アデノウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても発現が高レベルであり、細胞を効率的に形質転換するため、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、遺伝子を組織に導入するために特に有用である。核酸を、適切な宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞および宿主細胞複製物に挿入する場合、タンパク質は、組換えによって産生することができる。適切な宿主細胞はベクターに依存し、公知の方法を使用して構築した哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含みうる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出を参照されたい。外因性の核酸を細胞に挿入するためのウイルスベクターの使用に加えて、核酸は、細菌細胞のための形質転換；哺乳動物細胞のための、リン酸カルシウム沈降を使用したトランスフェクション；またはＤＥＡＥ－デキストラン；電気穿孔；またはマイクロインジェクションなど、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞に挿入することができる。方法についてはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出を参照されたい。したがって、本開示は、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞、または細菌細胞などの原核細胞も提供する。
ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、修飾されたヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリヌクレオチドの組立ての前に付与することもでき、組立ての後で付与することもできる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識化構成成分とコンジュゲートすることなどにより、さらに修飾することもできる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。そうでないことが指定または要請されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書で開示される任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を成すことが公知である、または予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。
本開示はまた、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含有し、かつ／または発現させる、遺伝子改変された細胞も提供する。遺伝子改変された細胞は、プロモーターまたは遺伝子活性化因子など、上流の調節配列を挿入することにより産生することができる（米国特許第５，７３３，７６１号を参照されたい）。
ポリヌクレオチドは、細胞中での核酸および／または遺伝子の発現の検出のために、検出可能マーカー、例えば、酵素標識または放射性同位元素にコンジュゲートすることが可能である。当技術分野では、検出可能なシグナルを生じることができる蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド、またはアビジン／ビオチンなど、他のリガンドを含む、多種多様な適切な検出可能なマーカーが公知である。一態様では、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識、またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを使用することが所望される可能性が高い。酵素タグの場合、熱量測定的指示基質を利用して、相補的な核酸含有試料との特異的なハイブリダイゼーションを同定するための、目視可能な手段または分光光度的に検出可能な手段をもたらすことができる。したがって、本開示はさらに、標的の一本鎖ポリヌクレオチドを、本明細書で開示されるポリヌクレオチドの一部である、標識化された一本鎖のポリヌクレオチド（プローブ）と、相補的な一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能になる条件下で（任意選択で、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）、または任意選択で、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させることにより、一本鎖ポリヌクレオチドまたはその相補物を検出するための方法も提供する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、ハイブリダイズしなかった一本鎖ポリヌクレオチドから分離する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、当業者に公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出に明示されている方法を使用して検出する。
本開示において具体化されるポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング法、ＰＣＲ、またはこれらの任意の組合せを用いて得ることができる。当技術分野では、化学的なポリヌクレオチド合成法が公知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、ＤＮＡ合成機を利用することにより、または市販のサービスを依頼することにより、所望のポリヌクレオチドを得るのに、本明細書で提供される配列データを使用することができる。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ＰＣＲを使用して単離または複製することができる。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，７５４，０６５号；および同第４，６８３，２０２号の主題であり、「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９．４年））またはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１年）および（１９９５年）、前出、ならびにそこに引用されている参考文献において記載されている。代替的に、当業者は、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して、ＤＮＡを複製することもできる。したがって、本開示はまた、ポリヌクレオチドの直鎖状配列、ヌクレオチド、適切なプライマー分子、酵素などの化学物質、およびそれらを複製するための指示をもたらし、ポリヌクレオチドを得るように、ヌクレオチドを、適切な方向に化学的に複製または連結することにより、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを得るためのプロセスも提供する。別の実施形態では、これらのポリヌクレオチドをさらに単離する。なおさらに、当業者は、複製し、増幅するために、ポリヌクレオチドを適切な複製ベクターに挿入し、そのベクターを適切な宿主細胞（原核細胞または真核細胞）に挿入することができる。こうして増幅されたＤＮＡは、当業者に公知の方法により、細胞から単離することができる。本明細書では、この方法によりポリヌクレオチドを得るためのプロセス、ならびにこうして得られたポリヌクレオチドもさらに提供される。
ＲＮＡは、まず、ＤＮＡポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞に挿入することにより得ることができる。ＤＮＡは、任意の適切な方法により、例えば、適切な遺伝子送達ビヒクル（例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター）を使用することにより送達することもでき、電気穿孔により送達することもできる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡに転写されたら、次いで、当業者に公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出において明示されている方法を使用して、ＲＮＡを単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出において明示されている手順に従い、種々の溶菌酵素または化学溶液を使用して単離することもでき、製造者によって提供される添付の説明書に従い、核酸結合性樹脂により抽出することもできる。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対する配列相補性または配列相同性を示すポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして、または本明細書で同定される特異的なポリヌクレオチドの等価物として有用である。転写物の完全なコード配列は公知であるので、この配列または相同な配列の任意の部分を、本明細書で開示される方法において用いることができる。
当技術分野では、特異的なハイブリダイゼーションのために、「完全に一致する」プローブは必要とされないことが公知である。少数の塩基の置換、欠失、または挿入により達成される、プローブ配列の軽微な変化は、ハイブリダイゼーションの特異性に影響を及ぼさない。一般に、２０％程度の塩基対のミスマッチ（最適にアラインメントした場合）が容認されうる。一部の実施形態では、前述のｍＲＮＡを検出するために有用なプローブは、相同領域と少なくとも約８０％同一である。一部の実施形態では、プローブは、相同な領域とアラインメントした後で、対応する遺伝子配列と８５％同一であり、一部の実施形態では、プローブは９０％の同一性を示す。
これらのプローブをラジオアッセイ（例えば、サザンブロット分析およびノーザンブロット分析）において使用して、これらの細胞を含有する種々の細胞または組織を検出、予後診断、診断、またはモニタリングすることができる。プローブはまた、本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するためのハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用するために、チップなどの固体支持体またはアレイに付着させることもできる。したがって、本開示は、ハイスループットスクリーニングにおいて使用するために固体支持体に付着させた、本明細書で開示されるポリヌクレオチド、またはその等価物、またはその相補物、またはその断片を含む、またはそれに対応するプローブも提供する。
断片の全体のサイズ、ならびに相補的なストレッチのサイズは、特定の核酸セグメントの、意図される使用または適用に依存する。より小型の断片は、一般に、ハイブリダイゼーションの実施形態において使用され、相補領域の長さは、少なくとも５～１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間など、変動する場合もあり、なおまたは、検出することが望まれる相補配列に従い、全長の場合もある。
ハイブリッドの安定性および選択性を増大させ、これにより、得られる特定のハイブリッド分子の特異性を改善するために、５ヌクレオチド超から１０ヌクレオチドの長さのストレッチにわたる相補配列を有するヌクレオチドプローブが一般に好適である。ある特定の実施形態では、１０ヌクレオチドもしくはこれを超える長さ、または５０ヌクレオチドを超える長さの遺伝子相補的ストレッチ、あるいは、所望の場合、さらに長い遺伝子相補的ストレッチを有するポリヌクレオチドを設計することができる。このような断片は、例えば、化学的手段を介して、断片を直接合成することによりたやすく調製することもでき、米国特許第４，６０３，１０２号において記載されている、２つのプライミングオリゴヌクレオチドを伴うＰＣＲ技術などの核酸複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）技術を適用することによりたやすく調製することもでき、組換えによる産生のために、選択された配列を、組換えベクターに導入することによりたやすく調製することもできる。一態様では、プローブは、約５０～７５ヌクレオチドもしくはこれを超える長さ、代替的に、５０～１００ヌクレオチドの長さである。
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される細胞において発現させる遺伝子または遺伝子転写物を検出するためのプライマーとして用いられうる。この文脈では、増幅とは、標的配列を妥当な忠実度で複製すること（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ができるプライマー依存性のポリメラーゼを利用する、任意の方法を意味する。増幅は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素などの、天然ＤＮＡポリメラーゼまたは組換えＤＮＡポリメラーゼにより行うことができる。例示だけを目的として、プライマーは、プローブについて同定された長さと同じ長さである。
ポリヌクレオチドを増幅するための１つの方法はＰＣＲであり、ＰＣＲ増幅のためのキットは市販されている。増幅後、結果として得られるＤＮＡ断片は、当技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、アガロースゲル電気泳動、その後の臭化エチジウム染色および紫外線照射を伴う視覚化により検出することができる。
有効量の遺伝子送達ベクターまたはビヒクルを細胞に投与するための方法が開発されており、当業者に公知であり、本明細書に記載される。当技術分野では、細胞における遺伝子発現を検出するための方法が公知であり、ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイおよびノーザンブロット分析などの技法を含む。このような方法は、細胞における遺伝子の発現を検出し、定量化するために有用である。代替的に、コードされるポリペプチドの発現は、種々の方法によって検出することもできる。特に、標的ポリペプチドと特異的に反応性である、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製することが有用である。このような抗体は、例えば、免疫組織学法、ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンブロット法などの技法を使用して、ポリペプチドを発現させる細胞を視覚化するために有用である。これらの技法を使用して、発現させたポリヌクレオチドの発現レベルを決定することができる。
上記で注記したとおり、抗体、抗体断片、タンパク質およびポリペプチドは、当業者に公知の、多数のプロセスによって得られ、これらのプロセスは、精製、化学合成、および組換え法を含む。ポリペプチドは、宿主細胞株などの調製物から、抗体を伴う免疫沈降などの方法、ならびにゲル濾過、イオン交換、逆相、および親和性クロマトグラフィーなどの標準的な技法により単離することができる。このような方法については、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら（１９９９年）、「Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。したがって、本開示はまた、これらのポリペプチドを得るためのプロセス、ならびにこれらのプロセスにより得ることができる生成物および得られる生成物も提供する。
ポリペプチドはまた、Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、モデル４３０Ａまたは４３１Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡにより製造された自動ペプチド合成機など、市販の自動ペプチド合成機を使用する化学合成によっても得ることができる。合成されたポリペプチドは、沈殿させ、さらに、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することができる。したがって、本開示はまた、アミノ酸および酵素など、タンパク質の配列および試薬を提供し、アミノ酸を、適切な方向および直鎖状配列に、併せて連結することにより、本明細書で開示されるタンパク質を化学的に合成するためのプロセスも提供する。
組成物
組成物がさらに提供される。組成物は、キャリアと、本明細書に開示される抗体断片または抗原結合性断片または単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、小分子、抗体または本明細書に開示される抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）のうちの１つまたは複数とを含む。キャリアは、固体支持体または薬学的に許容されるキャリアのうちの１つまたは複数であり得る。組成物は、ワクチンとしての投与に適するアジュバントまたは他の成分をさらに含み得る。一態様では、組成物を、１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリア、および／またはアジュバントと共に製剤化する。加えて、本開示の組成物についての実施形態は、１種または複数種の薬学的に許容される物質と共に製剤化された、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、小分子、本明細書に開示される単離された宿主細胞、抗体または本開示の抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）のうちの１つまたは複数を含む。
経口調製物の場合、本明細書で説明される単離されたもしくは組換え型のポリペプチド、本明細書で説明される単離されたもしくは組換え型のポリヌクレオチド、本明細書で説明されるベクター、本明細書で説明されるとおりの単離された宿主細胞、小分子、または本明細書で説明される抗体のうちの任意の１つまたは複数を、単独で用いることもでき、錠剤、粉末、顆粒、またはカプセルを作製するのに適切な添加剤と組み合わせた化合物、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、またはバレイショデンプンなど、従来の添加剤；微晶質セルロース（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、セルロース誘導体、アカシアガム、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ならびに、所望の場合は、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、および矯味矯臭剤と組み合わせた化合物を含む、またはこの化合物から本質的になる本明細書に開示される医薬処方物中で用いることもできる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として組み入れることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物：微晶質セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド性二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの矯味矯臭剤のうちのいずれかを含有し得る。
経口投与に適する医薬処方物および単位用量形態は、慢性状態、感染症の処置、および患者が薬物を自己投与する療法において特に有用である。一態様では、処方物が、小児科投与に特異的である。
本開示は、医薬製剤を提供し、これでは、本明細書に各々開示される抗体断片、抗原結合性ドメイン、単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数を、水性溶媒、あるいは植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪族系酸グリセリド、高級脂肪族系酸のエステル、またはプロピレングリコールなどの非水性溶媒中で、かつ、所望の場合は、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤（例えば、アラビアガム、アルギン酸およびアルギン酸ナトリウム）および保存剤、または他の抗微生物薬など、従来の添加剤と共に、溶解させる、懸濁させる、または乳化させることにより、本開示に従い注射用の調製物へと製剤化する。このようなものの非限定的な例は、表面抗原、例えば、ＯＭＰ Ｐ５、ＯＭＰ ２６、ＯＭＰ Ｐ２、またはワクチン成分、例えば、ＩＶ型ピリンタンパク質（JurcisekおよびBakaletz（２００７年）、J. of Bacteriology、１８９巻（１０号）：３８６８～３８７５頁；ならびにMurphy, T.F.ら（２００９年）、The Pediatric Infectious Disease Journal、２８巻：Ｓ１２１～Ｓ１２６頁を参照されたい）および抗微生物薬など、他の
ワクチン成分に対する抗体である別の治療剤である。静脈内投与のために、適切なキャリアには、生理学的静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合にも、非経口投与のための組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性（syringability）が存在する程度の流体であるべきである。
本開示により提供されるエアゾール処方物は、吸入を介して投与することができ、噴霧体に基づく場合もあり、非噴霧体に基づく場合もある。例えば、本明細書に開示される医薬処方物の実施形態は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など、加圧された許容可能な噴霧体へと処方される本明細書に開示される化合物を含む。吸入投与の場合、化合物は、適切な噴霧体、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくは分注器、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で送達することができる。非噴霧体の非限定的な例は、機械的な力により（すなわち、指でピストンを押し下げる、または容器の壁面に適用される圧縮力、または壁面自体により加えられる弾性力（例えば、弾性の袋（ｂｌａｄｄｅｒ）を介する）などを介する容器の圧縮により）閉鎖容器から駆出されるポンプスプレーである。
本明細書に開示される坐剤は、本明細書に開示される化合物を、乳化基剤または水溶性基剤など、各種の基剤のうちのいずれかと混合することにより調製することができる。本明細書に開示される化合物によるこの医薬処方物についての実施形態は、坐剤を介して直腸に投与することができる。坐剤は、体温では溶融するが、室温では固化するココアバター、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなどのビヒクルを包含し得る。
シロップ、エリキシル、および懸濁物など、経口投与または直腸投与のための単位剤形を提供することが可能であり、各用量単位、例えば、茶さじ１杯分、料理用スプーン１杯分、錠剤、または坐剤は、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物を含有する所定量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、または薬学的に許容される別のキャリア中の溶液としての組成物中に本明細書に開示される化合物を含み得る。
本明細書に開示される医薬処方物についての実施形態は、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本開示で用いられる小分子、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数が、注射用組成物へと処方される医薬処方物を包含する。本明細書に開示される注射用医薬処方物は、溶液または懸濁物として調製される、または注射前に液体のビヒクル中で溶解または懸濁させるのに適する固体形態として調製される。調製物はまた、本明細書に開示される医薬処方物についての他の実施形態に従い、乳化させることもでき、有効成分をリポソームビヒクル中に封入することもできる。
ある実施形態では、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、本明細書に開示される抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合）断片）のうちの１つまたは複数を、持続送達系を介する送達のために処方する。本明細書では、「持続送達系」という用語を、「制御送達系」と互換的に用い、それらのうちの多種多様なデバイスが当技術分野において公知である、カテーテル、注射デバイスなどと組み合わせた持続（例えば、制御）送達デバイス（例えば、ポンプ）を包含する。
機械的注入ポンプまたは電気機械的注入ポンプもまた、本開示と共に用いるのに適する場合がある。このようなデバイスの例には、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号；同第５，８２０，５８９号；同第５，６４３，２０７号；同第６，１９８，９６６号などで説明されているデバイスが含まれる。一般に、本明細書に開示される化合物の送達は、各種の再充填可能なポンプシステムのうちのいずれかを用いて達成することができる。ポンプは、ある時間にわたり、一定の制御放出をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に開示される化合物が、薬物不透過性レザバ内の液体処方物であり、個体に持続的に送達される。
一実施形態では、薬物送達系が、少なくとも部分的に植え込み式のデバイスである。植え込み式デバイスは、当技術分野で周知の方法およびデバイスを用いて、任意の適切な植え込み部位において植え込むことができる。植え込み部位は、薬物送達デバイスが導入および配置される、対象の体内の部位である。植え込み部位には、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ、ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）部位、筋肉内部位または対象の体内の他の適切な部位が含まれるが必ずしもそれらに限定されない。一部の実施形態では、薬物送達デバイスの植え込みおよび除去が簡便であるため、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）の植え込み部位を用いる。
本開示で用いるのに適する薬物放出デバイスは、各種の作動方式のうちのいずれかに基づき得る。例えば、薬物放出デバイスは、拡散システムに基づく場合もあり、対流システムに基づく場合もあり、浸食システム（例えば浸食ベースのシステム）に基づく場合もある。例えば、薬物放出デバイスは、電気化学式ポンプ、浸透圧ポンプ、電気浸透圧ポンプ、蒸気圧ポンプ、または浸透圧バーストマトリックス（ｏｓｍｏｔｉｃ ｂｕｒｓｔｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）であることが可能であり、例えば、薬物をポリマー中に組み込み、このポリマーが、薬物含浸性ポリマー材料（例えば、生体分解性の薬物含浸性ポリマー材料）の分解と共時的に薬物処方物を放出するポンプであり得る。他の実施形態では、薬物放出デバイスが、電気拡散システム、電気溶解式ポンプ、気泡ポンプ、圧電ポンプ、加水分解システムなどに基づく。
機械的注入ポンプまたは電気機械的注入ポンプに基づく薬物放出デバイスもまた、本開示と共に用いるのに適する場合がある。このようなデバイスの例には、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号などで説明されているデバイスが含まれる。一般に、対象の処置法は、各種の再充填可能な非交換型ポンプシステムのうちのいずれかを用いて達成することができる。ポンプおよび他の対流システムは、それらの、ある時間にわたる一般に一定である程度の高い制御放出のために、利用され得る。一部の実施形態では、浸透圧ポンプが、一定である程度の高い制御放出と比較的小型のサイズとを組み合わせた利点のために用いられる（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ ９７／２７８４０号；ならびに米国特許第５，９８５，３０５号および同第５，７２８，３９６号を参照されたい）。本開示で用いるのに適する例示的な浸透圧駆動式デバイスには、米国特許第３，７６０，９８４号；同第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，９２３，４２６号；同第３，９８７，７９０号；同第３，９９５，６３１号；同第３，９１６，８９９号；同第４，０１６，８８０号；同第４，０３６，２２８号；同第４，１１１，２０２号；同第４，１１１，２０３号；同第４，２０３，４４０号；同第４，２０３，４４２号；同第４，２１０，１３９号；同第４，３２７，７２５号；同第４，６２７，８５０号；同第４，８６５，８４５号；同第５，０５７，３１８号；同第５，０５９，４２３号；同第５，１１２，６１４号；同第５，１３７，７２７号；同第５，２３４，６９２号；同第５，２３４，６９３号；同第５，７２８，３９６号などにおいて説明されているデバイスが含まれるが必ずしもそれらに限定されない。本開示に適合させ得るさらなる例示的なデバイスは、Ｓｙｎｃｈｒｏｍｅｄ注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）である。
一部の実施形態では、薬物送達デバイスが、植え込み式デバイスである。薬物送達デバイスは、当技術分野で周知の方法およびデバイスを用いて、任意の適切な植え込み部位において植え込むことができる。本明細書で言及される通り、植え込み部位は、薬物送達デバイスが導入および配置される、対象の体内の部位である。植え込み部位には、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ、ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｏｓ）部位、筋肉内部位または対象の体内の他の適切な部位が含まれるが必ずしもそれらに限定されない。
本明細書に開示される化合物に適する賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せである。加えて、所望の場合、ビヒクルは、湿潤剤、または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤など、微量の補助物質も含有し得る。本開示について考慮するとき、当業者には、このような剤形を調製する方法が公知である、または明らかであろう。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、１７版、１９８５年を参照されたい。いずれにせよ、投与される組成物または処方物は、処置される対象において所望の状態を達成するのに十分な量の化合物を含有する。
本開示の組成物には、持続放出マトリックスまたは制御放出マトリックスを含む組成物が含まれる。加えて、本開示の実施形態は、持続放出処方物を用いる他の処置と共に用いることもできる。本明細書で用いられる持続放出マトリックスとは、通常はポリマーである、酵素的加水分解もしくは酸ベースの加水分解、または溶解を介して分解可能な材料から作製されるマトリックスである。体内に挿入されると、マトリックスは、酵素および体液により作用を受ける。持続放出マトリックスは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｔａｎｉｎｅ）、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコーンなどの生体適合性材料から選択することが望ましい。例示的な生体分解性マトリックスには、ポリラクチドマトリックス、ポリグリコリドマトリックス、およびポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）マトリックスが含まれる。
別の実施形態では、制御放出系により抗体断片（ならびに組合せ組成物）を送達する。例えば、本明細書に開示される化合物は、静脈内注入、植え込み式浸透圧ポンプ、経皮的パッチ、リポソーム、または他の投与方式を用いて投与することができる。一実施形態では、ポンプを用いることができる（Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７年）、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ．、１４巻：２０１頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら（１９８０年）、Ｓｕｒｇｅｒｙ、８８巻：５０７頁；Ｓａｕｄｅｋら（１９８９年）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３２１巻：５７４頁）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いる。さらに別の実施形態では、制御放出系を、治療標的、すなわち、肝臓の近傍に配置し、それにより、全身用量の一部しか必要としない。さらに別の実施形態では、制御放出系を、治療標的の近傍に配置し、それにより、全身用量の一部しか必要としない。他の制御放出系については、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１５２７～１５３３頁により総説されている。
別の実施形態では、本開示の組成物（ならびに個別または一体の組合せ組成物）に、本明細書で説明される阻害剤を縫合糸、包帯、およびガーゼなどの吸収性材料中に含浸させることにより形成される組成物、または組成物を送達するための手術用ステープル、ジッパー、およびカテーテルなどの固相材料の表面上にコーティングされる組成物が含まれる。本開示を念頭に置く当業者には、この種の他の送達系も容易に明らかであろう。
本開示は、微生物感染症を処置するために、１種または複数種の抗体断片を投与するための方法および組成物を提供する。多様な実施形態では、本明細書に開示されるこれらの方法が、ｉｎ ｖｉｖｏ法およびｅｘ ｖｉｖｏ法のほか、全身投与経路および局所投与経路を含め、薬物を送達するのに適する、利用可能なほとんど任意の方法および経路にわたる。
具体的な態様では、本開示は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質もしくはポリペプチドまたは配列番号１２から１７まで、配列番号３３、もしくはそれらのそれぞれの等価物から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、単離されたもしくは組換えポリペプチドを特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）を含む製剤または共製剤（co-formulation）を提供する。本明細書で開示される抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）は、それらが、バイオフィルムに対する、高レベルのエピトープ結合特異性および高結合親和性を有するように選択することができる。一般に、抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）の結合親和性が大きいほど、イムノアッセイにおいて、よりストリンジェントな洗浄条件を実施して、標的を除去せずに、非特異的に結合した物質を除去することができる。したがって、開示される方法において有用な、本技術の抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）は通例、少なくとも１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、または１０－１２Ｍの結合親和性を有する。ある特定の態様では、抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）は、標準的な条件下、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分間で、平衡に達するのに十分な動力学的結合速度を有する。別の態様では、抗体または抗原結合性断片の親和性は、１０００ピコモル（ｐＭ）、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、約１００ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、または４ｐＭ未満または約１０００ピコモル（ｐＭ）、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、約１００ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、または４ｐＭである。
一部の実施形態では、抗体は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約１から約１５０ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約２ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約３ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約４ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約５ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬまでの濃度で、処方物中に存在する。一部の実施形態では、抗体は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態では、複数の抗体のうちの少なくとも１つは、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
複数の異なる抗体が、抗体併合処方物中に含まれる、一部の実施形態では、異なる抗体は、実質的に等濃度で存在しうる。このような実施形態についての別の態様では、異なる抗体のうちの１つまたは複数は、他の抗体より実質的に高濃度で、例えば、約１．５：１、または代替的に、約１．５：１：１、または代替的に、約１．５：１：１：１、または代替的に、約２：１、または代替的に、約２：１：１、または代替的に、約２：１：１：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１：１：１の比で存在しうる。抗体製剤および共製剤を安定的に製剤化する方法は、当技術分野で開示される技法（例えば、米国特許出願第１２／８７５，０８３号（ＵＳ２０１１／００５９０７９として公開されている）を参照されたい）に従い行うことができる。
診断法および治療法
また、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質または微生物ＤＮＡを、本明細書に記載の抗体断片、抗原結合性断片または組成物と接触させ、これにより、ＤＮＡＢＩＩタンパク質またはポリペプチドの、微生物ＤＮＡへの結合を阻害する、それと競合する、またはそれを滴定することにより、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質の、微生物ＤＮＡへの結合を阻害する、それと競合する、またはそれを滴定するための方法も提供される。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを、例えば、互いに緊密に接触するとシグナルを発する発光分子で検出可能に標識する。接触は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて実施することもでき、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施することもできる。
別の態様では、バイオフィルムを、本明細書に記載の抗体断片、その抗原結合性断片またはポリペプチドと接触させ、これにより、微生物バイオフィルムを阻害、防止、または破壊することにより、微生物バイオフィルムを阻害、防止、または破壊するための方法が提供される。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを、例えば、互いに緊密に接触するとシグナルを発生する発光分子で検出可能に標識する。接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施することもでき、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施することもできる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施する場合、方法は、本明細書で開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）、宿主細胞、小分子、および組成物と同じ能力、同様の能力、または反対の能力を有する抗体断片およびポリペプチドを、スクリーニングまたは確認するために有用である。代替的に、それらを使用して、微生物感染を処置するためにはどの抗体断片またはポリペプチドが適しているかを同定することができる。例えば、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡおよび被験作用剤を含有する２つの試料を有することにより、例えば、新たな作用剤または組合せ療法をスクリーニングすることができる。第２の試料は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡおよび活性であることが公知の作用剤、例えば、抗ＩＨＦ抗体または陽性対照として用いられる小分子を含有する。さらなる態様では、いくつかの試料を提供し、希釈率を増大させながら、作用剤を、系に添加して、臨床の場で対象を処置するのに有効である可能性が高い、最適な用量を決定する。当業者に明らかである通り、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを含有する陰性対照を提供することができる。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを、互いに緊密に接触させるとシグナルを発生させる発光分子で検出可能に標識化する。試料を、作用剤がＤＮＡＢＩＩポリペプチドと微生物ＤＮＡとの相互作用を阻害する、それと競合する、またはそれを漸減するために有効な時間にわたり、同様の条件下に保ち、次いで、試料を、発光分子からのシグナルの発生についてアッセイする。試料がシグナルを発生させれば、その作用剤は結合を阻害するのに有効ではない。
別の態様では、ヒト／動物から、感染症を引き起こす微生物の（例えば細菌などの）単離株を単離し、次いで、培養して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてバイオフィルムとして成長させることができる、小型化チャンバースライドシステムにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を実施するが、例えば、下記の実験１を参照されたい。作用剤（抗ＩＨＦ抗体など）または潜在的な作用剤バイオフィルムを、抗ＩＨＦなど（または他の抗体、小分子、作用剤など）、潜在的な作用剤または作用剤の希釈率を増大させながら、または増大させずに、単独で、または別の作用剤と組み合わせて、培養物に添加して、感染症が存在する対象に送達した場合に、その患者を処置するのに有効である可能性が高い、最適用量を見出す。当業者に明らかである通り、陽性対照および陰性対照を同時に実施することができる。
さらなる態様では、抗体断片および／または潜在的な作用剤（単独で、または別の作用剤と組み合わせて）をフローセル内に伴う、ハイスループットプラットフォームにおいて、方法を実施する。抗ＩＨＦ抗体もしくはその断片または潜在的な作用剤を、抗ＩＨＦなど（または他の抗体、小分子、作用剤など）、潜在的な作用剤または作用剤の希釈率を増大させながら、または増大させずに、単独で、または別の作用剤と組み合わせて、培養物に添加して、感染症が存在する対象に送達した場合に、その患者を処置するのに有効である可能性が高い、最適用量を見出す。バイオフィルム単離体を超音波処理して、微生物ＤＮＡに結合したＩＨＦなどのＤＮＡＢＩＩポリペプチドからバイオフィルム細菌を分離する。ＤＮＡＢＩＩポリペプチド－ＤＮＡ複合体を、プラットフォーム上の抗ＩＨＦ抗体によって単離する。次いで、微生物ＤＮＡを、例えば、塩洗浄により放出させ、添加したバイオフィルム細菌を同定するのに使用する。次いで、遊離したＤＮＡを、例えば、ＰＣＲシーケンシングにより同定する。ＤＮＡが遊離しなければ、作用剤は、首尾よく機能した、または微生物ＤＮＡに結合した。ＤＮＡが試料中に見出されれば、作用剤は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチド－微生物ＤＮＡ間の結合に干渉しなかった。当業者に明らかである通り、陽性対照および／または陰性対照を同時に実施することができる。
別の態様では、本明細書で開示される抗体断片、抗原結合性断片、ポリペプチドまたは組成物のうちの１つまたは複数を、ｉｎ ｖｉｖｏでバイオフィルムを検出する方法において使用する。さらなる実施形態では、抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を、例えば、発光分子または蛍光分子で、検出可能に標識する。本明細書で開示される方法のさらなる適用は、このような抗体断片、ポリペプチドまたは組成物の使用法であって、例えば、バイオフィルムに結合すると、検出可能なシグナルをもたらす、検出可能に標識された一次抗体断片、ポリペプチドもしくは組成物、または一次抗体断片、ポリペプチドもしくは組成物がバイオフィルムに結合したときに、それに結合する、検出可能に標識された二次抗体断片、ポリペプチド、または組成物を使用して、バイオフィルムをイメージングする使用法を含む。
上記の方法はまた、所与の細菌種が、ある作用剤によって、別の作用剤によりもそのバイオフィルムの逆転によく応答する可能性があるので、診断検査としても使用することができ、この迅速なハイスループットアッセイシステムであれば、当業者が可能性のある抗ＩＨＦ様作用剤のパネルをアッセイして、最も効果的な群を同定することを可能とするであろう。
これらの方法の利点は、病院内の大半の臨床微生物学検査室には既に、液体培養物中で（または浮遊状態で）成長する細菌を使用してこれらの種類のアッセイ（すなわち、ＭＩＣ値、ＭＢＣ値の決定）を実施する設備が整っていることである。当業者には明らかである通り、細菌は一般に、疾患を引き起こすときには浮遊状態では持続しない。その代わりに、細菌は、安定なバイオフィルムとして成長し、これらのバイオフィルムは、抗生物質、抗体、または他の治療薬による処置に対する耐性が著明に大きい。この耐性が、大半のＭＩＣ／ＭＢＣ値により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を正確に予測することができない理由である。したがって、作用剤のどの「用量」がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細菌バイオフィルムを逆転しうるのかを決定することにより（上記で記載した通り）、出願人らの前臨床的なアッセイは、個別化医療の適用としてもなお、臨床的有効性についての、信頼性の大きな予測因子となるであろう。
臨床の場に加えて、この方法は、感染症を引き起こす微生物を同定し、かつ／または例えば、パイプにおいてなどの工業の場において有効な代替的な作用剤を確認するのにも使用することができる。
上記の方法のさらなる態様では、感染症を阻害しうるのかどうかを決定するために、根底的な感染症の進行を阻害することが公知である抗生物質または抗菌薬を、逐次的または同時に添加する。バイオフィルムの阻害をアッセイするためには、複合体を添加する前に、抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を、微生物ＤＮＡまたはＤＮＡＢＩＩポリペプチドに添加することも可能である。
チンチラなどの非ヒト動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する場合、方法は、バイオフィルムを分解するのに、単独で、または他の作用剤と組み合わせて使用しうる、抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を同定するための、前臨床なスクリーニングを提供する。
別の態様では、本明細書では、対象に、有効量の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を投与し、これにより、微生物バイオフィルムを阻害、防止、または破壊することにより、対象におけるバイオフィルムを阻害、防止、または破壊する方法が提供される。
代替的にまたは加えて、バイオフィルムを阻害、防止、または破壊する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施することもでき、かつ／またはｅｘ ｖｉｖｏにおいて実施することもでき、バイオフィルムの試料（対象から採取された、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて発生した）を提供するステップと、有効量の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を投与し、これにより、微生物バイオフィルムを阻害、防止、または破壊するステップとを伴う。同様に、本明細書で開示される抗体断片、ポリペプチドまたは組成物は、院内器具、工業装置、および生体組織に含まれない他の物質などであるがこれらに限定されない、バイオフィルムによりコロニー形成される、表面上の微生物バイオフィルムを阻害、防止、または破壊するための方法実施形態においても使用することができる。
さらなる態様では、方法は、対象に、有効量の、抗菌薬、抗原性ペプチド、またはアジュバントのうちの１つまたは複数を投与するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、なおまたはさらにそれからなる。
抗菌剤の非限定的な例は、表面抗原、例えば、ＯＭＰ Ｐ５、ｒｓＰｉｌＡ、ＯＭＰ ２６、ＯＭＰ Ｐ２、またはＩＶ型Ｐｉｌｉｎタンパク質などのワクチン構成成分に対して方向づけられた抗体である（ＪｕｒｃｉｓｅｋおよびＢａｋａｌｅｔｚ（２００７年）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８９巻（１０号）：３８６８～３８７５頁；Ｍｕｒｐｈｙら（２００９年）、Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ、２８巻：Ｓ１２１～Ｓ１２６頁；Ｎｏｖｏｔｎｙら（２０１５年）、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、９６巻（２号）：２７６～９２頁を参照されたい）。
本明細書で開示される作用剤および組成物は、他の抗菌剤および／または表面抗原と、同時にまたは逐次的に投与することができる。特定の一態様では、投与は、例えば、直接的な注射または吸入による、感染部位への局所投与である。投与の他の非限定的な例は、経皮的に、尿道に、舌下に、直腸に、膣に、眼に、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内に、吸入により、または経口的に投与することを含む、１つまたは複数の方法による投与を含む。
本明細書で開示される方法により処置されうる微生物感染症および疾患は、実施例４～実施例９において開示されている生物を含むがこれらに限定されない、バイオフィルムの形成と関連する多様な生物による感染症を含むがこれらに限定されない。関与性の生物（およびそれらの括弧中の例示的な株）の非限定的な例は、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えば、Ｂ３１）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、Ｔｏｈａｍａ Ｉ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（例えば、６６８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ（例えば、ＨＩ２４２４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、Ｋ１２ ＭＧ１６５５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（例えば、Ｖ５８３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、Ｒｄ ＫＷ２０）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば、２６６９５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、ＲＨ４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（例えば、ＭＣ２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＣＤＣ１５５１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（例えば、ＦＡ１０９０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、ＭＣ５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（例えば、Ｗ８３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（例えば、１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）２５８４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＭＷ２）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（例えば、ＲＰ６２Ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えば、２６０３Ｖ／Ｒ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（例えば、ＮＣＴＣ ７８６８ （Ｃｈａｌｌｉｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、Ｒ６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＭＧＡＳ１０２７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（例えば、６７１５）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（例えば、ｔｙｐｈｉ、ＣＴ１８）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）３５４０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｕｍ（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（例えば、Ｅｌ Ｔｏｒ、Ｎ１６９６１）を含む。バイオフィルムと関連する、かつ／またはこれを形成することが公知の、さらなる生物は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むがこれらに限定されない。例えば、嚢胞性線維症患者は、抗生物質耐性バイオフィルムを結果としてもたらすことが多い、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症を有する。バイオフィルムと関連する例示的な疾患は、嚢胞性線維症患者の肺感染症、中耳炎、自然弁感染性心内膜炎、骨髄炎、鼻副鼻腔炎、前立腺炎、再発性尿路感染症、創傷、齲歯、および歯周炎を含むがこれらに限定されない。感染した人工デバイス、関節、カテーテル、ステントまたは他の外科用インプラントなどの状態もまた、バイオフィルムの形成と関連する。
これらの微生物感染症は、上気道、中気道および下気道に存在しうる（耳炎、副鼻腔炎、気管支炎であるが、また、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪、慢性咳、嚢胞性線維症（ＣＦ）の合併症および／または主因、ならびに市中感染性肺炎（ＣＡＰ）でもある）。したがって、本明細書で開示されるｉｎ ｖｉｖｏ法を実施することにより、これらの感染症由来の、これらの疾患および合併症も、予防または処置することができる。
感染症は、口腔においても生じる可能性があり（齲歯、歯周炎）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｖｃｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓにより引き起こされる。感染症はまた、皮膚に局在する可能性もあり（膿瘍、「ブドウ球菌」感染症、膿痂疹、熱傷の二次感染症、ライム病）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉにより引き起こされる。尿路（ＵＴＩ）の感染症は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにより引き起こされることが典型的であり、これもまた処置することができる。消化管（ＧＩ）の感染症（下痢、コレラ、胆石、胃潰瘍）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉによって引き起こされることが典型的である。生殖管の感染症は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含み、これによって引き起こされることが典型的である。感染症は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓによって引き起こされる、膀胱の感染症または留置デバイスの感染症でありうる。人工股関節または人工膝関節など、植え込まれた人工デバイス、または歯科インプラント、またはポンプ、カテーテル、ステント、もしくはモニタリングシステムなどの医療デバイスと関連する感染症は、種々の細菌により引き起こされることが典型的であり、本明細書で開示される方法により処置することができる。これらのデバイスは、本明細書で記載される作用剤でコーティングすることもでき、これとコンジュゲートすることもできる。したがって、本明細書で開示されるｉｎ
ｖｉｖｏ法を実施することによって、これらの感染症由来の、これらの疾患および合併症も予防または処置することができる。
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅにより引き起こされる感染症も、本明細書で開示される方法により処置することができるが、これは、新生児における細菌性敗血症の主要な原因である。また髄膜炎を引き起こす恐れがある、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる感染症も、処置することができる。
したがって、本明細書で開示される方法に適用可能な投与経路は、鼻腔内、筋肉内、尿道、気管内、皮下、皮内、局所塗布、静脈内、直腸、経鼻、経口的、吸入、および他の経腸および非経口的な投与経路を含む。投与経路は、所望であれば組み合わせることもでき、作用剤および／または所望の効果に応じて調整することもできる。活性作用剤は、単回用量または複数回用量で投与することができる。送達に適する、これらの方法および経路の実施形態は、全身経路または局所経路を含む。一般に、本明細書で開示される方法に適する投与経路は、これらに限定されないが、直接注射経路、経腸経路、非経口的経路、または吸入による経路を含むがこれらに限定されない。
吸入による投与以外の非経口的投与経路は、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、嚢内経路、脊髄内経路、胸骨内経路、および静脈内経路、すなわち、消化管を通る経路以外の任意の投与経路を含むがこれらに限定されない。非経口投与は、阻害剤の全身送達または局所送達をもたらすように行うことができる。全身送達が望まれる場合、投与は、医薬調製物の侵襲的または全身的に吸収される局所投与または粘膜投与を伴うことが典型的である。
本明細書で開示される抗体断片、ポリペプチドまたは組成物はまた、経腸投与により対象に送達することもできる。経腸投与経路は、経口的送達および直腸送達（例えば、坐薬を使用する）を含むがこれらに限定されない。
皮膚または粘膜を通じた活性物質の投与方法は、適切な医薬調製物の局所塗布、経皮的浸透（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）、経皮的浸透（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）、注射および表皮投与を含むがこれらに限定されない。経皮的浸透については、吸収促進剤またはイオン泳動が適切な方法である。イオン泳動的な浸透は、それらの生成物を、数日またはそれよりも長い期間にわたり、損なわれていない皮膚を通じて、電気的パルスにより連続的に送達する、市販の「パッチ」を使用して達成することができる。
本明細書で開示される方法の種々の実施形態では、抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を、吸入、注射により、または経口的に、連続的に、毎日、１日少なくとも１回（ＱＤ）投与し、種々の実施形態では、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、なおまたは１日４回投与する。毎日の治療有効用量は、少なくとも約１ｍｇ、または少なくとも約１０ｍｇ、または少なくとも約１００ｍｇ、または約２００ｍｇ～約５００ｍｇであり、場合によっては、化合物に応じて、約１ｇから約２．５ｇまでと同程度であることが典型的であろう。
本開示は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を移出する細菌による宿主または宿主細胞の感染を阻害または予防する方法および組成物であって、細菌に曝露された、またはそれに感染した組織に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を特異的に認識し、それに特異的に結合する、有効量の細菌関連（bacteria-relevant）抗体断片、その抗原結合性断片、ポリペプチドまたは
組成物を投与し、これにより、細菌による宿主または宿主細胞の感染を阻害または予防することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法および組成物を提供する。複数の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物は、本明細書で言及される支持療法と共に、併せて投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
本開示は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を移出する細菌による細胞の感染を阻害または予防する方法を提供する。方法は、細菌に感染した組織に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を特異的に認識し、それに特異的に結合する、有効量の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を投与し、これにより、細菌による感染を阻害または予防するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。複数の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物は、本明細書で言及される支持療法と共に、併せて投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、培養物中の投与の場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、細菌に感染した患者への投与による場合もある。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施する場合、方法を使用して、感染した対象に、有効量の抗体を投与することにより、細菌に感染した対象を処置することができる。加えて、対象が非ヒト動物である場合、方法を使用して、ヒトへの投与の前に、可能な治療または組合せ療法について調べることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施する場合、方法は、組織内の細菌による感染症を阻害または予防する小分子薬など、他の治療薬および組合せ療法についてスクリーニングするのに有用である。
また、細菌感染の処置を必要とする対象であって、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を含む細菌に感染した対象における細菌の感染を処置する方法であって、対象に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を特異的に認識し、それに特異的に結合する、有効量の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を投与し、これにより、細菌による感染を阻害または予防するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法も提供される。抗体断片は、細菌関連ＤＮＡＢＩＩタンパク質を認識し、それに結合する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体の誘導体から生成され得る。ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体の供給源は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質による宿主への能動的ワクチン接種により誘発することもでき、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のタンパク質に対する抗血清または抗体の受動的移入により誘発することもできる。複数の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物は、本明細書で言及される支持療法と共に、併せて投与することもでき、または逐次的に投与することもできる。
なおさらに、状態の処置を必要とする対象における状態であって、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を発現する細菌の感染と関連する状態を処置する方法であって、対象に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を特異的に認識し、それに特異的に結合する、有効量の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物を投与し、これにより、細菌による感染を阻害または予防するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法も提供される。ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体断片、ポリペプチドまたは組成物をもたらした抗体の供給源は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質による宿主への能動的ワクチン接種により誘発することもでき、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗血清または抗体の受動的移入により誘発することもできる。抗体は、細菌関連ＤＮＡＢＩＩタンパク質を認識し、それに結合する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体の誘導体であってよい。複数の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物は、本明細書で言及される支持療法と共に、併せて投与することもでき、または逐次的に投与することもできる。
上記の方法のうちのいずれかは、対象、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組織培養物もしくは細胞培養物に、有効量の、抗菌薬、抗原性ペプチド、またはアジュバントのうちの１つまたは複数を投与するステップをさらに含む場合もあり、代替的にそれから本質的になる場合もあり、なおさらにそれからなる場合もある。一部の態様では、対象は、非ヒト動物またはヒト患者である。
抗体断片、ポリペプチドまたは組成物は、任意の適切な方法により、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）投与または全身投与される、例えば、感染症またはバイオフィルムの部位に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、直腸に、膣に、眼に、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、尿道に、鼻腔内に、吸入により、または経口的に投与される。
一部の態様では、対象は、小児患者であり、抗体は、小児患者用の処方物により投与される。
また、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を移出する細菌による細胞の感染症を阻害もしくは予防し、かつ／またはバイオフィルムの形成を破壊もしくは防止する、潜在的な治療薬を同定するスクリーニングも開示される。スクリーニング法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細菌に感染した組織に、作用剤を接触させるステップ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、細菌に感染した組織に、作用剤を投与するステップと、作用剤が、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に結合するのかどうかを決定するステップとを含む、または代替的にそれから本質的になる、なおまたはさらにそれからなる。当技術分野では、結合を決定する方法が公知であり、いくつかの非限定的な例については、本明細書でも記載する。一態様では、作用剤がタンパク質に結合すれば、作用剤は、潜在的な治療薬であり、作用剤がタンパク質に結合しなければ、作用剤は、潜在的な治療薬ではない。別の態様では、感染症またはバイオフィルムが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、阻害、破壊、または防止されれば、作用剤は、潜在的な治療薬であり、感染症が、阻害または防止されなければ、作用剤は、潜在的な治療薬ではない。当技術分野では、感染症が阻害または防止されるのかどうかを決定する方法が公知であり、いくつかの非限定的な例については、本明細書でも記載するが；当技術分野では、バイオフィルムが破壊または防止されるのかどうかを決定する方法も公知であり、本明細書でもさらに開示する。潜在的な治療薬の非限定的な例は、抗体、抗体誘導体、ポリペプチド、または小分子の群より選択される。複数の抗体は、本明細書で言及される支持療法と共に、共時的に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
さらなる態様において、作用剤は、タンパク質に結合し、その結合を、抗ＤＮＡＢＩＩ抗血清の、抗体断片またはポリペプチドへの結合と比較する。
ＤＮＡＢＩＩタンパク質の、微生物ＤＮＡへの結合を阻害する、それを漸減する、またはそれと競合するための抗体断片、ポリペプチドまたは組成物に関して想定される一般的特性のうちのいずれも同様に、細菌の感染症に関する、上記で開示した方法に適用されることを認識されたい。
投薬は、本明細書で開示される方法に従って、カプセル、錠剤、経口懸濁物、筋肉内注射用懸濁物、静脈内注入用懸濁物、局所塗布用ゲルもしくはクリーム、または関節内注射用懸濁物を使用して達成することができる。
本明細書で記載される組成物の投与量、毒性、および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順であって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定する手順により決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、高い治療指標を示す。毒性の副作用を示す化合物を使用しうるが、感染していない細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、これにより、副作用を軽減するために、このような化合物を患部組織部位にターゲティングする送達系を設計するように注意を払うべきである。
ヒトにおける使用のための投与量の範囲を処方するために、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを使用することができる。このような化合物の投与量は、毒性をほとんどまたは全く伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある（ある特定の実施形態では）。投与量は、利用される剤形および活用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。方法において使用される任意の化合物について、まず細胞培養アッセイから、治療有効用量を推定することができる。用量は、細胞培養物中で決定される、ＩＣ５０（すなわち、最大半量の症状の阻害が達成される被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
一部の実施形態では、治療効果または予防効果を達成するために十分な有効量の組成物は、投与１回当たり体重１キログラム当たり約０．０００００１ｍｇから投与１回当たり体重１キログラム当たり約１０，０００ｍｇまでの範囲である。投与量は、投与１回当たり体重１キログラム当たり約０．０００１ｍｇから投与１回当たり体重１キログラム当たり約１００ｍｇまでの範囲であることが適切である。投与は、初回用量、その後の１回または複数回の「追加」用量として施すことができる。追加用量は、初回用量の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後または１２カ月後に施すことができる。一部の実施形態では、追加用量は、前の投与に対する対象の応答を評価した後に投与される。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全般的健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼしうることを認識するであろう。さらに、対象の、治療有効量の、本明細書で記載される治療的組成物による処置は、単回の処置を含む場合もあり、処置のシリーズを含む場合もある。
抗体を用いた機能解析
本明細書で開示される抗体および抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）を使用して、本明細書で開示されるポリペプチドを精製し、生物学的に等価なポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを同定することができる。また、それらを使用して、本明細書で開示されるポリペプチドの機能を修飾する作用剤、例えば、アプタマー、ポリヌクレオチド、および小分子を同定することもできる。これらの抗体は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、および当業者によく知られており上に記載されているこれらの調製物に由来する種々の試薬を含む。
同定された遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を中和する抗体および抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）はまた、このような中和抗体を、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系に追加することにより、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける機能を裏付けるのにも使用することができる。このような中和抗体もまた、本明細書で開示されるポリペプチドの活性を調節する医薬剤としても有用である。
また、多様な抗体調製物および抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）も、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、同定された遺伝子によりコードされるタンパク質の、被験細胞による発現を裏付けるための、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットなどの分析法において使用することができる。また、代謝時のプロテアーゼ分解により発生するこのようなタンパク質の断片も、適切なポリクローナル抗血清を、実験試料に由来する試料と共に使用することにより、同定することができる。
さらに、一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体および抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）を使用して、バイオフィルムを視覚化および／または検出することができる。このような実施形態では、抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な生成物を生成させる酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識することもでき、または例えば、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）など、他の部分にコンジュゲートすることもできる。次いで、検出可能に標識された抗体を、バイオフィルムがコロニー形成していることが疑われる試料に導入し、顕微鏡法または関連の標識を検出することが公知の他の方法、例えば、分光法、サイトメトリー、または他の一般的な技法で、視覚化および／または検出することができる。コンジュゲート抗体または非標識抗体も同様に、それぞれコンジュゲート部分または抗体を対象とする、公知の分析法により同定することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体および／または抗体断片（例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）断片）のアイソタイプに特異的な、検出可能に標識された二次抗体も、バイオフィルムの視覚化および／または検出において使用することができ、このような実施形態は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質の「尾部」に特異的な抗体の、バイオフィルムがコロニー形成していることが疑われる表面への投与と、それに続く、検出可能に標識された二次抗体の投与およびその後における関連の標識の検出を必然的に伴い得る。
本明細書で開示される抗体断片、抗原結合性ドメイン、ポリペプチドまたは組成物は、単独で、ペプチドもしくはタンパク質ベースのワクチンまたは樹状細胞ベースのワクチンと組み合わせて、ワクチン接種のために使用することもでき、ワクチン接種をブーストするために使用することもできる。
スクリーニングアッセイ
本開示は、本明細書で記載される例示的な抗体と等価なモノクローナル抗体およびその断片などの等価作用剤、ならびに本明細書で開示される活性作用剤および医薬組成物の活性、または本明細書で開示されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド産物もしくはペプチド産物の機能を調節する各種の作用剤をスクリーニングする方法を提供する。本開示の目的では、「作用剤」に、単純なもしくは複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体）、ポリヌクレオチド（アンチセンス）、またはリボザイムなどの生物学的化合物または化学的化合物を含むがこれらに限定されないことを意図する。例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、および多様なコア構造に基づく合成有機化合物など、多種多様な化合物を合成することができ、これらもまた、「作用剤」という用語に含まれる。加えて、例えば、植物抽出物または動物抽出物など、各種の天然供給源も、スクリーニングのための化合物をもたらし得る。常に明示的に言及されるわけではないが、作用剤は、単独で、または本発明のスクリーニングにより同定される作用剤と同じもしくは異なる生物学的活性を有する、別の作用剤と組み合わせて使用されることを理解されたい。
本開示の目的では、「結合性部分」は、少なくとも１種のＤＮＡＢＩＩタンパク質に関して親和性を有する、単純なもしくは複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体）、ポリヌクレオチド（アンチセンス）、またはリボザイムなどの生物学的化合物または化学的化合物を含むがこれらに限定されないことを意図する。多種多様な化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、および多様なコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらもまた、「結合性部分」という用語に含まれる。加えて、例えば、植物抽出物または動物抽出物など、各種の天然供給源も、スクリーニングのための化合物をもたらし得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニング法を実施するために、処置される微生物に感染した適する細胞培養物または組織をまず提供する。細胞は、密度に依存する制約なしに、指数関数的な増殖を達成するための条件下（温度、増殖培地または培養培地、およびガス（ＣＯ２））で、適切な長さの時間にわたり培養する。また、対照として、感染していないさらなる別個の細胞培養物を維持することも所望される。
当業者に明らかである通り、適切な細胞は、マイクロタイタープレート内で培養することができ、遺伝子型の変化、表現型の変化、または微生物力価の低減に注目することにより、いくつかの作用剤を同時にアッセイすることができる。
作用剤が、上記で説明した小分子など、ＤＮＡまたはＲＮＡ以外の組成物である場合は、この作用剤を、細胞培養物に直接添加することもでき、追加用の培養培地に添加することもできる。当業者に明らかである通り、実験により決定され得る「有効」量を添加しなければならない。
作用剤が、抗体または抗原結合性断片である場合は、この作用剤を、競合的ＥＬＩＳＡを実施するための条件下で、本明細書に記載される標的抗原およびポリクローナル抗体と接触させることもでき、これらと共にインキュベートすることもできる。当業者には、このような方法が公知である。
アッセイはまた、対象において実施することもできる。対象が、ラット、チンチラ、マウス、またはサルなどの動物である場合、方法は、ヒト患者における作用剤の臨床試験の前に使用しうる、簡便な動物モデル系を提供する。この系では、疾患または微生物感染症の症状のそれぞれが、同じ感染症を有する処置されていない動物と比較して軽減される、または消失すれば、候補作用剤が潜在的な薬物である。また、比較のためのベースを提供する、健康で処置を受けていない細胞または動物の、別個の陰性対照群を有することも有用であり得る。
本明細書で想定される抗体に特異的な、さらなるスクリーニングアッセイは、本明細書で開示されるポリペプチドのうちの１つまたは複数に特異的に結合する抗体または作用剤を同定するのに適する方法を含む。この方法は、本発明の抗体が結合する、抗原上の部位に結合する抗体を同定するステップを伴う。
抗体が結合する部位は、当業者に公知の方法により決定することができる。例えば、抗体が、抗原の部分的立体構造に結合する、またはそれを認識する場合、抗体が結合する部位は、Ｘ線構造解析を使用して、抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を同定することにより決定することができる。例えば、抗体またはその断片と、抗原またはその断片とを、互いに結合させ、結晶させた後、構造解析を行い、抗体との相互作用距離を有する抗原上の各アミノ酸残基を同定することができる。相互作用距離は、８オングストロームまたはこれより短い、好ましくは６オングストロームまたはこれより短い、より好ましくは４オングストロームまたはこれより短い。抗体との相互作用距離を有する、１つまたは複数のこのようなアミノ酸残基は、抗体が結合する、抗原上の部位（エピトープ）を構成し得る。２つまたはそれよりも多いこのようなアミノ酸残基は、一次配列上では、互いと隣接しえない。このような構造解析は、タンパク質の三次元構造を提示することが可能であり、したがって、同定されたエピトープの配列および立体構造の両方をもたらし得る。
被験抗体または被験作用剤を、本明細書で開示されるポリペプチドのうちの１つまたは複数と接触させることができる。その後、物質と、本明細書で開示される抗体のうちの任意の１つが結合するエピトープを構成するアミノ酸残基との距離を測定する。被験抗体または被験作用剤は、それが、残基のそれぞれと、適切な相互作用距離にあれば、特異的に結合すると決定することができる。一部の実施形態では、被験抗体は、ポリクローナル抗体ではない。
一部の実施形態では、抗体－抗原間相互作用の構造解析により同定される、その立体構造エピトープとの相互作用に基づき、被験抗体または被験作用剤を分析する。このような立体構造エピトープの非限定的な例は、本明細書で開示されるポリペプチドのうちの１つまたは複数の中に含まれ得るβヘアピンである。さらなる非限定的な例示的エピトープは、コンセンサスのアミノ酸配列
Figure 2023033394000022
 ［配列中、「Ｘ」は、任意のアミノ酸を指す］など、アンチパラレルのベータリボンの一部としての鋭角ターンと一致するアミノ酸配列である。一部の実施形態では、Ｘを、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴから選択する。本明細書では、このようなものの非限定的な例を、コンセンサスアミノ酸配列
Figure 2023033394000023
 に下線を付して太字にして開示する。当業者は、これらの配列のうちの任意の１つでは、Ｘ位における残基（下記の例では、
Figure 2023033394000024
 でマークする）を、任意のアミノ酸（例えば、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴ）で置換し得ることを理解する。
配列番号１３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａ５断片：
Figure 2023033394000025
 ．
配列番号１４：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ、Ａ５断片：
Figure 2023033394000026
 ．
配列番号１７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、修飾Ｂ４（ｍＢ４）断片：
Figure 2023033394000027
 ．
配列番号２６：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａ先端部断片：
Figure 2023033394000028
 ．
配列番号２７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、Ｂ先端部断片：
Figure 2023033394000029
 ．
配列番号３１ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ、断片：
Figure 2023033394000030
 ．
一部の実施形態では、
Figure 2023033394000031
 を含むポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸の長さであり、ＮＰＸＴは、配列内のほぼ中心に位置する。このような配列の非限定的な例は、配列番号１３、１４、および３１を含む。
作用剤および組成物は、医薬の製造において用いることができ、医薬組成物の有効成分など、従来の手順に従う投与によって、ヒトおよび他の動物を処置するのに用いることができる。
組合せ療法
本開示の組成物および関連する方法は、他の療法の投与と組み合わせて用いることができる。これらには、ＤＮアーゼ酵素、抗生物質、抗微生物薬、ワクチンアジュバントまたは他の抗体の投与が含まれるがそれらに限定されない。
一部の実施形態では、方法および組成物が、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体と共に相乗的に作用するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）酵素を包含する。ＤＮアーゼとは、ＤＮＡ骨格におけるホスホジエステル結合の切断を触媒する任意の酵素である。十字構造だけでなく、ＤＮＡの多様な二次構造もまたターゲティングすることが公知であるＤＮアーゼ酵素についての、３つの非限定的な例は、ＤＮアーゼＩ、Ｔ４ Ｅｎｄｏ ＶＩＩ、およびＴ７ Ｅｎｄｏ Ｉを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮアーゼと組み合わせると、バイオフィルムを不安定化させるのに必要とされる抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の有効量が低減される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する場合、ＤＮアーゼは、アッセイに直接添加することもでき、この酵素を安定化させることが公知である適切な緩衝液中に添加することもできる。ＤＮアーゼの有効単位用量およびアッセイ条件は変動する場合があり、当技術分野で公知の手順に従い最適化することができる。
他の実施形態では、方法および組成物を、抗生物質および／または抗菌薬と組み合わせることもできる。抗菌薬とは、細菌、真菌、または原虫などの微生物を死滅させる、またはそれらの成長を阻害する物質である。バイオフィルムは一般に、抗生物質の作用に対して耐性であるが、本明細書で説明される組成物および方法を使用して、バイオフィルムを伴う感染症を、感染症を処置するための従来の療法に対して感作させることができる。他の実施形態では、抗生物質または抗菌薬を、本明細書で記載される方法および組成物と組み合わせて使用することにより、抗菌薬および／またはバイオフィルム低減剤の有効量を低減することが可能となる。本開示の方法との組合せに有用な抗菌薬および抗生物質についての一部の非限定的な例には、アモキシシリン、アモキシシリン－クラブラン酸、セフジニル、アジスロマイシン、およびスルファメトキサゾール－トリメトプリムが含まれる。バイオフィルム低減剤と組み合わされる抗菌薬および／または抗生物質の治療有効量は、従来の方法により容易に決定することができる。一部の実施形態では、バイオフィルム低減剤と組み合わされる抗菌薬の用量が、他の細菌感染症、例えば、感染症の病因がバイオフィルムを包含しない細菌感染症において有効であることが示されている平均有効用量である。他の実施形態では、用量が、平均有効用量の０．１、０．１５、０．２、０．２５、０，３０、０，３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、または５倍である。抗生物質または抗菌薬は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体を添加する前に付加することもでき、それと共時的に付加することもでき、その後で付加することもできる。
他の実施形態では、方法および組成物を、細菌感染症を処置する抗体と組み合わせることもできる。本明細書で説明される方法および組成物と組み合わせるのに有用な抗体の一例は、非類縁外膜タンパク質（すなわち、ＯＭＰ Ｐ５）を指向する抗体である。この抗体単独による処置は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてバイオフィルムを減量することがない。この抗体と、バイオフィルム低減剤とによる組合せ療法は、同じ濃度のいずれかの試薬を単独で用いることにより達成され得る効果より大きな効果を結果としてもたらす。バイオフィルム低減剤またはバイオフィルムを低減させる方法と組み合わせて用いると相乗効果をもたらし得る他の抗体には、抗ｒｓＰｉｌＡ調製物、抗ＯＭＰ２６調製物、抗ＯＭＰ Ｐ２調製物、および抗全ＯＭＰ調製物が含まれる。
バイオフィルムが関与しない細菌感染を処置するのには有効であるが、それ以外の、バイオフィルムが関与する細菌感染症を処置するには有効でない、一般的な治療モダリティーに対して、本明細書に記載される組成物および方法を用いて、バイオフィルムが関与する細菌感染を感作させることができる。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法を、バイオフィルムが関与する細菌感染を処置または予防するのに有効な治療モダリティーと組み合わせて用い得るが、このような追加的な療法とバイオフィルム低減剤または方法との組合せは、バイオフィルム低減剤または追加的な治療薬のいずれかの有効量を低減し得るような相乗効果をもたらす。他の場合には、このような追加的な療法とバイオフィルム低減剤または方法との組合せが、処置を増強するような相乗効果をもたらす。処置の増強は、感染を処置するのに必要とされる時間の長さの短縮により証拠立てることができる。
追加的な治療的処置は、バイオフィルムを低減させるのに用いられる方法または組成物の前に追加することもでき、それと併せて追加することもでき、その後で追加することもでき、同じ製剤中に含有させることもでき、別個の製剤として含有させることもできる。キット
本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ法およびｉｎ ｖｉｖｏ法を実施するのに必要な作用剤および指示を含有するキットもまた、特許請求される。したがって、本開示は、本明細書に開示される抗体断片またはその抗原結合性断片ならびに組織を収集するステップ、および／またはスクリーニングを実施するステップ、および／または結果を解析するステップ、および／または本明細書で規定される有効量の抗体断片またはその抗原結合性断片を投与するステップなどの本明細書に開示される方法を実施するための指示を含み得るこれらの方法を実施するためのキットを提供する。これらは、単独で用いることもでき、他の適切な抗微生物薬と組み合わせて用いることもできる。
例えば、キットは、任意の１つまたは複数の本開示の抗体断片、ポリペプチドまたは組成物および使用のための指示を含む場合もあり、代替的にそれから本質的になる場合もあり、またはなおさらにそれからなる場合もある。キットは、アジュバント、抗原性ペプチド、または抗微生物薬のうちの１つまたは複数をさらに含み得る（can further comprising）。キャリアの例には、液体キャリア、薬学的に許容されるキャリア、固相キャリア、薬学的に許容されるキャリア、薬学的に許容されるポリマー、リポソーム、ミセル、インプラント、ステント、ペースト、ゲル、歯科インプラント、または医療用インプラントが含まれる。
以下の例は、本明細書で開示される実施形態を例示することを意図するものであり、これらを限定することを意図するものではない。
（実施例１）
ＩＨＦおよびＨＵ抗体およびＦａｂ断片の生成
全体としてＩＨＦおよびＨＵに対する、および特異的断片に対する、ＩＨＦおよびＨＵ抗体、タンパク質およびポリペプチドを生成させた。
例えば、GranstonおよびNash（１９９３年）、J. Mol. Biol.、２３４巻：４５～５
９頁；Nashら（１９８７年）、Journal of Bacteriology、１６９巻（９号）：４１２
４～４１２７頁；ならびにRiceら（１９９６年）、Cell、８７巻：１２９５～１３０６頁に記載されている通り、当業者には、これらを産生する方法が周知である。略述すると、ＩＨＦ－α（配列番号６）を過剰産生するために、ｈｉｍＡ遺伝子を、細菌プラスミドであるｐＡＤ２８４におけるＰＬプロモーターの下流に挿入した。所望のプラスミドを施されたＣ６００ｈｉｍＡ４２株のラムダ溶原菌であるＫ５６０７株の形質転換株は、バクテリオファージミューを成長させる能力について、アンピシリン耐性形質転換株をスクリーニングすることにより同定した。標準的なＤＮＡ単離法に従い、ｈｉｍＡ＋形質転換株からＤＮＡを調製し、ｈｉｍＡ遺伝子の配向性は、制限酵素切断により決定した。ＰＬプロモーターによる発現に適正な配向性でｈｉｍＡ遺伝子を有するプラスミドであるｐＰＬｈｉｍＡ－１を、ｃＩ８５７熱誘導性リプレッサーを発現するラムダ潜在プロファージを含有するＮ５２７１株へと形質転換し、Ｋ５７７０株を得た。
ＩＨＦ－βサブユニット（配列番号７）を過剰産生するために、バクテリオファージラムダのＰＬプロモーターとのＩＨＦ－ベータをコードする配列の融合体を含有するプラスミドであるｐＫＴ２３－ｈｉｐ３２３を用いた。ｐＫＴ２３－ｈｉｐ３２３を、Ｎ５２７１に導入して、Ｅ４４３株を得た。別のプラスミドの存在下におけるｐＫＴ２３－ｈｉｐ３２３の選択を容易にするために、変更されたその選択マーカーを、アンピシリン耐性（ｂｌａ＋）から、クロラムフェニコール耐性（ｃａｔ－）へと変更した。ＦｌａｍｍおよびＷｅｉｓｂｅｒｇにより記載されている通りに、ｃａｔ含有断片を、プラスミドｐＢＲ３２５から単離し、ｂｌａにおける固有のＳｃａＩ部位に挿入した。ライゲーションされたＤＮＡを、ｈｉｐ変異を保有し、温度感受性のＸリプレッサーを合成するＥ４０３株内に導入し、低温でクロラムフェニコール耐性形質転換株を選択した。このような形質転換株の１つ（Ｅ７３５株）は、ｈｉｐ＋であり、かつ、アンピシリン感受性であり、したがって、ｐＫＴ２３－ｈｉｐ３２３のｂｌａ ｃａｔ＋誘導体（ｐＥ７３５）を保有すると考えられる。
ＩＨＦのいずれのサブユニットも過剰産生する株を産生するために、Ｅ７３５を、プラスミドｐＰＬｈｉｍＡ－１で形質転換し、アンピシリン耐性となり、クロラムフェニコール耐性を保持している形質転換株（Ｅ７３８）を選択した。いずれのサブユニットも過剰産生する第２の株の産生は、ｐｈｅＴ遺伝子およびｈｉｍＡ遺伝子を含有する、平滑末端（blunted）（ＳｓｔＩＩ制限酵素部位）を、ｐＫＴ２３－ｈｉｐ３２３プラスミド内に
ライゲーションすることにより作製されたプラスミドであるｐＰＬｈｉｐ ｈｉｍＡ－５の構築に依存した。これについては、Nashら（１９８７年）、J.Bacteriology、１６９巻（９号）：４１２４～４１２７頁においてさらに詳細に記載されている。Ｋ５６０７株のｈｉｍＡ＋形質転換株は、ＨｉｍＡ＋についてスクリーニングすることにより同定し、制限消化によりプラスミドＤＮＡを解析した。プラスミド構造が明らかである全ての場合において、２コピーのｈｉｍＡが、タンデムダイレクトリピートとしてベクター内にライゲーションされていた。このプラスミドにおける２コピーのｈｉｍＡ遺伝子の存在が、選択により要請されているのかどうかは未知であるが、ｈｉｍＡ変異体を補完するには、プラスミドｐＰＬｈｉｍＡ－１における単一コピーのｈｉｍＡ遺伝子で十分であることを想起するべきである。プラスミドｐＰＬｈｉｐｈｉｍＡ－５を用いて、Ｎ５２７１株を形質転換し、Ｋ５７４６株を得た。
同じ手順を繰り返して、ＨＵ（配列番号３）を過剰産生した。
細胞は、３１℃で振とう水浴において、ＴＢＹ培地（１リットルあたり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、および５ｇの塩化ナトリウム）中で成長させた。中期対数増殖期（mid-log phase）（６５０ｎｍにおける光学密度、約０．６）において、細胞を４２℃の水浴へとシフトし、引き続き振とうした。３００ｍｌの培養物を遠心分離し、２０ｍＭのＮａＣｌを含有する０．６～０．９ｍｌのＴＥＧ（２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡナトリウム、１０％のグリセロール）中に懸濁させることが典型的であった。細胞は、各バースト間に４０秒間ずつを置く、６回の２０秒間バーストの音波処理により破壊した。音波抽出物の一部は、Ｓｏｍａｌｉ ＳＳ３４ローター内、１５，０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離した。音波抽出物の試料は、標準的な分子生物学技法に従うドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動により解析した。
精製は、以下に従って行った：３．６リットルの細胞バッチを、３時間にわたり誘導した。その後の全てのステップは、０～４℃で実施した。３．３リットルからの細胞ペレットを、２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍｌのＴＥＧ中に懸濁させて、２９ｍｌの総容量をもたらし、それぞれに、９０秒間の間隔を置き、３分間の音波処理の６回のバーストを施した２つのバッチにおいて、この懸濁物を破壊した。音波抽出物を１５，０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離し、１６．９ｍｌの清澄化した抽出物を得た。ポリミンＰ（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ）の１０％（容量／容量）溶液（１．１ｍｌ）を、この清澄化した抽出物へとゆっくり添加し、２０ｍｍにわたり撹拌した後、混合物を、１０，０００ｒｐｍで３０ｍｍにわたり遠心分離した。結果として得られるペレットを、５００ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍｌのＴＥＧ中に懸濁させ、１５分間にわたり撹拌した後、混合物を、１２，０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離した。上清（１０．３ｍｌ）を、３．２ｇの硫酸アンモニウムを添加することにより、５０％飽和へと調整し、２０分間にわたり撹拌し、１５，０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。結果として得られる上清を、１．６４ｇの硫酸アンモニウムを添加することにより、７０％飽和へと調整し、２０分間にわたり撹拌し、１５，０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。結果として得られるペレットを、１ｍｌのＴＧ（１０％のグリセロールを含有する５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４））中に懸濁させ、２回にわたり交換されるＴＧに対して透析した。透析された物質（２．０ｍｌ）を、ＴＧで平衡化した、１ｍｌのホスホセルロースカラム（Ｐ１１、Ｗｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ．）（０．５×５．８ｃｍ）にロードした。カラムを３ｍｌのＴＧで洗浄し、ＴＧ中の２０ｍｌのＫＣＩ直線勾配（０～１．２Ｍ）で展開した。０．５ｍｌの画分を収集し、－２０℃で保存し、ＩＨＦ活性についてアッセイした。
ポリクローナル抗ＩＨＦは、以下の通りに調製した。ウサギに、フロイント完全アジュバントを伴う２５０μｇの精製されたＩＨＦを注射した。フロイント不完全アジュバントを伴う２５０μｇのＩＨＦの追加免疫による免疫を、１、７、および１２週間後に施した。ＩＨＦについての免疫ブロット法により決定される通り、初回注射の１３週間後に収集した血清は、高力価のＩＨＦ反応性物質を有した。動物は、数年間にわたり維持し、それらの血清中の抗ＩＨＦの高力価を維持するために必要な場合は、さらなる追加免疫による免疫を施した。抗体をさらに精製することはなかった。粗血清は、－７０℃で保存した。ポリクローナル抗ＨＵも、同じ方式に従い調製した。
ＩＨＦまたはＨＵの各サブユニットに特異的なマウスモノクローナル抗体であって、配列番号１２～１７に対応する合成ポリペプチドを使用することにより生成される抗体を産生するハイブリドーマは、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｏｎｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、ＰＡに注文した。ハイブリドーマのうちの３つは、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣにより、生存率について検証された、上記の表１を参照されたい。
ウサギポリクローナル抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩおよび抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを以下の通りに調製した。ウサギにフロイント完全アジュバントを伴う２５０μｇのＩｈｆＢ２ＮＴＨＩペプチドまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩペプチドを注射した。フロイント不完全アジュバントを伴う２５０μｇのＩｈｆＢ２ＮＴＨＩまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩの２回の追加免疫による免疫を、２１日の間隔で施した。ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩのＥＬＩＳＡによって決定される通り、３回目の注射の２１日後に収集した血清は、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ反応性物質の≧４０，０００の逆数力価を有していた。抗体は、さらに精製しなかった。粗血清は、－７０℃で保存した。
マウスＦａｂ断片を、モノクローナル抗体の消化によって生成させた。特に、図１（Marianiら、A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab)2 suitable for clinical use from mouse IgGl、Molec. Immunol.（１９９１年）１月～２月、
２８巻（１～２号）：６９～７７頁． ＰＭＩＤ： ２０１１１３０）に示されるように、マウスＦａｂ断片を、マウスモノクローナル抗体ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ（クローン１２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５）、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ（クローン７Ａ４．Ｅ４．Ｇ４）およびＩｇＧ１ κ（クローンＰ３．６．２．８．１、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃ）の、アガロース固定したフィシン＋２５ｍＭシステイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる５時間の消化によって生成させた。ウサギＦａｂ断片を、ＩｇＧ富化ポリクローナルウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよびナイーブウサギ血清から、アガロース固定したパパインプロテアーゼ＋システイン－ＨＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる４時間の消化によって生成させた。次いで、図１および図１０に示されるように、断片を、プロテインＡスピンカラムによって精製し、１０ｍＭリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４に対して透析し、各調製物の純度を、１０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥ （ＢｉｏＲａｄ）およびＳＹＰＲＯオレンジタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確認した。各Ｆａｂ断片調製物の濃度は、１．４の吸光係数を使用するＮａｎｏｄｒｏｐを介して決定した。
（実施例２）
マウスＦａｂを使用するバイオフィルム低減の解析
この実験は、８ウェルのチャンバースライドにおいて、確立されたバイオフィルムの破壊のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルについて記載する。この実験で用いられる材料は、チョコレート寒天培地；ｓＢＨＩ（１ｍＬあたり２ｍｇのヘムおよび１ｍＬあたり２ｍｇのｂ－ＮＡＤを伴うＢＨＩ）；８ウェルのチャンバースライド（Ｎｕｎｃ＊ Ｌａｂ－Ｔｅｋ＊ Ｆｉｓｈｅｒ、型番１２－５６５－１８）；０．９％の滅菌食塩水；ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ
ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ、型番ＮＣ９４３９０２３）、およびホルマリンであった。
１日目に、ＮＴＨＩを、単離のために、チョコレート寒天上にこすりつけた（struck）。次いで、ＮＴＨＩを、３７℃および５％ＣＯ２で、２０時間にわたりインキュベートした。翌日、細菌を、ｓＢＨＩ中５ｍＬに懸濁させ、平衡化させ（３７℃、５％のＣＯ２）、光学密度を、ＯＤ４９０約０．６５に調整した。細菌を、平衡化したｓＢＨＩ（１ｍＬの細菌懸濁物＋５ｍＬのｓＢＨＩ）中、１：６に希釈した。次いで、細菌を、３７℃、５％ＣＯ２中で３時間にわたり、静置してインキュベートした（ＯＤ４９０を、約０．６５とする）。次に、細菌を、平衡化したｓＢＨＩ中で、再度１：２５００に希釈し、２００ｍＬの細菌懸濁物を、チャンバースライドの各ウェルに添加した。希釈のため、１０μＬの細菌を、エッペンドルフ管内の９９０μＬのｓＢＨＩへと添加し、８μＬの希釈物を、各チャンバー内の１９２μＬのｓＢＨＩへと添加し、３７℃、５％ＣＯ２中で静置してインキュベートした。
３日目、１６時間のインキュベーション後、バイオフィルムを攪乱しないようにウェルの角から培地を吸引することにより、チャンバーから培地を吸引した。次いで、２００ｍＬの平衡化したｓＢＨＩを各チャンバーに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で８時間にわたり静置してインキュベートした。８時間後、培地を吸引し、２００ｍＬの平衡化したｓＢＨＩを処置されていない各チャンバーに添加し、ウェルあたりｓＢＨＩ中、４０ｎＭまたは４４０ｎＭ抗体またはＦａｂ（以下の各々：マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ１ Ｆａｂ、ｍＡｂ ＩＨＦＢ２ＮＴＨＩ、ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、ｍＡｂ ｍＩＨＦＢ４ＮＴＨＩ、およびｍＡｂ ｍＩＨＦＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂ）を添加した。次いで、それらを、３７℃、５％ＣＯ２において静置してインキュベートした。
４日目、約１６時間のインキュベーション後、ｓＢＨＩを吸引し（aspirate sBHI was aspirated）、２００ｍＬの滅菌食塩水で２回にわたりバイオフィルムを洗浄した。食塩水を吸引し、２００ｍＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料を添加した。次に、１ｍＬの滅菌１０ｍＭリン酸緩衝食塩水中に３ｍＬの成分Ａおよび３ｍＬの成分Ｂを添加した。次いで、これを、室温で１５分間にわたり光から保護して静置してインキュベートした。染料を吸引し、２００ｍＬの滅菌食塩水で２回にわたりバイオフィルムを洗浄した。食塩水を吸引し、２００ｍＬのホルマリンを添加して、バイオフィルムを固定した。次いで、これを、室温で１５分間にわたり光から保護して静置してインキュベートした。ホルマリンを吸引し、２００ｍＬの滅菌食塩水で２回にわたりバイオフィルムを洗浄した。ガスケットを取り外し、スライドガラスにカバースリップを取り付け、カバースリップを、マニキュア液（nail polish）で封印し、乾燥させてから、共焦点顕微鏡法で観察した。
別個の実験において、ＮＴＨＩ８６－０２８ＮＰコロニーをチョコレート寒天での一晩培養物から収集し、培地（ｓＢＨＩ）１ｍｌ当たり２μｇのβ－ＮＡＤおよびヘムを補充した脳心臓注入ブロス中に懸濁した。次に４９０ｎｍでの光学密度を０．６５に調整し、培養物をｓＢＨＩで１：６に希釈してから静置して３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。次に、培養物を新鮮なｓＢＨＩで１：２５００に希釈し、２００μｌの懸濁液を８ウェルチャンバースライドの各ウェルに分注した。次にスライドを静置して３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。１６時間後、２００μｌの新鮮なｓＢＨＩを各ウェルに添加し、スライドをさらに８時間インキュベートした。この時点で、培地を各ウェルから吸引し、１７１ｎＭの処置物（treatment）（ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体もしくはＦａｂ断片）を添加した。バイオフィルムをさらに１６時間インキュベートした。次にバイオフィルムを洗浄し、ＦＭ１－４３ＦＸ細菌細胞膜染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした１６％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、４．０％酢酸中で、４℃で一晩固定した。固定剤を吸引し、２００μｌの０．９％食塩水を各ウェルに添加してからバイオフィルムをＺｅｉｓｓ５１０Ｍｅｔａ－ｌａｓｅｒ走査共焦点顕微鏡で観察した。画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎソフトウェアに蓄積し、バイオフィルムバイオマスはＣＯＭＳＴＡＴ２ソフトウェアで計算した。
マウスにおいて、個別に、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩおよびｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩの各々を使用する標準的な技法に従い、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩＨＦに対して向けられたモノクローナル抗体を調製した。実施例１は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩおよびｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩに対して向けられたモノクローナル抗体からのＦａｂ（断片抗原結合性）断片の生成について記載している。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩポリペプチドに対して向けられたマウスモノクローナル抗体から生成されたＦａｂは、培地、ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、およびマウスＩｇＧ１ Ｆａｂ対照と比べて、バイオフィルムの頑健な破壊を有することが裏付けられた（図２）。具体的には、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂは、ｍＡｂ ＩｇＧ１ Ｆａｂ対照に対してバイオマスの７４％の低減を示すバイオフィルムの頑健な破壊が裏付けられた。ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂは、対照に対してバイオマスの２％増加が裏付けられた（図２）。
ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ２９２１３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２７８５３、およびＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｋ５６－２によって形成されたバイオフィルムを破壊する能力を調べた（図３）。特に、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ２９２１３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ２７８５３、およびＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｋ５６－２によって形成されたバイオフィルムを、ウェルあたり４４０ｎＭのマウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ１ Ｆａｂ、ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、およびｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂと共にインキュベートした（図３）。ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよびｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂは、全ての被験細菌種によって形成されたバイオフィルムの頑健な破壊が裏付けられた（図３）。
（実施例３）
マウスＦａｂを使用する中耳炎解析
中耳の感染症（または中耳炎、ＯＭ）は、世界的に高度に蔓延した疾患であり、最も重度の形態（慢性化膿性ＯＭまたはＣＳＯＭと呼ばれる）に、世界で毎年５０００万～３億３０００万人の小児が罹患している。ＯＭの社会経済的負荷もまた大きく、費用は、米国だけで、毎年５０～６０億ドルの間である。ＯＭの優勢な細菌性病原体の３つ全てが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、バイオフィルムを形成することが公知であり、近年、臨床医らは、ＯＭの慢性性および再発が、少なくとも部分的には、中耳腔内の細菌バイオフィルムの形成に起因することを認識するようになっている。
実際、中耳腔換気用チューブおよび遷延性耳漏を伴う小児患者に由来する耳漏固体を、微生物培養物と組み合わせたｅＤＮＡおよびＩＨＦについて標識化した結果は、バイオフィルムが、慢性耳漏において役割を果たすことを指し示す。具体的に、分析された小児耳漏試料１５例のうち、９例（６０％）が、ｅＤＮＡ（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ５９４にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧにより検出されるウサギ抗ＩＨＦを使用して標識化された）の格子と関連するＩＨＦの標識化について陽性の固体を含有し、７５％が、陽性の細菌培養物をもたらした。細菌の培養結果は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ＭＲＳＡ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を裏付けた。これらのデータは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、他の耳疾患の中でも、中耳腔換気用チューブ後の耳漏における治療標的として用いられうることを示唆する。
ＯＭについてのチンチラモデルの１つでは、若年のチンチラに、まずウイルス性の「風邪」を施した１週間後、これらに、生菌による接種物で鼻腔内的にチャレンジした。「私の子供は風邪をひき、１週間後に耳の感染症になりました」というヒトにおける状態と同様に、チンチラもまた、チャレンジの約１週間後に、ウイルス性の上気道感染症を患う一方で、細菌性ＯＭを発症した。細菌の増加が中耳に到達すると（耳管の上行を介して、または中耳腔への直接的なチャレンジ後において）、細菌は、頑健なバイオフィルムを形成する。したがって、本出願人らは、本明細書で報告する通り、チンチラモデルを意図し、これをすでに実際に用いて、既存のバイオフィルムを速やかに消失させる結果をもたらすＩＨＦによる免疫化の防御効果を裏付けた。このモデルはまた、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の受動送達を介する、またはＩＨＦもしくは他のＤＮＡＢＩＩファミリーメンバーに結合することが公知である小分子または他の作用剤の送達を介する療法にも有用である。
チンチラモデルを、ヒトワクチンの開発および前臨床試験に用いるため、ヒト宿主、特に、小児との有意義な免疫学的相応物を確立することが重要である。本出願人らは、ＮＴＨＩに起因するＡＯＭを伴う小児から回収された滲出物と、実験によるＮＴＨＩ誘導性ＯＭを伴うチンチラに由来する中耳液とが、ＯＭＰ Ｐ５の免疫優性領域を類似した階層的な方式で認識することを示した（例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙら（２０００年）、Ｉｎｆｅｃｔ、６８巻（４号）：２１１９～２１２８頁；Ｎｏｖｏｔｎｙら（２００７年）、９ｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ、Ｓｔ． Ｐｅｔｅ Ｂｅａｃｈ、Ｆｌａ；Ｎｏｖｏｔｎｙら（２００２年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻（２９～３０号）：３５９０～３５９７頁を参照されたい）。本出願人らはまた、実験によるＯＭを伴うチンチラ、自然ＯＭを伴う小児、およびＣＯＰＤが増悪した成人のいずれもが、ＰｉｌＡを示すペプチドを非常に類似した方式で認識することも示した（例えば、Ａｄａｍｓら（２００７年）、１０７ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ；Ａｄａｍｓら（２００７年）、９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ、Ｓｔ． Ｐｅｔｅ Ｂｅａｃｈ、Ｆｌａ．を参照されたい）。したがって、実験によるＯＭを伴うチンチラと、自然疾患を有する小児とは、少なくとも２つの非類縁ＮＴＨＩタンパク質であるアドヘシンに対して免疫学的に類似して応答する。近年、この類似が最終的な試験にかけられたが、そこでは、新規の１１価のプロテインＤ－肺炎菌多糖類コンジュゲートワクチンの前臨床有効性試験を実施するのに、チンチラのＡＶ－ＮＴＨＩ重感染モデルが用いられた。チンチラにおいて得られたデータが３４％の有効性を予測する一方、小児で調べたところでは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘導性ＯＭに対して得られた有効性が３５．６％であり（例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙら（２００６年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻（２２号）：４８０４～１１頁；およびＰｒｙｍｕｌａら（２００６年）、Ｌａｎｃｅｔ．、３６７巻（９５１２号）：７４０～８頁を参照されたい）、それにより、ＯＭワクチン候補物質の開発および試験に対するこのモデルの関与性が強く裏付けられた。
方法：
生成された抗体の有効性を決定するために、ＮＴＨＩ細菌を、チンチラの中耳腔に注射して、バイオフィルムを形成させた。特に、中耳疾患のエビデンスのない成体チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）を得（Ｒａｕｓｃｈｅｒ’ｓ Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ Ｒａｎｃｈ、ＬＬＣ）、７日間休息させ、その後、滅菌、発熱物質不含食塩水で希釈した中耳骨胞（bulla）あたり１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）の分類不能Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ番号８６－０２８ＮＰによる経中耳骨胞チャレンジ（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を行った（０日目（０））（図４）。４日目および５日目に、３４２ｎＭのＦａｂ断片溶液を各中耳腔中に注入した（中耳骨胞あたり１００μｌ；３４２ｎＭ）（図４）。６日目（６）に、動物を屠殺した。実験には、マウスｍＡｂ ＩｇＧ１ Ｆａｂ断片（４匹のチンチラ）、マウスｍＡｂ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ断片（４匹のチンチラ）、およびマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂ断片（４匹のチンチラ）を使用するコホートを含めた。
中耳液を収集し、一定量を系列希釈し、相対的な浮遊細菌負荷を定量するためにチョコレート寒天に塗布した。残存液を１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を分離し、細胞ペレットおよび液体の両画分を瞬時冷凍してから－８０℃で保存した。中耳粘膜および接着した細菌バイオマスをデジタル的にイメージングし、予め秤量した微量遠心分離管に収集し、１．０ｍｌの滅菌した０．９％塩化ナトリウム中でホモゲナイズした。ホモジネートはまた、組織／バイオマスの１ｍｇ当たりの中耳腔内に接着した細菌の集団を定量するために、以前の通り系列希釈してプレーティングした。残存する試料を瞬時冷凍してから－８０℃で保存した。培養プレートを加湿した雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートしてからＰｒｏｔｏｃｏｌ２機器（Ｓｙｎｂｉｏｓｉｓ）を介して細菌コロニーを計数した。
ビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリー。デジタルカメラシステムに連結された０度、３インチプローブを使用するビデオ耳鏡検査（ＭｅｄＲｘ、Ｌａｒｇｏ、ＦＬ）を利用してＯＭの徴候（例えば、鼓膜炎症および／または中耳腔における液体の存在）をモニターした。ティンパノメトリーはＭＡＤＳＥＮ Ｏｔｏｆｌｅｘティンパノメーターで実施し、データはＯＴＯｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ、ＩＬ）で分析した。ＯＭの全体的な徴候は、確立された０から４＋のスケールに盲検的に等級付けし、≧２．０のスコアの中耳は、中耳液が鼓膜の後に見ることができる場合、ＯＭについて陽性と見なした。鼓膜が外耳道内の閉塞により（すなわち、耳垢蓄積により）見ることができないならば、その耳は毎日の計数から除外した。確立されたプロトコールに従って、各中耳は独立していると考えられ、各コホートについて、ＯＭの中耳の百分率を計算した。
中耳腔内の残存バイオフィルムをランク付けするために、中耳画像はスクランブルされ、７人の個人が盲検的によく調べた。確立された規程を使用して、０から４までのスコアを各画像に割り当てた：０：見ることができるバイオフィルムはない、１：バイオフィルムは中耳腔の≦２５％を満たす、２：バイオフィルムは中耳腔の＞２５％から≦５０％を満たす、３：バイオフィルムは中耳腔の＞５０％から≦７５％を満たす、４：バイオフィルムは中耳腔の＞７５％から≦１００％を満たす。
このランク付け／スコア付けスケールは、以下の表２に詳述されており、各動物の中耳内に残存するバイオマスの相対量を示す。
Figure 2023033394000032
清澄化された中耳液中の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネル（ＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３およびＩＬ－１７Ａ）の相対量を、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ
ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して決定し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６サイトメーターでサンプルを評価した。データをＦｌｏＪｏ Ｖ＿１０ソフトウェアを用いて解析した。
中耳バイオフィルムおよび粘膜の組織学的解析を実施するために、中耳骨胞を画像処理後に１０％中性緩衝ホルマリンに入れ、４℃で保存した。中耳骨胞を室温で２時間、水ですすぎ、次いで、新鮮な０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．９５）中に一晩入れ、続いて、さらに水ですすいだ。次いで、中耳骨胞を０．３５Ｍ ＥＤＴＡ－０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．９５）中に入れ、シュウ酸アンモニウム試験で陰性が達成されるまで、３７℃、１０００ワットに設定したＨ２８００ Ｅｎｅｒｇｙ Ｂｅａｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓマイクロ波プロセッサを用いて２時間サイクルで脱灰した。次いで、中耳骨胞をパラフィン中に包埋し、５μｍ厚の切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。
結果：
図５（Ａ）に示されるように、ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラについて、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後、４、５および６日目に平均耳鏡検査スコアを決定した。ＷｅｌｃｈＡｌｌｙｎ
ＭａｃｒｏＶｉｅｗ耳鏡を使用して、各動物の鼓膜を可視化し、０～４＋スケールで盲検的にランク付けし、≧２．０のスコアは、中耳腔内の流体の存在、すなわち、中耳炎を示した（Novotnyら、（２００６年） Vaccine第２４巻：４８０４頁）。ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの投与は、ＩｇＧ１ ＦａｂおよびＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照と比較して、より低い平均耳鏡検査スコアをもたらした（＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１）。
図５（Ｂ）は、ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラについて、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の０日目、４日目および６日目の代表的な耳鏡検査画像を示す。４日目までに、鼓膜の後ろに中耳液が見られる。４日目および５日目に、チンチラにＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与された。６日目に、ＩｇＧ１ Ｆａｂ（対照）を投与されたチンチラにおいて中耳液が見られ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂを投与されたチンチラにおいて、鼓膜の肥厚が見られることもあり、これらの両方とも、バイオフィルムの存在を示す。６日目に、ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを投与されたチンチラにおいて、非炎症鼓膜が見られ、これは、バイオフィルムの消散を示す。
図６（Ａ）に示されるように、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ） ８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後のＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける粘膜バイオフィルムのミリグラム（ｍｇ）あたりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ） ８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を実施した。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ（処置は、４および５日目に実施した）後の６日目に実施した。ＩｇＧ１ ＦａｂおよびＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照と比較して、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いる２回の処置の受容１日後の中耳バイオフィルム内で、および粘膜に対して、有意に少ないＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰが接着した（図６（Ａ））（ｐ≦０．０１）。
さらに、図６（Ｂ）に示されるように、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後のＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおいて、中耳液のミリグラム（ｍｇ）あたりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を実施した。ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの間で、中耳液中の回収可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰの相対濃度間に相違は観察されなかった（図６（Ｂ））。いずれか特定の理論に捉われようとは思わないが、この研究は短い時間枠（チャレンジから試料回収まで６日のみ）で実施したので、ＤＮＡＢＩＩタンパク質先端部に対して向けられた抗体が、バイオフィルム崩壊および残存する細菌の放出を誘導するので、相違が観察されなかった可能性があると考えられる。この短い時間枠は、放出された（浮遊）細菌のクリアランスを観察するためには十分に長くなかった可能性があると考えられる。
図７（Ａ）に示されるように、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラから集められた、中耳粘膜および粘膜バイオフィルムの量（グラム、ｇ）の定量も実施した。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後６日目に実施した。図７（Ａ）に示されるように、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いる２回の処置の１日後に、中耳内により少ないバイオマスが存在した。
図７（Ｂ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラから回収された中耳液（ＭＥＦ）の容量（マイクロリットル、ｍＬ）の定量を示す。定量は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の６日目に実施した。ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂが投与されたチンチラ間で、ＭＥＦの容量間に相違は観察されなかった。いずれか特定の理論に捉われようとは思わないが、この研究は短い時間枠（チャレンジから試料回収まで６日のみ）で実施し、ＤＮＡＢＩＩタンパク質先端部に対して向けられた抗体が、バイオフィルム崩壊および残存する細菌の放出を誘導するので、相違が観察されなかった可能性があると考えられる。この短い時間枠は、ＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはマウス ｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置されたチンチラ間で回収された中耳液の相対容量の相違を観察するためには十分に長くなかった可能性があると考えられる。
ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの、チンチラの中耳において形成されたバイオフィルムを破壊する能力を評価するために、粘膜バイオマス解析も実施した。図８（Ａ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラについて７名の個人によって盲検的によく調べられた（reviewed）粘膜バイオマススコアを示す。粘膜バイオフィルムスコアスケールを使用して、中耳腔内の残存するバイオフィルムをランク付けした。確立された規程（rubric）を使用して、０～４のスコアを以下の通りに各画像に割り当てた：ゼロ（０）：見ることができるバイオフィルムなし、１：バイオフィルムが中耳腔の＞０～≦２５％を満たす、２：バイオフィルムが中耳腔の＞２５％～≦５０％を満たす、３：バイオフィルムが、中耳腔の＞５０％～≦７５％を満たす、４：バイオフィルムが、中耳腔の＞７５％～１００％を満たす。ＩｇＧ１ Ｆａｂ対照またはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照が投与されたチンチラと比較して、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置したチンチラにおいて、有意に低い粘膜バイオマススコアが観察された（＊Ｐ≦０．０５および＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後のＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＡｂ ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかの最終用量の受容１日後の耳鏡検査によって得られた代表的な中耳画像が図８（Ｂ）に示されている。ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いる処置は、残存するバイオフィルムがほとんどないし全くないことを示すが、ＩｇＧ１ ＦａｂまたはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ（対照）を用いる処置は、中耳中の残存する多量のバイオフィルムを示す。
清澄化された中耳液中の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインを測定して、炎症に対するｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの効果を評価した。図９は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける、清澄化中耳液中の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネル（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１２ｐ７０およびＴＮＦ）の相対量を示す。定量は、ミリリットル（ｍｌ）ＭＥＦあたりのピコグラム（ｐｇ）サイトカインを提供するように実施した。ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂおよびＩｇＧ１ Ｆａｂ対照を用いて処置した中耳において、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂに対してより多量の炎症誘発性サイトカインが見られた。最大量の抗炎症性サイトカインＩＬ－４（データは示さず）、ＩＬ－１０（図９に示されている）、およびＩＬ－１３（データは示さず）が、ＩｇＧ１ ＦａｂおよびＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照と比較してｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置した中耳において観察された。
図１０は、チンチラにおける中耳の組織学的解析を示す。チンチラに、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にマウスＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＦａｂまたはマウスｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ
Ｆａｂのいずれかが投与された。染色は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて実施した。画像は、１０Ｘ対物レンズを使用して入手した。スケールバーは、１００μｍに相当する。左の画像は、マウスＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照が投与された動物から得た中耳を示す。この組織切片は、中耳腔内に存在する頑健なバイオフィルムならびにＰＭＮの流入、粘膜下浮腫および病巣の出血によって証明されるような有意な炎症の徴候を示す。全体的に、マウスＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照の投与後に、疾患の治療（remediation）または既存の細菌バイオフィルムの破壊はなかった。逆に、右の画像は、マウ
スｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂが投与された動物から得た中耳を示す。この組織切片は、中耳内腔内にバイオフィルムの痕跡が全くないことを示す。加えて、制限された粘膜下病巣の出血を伴う粘膜上皮の幾分かの細胞崩壊はあるものの、これらの変化は、左の画像と比較して格別に軽度である。全体的に、マウスｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの投与は、この前臨床研究において得られた他のデータと十分に一致して、既存の細菌バイオフィルムの完全根絶および有意に低減された炎症の徴候の両方をもたらした。
（実施例４）
ウサギＦａｂを使用する中耳炎解析
方法：
実施例１は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩおよびｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩに対して向けられたウサギポリクローナル抗体からの、ならびにナイーブウサギ血清ＩｇＧからのＦａｂ（断片抗原結合性）断片の生成を記載する。各Ｆａｂ調製物（ウサギポリクローナルナイーブＦａｂ、ウサギポリクローナルＩｈｆＢ２
Ｆａｂ、およびウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂ）の純度を、ＰＡＧＥによって確認した（図１１）。図１１は、１０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）およびＳＹＰＲＯオレンジタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって確認されたような、各Ｆａｂ調製物（３種の別個の調製物：ナイーブ、ＩｈｆＢ２およびｍＩｈｆＢ４）の純度を示す。
図１１は、ポリクローナルウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、およびナイーブウサギ血清から生成されたＦａｂ断片を使用する成体チンチラの中耳において、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰによって形成されたバイオフィルムの破壊を解析する方法を描示する。実験には、ナイーブウサギ血清ＩｇＧ Ｆａｂ断片、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ断片、およびウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂ断片を使用するコホートを含んでいた。
ウサギポリクローナル抗体から生成されたＦａｂ（断片抗原結合性）断片の有効性を決定するために、ＮＴＨＩ細菌を、チンチラの中耳腔に注射して、バイオフィルムを形成させた。特に、中耳疾患のエビデンスのない成体チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）を得（Ｒａｕｓｃｈｅｒ’ｓ Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ Ｒａｎｃｈ、ＬＬＣ）、７日間休息させ、その後、滅菌、発熱物質不含食塩水で希釈した、中耳骨胞あたり１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）の分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ番号８６－０２８ＮＰを用いる経中耳骨胞チャレンジ（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を行った（０日目（０））（図１１）。次いで、４日目および５日目または４、５および６日目のいずれかに、３４２ｎＭのＦａｂ断片溶液を各中耳腔中に注入した（中耳骨胞あたり１００μｌ；３４２ｎＭ）。４および５日目にＦａｂ溶液を投与したチンチラについて、６日目または１２日目のいずれかで、コホートあたり３匹のチンチラを屠殺した（２用量実験）（図１１）。４、５および６日目に投与されたチンチラについては、１３日目にコホートあたり３匹のチンチラを屠殺した（３用量実験）。屠殺後、チンチラを画像化し、中耳粘膜を収集し、接着したバイオフィルムを評価し、中耳液を収集し、細菌の定量を実施し、サイトカイン多重アッセイを使用して中耳液を評価した。
中耳液を調製する方法、ビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリー、残存バイオフィルムランク付けおよびサイトカインの定量は、実施例３に記載されたように実施した。
ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの、粘膜バイオフィルムを低減する能力を決定した。図１２は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にウサギＩｇＧ１ Ｆａｂ、ウサギＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはウサギｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける粘膜バイオフィルムのミリグラム（ｍｇ）あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰの定量を示す。定量は、以下の用量／屠殺の組合せについて実施した：（１）それぞれのウサギＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのウサギＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのウサギＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。
３つの用量／屠殺組合せ全てにおいて、非特異的ＩｇＧ１ ＦａｂおよびＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照と比較して、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの投与後に、有意に少ないＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰしか、中耳粘膜に対して接着せず、バイオフィルム内に存在しなかった（図１２）。２用量のｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂ断片の投与は、確立された中耳バイオフィルムの根絶において３用量に匹敵した（図１２）。図１２に示されるように、２回の治療用量の投与の７日後に、ｍＩｈｆＢ４免疫原に対するＦａｂ断片を受容した動物は、中耳から得たこの生物学的試料内に有意に少ない細菌しか有していなかった（＊＊Ｐ≦０．０１）。
図１３は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にウサギポリクローナルＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける、中耳粘膜のミリグラム（ｍｇ）あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰの定量を示す。定量は、以下の用量／屠殺組合せについて実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与し、１日後に屠殺した、（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与し、７日後に屠殺した、および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与し、７日後に屠殺した。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後に、Ｆａｂの用量を、４および５日目（２用量）に、または４、５および６日目（３用量）に投与した。ＤＮＡＢＩＩタンパク質先端部に対して向けられた抗体が、バイオフィルム崩壊および残存細菌の放出を誘導し得るので、最終用量の投与の１日後の中耳液中の回収可能なＮＴＨＩの相対濃度の相違は予測せず、観察もしなかった。しかし、２または３用量のｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂ断片の受容１週間後に、ＩｇＧ１ ＦａｂまたはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂを受容したコホートのいずれかと比較して、中耳液内のＮＴＨＩの有意な低減が観察された（図１３）（それぞれ、Ｐ≦０．０１およびＰ≦０．０５）。ｍＩｈｆＢ４に対して向けられたＦａｂ断片の投与により、Ｆａｂの最後の用量の投与後少なくとも１週間治療効果を継続して媒介し、データは、この投与計画は適応性があり最適化可能であることを示唆している。
ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの、バイオフィルムを破壊する能力を評価するために、平均粘膜バイオフィルムスコアを決定した。図１４は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にウサギポリクローナルＩｇＧ１ Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ、またはｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラの平均粘膜バイオフィルムスコアを示す。定量は、以下の用量／屠殺組合せについて実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与し、１日後に屠殺した、（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与し、７日後に屠殺した、および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与し、７日後に屠殺した。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後に、Ｆａｂの用量を、４および５日目（２用量）に、または４、５および６日目（３用量）に投与した。粘膜バイオフィルムスコアスケールを使用して、中耳腔内の残存するバイオフィルムをランク付けした。確立された規程を使用して、０～４のスコアを以下の通りに各画像に割り当てた：ゼロ（０）：見ることができるバイオフィルムなし、１：バイオフィルムが中耳腔の＞０～≦２５％を満たす、２：バイオフィルムが中耳腔の＞２５％～≦５０％を満たす、３：バイオフィルムが、中耳腔の＞５０％～≦７５％を満たす、４：バイオフィルムが、中耳腔の＞７５％～１００％を満たす（図１４）。
図１４に示されるように、ウサギポリクローナルＩｇＧ１ Ｆａｂ対照またはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂ対照が投与されたチンチラと比較して、ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置したチンチラにおいて、有意に低い平均粘膜バイオマススコアが観察された（＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１）。それぞれのＦａｂの２用量を投与し、１日後に屠殺したデータについては、ＩｇＧ１ ＦａｂまたはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂを受容したコホートのいずれかと比較してｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置したチンチラにおいて有意に低い平均粘膜バイオマススコアが観察された（Ｐ≦０．０５）（図１４）。それぞれのＦａｂの２用量を投与し、７日後に屠殺したデータについては、ＩｇＧ１ Ｆａｂを受容したコホートと比較して（Ｐ≦０．０５）、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂを受容したコホートと比較して（Ｐ≦０．０１）、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置したチンチラにおいて有意に低い平均粘膜バイオマススコアが観察された（図１４）。それぞれのＦａｂの３用量を投与し、７日後に屠殺したデータについては、ＩｇＧ１ ＦａｂまたはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂを受容したコホートのいずれかと比較してｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置したチンチラにおいて有意に低い平均粘膜バイオマススコアが観察された（Ｐ≦０．０５）（図１４）。ＤＮＡＢＩＩタンパク質先端部に対して向けられた抗体が、バイオフィルム崩壊を誘導するので、ｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂ断片が投与された動物の中耳における粘膜バイオフィルムの有意な減少が、２用量の受容１日後に観察された。２または３用量のｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂ断片の受容１週間後に、この減少は維持された。ｍＩｈｆＢ４に対して向けられたＦａｂ断片の投与により、最後の用量の受容後、少なくとも１週間治療効果を継続して媒介し、データは、この投与計画は適応性があり、最適化可能であることを示唆している。
清澄化された中耳液中の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインを測定して、炎症に対するｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂの効果を評価した。図１５は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後にナイーブウサギＩｇＧ Ｆａｂ、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ ＩｇＧ Ｆａｂ、またはウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ ＩｇＧ Ｆａｂのいずれかが投与されたチンチラにおける、清澄化された中耳液中の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネルの相対量を示す。２用量のＦａｂ断片が投与され、第２の用量の受容１日後に屠殺したチンチラから流体を収集した。測定された炎症誘発性サイトカインには、以下が含まれていた：ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦおよびＩＦＮγ。測定された抗炎症性サイトカインには、以下が含まれていた：ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３。ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ ＩｇＧ Ｆａｂを用いて処置された中耳と比較して、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ Ｆａｂまたは非特異的ウサギＩｇＧ Ｆａｂを用いて処置された中耳において炎症誘発性サイトカインのより大きな相対量が観察された（図１５に示される）。ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ Ｆａｂを用いて処置された中耳において最大量の抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３）が観察された（図１５に示される）。
無傷のウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナルＩｇＧに対するＩｇＧ Ｆａｂ断片の効力のまとめを、以下の表５に示す。
Figure 2023033394000033
Figure 2023033394000034
表５は、多様なマウスモノクローナルの各々を生成するために使用される標的（ＩｈｆＢ２およびｍＩｈｆＢ４）を示し、これらの標的各々に対するＩｇＧおよびＦａｂ断片のデータを提供する。表５はまた、多様なウサギポリクローナル血清の各々を生成するために使用される標的（ＩｈｆＢ２およびｍＩｈｆＢ４）を示し、これらの標的各々に対するＩｇＧおよびＦａｂ断片のデータを提供する。示した実験はすべて、高度に制御された治療研究として実施された。表は、上記の実施例２、３および４で提示した実験に関する定量の概要を示しかつ提供し、「Monoclonal antibodies against DNA-binding tips of DNABII proteins disrupt biofilms in vitro and induce bacterial clearance in vivo.」（２０１６年）EBioMedicine.８月；１０巻：３３～４４頁において
発表されたデータ（「ＰｏＭｏ」研究コード）も提示する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ対ＮＴＨＩバイオフィルムについて、使用した方法は上記の実施例２において記載したとおりであった。示したような抗体またはＦａｂ断片の正確な濃度を、予め形成されたバイオフィルムに適用した。特に、使用した濃度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析で使用した全抗体および断片について１７１ｎＭであった。ｉｎ ｖｉｖｏ研究について、使用した方法は上記の実施例３および４において記載したとおりであった。バイオフィルム形成を開始するために各動物の耳に送達された正確な接種物（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰ）を制御し、耳の注入は示したような抗体または断片の特定量で実施した。特に、使用した濃度は、ｉｎ ｖｉｖｏ分析で使用した全抗体および断片について３４２．５ｎＭであった。
マウス抗体およびＦａｂ断片を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏバイオフィルム解析において、マウスモノクローナルｍＩｈｆＢ４ ＩｇＧは、バイオマスの７１％低減を示し、マウスモノクローナルｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂは、バイオマスの７７％低減を示した。ＮＴＨＩ誘発中耳炎のｉｎ ｖｉｖｏチンチラモデルについて、マウスモノクローナルｍＩｈｆＢ４ ＩｇＧは、ＣＦＵ ＮＴＨＩ／ｍｇ 中耳粘膜バイオフィルムの１．８－ｌｏｇ１０低減を示し、マウスモノクローナルｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂは、ＣＦＵ ＮＴＨＩ／ｍｇ 中耳粘膜バイオフィルムの３．９－ｌｏｇ１０低減を示した。これらの測定は、最終用量の受容１日後に実施し、非特異的マウスＩｇＧ１との比較である。マウスＩｈｆＢ２ ＩｇＧは、３．３の中耳バイオフィルムスコアを示した。マウスＩｈｆＢ２ Ｆａｂは、２．７の中耳バイオフィルムスコアを示した。マウスｍＩｈｆＢ４ ＩｇＧは、１．４の中耳バイオフィルムスコアを示した。マウスｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂは、１．０の中耳バイオフィルムスコアを示した。
ウサギ抗体およびＦａｂ断片を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏバイオフィルム解析では、ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ ＩｇＧは、バイオマスの７５％の低減を示し、ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂは、バイオマスの７８％の低減を示した。ＮＴＨＩ誘発中耳炎のｉｎ ｖｉｖｏチンチラモデルについて、ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂは、ＣＦＵ ＮＴＨＩ／ｍｇ 中耳粘膜バイオフィルムの５．５－ｌｏｇ１０低減を示したが、ウサギポリクローナルＩｈｆＢ２ Ｆａｂ（対照）は、ＣＦＵ ＮＴＨＩ／ｍｇ 中耳粘膜バイオフィルムの０．４－ｌｏｇ１０低減を示した。ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ Ｆａｂは、１．０の中耳バイオフィルムスコアを示したが、ウサギポリクローナルＩｈｆＢ２ Ｆａｂ（対照）は、３．７の中耳バイオフィルムスコアを示した。
表５に提供した「ＰｏＭｏ」ｉｎ ｖｉｖｏ研究コードは、「Monoclonal antibodies
against DNA-binding tips of DNABII proteins disrupt biofilms in vitro
and induce bacterial clearance in vivo.」（２０１６年）EBioMedicine.８月
；１０巻：３３～４４頁において発表されたデータを指す。
（実施例５）
受動免疫
本明細書に記載される方法を使用して、非免疫対象に受動免疫を付与することができる。所与の抗原に対する受動免疫は、本明細書に開示される特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体断片または抗原結合性断片の移入を介して付与され得る。抗体のドナーおよびレシピエントは、ヒト対象の場合もあり、非ヒト対象の場合もある。それに加えて、またはその代わりに、抗体組成物は、特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体断片または抗原結合性断片をコードする、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを含み得る。
受動免疫は、免疫原性組成物の投与がレシピエント対象に対して危険性をもたらす場合、レシピエント対象が免疫無防備状態（immuno-compromised）である場合、またはレシピエント対象が即時的な免疫を必要とする場合に付与することができる。免疫原性組成物は、選択された投与方式と符合する形で調製することができる。組成物は、抗体断片および／または抗原結合性断片を、単独で、またはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｉｎ ｖｉｖｏで生成された抗体、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された抗体、精製もしくは部分精製された抗体、もしくは全血清と組み合わせて含み得る。投与は、抗体組成物の単回用量を含む場合もあり、初回投与に続いて、１回または複数回の追加免疫用量を含む場合もある。追加免疫用量は、初回用量の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後、もしくは１２カ月後、または他の任意の時点において施すことができる。追加免疫用量は、対象の抗体力価を評価した後で投与することもできる。バイオフィルム形成の間、療法の有効性をモニタリングする方法を使用できる。
バイオフィルム形成をモニタリングするためにビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリーを使用できる。デジタルカメラシステム（ＭｅｄＲｘ、Ｌａｒｇｏ、ＦＬ）に接続された０度、３インチプローブを使用するビデオ耳鏡検査を使用して（iss utilized）、Ｏ
Ｍの徴候（例えば、鼓膜炎症および／または中耳腔中の流体の存在）をモニタリングする。ティンパノメトリーは、ＭＡＤＳＥＮ Ｏｔｏｆｌｅｘティンパノメーターを用いて実施し、データは、ＯＴＯｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ、ＩＬ）を用いて解析する。ＯＭの全体的な徴候を、確立された０～４＋スケールで盲検的に等級付けし、≧２．０のスコアを有する中耳は、鼓膜の後ろの中耳液を見ることができる場合にはＯＭについて陽性とみなした。外耳道内の閉塞により（すなわち、耳垢蓄積のために）鼓膜を見ることができない場合には、その耳をその日のカウントから除外できる。確立されたプロトコールによって、各中耳は、独立しているとみなされ、各コホートについて、ＯＭを有する中耳のパーセンテージを算出した。炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの生成は、本明細書に開示される方法を使用して評価できる。
（実施例６）
口腔疾患の処置
歯槽骨および歯肉を破壊する歯周炎およびインプラント周囲炎などの炎症性疾患の病因には、多数の口内細菌（例えば、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が関与している。これらの細菌の病因についての探索は、有効な動物モデルの欠如により妨げられている。特定の細菌の病原性を探索することの難題の１つは、外因性細菌が、動物の口腔内に導入された場合のバイオフィルムを確立することの困難である。歯周炎の動物モデルは開発されているが、接種された動物の口腔から培養可能な細菌が回収されることはまれである。特定の細菌の病原性を評価し得る有効な動物モデルを開発することは、それらの病原性機構を解明することに大きな一助となるであろう。
本明細書に記載の組成物を使用して、口腔疾患を処置できる。有効性を試験するために、機械加工したチタン製の歯科インプラント（１．２×４．５ｍｍ）の表面は、Ａ１０３によるグリットブラスト（１００μｍ）、およびＨＣｌによるエッチング（ｐＨ７．８、８０℃で２０分間にわたる）によって修飾できる。機械加工およびナノテクスチャー処理したインプラントを、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａａ）のＤ７Ｓ臨床株を接種したＴＳＢ培地中、３７℃で１～３日間にわたりインキュベートする。インプラント上の細菌バイオフィルムは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）で染色した後、ＳＥＭにより解析するほか、共焦点レーザー走査顕微鏡法により解析する。バイオフィルムが確立されたインプラントおよびバイオフィルムが確立されていないインプラントを、雌ラットの上顎の小臼歯領域と切歯領域との間で歯槽骨に経粘膜的に配置する。ｉｎ ｖｉｖｏで配置されたインプラントにおけるバイオフィルムの存在を検出するため、２日後に唾液およびインプラントの口腔表面から細菌試料を収集する。Ａａは、培養によるほか、ＰＣＲ解析によっても検出できる。様々な時点、例えば、植え込みの６週間後に、インプラント周囲の骨および粘膜組織についてのマイクロＣＴ解析および組織学的解析を実施できる。本明細書に開示される方法および組成物は、本明細書に記載の組成物を使用してこれらのバイオフィルムを低減および／または排除するための治療的戦略ならびに予防的戦略の両方を開発する。感染対照と比較した、発赤、炎症および出血の減少は、バイオフィルム減少および／または排除を示すであろう。加えて、感染対照と比較した、インプラントスクリューの炎症性または炎症誘発性組織像の減少または不在およびトルク除去力の維持は、バイオフィルム低減および／または排除を示す。
（実施例７）
ライム病
この実験は、ライム病を処置するために記載されるような組成物の前臨床試験のマウスモデルを提供する。Ｄｒｅｓｓｅｒら、Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、５巻（１２号）、ｅ１０００６８０号、Ｅｐｕｂ、２００９年１２月４日を参照されたい。ライム病は、スピロヘータである微生物Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにより引き起こされる。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉは、Ｉｘｏｄｅｓ種のダニの咬刺を介して伝染し、その後、血流を介して他の組織および器官へと拡散する。
この動物モデルでは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、背側皮下注射および腹腔内注射を介して、または静脈内注射を介してスピロヘータを注射する。感染の約７日後に、組織および器官における微生物負荷を評価し、病態を評価するために、血液検体および生検検体を回収する。本明細書に開示される方法および組成物は、チャレンジの後に形成され、疾患の病因および慢性性の両方に寄与すると考えられる、結果として生じるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのバイオフィルムを低減させ、かつ／または消失させるための治療的戦略ならびに予防的戦略の両方を開発することを意図する。
（実施例８）
嚢胞性線維症
この実験は、嚢胞性線維症を処置する作用剤についての前臨床試験のためのブタモデルを提供する。Ｓｔｏｌｔｚら（２０１０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻（２９号）：２９～３１頁を参照されたい。嚢胞性線維症とは、ＣＦ膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲと呼ばれる）のアニオンチャネルをコードする遺伝子の変異に起因する常染色体劣性疾患である。このモデルでは、「ＣＦＴＲ」と呼ばれる遺伝子内に欠損を保有するように特異的に交配され、ＣＦブタと呼ばれているブタが、複数の細菌種による下気道感染症を包含する、ＣＦ肺疾患の顕著な特徴を自発的に発生させる。ブタを本明細書に記載のとおりの作用剤で免疫化して、疾患および関連する病態の徴候の改善を評価するために、１）これらのＣＦブタを、ポリペプチドまたは他の免疫原性作用剤で免疫化し、これにより、肺における細菌性バイオフィルムを根絶する抗体の形成を誘導し得（能動的な免疫化の後で、ＩＨＦに対する抗体により、チンチラの中耳内に存在するバイオフィルムを根絶した方式と同様に）、これらの動物の肺に、噴霧化を介して作用剤を送達し得る。
（実施例９）
結核
本出願人らはまた、結核（ＴＢ）の前臨床モデルも提供する。Ｏｒｄｗａｙら（２０１０年）、Ａｎｔｉ． Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５４巻：１８２０頁を参照されたい。微生物であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、広がりつつある世界的な流行の原因である。最新の数字は、毎年約８００万例の新たなＴＢ症例が認められ、毎年約２７０万例がＴＢにより死亡していることを示唆する。ＨＩＶを伴う個体の共感染症としてのこの微生物の役割（ＨＩＶに感染する約４５００万例のうち、約１／３が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにも共感染していると推定されている）に加えて、単離菌が、複数の薬物に対して高度に耐性となっており、四半世紀超にわたり新規のＴＢ薬が導入されていないことも、特に、問題である。この動物モデルでは、ＳＰＦモルモットを、障壁コロニー内に維持し、約２０ｃｆｕのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株であるＥｒｄｍａｎ Ｋ０１桿菌を、それらの肺内に送達するエアゾール化スプレーを介して感染させる。チャレンジの２５、５０、７５、１００、１２５、および１５０日後において、細菌負荷を決定し、組織病理学的評価のために組織を回収すると共に動物を屠殺する。ＴＢの古典的な徴候を発症しないマウスと異なり、このようにしてチャレンジされたモルモットは、ヒト疾患の特徴である、中央部に壊死を伴う、十分に組織された肉芽腫を発症する。さらに、ヒトと同様に、モルモットは、原発病変複合体の一部として、排出リンパ節の化膿性肉芽腫性で壊死性の重度のリンパ節炎を発症する。このモデルの使用は、チャレンジの後にこれらの動物の肺内で形成され、疾患の病因および慢性性の両方に寄与すると考えられる、結果として生じるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのバイオフィルムを低減させ、かつ／または消失させるための治療的戦略ならびに予防的戦略を確認および同定するための前臨床スクリーニングを提供する。
（実施例１０）
デバイスの適用
カテーテル／留置デバイスによるバイオフィルム感染症については、複数の動物モデルが公知である。Ｏｔｔｏ（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７巻：５５５頁を参照されたい。通常の皮膚微生物叢であると考えられることが典型的であるが、微生物であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、多くの研究者が重要な日和見病原体であるとみなす微生物となっており、院内感染の原因作用物質の第１にランクされている。第１に、この細菌は、デバイス挿入時にこの一般的な皮膚コロニー形成菌により汚染される、留置医療デバイス上で発生する感染症の大半の原因である。致死性ではないことが典型的であるが、これらのバイオフィルム感染症の処置と関連する困難により、これらのバイオフィルム感染症は、それらの頻度と組み合わさって、重篤な公衆衛生負荷となっている。米国において、血管カテーテルと関連する血流感染症の処置と関連する費用は、今日、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに起因するものだけで、毎年２０億ドルに上る。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに加えて、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓもまた、留置医療デバイスにおいて見いだされる汚染である。カテーテルに関連するＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染症については、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットを含めて複数の動物モデルが存在し、これらの全てが、病因の分子的機構を研究するのに用いられ、予防および／または治療薬の研究に役立っている。ラットの頸静脈カテーテルは、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによるバイオフィルムの形成に干渉する療法を評価するのに用いられている。バイオフィルムの低減は、３つの方法：（ｉ）カテーテルを超音波処理し、ＣＦＵを計算する方法、（ｉｉ）カテーテルをスライスする、または単純にプレート上に置き、スコア付けする方法、（ｉｉｉ）バイオフィルムをクリスタルバイオレットまたは別の色素で染色し、溶出させ、ＣＦＵの代用物としてのＯＤを測定する方法で測定されることが多い。
等価物
別段に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書において例示的に説明された発明は、本明細書で具体的に開示されていない、１つまたは複数の任意の要素、１つまたは複数の任意の限定が存在しない場合にも、適切に実施することができる。したがって、例えば、「～を含む」、「～を包含する」、「～を含有する」などの用語は、外延的に、かつ限定なしに読まれるものとする。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、説明を目的として用いられるものであり、限定を目的として用いられるものではなく、示され、かつ、説明される特徴またはその部分の任意の等価物を除外する、このような用語および表現の使用を意図するものではなく、本願発明の範囲内にある多様な改変が可能であると認識される。
したがって、本明細書で提供される材料、方法および例は、好ましい実施形態を表しており、例示的なものであり、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではないことを理解されたい。
本明細書では、本発明を広範かつ一般的に説明してきた。一般的な開示の範囲内に収まる、より狭い範囲内にある種類、および亜属の群分けのそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これは、除外される材料が、本明細書で具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、属から任意の対象物を除外する条件または否定的限定を伴う本発明の一般的な説明を包含する。
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群との関係で説明される場合、当業者は、本発明がまた、それにより、マーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはマーカッシュ群のメンバーの亜群との関係でも説明され得ることを認識するであろう。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが参照により個別に組み込まれるのと同程度に、参照によりそれらの全体において明示的に組み込まれる。齟齬が生じた場合は、定義を含め、本明細書に従う。
その他の実施形態を以下の特許請求の範囲内に記載する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
対象においてＤＮＡＢＩＩタンパク質を産生する微生物による感染と関連する炎症応答を処置もしくは予防し、またはバイオフィルムに感染している、もしくはバイオフィルムの存在と関連する状態を患っている対象を処置する方法であって、該対象に、有効量の抗体Ｆａｂ断片を投与するステップを含み、該抗体は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質またはその等価物と特異的に結合し、さらに、該抗体Ｆａｂ断片は、該対象において抗炎症性サイトカインの産生を誘導する方法。
（項目２）
前記抗体Ｆａｂ断片が、
ａ．ｍＩｈｆＢ４ＮＨＴＩ抗体のＦａｂ断片を含む単離されたポリペプチドまたは該ポリペプチドの等価物、
ｂ．ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ抗体のＦａｂ断片から本質的になる単離されたポリペプチドまたは該ポリペプチドの等価物、
ｃ．該Ｆａｂ断片が、必要に応じて、ウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体、イヌポリクローナル抗体またはヒトポリクローナル抗体の群から選択される哺乳動物ポリクローナル抗体に由来する、ａまたはｂの単離されたポリペプチド、
ｄ．該Ｆａｂ断片が、モノクローナル抗体に由来する、ａまたはｂの単離されたポリペプチド、または
ｅ．該Ｆａｂ断片が、ヒト化抗体またはヒト抗体である、ａまたはｂの単離されたポリペプチド
のうちいずれか１つのポリペプチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｆａｂ断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２２３３５の下で寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に由来する、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記Ｆａｂ断片が、検出可能な標識をさらに含む、項目１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目５）
前記抗炎症性サイトカインが、ＩＬ－４、ＩＬ－１３またはＩＬ－１０のうち１つまたは複数を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記対象が、哺乳動物である、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記哺乳動物がヒトである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記対象が、小児患者である、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
有効量の抗生物質および／またはワクチンアジュバントを投与するステップをさらに含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ｍＩｈｆＢ４ＮＨＴＩ抗体のＦａｂ断片を含む単離されたポリペプチドまたは該ポリペプチドの等価物。
（項目１１）
ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ抗体のＦａｂ断片から本質的になる単離されたポリペプチドまたは該ポリペプチドの等価物。
（項目１２）
前記Ｆａｂ断片が、哺乳動物ポリクローナル抗体に由来する、項目１０または１１に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記哺乳動物ポリクローナル抗体が、ウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体、イヌポリクローナル抗体またはヒトポリクローナル抗体の群から選択される、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目１０または１１に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体である、項目１０または１１に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２２３３５の下で寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、項目１０または１１に記載のポリペプチド。
（項目１７）
検出可能な標識をさらに含む、項目１０から１６のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目１８）
項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドおよびキャリアを含む組成物。
（項目１９）
前記キャリアが、保存剤または安定化剤を含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目２１）
検出可能な標識をさらに含む、項目２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目２２）
前記検出可能な標識が、コンジュゲートされたポリヌクレオチドではない、項目２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目２３）
必要に応じて発現ベクターまたは宿主細胞内に含有される調節エレメントに作動可能に連結されている、項目１１から１３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目２４）
項目２０から２２のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドおよびキャリアを含む組成物。
（項目２５）
前記キャリアが、保存剤または安定化剤を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
項目２０から２２のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目２７）
項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む単離された宿主細胞。
（項目２８）
項目２０から２３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞。
（項目２９）
原核細胞または真核細胞である、項目２７または２８に記載の単離された宿主細胞。
（項目３０）
ポリペプチドを産生するための方法であって、項目２７から２９のいずれか一項に記載の単離された宿主細胞を、ポリヌクレオチドのポリペプチドへの発現を可能にする条件下で培養するステップを含む方法。
（項目３１）
前記ポリペプチドを単離するステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
産業プロセスと関連するバイオフィルムの形成を防止する、またはバイオフィルムを破壊する方法であって、バイオフィルムに対して感受性の表面またはバイオフィルムを含有する表面を、項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて処置するステップを含む方法。
（項目３３）
バイオフィルムを破壊する結合性部分を同定する方法であって、候補結合性部分を、バイオフィルム構成成分、および項目１から８のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドと接触させるステップと、該結合性部分の、該バイオフィルム中の前記ＤＮＡＢＩＩとの結合について、項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの、該バイオフィルム中の該ＤＮＡＢＩＩとの結合と比較してアッセイするステップとを含み、該ポリヌクレオチドの結合と比較して実質的に同一またはより強い結合を有する結合性部分が、バイオフィルムを破壊する結合性部分である方法。
（項目３４）
複数の細菌種において薬物耐性を逆転させる作用剤を同定する方法であって、作用剤を複数の種によって産生されたバイオフィルムを破壊する活性について評価するステップを含み、該バイオフィルムを破壊する作用剤が、項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドと実質的に等しい活性を有し、必要に応じて、多数の前記タンパク質と結合する作用剤が、薬物耐性を逆転させる作用剤と同定される方法。
（項目３５）
対象において状態を処置し、またはバイオフィルムの形成を特徴とする該対象におけるバイオフィルムの形成を該対象において検出する方法であって、該対象に、有効量の項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与するステップを含む方法。
（項目３６）
前記バイオフィルムを検出しようとする場合、前記方法は、前記対象におけるバイオフィルムの形成または破壊をイメージングまたはモニタリングするステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記バイオフィルムを検出しようとする場合、前記ポリペプチドが化学修飾されている、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記バイオフィルムを検出しようとする場合、前記ポリペプチドが診断剤にコンジュゲートされている、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記バイオフィルムを検出しようとする場合、前記方法は、項目１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドの、存在する任意のバイオフィルムとの複合体形成を観察するステップをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記状態が、静脈性潰瘍および糖尿病性足部潰瘍、耳感染症、副鼻腔感染症、尿路感染症、肺感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、植え込まれたプロテーゼに関連する感染症、または歯周病を含む慢性非治癒創傷の群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
対象におけるバイオフィルムの形成を特徴とする状態の発生または進行をモニタリングする方法であって、該対象を、項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて処置するステップを含む方法。
（項目４２）
項目１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドの、存在する任意のバイオフィルムとの複合体形成を観察するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ポリペプチドが、化学修飾されている、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記ポリペプチドが、診断剤にコンジュゲートされている、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４５）
対象におけるバイオフィルムの形成を特徴とする状態の処置をモニタリングする方法であって、該対象に項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与するステップを含む方法。
（項目４６）
前記対象におけるバイオフィルム形成および／または破壊をイメージングまたはモニタリングするステップをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ポリペプチドが、化学修飾されている、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ポリペプチドが、診断剤にコンジュゲートされている、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４９）
バイオフィルムの形成防止、またはバイオフィルムの破壊を必要とする対象におけるバイオフィルムの形成を防止する、またはバイオフィルムを破壊する方法であって、項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与するステップを含む方法。
（項目５０）
項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドでコーティングされた非生理学的表面であって、必要に応じて、産業的環境にある、非生理学的表面。
（項目５１）
対象においてＤＮＡＢＩＩポリペプチドを産生する微生物の感染と関連する該対象における状態を処置または予防する方法であって、該対象に、有効量の項目１０から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドならびに抗生物質および／またはワクチンアジュバントを投与するステップを含む方法。
（項目５２）
前記ポリペプチドが、前記抗生物質の効力を増加させる、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
項目１０から１７のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドおよび使用のための指示を含むキット。
（項目５４）
抗ＩｈｆＢ２ＮＨＴＩ抗体またはその断片をさらに含む、項目５３に記載のキット。
政府権利についての陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられる認可番号ＤＣ０１１８１８のもとで政府支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
別の態様では、抗体または抗原結合性断片は、任意の適切な生物によって産生されるＤＮＡＢＩＩ結合性ポリペプチド、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩＨＦアルファ、ＩＨＦベータまたはＨＵポリペプチドの立体構造先端部領域を特異的に認識し、それに特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離されたポリペプチドとして記載される。このようなものの非限定的な例は、設計された立体構造先端部領域の群、Ａ５またはｍＢ４ペプチド断片またはその各々の等価物から選択される。一態様では、断片は、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ抗体またはその抗体の等価物に由来する。一態様では、断片は、ＩＨＦ Ａ５抗体またはその抗体の等価物に由来する。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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