CN113637051A - 一种具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽及其应用 - Google Patents

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周慧玲
杨溪
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Abstract

本发明公开了一种具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽及其应用。所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽选自：（a）具有MNKAELIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVVD氨基酸序列的多肽；或（b）具有GNKAEGIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVGD氨基酸序列的多肽；或（c）具有MNKAEGIDVLTGKLGSDRRGATAAVENVVD氨基酸序列的多肽。这类多肽能够预防Aβ和P‑tau产生，能远期改善远期认知障碍，预防阿尔兹海默症发生，作为预防性疫苗和佐剂，也可作为阿尔兹海默症潜在治疗药物。

Description

一种具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽及其应用。
背景技术
阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease ,AD）即老年痴呆，是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性脑病变疾病。它具有不可治愈性、进行性及致命性。阿尔兹海默症是发生在老年期的中枢神经系统变性疾病，是痴呆最常见病因，临床上表现为（1）一般起病隐匿，持续、进行性发展的智能衰退，病程5-10年。（2）早期显著的情景性记忆障碍，先近记忆障碍，随后远记忆受损、时间及地点定向障碍（3）认知障碍和视空间障碍（4）可出现人格改变和精神障碍（5）早期一般无神经科的阳性体征，晚期出现锥体系和锥体外系的体征如行动迟缓、肌强直（6）头部MRI发现海马、内嗅皮层萎缩。其主要病理学特征是细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）积累引起的老年斑和神经原纤维缠结，其主要核心成分分别是Aβ和过度磷酸化的Tau蛋白。
根据流行病学的调查，人类社会高速发展、人类寿命不断延长、社会老龄化加剧、生活节奏加剧使阿尔兹海默症在人群中的发病率逐年升高，尤其在老年人群中。预防及治疗阿尔兹海默症是我们必须要解决的一个问题。目前临床上治疗阿尔兹海默症尚没有特异药物。虽然临床上对阿尔兹海默症治疗的方法很多，药物治疗一般选用乙酰胆碱酯酶抑制药及谷氨酸受体拮抗剂改善认知功能，或选择脑血液循环促进剂和脑细胞代谢激活剂治疗，或采用一些训练如智力游戏、物理治疗、娱乐治疗及一些生活技能的培训，但这些都是改善临床症状。且这些方法的实行需要本人和家属的极力配合、长期坚持，这对患者本人和患者家属都是一个巨大的挑战。这就迫切需要一个易行、有效的治疗方法。研究者发现β-淀粉样多肽（Aβ）的沉积和清除是引起阿尔兹海默症的关键因素。因此能抑制Aβ淀粉样沉积的药物是研制预防及治疗阿尔兹海默症的关键因素。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽；第二目的在于提供所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽选自：
（a）具有MNKAELIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVVD氨基酸序列的多肽（多肽1）；或
（b）具有GNKAEGIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVGD氨基酸序列的多肽（多肽2）；或
（c）具有MNKAEGIDVLTGKLGSDRRGATAAVENVVD氨基酸序列的多肽（多肽3）。
具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽，该多肽的纯度不低于95%，多肽2是在多肽1的基础上突变三个氨基酸，该条多肽2与多肽1氨基酸序列有90%的相似度；多肽2是在多肽1的基础上突变三个氨基酸，该条多肽3与多肽1氨基酸序列有90%的相似度。
阿尔兹海默症模型小鼠即APP/PS1小鼠通过注射本发明所述具有预防和改善阿尔兹海默症症状的多肽能抑制远期Aβ蛋白和P-Tau蛋白的沉积的产生，能远期改善小鼠的认知障碍，说明这一类多肽能抑制远期Aβ蛋白和P-Tau蛋白的沉积的产生，说明早期注射能够预防阿尔兹海默症的发生，可作为一种阿尔兹海默症的预防性疫苗和佐剂，同时可作为治疗阿尔兹海默症的潜在药物。其中多肽1的效果优于多肽2、多肽3，可认为与多肽1氨基酸序列有90%及其以上的相似性的多肽都具有与多肽1相同的功效。
附图说明
图1为小鼠定位导航实验结果示意图；
图2为小鼠空间探索实验结果示意图；
图3为本发明多肽对小鼠脑内Aβ蛋白沉积表达的影响（ELISA实验结果）示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽选自：
（a）具有MNKAELIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVVD氨基酸序列的多肽；或
（b）具有GNKAEGIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVGD氨基酸序列的多肽；或
（c）具有MNKAEGIDVLTGKLGSDRRGATAAVENVVD氨基酸序列的多肽。
本发明具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的核酸选自：
（a）编码如权利要求1所述的多肽的核酸；或
（b）与核酸序列（a）互补的核酸。
本发明所述的载体为包含具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的核酸。
本发明所述的宿主细胞为包含具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的核酸的载体，或其基因组中整合有具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的核酸。
本发明所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽的应用为所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽在制备预防/治疗老年痴呆药物中的应用。
所述的药物为含有具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽序列的多肽疫苗。
所述的多肽疫苗还包含一种佐剂。
所述的佐剂为完全弗氏佐剂、非完全弗氏佐剂、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、表面活性剂或细胞因子佐剂。
下面以具体实施实验案例对本发明做进一步说明：
1、所需多肽是由生物合成公司所合成的。
2、多肽对阿尔兹海默症的预防及远期改善作用。
具体实验方法：
小鼠模型：健康APP/PSEN1（简称APP/PS1小鼠）转基因小鼠，健康C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重18-20g。随机分组，分成对照组C57BL/6小鼠10只，模型组APP/PSEN1（简称APP/PS1小鼠）小鼠10只，实验组APP/PSEN1小鼠30只，分为三组，分别多肽1注射组10只，多肽2注射组10 只，多肽3注射组10只。
实验条件：
SPF级动物房，温度22-25℃，相对湿度40%-60%，12/12h明暗周期，自由进食饮水。
动物在体实验：
为评估该种多肽对小鼠脑内沉积的淀粉样斑块的作用疗效。我们选用6周龄雌雄各半的APP/PS1小鼠和同龄的C57BL/6小鼠。有研究报道称APP/PS1转基因小鼠在3月龄时会出现认知缺陷，在3月时可检测出Aβ淀粉样沉积。
多肽处理：将 1 mg多肽干粉溶于 200 μL去离子水中，小心摇晃待其完全溶解，再加入300 μL PBS 溶液，此时接种液浓度为 2 μg/μL，充分混匀后将接种液每 50 μL 进行分装。每次免疫用量为 50 μL（100μg）多肽。
小鼠实验处理：第一次皮下注射多肽时小鼠为6周龄，第二次间隔2周，即第8周第二次注射，之后每隔一个月注射即小鼠3月、4月、5月、6月时分别皮下注射多肽一次。在最后一次注射后第8天时，我们连续5天训练小鼠水迷宫实验，在最后一次注射后第13天时正式进行Morris水迷宫实验。
Morris水迷宫实验是一种让小鼠学会寻找隐藏在水中的平台的实验，包括定位航行实验和空间探索实验，测试小鼠的学习、记忆能力。水迷宫装置是由一个直径120cm，高60cm的黑色圆柱水箱。在水箱中注入自来水，水深10cm，并加入墨水搅拌均匀，使水变为黑色，水温控制在21-25℃。直径10cm的表面黑色的站台放置在目标象限（第一象限）的中央并放入水下1cm。小鼠在水池中的运动情况由水池上方的摄像头进行记录，该摄像机与计算机相连。
定位航行实验：前5天连续进行定位航行实验，每天早上9点开始测试，提前30分钟把小鼠放入水迷宫里让小鼠提前适应环境。将小鼠随意放入其中一个象限，让其自由寻找隐藏的平台。第一天小鼠未在1分钟内发现平台，则引导其找到平台，并让其在平台上适应30s，成功找到平台的小鼠也需在平台上适应30s。连续5天测试，记录小鼠从入水点到站台所需时间以及这段时间内游泳的路程和速度，所需时间作为学习记忆的成绩（潜伏逃避期），一分钟内未找平台，引导找到平台记录为60s。空间探索实验：到第6天时撤去平台，进行空间探索实验，记录小鼠在60s内穿原来平台位置的次数。
在行为测试结束后，对各组小鼠进行解剖取材，进行下一步实验。将小鼠脱颈处死后，取半脑，制备脑组织匀浆后用ELISA（酶联免疫吸附法）方法检测脑内Aβ在各小组小鼠脑内的表达（参考张永兰. 京尼平苷调节β淀粉样蛋白神经毒性及其代谢的分子机制[D]. 重庆:重庆大学,2015.）。
实验结果：用Morris 水迷宫实验检测皮下注射多肽后对APP/PS1小鼠的学习和记忆能力的改善。1.定位导航实验结果如下所示，实验组注射多肽后的APP/PS1小鼠可以在一定程度降低其逃避潜伏期，其中多肽1的效果优于多肽2、多肽3。2.空间探索实验结果如下图所示,多肽注射后的APP/PS1小鼠能增加其经过原平台的次数，其中多肽1的效果优于多肽2、多肽3。通过Morris 水迷宫实验可以得出结论多肽注射后能远期改善APP/PS1小鼠的认知障碍。
用ELISA方法检测Aβ在各组小鼠脑内的表达。实验结果表明，APP/PS1小鼠脑内Aβ的表达增加，多肽注射后的APP/PS1小鼠脑内Aβ表达降低，其中多肽1的效果优于多肽2、多肽3，说明早期注射该类多肽，能远期预防Aβ在体内的沉积。

Claims (8)

1.一种具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽，其特征在于，所述的具有预防阿尔兹海默症的多肽选自：
（a）具有MNKAELIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVVD氨基酸序列的多肽；或
（b）具有GNKAEGIDVLTQKLGSDRRQATAAVENVGD氨基酸序列的多肽；或
（c）具有MNKAEGIDVLTGKLGSDRRGATAAVENVVD氨基酸序列的多肽；或
（d）具有与（a）序列相似度90%以上的多肽序列。
2.一种具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的核酸，其特征在于，所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的核酸选自：
（a）编码如权利要求1所述的多肽的核酸；或
（b）与核酸序列（a）互补的核酸。
3.一种载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有如权利要求2所述的核酸。
5.一种权利要求1所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽的应用，其特征在于所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽在制备预防/治疗阿尔兹海默症药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽的应用，其特征在于所述的药物为含有具有预防和远期治疗阿尔兹海默症的多肽序列的多肽疫苗。
7.根据权利要求6所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的应用，其特征在于所述的多肽疫苗还包含一种佐剂。
8.根据权利要求7所述的具有预防和远期改善阿尔兹海默症症状的多肽的应用，其特征在于所述的佐剂为完全弗氏佐剂、非完全弗氏佐剂、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、表面活性剂或细胞因子佐剂。
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