CZ284416B6 - Vakcina proti infekcím bakteriemi rodu Helicobacter na bázi ureasy - Google Patents
Vakcina proti infekcím bakteriemi rodu Helicobacter na bázi ureasy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ284416B6 CZ284416B6 CZ941609A CZ160994A CZ284416B6 CZ 284416 B6 CZ284416 B6 CZ 284416B6 CZ 941609 A CZ941609 A CZ 941609A CZ 160994 A CZ160994 A CZ 160994A CZ 284416 B6 CZ284416 B6 CZ 284416B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- urease
- helicobacter
- composition
- helicobacter pylori
- immune response
- Prior art date
Links
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 25
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 15
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims abstract description 260
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 44
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 claims abstract description 25
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims description 114
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims description 114
- 241000590017 Helicobacter felis Species 0.000 claims description 81
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 45
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 44
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 40
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 40
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 24
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 74
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 32
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 26
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 23
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 23
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 8
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 7
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- OUFRIWNNMFWZTM-UHFFFAOYSA-M sodium arsanilate Chemical compound [Na+].NC1=CC=C([As](O)([O-])=O)C=C1 OUFRIWNNMFWZTM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 241000220451 Canavalia Species 0.000 description 5
- 206010061459 Gastrointestinal ulcer Diseases 0.000 description 5
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000003126 m-cell Anatomy 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010056663 Gastric infection Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 101150061086 ureB gene Proteins 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 229910014497 Ca10(PO4)6(OH)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 235000010520 Canavalia ensiformis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 208000028861 Helicobacter pylori infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 1
- 241000428199 Mustelinae Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000588777 Providencia rettgeri Species 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N [9-(dimethylamino)-10-methylbenzo[a]phenoxazin-5-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(=[NH2+])C3=CC=CC=C3C2=NC2=C1C=C(N(C)C)C(C)=C2 ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001621 bismuth Chemical class 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 208000003836 bluetongue Diseases 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 229940079920 digestives acid preparations Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000011587 gastric lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 229940076266 morganella morganii Drugs 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012134 rapid urease test Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000009863 secondary prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Popisuje se způsob vyvolání ochranné imunitní odpovědi na infekci bakteriemi rodu Helicobacter v savčím hostiteli tím, že se mu podá imunologicky účinné množství ureasy bakterie rodu Helicobacter, nebo jejich podjednotek, jako antigenu. Popisuje se rovněž složení vakcíny.
ŕ
Description
Vynález se tyká prevence a léčby žaludečních infekcí u savců včetně člověka. Podrobněji řečeno, vy nález se vztahuje k vhodné vakcíně, která je použitelná k prevenci a léčbě infekce, způsobené bakteriemi rodu Helicobacter, u savců včetně člověka. Dále se vynález týká způsobu léčby lidí, postižených žaludeční infekcí a jejími následky, jako jsou chronická gastritida nebo vředy trávicího traktu, a prevence rakoviny žaludku.
Dosavadní stav techniky
Ve WO-93/20843 jsou popsány způsoby prevence infekce bakteriemi rodu Helicobacter u pacientů pomocí orálního podání lyzátů celých buněk bakterií rodu Helicobacter, které obsahují velký počet složek. Je nejasné, které složky lyzátu z WO-93/20843 jsou nutné pro dosažení ochrany. Ve WO-93/20843 nejsou nijak zmíněny polvpeptidy s epitopy ureázy bakterií rodu Helicobacter. jak jsou používány podle předkládaného vynálezu, ani protilátky, které rozpoznávají takové epitopy.
Bakterie rodu Helicobacter. které při infekci lidského žaludečního epitelu způsobují gastritidu. jsou hlavním faktorem ve vývoji vředů trávicího traktu a žaludečných lymfomů, a mohou být také rizikovým faktorem při vývoji rakoviny žaludku [Blaser, Gastroenterology 1987. 93. 371383, Graham. Gastroenterology 1989, 196, 615-625, Parsonnet. J. Nati, Cancer Inst. 1991, 93. 640-643]. Nejčastějším infekčním agens je Helicobacter pylori, následovaná mnohem méně se vyskytující bakterií Helicobacter heilmanii. Helicobacter pylori je úzký, gram-negativní mikroorganismus tvaru S. který je rutinně získáván z biopsií žaludků dospělých a děti s histologickými příznaky gastritidy nebo vředů trávicího traktu. Důkazy' pro kauzální vztah mezi výskytem Helicobacter py lori a gastrointestinálními onemocněními pocházejí ze studií na dobrovolnících, pacientech se vředy a rakovinou žaludku, gnotobiotických prasatech a na hlodavcích bez choroboplodných zárodků. S ohledem na etiologii. Kochovy postuláty byly splněny vývojem histologickv potvrzené gastritidy u předtím neinfikovaných individuí, jakožto důsledek konzumace živých mikroorganismů [Marshall, Med. J. Aust. 1985, 142. 436-439: Morris, Am. J. Gastroenterology, 1987, 82, 192-199; Engstrand. Infect. Immun. 1990. 53, 17631768: Fox. Infect. Immun. 1988, 56, 2994-2996: Fox, Gastroenterology 1990, 99, 352-361: Lee, Gastroenterology 1990. 99. 1315-1323; Fox, Infect. Immun. 1991, 59, 785-791; Eaton. Infect. Immun. 1989. 57. 1119-1 125]. Po léčbě, která zlikvidovala Helicobacter pylori. došlo k zániku gastritidy. a u pacientů se žaludečními vředy ke snížení počtu recidiv [Peterson, N. Engl. J. Med. Ϊ991, 324. 1043-1048],
Často je velmi obtížné zlikvidovat rozvinutou infekci Helicobacter pylori pomocí antimikrobiálních látek in vivo, přes jejich citlivost k mnoha antimikrobiálním látkám in vitro [Czinn. Infect. Immun. 1991, 2359-2363 ]. Mikroorganismus se nachází v mukosní vrstvě pokrývající žaludeční epitel a v žaludečních lalocích. Ukazuje se, že v těchto místech není možno dosáhnout adekvátní antimikrobiální koncentrace léčiva, a to i když jsou antibiotika podávána orálně ave vysokých dávkách. V současnosti většina autorit doporučuje trojnásobnou terapii, jmenovitě bismutitou sůl v kombinaci s léčivy jako jsou tetracyklin a metronidasol po dobu dvou až čty ř týdnů. Nicméně efektivita tohoto nebo jiného chemoterapeutického způsobu vedení léčby, zůstává nižší, než by bylo optimální. Navíc, při tomto způsobu léčby může dojít k vážným nepříznivým reakcím na podaná léčiva.
V současnosti je ještě málo známo o úloze mukosního imunitního systému v žaludku. Distribuce buňek produkujících imunoglobulin(Ig) v normální žaludeční dutině ukazuje, že plasmatické buňky produkující IgA tvoří více než 80% z celkové populace plasmatických buněk. Navíc, množství plasmatických IgA buňek přítomných v žaludeční dutině je srovnatelné s jinými sliznicemi [Brandtzaeg, Scand. J. Immunol. 1985, 22, 111-146; Brandtzaeg, Ann. Allergy 1987, 59, 21-39], Množství studii na lidech [Wvatt, J. Clin. Path. 1986, 39, 863-870] a na zvířecích modelech [Fox, Gastroenterology 1990. 99, 353-361; Fox, Infect. Immun. 1991, 59, 785-791] ukazuje specifickou IgG a IgA odpověď v séru a žaludečních sekretech, jako odpověď na infekci bakteriemi rodu Helicobacter. Z pozorování vyplývá, že infekce Helicobacter pylori přetrvává jako chronická infekce po dobu několika let a navzdory indukci lokální a systémové imunitní odpovědi nepodporuje vývoj imunizačních strategií.
Lee a kol. popsali schopnost bakterií druhu Helicobacter felis (bakterie blízce příbuzná bakteriím Helicobacter pylori) infikovat hlodavce, kteří předtím nebyli infikováni, a reprodukovatelně dokumentovali histologickou gastritidu [Lee. Gastroenterology 1990, 99, 1315-1323; Fox, Infect. Immun. 1991, 59, 785-791]. Od té doby byla tato dvojice bakterie-hostitel akceptována jako dobrý model pro studium gastritidy, způsobené Helicobacteriemi, ajejich iniciačních faktorů [Lee. Infect. Immun. 1993, 61, 1601-1610 ]. Czinn a kol. ukázali, že opakovaná orální imunizace surovou šťávou z lyžovaných bakterií Helicobacter pylori, ve které byl jako adjuvans použit choleratoxin. indukuje silnou gastrointestinální IgA odpověď se specifitou anti-Helicobacter pylori u myší a lasic [Czinn, Infect. Immun. 1991. 2359-2363]. Dále Chen a kol. a Czinn a kol. v poslední době oznámili, že orální imunizace surovou šťávou z lyžovaných bakterií Helicobacter felis vyvolává ochranu proti infekci bakteriemi Helicobacter felis u myší [Chen. Lancet. 1992, 339. 1120-1121; Czinn, Američan Gastroenterological Association. May 10-13, 1992. 1321, A-331], Přesná povaha antigenu(ů), zodpovědného za indukci této ochrany, nebyla dosud určena, a žádné informace nepředpokládají, že ochranný antigen(y) z bakterie Helicobacter felis, který způsobil ochranu proti tomuto patogenu, by mohl indukovat křížovou ochranu, vztahující se k jiným druhům helikobakterií.
Podle vynálezu bylo zjištěno, že sonikáty z Helicobacter pylori a Helicobacter felis jsou schopny indukovat tvorbu protilátek, přičemž se dokázalo, že některé z těchto protilátek, namířené proti Helicobacter py lori, jsou schopny křížové reakce s Helicobacter felis a naopak [Michetti. Američan gastroenterology Association. May 10-13. 1992, 1001. A-251: Davin. Američan Gastroenterological Association. May 16-19, 1993, 1213. A-304], Podstata těchto křížových reaktivit nebyla známa.
Na základě existující homologie mezi různými známými aminokyselinovými sekvencemi ureáz bylo navrženo, že ureáza by mohla být použita jako vakcina proti Helicobacter pylori [Pallen. Lancet 1990, 336. 186-7], Přesto není křížová reaktivita pravidlem. Guo a Liu před lety dokázali, že ureázy z bakterií Próteus mirabilis. Próteus vulgaris a Providencia rettgeri vykazují navzájem křížovou reaktivitu, zatím co ureázy z rostliny Canavalia (jack beán) a Morganella morganii jsou imunologicky vzdálené od tří dříve jmenovaných ureáz [Guo, J. Gen. Microbol. 1965. 136, 19952000], I když možnost antigenní křížové reaktivity ureázy z Helicobacter py lori s ureázami jiných helikobakterií byla rozumným předpokladem, neexistovala žádná data dokazující, že to je pravou příčinou křížových reaktivit, dokud nebylo podle vynálezu dokázáno, že některé monoklonální protilátky proti Helicobacter felis reagovaly s ureázou Helicobacter pylori [Davin. Američan Gastroenterology Association. May 16-19, 1933. 1213, A-304], J. Pappo dále demonstroval, že myši, které byly infikovány bakteriemi Helicobacter felis, vytvářely protilátky, které byly schopny křížové reakce s ureázou z Helicobacter pylori, ale nereagovaly s ureázou z rostliny Canavalia (J. Pappo, nepublikovaná data, 1993).
Použití ureázy z Helicobacter py lori, nebo příbuzných ureáz, jako vakcíny proti infekci bakteriemi Helicobacter pylori, bylo již dříve navrženo A. Labignem [patentová přihláška číslo EP 0 367 644 Al, 1989, Int. Publication číslo WO 90/04030, 1990]. Nicméně, jmenovaná přihláška neobsahuje žádný důkaz o vakcinaci jakéhokoliv savce proti libovolné helikobakteriální infekci pomocí ureázy.
Mimoto, zatím co sekvenční homologie s jinými bakteriálními ureázami může podpořit použití 5 ureázy jako vhodného kandidáta na vakcínu proti infekci Helicobacter pylori, současné znalosti o průběhu lidské infekce bakteriemi Helicobacter pylori ji jistě nepodpoří. Přestože infikovaná individua často vytvářejí silnou protilátkovou odpověď proti ureáze, tato anti-ureázová imunitní odpověď nevede k likvidaci nebo kontrole infekce. Mimoto bakterie Helicobacter pylori je schopna transportovat ureázu ven z buňky a uvolňovat ji ze svého povrchu [Evans. Infect.
Immun. 1992, 60, 2125-2127; Ferrero, Microb. Ecol. Health Dis. 1991, 4, 1120-1121]. Proto ureáza nemůže reprezentovat vhodný cíl pro vývoj ochranné mukózní imunitní odpovědi. Vskutku, všeobecně se soudí, že mukózní imunitní ochrana je zvětší části zprostředkovaná sekretovanými IgA, jejichž aglutinační aktivita se zhorší, může-li se rozpoznávaný antigen uvolňovat z cílového patogenu atak sloužit jako klamný cíl pro ochrannou protilátku. Dále se zdá, že ureáza je toxická pro epitelové buňky v kultuře, a existuje podezření, že hraje roli v degradaci mukózy a ve vývoji vředů trávicího traktu in vivo. Proto její použití jako antigenu může být toxické.
Přesto lze soudit, že tento antigen by mohl byt potenciálně účinnou vakcínou, jestliže:
- za prvé, by bylo možno podat tento antigen orálně tak. aby byla dávka dostatečně vy soká k vyvoláni silnější imunitní odpovědi, než jaká se vy skytuje přirozeně.
- za druhé, množství produkovaných protilátek musí být dostatečně vysoké, aby vázaly veškerou 25 ureázu, a to uvolněnou i neuvolněnou z povrchu buněk.
- za třetí, kdy bychom mohli použit podjednotky ureázy nebo molekulární varianty , které by nebyly toxické.
Nakonec zůstává tedy potřeba efektivní léčby a prevence žaludečních humánních infekcí, které jsou způsobeny Helicobacter pylori. Současná data navrhovala možnost vytvořit vakcínu proti této infekci, ale neobsahovala jasnou identifikaci definovaného antigenu(ů), společného pro všechny kmeny Helicobacter pylori. který' by mohl být inkorporován do bezpečné a efektivní vakcíny.
Podle vy nálezu byl identifikován antigen z ureázy Helicobacter pylori jako možná vakcína a jeho účinnost byla demonstrována na zvířecím modelu. Tyto výsledky byly neočekávané v kontextu historie infekcí bakteriemi rodu Helicobacter.
Podstata vy nálezu
Podle tohoto vynálezu bylo zjištěno, že imunita se může u savců, kteří jsou citliví na gastrointestinální infekci bakteriemi Helicobacter. indukovat, použijí-li se jako cílová místa 45 vakcíny epitopy ureázy. vyskytující se na nebo v blízkosti povrchu bakterie Helicobacter.
K vyvolání imunity se může použít buď přírodní ureázy, nebo se může použít rekombinantní ureázová podjednotka, která je produkována v enzymaticky neaktivní a proto netoxické formě. Vynález popisuje způsob vyvolání imunity proti infekci bakteriemi Helicobacter podáním polyaminokyselinového přípravku na savčí mukózní povrch, t.j. směsi peptidů a/nebo proteinů 50 spolu s vhodným adjuvantem. V tomto polyaminokyselinovém přípravku je přítomno množství epitopů. charakteristických a prezentovaných ureázou endogenní pro bakterii z rodu Helicobacter, kterou bude provedena infekce. Podání tohoto polyaminokyselinového přípravku může být provedeno orálně.
Aktivní složka tohoto přípravku může obsahovat přírodní nebo biosyntetické epitopy a může mít různé formy. Nevyčerpávající výčet možných přípravků obsahuje purifikované. v přírodě se vyskytující nebo rekombinantně produkované ureázové přípravky bakteriálního nebo jiného původu, proteolytické fragmenty ureázy. fúzní proteiny, obsahující ureázové epitopy, pozměněné formy ureázy, nebo peptidy, homologní s aminokyselinovou sekvencí ureázy. Protože vyvolání imunity závisí na indukci humorální a nebo buněčné imunitní odpovědi, která je namířena proti infikující Helicobacter. jsou upřednostňovány takové přípravky, které nejlépe duplikují epitopy endogenní ureázy infikujícího organismu. Například přípravky, obsahující epitopy z ureázy Helicobacter pylori, jsou přednostně podávány lidem, citlivým na Helicobacter pylori. Navíc, s ohledem na důležitý aspekt vynálezu, bylo zjištěno, že mohou být použity ureázy z jiných druhů. Například, bylo zjištěno, že k prevenci infekce Helicobacter felis u myší může dojít po podání ureázy z Helicobacter pylori.
Předmětem vynálezu je způsob vyvolání ochranné imunitní odpovědi v savčím hostiteli proti infekci bakteriemi Helicobacter, pro který je charakteristické, že je na mukózní povrch hostitele podáno imunologicky efektivní množství ureázy, schopné vyvolat takovouto ochrannou imunitní odpověď.
Dále je předmětem vynálezu složení vakcíny, vhodné pro prevenci infekce bakteriemi Helicobacter a obsahující efektivní množství ureázy jakožto antigenu. nejlépe ureázy z Helicobacter pylori nebo B podjednotky ureázy z Helicobacter pylori, schopné vyvolat v hostiteli ochrannou imunitní odpověď proti infekci bakteriemi Helicobacter, spolu s farmaceuticky vhodným nosičem nebo rozpouštědlem.
Dále vynález popisuje způsob udělení pasivní ochrany savčímu hostiteli proti infekci bakteriemi Helicobacter, zahrnující podání imunologicky efektivního množství specifické protilátky proti ureáze, na mukózní povrch hostitele. Tato protilátka je produkována hostitelem, imunizovaným ureázou, nejlépe ureázou z Helicobacter pylori nebo B podjednotkou ureázy z Helicobacter pylori, a je schopna vyvolat ochrannou imunitní odpověď proti infekci bakteriemi Helicobacter.
Popis obrázků
Vynález se dále popisuje s odkazy na obrázky , přičemž na obrázcích 1 až 6 je grafické znázornění výsledků, uspořádaných v tabulkách 1 až 6.
Obrázek 1 (Skupina A): Myši nechráněné po imunizaci ureázou.
Osa X: o značí IgG. · značí IgA.
OsaY: znázorňuje koncentraci imunoglobulinu. měřenou spektrofotometricky. Číselný údaj odpovídá absorbanci při vlnové délce 495 nm, vynásobené 1000.
Obrázek 2 (Skupina B): Myši chráněné po imunizaci ureázou.
Osa X: o” značí IgG. · značí IgA.
OsaY: znázorňuje koncentraci imunoglobulinu. měřenou spektrofotometricky. Číselný údaj odpovídá absorbanci při vlnové délce 495 nm, vynásobené 1000.
Obrázek 3 (Skupina C): Myši nechráněné po imunizaci sonikátem Helicobacter pylori.
Osa X: o značí IgG, · značí IgA.
- 4 CZ 284416 B6
OsaY: znázorňuje koncentraci imunoglobulinu, měřenou spektrofotometricky. Číselný údaj odpovídá absorbanci při vlnové délce 495 nm, vynásobené 1000.
Obrázek 4 (Skupina D): Myši chráněné po imunizaci sonikátem Helicobacter pylori.
Osa X znázorňuje: o značí IgG, · značí IgA.
Osa Y znázorňuje: koncentraci imunoglobulinu, měřenou spektrofotometricky. Číselný údaj odpovídá absorbanci při vlnové délce 495 nm, vynásobené 1000.
Obrázek 5: Ukazuje procento myší, u kterých se rozvinula infekce (osa Y).
Osa X A: Skupina myší imunizovaných sonikátem Helicobacter pylori. Infekce se nerozvinula 15 u tří z devíti pokusných zvířat.
B: Skupina myší imunizovaných ureázou Helicobacter pylori. Infekce se nerozvinula u sedmi z deseti imunizovaných zvířat.
C: Kontrolní skupina myší. Infekce se nerozvinula u jedné z deseti pokusných zvířat (p=0.019 ve Fisherově testu přesnosti)
Obrázek 6: Shrnuje výsledky, získané po orální imunizaci rekombinantními A a B podjednotkami ureázy. Na ose X číslo udává počet pokusných zvířat. V obdélníku, označeném symbolem 1. jsou myši kontrolní, které nebyly chráněny imunizací. V obdélníku, označeném 25 symbolem II. jsou zvířata, chráněná imunizací rekombinantní podjednotkou A (horní polovina obrázku) a B (dolní polovina obrázku) ureázy, která byla usmrcena 12 dní po vystavení patogenu, zatím co zvířata v obdélníku, označeném III, byla usmrcena po 10 týdnech, ale jinak ošetřena stejným způsobem. Hodnoty Fisherova testu přesnosti: p=0,003 (myši imunizované B podjednotkou ureázy, usmrcené po 12 dnech) a p=0,01 (imunizace B podjednotkou ureázy B po 30 10 týdnech). Hodnoty na ose Y udávají velikost absorbance při vlnové délce 550 nm.
Podle vynálezu bylo zjištěno, že orální podání polyaminokyselinových přípravků, prezentujících epitopv ureázy' z Helicobacter pylori způsobuje u myší nárůst ochranné imunitní odpovědi proti Helicobacter felis. Myš je použita jako zvířecí model se všeobecně akceptovanou hodnotou pro 35 studium imunitní odpovědi na infekci bakteriemi Helicobacter [Lee, Gastroenterology 1990, 99.
1315-1323]. Efekt takovéto ochranné imunitní odpovědi je ten, že imunizovaná zvířata, jsou-li vystavena působení patogenu. mají velmi snížený výskyt infekce ve srovnání s neimunizovanými zvířaty. Orální imunizace myší pomocí B podjednotky ureázy Helicobacter pylori, která je produkována jako enzy maticky neaktivní rekombinantní protein, přináší u myší zvýšení ochranné 40 imunitní odpovědi proti Helicobacter felis. Efekt této ochranné imunitní odpovědi je ten, že imunizovaná zvířata, jsou-li vy stavena působení patogenu, mají také velmi zredukovaný výskyt infekce ve srovnání s neimunizovanými zvířaty.
Vynález popisuje způsob vyvolání ochranné imunitní odpovědi na infekci bakteriemi 45 Helicobacter v savčím hostiteli. Způsob zahrnuje krok podání imunologicky efektivního množství ureázy jakožto antigenu. nejlépe ureázy z Helicobacter pylori, schopné vyvolat takovouto ochrannou imunitní odpověď, na mukózní povrch savce, včetně člověka.
Dále vynález popisuje způsob vyvolání ochranné imunitní odpovědi na infekci bakteriemi 50 Helicobacter v savčím hostiteli. Způsob zahrnuje krok podání imunologicky efektivního množství rekombinantní. enzymaticky inaktivní B podjednotky ureázy jakožto antigenu, nejlépe rekombinantní B podjednotky ureázy z Helicobacter pylori, schopné vyvolat takovouto ochrannou imunitní odpověď, na mukózní povrch savce včetně člověka.
- 5 CZ 284416 B6
Vynález se dále týká také léčby nebo preventivní ochrany savců včetně člověka před infekcí bakteriemi Helicobacter, přičemž je na mukózní povrch pacienta podáno imunologicky efektivní množství ureázy, nebo jejích podjednotek, schopné vyvolat ochrannou imunitní odpověď na infekci bakteriemi Helicobacter. Je výhodné, je-li použita ureáza z Helicobacter pylori nebo B podjednotka ureázy Helicobacter pylori, a tato ureáza může být podána buď samotná, nebo navázaná na hydroxylovaný fosforečnan vápenatý, například hydroxvapatit, který slouží jako nosná částice. Dále je výhodné podat ureázu z Helicobacter pylori spolu s mukózním adjuvantem, například sB podjednotkou choleratoxinu, muramyl dipeptidem anebo sjinými podobnými adjuvanty.
Lze předpokládat, že podání ureázy nebo její B podjednotky jakožto antigenu na mukózní povrch stimuluje celkový mukózní imunitní systém a snad i lokální místa v žaludečním hlenu včetně imunitní odpovědi, včetně objevení se specifických protilátek IgA proti Helicobacter pylori v žaludečních sekretech, které jsou prevencí před infekci bakteriemi rodu Helicobacter. Jelikož je rutinní záležitostí provádět předklinické testy budoucích vakcín pro lidskou potřebu na zvířecích modelech, lze soudit, že metodologie, použitá u tohoto vynálezu, bude efektivní i u lidí, zvláště v prevenci a léčbě vředů trávicího traktu, gastritidy, žaludečních malignancií a dalších nemocí, vznikajících jako důsledek přítomnosti Helicobacter pylori a/nebo Helicobacter heilmanii.
A-Bakteriální kultury a purifikace ureázy .
Kmen bakterie Helicobacter pylori. použitý ke studiu, pocházel od pacienta, trpícího duodenálním vředem a by l předpěstován na plotnách s BHI agarózou tak. aby byla výsledná kultura homogenní. Helicobacter pylori se pěstuje na vhodném médiu, typicky na BHI médiu (Brain-Heart Infusion. médium obsahující výluh ze srdce a mozku), obsahujícím 0,25 % kvasničného extraktu a 10 % fetálního telecího séra a doplněném 0,4 % doplňkem pro selektivní růst Campylobacterií (doplněném podle Skirrowa; Oxoid 69). Bakterie se inkubují přes noc za mikroaerofilních podmínek při 37 °C v lahvích, které se potom zapečetí a třepou při 37 °C po dobu dvou až tří dní tak. aby vznikla tekutá kultura. Kultura může byt též připravena na agarózových plotnách, které obsahují médium BHI s 0,25 % kvasničného extraktu a5% ovčí krve. Kultivace probíhá za mikroaerofilních podmínek při teplotě 37 :C po dobu tří dní. Množství bakterií se zjišťuje měřením absorbance roztoku BHI při vlnové délce 660 nm. přičemž jedna jednotka absorbance odpovídá 108 bakteriím. Kultury na agarózových plotnách se nejdříve resuspendují v 154 mMNaCl.
Běžný a výhodný zdroj polyaminokyseliny, vykazující epitopy ureázy . je purifikovaná ureáza, například ureáza z Helicobacter pylori. získaná obecným způsobem podle Dunn a kol.. J. biol. chem. 265. 9464-9465. Tato metoda byla modifikována tak. jak je popsáno níže. Po kultivaci se buňky lyžují ve vodě, odstředí se, poté se peleta rozmíchá na vortexu a znovu odstředí za vzniku supematantu. Roztok, vykazující ureázovou aktivitu Helicobacter pylori (odhadnuto rychlým ureázovým testem, viz níže), se poté podrobí chromatografii na CL-6B koloně. Frakce, vykazující silnou ureázovou aktivitu, se shromáždí a přes noc dialyzují. poté se opět podrobí chromatografii na anionickém iontoméniči. Frakce se eluují pufrem se vzrůstající koncentrací NaCl a shromážděné frakce se silnou ureázovou aktivitou se podrobí SDS gelové elektroforéze. po které následuje barvení Coomassie modří. Jako ureázy byly identifikovány dva oddělené proužky, odpovídající molekulové hmotnosti okolo 63 kDa a okolo 29 kDa. Frakce, obsahující ureázu. se shromáždí, čímž vzniká purifikovaná ureáza z Helicobacter pylori o čistotě v intervalu od 95 % do 99 %.
B-Orální imunizace ureázou z Helicobacter pylori když je výhodné používat ureázu purifikovanou z Helicobacter pylori, která se získá popsaným způsobem, rozumí se, že jako antigenní materiál lze použít jakoukoli ureázu nebo podjednotku
-6CZ 284416 B6 ureázy, buď v přírodě se vyskytující nebo získanou technikami rekombinantní DNA, jakož i proteolytický fragment, fuzní proteiny, obsahující fragmenty nebo celou ureázu, pozměněné ureázové konstrukty, nebo jiné peptidy nebo proteinové přípravky, obsahující epitopy ureázy, které jsou schopné vyvolat ochrannou imunitní odpověď proti infekci bakteriemi rodu Helicobacter (viz níže). Takto je možné použít ureázy, která má částečnou homologii s ohledem na ureázu z Helicobacter pylori. a která je efektivní ve vyvolání křížové ochranné imunitní odpovědi proti Helicobacteriím. Příkladem takovéto ureázy je ureáza z rostliny Canavalia, která vykazuje asi 70 % homologii s ureázou z Helicobacter pylori. Vynález proto není omezen na použití intaktní ureázy, ale zahrnuje použití jakéhokoliv polyaminokyselinového přípravku, který obsahuje epitopy ureázy a je schopen v hostiteli vy volat ochrannou imunitní odpověď proti infekci bakteriemi rodu Helicobacter. Je typické, že ureáza, mající homologii v intervalu 70 až 95 %, například 80 % až 90 % homologii, vzhledem k ureáze z Helicobacter pylori, může být použita jako antigenní ureáza podle vy nálezu.
Neomezující výčet zdrojů potenciálně užitečných ureázových přípravků obsahuje endogenní ureázové enzymy nižných druhů Helicobacterií, ureázy z jiných bakterií, jako jsou Klebsiella pneumoniae nebo Próteus mirabilis a analogicky jakákoli jiná ureáza s podmínkou, že tato ureáza sdílí epitopy, důležité pro křížovou reakci s ureázou z Helicobacter pylori. Geny kódující ureázy výše zmíněných organismů tvoří potenciální nástroj pro expresi rekombinantních ureázových produktů, jako i sou celé proteiny nebo jejich části.
Neomezující výčet potenciálně užitečných ureázových přípravků zahrnuje peptidy, které se připraví z puntíkovaných ureáz (zdroje jsou zmíněny výše) použitím fyzikálních a/nebo chemických štěpných procedur (t.j. CnBr) a/nebo enzymatické proteolýzy (za použití proteáz, např. proteázy V8, trypsinu nebo jiných, nebo peptidy, syntetizované chemicky a sdílející epitopy s ureázou).
Dalším zdrojem potenciálně užitečných epitopů jsou epitopy, identifikované díky jejich křížové reaktivitě s ureázou. které lze vyhledat pomocí protilátek proti ureáze. Tyto peptidy mohou být přírodně se vyskytující peptidy, nebo mohou vznikat chemickou syntézou. Dále mohou takovéto peptidy vznikat expresí náhodného rekombinantního oligonukleotidu.
Jiným zdrojem potenciálně užitečných epitopů jsou epitopy. podobné epitopům ureázy, které vznikají produkcí anti-idiotypových protilátek proti ureáze. Takovéto anti-idiotypové protilátky, produkované libovolným imunokompetentním hostitelem, se získají imunizací tohoto hostitele anti-ureázovými protilátkami za účelem produkce protilátek, namířených proti anti-ureázovým protilátkám, a které sdílejí strukturní homologie s ureázou.
Tato diskuze se zaměřuje na použití přirozené ureázy. produkované bakteriemi Helicobacter pylori (část B), nicméně ureázy nebo jejich podjednotky či jejich konstrukty , zmíněné výše, které jsou schopné vyvolat požadovanou ochrannou imunitní odpověď, mohou byt produkovány také použitím technik rekombinantní DNA, které jsou odborníkovi dobře známy. Účinnost jednotlivých přípravků může byt zjištěna rutinní administrací, při použití zvířecích modelů, orálním podáním látky kandidující na vakcínu a vystavením účinkům patogenu. při kterém se použije protokol v podstatě stejný nebo podobný níže popsané proceduře.
Tabulky 1 a 2 dole a obrázky 1 až 5 popisují výsledky, které byly získány při orální imunizaci myši purifikovanou ureázou z Helicobacter pylori. V tomto prvním experimentu se podávání antigenu z Helicobacter py lori provádělo orální administrací ureázy z Helicobacter py lori myším. Purifikace se prováděla tak. jak bylo popsáno v části A. Ureáza z Helicobacter pylori se nechala adsorbovat na krystaly hydroxyapatitu, který se používá jako nosič, zesilující vazbu M-buněk a absorpci. Choleratoxin (Sigma) se přidával jako mukózní adjuvans. V tomto experimentu se skupiny samiček šest týdnů starých myší BALB/c orálně imunizovaly 30 μg purifikované ureázy
- 7 CZ 284416 B6 z Helicobacter pylori. navázané na l mg hydroxyapatitu spolu slOpg choleratoxinového adjuvantu ve dnech 0. 7, 14 a 21. Myši se poté vystavily působení 108 Helicobacter felis, a to ve dnech 28 a 30. Pro účely srovnání se podobné, šest týdnů staré samičky myší SPF-BALB/c orálně imunizovaly lyzátem z celých Helicobacter pylori (sonikátem) s 10 pg choleratoxinu, ve dnech 0, 7, 14 a 21. Myši byly vystaveny působení Helicobacter felis ve dnech 28 a 30. Sonikát z Helicobacter pylori byl připraven shromážděním Helicobacter pylori z buněčných kultur, centrifúgací. rozpuštěním pelety v 0,9 % NaCl, po kterém následovala sonikace.
Pro kontrolu byly klamně imunizovány samičky šest týdnů starých myší SPF BALB/c 10 pg choleratoxinu a 1 mg hydroxyapatitu ve dnech 0. 7, 14 a 21. Všechny myši byly pěstovány, imunizovány a vystaveny účinkům patogenu paralelně. Všechny myši, použité ke studiu byly usmrceny 35-tého dne.
C-Orální imunizace rekombinantními podjednotkami ureázy z Helicobacter pylori
Geny, kódující strukturní A a B podjednotky ureázy z Helicobacter pylori, se získají klonováním polymerázovou řetězovou reakcí (PCR-Polymerase Chain Reaction) podle standardních procedur, založeným na dříve publikovaných sekvencích [Clayton, Nucleic Acid Res., 1990, 18, 362]. Tyto geny byly vloženy do vektoru (nazván pEV 40), který· byl vytvořen pro vysokou úroveň exprese a snadnou purifikaci cizích genů v bakteriích E. coli. Stručně řečeno, cizí gen se vloží po směru transkripce termo-represibilního promotoru ave čtecím rámci se sekvencí šesti histidinů. Pro selekci transformantů je v tomto vektoru přítomen gen ampR. Za vhodných teplotních podmínek je získáván protein, doplněný na N-konci repeticí šesti histidinů. které umožňují jednostupňovou afinitní purifikaci na niklovém sloupci. Obě rekombinantni podjednotky (A aB) ureázy z Helicobacter pylori byly exprimovánv odděleně v E. coli a přečištěny na niklovém sloupci až do 95 % čistoty.
I když je výhodné používat jako antigenní materiál rekombinantni ureázu z Helicobacter pylori, která se získá tak, jak je popsáno výše, rozumí se, že je zrovna tak možné jako antigenní materiál použít libovolnou ureázu. nebo podjednotku ureázy, získanou rekombinantími technikami (například fúzní proteinT která má antigenní místa ureázy a která je schopna vyvolat ochrannou imunitní odpověď proti infekci bakteriemi rodu Helicobacter. To znamená, že je možné ke konstrukci použít ureázový gen, který vykazuje podstatnou homologii vzhledem k ureáze z Helicobacter pylori. a který je efektivní při vyvolání křížové ochranné imunitní odpovědi proti Helicobacteriím. Příkladem takovéto ureázy je ureázy za z rostliny Canavalia, která vykazuje přibližně 70 % homologii s ureázou z Helicobacter pylori, nebo ureáza z Helicobacter felis, která vykazuje přibližně 88 % homologii s ureázou z Helicobacter pylori. Vynález proto není omezen na použití genů pro ureázu z Helicobacter pylori ajejich genových produktů, ale zahrnuje použití libovolné rekombinantni ureázy nebo jejích podjednotek. které jsou schopny v hostiteli vyvolat ochrannou imunitní odpověď proti infekci bakteriemi rodu Helicobacter. Jako rekombinantni antigenní ureáza podle vy nálezu se může použít rekombinantni ureáza, vykazující 70 až 95 % homologii. například 80až 90 % homologii vzhledem k ureáze z Helicobacter pylori.
Tato diskuze je zaměřena na použití rekombinantních A a B podjednotek ureázy z Helicobacter pylori, které jsou produkovány bakteriemi E. coli. nicméně je známo, že rekombinantni ureázy, nebo jejich podjednotky či jejich konstrukty zmíněné výše, které jsou schopny vyvolat požadovanou ochrannou imunitní odpověď, mohou být produkovány pomocí jiných technik rekombinantni DNA a v jiných eukaryotickvch nebo prokaryotických expresních vektorech, které jsou odborníkovi dobře známé.
Tabulky 3, 4 a spodní část tabulky 5 a obrázek 6 popisují výsledky, získané v pokusech, při kterých se myši orálně imunizovaly rekombinantními podjednotkami ureázy z Helicobacter pylori, které byly vyprodukovány v E. coli. V tomto experimentu se antigen z Helicobacter pylori
- 8 CZ 284416 B6 podával tak, že se myším orálně podala rekombinantní A nebo B podjednotka ureázy z Helicobacter pylori, která byla vyprodukována v E. coli a purifikována tak, jak bylo popsáno výše. Antigen se předem navázal na krystaly hydroxyapatitu, který se používá jako nosič, který zesiluje vazbu M-buněk a absorpci antigenu. Jako mukózní adjuvans se přidává choleratoxin (Sigma). V těchto experimentech byly použity skupiny šest týdnů starých samiček myší SPFBALB/c. Každá z myší se orálně imunizovala 30 pg rekombinantní A a B podjednotky ureázy z Helicobacter pylori, konjugované s 1 mg hydroxyapatitu, spolu s 10 pg choleratoxinového adjuvantu. Imunizace se prováděla ve dnech 0, 8, 14 a 21. Myši se poté třikrát vystavily působení 108 Helicobacter felis, a to ve dnech 32, 34 a 36. Pro účely srovnání se podobné, šest týdnů staré samičky myší SPF-BALB/c, orálně imunizovaly 30 pg rekombinantní B podjednotky ureázy z Helicobacter pylori, absorbované na 1 mg hydroxyapatitu, spolu s 10 pg choleratoxinového adjuvantu. Imunizace se prováděla ve dnech 0, 8, 14 a 21. Myši se poté třikrát vystavily působení 108 Helicobacter felis. a to ve dnech 32, 34 a 36. Všechny myši byly pěstovány, imunizovány a vystaveny účinkům patogenu paralelně. Myši, použité ke studiu, byly usmrceny 48-tého dne (12 dní po setkání s patogenem) nebo 10 týdnů po vystavení účinkům patogenu.
D-Analýza žaludečních biopsií. krve a střevních sekretů
Biopsie se odeberou z žaludku a krev se získává ze srdce. Střeva se odeberou a promyjí ImM PMSF (fenyl-methy 1-sulfonyl-fluorid. Boehringer) v pufru PBS (Phosphate Buffered Salinefyziologický roztok s fosforečnanovým pufrem) tak. aby se získaly střevní sekrety pro ELISA analýzu.
Pro vyhodnocení ochrany proti kolonizaci bakteriemi Helicobacter felis se žaludeční biopsie z každého zvířete podrobí testování na přítomnost Helicobacter felis pomocí rychlého testu na určení ureázové aktivity (Jatrox HP test, Rohm Pharma), přičemž se postupuje podle směrnic dodavatele. Stručně řečeno, žaludeční biopsie se ponoří do 0,5 ml směsi močoviny a fenolové červeně, která slouží jako indikátor pH, a která je dodávána přímo dodavatelem. Aktivitou ureázy vzniká z ureáz amoniak a hydrogen-uhličitan a reakce je doprovázena kolorometrickou změnou vzhledem k vyšší absorbanci při vlnové délce 550 nm. Ureázová aktivita se kvantifikuje spektrofotometrickou analýzou.
Pro detekci přítomnosti Helicobacter felis se žaludeční biopsie všech zvířat, včetně z těch, která byla použita v experimentu popsaném v části B, kultivují na plotnách s BHI agarózou, která je doplněna tak, jak je popsáno výše. Přítomnost Helicobacter felis se potvrzuje barvením podle Grama a určením ureázové aktivity po 3 až 10 denní inkubaci za mikroaerofilních podmínek. Významné shody bylo dosaženo při detekci kultur Helicobacter felis během první sady experimentů (viz tabulku 3). V experimentu, který je popsán v části C, byly provedeny pro detekci přítomnosti Helicobacter felis pouze testy, stanovující aktivitu ureázy v žaludečních biopsiích. Přítomnost Helicobacter felis byla potvrzena mikroskopicky dvěma nezávislými badateli, za použití dvou různých metod barvení (akridinovou oranží a kresylovou violetí).
Krevní vzorky se nechají usadit po dobu tří hodin při pokojové teplotě, poté se odebere sérum a nechá se zmrznout na -20 °C až do doby analýzy. Střevní sekrety se centrifugují 5 minut při 4 °C, čímž se odstraní makroskopické částice, a poté se uchovají zmražené na -20 °C. Stanovení antihelikobakteriální aktivity' ve střevních vzorcích každého zvířete se provádí ELISA analýzou podle standardních procedur. Stručně řečeno, 96 jamkové desky se potáhnou sonikátem z bakterií Helicobacter pylori, a poté se nasytí 5 % odtučněným mlékem. Vzorky se postupně naředí od ředění 1 : 1 do 1 : 1000 a inkubují se přes noc na ELISA deskách při 4 °C. Pro určení koncentrace protilátek se použije biotinyiovaných protilátek proti myším IgG (při testování séra) a proti myším IgA, po kterých následuje konjugát streptavidin - křenová peroxidáza.
-9CZ 284416 B6
Výsledky vystaveni pokusných zvířat infekci Helicobacter felis. následující po imunizaci purifikovanou ureázou z Helicobacter pylori, jsou udány v tabulkách 1 až 3 a na obrázcích 1 až 4 a výsledky po vystavení infekci Helicobacter felis, následující po imunizaci rekombinantními A a B podjednotkami ureázy z Helicobacter pylori, jsou udány v tabulkách 4 až 6 a na obrázcích 5 5 až 6.
Tabulka I
| Myš číslo | Imunizace test | Ureázový test 12 h | Gramovo barvení | Imunog obuliny | |||
| Sérum | Střev. Sekret | ||||||
| Ig | IgG | Ig | IgA | ||||
| 1 | Ureáza+HF | + | H. felis | 27 | 0 | 25 | 258 |
| 2 | Ureáza+HF | 0 | 0 | 264 | — ; J | 221 | 246 |
| 'Ί 0 | Ureáza+HF | 0 | 0 | 84 | 44 | 318 | 354 |
| 4 | Ureáza+HF | + | H. felis | 81 | 42 | 12 | 15 |
| 5 | Ureáza+HF | 0 | 0 | 98 | 137 | 126 | 234 |
| 6 | Ureáza+HF | + | 0 | 968 | 2093 | 31 | 22 |
| 7 | Ureáza+HF | 0 | 0 | 98 | 0 | 96 | 34 |
| 8 | Ureáza+HF | 0 | 0 | 247 | 1010 | 214 | 126 |
| 9 | Ureáza+HF | 0 | 0 | nez. | nez. | 48 | 32 |
| 10 | Ureáza+HF | 0 | 0 | 50 | 0 | 124 | 99 |
| 11 | Ureáza | 0 | 0 | 319 | 205 | 44 | 53 |
| 12 | Ureáza | 0 | 0 | 14 | 0 | 86 | 87 |
| 13 | U reáza | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 14 | Ureáza | 0 | 0 | 0 | 0 | 43 | 61 |
| 15 | Ureáza | 0 | 0 | 58 | 0 | 110 | 127 |
| 16 | Ureáza | 0 | 0 | 140 | 63 | 21 | 37 |
| 17 | Ureáza | 0 | 0 | 84 | 240 | 114 | 280 |
| 18 | Ureáza | 0 | 0 | nez. | nez. | 93 | 148 |
| 19 | Ureáza | 0 | 0 | 45 | 0 | 135 | 216 |
| 20 | Ureáza | 0 | 0 | 261 | 197 | 161 | 261 |
| 21 | ChT+HF | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 22 | ChT+HF | + | H. felis | 63 | 0 | 310 | 303 |
| 23 | ChT+HF | + | H. felis | 90 | 0 | nez, | nez. |
| 24 | ChT+HF | + | H. felis | 31 | 0 | 150 | 192 |
| 25 | ChT+HF | 4- | H. felis | 197 | 250 | 250 | 440 |
| 26 | ChT+HF | + | H. felis | 105 | 135 | 214 | 138 |
| 27 | ChT+HF | H. felis | 140 | 109 | 55 | ||
| 28 | ChT+HF | + | 0 | 0 | 0 | 16 | 15 |
| 29 | ChT+HF | -r | H. felis | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 | ChT+HF | + | H. felis | nez. | nez. | nez. | nez. |
| 31 | HP sonikát+HF | + | H. felis | 0 | 0 | 76 | 103 |
| 32 | HP sonikát-HF | + | H. felis | 77 | 0 | 11 | |
| π -» | HP sonikát+HF | + | H. felis | 549 | 748 | 57 | 36 |
| 34 | HP sonikát-HF | 0 | 0 | 660 | 153 | 180 | 286 |
| 35 | HP sonikát-i-HF | + | H. felis | 730 | 192 | 0 | 5 |
| 36 | HP sonikát+HF | 4- | H. felis | 32 | 0 | 5 | 64 |
| 37 | HP sonikát+HF | 0 | 0 | 400 | 400 | 312 | 1149 |
| 38 | HP sonikát+HF | + | H. felis | 1007 | 1360 | 149 | 26 |
| 39 | HP sonikát+HF | 0 | 0 | 220 | 166 | 133 | |
| 40 | HP sonikát | 0 | 0 | 873 | 1016 | 352 | 514 |
| 41 | HP sonikát | 0 | 0 | 727 | 899 | 126 | 191 |
| 42 | HP sonikát | 0 | 0 | 109 | 68 | 44 | 83 |
- 10 CZ 284416 B6
Tabulka I
| Myš číslo | Imunizace test | Ureázový test 12 h | Gramovo barvení | Imunog | obuliny | ||
| Sér ig | um IgG | Střev, ig | Sekret IgA | ||||
| 43 44 45 46 47 48 | HP sonikát HP sonikát HP sonikát HP sonikát HP sonikát HP sonikát | 0 0 0 0 0 0 | 0 0 0 0 0 0 | 147 845 1217 81 329 1049 | 949 1094 1198 0 210 737 | 167 246 210 256 241 197 | 97 64 157 218 276 211 |
V tabulce 1, která se vztahuje k experimentu, popsaném v části B. mají následující zkratky tento význam: h znamená hodiny, Ig znamená imunoglobulin, nez znamená nezjištěno, ureáza + HF znamená, že myš byla imunizována ureasou (navázanou na hydroxvapatit a podávanou spolu s choleratoxinem) a potom byla vy stavena působení patoogenu Helicobacter felis, ureáza znamená, že myš byla imunizována ureázou (navázanou na hydroxvapatit a podávanou spolu s choleratoxinem) a nebyla vystavena působení patoogenu, ChT = HF znamená, že myš byla pro kontrolu klamně imunizována pouze choleratoxinem a vystavena působení patogenu Helicobacter felis. HP sonikát + HF znamená, že myš byla imunizována sonikátem z bakterií Helicobacter pylori, podávaným spolu s choleratoxinem a vystavena působení patogenu Helicobacter felis. HP sonikát znamená, že myš byla imunizována sonikátem z bakterií Helicobacter pylori. podávaným spolu s choleratoxinem a nebyla vystavena působení patogenu Helicobacter felis. V tabulce 1 čísla, udávající výsledky stanovení protilátek, pocházejí z měření absorbance při vlnové délce 595 nm, která byla vynásobena 1000. Hodnota absorbance pozadí, změřena v nepřítomnosti protilátek, byla od výsledku odečtena.
V tabulce 2 jsou vyneseny výsledky experimentu, který je popsán v části B, které jsou získány na základě ureázových testů žaludečních biopsií aGramova barvení kultur Helicobacter felis. Jako infikované byly definovány myši sjedním nebo více markéry kolonizace Helicobacter felis. zahrnující ureázový test, nebo Gramovo barvení kultur.
Tabulka 2
| Imunizace | Patogen | % infikovaných jedinců | % ochráněných jedinců |
| Ureázou | H. felis | 3/10(30%) | 7/10 (70 %)* |
| Sonikátem | H. felis | 6/9 (66%) | 3/9 (33%)** |
| Ch. toxinem | H. felis | 9/10 (90 %) | 1 10(10%) |
* p = 0.0198 (Fisherův test přesnosti) vzhledem ke kontrole, imunizované choleratoxinem. ** p = 0.303 (Fisherův test přesnosti) vzhledem ke kontrole, imunisované choleratoxinem.
Z výsledků udaných v tabulkách 1 a 2 je patrné, že orální imunizací ureázou z bakterií Helicobacter pylori je získána statisticky významná ochrana proti působení patogenu Helicobacter felis ve srovnání s ochranou, získanou použitím buď sonikátu z Helicobacter pylori nebo použitím choleratoxinu. Z tabulky 2 je patrné, že z celkových 10 imunizovaných zvířat pouze 3 byla infikována ve srovnání se 6 zvířaty, která byla imunizována sonikátem z Helicobacter pylori. a 9 zvířaty , která byla imunizována choleratoxinem. Tabulka 2 ukazuje, že 70 % zvířat bylo chráněno proti působení Helicobacter felis ve srovnání s 33 % zvířat, imunizovaných sonikátem z Helicobacter pylori a 10% zvířat, imunizovaných choleratoxinem, a poté vy stavených působení Helicobacter felis. Jinými slovy, 90 % kontrolních myší, které byly vystaveny působeni Helicobacter felis, bylo tímto patogenem infikováno, zatím co naproti tomu u myší.
imunizovaných ureázou z Helicobacter pylori 28 dní před vystavením Helicobacter felis, byla úroveň infekce pouze 30%. To znamená významnou redukci infekce (p=0,0198 ve Fisherově testu přesnosti) ve srovnání s kontrolními myšmi. U myší, imunizovaných orálně sonikátem z Helicobacter pylori, byla úroveň infekce 67 % (nevýznamné snížení proti kontrole). Ochrana, získaná použitím ureázy z Helicobacter pylori, byla neočekávaná a nemohla být předpokládána na základě výsledků, získaných při použití sonikátu z Helicobacter pylori.
Obrázek l graficky vyjadřuje výsledky testů, stanovujících koncentraci protilátek v séru (IgG) a ve střevních sekretech (IgA) u myší, které po imunizaci ureázou nebyly ochráněny před infekcí. V tabulce 1 jde o myši s čísly 1, 4 a 6. Tyto myši tvoři skupinu A. Obrázek 2 ukazuje protilátkovou odpověď u myší, které byly po imunizaci chráněny před infekcí (skupina B), t.j. myši 2, 3, 5 a 7 až 10. Obrázky 3 a 4 se vztahují k výsledkům, které byly získány na myších 31 až 39. Obrázek 3 (skupina C) zobrazuje protilátkovou odpověď myší po imunizaci sonikátem z Helicobacter pylori (myši číslo 31, 32, 33, 35, 36 a 38) a obrázek 4 (skupina D) zobrazuje protilátkovou odpověď myší, chráněných po imunizaci sonikátem z Helicobacter pylori (myši číslo 34, 37 a 39). S ohledem na obrázky 3 a 4 je zajímavé, že protilátkové odpovědi IgA (ale ne IgG) jsou vyšší u myší, které mají ochrannou imunitu, než u myší, které ochranu nemají. Dá se tudíž předpokládat vzájemný vztah mezi ochrannou a protilátkovou odpovědí IgA. Sérové IgG takovýto vztah nevykazují. O mukózních protilátkách IgA, nikoliv však o sérových IgG, je známo, že hrají roli v ochraně proti bakteriálním infekcím vnitřností [Parsonnet, J. Nati. Cancer Inst. 1991. 93, 640-643].
Výsledky, které udávají korelaci mezi detekcí bakterií Helicobacter felis v žaludečních biopsiích pomoci ureázových testů a detekcí pomocí zjišťováni přítomnosti kultur, jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
| Ureázový test + | Ureázový test - | Celkem | |
| Přítomnost kultur H. felis + | 16 | Ó | 16 |
| Přítomnost kultur H. felis - | 30 | 32 | |
| Celkem | 18 | 30 | 48 |
p < 0,0001 ve Fisherově testu přesnosti.
Tabulka 3 ukazuje, že existuje velmi významná korelace mezi výsledky ureázových testů, provedených na žaludečních biopsiích a identifikací infekce bakteriemi Helicobacter felis. Ureázové testy byly výhodně používány pro diagnózu infekce Helicobacter felis u myší v dalších experimentech vzhledem kjejich větší citlivosti. Tento přístup umožnila duplikace ureázových testů s většími žaludečními fragmenty z každé myši a další zlepšení citlivosti ureázových testů. Použití této metody s vyšší citlivostí zabránilo přecenění ochrany, získané testovaným vakcinačním přípravkem. Při použití pozitivní kultury jakožto standardu pro infekci, je indukovaná ochrana po imunizaci ureázou během experimentu, který je popsán v části B, stejně významná jako při kombinovaném použití ureázového testu a stanovení kultur (p=0,021 proti p=0.019).
Výsledky experimentů, které jsou popsány v části C (rekombinantní ureázové podjenotky), které byly získány na základě ureázových testů z žaludečních biopsií, jsou uvedeny v tabulkách 4, 5 a 6 a zobrazeny na obrázku 6.
- 12 CZ 284416 B6
Tabulka 4
| Imunizace | Myš č. | Ureázový test | Infekce |
| ChT | 20 | 0,49 | + |
| 21 | 0,31 | + | |
| 22 | 0,62 | + | |
| 23 | 0,67 | + | |
| 24 | 0,55 | + | |
| 50 | 0,50 | + | |
| 51 | 0,37 | + | |
| 52 | 0,29 | 4- | |
| 53 | 0,79 | + | |
| 54 | 0,32 | -r | |
| ureA+HAP+ChT | 40 | 0,67 | + |
| 41 | 0,48 | + | |
| 42 | 0,42 | + | |
| 43 | 0,65 | 4- | |
| 44 | 0,56 | + | |
| 45 | 0,52 | + | |
| 46 | 0,33 | 4- | |
| 47 | 0.63 | + | |
| 48 | 0,22 | ||
| 49 | 0,37 | -i- | |
| ureB+HAP+ChT | 25 | 0,15 | - |
| 26 | 0,07 | - | |
| 27 | 0,03 | - | |
| 28 | 0,64 | + | |
| 29 | 0,13 | - | |
| 30 | 0,02 | - | |
| 31 | 0,66 | -U | |
| 32 | 0.00 | - | |
| ureA+HAP+ChT | 68 | 0,00 | - |
| 69 | 0,07 | - | |
| 70 | 0,42 | -L | |
| 71 | 0,00 | - | |
| 72 | 0,00 | - | |
| ureB+HAP+ChT | 73 | 0,37 | + |
| 74 | 0,00 | - | |
| 75 | 0.37 | + | |
| 76 | 0,00 | - | |
| 77 | 0,00 | - | |
| 78 | 0.00 | - | |
| 79 | 0,39 | + | |
| 80 | 0,00 | - | |
| 81 | 0,37 | + | |
| 82 | 0.00 | - |
V tabulce 4 mají následující zkratky tyto významy: ChT znamená choleratoxin, UreA 5 znamená rekombinantní A podjednotku ureázy z Helicobacter pylori, UreB znamená rekombinantní B podjednotku ureázy z Helicobacter pylori, HAP značí krystaly hydroxyapatitu. Myši 20 až 54 byly usmrceny 12 dní po vystavení účinkům patogenu a myši 68 až 82 po 10-ti týdnech (106 dnech) po vystavení účinkům patogenu. Výsledky ureázových testů, provedených na žaludečních biopsiích každého zvířete, jsou vyjádřeny jako hodnoty absorbance
- 13 CZ 284416 B6 při vlnové délce 550 nm. Znaménka + a označují konečný stav infekce jednotlivých zvířat vzhledem k pozitivitě nebo negativitě ureázových testů, detekujících přítomnost Helicobacter felis. Jako pozitivní byly brány hodnoty absorbance (při 550 nm) větší než 0,2.
Tabulka 5
Ochrana naměřená u myší, usmrcených 12 dní po vystavení účinkům patogenu
| Imunizace | Patosen | % infikovaných jedinců | % ochráněných jedinců |
| A podjednotkou ureázy | H. felis | 10/10(100%) | 0/10(0%) |
| B podjednotkou ureázy | H. felis | 3/10(30%) | 7/10 (70 %)* |
| Ch. toxinem | H. felis | 10/10(90%) | 0/10(10%) |
* p = 0, 0031 (Fisherův test přesnosti) vzhledem ke kontrole, imunizované choleratoxinem,
Tabulka 6
Ochrana naměřená u myší, usmrcených 10 týdnů po vystavení účinkům patogenu
| Imunizace | Patogen | % infikovaných jedinců | % ochráněných jedinců |
| A podjednotkou ureázy | H. felis | 1/5 (20%) | 4/5 (80%)* |
| B podjednotkou ureázy | H. felis | 4/10(40%) | 6/10(60%)** |
* p = 0,003 (Fisherův test přesnosti) vzhledem ke kontrole, imunizované choleratoxinem, ** p = 0,01 (Fisherův test přesnosti) vzhledem ke kontrole, imunizované choleratoxinem.
Z výsledků uvedených v tabulkách 4, 5 a 6 je patrné, že statisticky významné ochrany proti působení Helicobacter felis se dosáhne orální imunizací, při které se použije rekombinantní B podjednotka ureázy z Helicobacter pylori, ve srovnání s ochranou, které se dosáhne při použití buď rekombinantní A podjednotky ureázy z Helicobacter pylori nebo choleratoxinu. Z tabulky 4 je vidět, že 12 dní po vystavení účinkům patogenu byla z 10 imunizovaných zvířat ze skupiny, ve které bylo použito B podjednotky ureázy, pouhá 3 shledána jako infikovaná. Pro srovnání, z 10 zvířat, imunizovaných A podjednotkou ureázy, bylo infikováno všech 10 a z 10 imunizovaných choleratoxinem bylo rovněž 10 zvířat infikováno. Tabulka 4 ukazuje, že 70% zvířat bylo chráněno před působením Helicobacter felis ve srovnání s 0 % ze zvířat, imunizovaných A podjednotkou ureázy z Helicobacter pylori a 0 % ze zvířat, imunizovaných choleratoxinem a poté vystavených účinkům Helicobacter felis. Jinými slovy 100% kontrolních myší, vystavených Helicobacter felis, bylo infikováno, zatím co naproti tomu u myší, imunizovaných rekombinantní B podjednotkou Helicobacter pylori byla úroveň infekce pouze 30 %. To reprezentuje významnou redukci infekce (p=0,0031. Fisherův test přesnosti) ve srovnání s kontrolními myšmi.
Skutečnost že ochrana, pozorovaná u ureázy z Helicobacter pylori je vesměs udělená imunizací B podjednotkou ureázy a že A podjednotka nemá žádný takovýto efekt, nebyla očekávána na základě našich experimentů s purifikovanou ureasou. Proto je definování úloh, které mají tyto dvě strukturní podjednotky ureázy při vyvolání ochranné imunitní odpovědi, zcela nové. Ochrana, vyvolaná použitím rekombinantní B podjednotky ureázy, která je enzymaticky neaktivní, dokazuje, že jako orální vakcíny proti infekci bakteriemi rodu Helicobacter se může použít netoxická forma ureázy. Dále z těchto výsledků vyplývá, že rozpoznání aktivního místa není pro ochranu nezbytné, protože je velmi nepravděpodobné, že inaktivní B podjednotka ureázy indukuje protilátky, které rozpoznávají a inhibují katalytické místo nativní ureázy.
- 14 CZ 284416 B6
Z tabulky 6 vy plývá, že z myší, které byly usmrceny 10 týdnů po infekci, 60 % (6 myší z 10) zvířat, imunizovaných B podjednotkou ureázy, a 80 % (4 myši z 5) ze zvířat, imunizovaných B podjednotkou ureázy z Helicobacter pylori, bylo chráněno proti infekci bakteriemi Helicobacter felis. Skutečnost že ochrana, získaná imunizací B podjednotkou ureázy, přetrvává po dlouhou 5 dobu a že imunizace A podjednotkou ureázy indukuje pouze ochranu, která se vytrácí ve srovnání s ochranou, indukovanou B podjednotkou ureázy, nemohla být očekávána na základě našich experimentů s purifikovanou ureasou nebo z jiných experimentů, provedených dříve. Skutečnost, že imunizace B podjednotkou ureázy způsobuje ochranu, definitivně dokazuje, že rozeznání aktivního místa není zapotřebí pro ochrannou funkci. Obrázek 6 shrnuje výsledky, ίο získané po orální imunizaci rekombinantními A a B podjednotkami ureázy (popsáno v tabulkách 5 a 6).
Tento vynález popisuje složení vakcín, vhodných pro prevenci infekce bakteriemi rodu Helicobacter. Tyto přípravky obsahují efektivní množství ureázy jakožto antigenu, výhodně 15 ureázu z Helicobacter pylori nebo rekombinantní podjednotky ureázy z Helicobacter pylori, schopné v hostiteli vyvolat ochrannou imunitní odpověď na infekci bakteriemi rodu Helicobacter. Přípravky rovněž obsahují farmaceuticky akceptovatelný nosič nebo rozpouštědlo.
Vakcíny podle vynálezu se podávají v množství, které snadno určí odborník. Vhodná dávka pro 20 dospělé je v rozmezí od 10 pg do 100 mg, např. od 50 pg do 50 mg. Podobné rozmezí dávky je možno aplikovat na dětech. Jako nosný sy stém u člověka se může použít kapslí, ze kterých se účinná látka uvolní v tenkém střevě, čímž se antigen ochrání před působením kyselého prostředí v žaludku a může rovněž obsahovat ureázu jakožto antigen v nerozpustné formě fúzních proteinu. Vakcína se může podávat jako primární preventivní agens dospělým nebo dětem, jako 25 sekundární prevence po úspěšné likvidaci bakterií Helicobacter pylori v infikovaném hostiteli.
nebo jako terapeutické agens s cílem v citlivém hostiteli indukovat imunitní odpověď a tím přispět k likvidaci infekce bakteriemi Helicobacter pylori.
Vhodný mukózní adjuvans je choleratoxin, jak bylo zmíněno výše. Dále se může použít 30 muramyl-dipeptid nebo jeho deriváty', netoxické deriváty choleratoxinu včetně jeho B podjednotky a nebo konjugáty nebo technikami genového inženýrství připravené fúzní produkty z ureázy jakožto antigenu a choleratoxinu nebo jeho B podjednotky. Další vhodné způsoby podání zahrnují biodegradovatelné mikrokapsle nebo imunitní odpověď stimulující komplexy (ISCOM'S - Immunity Stimulating Complexes) nebo liposomy nebo zjednodušené živé vektory , 35 připravené technikami genového inženýrství, jako jsou viry nebo bakterie, a rekombinantní (chimérické) virům podobné částice, např. bluetongue. Množství použitého mukózního adjuvantu závisí na jeho druhu. Například když se jako mukózní adjuvans použije choleratoxin. je výhodné jej aplikovat v množství od 5 pg do 50 pg, např. 10 pg až 35 pg. Při použití mikrokapslí závisí použité množství na množství adjuvantu, které je obsaženo v matrici mikrokapslí tak, aby se 40 dosáhlo požadované dávky. Určit toto množství je ve schopnostech odborníků v tomto oboru.
Vhodnými nosiči pro vakcínu podle vynálezu jsou kapsle potažené tak, aby se jejich obsah uvolnil v tenkém střevě a mikrokuličky z polyaktidu-glykolidu. Vhodná rozpouštědla jsou 0.2N NaHCCfi a/nebo fyziologický roztok.
Drobné částice hydroxylovaného fosforečnanu vápenatého (HCP, Hydroxylated Calcium Phosphate) jsou zvláště výhodné jako nosič pro ureázu z Helicobacter pylori při aplikaci na mukózní povrchy. Předpokládá se. že konjugát: ureáza z Helicobacter pylori - hydroxylovaný fosforečnan vápenatý, je transportován epitelem, kde vzbuzuje poly-Ig imunitní odpověď. Výhodné je, je-li hydroxy lovaný fosforečnan vápenatý ve formě mikročástic, vhodných pro 50 transport epitelem, zejména pro buňky, specializované k tomuto účelu (M-buňky). Výhodná forma hydroxylovaného fosforečnanu vápenatého je hydroxyapatit, komerčně dostupný fosforečnan vápenatý’ Ca10(PO4)6(OH)2.
- 15 CZ 284416 B6
Komerčně dostupný hydroxyapatit vesměs sestává ze zdánlivě vazkých krystalů, které jsou chemicky a fyzikálně analogické anorganickému hydroxyapatitu v normální kostní tkáni. Strávení hydroxyapatitu by proto mělo být bezpečné, což dokazuje existence výživných doplňků, obsahujících vápník a fosfor, odvozených od kostní hmoty, které jsou pro strávení vyráběny. Komerčně rozšířený hydroxyapatit (výrobek CalBioChem) sestává z krystalů, které se velmi liší svou velikostí. Není pravděpodobné, že by krystaly, které mají větší délku než 1 pm, byly vstřebány pomocí M-buněk. Proto se pro použití podle vynálezu krystaly hydroxyapatitu drtí na malé, relativně stejně veliké krystalické fragmenty, např. sonikací. Výhodné je, jsou-li rozměry přítomných fragmentů hydroxyapatitu v rozmezí okolo 0,01 až 0,09 pm. Úspěch fragmentace se může změřit buď elektronovou mikroskopií nebo rozptylem světla za použití standardních technik.
Výhodné způsoby podání ureázy z Helicobacter pylori jakožto antigenu jsou orální, nasální, rektální nebo okulámí podání. Orální administrace může dopravit antigen na jiný mukózní povrch v trávicím traktu včetně střevní mukózv.
Vakcíny podle vynálezu se mohou podávat na mukózní povrch ve formě aerosolu, suspenze, kapslí a/nebo čípků. Způsob podání je odborníkovi zřejmý.
Vynález dále popisuje pasivní imunizaci savců, včetně člověka, proti infekci bakteriemi rodu Helicobacter. Této se dosáhne podáním efektivního množství specifické protilátky proti ureáze na mukózní povrch pacienta. Je výhodné použít efektivní množství monoklonální IgA protilátky, která má specifitu proti ureáze z Helicobacter pylori.
Zatímco se ukazuje, že ureáza z Helicobacter pylori hraje roli jako antigen, vyvolávající ochrannou imunitu, vynález také popisuje použití ureázy z Helicobacter pylori jako diagnostické reagencie pro měření imunitní odpovědi u osob, které obdržely vakcínu, založenou na ureáze, nebo sloužící k určení, je-li individuum imunní nebo citlivé (a tedy potřebuje vakcinaci). Vynález dále popisuje použití ureázy a specifických protilátek proti ureáze ke konstrukci zkoušek a diagnostických kitů pro stanovení imunity proti helikobakteriím, k odhadu citlivosti na helikobakterie a definování imunitní odpovědi na vakcíny.
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude dále podrobněji popsán v následujících příkladech, které nejsou nijak omezující. Uváděnými procenty jsou procenta hmotnostní, stejně jako jinde v textu, není-li uvedeno j inak.
A) Bakteriální kmeny
Bakterie Helicobacter felis byla získána panem J. Fo (oddělení Kooperativní medicíny, Massachusettský technologický institut, MIT. Boston. USA). Helicobacter pylori byla izolována od pacientů s vředovým onemocněním (CHŮV, Lausanne, Švýcarsko)
B) Bakteriální kultury
Kapalná kultura
Bakterie se kultivují v kapalném médiu BHI (BioMerieux), které obsahovalo 0,25% kvasničného extraktu (Difco) a 10 % fetálního telecího séra (Inotech), které bylo doplněno 0,4 % doplňku pro selektivní růst bakterií Campylobacter (Oxoid). Bakterie se inkubují přes noc za mikroaerofilních podmínek při 37 °C a poté se třepou při 37 °C po dobu 2 až 3 dní.
- 16CZ 284416 B6
Kultury na agarózových plotnách
Bakterie se kultivují na agarózových plotnách, které obsahují médium BHI. 0,25 % kvasničného extraktu a 5 % ovčí krve za mikroaerofilních podmínek při 37 °C po dobu tří dnů.
Kvantifikace
Množství bakterií se zjistí měřením absorbance roztoku BHI při vlnové délce 660 nm (1 jednotka absorbance odpovídá 10s bakteriím).
C) Příprava sonikátů
Helicobacter pylori byly shromážděny z 31 ploten s agarem a krví a převedou do 0,15M NaCl. Poté se centrifugují 5 minut při 1400 g a4°C. Peleta se poté resuspenduje v 3 ml NaCl a sonikuje 4 minuty. Množství proteinů bylo zjištěno pomocí Bradfordova testu (BioRad Kid podle návodu dodavatele).
D) Konjugace imunogenu s hydroxyapatitem
Imunogen (ureáza nebo její podjednotka) se inkubuje jednu hodinu s hydroxyapatitem při 4 °C. 1.0 mg hydroxyapatitu se použije na 30 pg imunogenu pro jednu myš. Na konec inkubace se přidá 10 Lig choleratoxinu do konečného objemu 200 μΐ PBS.
Příklad 1
A) Extrakce
Helicobacter pylori z 30 agarových ploten s krví se převedou do 0,15M NaCl na ledu. Roztok se 5 minut centrifuguje při 1400xg a4°C. Peleta se resuspenduje ve 20 ml H2O a vortexuje 45 sekund (na maximální rychlost). Extrakt se poté 20 minut centrifuguje při 6700 g a4°C. Supernatant se odstraní a stanoví se množství proteinů podle výše uvedené kvantifikace a precipituj í 70 % síranem amonným.
B) Purifikace ureasy
Roztok se podrobí chromatografii na koloně, naplněné sepharosou CL-68 (Pharmacia) s PBS pufrem. který' se používá jako mobilní fáze. 22 frakcí, které vykazují silnou ureasovou aktivitu, se shromáždí a dialýzuje přes noc při 4 °C proti 3 1 PEB (20 nM fosforečnanový pufr. pH=7) a pak se podrobí chromatografii na sloupci, naplněném Q-Sepharosou pro rychlý průtok (Pharmacia) s PEB jakožto mobilní fází. Frakce se eluují gradientem NaCl o koncentraci 0 až 500 nM. Deset ze shromážděných frakcí se silnou ureázovou aktivitou se individuálně podrobí SDS gelové elektroforéze. po které následuje Coomassie barvení. Šest frakcí, které obsahovaly dva oddělené proužky, odpovídající molekulární hmotnosti 63 kDa a 28 kDa. byly spojeny a považonány za purifikovanou ureázu.
Příklad 2 (viz též část B)
Myším, které se používají v imunizačních studiích, se nejprve aplikuje lehká anestézie éterem a poté se přistoupí k žaludeční imunizaci. Sonikát nebo purifikovaná ureasa, hydroxyapatit a choleratoxin se suspendují v PBS a 200 μΙ této směsi se dopraví do žaludku příslušné myši
- 17 CZ 284416 B6 pomocí polyetylenové hadičky, připojené na injekční stříkačku. O této proceduře se zmiňujeme jako o orální imunizaci.
Byly zhotoveny tři imunizační protokoly, které jsou popsány níže.
Protokol B1 - Vakcinace purifikovanou ureázou
Samičky šest týdnů starých myší BALB/c (20 kusů) byly orálně imunizovány 30 pg purifikované ureázy z Helicobacter pylori a 1 mg hydroxyapatitu a 10 pg choleratoxinu ve dnech 0, 7, 14 a 21. Deset myší bylo poté vystaveno působení 5.107 a 108 Helicobacter felis z kapalné kultury, a to ve dnech 28 a 30.
Protokol B2 - Vakcinace sonikátem z bakterií rodu Helicobacter
Samičky šest týdnů starých myší BALB/c (20 kusů) byly orálně imunizovány 2 mg roztoku sonikátu z Helicobacter pylori ve dnech 0, 7, 14 a 21. Deset myší bylo poté vystaveno působení 5.107 a 108 Helicobacter felis z kapalné kultury, a to ve dnech 28 a 30.
Protokol B3 - Kontrola
Samičky šest týdnů starých myší BALB/c (20 kusů) byly orálně imunizovány lmg hydroxyapatitu a 10 pg choleratoxinu ve dnech 0, 7, 14 a 21. Deset myší bylo poté vystaveno působení 5.10 a 10s Helicobacter felis z kapalné kultury, a to ve dnech 28 a 30.
35-tého dne byly všechny myši usmrceny a byly odebrány biopsie ze žaludku, střevní sekrety a krev.
Ochrana a vyhodnocení výsledků
Za účelem zhodnocení výsledné ochrany byly biopsie testovány, a byla u nich stanovena ureázová aktivita pomocí testu Jatrox HP (Rohm Pharma), přičemž se postupovalo podle instrukcí dodavatele. Množství ureázy se kvantifikovalo spektrofotometr! c kým měřením při vlnové délce 550 nm. Biopsie se také kultivovaly v přítomnosti Helicobacter felis a výsledek se stanovil Gramovým barvením. Biopsie z žaludeční dutiny se homogenizovaly a ředily (1 : 10 a 1 : 1000) v 0,15M NaCl a poté se umístily na plotny s agarem, obohaceným krví, a inkubovaly za mikroaerofilních podmínek při 37 °C po dobu 4 až 10 dní.
ELISA
Stanovení titru protilátek ve střevních sekretech a krvi se provádí pomocí ELISA analýzy. ELISA analýza se provádí následovně. Polystyrénové desky (96 jamkové) se potáhnou 1 pg na jamku purifikované ureázy . Potahování se provádí při 37 °C a trvá dvě hodiny. Nespecifická vazebná místa se blokují 5 % práškovým mlékem v PBS pufru s 0,1 % Tvveenu při 37 °C po dobu 30 minut. Desky se poté jednou promyjí PBS s 0,1 % Tweenu. Krevní vzorky se testují ve zředění 1 : 100 a střevní sekrety 1:1. Na antigenem potažené desky se přidá do každé jamky 100 μΐ vzorku. Po dvou hodinách inkubace se desky třikrát promyjí pufrem PBS sO, 1% Tweenu. Celkové anti-myší biotinylované kozí protilátky a anti-myší IgA, IgG a IgM biotinylované protilátky (Amersham) se přidají (100 μΐ) ve zředění 1 : 500, vyjma IgA, které se přidá v ředění 1 : 250, ainkubují 1 hodinu při 37 °C. Desky se poté třikrát promyjí pufrem PBS s 0,1 % Tweenu a poté se přidá 100 μΐ konjugátu streptavidin- křenová peroxidáza ve zředění 1 : 1000 v pufru PBS s 0,1 % Tweenu. Desky se inkubují 30 minut při 37 °C. Desky se poté třikrát promyjí a přidá se 50 μ! roztoku o-fenyl-diaminu v citrátovém pufru (1 : 50, pH=5,0)
- 18CZ 284416 B6 s 1 μΐ/ml 30 % HAX Desky se 20 minut inkubují při pokojové teplotě. V každé jamce se změří absorbance při vlnové délce 495 nm.
Příklad 3 (viz též část C)
Myším, které se používají v imunizačních studiích, se nejprve aplikuje lehká anestézie éterem a poté se přistoupí k žaludeční imunizaci. Poté -se suspenduje 30 pg rekombinantní A a B podjednotky ureázy Helicobacter pylori, která byla vyprodukována v E. coli, vázané na 10 hydroxyapatit a doplněné choleratoxinem v PBS. 200 μΐ této směsi se dopraví do žaludku příslušné myši pomocí polyetylenové hadičky, připojené na injekční stříkačku. O této proceduře se zmiňujeme jako o orální imunizaci.
Byly zhotoveny tři imunizační protokoly, které jsou popsány níže.
Protokol Cl - Vakcinace rekombinantní A podjednotkou ureázy
Samičky šest týdnů starých myší BALB/c (10 kusů) byly orálně imunizovány 30 pg purifikované rekombinantní A podjednotky ureázy z Helicobacter pylori a 1 mg hvdroxvapatitu a 10 pg 20 choleratoxinu ve dnech 0. 8. 14 a 21. Deset myší bylo ve dnech 32. 34 a 36 vy staveno působení 10s Helicobacter felis z kapalné kultury.
Protokol C2 - Vakcinace rekombinantní B podjednotkou ureázy
Samičky šest týdnů starých myší BALB/c (10 kusů) byly orálně imunizovány 30 pg rekombinantní B podjednotkou ureázy z Helicobacter pylori a 1 mg hydroxyapatitu a 10pg choleratoxinu ve dnech 0, 8, 14 a 21. Deset myší bylo ve dnech 32, 34 a 36 vystaveno působení 10s Helicobacter felis z kapalné kultury.
Protokol C3 - Kontrola
Samičky šest týdnů starých myší BALB/c (10 kusů) byly orálně imunizovány Img hydroxyapatitu a 10 pg choleratoxinu ve dnech 0, 8, 14 a 21. Deset myší bylo ve dnech 32. 34 a 36 vystaveno působení 10s Helicobacter felis z kapalné kultury.
Ve dnech 42 nebo 106 byly myši usmrceny a byly několikanásobně odebrány biopsie ze žaludku.
Ochrana a vyhodnocení výsledků
Za účelem zhodnocení výsledné ochrany byly biopsie ze žaludeční dutiny a ze žaludeční hmoty testovány stanovením ureázové aktivity pomocí testu Jatrox HP (Rohm Pharma), přičemž se postupovalo podle instrukcí dodavatele. Množství ureázy se kvantifikovalo spektrofotometrickým měřením při vlnové délce 550 nm. Výsledná hodnota absorbance. platná pro jednu myš, byla získána jako součet hodnot, naměřených pro dutinu a korpus.
Claims (25)
1. Přípravek, poskytující savčímu hostiteli ochranu proti infekci bakteriemi rodu Helicobacter, vyznačující se tím, že obsahuje buď dostačující počet epitopů endogenní ureázy bakterie rodu Helicobacter, vybrané ze skupiny, zahrnující Helicobacter pylori a Helicobacter felis, k vyvolání ochranné nebo terapeutické imunitní odpovědi na infekci jmenovanou bakterií, nebo imunologicky účinné množství IgA protilátky specifické k ureáze.
2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jím je polyaminokyselinový přípravek, vyvolávající v savčím hostiteli ochrannou nebo terapeutickou imunitní odpověď na infekci bakteriemi rodu Helicobacter, který obsahuje dostačující počet epitopů endogenní ureázy bakterie rodu Helicobacter, vybrané ze skupiny, zahrnující Helicobacter pylori a Helicobacter felis, k vyvolání ochranné nebo terapeutické imunitní odpovědi na infekci jmenovanou bakterií.
3. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje intaktní ureázu, purifikovanou z bakterie rodu Helicobacter.
4. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje peptidy. homologní s enzymaticky inaktivními částmi aminokyselinové sekvence ureázy.
5. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje peptidy. které nejsou homologní s aminokyselinovou sekvencí ureázy, ale které vykazují epitopy. schopné křížové reakce s ureázou.
6. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje ureázu z Helicobacter pylori.
7. Přípravek podle nároku 2. vyznačující se tím. že tento přípravek obsahuje alespoň podjednotku ureázy . s nebo bez enzymatické aktivity.
8. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje antiidiotypické protilátky k ureáze.
9. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje peptidy. imunologicky křížově reagující s ureázou.
10. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje ureázové antigeny, vyprodukované pomocí technik rekombinantní DNA.
11. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že tento přípravek obsahuje subgenní fragmenty ureázy', produkované rekombinantními technikami.
12. Přípravek podle nároku 2. vyznačující se tím. že tento přípravek obsahuje subgenní fragmenty ureázy, produkované jako geneticky fúzní proteiny.
13. Přípravek podle nároku 12. vyznačující se tím. že uvedené fúzní proteiny obsahují podjednotky choleratoxinu.
14. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že je určen pro podání spolu s mukózním adjuvantem.
-20 CZ 284416 B6
15. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedeným mukózním adjuvantem je choleratoxin.
16. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že je určen pro podání člověku.
17. Přípravek podle nároku 2, vyznačující se tím, že je určen k podání spolu s hydroxylovaným fosforečnanem vápenatým.
18. Přípravek podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedeným hydroxylovaným fosforečnanem vápenatým je hydroxyapatit.
19. Vakcína pro vyvolání ochranné nebo terapeutické imunitní odpovědi na infekci bakteriemi rodu Helicobacter v savčím hostiteli, vyznačující se tím, že tato vakcína obsahuje polyaminokyselinový přípravek podle nároku 2, vykazující epitopy ureázy, která je endogenní pro bakterii rodu Helicobacter, vybranou ze skupiny, zahrnující Helicobacter pylori a Helicobacter felis, na farmaceuticky akceptovatelném nosiči nebo ředidle.
20. Vakcína podle nároku 19, vyznačující se tím, že dále obsahuje mukózní adjuvans.
21. Přípravek podle nároku 1, poskytující savčímu hostiteli pasivní ochranu před infekcí bakteriemi rodu Helicobacter, vyznačující se tím, že obsahuje imunologicky účinné množství IgA protilátky specifické k ureáze, vyprodukované v člověku imunizací ureázou, vyvolávající ochrannou imunitní odpověď na bakterie rodu Helicobacter.
22. Přípravek podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedenou protilátkou je IgA protilátka, specifická k ureáze z Helicobacter pylori.
23. Přípravek podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedeným savčím hostitelem je člověk.
24. Způsob vyhodnocení endogenní imunitní odpovědi savce, infikovaného bakteriemi rodu Helicobacter, vyznačující se t í m , že se ve vzorku z gastrointestinálního traktu tohoto savce stanoví přítomnost protilátky, reagující s epitopy endogenní ureázy této bakterie rodu Helicobacter.
25. Způsob vyhodnocení endogenní imunitní odpovědi savce, infikovaného bakteriemi rodu Helicobacter. kterému byla podána vakcína proti bakteriím rodu Helicobacter, vyznačující se tím, že se ve vzorku z gastrointestinálního traktu tohoto savce stanoví přítomnost protilátky, reagující s epitopy endogenní ureázy této bakterie rodu Helicobacter.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US97099692A | 1992-11-03 | 1992-11-03 | |
| US08/085,938 US5972336A (en) | 1992-11-03 | 1993-07-06 | Urease-based vaccine against helicobacter infection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ160994A3 CZ160994A3 (en) | 1995-04-12 |
| CZ284416B6 true CZ284416B6 (cs) | 1998-11-11 |
Family
ID=25517797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ941609A CZ284416B6 (cs) | 1992-11-03 | 1993-11-02 | Vakcina proti infekcím bakteriemi rodu Helicobacter na bázi ureasy |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5972336A (cs) |
| EP (2) | EP0625053B1 (cs) |
| JP (1) | JPH07503255A (cs) |
| KR (1) | KR100287424B1 (cs) |
| CN (1) | CN1111429C (cs) |
| AT (1) | ATE217196T1 (cs) |
| AU (2) | AU678195C (cs) |
| BR (1) | BR9305711A (cs) |
| CA (1) | CA2127283A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ284416B6 (cs) |
| DE (1) | DE69331901T2 (cs) |
| DK (1) | DK0625053T3 (cs) |
| ES (1) | ES2176232T3 (cs) |
| FI (1) | FI112032B (cs) |
| GE (1) | GEP20012429B (cs) |
| HU (1) | HU219760B (cs) |
| IL (1) | IL107474A (cs) |
| MX (1) | MX9306841A (cs) |
| NO (1) | NO942490L (cs) |
| NZ (2) | NZ258118A (cs) |
| OA (1) | OA10087A (cs) |
| PL (1) | PL174448B1 (cs) |
| PT (1) | PT625053E (cs) |
| RO (1) | RO114870B1 (cs) |
| RU (1) | RU2125891C1 (cs) |
| SG (1) | SG70978A1 (cs) |
| SK (1) | SK280619B6 (cs) |
| WO (1) | WO1994009823A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA938203B (cs) |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2682122B1 (fr) * | 1991-10-03 | 1995-06-09 | Pasteur Institut | Nouveaux genes d'helicobacter pylori. leur utilisation pour la preparation de souches recombinantes de h. pylori. |
| US6290962B1 (en) * | 1992-11-03 | 2001-09-18 | Oravax, Inc. | Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection |
| WO1995014093A1 (en) | 1993-05-19 | 1995-05-26 | Institut Pasteur | Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides |
| US5843460A (en) * | 1993-05-19 | 1998-12-01 | Institut Pasteur | Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides |
| US6406703B1 (en) | 1993-07-27 | 2002-06-18 | Csl Limited | Treatment of H. pylori associated gastroduodenal disease |
| KR100333113B1 (ko) * | 1993-07-27 | 2002-11-27 | 시에스엘 리미티드 | 헬리코박터피롤리관련위십이지장질환의치료방법 |
| AU702878B2 (en) * | 1994-06-08 | 1999-03-11 | Csl Limited | Treatment and prevention of helicobacter infection |
| AUPM612494A0 (en) | 1994-06-08 | 1994-06-30 | Csl Limited | Treatment or prevention of helicobacter infection |
| JPH10502365A (ja) * | 1994-07-01 | 1998-03-03 | リカン・リミテッド | ヘリコバクタータンパク質およびワクチン |
| AU723063B2 (en) * | 1995-04-28 | 2000-08-17 | Oravax, Inc | Multimeric, recombinant urease vaccine |
| US5837240A (en) * | 1995-04-28 | 1998-11-17 | Oravax-Merieux Co. | Multimeric, recombinant urease vaccine |
| EP0840796A2 (en) * | 1995-07-26 | 1998-05-13 | Maxim Pharmaceuticals | Mucosal delivery of polynucleotides |
| GB2307987A (en) * | 1995-12-06 | 1997-06-11 | Univ Manchester | Epitopes of the urease of Helicobacter pylori as dignostic agents; pharmaceuticals comprising such epitopes or the antibodies thereto |
| US6248551B1 (en) * | 1997-03-28 | 2001-06-19 | Institut Pasteur | Helicobacter aliphatic amidase AmiE polypeptides, and DNA sequences encoding those polypeptides |
| US20020026035A1 (en) * | 1997-04-01 | 2002-02-28 | Harold Kleanthous | Helicobacter ghpo 1360 and ghpo 750 polypeptides and corresponding polynucleotide molecules |
| AU7537598A (en) * | 1997-04-30 | 1998-11-24 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Dna based anti-(helicobacter) vaccine composition |
| US20030158396A1 (en) * | 1997-07-29 | 2003-08-21 | Harold Kleanthous | Identification of polynucleotides encoding novel helicobacter polypeptides in the helicobacter genome |
| US5985631A (en) * | 1997-09-12 | 1999-11-16 | Oravax-Merieux Co. | Method for preventing the activation of inactive, recombinant Helicobacter pylori apourease |
| US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| US20020151462A1 (en) * | 1998-02-19 | 2002-10-17 | Ling Lissolo | Helicobacter pylori membrane proteins |
| GB9807721D0 (en) * | 1998-04-08 | 1998-06-10 | Chiron Spa | Antigen |
| CA2335487A1 (en) | 1998-06-19 | 1999-12-23 | Merieux Oravax | Lt and ct in parenteral immunization methods against helicobacter infection |
| US6190667B1 (en) * | 1998-06-30 | 2001-02-20 | Institut Pasteur | Methods of inhibiting Helicobacter pylori |
| AU8464398A (en) * | 1998-07-16 | 2000-02-07 | Cheil Jedang Corporation | Urease based vaccine against (helicobacter) infection |
| CA2361377C (en) * | 1999-02-05 | 2009-02-03 | Alk-Abello A/S | Novel mucosal delivery system |
| US7384640B1 (en) * | 1999-09-30 | 2008-06-10 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant |
| DK2116257T3 (da) | 2000-08-09 | 2013-02-04 | Alk Abello As | Parenterale vaccineformuleringer og anvendelser deraf |
| US20020107368A1 (en) * | 2000-12-07 | 2002-08-08 | Jing-Hui Tian | Helicobacter proteins, gene sequences and uses thereof |
| AUPR524101A0 (en) * | 2001-05-25 | 2001-06-21 | Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The | Antigen targeting |
| US7285281B2 (en) | 2001-06-07 | 2007-10-23 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant |
| JP2005508143A (ja) * | 2001-06-07 | 2005-03-31 | ワイス・ホールデイングス・コーポレーシヨン | アジュバントとしてのコレラホロトキシンの突然変異形 |
| MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US8916165B2 (en) | 2004-12-15 | 2014-12-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized Aβ antibodies for use in improving cognition |
| US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
| CN100460014C (zh) * | 2006-07-20 | 2009-02-11 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于尿素酶b亚单位活性片段的幽门螺杆菌疫苗及其制备方法 |
| CN101611143B (zh) * | 2006-11-10 | 2015-01-14 | 翁德克控股有限公司 | 将肽递送入胃粘膜的方法和装置 |
| US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
| PL2182983T3 (pl) | 2007-07-27 | 2014-10-31 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta |
| JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
| KR100982489B1 (ko) * | 2007-12-17 | 2010-09-15 | 대구한의대학교산학협력단 | 헬리코박터 파일로리로부터 유래된 항원을 이용하여헬리코박터 파일로리 특이 항체 생산을 위한 백신을제조하는 방법 |
| US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
| US9511151B2 (en) | 2010-11-12 | 2016-12-06 | Uti Limited Partnership | Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer |
| US10988516B2 (en) | 2012-03-26 | 2021-04-27 | Uti Limited Partnership | Methods and compositions for treating inflammation |
| PL218700B1 (pl) | 2012-03-29 | 2015-01-30 | Gdański Univ Medyczny | Doustna szczepionka zawierająca przetrwalniki Bacillus subtilis oraz jej zastosowanie do immunizacji przeciwko Helicobacter pylori |
| US9603948B2 (en) | 2012-10-11 | 2017-03-28 | Uti Limited Partnership | Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders |
| EP2837939A1 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-18 | Technische Universität München | Method for the detection of H.pylori infection |
| WO2015063616A2 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Uti Limited Partnership | Methods and compositions for sustained immunotherapy |
| AU2016275312B2 (en) | 2015-05-06 | 2021-12-23 | Uti Limited Partnership | Nanoparticle compositions for sustained therapy |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879213A (en) * | 1986-12-05 | 1989-11-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse |
| US5268276A (en) * | 1988-09-16 | 1993-12-07 | Jan Holmgren | Recombinant systems for expression of cholera B-sub-unit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides |
| FR2637612B1 (fr) * | 1988-10-06 | 1993-09-10 | Pasteur Institut | Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique |
| US5443832A (en) * | 1990-04-16 | 1995-08-22 | Institut Swisse De Recherches Experimentales Sur Le Cancer | Hydroxyapatite-antigen conjugates and methods for generating a poly-Ig immune response |
| JPH04169539A (ja) * | 1990-11-01 | 1992-06-17 | Imuno Japan:Kk | 消化器疾患治療・予防剤およびその製造方法 |
| EP0582672A4 (en) * | 1991-04-26 | 1994-06-29 | Emanuel Calenoff | Methods to detect and treat diseases caused by bacterial allergens |
| FR2682122B1 (fr) * | 1991-10-03 | 1995-06-09 | Pasteur Institut | Nouveaux genes d'helicobacter pylori. leur utilisation pour la preparation de souches recombinantes de h. pylori. |
| US5859219A (en) * | 1992-02-26 | 1999-01-12 | Vanderbilt University | Purified vacuolating toxin from Helicobacter pylori and methods to use same |
| JP3368902B2 (ja) * | 1992-03-02 | 2003-01-20 | カイロン エセ．ピー．アー． | ワクチンおよび診断に有用なＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉタンパク質 |
| MX9301706A (es) * | 1992-04-13 | 1994-05-31 | Oravax Inc | Composicion de vacuna para el tratamiento de la infeccion por helicobacter. |
| US5733740A (en) * | 1992-10-13 | 1998-03-31 | Vanderbilt University | Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma |
| US5843460A (en) * | 1993-05-19 | 1998-12-01 | Institut Pasteur | Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides |
| US5897475A (en) * | 1994-10-05 | 1999-04-27 | Antex Biologics, Inc. | Vaccines comprising enhanced antigenic helicobacter spp. |
| US5837240A (en) * | 1995-04-28 | 1998-11-17 | Oravax-Merieux Co. | Multimeric, recombinant urease vaccine |
-
1993
- 1993-07-06 US US08/085,938 patent/US5972336A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-02 IL IL10747493A patent/IL107474A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-11-02 SG SG1996004759A patent/SG70978A1/en unknown
- 1993-11-02 BR BR9305711A patent/BR9305711A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-11-02 AU AU55619/94A patent/AU678195C/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1993-11-02 WO PCT/EP1993/003059 patent/WO1994009823A1/en active IP Right Grant
- 1993-11-02 CZ CZ941609A patent/CZ284416B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-11-02 PL PL93304419A patent/PL174448B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-11-02 KR KR1019940702314A patent/KR100287424B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-11-02 PT PT94900794T patent/PT625053E/pt unknown
- 1993-11-02 NZ NZ258118A patent/NZ258118A/en unknown
- 1993-11-02 CA CA002127283A patent/CA2127283A1/en not_active Abandoned
- 1993-11-02 HU HU9402261A patent/HU219760B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-11-02 RU RU94037239A patent/RU2125891C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-11-02 SK SK793-94A patent/SK280619B6/sk unknown
- 1993-11-02 EP EP94900794A patent/EP0625053B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-02 RO RO94-01132A patent/RO114870B1/ro unknown
- 1993-11-02 EP EP01122576A patent/EP1170016A3/en not_active Withdrawn
- 1993-11-02 ES ES94900794T patent/ES2176232T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-02 GE GEAP19932678A patent/GEP20012429B/en unknown
- 1993-11-02 NZ NZ299149A patent/NZ299149A/en unknown
- 1993-11-02 AT AT94900794T patent/ATE217196T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-11-02 DE DE69331901T patent/DE69331901T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-02 DK DK94900794T patent/DK0625053T3/da active
- 1993-11-02 JP JP6510719A patent/JPH07503255A/ja active Pending
- 1993-11-03 ZA ZA938203A patent/ZA938203B/xx unknown
- 1993-11-03 MX MX9306841A patent/MX9306841A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-11-03 CN CN93112675A patent/CN1111429C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-07-01 FI FI943171A patent/FI112032B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-07-01 OA OA60532A patent/OA10087A/en unknown
- 1994-07-01 NO NO942490A patent/NO942490L/no not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-12-18 AU AU2003270987A patent/AU2003270987A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ284416B6 (cs) | Vakcina proti infekcím bakteriemi rodu Helicobacter na bázi ureasy | |
| AU694195B2 (en) | Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection | |
| Czinn et al. | Protection of germ-free mice from infection by Helicobacter felis after active oral or passive IgA immunization | |
| JPH11504633A (ja) | 多量体の組換えウレアーゼワクチン | |
| KR100251391B1 (ko) | 헬리코박터 감염에 대한 우레아제 기재 백신 | |
| WO2000003730A1 (en) | Urease based vaccine against helicobacter infection | |
| KR100207289B1 (ko) | 헬리코박터 파이로리 유래의 항원단백질을 함유하는 리포좀 | |
| PL235826B1 (pl) | Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20041102 |