PL235826B1 - Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae - Google Patents

Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae Download PDF

Info

Publication number
PL235826B1
PL235826B1 PL408955A PL40895514A PL235826B1 PL 235826 B1 PL235826 B1 PL 235826B1 PL 408955 A PL408955 A PL 408955A PL 40895514 A PL40895514 A PL 40895514A PL 235826 B1 PL235826 B1 PL 235826B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
conjugate
protein
vaccine
carrier
peptide
Prior art date
Application number
PL408955A
Other languages
English (en)
Other versions
PL408955A1 (pl
Inventor
Anna JARZĄB
Anna Jarząb
Andrzej Gamian
Danuta Witkowska
Edmund ZIOMEK
Edmund Ziomek
Original Assignee
Wroclawskie Centrum Badan Eit Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wroclawskie Centrum Badan Eit Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Wroclawskie Centrum Badan Eit Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL408955A priority Critical patent/PL235826B1/pl
Priority to PCT/IB2015/055537 priority patent/WO2016012951A1/en
Publication of PL408955A1 publication Critical patent/PL408955A1/pl
Publication of PL235826B1 publication Critical patent/PL235826B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0283—Shigella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Ujawniono koniugat białka nośnikowego i antygenu peptydowego, stanowiącego epitop białka OmpC, mający zastosowanie jako szczepionka chroniąca przed zakażeniami powodowanymi przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae, szczególnie gatunków z rodzaju Shigella. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna i szczepionka zawierające rzeczony koniugat oraz sposób jego otrzymywania i zastosowanie.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest koniugat białka nośnikowego i antygenu peptydowego, stanowiącego epitop białka OmpC, mający zastosowanie jako szczepionka chroniąca przed zakażeniami powodowanymi przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae, szczególnie gatunki z rodzaju Shigella, Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, kompozycja diagnostyczna i szczepionka zawierająca rzeczony koniugat oraz sposób otrzymywania koniugatu i jego zastosowanie.
Bakterie z rodzaju Shigella są jednymi z najniebezpieczniejszych wśród patogennych gatunków należących do rodziny Enterobacteriaceae. Shigeloza (dyzenteria, czerwonka bakteryjna), to choroba charakteryzująca się ostrym zapaleniem przewodu pokarmowego, wywołanym wnikaniem bakterii do komórek nabłonkowych wyścielających ściany jelit. Do najbardziej charakterystycznych objawów shigelozy należą wodniste, krwawe lub śluzowe biegunki, nudności, wymioty, gorączka i bóle brzucha.
Wśród gatunków Enterobacteriaceae na specjalną uwagę zasługuje grupa bezwzględnych patogenów, w szczególności gatunki z rodzajów Shigella, Salmonella i Yersinia, odpowiedzialne za bakteryjne zakażenia pokarmowe, zwłaszcza pałeczki będące bezpośrednią przyczyną biegunek, duru brzusznego, czerwonki bakteryjnej i innych schorzeń jelitowych. Pałeczki jelitowe wraz z paciorkowcami i gronkowcami wymieniane są jako jeden z najczęściej występujących i najpoważniejszych czynników etiologicznych zachorowań o podłożu bakteryjnym. Według raportów Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) na 4,5 miliarda przypadków zachorowań, zatrucia pokarmowe są przyczyną śmierci 1,9 miliona osób rocznie i zajmują trzecie miejsce wśród chorób o największym odsetku śmiertelności na świccte. Ponadto szacuje się, że do około 99% wszystkich zgonów dochodzi w krajach rozwijających się, a w szczególności dotyczy to noworodków i dzieci poniżej piątego roku życia. Zakażenia pokarmowe, powodowane przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae stanowią zagrożenie dla ludności na całym świecie, w szczególności wśród uchodźców, żeglarzy i turystów, którzy mogą przenosić zakażenie wskutek geograficznego przemieszczania się ludności. Z danych statystycznych wynika, że około 50% wszystkich podróżujących do krajów Trzeciego Świata choruje na tzw. „biegunkę podróżnych.
Rozprzestrzenianie się wśród bakterii z rodziny Enterobacteriaceae mechanizmów oporności na antybiotyki, a także pojawienie się szczepów wykazujących oporność wielolekową, jest ważnym i trudnym problemem terapeutycznym. Ze względu na duże podobieństwo mikroorganizmów należących do tej rodziny, trudniejsze jest odróżnienie poszczególnych gatunków, szczególnie ich identyfikacja. Komplikuje to podjęcie właściwych procedur terapeutycznych, umożliwiających leczenie, zwłaszcza dobór odpowiedniej, ukierunkowanej i skutecznej antybiotykoterapii. Wydaje się zatem, że działaniem najskuteczniejszym powinna być profilaktyka. W tym pojęciu mieści się zarówno zachowanie odpowiedniej higieny sanitarnej, jak i badania dotyczące nowych leków, lecz także opracowanie i szczegółowa charakterystyka dodatkowych czynników umożliwiających szybką diagnostykę zakażeń oraz działania prewencyjne, zmierzające do opracowania szczepionek chroniących przed zakażeniami wywoływanymi przez te patogeny.
Ze stanu techniki znane są szczepionki złożone z żywych, atenuowanych (osłabionych) szczepów (Barnoy S., Baqar S., Kaminski R. W., Collins T., Nemelka K., Hale T. L., Ranallo R. T., Venkatesan M. M.: Shigella sonnei vaccine candidates WRSs2 and WRSs3 are as immunogenic as WRSS1, a clinically tested vaccine candidate, in a primate model of infection. Vaccine, 2011; 29(37); 6371-637) lub zabitych komórek bakteryjnych, inaktywowanych wysoką temperaturą, działaniem promieniowania lub czynników chemicznych, wykazujących zdolność do wzbudzania odpowiedzi immunologicznej związanej z przewodem pokarmowym. W przypadku konstrukcji szczepionek zawierających żywe, lecz osłabione szczepy bakteryjne rozważane jest użycie mutantów otrzymanych w wyniku delecji w obrębie genu białka virG, odpowiedzialnego za ruchliwość komórek Shigella, wiążącą się z wykorzystaniem włókien aktynowych. Prace ilustrujące rezultaty przeprowadzonych badań klinicznych znajdujących się aktualnie w I i II fazie opublikowali Ranallo R.T., Fonseka S., Boren T.L., Bedford L.A., Kaminski R.W., Thakkar S., Venkatesan M.M.: Two live attenuated Shigella flexneri 2a strains WRSf2G12 and WRSf2G15: a new combination of gene deletions for 2nd generation live attenuated vaccine candidates. Vaccine. 2012; 30(34): 5159-5171.
Ponadto pałeczki S. flexneri 2a pozbawiono genów odpowiedzialnych za ekspresję enterotoksyn (senA, senB) oraz genu odpowiedzialnego za ekspresję acylotransferazy lipidu A (msbB2), który w przypadku użycia do szczepionek otrzymanych w wyniku tych modyfikacji szczepów WRSf2G12 i WRSf2G15 prowadzi do podniesienia bezpieczeństwa szczepionki. Obydwa szczepy są silnie osłabione i zachowują stabilność genetyczną, zarówno w testach in vitro, prowadzonych na liniach komór
PL 235 826 B1 kowych jak i in vivo na modelach zwierzęcych. Badania przeprowadzone na świnkach morskich wykazały, że po immunizacji zwierząt podanej do oka dochodzi do silnej indukcji zarówno układowej jak i śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej. Stwierdzono, że zwierzęta immunizowane atenuowanymi szczepami WRSf2G12 oraz WRSf2G15 są chronione przed infekcją homologicznym dzikim szczepem Shigella flexneri (Ranallo R.T., Fonseka S., Boren T.L., Bedford L.A., Kamiński R.W., Thakkar S., Venkatesan M.M.: Two live attenuated Shigella flexneri 2a strains WRSf2G12 and WRSf2G15: a new combination of gene deletions for 2nd generation live attenuated vaccine candidates. Vaccine. 2012; 30(34); 5159-5171).
Podobne modyfikacje są wprowadzane w genomie Shigella sonnei. Delecje wprowadzone w obrębie genu białka VirG uniemożliwiły temu patogenowi rozprzestrzenianie się w obrębie tkanek gospodarza, a także gwarantowały indukcję ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu patogenowi. Tak przygotowany szczep był podstawą szczepionki WRSS1, która znalazła się w I fazie badań klinicznych. Jednak pojawienie się u niektórych wolontariuszy skutków ubocznych takich jak gorączka i lekkie biegunki, było przyczyną wprowadzenia dodatkowych mutacji zmierzających do zmniejszenia toksyczności, spowodowanej obecnością w WRSS1 dużych ilości lipopolisacharydu. Podobnie jak w przypadku szczepów S. flexneri, mutant szczepu S. sonnei WRSS1 został dodatkowo osłabiony przez unieczynnienie genów senA, senB (WRSs2) oraz dodatkowo msbB2 (WRSs3). Badania przeprowadzone na małpach rezus wykazały, że zarówno WRSs2 jak i WRSs3 powodują u zwierząt wzbudzenie układowej i śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej na podobnym poziomie jak w przypadku użycia szczepu WRSS1, jednocześnie gwarantując użycie bezpieczniejszej szczepionki o porównywalnej immunogenności (Barnoy S., Baqar S., Kaminski R. W., Collins T., Nemelka K., Hale T.L., Ranallo R.T., Venkatesan MM.: Shigella sonnei vaccine candidates WRSs2 and WRSs3 are as immunogenic as WRSS1, a clinically tested vaccine candidate, in a primate model of infection. Vaccine, 2011; 29(37); 6371-6378).
Szczepionki atenuowane składają się więc z odpowiednio osłabionej wersji żywego mikroorganizmu, która nie jest w stanie wywołać zakażenia. Zastosowanie w szczepionce tego typu drobnoustrojów jest zabiegiem najlepiej imitującym wywołanie naturalnej infekcji i prowadzi to do wytworzenia pełnowartościowej pamięci immunologicznej, pozwalającej w przypadku wniknięcia do organizmu tego patogenu na rozpoznanie jego antygenów. Szczepionki te wzbudzają obydwa typy odpowiedzi immunologicznej, zarówno komórkową jak i humoralną i wywołują długotrwałą odporność po podaniu zaledwie 1-2 dawek szczepionki. Niestety zastosowanie szczepionek atenuowanych niesie zawsze pewne ryzyko zakażenia poszczepiennego, związane z możliwością rewersji drobnoustroju do formy zjadliwej na skutek mutacji lub może wynikać również z niedostatecznej inaktywacji zjadliwych patogenów, lub mogą wystąpić reakcje uboczne, między innymi alergie spowodowane obecnością wielu komponentów wchodzących w skład komórek bakteryjnych.
Ponadto, szczepionki zawierające żywe czy osłabione szczepy nie mogą być podawane osobom, z zespołem nabytego upośledzenia odporności (np. chorzy na AIDS) oraz pacjentom, znajdującym się w czasowej niedyspozycji immunologicznej, do których należą chorzy na różnego typu nowotwory, poddawani chemioterapii.
Uzyskiwanie osłabionych szczepów wirusów, których genom jest relatywnie mały, jest procesem znacznie łatwiejszym niż atenuacja komórek bakteryjnych, których genom jest zdecydowanie większy. W przypadku wirusów bardzo często wystarczającym czynnikiem mutagennym prowadzącym do osłabienia drobnoustroju jest hodowla wirusa w niesprzyjających warunkach do jego rozwoju. Natomiast w przypadku wyposażonych w tysiące różnych genów bakterii, proces atenuacji jest dużo bardziej skomplikowany i trudniejszy do kontrolowania. Bardzo często w celu unieczynnienia kluczowych dla patogennych bakterii genów wymagane jest zastosowanie metod inżynierii genetycznej.
Alternatywą do szczepionek atenuowanyćh są szczepionki inakiywowane, zawierające zabite szczepy mikroorganizmów. Jedną z obiecujących szczepionek, która jest aktualnie w I fazie badań klinicznych, jest szczepionka SsWC złożona z komórek Shigella sonnei inaktywowanych formaliną. Badania przedkliniczne nad szczepionką SsWC pokazały, że ma ona właściwości immunogenne i po zakażeniu świnek morskich winilentnym szczepem Shigella sonnei działa ochronnie przeciwko zapaleniu rogówki. Przeprowadzone na małej grupie ochotników badania kliniczne pozwoliły stwierdzić, że podanie 2,0 x 10 to inaktywowanych komórek bakteryjnych w różnych odstępach czasowych i w różnej liczbie dawek przez 4 tygodnie, powoduje podwyższenie miana przeciwciał anty-SsWC, anty-LPS oraz anty-IpaC w surowicy i kale wolontariuszy. Ponadto szczepionka ta była dobrze tolerowana przez organizm i nie zanotowano żadnych objawów ubocznych związanych z wystąpieniem gorączki czy
PL 235 826 B1 zakażeniem układu pokarmowego. Po szczepieniu SsWC miano przeciwciał klasy IgG oraz IgA w surowicy ochotników wykazywało tendencje wzrostowe. Spośród 7 szczepionych ochotników wzrost przeciwciał anty-SsWC, anty-LPS i anty-IpaC stwierdzono odpowiednio u 6 (86%), 4 (57%) i 5 (61%) osób. Obecność wydzielniczych IgA badano u 5 osób, z których 5 (100%) posiadało przeciwciała skierowane przeciwko SsWC, 3 (42%) przeciwko LPS i 3 (42%) przeciwko IpaC (McKenzie R., Walker R.I., Nabory G.S., Van De Verg L.L., Carpenter C., Gomes G., Forbes E., Tian J.H., Yang H.H., Pace J.L, Jackson W.J., Bourgeois A.L.: Safety and immunogenicity of an oral, inactivated, whole-cell vaccine for Shigella sonnei: preclinical studies and a Phase I trial. Vaccine. 2006: 24(18): 3735-3745). Szczepionka ta powoduje wzbudzenie odpowiedzi na LPS, który jest specyficzny dla danego serotypu, wywołuje również specyficzną odpowiedź immunologiczną na białka stanowiące antygeny plazmidu odpowiedzialnego za adhezję i inwazję bakterii na komórki nabłonkowe (Ipa - Invasion plasmid antigen). Zaletą jest fakt, że wzbudza ona odpowiedź śluzówkową związaną z jelitem, a także odpowiedź układową, w dużej mierze zbliżoną do wywoływanej podczas naturalnego zakażenia patogenem. Przygotowanie jej jest stosunkowo tanie, a podanie nieskomplikowane i niewymagające zastosowania igieł. Jednak należy zauważyć, że doustna szczepionka SsWC zawierająca całe, zabite komórki bakteryjne jest jednak o małym stopniu zdefiniowania i standaryzacji, ponieważ zawiera szeroki panel antygenów bakteryjnych (McKenzie R., Walker R.I., Nabors G.S., Van De Verg L.L., Carpenter C., Gomes G., Forbes E., Tian J.H., Yang H.H., Pace J.L., Jackson W.J., Bourgeois A.L. : Safety and immunogenicity of an oral, inactivated, whole-cell vaccine for Shigella sonnei: preclinical studies and a Phase I trial. Vaccine. 2006; 24(18): 3735-3745).
W odróżnieniu od żywych i osłabionych szczepów zabite patogeny są bardziej stabilne i bezpieczniejsze, a także łatwiejsze w transporcie i przechowywaniu. Niemniej jednak szczepionki te wywołują słabszą odpowiedź odpornościową, którą charakteryzuje krótsza pamięć immunologiczna. Z tego też względu skuteczna immunizacja wymaga najczęściej podania kilku dawek przypominających. Inaktywacja patogenów może także doprowadzić do zmian konformacji antygenów obecnych na powierzchni komórek, a tym samym do obniżenia ich właściwości immunogennych (Burke CJ., Hsu T.A„ Volkin D.B.: Formulation, stability, and delivery of live attenuated vaccines for human use. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999;16(1): 1-83).
Problemy związane ze stosowaniem całych komórek bakteryjnych w szczepionkach nic dotyczą szczepionek nowej generacji, zawierających jedynie zestaw wyselekcjonowanych antygenów wzbudzających specyficzną odpowiedź immunologiczną, co zasadniczo ogranicza występowanie efektów ubocznych. Rozwój nowoczesnych technologii sprawił, że badania związane z rozwojem wielu chorób zakaźnych oraz poszukiwanie antygenów do szczepionek zaczęto rozpatrywać na poziomie genomowym i proteomicznym. Wyselekcjonowane składniki szczepionek podjednostkowych umożliwiają identyfikację czynników bezpośrednio zaangażowanych w indukcję odpowiedzi odpornościowej. Chemiczna synteza antygenów stanowiących sekwencje epitopów peptydowych lub polisacharydowych, jak również izolacja określonych frakcji komórkowych drobnoustrojów oraz ekspresja białek wirulentnych szczepów w innych systemach (np. bakteryjnych, wirusowych, drożdżowych, zwierzęcych, roślinnych) stanowią podstawę w rozwoju szczepionek podjednostkowych i koniugatowych.
W przypadku szczepionek chroniących przed rozwojem czerwonki bakteryjnej pod uwagę brane są szczepionki podjednostkowe, oparte na antygenach powierzchniowych, takich jak np, lipopolisacharydy (LPS) (Lowell G.H., Kaminski R.W., Grate S., Hunt R.E., Charney C., Zimmer S., Colleton C.: Intranasal and intramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice. Infect. Immun. , 1996; 64:
1706-1713), czy białka błony zewnętrznej ściany komórkowej (Witkowska D., Bartyś A., Gamian A.: Białka osłony komórkowej pałeczek jelitowych i ich udział w patogenności oraz odporności przeciwbakteryjnej. Postępy Hig. Med. Dośw. 2009; 63: 176-199), a także szczepionki hybrydowe, z antygenami pochodzącymi z wielu różnych mikroorganizmów (np. Shigella, E. coli, S. typhi), które mogą chronić organizm przed kilkoma chorobami jednocześnie (Kotloff K.L., Herrington D.A., Hale T.L., Newland J.W., Van De Verg L., Cogan J.P., Snoy P.J., Sadoff J.C., Formal S.B., Levine M.M.: Safety, immunogenicity, and efficacy in monkeys and humans of invasive Escherichia coli K-12 hybrid vaccine candidates expressing Shigella flexneri 2a somatic antigen. Infect. Immun., 1992; 60; 2218-2224).
Invaplex 50 stanowiący kompleks inwazyn: IpaB, IpaC, IpaD wyizolowanych z Shigella flexneri 2a oraz LPS, jest typem szczepionki podjednostkowej dobrze rokującej we wzbudzaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej na zakażenia pałeczkami czerwonki bakteryjnej. Badania na modelach zwierzęcych wykazały, że myszy i świnki morskie immunizowane tym kompleksem były chronione
PL 235 826 B1 przed letalną dawką wirulentnego szczepu S. flexneri (Turbyfill K.R., Kamiński R.W., Oaks E.V.: Immunogenicity and efficacy of highly purified invasin complex vaccine from Shigella flexneri 2a. Vaccine, 2008; 26: 1353-1364). Sposobem jej produkcji na duża skalę będzie uzyskiwanie rekombinowanych form białek inwazyjnych, a wchodzący w jej skład LPS będzie ekstrahowany z natywnych komórek bakteryjnych. Wskazuje to jednak na fakt, że koszty opracowania takiej szczepionki, związane z koniecznością oczyszczania wchodzących w jej skład antygenów będą wysokie (Riddle M.S., Kaminski R. W., Williams C., Porter C., Baqar S., Kordis A., Gilliland T., Lapa J., Coughlin M., Soltis C., Jones E., Saunders J., Keiser P.B., Ranallo R.T., Gormley R., Nelson M., Turbyfill K.R., Tribble D., Oaks E.V.: Safety and immunogenicity of an intranasal Shigella flexneri 2a Invaplex 50 vaccine. Vaccine., 2011; 29(40): 7009-7019).
Badania nad podjednostkową szczepionką zawierającą TTSS białka IpaB oraz IpaD, zostały także przeprowadzone przez inny zespół, gdzie na modelu mysim potwierdzono immunogenność i właściwości ochronne białek IpaB oraz IpaD. Wykazano, że białka te podane razem z adiuwantem w postaci zmodyfikowanej genetycznie ciepło-labilnej toksyny E. coli, mają właściwości immunogenne i ochronne. Myszy immunizowane tylko białkiem IpaB lub białkiem IpaB w kompleksie z IpaD oraz wspomagane w obu przypadkach adiuwantem były chronione przed dawką śmiertelną S. flexneri i S. sonnei. Donosowa immunizacja zwierząt powoduje wzbudzenie układowej oraz śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej, skierowanej przeciwko obu tym białkom, a w szczególności przeciwko IpaB. Wadą tej szczepionki poza wskazanym wyżej wysokim kosztem rekombinowanych składników, są efekty uboczne: problemy związane z podrażnieniem błon śluzowych nosa.
Innymi białkami branymi pod uwagę jako antygeny szczepionek koniugatowych są białka błony zewnętrznej (OMP). Są one eksponowane na powierzchni bakterii i podczas inwazji patogenów jako pierwsze kontaktują się z komórkami zakażanego organizmu. Z tego względu charakteryzuje je wysoki potencjał dla konstrukcji szczepionek podjednostkowych. Analizy immunochemiczne głównych białek błony zewnętrznej S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae i S. boydii wykazały podobny profil białkowy oraz reaktywność krzyżową wśród wszystkich czterech gatunków rodzaju Shigella (Mulczyk M., Adamus G., Witkowska D., Romanowska E.: Studies on virulence of Shigella flexneri. Protective effect of outer membrane proteins. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1981; 29: 85-90, Witkowska D., Adamus G., Mulczyk M., Romanowska E.: Outer membrane protein composition of Shigella flexneri. FEMS Microbiol. Lett., 1982; 13: 109-111). Szczepionki te dają nadzieję na selektywną ochronę przed określonymi patogenami. Niestety szczepionki zawierające jedynie wybrane antygeny wymagają najczęściej większej liczby dawek przypominających i adiuwantów.
Ze zgłoszenia P.401502 znany jest epitop białka błony zewnętrznej ściany komórkowej z Shigella flexneri 3a o sekwencji A1-A2-A3-A4-A5-A6, gdzie:
A1 oznacza R,
A2 oznacza Y,
A3 oznacza D, R, E, N lub Q,
A4 oznacza E, D, N lub Q,
A5 oznacza R,
A6 oznacza Y, G lub F.
wykazujący immunoreaktywność z surowicą ludzką, szczególnie z surowicą krwi pępowinowej.
Pomimo, że badania nad szczepionką zabezpieczającą przed czerwonką bakteryjną prowadzone są z zastosowaniem praktycznie wszystkich najnowszych metod, aktualnie na rynku farmaceutycznym nie jest dostępna żadna licencjonowana szczepionka. Fakt ten nie tylko podkreśla konieczność jej opracowania, ale pokazuje równocześnie, że szczepionka ta nie jest łatwym celem. Wszystkie powyższe podejścia oraz szczepionki posiadają wady, mianowicie, żywe, pozbawione toksyn, inaktywowane, atenuowane szczepionki komórkowe zawierają całe komórki bakteryjne, gdzie istnieje ryzyko zakażenia poszczepiennego, możliwość rewersji drobnoustroju do formy zjadliwej, mutacji, niedostatecznej inaktywacji zjadliwych patogenów, mogą wystąpić reakcje uboczne, alergie przez wiele składników komórkowych, stosowanie konstruktów genetycznych, żywe i osłabione szczepy nie mogą być podawane osobom z obniżoną odpornością. Natomiast wadą proponowanych szczepionek podjednostkowych są wysokie koszty i efekty uboczne w postaci problemów związanych z podrażnieniem błon śluzowych nosa.
Problemem w stanie techniki jest brak bezpiecznej i efektywnej szczepionki przeciwko oportunistycznym bakteryjnym patogenom układu pokarmowego. Aby mogła być zaakceptowana, taka szczepionka powinna spełnić szereg kryteriów, takich jak aktywność w śluzówce jelita, zapewnianie długotrwałej osłony immunologicznej, brak skutków ubocznych. Ponadto pożądane jest aby była łatwa
PL 235 826 B1 w podawaniu i stosunkowo tania, ponieważ głównym odbiorcą będą dzieci w krajach o niskim poziomie ekonomicznym.
Jednocześnie dotychczasowe podejścia do konstrukcji szczepionek wykazują wiele wad, jak np. długotrwały proces oczyszczania natywnych antygenów, ich denaturacja podczas izolacji, mała standaryzacja preparatów stanowiących mieszanki różnych antygenów.
Celem wynalazku jest więc dostarczenie składników dla szczepionki przeciwko Enterobacteriaceae, szczególnie oportunistycznym bakteryjnym patogenom układu pokarmowego, zwłaszcza bakteriom rodzaju Shigella, rozwiązującej istniejące problemy i spełniającej powyższe kryteria.
Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu konstruowania szczepionki, wykluczającego możliwość występowania zakażeń w wyniku rewersji osłabionych szczepów do formy wirulentnej.
Przedmiotem wynalazku jest koniugat złożony z nośnika o charakterze hydrofobowym i antygenu peptydowego będącego epitopem białka OmpC, o sekwencji aminokwasowej A1-A2-A3-A4-A5-A6, gdzie:
A1 oznacza R,
A2 oznacza Y,
A3 oznacza D, R, E, N lub Q,
A4 oznacza E, D, N lub Q,
A5 oznacza R,
A6 oznacza Y, G lub F, a nośnik stanowi polietylen lub nośnik białkowy wybrany z grupy obejmującej toksoid tężcowy, toksoid dyfterytowy, albuminę surowicy wołowej.
Korzystnie antygen peptydowy wybrany jest z grupy obejmującej peptydy o sekwencji aminokwasowej: RYDERY, RYDDRY, RYEERY, RYQERY lub RYDQRY.
Korzystnie antygen peptydowy posiada sekwencję RYDERYIGC.
Korzystnie antygen peptydowy posiada sekwencję GLNRYDERYIGC.
Korzystnie, antygen peptydowy posiada konformację pętli. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca rzeczony koniugat i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Innym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca rzeczony koniugat, dopuszczalny farmaceutycznie nośnik oraz opcjonalnie adjuwant.
Korzystnie, szczepionka indukuje produkcję przeciwciał skierowanych przeciwko pałeczkom jelitowym z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakteriom z rodzaju Shigella.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca rzeczony koniugat, dopuszczalny farmaceutycznie nośnik oraz opcjonalnie adjuwant do zapobiegania i leczenia chorób wywołanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterie z rodzaju Shigella.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania rzeczonego koniugatu, obejmujący następujące etapy:
a) zabezpieczenie grup tiolowych białka nośnikowego w drodze bromoacetylacji;
b) koniugacje peptydu z nośnikiem białkowym;
c) dezaktywację nieprzereagowanych grup bromoacetylowych białka nośnikowego.
Korzystnie, bromoacetylację białka nośnikowego przeprowadza się w buforze węglanowym o pH 8,3 przy pomocy estru N-hydroksybursztynianowego kwasu bromoacetylowfego, korzystnie w stężeniu 1 mg estru na 1 mg białka (utrzymując stężenie białka c = 2 mg/ml). Korzystnie, po br omoacetylacji mieszaninę reakcyjną dializuje się do 0,1 M dwuwęglanu sodu o pH 8,3 i usuwa się ester na kolumnie.
Korzystnie, peptydy zawierające grupy tiolowe do koniugacji zawiesza się w 0,1 M buforze węglanowym z 2 mM EDTA o pH 8,3, następnie do roztworu peptydu dodaje się bromoacetylowane białko, po czym pH doprowadza się za pomocą 0,1 M NaOH do wartości 8,5.
Korzystnie, dezaktywację prowadzi się stosując 10 μl 2-merkaptoetanolu na 1 ml mieszaniny reakcyjnej podczas inkubacji przez 1 h w temperaturze pokojowej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku rzeczony koniugat do zastosowania jako szczepionka przeciwko Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakteriom rodzaju Shigella.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rzeczonego koniugatu do wytwarzania testu diagnostycznego do wykrywania Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.
Innym przedmioem wynalazku jest zastosowanie rzeczonego koniugatu do wytwarzania krwiopochodnych, immunoglobulinowych preparatów terapeutycznych specyficznych wobec Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.
PL 235 826 B1
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rzeczonego koniugatu do izolacji przeciwciał do biernej immunizacji w terapii zakażeń wywołanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae.
Korzystnie, zakażenia wywołane są przez bakterie z rodzaju Shigella.
Nieoczekiwanie okazało się. że istnieje duża różnica antygenowości pomiędzy koniugatami epitopu peptydowego OmpC i nośnika, i wynika z charakteru zastosowanego nośnika, co dotychczas nie było spotykane. Mianowicie peptydy syntezowane na nośnikach hydrofobowych jak polietylenowe piny, bądź nośniki białkowe jak toksoid tężcowy, toksoid dyfterytowy łub albumina surowicy wołowej, są znacznie lepiej rozpoznawane przez przeciwciała niż takie same peptydy związane z polilizyną (Fig. 7).
Nieoczekiwanie, zmiana nośnika peptydu z hydrofiiowej polilizyny na nośnik bardziej hydrofobowy, na przykład polietylen lub białko toksoid tężcowy (TT), znacznie podwyższyła antygenowość koniugatu z surowicą pępowinową oraz immunogenność u myszy. Nieoczywistym jest więc fakt, że biologicznie aktywna konformacja peptydu jest zależna od rodzaju nośnika użytego w koniugacie. W rezultacie zastosowano dla peptydów o budowie epitopu wyłącznie takie nośniki, które dają wysoce immunogenny koniugat. To sugerowało przyjmowanie przez peptyd właściwej konformacji epitopu w warunkach otoczenia hydrofobowego. Takimi nośnikami o wyraźnej hydrofobowości są toksoid tężcowy, toksoid dyfterytowy, powszechnie stosowane w szczepionkach ludzkich, także albumina surowicy wołowej jako białko modelowe. Nieoczywistym rozwiązaniem okazała się synteza peptydu o konformacji pętli, według modelu występującego w cząsteczce białka OmpC, jako epitopu do koniugacji z nośnikiem. Nieoczywistym jest, że peptyd RYDERY wymaga do utworzenia aktywnego epitopu przyjęcia właściwej konformacji, w postaci pętli. Taki epitop rozpoznawany przez przeciwciała pępowinowe formuje się w otoczeniu hydrofobowym, jakie zapewnia polietylen czy nośniki TT, BSA, lecz nie nośnik polilizynowy.
Dobór właściwego nośnika okazał się niezwykle ważny, pozwolił bowiem na wzbudzenie swoistej odpowiedzi skierowanej przeciwko rzeczonemu epitopowi, bez użycia adiuwantu. Wcześniejsze eksperymenty pokazały, że peptyd syntezowany na nośniku polilizynowym nie wykazywał tak dobrych właściwości immunogennych, jak peptyd koniugowany z hydrofobowymi nośnikami TT i BSA, umożliwiającymi syntezę koniugatu z peptydem o konformacji pętli.
Przygotowane koniugaty według wynalazku wykazywały w ten sposób immunogenność, objawiająca się indukowaniem wysokiego miana wysoce swoistych immunoglobulin, rozpoznających antygen peptydowy.
Proponowane rozwiązanie dostarcza więc skuteczną i bezpieczną szczepionkę opartą o epitop peptydowy związany do nośnika, szczepionkę pozbawioną materiału genetycznego oraz toksyn, stabilną oraz znacznie tańszą w produkcji i przechowywaniu.
Wyizolowany epitop, nie tylko bez komórki, ale też bez całej reszty wyjściowego białka stanowi aktywny fragment, element niezbędny do konstrukcji szczepionki, pozbawionej całego balastu wysokocząsieczkowego. Sposób przygotowania odchodzi od tradycyjnych metod uzyskiwania szczepionek atenuowanych lub wykorzystujących całe bakterie, czy całe antygeny białkowe.
Syntetyczna szczepionka peptydowa zawierająca rzeczony epitop reprezentuje sekwencje antygenów białkowych, wykazujących szczególną aktywność antygenową i immunogenną, natomiast skoniugowanie epitopu peptydowego z większymi nośnikami, poprawia ich ekspozycję wobec komórek układu odpornościowego.
Szczepionki podjednostkowe, do których zaliczana jest szczepionka peptydowa według wynalazku jest bezpieczna i nie niesie ryzyka zakażenia poszczepiennego. Ponadto szczepionka taka jest stosunkowo tania w produkcji, a także wykorzystuje technologie nieobarczone ryzykiem zakażenia wirulentnym szczepem. Szczepionka według wynalazku jest pozbawiona składników wywołujących dodatkowy odczyn zapalny oraz nadmierną reaktogenność preparatu, takich jak LPS czy toksyny.
Niewątpliwą zaletą stosowania antygenów peptydowych jest posługiwanie się składnikiem dobrze zdefiniowanym i wystandaryzowanym, o strukturze charakterystycznej dla natywnego antygenu białkowego. Szczepionka według wynalazku może być bardzo łatwo i w sposób kontrolowany modyfikowana na drodze chemicznej, co może mieć kluczowe znaczenie, by zapobiec wystąpieniu alergii lub wzbudzeniu odpowiedzi autoimmunologicznej skierowanej przeciw własnym tkankom.
Zastosowanie koniugatu do immunizacji umożliwia zastąpienie szczepionki klasycznej opartej na użyciu termicznie unieczynnionych bakterii, szczepionką opartą na syntetycznych fragmentach reprezentujących główny antygen powierzchniowy komórek bakteryjnych wyizolowany z białka OmpC. W odróżnieniu od szczepionki klasycznej, syntetyczna szczepionka jest bezpieczna, efektywna, tania
PL 235 826 B1 i może być produkowana na dużą skalę. Szczepionka zastąpi wszystkie dotychczasowe szczepionki przeciwko zakażeniom Shigella i innych patogennych enterobakterii.
Koniugaty złożone z nośników i immobilizowanych na nich peptydów według wynalazku mogą być następnie wykorzystane do przygotowania żelu powinowactwa do izolacji przeciwciał ochronnych z krwi/surowicy dawców. Uzyskane w ten sposób przeciwciała mogą być wykorzystane do wytwarzania krwiopochodnych, immunoglobulinowych preparatów terapeutycznych specyficznych wobec enterobakterii.
Nośniki zawierające immobilizowane na nich peptydy według wynalazku mogą być również wykorzystane do diagnostyki swoistych niedoborów odporności humoralnej. Dzięki swojej specyficzności, testy diagnostyczne zawierające peptydy według wynalazku nadają się szczególnie do oznaczania poziomu przeciwciał specyficznych wobec ważnych patogenów przewodu pokarmowego, które posiadają istotne znaczenie zwłaszcza w pediatrii.
Opis figur
Fig 1. A. Obraz elektroforetyczny (SDS-PAGE) monomeru toksoidu tężcowego (5 μg) oraz koniugatów RYDERYIGC:TT (5 pg) i GLNRYDERYIGC:TT (5 pg); B. Obraz elektroforetyczny (SDS-PAGE) BSA (2 pg) oraz koniugatów RYDERYIGC:BSA (2 pg) i GLNRYDERYIGC:BSA (2 pg).
Fig. 2. A. Widmo MALDI-TOF-MS monomer u TT oraz koniugatów RYDERYIGC:TT i GLNRYDERYIGC:TT, B. Widmo MALDI-TOF-MS BSA oraz koniugatów RYDERYIGC:BSA i GLNRYDERYIGC:BSA.
Fig. 3. A. Reaktywność absorbowanej przez TT surowicy krwi pępowinowej z białkiem OmpC, TT oraz koniugatami GLNRYDERYIGC:TT i RYDERYIGC:TT. B. Reaktywność surowicy nieabsorbowanej krwi pępowinowej z białkiem OmpC, BSA oraz koniugatami GLNRYDERYIGOBSA i RYDERYIGC:BSA.
Fig. 4. Miano przeciwciał anty-OmpC klasy IgG w surowicy mysiej po I, II, III i IV immunizacji zwierząt koniugatami GLNRYDERYIGC:TT oraz RYDERYIGC:TT, białkiem TT oraz PBS.
Fig.5. A. Poziom przeciwciał IgG w surowicy mysiej* po 4 immunizacjach odpowiednimi antygenami w teście z OmpC. B. Poziom przeciwciał IgG w surowicy mysiej po immunizacji koniugatami peptydu GLNRYDERYIGC z TT/BSA w teście peptydem RYDERY zsyntetyzowanym na 15 identycznych pinach polietylenowych.
Wprowadzone na Fig. 5 oznakowanie grup to odpowiednio:
(Gr.1 na rycinie G1) - po 4-krotnej immunizacji koniugatem GLNRYDERYIGC:TT (Gr.2 na rycinie G2) - po 4-krotnej immunizacji koniugatem GLNRYDERYIGC:BSA (Gr.3 na rycinie G3) - po 2-krotnej immunizacji koniugatem GLNRYDERYIGC:TT i po 2krotnej immunizacji koniugatem GLNRYDERYIGC:BSA (Gr.4 na rycinie G4) po 4-krotnej immunizacji białkiem nośnikowym TT (Gr.5 na rycinie G5) po 4-krotncj immunizacji białkiem nośnikowym BSA (Gr.6 na rycinie G6) po 4-krotnej immunizacji PBS
Fig. 6. Wyniki testu ELISA obrazujące siłę wiązania poszczególnych peptydów po cyklizacji z przeciwciałami ludzkiej krwi pępowinowej.
Fig. 7. Immunizacja myszy koniugatem GLNRYDERYIG-poly-Lys oraz immunizacja myszy koniugatem GLNRYDERYIGC:TT w adiuwancie MPL oraz bez zastosowania dodatkowego adiuwantu.
Przedmiotowy wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania nie ograniczających jego zakresu ochrony.
P r z y k ł a d 1 Koniugacja peptydu z białkiem nośnikowym.
Etap 1. Bromoacetylacja białka. Celem zabezpieczenia przed dimeryzacją peptydy zawierające Cys przed koniugacją do nośnika białkowego, rozpuszczano w metylofosfinie (ok. 10-krołny nadmiar metylofosfiny w stosunku do ilości peptydu) i suszono peptyd pod argonem, szczelnie zamykając fiolkę. Wolne grupy aminowe w białku nośnikowym przed koniugacją bromoacetylowano w 0,1 M buforze węglanowym o pH 8,3 przy pomocy estru N-hydroksybursztynianowego kwasu bromoacetylowego w stężeniu 1 mg estru na 1 mg białka (utrzymując stężenie białka c = 2 mg/ml) przez 3 godz. w temperaturze pokojowej na mieszadle rotacyjnym. Podczas bromoacetylacji utrzymywano stałe pH w granicach 8,3 przy pomocy 0,1 M NaOH. Po reakcji mieszaninę dializowano do 0,1 M dwuwęglanu sodu o pH 8,3 i usuwano ester na kolumnie PD-10. Bromoacetylowane białko zagęszczano na membranie do stężenia 10-20 mg/ml. Stopień bromoacetylacji określano oznaczając wolne grupy aminowe przed i po bromoacetylacji przy pomocy TNBS (kwas 2,4,6-trinitrobenzen sulfonowy).
PL 235 826 B1
Etap 2. Koniugacja. Peptydy do koniugacji zawierające grupy tiolowc zawieszano w 0,1 M buforze węglanowym z 2 mM EDTA o pH 8,3 w stężeniu 10-50 mg/ml. Do roztworu peptydu w ciągu 1 min dodawano bromoacetylowane białko, pH doprowadzano za pomocą 0,1 M NaOH do wartości 8,5. Stosunek peptydu do białka zawierał się między 50 a 100 mol/mol. Stężenie białka utrzymywano w granicach 2 mg/ml, dostosowywano natomiast stężenie peptydu. Reakcję koniugacji prowadzono przez noc, ok. 16 godz. w temperaturze pokojowej na mieszadle rotacyjnym w szczelnie zamkniętym naczyniu pod argonem.
Etap 3. Dezaktywacja nieprzereagowanych grup bromoacetylowych białka nośnikowego. Dezaktywację prowadzono stosując 10 μl 2-merkaptoetanolu na 1 ml mieszaniny reakcyjnej przez 1 godz. w temperaturze pokojowej.
Etap 4. Analiza koniugatu. Proces koniugacji monitorowano w 6% (koniugaty z TT) lub 12,5% (koniugaty z BSA) żelu poliakrylamidowym w SDS-PAGE (Fig. 1). Procentowość żelu poliakrylamidowego uzależniono od masy cząsteczkowej białka nośnikowego. Stopień obsadzenia cząsteczki białka peptydami mierzono z wykorzystaniem MALDI-TOF-MS (Fig. 2).
P r z y k ł a d 2 Reaktywność koniugatów peptydowych z przeciwciałami ludzkiej krwi pępowinowej, oznaczana techniką dot-blot.
Membranę Immobilon P zwilżano nanosząc punktowo po 2 μl metanolu. Następnie na zwilżone miejsca nanoszono roztwory antygenów (koniugatów peptydowych, białek nośnikowych - kontrola negatywna, białka OmpC - kontrola pozytywna) w odpowiednim stężeniu i pozostawiano je do całkowitego wyschnięcia. Wolne miejsca na membranie blokowano w 10 ml 1% roztworu BSA w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie membranę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w 5 ml roztworu przeciwciał/surowicy w odpowiednim rozcieńczeniu w buforze TBS-T z 1% BSA i płukano 3-krotnie w buforze TBS-T. Na kolejnym etapie procedury membranę inkubowano w roztworze przeciwciał drugorzedowych skoniugowanych z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:10 000 · i płukano 3-krotnie w buforze TBS-T. Następnie membranę umieszczano w roztworze substratu, zawierającym 5 ml buforu do fosfatazy alkalicznej, 15% BCPI, 30% NBT. Reakcję przerywano przez zanurzenie membrany w wodzie.
P r z y k ł a d 3 Oznaczenie immunogenności koniugatów peptydowych na modelu mysim.
Sześciotygodniowe myszy BALB/c w grupach po 6 sztuk każda immunizowano dootrzewnowo antygenami. Antygeny (10 μg) podawano 4-krotnie w 200 μl PBS lub w buforze PBS w odstępach 7-dniowych, zgodnie ze schematem:
Gr.1 - 4-krotna immunizacja koniugatem GLNRYDERYIGC:TT
Gr.2 - 4-krotna immunizacja koniugatem GLNRYDERYIGC:BS A
Gr.3 - 2-krotna immunizacja koniugatem GLNRYDERYIGC:TT i 2-krotna immunizacja koniugatem GLNRYDERYIGC:BSA
Gr.4 - 4-krotna immunizacja białkiem nośnikowym TT (grupa kontrolna)
Gr.5 - 4-krotna immunizacja białkiem nośnikowym BSA (grupa kontrolna)
Gr.6 - 4-krotne podanie PBS (grupa kontrolna)
Stopień wzbudzanej odpowiedzi immunologicznej określano po 4-krotnej immunizacji zwierząt, oznaczając przeciwciała klasy IgG w teście ELISA wobec białka OmpC (Fig. 5a) oraz w teście ELISA na pinach polietylenowych przeciwko epitopowi RYDERY (Fig. 5b). Przygotowano i przetestowano koniugaty oparte na białkach nośnikowych. W tym celu przeprowadzono koniugację peptydów GLNRYDERYIGC oraz RYDERYIGC z białkami toksoid tężcowy (M = 158,5 kDa) i BSA (M = 66,97 kDa), oraz OVA i DT. Wszystkie koniugaty wykazywały właściwości antygenowe, co potwierdziło ich oddziaływanie z przeciwciałami pępowinowymi. Badane na modelu mysim okazały się immunogenami, w szczególności koniugaty zawierające sekwencję przedłużonego epitopu: GLNRYDERYIGC. Peptyd o sekwencji epitopu RYDERY, w szczególności dłuższa wersja GLNRYDERYIG, która ma lepsze właściwości immunogenne, może służyć jako antygen w konstrukcji szczepionki koniugatowej. Potwierdziły to m.in. eksperymenty dotyczące określenia wzrostu poziomu swoistych przeciwciał anty-RYDERY po immunizacji myszy koniugatami GLNRYDERYIGC:TT/BSA. Zastosowanie koniugatów TT skutkowało podniesieniem miana przeciwciał anty-OmpC po immunizacji koniugatem GLNRYDERYIGC:TT. Mniej immunogenny był koniugat zawierający krótszy peptyd RYDERYIGC:TT a peptyd RYDERY bez aminokwasów flankujących, mimo właściwości antygenowych, jest słabszym immunogenem. Do immunizacji nie zastosowano adiuwantów, co oznacza, że wzbudzana odpowiedź jest wysoce specyficzna i skierowana wobec cząsteczki epitopu w koniugacie. Surowice po immunizacji koniugatami zawierały też przeciwciała wobec nośnika (Fig 5a i Fig 5b).
PL 235 826 B1
P r z y k ł a d 4 Badanie struktury przestrzennej cyklicznych peptydów metodami in silico.
Analizę konformacji peptydów zbadano z wykorzystaniem modelu ich struktury z wykorzystaniem metod in silico. W tym celu, z wykorzystaniem serwisu pep-fold (http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/PEP-FOLD/) wygenerowano szereg modeli peptydów zawierających motyw RYDERY. Przy wyborze najlepszego modelu posłużono się wartością sOPEP (Optimized Potential for Efficient structure Prediction) jako kluczową wartością wskazującą na model jak najbardziej natywny lub bliski natywnemu, stanowiący strukturę przestrzenną peptydu. Z tego względu w badaniach in silico, konformacje epitopów w roztworach wodnych zostały wyznaczone tylko na podstawie obliczeń uzyskanych dla modeli peptydów z najniższą energią sOPEP. Analizę konformacji uzyskanych modeli przeprowadzono w programie Chimera.
P r z y k ł a d 5 Cyklizacja peptydów zsyntezowanych na pinach polietylenowych oraz badanie antygenowości z przeciwciałami ludzkiej krwi pępowinowej.
Syntezę prowadzono rotacyjnie usuwając z aminokwasu blokujące grupy Fmoc i sprzęgając je z kolejnymi aminokwasami. Odblokowanie grupy Fmoc przeprowadzano pod wyciągiem w 20% roztworze piperydyny w DMF (dimetyloformamid) przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Następnie piny płukano w DMF, potem w metanolu i suszono pod wyciągiem. Aminoacylację prowadzono przez 4 godz. lub przez noc w temperaturze pokojowej umieszczając piny w 100 pl roztworu 60 mM pochodnej Fmoc aminokwasu z 65 mM HoAt (1-hydroksy-7-azabenzotriazol) i 60 mM DIC (diizopropylokarbodiimid) w DMF oraz używając 50 pM błękitu bromofenolowego, jako wskaźnika zakończenia reakcji acylacji. Po zakończonej syntezie wszystkie peptydy poddawano N-acetylacji za pomocą roztworu acetylującego zawierającego 3% bezwodnik kwasu octowego i 0,5% DIEA (N,N-diizopropyloetylamina) w DMF przez 90 min w temperaturze pokojowej. Następnie piny płukano w metanolu i suszono na powietrzu. Usunięcie grup blokujących łańcuchy boczne aminokwasów użytych do syntezy przeprowadzano przez zanurzenie pinów w roztworze odblokowującym, zawierającym 5% anizol i 2,5% 1,2-ditioctan w stężonym kwasie trifluorooctowym (TFA). Następnie piny płukano w metanolu, następnie w roztworze 0,5% kwasu octowego w 50% metanolu oraz dwukrotnie w metanolu i suszono. Przed poddaniem peptydów zsyntetyzowanych na pinach polietylenowych procesowi cyklizacji oraz testom biochemicznym, piny zanurzano w roztworze denaturującym, umożliwiającym dokładne rozdzielenie poszczególnych peptydów oraz ich właściwą ekspozycję. W tym celu sonikator wypełniano ogrzanym do 55-65°C 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,2), zawierającym 1% SDS. Bloczki polietylenowe z pinami układano na powierzchni buforu tak, aby były skierowane do dołu oraz sonikowano przez 10 min (7kW/25kHz). Następnie piny płukano w H2O w 60°C oraz poddano procesowi cykłizacji. Cyklizację przeprowadzono utleniając grupy -SH łańcuchów bocznych Cys za pomocą 0,05% roztworu K3Fe(CN)6 w 40% acetonitrylu w 100 mM buforze NH4HCO3 przez 4 godz. w temp. pokojowej.
Peptydy zsyntetyzowane na pinach polietylenowych poddano testom aktywności biologicznej w oddziaływaniach z przeciwciałami ludzkiej krwi pępowinowej. W tym celu piny zrównoważono w buforze TBS-T, wolne miejsca blokowano przy użyciu 200 pl 1% roztworu BSA w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie piny inkubowano w 100 pl zmieszanych 9 próbek surowicy pępowinowej (1H-9H) w rozcieńczeniu 500-krotnym w roztworze 1% BSA w TBS-T. Piny płukano 3-krotnie po 5 min w 10 ml buforu TBS-T i inkubowano z 100 pl przeciwciał Il-rzędowych anty-ludzkie IgG koniugowane z fosfatazą alkaliczną (Sigma) w rozcieńczeniu 1:10000 przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Piny płukano 3-krotnie po 5 min w 10 ml buforu TBS-T i umieszczano je na 30 min w 200 pl substratu AP Yellow (pNPP; p-nitrofcnylofosforan)/pin w temperaturze pokojowej. Reakcję barwną przerywano przez usunięcie polietylenowych pinów z roztworu substratu. Absorbancję odczytywano przy λ = 405 nm. Po zakończonym teście białka/przeciwciała dysocjowano od peptydów zsyntetyzowanych na pinach w buforze do denaturacji w 55-65°C (0,1 M bufor fosforanowy o pH 7,2 zawierający 1% SDS) przez 10 min przy użyciu ultradźwięków (7kW/25kHz). Następnie piny płukano w wodzie w 60°C, suszono i przechowywano nad żywicą osuszającą. Wyniki ELISA przedstawiono na Fig. 6.
P r z y k ł a d 6 Porównanie na modelu mysim immunogenności oraz potencjału diagnostycznego koniugatów peptydowych z poli-lizyną oraz toksoidem tężcowym.
Myszy immunizowano 4-krotnie dawkami 10 pg antygenu. Podczas immunizacji antygenami peptydowymi syntezowanymi na nośniku poli-Lys zastosowano adiuwant MPL ze względy na niską immunogenność. Okazało się wtedy, że sam adiuwant nieswoiście podnosi miano przeciwciał wobec podanego antygenu, zwłaszcza koniugatu peptydowego. Dlatego immunizację koniugatami na nośniku toksoidu tężcowego (TT) przeprowadzono bez zastosowania adiuwantu, gdyż sam adiuwant
PL 235 826 B1
MPL podnosił miano badanych przeciwciał. Aktywność surowic mysich po 4-krotnej immunizacji sprawdzano względem antygenu białkowego (OmpC) w standardowym teście ELISA oraz peptydowego (RYDERY) z wykorzystaniem testu ELISA na pinach polietylenowych (Fig. 7). Myszy immunizowano koniugatem GLNRYDERYlG-poly-Lys w adiuwancie MPL. Wykazano indukcję przeciwciał IgG wobec białka OmpC oraz peptydu RYDERY-pin, przy czym poziom przeciwciał wobec białka był wyższy niż wysoce swoistych przeciwciał wobec peptydu RYDERY. Poziom przeciwciał po immunizacji antygenem GLNRYDERYlG-polyLys w adiuwancie MPL był porównywalny z poziomem po podaniu samego MPL. W przypadku immunizacji koniugatem GLNRYDERYIGC:TT bez adiuwantu uzyskano lepszą indukcję przeciwciał o wysokiej swoistości wobec peptydu RYDERY-pin niż w przypadku reaktywności z całym antygenem białkowym. Poziom swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko peptydowi RYDERY-pin był wyższy po immunizacji koniugatem GLNRYDERYIGC:TT niż po immunizacji samym białkiem TT. Miano przeciwciał wobec białka OmpC podniosło się też po immunizacji samym białkiem nośnikowym, co może świadczyć o indukcji dodatkowych przeciwciał krzyżowo reagujących z białkiem OmpC, niekoniecznie korzystnych. Najlepszą korzystną odpowiedź uzyskano po immunizacji peptydem w koniugacie z TT bez adiuwantu.
Przetestowane dotychczas nośniki szczepionki pokazują, że peptyd stanowiący sekwencję epitopu wykazuje właściwości wzbudzania odpowiedzi immunologicznej manifestującej się sekrecją swoistych przeciwciał.
Istotnym jest, że immunizacje na modelach zwierzęcych prowadzono bez zastosowania adiuwantów, aby wykluczyć nieswoiste podniesienie poziomu tych przeciwciał przez sam adjuwant, co obserwowano w tych badaniach.
Ujawnione koniugaty nadają się do konstrukcji szczepionki do indukcji ochrony przed patogennymi szczepami Enterobacteriaceae, szczególnie gatunkom Shigella. Szczepionka aktywnie chroniąca przed rozwojem zakażeń pokarmowych przeznaczona jest dla ludzi zamieszkujących kraje o niskim standardzie życia i higieny sanitarnej. Szczepionka nadaje się również do stosowania dla personelu medycznego, żołnierzy, turystów, w szczególności ludzi posiadających defekt w niedoborach humoralnych odporności, także dla ludzi a zwłaszcza dzieci z humoralnymi niedoborami odporności.

Claims (19)

1. Koniugat złożony z nośnika o charakterze hydrofobowym i antygenu peptydowego będącego epitopem białka OmpC, o sekwencji aminokwasowej A1-A2-A3-A4-A5-A6, gdzie:
A1 oznacza R,
A2 oznacza Y,
A3 oznacza D, R, E, N lub Q,
A4 oznacza E, D, N lub Q,
A5 oznacza R,
A6 oznacza Y, G lub F, a nośnik stanowi polietylen lub nośnik białkowy wybrany z grupy obejmującej toksoid tężcowy, toksoid dyfterytowy, albuminę surowicy wołowej.
2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen peptydowy wybrany jest z grupy obejmującej peptydy o sekwencji aminokwasowej: RYDERY, RYDDRY, RYEERY, RYQERY lub RYDQRY i GLNRYDERYIGC oraz cykliczne CGGGRYDERYGGGCGG, CGGRYDERYGGCGG, CGRYDERYGCGG.
3. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen peptydowy posiada sekwencję RYDERYIGC.
4. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen peptydowy posiada sekwencję GLNRYDERYIGC, CGGGRYDERYGGGCGG, CGGRYDERYGGCGG, lub CGRYDERYGCGG.
5. Koniugat według zastrz. 1 znamienny tym, że antygen peptydowy posiada konformację pętli.
6. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat jak określono w jednym z zastrz. 1-5 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
7. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera koniugat jak określono w jednym z zastrz. 1-5, dopuszczalny farmaceutycznie nośnik oraz opcjonalnie adjuwant.
PL 235 826 B1
8. Szczepionka według zastrz. 7, znamienna tym, że indukuje produkcję przeciwciał skierowanych przeciwko pałeczkom jelitowym z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakteriom z rodzaju Shigella.
9. Szczepionka zawierająca koniugat jak określono w jednym z zastrz. 1-5, dopuszczalny farmaceutycznie nośnik oraz opcjonalnie adjuwant do zapobiegania i leczenia chorób wywołanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterie z rodzaju Shigella.
10. Sposób otrzymywania koniugatu jak określono w zastrz. 1-5, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
a) zabezpieczenie grup tioiowych białka nośnikowego w drodze bromoacetylacji;
b) koniugację peptydu z nośnikiem białkowym;
c) dezaktywację nieprzereagowanych grup bromoacetylowych białka nośnikowego.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, bromoacetylację białka nośnikowego przeprowadza się buforze węglanowym o pH 8,3 przy pomocy estru N-hydroksybursztynianowego kwasu bromoacetylowego, korzystnie w stężeniu 1 mg estru na 1 mg białka, utrzymując stężenie białka c = 2 mg/ml.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, po bromoacetylacji mieszaninę reakcyjną dializuje się do 0,1 M dwuwęglanu sodu o pH 8,3 i usuwa się ester na kolumnie.
13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że peptydy zawierające grupy tiolowe do koniugacji zawiesza się w 0.1 M buforze węglanowym z 2 mM EDTA o pH 8,3, następnie do roztworu peptydu dodaje się bromoaceiylowane białko, po czym pH doprowadza się za pomocą 0,1 M NaOH do wartości 8,5.
14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że dezaktywację prowadzi się stosując 10 μl 2-merkaptoetanolu na 1 ml mieszaniny reakcyjnej podczas inkubacji przez 1 h w temperaturze pokojowej.
15. Koniugat określony w zastrz. 1-5 do zastosowania jako szczepionka przeciwko Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakteriom rodzaju Shigella.
16. Zastosowanie koniugatu określonego w zastrz. 1-5 do wytwarzania testu diagnostycznego do wykrywania Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.
17. Zastosowanie koniugatu określonego w zastrz. 1-5 do wytwarzania krwiopochodnych, immunogłobulinowych preparatów terapeutycznych specyficznych wobec Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.
18. Zastosowanie koniugatu określonego w zastrz. 1-5 do izolacji przeciwciał do biernej immunizacji w terapii zakażeń wywołanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae.
19. Zastosowanie koniugatu według zastrz. 18, znamienne tym, że zakażenia wywołane są przez bakterie z rodzaju Shigella.
PL408955A 2014-07-22 2014-07-22 Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae PL235826B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL408955A PL235826B1 (pl) 2014-07-22 2014-07-22 Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae
PCT/IB2015/055537 WO2016012951A1 (en) 2014-07-22 2015-07-22 Immunogenic conjugate

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL408955A PL235826B1 (pl) 2014-07-22 2014-07-22 Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL408955A1 PL408955A1 (pl) 2016-02-01
PL235826B1 true PL235826B1 (pl) 2020-11-02

Family

ID=54771161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL408955A PL235826B1 (pl) 2014-07-22 2014-07-22 Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL235826B1 (pl)
WO (1) WO2016012951A1 (pl)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL220297B1 (pl) * 2012-11-07 2015-10-30 Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności& Epitop i jego zastosowanie

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016012951A1 (en) 2016-01-28
PL408955A1 (pl) 2016-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112032B (fi) Menetelmä ureaasipohjaisen rokotteen valmistamiseksi Helicobacter-infektiota vastaan
de Zoete et al. Vaccination of chickens against Campylobacter
Summerton et al. Toward the development of a stable, freeze-dried formulation of Helicobacter pylori killed whole cell vaccine adjuvanted with a novel mutant of Escherichia coli heat-labile toxin
JP2012152228A (ja) 髄膜炎／敗血症に関連する大腸菌由来のタンパク質および核酸
JP2010500399A (ja) 尿路病原性大腸菌由来の免疫原
PL179149B1 (pl) Szczepionka do wywolywania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcje Helicobacter PL PL PL PL
KR0177510B1 (ko) 에스케리키아 콜리 백신
PT2066339E (pt) Composições e métodos de potenciar respostas imunes
JP2013537401A (ja) カンピロバクター感染を減少させるワクチン及び方法
Zeng et al. A totally synthetic lipopeptide-based self-adjuvanting vaccine induces neutralizing antibodies against heat-stable enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli
US9597386B2 (en) Outer membrane proteins of Histophilus somni and methods thereof
US5455032A (en) Use of phosphocholine hapten conjugates in vaccines
Sharma et al. Immune response characterization and vaccine potential of a recombinant chimera comprising B-cell epitope of Aeromonas hydrophila outer membrane protein C and LTB
US20120269842A1 (en) Enterotoxigenic e. coli fusion protein vaccines
Ali et al. Escherichia coli in broiler chickens in Egypt, its virulence traits and vaccination as an intervention strategy
SK280919B6 (sk) Spôsob výroby kompozitnej vakcíny proti črevnej infekcii spôsobenej enterotoxigénnymi baktériami e. coli u ľudí
CA1331445C (en) Vaccine against e. coli septicaemia in poultry
Lasaro et al. Prime-boost vaccine regimen confers protective immunity to human-derived enterotoxigenic Escherichia coli
Padh et al. EpiMix based novel vaccine candidate for Shigella: Evidence of prophylactic immunity in Balb/c Mice
Shin et al. Effective methods for the production of immunoglobulin Y using immunogens of Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida and Actinobacillus pleuropneumoniae
CN111263639B (zh) 用于免疫活性蛋白(iap)生产的名为i-spga的复合免疫原的组分、制备方法和评估
PL235826B1 (pl) Immunogenny koniugat i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae
Jogi et al. Immunoprotection in mice immunized with native OmpH, recombinant OmpH and HS alum precipitated vaccine of Pasteurella multocida P52 against P. multocida challenge
WO2011005587A1 (en) Vaccine compositions and methods of use to protect against infectious disease
Ellis et al. Evaluation of a toxoid for protection of rabbits against enteroxaemia experimentally induced by trypsin-activated supernatant of Clostridium spiroforme