CZ342697A3 - Multimerní rekombinantní ureázová vakcina - Google Patents

Description

Multimerní, rekoinbinantní ureasová vakcína

Oblast -techniky

Tento vynález se týká způsobů a prostředků pro prevenci nebo léčbu Helicobacter infekce.

Dosavadní stav techniky

Helicobacter je rod spirální, gram-negativní bakterie, jenž kolonizuje gastrointestinální trakt savců. Některé druhy kolonizují žaludek, nejvýznamněji H. pylori, H. heilmanii, H. felis a H. mustelae. I když H. pylori je druh nejčastěji spojený s infekcí u lidí, u H. heilmanii nalezeno, že lidi infikují, ale s H. pylori.

Helicobacter infikuje víc než 50 % a H. felis bylo též nižší četností než dospělé populace ve vyspělých zemích a skoro 100 % v rozvojových zemích a v některých zemích na okraji Pacifiku, což jej činí být jednou z nejvíce převládajících infekcí lidstva v celosvětovém měřítku. Infekce H. pylori má za následek chronický žaludeční zánětlivý stav u všech infikovaných subjektů, i když klinická gastroduodendální onemocnění spojená s Helicobacter infekcí se objevují - obecně po několika létech až několika dekádách od původní infekce. H. pylori je kausativní agens chronické povrchové (typ B) gastritidy u lidí. Infekce H. pylori je rovněž spojena s atrofií žaludeční sliznice, žaludečními adenokarcinomy a ne-Hodgkinovým lymfomem žaludku (viz např. Blaser, <7. Infect. Dis. 161:626-633, 1990; Scolnick et al., Infect. Agents Dis. 1:294-309, 1993; Goodwin et al.,

Helicobacter pylori, Biology and Clinical Practice, CRC Press,

Boča Raton, FL, 465 stran, 1993; Northfield et al. .,

Helicobacter pylori, Infection, Kluwe Acad. Pub., Dordrecht,

178 stran, 1994).

• ·

Podstata vynálezu

Ukázali jsme, že vakcinační prostředky obsahující multimerní, rekombinantní ureasu Helicobacter jsou účinné v prevenci a léčbě Helicobacter infekce. Navíc jsme ukázali, že prostředek obsahující ureasu H. pylori a mukosální adjuvans, v kombinaci s antibiotikem a solí vizmutu, je v léčbě infekce Helicobacter účinnější než kterákoli z těchto složek samotných nebo než jakákoli kombinace tří nebo méně těchto složek.

V souladu s tím vynález v prvním ohledu obsahuje vakcínu k vyvolání imunitní odezvy k Helicobacter (např. H. pylori) u pacienta (např. lidského pacienta) u nějž a) je riziko vývoje infekce Helicobacter, ale infekci nemá (ochranná imunitní odezva), b) je již infikován Helicobacter (terapeutická imunitní odezva). Tato vakcína obsahuje multimerní komplexy rekombinantní, enzymaticky neaktivní ureasy Helicobacter (např. H. pylori) a farmaceuticky přijatelný nosič nebo zředovadlo (např. sterilní vodu nebo 2 % [hmotn./obj.] roztok sacharosy). Vakcína může obsahovat multimerní komplex, obsahující osm A podjednotek ureasy a osm B podjednotek ureasy, multimerní komplex, obsahující šest A podjednotek ureasy a šest B podjednotek ureasy, multimerní komplex, obsahující čtyři A podjednotky ureasy a čtyři B podjednotky ureasy, nebo jejich kombinace. Navíc může vakcína obsahovat mukosální adjuvans, jako je termolabilní enterotoxin enterotoxigenní Escherichia coli (LT), choleratoxin (CT), toxin Clostridiuin difficile, nebo jejich podjednotky či deriváty, jimž chybí toxicita, ale mají nadále adjuvanční aktivitu (např. fragment, mutant nebo toxoid), nebo jejich směsi. Například: Lze použít fragment obsahující 794 karboxyterminálních aminokyselin toxinu A Clostridium difficile (viz např. Dove et al. , výše, o sekvenci toxinu A Clostridium difficile). Dále: Multimerní komplexy rekombinantní, enzymaticky neaktivní ureasy Helicobacter • · • · * · • ·

mohou být před použitím vakcíny podle tohoto vynálezu lyofilizovány.

V druhém ohledu vynález obsahuje způsob vyvolání ochranné nebo terapeutické mukosální imunitní odezvy k Helicobacter (např. H. pylori) u pacienta (např. lidského pacienta). U tohoto způsobu se podává prostředek obsahující imunogenně účinné množství multimerního komplexu rekombinantní, enzymaticky neaktivní ureasy Helicobacter (např. H. pylori) na slizničný povrch pacienta (např. orální nebo intraanální povrch), nebo na rektální povrch (např. pomocí análního čípku). Prostředek může obsahovat multimerní komplex, obsahující osm A podjednotek ureasy a osm B podjednotek ureasy, multimerní komplex, obsahující šest A podjednotek ureasy a šest B podjednotek ureasy, multimerní komplex, obsahující čtyři A podjednotky ureasy a čtyři B podjednotky ureasy, nebo jejich kombinace. Prostředek může být podáván bez žaludeční neutralizace (např. pomocí hydrogenuhličitanu sodného).

Navíc k multimernímu komplexu rekombinantní, enzymaticky neaktivní ureasy Helicobacter může prostředek používaný při tomto způsobu dále obsahovat mukosální adjuvans. Například: Prostředek může obsahovat tepelně labilní enterotoxin enterotoxigenní Escherichia coli (LT), choleratoxin (CT), toxin Clostridium difficile, nebo jejich podjednotky či deriváty, jimž chybí toxicita, ale mají nadále adjuvanční aktivitu (např. fragment, mutant nebo toxoid), nebo jejich směsi. Například: Lze použít fragment obsahující 794 karboxyterminálních aminokyselin toxinu A Clostridium difficile (viz např. Dove et al., výše, o sekvenci toxinu A Clostridium difficile). Dále: Multimerní komplexy rekombinantní, enzymaticky neaktivní ureasy Helicobacter v tomto prostředku mohou být lyofilizovány před použitím tímto způsobem.

V třetím ohledu vynález obsahuje prostředek k léčbě infekce k Helicobacter (např. H. pylori) u pacienta (např. lidského pacienta). Tento prostředek obsahuje a) antigen • · • · • · · · • ·

Helicobacter (např. H. pylori), např. ureasu, b) antibiotikum, antisekreční činidlo, sůl vizmutu, nebo jejich kombinace. Příkladem Helicobacter ureasového antigenu, použitelného v tomto prostředku je ureasový antigen, jenž obsahuje multimerní komplex rekombinantní, enzymaticky neaktivní ureasy Helicobacter, jak je popsán shora. Jiné antigeny Helicobacter, jež mohou být použity, zahrnují např. HspA, HspB, AlpA, AlpB, ClpB a antigen rozpoznávaný monoklonální protilátkou IgG 50 (viz níže). Tento prostředek může dále obsahovat mukosální adjuvans (nebo kombinaci mukosálních adjuvans), jako jsou ty, jež jsou uváděny výše.

Antibiotika, jež mohou být zahrnuta do tohoto prostředku zahrnují, ale bez omezení, anoxicillin, klarithromycin, tetracyklin, metronidizol a erythromycin; a soli vizmutu, jež mohou být zahrnuty, jsou např. kyselý citrát vizmutitý a kyselý salicylát vizmutitý. Antisekreční činidla, jež mohou být zahrnuta do daného prostředku, jsou např. inhibitory protonové pumpy (např. omeprazol, lansoprazol a pantoprazol), antagonisté H₂~receptoru (např. ranitidin, cimetidin, famotidin, nizatidin a roxatidin) a analoga prostaglandinů (např. misoprostil nebo enprostil).

V posledním ohledu vynález obsahuje způsob léčby infekce k Helicobacter (např. H. pylori) u pacienta (např. lidského pacienta). U tohoto způsobu se pacientovi podává prostředek obsahující a) antigen Helicobacter (např. H. pylori), např. antigeny uváděné shora, b) antibiotikum, antisekreční činidlo, sůl vizmutu, nebo jejich kombinace. Uplatněn může být jakýkoli standardní způsob podávání nebo kombinace standardních způsobů. Například: Lze použít slizničné podávání (např. podávání na orální nebo intraanální povrch, nebo podávání na rektální povrch, např. pomocí análního čípku). Prostředek, podávaný na slizničný povrch u tohoto způsobu, může dále obsahovat mukosální adjuvans (nebo kombinaci mukosálních adjuvans), jako jsou ty, jež jsou popsány shora. Antibiotika, soli vizmutu a antisekreční činidla, jež mohou být zahrnuty • · • · · · • ·

do daného prostředku používaného u tohoto způsobu, jsou popsány výše.

Vakcínou se míní prostředek obsahující přinejmenším jeden antigen (např. antigen z patogenního mikroorganismu, jako je H. pylori), jenž při podávání pacientovi vyvolává nebo zesiluje imunitní odezvu k antigenu, jež je účinná v prevenci nebo léčbě choroby (např. choroby způsobované infekcí daným mikroorganismem) nebo v léčbě již existující choroby.

Imunogenně účinným množstvím’' se míní množství antigenu (např. multimerního komplex rekombinantní, enzymaticky neaktivní ureasy Helicobacter, nebo kteréhokoli jiného antigenu uváděného shora), jež je účinné pro vyvolání imunitní odezvy (např. humorální nebo mukosální imunitní odezvy, když je podáváno pacientovi, jako je lidský pacient.

Výrazem Helicobacter se míní jakákoli bakterie rodu Helicobacter, obzvláště Helicobacter, jenž infikuje lidi (např. H. pylori). Ureasou se míní enzym (např. ureasa

H. pylori), jenž katalýzuje přeměnu močoviny na hydroxid amonný a kysličník uhličitý.

Multimerním komplexem se míní makromolekulám! komplex polypeptidů (např. ureasových polypeptidů). Polypeptidy mohou být v komplexu asociovány řadou různých intermolekulárních interakcí, jako jsou kovalentní vazby (např. disulfidové vazby), vodíkové vazby a iontové vazby.

Mukosálním adjuvans se míní sloučenina (např.

imunomodulátor), jež nespecificky mukosální imunitní odezvu (např. Podávání mukosálního adjuvans v stimuluje nebo zesiluje tvorbu IgA protilátek). kombinaci s imunogenním prostředkem podporuje indukci mukosální imunitní odezvy na antigen v daném prostředku.

Antibiotikem se míní sloučenina odvozená z plísně nebo bakterie, která inhibuje růst jiných mikroorganismů.

Jiné složky nebo výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a z nároků.

• · • · · · • ·

Příklady provedení vynálezu

Napřed budou popsány obrázky

Obrázky

Obr. 1. je diagram, jenž ukazuje restrikční enzymovou mapu 2,5 kb PCR produktu klonovaného z pSCPl. Čísla nad mapou vyznačují nukleotidovou pozici s použitím prvního páru baží (bp) z BL1 jako nukleotidu č. 1. Ukázána jsou umístění genů ureA a ureB a směr transkripce těchto genů. Umístění štěpících míst restrikčních enzymů jsou ukázána pod danými geny. Čísla vedle názvů restrikčních enzymů ukazují polohu prvního páru baží v rekogniční sekvenci vyznačeného enzymu.

Obr. 2 je diagram genetické mapy plasmidu exprese pORV214. Geny ureA a ureB jsou kázány jako nevyplněné segmenty s šipkami. Tmavá šipka resp. vyplněný sloupec představují sekvence T7 promotoru resp. terminátoru. Tenká čára představuje sekvence DNA pBR322. Fágové a plasmidové počátky replikace jsou ukázány jako velké vyplněné šípky, označené fl počátek resp. ori, a indikují směr syntézy DNA. Geny kódující kanamycinovou resistenci (kan) a laktosový represor (lad) jsou ukázány jako zčásti vyplněné segmenty. Vyznačena jsou BamHI a EcoRT místa použitá pro klonování PCR produktu. Šipky uvnitř segmentů představujících geny lad, ureA, ureB a kan vyznačují směr transkripce.

Obr. 3 je schematickou reprezentací nukleotidové sekvence lokusu H. pylori kódujícího geny ureA a ureB, jakož i transkripčních regulačních sekvencí z pORV214 (SEKV. ID. Č. 1). Nad DNA sekvencí jsou ukázány předpovězené aminokyselinové sekvence ureA (SEKV. ID. Č. 2) ureB (SEKV. ID. Č. 3). Čísla nalevo od sekvence odpovídají nukleotidovým pozicím a čísla napravo vyznačují aminokyselinové pozice. Sekvence odpovídající PCR primerům jsou podtrženy a vyznačena jsou BamHT a EcoRT místa použitá pro klonování PCR produktu. Předpovězené místo transkripční iniciace (G) a směr • · · · · · • · • · · ·· · « · * · • ···· · · · · · · • ·· ··· · ·· ··«« · ···· · · · · «·· - 7 - ............

transkripce jsou vyznačeny šipkou. Vyznačeno je ribosomální vazebné místo (RBS). Sekvence, jež regulují transkripční iniciaci (T7 promotor a lac operátor) a terminace, jsou podtrženy a označeny.

Obr. 4. je graf ukazující analytickou HPLC s velikostním vytěsňováním pro rekombinantní ureasu.

Obr. 5 je série grafů ukazujících počty bakterií proti hladinám protilátek IgA v séru, IgG v séru a IgA ve stolici u myší imunizovaných rekombinantní ureasou H. pylori a choleratoxinem (CT).

Obr. 6. je série grafů ukazujících počty bakterií proti hladinám protilátek IgA v séru, IgG v séru a IgA ve stolici u myší imunizovaných rekombinantní ureasou H. pylori a termolabilním toxinem enterotoxigenní E. coli.

Obr. 7 je tabulka ukazující experimentální protokol použitý pro srovnání intranasální a orální cesty imunizace pro rekombinantní ureasu.

Obr. 8 je série grafů ukazujících hladiny IgG v séru (G v séru), IgA v séru (A v séru, IgA ve stolici (A ve stolici) a IgA ve slinách (A ve slinách) ve skupinách myší podrobených působení podle protokolu znázorněného v Obr. 7.

Obr. 9 je tabulka ukazující experimentální protokol použitý pro srovnání intranasální a intragastrické cesty imunizace pro rekombinantní ureasu.

Obr. 10 je série grafů ukazujících výsledky ureasových testů provedených na myších podrobených působení podle protokolu znázorněného v Obr. 9.

Obr. 11 je graf ukazující, že rekombinantní ureasa (10 μg) podaná intranasální cestou s CT (5 μ9) je v prevenci infekce H. felis přinejmenším stejně účinná jako rekombinantní ureasa (25 μg) podaná orální cestou s CT (10 μg),

Obr. 12 je graf ukazující, že imunizace myší rekombinantní ureasou + 10 μg LT snižuje nebo eradikuje etablovanou infekci H. felis. Když tato zvířata byla reinfikována H. felis, byla chráněna proti tomuto napadení.

• · · · • ···· » · · 9 * · • ·· ··· · ·· · 9 · · · ···· ···· ««·

- 8 - ............

Obr. 13 je graf ukazující střední protilátkovou odezvu myší za 4 týdny a 10 týdnů po terapeutické imunizaci buď rekombinantní ureasou H. pylori a CT, anebo CT samotným.

Obr. 14 je graf ukazující počty buněk secernujících protilátky IgA v žaludeční sliznici imunizovaných a neimunizovaných myší před infekcí H. felis a v určitých intervalech po ní.

Obr. 15 je graf ukazující odeznívání infekce H. felis u myší předem imunizovaných rekombinantní ureasou H. pylori a CT.

Klonování genů ureA a ureB

Strukturální geny kódující ureasu, ureA a ureB, byly klonovány (Clayton et al., Nud. Acids Res. 18:362, 1990; Labigne et al., J. Bacteriol. 173: 1920-1931, 1991) a rekombinantní ureasa kódovaná těmito geny byla purifikována (Hu et al., Infect. Inonun. 60: 2657-2666, 1992). Pro použití v tomto vynálezu byla ureasa klonována z klinického izolátu H. pylori (CPM630), získaného z klinického vzorku poskytnutého Dr. Soadem Tabaqchalim, St. Bartholomew's Medical College, University of London. Byla připravena genomická knihovna kmene CPM630 v lambda fágovém vektoru EMBL3. Plaky byly hodnoceny na reaktivitu s králičí polyklonální protilátkou proti urease Helicobacter, a byly izolovány jediný reaktivní plak. Tento klon obsahoval 17 kb Sáli fragment, jenž kódoval geny ureA a ureB. Tento 17 kb fragment byl subklonován do pUC18 a označen pSCPl. Jeden 2,7 kb Taql fragment byl subklonován (pTCP3) a kompletně sekvenován. Tento 2,7 kb TaqT fragment kódoval jak ureA, tak ureB.

K amplifikaci a klonovaní 2,5 kb fragmentu z pSCPl byly použity primery BL1 (CGG GAT CCA CCT TGA TTG CGT TAT GTC T, SEKV. ID. Č. 4) a BL2 (CGG AAT TCA GGA TTT AAG GAA GCG TTG, SEKV. ID. Č. 5). Primery BL1 a BL2 odpovídají nukleotidům 2605-2624 přístupového čísla M60398 z GenBank (BL1) • ·

- 9 a nukleotidům 2516-2498 přístupového čísla X17079 z EMBL (BL2). Restrikční enzymová mapa 2,5 kb fragmentu PCR produktu je ukázána v Obr. 1. Fragment 2,5 kb obsahuje celou kódující oblast ureA a ureB, jakož i transkripční startovací signály z H. pylori před ureA.

Exprese rekombinantní ureasy

Purifikovaný 2,5 kb PCR fragment obsahující geny, jež kódují ureA a ureB, byl digerován EcoRl a BamHl a zaveden do vektoru exprese pET24+ (Novagen, Madison, Wisconsin) za vytvoření plasmidu pORV214 (Obr. 2). Plasmid pET24+ obsahuje počátek replikace colEl, počátek replikace filamentárního fága (fl) pro vytěžení jednovláknové DNA a gen kanamycinové resistence z Tn903. Fragment byl zaveden pod T7 promotor, jenž poskytne transkripční iniciaci pro ureasové geny. Mezi T7 promotorem a klonovacími místy jsou přítomny sekvence laktosového operátoru (lacO) k zajištění indukovatelné exprese ureasových genů. Transkripční terminátorová sekvence T7 je umístěna za klonovacími místy. Daný vektor obsahuje také gen pro laktosový represor (láci) k zajištění úplné represe exprese. Další sekvence přítomné v daném vektoru jsou odvozeny od pBR322, jenž sloužil jako kostra pro konstrukci vektoru.

Iniciální ligační směs, obsahující 2,5 kb PCR EcoRI-BamHI fragment a pET24+ vektor digerovaný EcoRT a BamHl, byla použita k transformaci XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) připravených CaCl₂ metodou. XLl-Blue je kmen E. coli, jenž neexprimuje T7 RNA polymerasu. Kolonie resistentní ke kanamycinu byly hodnoceny přímo PCR s použitím primerů specifických pro ureasu. Plasmidová DNA z několika pozitivních klonů byla extrahována pomocí kolonek Qiagen Minispin (Qiagen, Chatsworth, CA) a ověřována co do správného restrikčního obrazce.

Purifikovaná DNA pORV214 byla použita k transformaci buněk BL21-DE3 kmene E. coli (Novagen, Madison, Wisconsin) • * · · · · • » * ·· · ♦·* » ····· ·· · * ·* φ ·» & e·· · ·> ♦**·- » ·«·· «··· * * ·

- 10 - .......... ·· připravených CaCl₂ metodou. BL21-DE3 je kmen E. coli B, jenž je lysogenizován lambda fágem DE3, rekombinantním fágem, jenž kóduje T7 RNA polymerasu pod kontrolou lacUV5 promotoru. BL21 je deficientní na Ion a ompT proteasy, jakož i na hsdS-g restrikčně/modifikační systém a dcm methylaci. DNA byla připravena z kanamycin resistentních kolonií pomocí kolonek Qiagen Minispin a hodnocena restrikční enzymovou analýzou s použitím BanHl a EcoRL pro potvrzení přítomnosti daného plasmidu. Exprese ureasy byla zjišřována zkoumáním buněčných lyzátů BL21-DE3 (pORV214) pomocí SDS-PAGE a Western analýzy. Několik pozitivních klonů mělo správný obrazec digesce restrikčními endonukleasami a exprimovalo ureasu.

Byl vybrán jediný klon obsahující pORV214, rozrůstán na LB miskách obsahujících kanamycin (50 pg/ml), sklizen a uschován při -80”C v LB obsahujícím 50 % glycerolu. Banka buněk pro výzkum byla připravena rozrůstáním vzorku z glycerinové konzervy na LB miskách obsahujících kanamycin, vybráním izolované kolonie, a zaočkováním tekuté kultury s LB obsahujícím kanamycin. Tato kultura byla ponechána narůst na ^od600 hodnoty 1,0, stočena a resuspendována ve stejném objemu LB obsahujícím 50 % glycerolu. Z této banky buněk pro výzkum (RCB, research cell bank) byly pak alikvoty (100 μΐ) skladovány při -80C. Referenční banka buněk (MCB, master cell bank) byla připravena podobně s použitím izolované kolonie z banky buněk pro výzkum, a výrobcova pracovní banka buněk (MWCB, manufacturer's cell bank) byla připravena s použitím izolované kolonie z MCB.

Buňky MCB a MWCB byly životaschopné, resistentní ke kanamycinu, a vykazovaly normální morfologii kolonií E. coli. Exprese T7 RNA polymerasy a lambda fágová lysogenicita byly potvrzeny s použitím patřičných testů, jež jsou v oboru dobře známé. Exprese ureasy byla u buněk MCB a MWCB indukovatelná IPTG, jak bylo stanoveno zkoumáním kultur narostlých v přítomnosti IPTG a analýzou lyzátů buněk z těchto kultur na SDS-PAGE. Produkce 60 kD a 29 kD bílkovin (UreB resp. UreA) buňkami MCB a MWCB se zvyšoval s dobou inkubace.

• · • · • · · · • ·

- 11 Z buněk MCB a MWCB byla izolována plasmidové DNA a k potvrzení plasmidové struktury testována restrikční enzymovou analýzou, analýzou polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) a analýzou DNA sekvencí. MCB obsahovala plasmid s patřičným obrazcem digesce restrikčními endonukleasami, bez delecí nebo přestaveb plasmidu. Podobně nebylo rozdílů mezi RFPL otisky prstů plasmidu pSCPl a RFPL otisky prstů plasmidové DNA z MCB a MWCB, což ukazovalo na to, že v ureasových genech nedošlo k detekovatelným (> 50 bp) delecím nebo přestavbám v procesu klonování nebo při přípravě buněčných bank.

Kódující oblasti ureA a ureB a sekvence promotorových a terminátorových oblastí plasmidu izolovaného z MCB buněk byly sekvenovány. Sekvenační reakce byly prováděny s použitím soupravy Di-Deoxy Cycle Sequencing Kit podle návodu výrobce (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) a s použitím fluorescenčně značených dideoxynukleotidů. Sekvence ureA a ureB s předpovězenými bílkovinnými sekvencemi, jakož i DNA sekvence přilehlých oblastí, jsou ukázány v Obr. 3.

Produkce rekombinantní urease ve velkém měřítku

Fermentor(y) byly k použití vyčištěny a sterilizovány schválenými postupy. Kultivační médium obsahovalo 24 g/1 kvasničného extraktu, 12 g/1 tryptonu, 6-15 g/1 glycerolu v RO/DI vodě. Protože pORV214 byl dostatečně stabilní bez přítomnosti antibiotik, nabyla v kulturách fermentací ve velkém měřítku přítomna žádná antibiotika. Bylo přidáno činidlo proti pěnění a jednotka byla sterilizována v sestavě.

Pro produkci ve 40 litrovém fermentoru byla rozmražena ampule MWCB a použita k naočkování čtyřlitrové třepáčkové baňky obsahující jeden litr LB média (1 % trypton, 0,5 % kvasničný extrakt, 1 % NaCl, všechna procenta hmotn./objem) bez antibiotik. Kultura byla třepána při 37 °C po 16 - 24 hodin. Inokulum bylo pak přeneseno do 40 litrového fermentoru • · • ·

- 12 (30 litrů pracovního objemu) obsahujícího produkční médium popsané shora. Fermentace probíhala se vzdušněním a mícháním dokud hustota buněk stanovená OD₆₀₀ nedosáhla přibližně 8-10. Pak byl přidán β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) na konečnou koncentraci 0,1 mM a indukce byla ponechána probíhat po 16 - 24 hodin. Buňky byly sklizeny centrifugací a vlhká pasta byla alikvótována do polypropylenových skladovacích nádobek a uschovávána při -80°C. K produkci v měřítku 400 litrů (300 litrů pracovního objemu) bylo připraveno inókulum a kultura v 40 litrové nádobě jak je popsáno shora. Když se v 40 litrové nádobě dosáhlo Οϋ₆θθ přibližně 5,0, kultura se použila k inokulaci 400 litrového fermentoru. Tato kultura se dále inkubovala na θθβοο hodnotu 8-10. Kultura byla pak indukována, sklizena a uskladněna jak je popsáno shora. Tento postup vyžadoval o 2 - 3 generace více než postup s 40 litry.

Čištěni rekombinantní ureasy H. pylori

Nádobky s buněčnou pastou, vyprodukovanou fermentačním postupem popsaným shora, byly vyňaty z uložení, rozmraženy při pokojové teplotě a resuspendovány v pufru 20 mM fosfát sodný/ 1 mM EDTA, pH 6,8. Resuspendované buňky byly rozbity extruzí úzkým otvorem za tlaku (Microfluidizer Cell Disruptor). Rozbité buňky byly zcentrifugovány při 4’C k usazení buněčného debris a supematant, obsahující rozpustnou ureasu) byl sebrán.

K buněčnému supernatantu byl přidán 3 M chlorid sodný na konečnou koncentraci 0,1 M. Supernatant pak byl nanesen na kolonu DEAE-Sepharose ékvilibrovanou 20 mM fosfátem sodným/ 1 mM EDTA, a proteklý materiál byl sebrán k dalšímu zpracování. K odstranění nízkomolekulárních kontaminant a ke snížení iontové síly byl proteklý materiál diafiltrován do 20 mM fosfátu sodného / 1 mM EDTA, pH 6,8, s membránou o hraniční hodnotě propustnosti 100 kD.

Tento materiál byl nanesen na druhou kolonu DEAE-Sepharose ekvilibrovanou 20 mM fosfátem sodným/ 1 mM EDTA. Proteklý materiál byl vyhozen a kolona promyta 20 mM fosfátem sodným/ 1 mM EDTA, pH 6,8. Navázaný materiál byl eluován přibližně třemi objemy kolony 0,1 M NaCl / 1 mM β-merkaptoethanolu. Účinná eluce navázané ureasy byla řízena objemem a průtokovou rychlostí elučního pufru.

Částečně purifikovaná ureasa byla diafiltrována proti 25 mM Tris-HCl, pH 8,6 a nanesena na kolonu Q-Sepharose. Kolona byla promyta přibližně dvěma objemy stejného pufru a proteklý materiál, obsahující vysoce purifikovanou ureasu byl sebrán. Materiál proteklý v kroku Q-Sepharose byl pak zkoncentrována a diafiltrován v 2 % sacharose ve vodě pro injekce (WFI), pH 7,5.

Charakterizace antigenicity a podiednotkové skladby purifikované rekombinantní ureasy H. pylori

Pro porovnání antigenicity a podjednotkové skladby purifikované rekombinantní ureasy H. pylori s nativní ureasou H. pylori byla vyčištěna nativní ureasa H. pylori a použita jako antigen při produkci polyklonálních anti-ureasových protilátek, jakož i monospecifických polyklonálních anti-UreA, anti-UreB a anti-holoenzymových ureasových protilátek.

Nativní ureasa H. pylori byla purifikována s použitím modifikovaného postupu uváděného Huem a Mobleym (Infect. Immun. 58: 992-998, 1990). H. pylori kmene ATCC 43504 (Američan Type Culture Collection, Rockville, MD) byl ponechán narůst na Muellerově-Hintonově agaru (Difco Laboratories, Detroit, MI) obsahujícím 5 % ovčích červených krvinek (Crane Labs, Syracuse, NY) a antibiotika (5 gg/ml trimethoprim, 10 μg/ml vancomycin a 10 U/ml polymixin B sulfát) (TVP, Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO). Misky byly inkubovány 3-4 dny při 37°C v 7 % C0₂ a 90 % vlhkosti a bakterie byly sklizeny centrifugací. Bakterie byly suspendovány ve vodě nebo 20 mM • · • · · ·

- 14 fosfátu, 1 mM EDTA, 1 mM β-měrkaptoethanolu (pH 6,8) obsahujícím inhibitory proteas, lyžovány sonikací a vyčeřeny centrifugací. Vyčeřený supernatant byl smíchán s 3 M chloridem sodným na konečnou koncentraci 0,15 M a nechán protéci kolonou DEAE-Sepharose (Fast Flow). Aktivní ureasa, jež protekla přes kolonu, byla sebrána, zkoncentrována v centrifugačních filtračních jednotkách Filtron Macrosep 100 a pak nechána protékat kolonou Superose-12 nebo Superdex 200 k vytěsnění podle velikosti. Chromatografie s vytěsňováním podle velikosti se prováděla s použitím předem plněných kolon Pharmacia FPLC. Frakce obsahující ureasu byly spojeny, zkoncentrovány a dále purifikovány FPLC anexovou chromatografií na koloně Mono Q Sepharose předem plněné od fy. Pharmacia. Navázaná ureasa byla eluována s použitím gradientu chloridu sodného. Frakce s ureasovou aktivitou byly spojeny a zkoncentrovány s použitím centrifugačních filtrů Macrosep 100 od Filtron lne. U některých šarží se konečné purifikace dosahovalo analytickou FPLC s vytěsňováním podle velikosti na kolonách Superose-12.

Polyklonální antisérum k urease H. pylori bylo připraveno imunizací tří samic bílých králíků New Zealand purifikovanou nativní ureasou H. pylori. Zvířatům byla předem odebrána krev k potvrzení neimunního stavu, a pak byla imunizována podkožně se 150 μg ureasy v úplném Freundově adjuvans. Dvě booster dávky, každá o 150 pg, byly podány podkožně za 27 a 45 dní s neúplným Freundovým adjuvans. Po potrvzení imunitní odezvy pomocí ELISA a Western analýzy proti purifikované urease byla zvířata exsangvinována. Krev byla ponechána srazit se přes noc při 4°C a sérum bylo získáno centrifugací. Sérové IgG byly purifikovány srážením síranem amonným (50 %) přes noc při 4°C. Precipitát byl resuspendován v PBS a dialyzován k odstranění síranu amonného. Anti-ureasový titr IgG byl u každého zvířete nalezen s hodnotou l:10⁷ a protilátky z těchto tří zvířat byly spojeny. Koncentrace bílkoviny byla stanovena jako 17,3 mg/ml. Byly připraveny alikvoty o 0,2 ml a skladovány při -80°C.

Myší polyklonální ascity proti holoenzymu ureasy H. pylori (MPA3) byly připraveny podkožními injekcemi pěti • · · · • ·

myší s 10 pg nativního holoenzymu ureasy v úplném Freundově adjuvans v den 0. Myši dostaly booster ve dnech 10 a 17, v den 24 jim byla odebrána krev k potvrzení imunitní odpovědi a v den 26 dostaly znovu booster. V den 28 byly myši injikovány intraperitoneálně buňkami Sarcoma 180. Konečná intraperitoneální booster dávka 10 pg ureasy byla dána v den 31, a ascitické tekutiny byly odebrány sedm dní potom.

Ascitické tekutiny byly inkubovány po dvě hodiny při pokojové teplotě a pak při 4°C po 16 hodin; sraženiny byly rozbity intenzivním roztřepáním a odstraněny centrifugací při 10 000 rpm po 10 minut. Po inkubaci přes noc při 4°C v plastových zkumavkách tekutiny vytvořily pevné sraženiny. Ty byly zhomogenizovány, zředěny pět krát s PBS, a znovu vyčeřeny centrifugací při 10 000 rpm po 10 minut. Bylo sebráno 36 ml zředěné ascitické tekutiny a zamrznuto při -20°C v 300 pl alikvotech. Western analýza prokázala, že daná protilátka reaguje s podjednotkami UreA a UreB. V ELISA bylo dosaženo titrací koncového bodu 1:300 000 proti urease.

Myší polyklonální ascity proti UreA H. pylori (MPA4) byly připraveny podkožními injekcemi myší nativní podjednotkou UreA H. pylori ureasy, izolovanou elektroelucí z gelů SDS-PAGE. Následné kroky při přípravě anti-ureA ascitů byly provedeny jak je popsáno shora pro vytvoření protilátek proti holoenzymu.

Myší polyklonální ascity proti UreB H. pylori (MPA6) byly připraveny podkožními injekcemi myší nativní UreB, izolovanou elektroelucí z gelů SDS-PAGE. Následné kroky při přípravě anti-UreB ascitů byly provedeny jak je popsáno shora pro vytvoření protilátek proti holoenzymu.

MAB71 je IgA monoklonální protilátka proti urease H. felis, jež rozpoznává protektivní epitop na B podjednotce. Preparace této protilátky je popsána v Czinn et al., J. Vaccine 11(6): 637-642, 1993, a hybridomová linie, jež ji produkuje, je uložena u ATTC a označena číslem uložení HB 11514. Protilátky popsané shora byly použity v pokusech • · • · · · s Western analýzou rekombinantní ureasy H.

pro charakterizaci purifikované pylori.

SDS-PAGE a Western analýza rekombinantní ureasy ureasa byla napřed analyzována SDS-PAGE probíhající za redukujících podmínek. Zřetelné byly a 60 kD a několik slabších identifikaci bílkovin v těchto provedena Western analýza s použitím protilátek

Rekombinantní (12,5 %) dva hlavni pruhy bílkovin (29 kD pruhů (přibližně 38 kD). K pruzích byla

proti urease	a proti	ureasovým	podjednotkám, popsaných výše.
Bílkovina o	60 kD	reagovala	s	MPA3	(proti	ureasovému
holoenzymu)	a MPA6	(anti-UreB),	ale	ne s	MPA4	(anti-UreA).
Bílkovina o	29 kD	reagovala	s	MPA3	(proti	ureasovému
holoenzymu)	a MPA4	(anti-UreA),	ale	ne s	MPA6	(anti-UreB).
Slabší 38	kD pruh	reagoval	s MPA3	(proti	ureasovému

což ukazovalo na to, že tato holoenzymu) a MPA6 (anti-UreB), bílkovina je částí UreB.

Na SDS-PAGE byly zřetelné molekulové hmotnosti (>150 s protilátkami jak k UreA, malá část podjednotek kovalentní jednotky odolné použitých podmínek. Žádné další barvených gelech nebylo vidět, v purifikovaném produktu tedy deriváty UreA nebo UreB.

Vlhký, Coomassie barvený slabounké pásy kD). Oba pásy slabě tak k UreB, což ukazovalo rekombinantní proteasy k sulfhydrylové bílkovinné pásy na Coomassie Všechny delegované bílkoviny byly bud' UreA, UreB, anebo dva o vysoké reagovaly na to, že vytváří redukci za gel SDS-PAGE byl proměřen s použitím Ultroscan XL laserového densitometru a Gel Scan XL programového software (Pharmacia-LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Densitometrická data byla v souladu s molárním poměrem 1:1 podjednotek UreA:UreB, jak bylo očekáváno podle struktury nativní ureasy H. pylori. UreA a UreB představovaly víc než 95 % z celkové bílkoviny, • · · ·

- 17 přítomné v preparátu purifikované ureasy. Stanovená průměrná hodnota pro sečtené vrcholy UreA + UreB byla 95,2 + 1,2 %.

Analytická HPLC s vytěsňováním podle velikosti pro rekombinantní ureasu

Čistota a molekulární skladba purifikované rekombinantní ureasy byla stanovována analytickou chromátografii HPLC s vytěsňováním podle velikosti. Chromatografie byla prováděna s použitím HPLC systému Beckman Systém Gold, sestávajícího z pumpy 126, diodového plošného detektoru dvojí vlnové délky 168, Systém Gold Software Version V7.ll, kolony Progel-TSK G4000SWXL (5 mm x 30 cm vnitř, prům.) (Beckman Instruments, Brea, California), a SWXL ochranné kolony od Supěl Co. Chromatografie se prováděla za isokratických podmínek s použitím pufru 100 mM fosfát, 100 mM chlorid sodný, pH 7,0. Kolona byla kalibrována s použitím markérů molekulové hmotnosti od Pharmacia LKB.

Typický HPLC separační profil reprezentativního vzorku z většího množství čištěného materiálu je ukázán v Obr. 4. Purifikovaný ureasový produkt vykazuje prominentní bílkovinný vrchol s retenčním časem mezi časy thyroglobulinu (mol. hmotn. 669 kD) a ferritinu (mol. hmotn. 440 kD). Na základě série běhů byla stanovena zdánlivá molekulová hmotnost 550-600 kD. Tento vrchol byl předběžně připsán hexamerní urease. U různých šarží produktu byla plocha příslušná hexamerní urease alespoň 70 % celkové bílkoviny.

Detegován byl též druhý prominentní vrchol s nižším retenčním časem (vyšší molekulovou hmotností). Plocha tohoto vrcholu kolísala v rozmezí 5 - 20 %. Tento vrchol, s molekulovou hmotností >600 byl připsán oktamerní urease. Celková plocha vrcholů oktamerní plus hexamerní ureasy byla přes 90 %.

Tyto dva charakteristické vrcholy byly izolovány pro další charakterizaci, Dané dva vrcholy byly purifikovány HPLC • ♦ • · · ·

z preparátu rekonstituované, lyofilizované ureasy a uskladňovány při 4’C po déle než jeden týden. V průběhu skladování po toto období se zvyšoval obsah oktamerní ureasy, zatímco klesal obsah hexamerní formy. Separované vrcholové frakce byly analyzovány pomocí redukující SDS-PAGE a ELISA reaktivity s monoklonálními a polyklonálními protilátkami k urease. Na SDS-PAGE vykazovaly oba vrcholy ureasové pruhy A a B ve srovnatelných zastoupeních. Navíc oba vykazovaly skoro stejnou imunoreaktivitu v ELISA s polyklonálními protilátkami proti ureasovému holoenzymu (MPA3) a s monoklonální anti-UreB protilátkou (MAB71).

Enzymová aktivita rekombinantní ureasy (v hydrolyze močoviny)

Ke zkoumání enzymové aktivity rekombinantní ureasy se použily tři metody: Na ureasu specifické barvení stříbrem následující po elektroforéze, pH-senzitivní test s močovinovou půdou a fenolovou červení, a přímá detekce amoniaku. Na ureasu specifické barvení stříbrem, popsané deLlanoem et al., (Anal. Biochem. 177: 37-40, 1989) se zakládá na reakci ureasy s močovinou za produkce amoniaku. Tato reakce vede k lokalizovanému zvýšení pH, jež podporuje fotografickou redoxní reakci, jež vede k ukládání kovového stříbra. Enzymová aktivita nativní ureasy H. pylori byla detegována se vzorkem pouhých 1,0 μ9· Naproti tomu 20 μ9 purifikované rekombinantní ureasy nevykazovalo žádnou ureasovou aktivitu.

pH-senzitivní test s půdou s fenolovou červení, jenž je v oboru dobře znám, je založen na změně pH, způsobovanou tvorbou amoniaku jako důsledku hydrolýzy močoviny. Ureasová aktivita byla demonstrována i s tak malou koncentrací purifikované ureasy H. pylori jako je 0,2 μφ/ιηΐ. Naproti tomu nebyla žádná ureasová aktivita spojena s purifikovanou rekombinantní ureasou, dokonce ani při koncentracích do 750 vg/j&l.

• · • · · · • ·

Přímé určení amoniaku produkovaného hydrolýzou močoviny ureasou bylo kvantifikováno s použitím Nesslerova činidla (Koch et al., J. Am. Chem. Society 46: 2066-2069, 1924). Ureasová aktivita nativní ureasy H. pylori byla detekovatelná při koncentraci 1 ^g/ml. Žádná aktivita nebyla detekovatelná v testech obsahujících purifikovanou rekombinantní ureasou až do 500 gg/ml.

Podle výsledku na ureasu specifického barvení stříbrem, pH-senzitivního testu s půdou s fenolovou červení, a přímého stanovení amoniaku není v rekombinantním ureasovém produktu žádná detekovatelná ureasová aktivita.

Ochranná____a____terapeutická____účinnost purif ikované rekombinantní ureasy

K testování účinnosti rekombinantní ureasy H. pylori při prevenci a léčbě infekce Helicobacter byl použit model H. felis-myš. U tohoto model je kolonizace žaludku již etablována a provázena gastrickým zánětem. Tento zvířecí model je dobře zavedeným systémem pro danou studii Helicobacter, a byl široce používán v laboratorním výzkumu patogeneze a léčby chorob vyvolávaných Helicobacter (viz např. Fox et al., Infect. Immun. 61: 2309-2315, 1993; Goodwin et al.,

Helicobacter pylori, Biology and Clinical Practice, CRC Press, Boča Raton, FL, 465 stran, 1993). Antigenní křížová reaktivita mezi ureasami H. pylori a H. felis umožňuje použití kandidátní lidské vakcíny podle vynálezu, rekombinantní ureasy (rUre) H. pylori k imunizaci zvířat infikovaných anebo následně vystavených H. felis.

Infekci H. felis jsou přístupné jak myši bez patogenních zárodků, tak konvenční myši, a vyvíjí se u nich celoživotní infekce žaludečního epithelu, charakterizovaná infiltrací zanětlivých buněk (Fox. et al., výše). Studie s dávkovou odezvou ukázaly, že 100 % Swiss-Webster myší prostých specifických patogenů (SPF) se stalo infikovanými po jediném • · · · · · ··*· • ···· · · · · ·· • ·* ··· · · · ···· · orálním vystavení 10⁴ H. felis. Pokud není uváděno jinak, k infekci myší před terapeutickou imunizací nebo k vystavení myší po profylaktické imunizaci se používala jediná dávka 10 . Vystavení ~10³ násobku infekční dávky (I.D._go) představuje u tohoto Helicobacter přísný test na imunitu.

Testy na žaludeční infekci

Pro detekci Helicobacter v žaludeční tkání se použilo několik metod, včetně měření žaludeční ureasové aktivity, histologického zkoumání a kultivace žaludeční tkáně. Žaludeční ureasová aktivita byla měřena jak kvalitativně (přítomna nebo ne), tak kvantitativně. V kvantitativním testu byly žaludky podélně rozděleny na dvě poloviny od gastroesofagového svěrače k pyloru. Jeden žaludku byl dán podélný kus, představující přibližně 1/4 do 1 ml ureasové půdy (0,1 g kvasničného extraktu,

0,091 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,095 g hydrogenfosforečenanu sodného, 20 g močoviny, a 0,1 g/1 fenolové červeně, pH 6,9). Zřetelná změna zabarvení (způsobená hydrolýzou močoviny enzymem, tvorbou amoniaku a zvýšeným pH) po čtyřech hodinách inkubace za pokojové teploty ukazovala na pozitivní výsledek. Pro kvantitativní stanovení byla ureasová aktivita stanovována měřením absorbance při 550 nm ve vyčeřené ureasové půdě inkubované s řezy celého žaludku po 4 hodiny. Tento test může detegovat až tak nízký obsah jako je 1-2 x 10⁴ H. felis/0,1 g žaludeční tkáně. Tento test poskytuje stejnou citlivost jako komerčně dostupné soupravy na testování ureasy, užívané u humánních vzorků. U komerčních souprav byla prokázána 100 % specifita a 90-92 % citlivost ve srovnání s odběrem tkáně a histologií (Szeto et al., Postgrad. Med. J.

64: 935-936, 1988; Borromeo et al., J. Clin. Pathol. 40: 462-468, 1987).

Kvantitativní testy na žaludeční ureasu spektrofotometrickým měření A₅₅₀ byly poněkud citlivější než vizuální stanovení a umožňovaly určení stupně infekce.

• · • · · · • ·

- 21 Hraniční hodnota pro negativní ureasový test byla definována jako 2 standardní odchylky nad středním ^A55o nevystavených/neinfikovaných myší. Hraniční hodnota pro pozitivní ureasový test byla definována jako 2 standardní odchylky pod středním A₅₅₀ neimunizovaných/vystavených myší. Jednotlivá zvířata s infekcemi nízkého stupně měla itermediární hodnoty mezi negativní a pozitivní hranicí. Vizuálním určením stupně ureasové odpovědi bylo identifikováno 11/12 (92 %) pozitivních vzorků.

Histologické zkoumání bylo prováděno fixací žaludeční tkáně v 10 % formalinu. Tkáň pak byla uzavřena v parafinu, rozřezána a barvena modifikovaným Warthinovým-Starryho stříbrným barvením (Steinerovo barvení; Garvey et al., Histotechnology 8: 15-17, 1985) k vizualizaci H. felis, a hernatoxylínovým a eosinovým barvením k určení zánětlivých odpovědí v dané tkáni. Barvené řezy byly zkoumány zkušeným patologem naslepo, jen s kódy vzorků.

Ke stanovení počtu bakterií a intenzity zánětu byl používán semikvantitativní systém stupňů. Používaný systém je modifikací široce přijímaného Sydneyho sytému pro histologickou charakterizaci gastritidy u lidí (Price, Gastroenterol. Hepatol. 6: 209-222, 1991). Mukosální řezy plné tloušťky byly zkoumány na intenzitu zánětu (vzrůst u lymfocytů, plasmatických buněk a neutrofilů, a přítomnost lymfoidních váčků) a na hloubku infiltrace těchto buněk, a přiřazen stupeň na škále 0-4+. Přiřazení stupně hustoty H. felis se provádělo určením počtu bakteriálních buněk s typickou spirální morfologií v celém podélném řezu gastrického antra (nebo korpusu, pokud se tak uvádí). Stupně byly přiřazovány podle určitého rozsahu pozorovaných bakterií (0 = žádné; 1+ = 1-20 bakterií; 2+ = 21-50 bakterií; 3+ = 51-100 bakterií a 4+ = >100 bakterií).

• · • · · ·

• · · · • ·· • · · · · • · · ·· • · · ··

Cesta imunizace

Vliv cesty podávání na účinnost vakcíny podle vynálezu byl zkoumán na modelu myší infekce. Šest až osm týdnů staré samičky myší Swiss-Webster prosté specifických patogenů (SPF) byly imunizovány s 200 μg rekombinantní ureasy H. pylori, bud s nebo bez 0,24 M NaHCOg . Rekombinantní ureasa byla u všech zvířat podávána spolu s 10 μg choleratoxinu (CT) jako mukosálním adjuvans. Intragastrická (IG) imunizace byla prováděna dodáním antigenu v 0,5 ml anestetizovaným zvířatům přes krmící jehlu velikostní měrky 20. Orální imunizace se prováděla dodáváním antigenu v objemu 50 μΐ špičkou pipety do ústní dutiny neanestetizovaných zvířat. Pro parenterální imunizaci dostaly myši subkutánně 10 μg rekombinantní ureasy. Úplné Freundovo adjuvans bylo použito v první subkutánní imunizaci a neúplné Freundovo adjuvans bylo používáno v následných zesilovacích dávkách. U všech cest podávání byly celkem podány čtyři dávky vakcíny, podávané v sedmidenních intervalech. Myši byly vystaveny 10⁷ H. felis dva týdny po poslední dávce vakcíny a pitvány dva týdny po tomto vystaveni. Žaludeční infekce H. felis byla detegována pomocí ureasové aktivity a histologie. Ochrana jednotlivých myši byla definována negativním ureasovým testem a histologickým bakteriálním nálezem 0 nebo 1+.

Orální a intragastrické podávání rekombinantní ureasy poskytovalo (86-100 %).

významnou ochranu proti vystavení H. felis Orální podávání bylo účinné jak s podáváním

NaHCO₃ společně s rekombinantní ureasou, tak bez podávání NaHCO₃ . Intragastrické podávání bylo účinnější, když se rekombinantní ureasa podávala spolu s NaHCO₃ . Parenterální injekce antigenu vakcíny byly účinné nejméně. Imunizované myši měly významně nižší počty bakterií v žaludeční tkáni po vystavení než neimunizované kontroly. Protilátkové odezvy IgA v séru a sekrece byly nejvyšší u myší imunizovaných orální cestou. IgA protilátky nebyly vyvolány parenterální imunizací.

• · • ·

Tabulka 1

Rekombinantní ureasa H. pylori ochraňuje myši před vystavením H. felis při mukosální, ale ne při parenterální, imunizací

VAKCÍNA	CESTA IMUNIZACE	ADJUVANS	BIKARBONÁT a)	PROCENTO CHRÁNĚNÝCH (POČET CHRÁNÉNÝCH/CELK.)
ureasový test	histologie b)
PBS	orální	CT	ne	0 (0/6)	0 (0/7)
200 qg rUre	orální	CT	ne	100 (8/8)*	100 (7/7)*
200 μg rUre	orální	CT	ano	100 (7/7)*	86 (6/7)*
200 μ9 rUre	intragastrická	CT	ne	75 (6/8)*	38 (3/8)*
200 μ-g rUre	intragastrická	CT	ano	100 (7/7)*	100 (7/7)*
10 μ9 rUre	subkutánní	Freund	-	38 (3/8)*	25 (2/8)*

a) s vakcínou a adjuvans	byl podáván 0,24 hydrogenuhličitan
	sodný
b)	procento	chráněných	(počet	myší	s bakteriální hodnotou
	0 - 1+ /	počet testovaných)
*	p < 0,01,	Fisherův exaktní	test,	srovnání s myšmi, jež
	dostaly	jen CT

• · • « • · * ·

- 24 Vliv imunizační cesty na odezvu anti-ureasových protilátek byl zkoumán na myších. Myši byly imunizovány čtyřikrát v desetidenních intervalech jedním z: 1) 200 pg rekombinantní purifikované ureasy H. pylori s 10 pg (CT), buď s nebo bez 0,24 M NaHCO₃ , orálním podáváním; 2) 200 pg rekombinantní purifikované ureasy H. pylori a 10 pg (CT), s 0,24 M NaHCO₃ , intragastrickým podáváním; 3) 10 pg rekombinantní purifikované ureasy H. pylori s Freundovým adjuvans subkutánním podáváním. Jeden týden po čtvrté dávce vakcíny byly zkoumány protilátkové mukosální a sérové odezvy pomocí ELISA s mikrotitračními destičkami potaženými 0,5 pg nativní ureasy H. pylori. Sérové vzorky byly ředěny 1:100 a testovány na IgA a IgG specifické k urease. Čerstvé fekální bobky, extrahované pufrem s proteasovým inhibitorem (PBS obsahující 5 % netučného sušeného mléka, 0,2 pM AEBSF, 1 pg aprotininu na ml, a 10 pM leupeptin), byly zkoumány na fekální anti-ureasovou IgA protilátku. V některých pokusech byly hodnoty fekálních protilátek normalizovány na celkový obsah

IgA, stanovený ELISA, s fekálními vyjádřenými v každém vzorku jako

IgA. Vzorky slin byly odebrány po

IgA specifickými k urease ^A405 j^notky/mg celkových stimulaci pilokarpinem pod ketaminovou anestezí, a testovány na IgA specifické k urease při ředění 1:5.

Žádné významné rozdíly mezi protilátkovými odezvami myší imunizovaných orálně s nebo bez NaHCO₃ nebyly detegovány a tato data byla pro analýzu spojena. Myši, jež dostaly subkutánní antigen vyvinuly sérové IgG specifické k urease, ale sérové a fekální odezvy IgA byly vyvolány pouze když antigen byl podán mukosální cestou (orálně nebo intragastricky).

Myši imunizované s ureasou a CT buď orálně, anebo intragstricky, byly vystaveny 10⁷ H. felis. Hladiny protilátek před tímto vystavením byly u orálně nebo intragastricky imunizovaných myší korelovány s histologicky stanovenými počty bakterií po vystavení H. felis (Obr. 5). I když odezvy IgA se mezi jednotlivými myšmi závažně lišily, celkově vzato měly • «

- 25 a fekálních IgA snížené IgA v potlačení tomu sérové IgG některé chráněné na roli

Naproti Zatímco myši s vyššími hladinami sérových počty bakterií. Tato data ukazují infekce a ochraně před infekcí, protilátky nekorelovaly s ochranou.

myši neměly žádné detekovatělně IgA protilátky, vysoké hladiny anti-ureasových IgA nebyly pozorovány u vyvinula po vystavení 4+ infekce, podpírají roli mukosálních imunitních také napovídají, že imunitní a sérové IgA hrají určitou roli

Tato data ukazují, že: mukosální imunizace; ne-li více, účinná žaludeční zvířat, u nichž se Tyto výsledky nejen odpovědí v ochraně, ale mediátory jiné než fekální v eradikaci infekce H. felis.

1) k protektivní imunitě je

2) orální cesta imunizace je jako intragastrická cesta;

kyseliny s NaHCO₃ je potřebná pro (ale ne orální) imunizaci;

nestimuluje mukosální imunitu ani neposkytuje účinnou ochranu proti potřebná stejně,

3) neutralizace účinnou intragastrickou

4) parenterální imunizace danému vystavení.

Schéma imunizace

Pro stanovení optimálního časového rozvrhu k vyvolání ochranné mukosální imunitní odezvy byla porovnávána alternativní imunizační schémata. Myši Swiss-Webster byly imunizovány se 100 gg rekombinantní ureasy ve dvou, třech nebo čtyřech orálních podáváních, podle schémat ukázaných v Tabulce 2. S rekombinantní ureasou bylo společně podáváno mukosální adjuvans CT (10 gg). Jak bylo zjištěno kvalitativním testem na žaludeční ureasu, myši, jež obdržely čtyři týdenní dávky antigenu, vykazovaly nejvyšší hladinu ochrany. Významná ochrana byla též pozorována u myší, j imž byly dány tři dávky antigenu ve dnech 0,7 a 21. Sekretorní odezvy IgA protilátek byly nejvyšší u myší, jimž byly dány celkově čtyři dávky rekombinantní ureasy v jednotýdenních intervalech. Na základě protilátkové odezvy a podílu ochrany bylo posledně jmenované schéma vybráno pro další hodnocení terapeutické a protektivní účinnosti dané vakcíny.

• 9 9 9 9 9

9

Tabulka 2

Vliv různých schémat orální imunizace na profylaktickou účinnost ureasové vakcíny

SKUPINA	DÁVKA VAKCÍNY/ IMUNIZACI ^g)a	SCHÉMA (DEN IMUNIZACE)	% CHRÁNĚNÝCH (POČET/CELK.)b
1	25	0, 7, 14, 21	70 (7/10)*
2	50	0, 14	20 (2/10)
3	50	0, 14	30 (3/9)
4	33,3	0, 7, 21	40 (4/10)*
5	50, 25 a 25	0, 7, 21	60 (6/10)*
6	žádná	0, 7, 14, 21	0 (0/10)

^a Myši každé skupiny byly orálně imunizovány s celkovou dávkou 100 μ9 rekombinantní ureasy H. pylori. CT (10 μ9), suspendovaný ve sterilní vodě, se použil v každé imunizaci jako mukosální adjuvans. Skupina 6 obdržela jen CT se stejným schématem jako skupina 1, a sloužila jako kontrola. Skupiny 4 a 5 porovnávaly vliv zesilovacích dávek podávaných po dvou předešlých týdenních imunizacích.

^b Procento chráněných (počet chráněných/celkový počet) před vystavením dávce 10⁷ H. felis, v čase dva týdny po imunizaci. Myši byly usmrceny dva týdny po vystavení a ochrana byla stanovována kvalitativním testem na žaludeční ureasu.

* p <0,05, Fisherův exaktní test, srovnání s myšmi, jež dostaly jen CT

- 27 >· ····

Vliv různých imunizačních schémat na produkci anti-ureasových protilátek byl zkoumán na myších. Byly zkoumány protilátkové odezvy myší imunizovaných jedním z pěti schémat popsaných v Tabulce 2. Významná ochrana byla pozorována u myší, jež obdržely vakcínu v pěti týdenních dávkách nebo ve dvou týdenních dávkách se zesílením v den 21. Myši imunizované jedním z těchto dvou imunizačních schémat měly také nejvyšší průměrné imunitní odezvy. Hladiny IgG v séru a IgA ve slinách byly nejvyšší u myší očkovaných schématem čtyř týdenních dávek.

Vztah dávky a ochrany

Pro určení minimálních a optimálních dávek potřebných k imunizaci a ochraně byly myším orálně podávány stupňované dávky rekombinantní ureasy. Dávky rekombinantní ureasy o 5, 10, 25, 50 a 100 gg byly podávány skupinám o osmi myších orální cestou s 10 gg CT v PBS. Antigen byl dán ve schématu čtyř týdenních dávek. Jak bylo zjištěno podle gastrické ureasy a histologických bakteriálních hodnot, významná ochrana myší proti vystavení H. felis byla pozorována u všech dávek, bez významných rozdílů mezi dávkovanými skupinami (Tabulka 3). Vliv dávky na odezvu byl jasně doložen u sérových a mukosálních protilátkových odpovědí k rekombinantní urease, s nejvyšší imunitní odezvou při 100 gg dávkové hladině.

Tabulka 3

Rekombinantní ureasa H. pylori v dávkách 5 μ9 a vyšších ochraňuje myši před vystavením H.felis

VAKCÍNA	ADJUVANS	CESTA IMUNIZACE	PROCENTO CHRÁNĚNÝCH A (POČET CHRÁNÉNÝCH/CELK.)
ureasový test	histologie
žádná	10 μg CT	orální	0 (0/7)	0 (0/7)
5 μ9 rUre	10 μ9 CT	orální	86 (6/7)*	71 (5/7)*
10 μ9 rUre	10 μg CT	orální	88 (7/8)*	63 (5/8)*
25 μg rUre	10 μ9 CT	orální	100 (9/9)*	100 (9/9)*
50 μ9 rUre	10 μ9 CT	orální	100 (8/8)*	88 (7/8)*
100 μυ rUre	10 μ9 CT	orální	100 (7/7)*	71 (5/7)*

^Ά Procento chráněných (počet myší s 0 - 20 bakteriemi na řez / počet testovaných) jak bylo stanovenou zkoumáním stříbrem barvených řezů žaludku.

Srovnání s naprázdno imunizovanými kontrolami, Fisherův exaktní test, p < 0,02.

Vliv dávkování rekombinantní ureasy na protilátkovou odezvu byl zkoumán na myších. Myši Swiss-Webster byly orálně imunizovány stupňovanými dávkami rekombinantní ureasy (5, 10, 25, 50 nebo 100 ^g) plus 10 μ9 CT jako mukosálního adjuvans. Protilátkové odezvy IgA v séru, stolici a slinách se zvyšovaly s množstvím podané rekombinantní ureasy. Dávka 100 μς rekombinantní ureasy vyvolala nejvyšší hladiny protilátek.

- 29 • · · · • ·

Myši Swiss-Webster byly orálně imunizovány stupňovanými dávkami rekombinantní ureasy (5, 10, 25, 50 nebo 100 μ9) s 25 μ9 termolabilního toxinu enterotoxigenické E. coli (LT) jako mukosálním adjuvans. Jedna skupina myší obdržela pro srovnání 25 μg rekombinantní ureasy a 10 μg CT jako mukosální adjuvans. Myši byly imunizovány orálně 4 krát vždy po 7 dnech. Sérum, stolice a sliny byly brány 10 až 13 dnů po poslední imunizaci a hladiny protilátek specifických k urease byly stanovovány pomocí ELISA. U myší imunizovaných rekombinantní ureasou a LT se vyvinuly sérové a sekretorní protilátky proti urease, s jasným vlivem dávky na odezvu. U těchto zvířat byly pozorovány silné odezvy slinných

Myši imunizované ureasou a 10⁷ H. felis vystaveny ureasou/LT korelovány ;

(Obr. 6).

a zvířata měla vyšší zvířata s vážnější infekcí, žádnou zjistitelnou imunitní mediátory jiné než IgA

H.

imuni zováných s histologicky

Plně chráněná s infekcí nízkého stupně hladiny protilátek ve Několik

IgA protilátek.

LT jak je popsáno shora byly Obr. 4). Protilátkové odezvy před daným vystavením byly (viz myší stanovenými bakteriálními hodnotami zvířata odezvu, protilátky

0)

1+) než (bakteriální hodnota (bakteriální hodnota všech kompartmentech chráněných zvířat nemělo což napovídá, že imunitní hrají určitou roli v eradikaci infekce H. felis.

Schopnost vysokých dávek rekombinantní ureasy vyvolávat mukosální imunitní odezvu byla zkoumána intragastrickým podáváním 1 μg, 200 μg nebo 5 mg bez adjuvans. Jedna skupina myší byla intragastricky imunizována jako kontrola s 200 μg ureasy plus 10 μg CT. Krev, 8 dnů po poslední imunizaci.

H. felis 10 dnů po poslední vystavení. Infekce H. felis aktivity v žaludeční tkáni.

stolice a sliny byly brány 5 až

Zvířata byla pak vystavena 10 imunizaci a usmrcena 14 dnů po byla detegována pomocí ureasové

Vysoké dávky rekombinantní ureasy vyvolávaly sérové IgG specifické k urease, ale vyvolávaly poměrně nízké hladiny mukosálních protilátek, jak se detegují ELISA. Zvířata, jež vykazovala na odezvy IgG, specifických na ureasu, byla plně

susceptibilní k vystavení H. felis, což ukazuje, že sérové IgG nehrají žádnou roli v ochraně.

V souhrnu: Data ze shora uváděných pokusů, jimiž se zkoumaly různé cesty podávání, schémata podávání a mukosální adjuvans, ukazují, že pokud se podává s účinným mukosálním adjuvans, orální nebo intragastrické podávání rekombinantní ureasy v poměrně malých dávkách vyvolává odezvy sekretorních IgA protilátek a odpovědi sérových IgA a IgG. Sekretorní IgA protilátky poskytují ochranu, zatímco sérové IgG odezvy ne. Když se ochrana měří histologickými bakteriálními hodnotami, zvířata s vyššími titry IgA protilátek jsou plně chráněna, nebo mají významně snížené infekce v porovnání s nižšími titry IgA protilátek. U zvířat, jež nevykazovala detekovatelné hladiny IgA protilátek, se vyvíjely po vystavení silné infekce. Protilátkové odezvy byly závislé na dávce a lišily se podle schématu podávání antigenu. Nejvyšší hladiny byly dosahovány při dávkách antigenu 100 - 200 gg. Podávání čtyř dávek v týdenních intervalech poskytovalo optimální schéma pro imunizaci. Další, intranasální, cesta podávání byla zkoumána jak následuje.

Intranasální vakcinace rekombinantní ureasou

Myši Swiss—Webster byly imunizovány bud orálně nebo intranasálně (IN) rekombinantní ureasou nebo formalinem fixovanou ureasou. Množství antigenu a adjuvans, cesta podávání (IN nebo orální) a imunizační schémata jsou ukázány v Obr. 7. Formalinem fixovaná ureasa (Form-ure) byla připravena podle následujícího protokolu:

1) ampule obsahující 1 mg rekombinantní ureasy se rekonstituuje se 150 μΐ RO/DI vody,

2) do ampule se přidá 50 μΐ formalinu (37 % formaldehydu), zředěného 1:1000 v RO/DI vodě (konečná koncentrace ureasy je 5 mg/ml), a

3) ampule se inkubuje při 35°C po 48 hodin.

Odezvy IgG a IgA v séru, IgA ve stolici a IgA ve slinách byly ve skupině IN + CT vyšší než ve skupině orální + CT, i přes to, že pro orální imunizaci se použily vyšší dávky rekombinantní ureasy a adjuvans (Obr. 7 a Tabulka 4). Ochrana byla měřena ureasovým testem, jakož i stanovením bakteriálních hodnot na řezech žaludku usmrcených zvířat. Ve skupině IN byla nalezena stoprocentní ochrana a ve srovnávané orální skupině 80 %, pokud se ochrana určovala ureasovým testem. Sedm z osmi orálně imunizovaných myší bylo pozitivních na baktérie v žaludečních tkáních, zatímco je 1/10 z myší v IN skupině byla pozitivní na baktérie (viz skupiny 3 a 6 v Tabulce 4 a Obr. 8).

V druhém pokusu byly myši imunizovány buď intragastricky (IG) nebo intranasálně s rekombinantní ureasou společně podávanou s LT jako mukosálním adjuvans (k podrobnostem pokusu a k imunizačnímu schématu viz Obr. 9). V tomto pokusu byly odezvy IgG v séru, IgA v séru, a IgA ve slinách ve skupině IN + LT vyšší než ve skupině IG + LT, i přes to, že pro IG imunizaci se použily vyšší dávky antigenu a adjuvans (Obr. 10 a Tabulka 5, skupiny 4 a 8). Myši ve skupině IN + LT byly plně chráněny před vystavením H. felis (10/10 ve srovnání s 3/9 u skupiny bez imunizace), jak bylo stanovenou ureasovým testem (viz skupiny 4 a 5 z Tabulky 5).

• · • · • · • · · ·

- 32 Tabulka 4

Intranasální imunizace rekombinantní ureasou a choleratoxinem

Myš č.	Ureasa/ působení	Cesta/ adjuvans	IgG v séru	IgA v séru	IgA ve stolici	IgA ve slinách	4 hod ureasa	bakt.	pat.
1A1	1<W/ HCHO	IN/ žádn.	3,398	3,318	3,377	3,339	+
1A2			3,119	3,218	0,786	3,249	+
1A3			2,967	2,535	0,893	3,153
1A4			3,064	2,390	1,065	3,311	+
1A5			3,009	2,647	0,617	3,244	+
1B1			2,994	2,068	0,497	3,329	-
1B2			3,099	2,611	0,010	3,235	+
1B3			3,306	1,823	0,323	3,295	+
1B4			3,424	2,931	0,522	3,372	+
1B5			3,175	0,832	0,803	2,439	+
2A1	10μ9	IN/žádn.	3,021	2,562	2,090	3,204	+
2A2			2,971	2,806	1,475	3,304	+
2A3			2,894	1,943	0,584	3,288	+
2A4			2,918	2,804	2,291	3,363	+
2A5			2,926	3,264	0,118	3,418	+
2B1			3,220	3,505	1,634	3,415	+
2B2			3,383	2,708	0,410	3,336	+
2B3			3,092	1,814	0,411	3,253	+
2B4			3,033	3,090	2,672	3,266	+
2B5			3,055	2,076	1,193	3,263	+

• ·

3A1	10pg	IN/CT	2,969	0,405	0.192	1,670	-	0	2
3A2			2,871	0,097	0,154	0,526	-	0	2
3A3			2,984	0,677	0,081	0,473
3A4			3,092	0,563	1,824	3,398	-
3A5			3,335	0,256	1,052	0,587	-	1	2
3B1			3,013	0,148	0,142	0,586	-	0	2
3B2			3,068	0,388	0,867	2,410	-	0	2
3B3			3,008	0,255	0,468	0,778	-	0	2
3B4			2,908	0,985	1,086	1,172	-	0	2
3B5			2,879	0,186	1,904	1,317	-	0	2
4A1	lOOpg/ HCHO	orální/ žádn.	~0,006	0,024	0,021	0,009	+
4A2			0,050	0,097	0,079	0,041	+
4A3			0,001	0,097	0,056	'0,019	+
4A4			3,195	0,598	0,190	2,097	+	0	3
4A5			1,271	0,027	0,034	0,010	+
4B1			0,096	0,045	0,165	0,309	+
4B2			0,021	0,033	0,043	0,059	+
4B3			1,109	0,055	0,080	0,019	+
4B4			0,006	0,022	0,083	0,017	+
4B5			0,013	0,027	0,039	0,010	+

• ·

- 34 • ·

5A1	100μ9/	orální/ žádn.	0,032	0,042	0,151	0,030	+
5A2			0,756	0,077	2,957	0,156	+
5A3			2,362	0,075	0,104	0,262	+
5A4			0,012	0,034	0,146	0,065	+
5A5			0,011	0,035	0,163	0,013	+
5B1			0,012	0,042	0,089	0,017	+
5B2			0,017	0,017	0,076	0,049	+
5B3			1,583	0,058	0,058	0,182	+/-
5B4			0,602	0,030	0,093	0,093	+
5B5			1,672	0,059	0,060	0,093	+
6A1	25μ9/	orální/ CT	0,698	0,267	0,076	0,387	-	1	2
6A2			2,139	0,065	0,089	0,206	-	1	2
6A3			0,006	0,013	0,098	0,011	-	3	2
6A4			2,957	0,354	0,185	2,999	-	1	2
6A5			0,011	0,019	0,042	0,026	-	0	2
6B1			0,000	0,022	0,041	0,005	-	1	2
6B2			0,009	0,002	0,067	0,069	-	2	2
6B3			0,320	0,022	0,041	0,048	+	4	2
6B4			0,010	0,009	0,021	0,023	+	4	2
6B5			2,633	0,090	0,047	0,647	-	1	2

• · · *

7A1	žádná		0,011	0,018	0,074	0,019	+	4	1
7A2			0,007	0,025	0,042	'0,004	+	4	2
7A3			0,000	0,019	0,082	0,018	+	4	2
7A4			0,004	0,028	0,024	0,002	+	4	2
7A5			0,011	0,005	0,041	0,029	X
7B1			0,019	0,004	0,089	0,005	+	4	1
7B2			0,006	0,003	0,009	0,008	+	4	2
7B3			0,006	0,024	0,066	0,167	+	4	2
7B4			0,015	0,018	0,063	0,018	+	4	1
7B5			0,007	0,023	0,111	0,011	+
deštic	5ka 1 koi	itroly
+			2,265	3,280	1,651	3,315
-			0,010	0,040	0,065	0,056
deštic	5ka 2 koj	ítroly
+			1,96.9	3,289	1,700	3,298
-			0,001	0,034	'0,004	0,019

• · β «

Tabulka 5

Intranasální imunizace rekombinantní ureasou a LT

Myš č.	Ureasa působení	IgG v séru	IgA v séru	IgA ve slinách	2 týd.utraceni Absorbance550
1AN	25 pg 5 x IN	3,530	0,350	0,340	0,802
1AL	200 pg 2 x IG	3,263	0,154	1,544	0,768
1AR		3,231	0,630	0,204	0,805
1ALL		3,233	0,318	0,251	0,806
1BN		3,344	0,401	0,112	0,726
1BL		3,322	0,724	2,015	0,168
1BR		3,424	0,225	0,426	0,748
1BLL		3,285	0,591	0,719	0,807
1BRR		3,262	0,141	0,202	0,675
2AN	25 pg 5 x IN	3,164	0,054	0,014	0,814
2AL	200 pg 1 x IG	3,232	0,231	0,747	0,823
2AR		3,236	0,981	0,412	0,695
2ALL		3,303	0,122	0,832	0,813
2BN		3,357	0,690	0,993	0,747
2BL		3,264	1,002	0,840	0,704
2BR		3,284	1,377	0,0934	0,161
2BLL		3,241	0,0458	0,191	0,748
2BRR		3,280	0,129	0,134	0,720

<

• · • · · ·

3AN	25 gg 2 x IN	0,165	0,031	0,001	0,791
3AL	200 gg 2 X IG	3,364	0,332	0,356	0,824
3 AR		1,731	0,031	‘0,003	0,810
3ALL		3,321	0,450	0,541	0,798
3ARR		3,358	0,158	0,001	0,675
3BN		3,199	0,276	0,212	0,820
3BL		3,174	2,463	2,838	0,839
3BR		3,274	0,607	1,517	0,481
3BLL		3,284	1,279	2,593	0,829
3BRR		3,254	0,427	1,684	0,852
4 ΑΝ	25 gg 5 x IN	3,375	0,118	0,212	0,111
4AL	s 2 gg LT	3,482	0,346	0,546	0,107
4AR		3,330	3,237	3,302	0,109
4ALL		3,343	3,067	3,229	0,103
4ARR		3,320	1,625	2,156	0,106
4BN		3,287	1,263	2,943	0,224
4BL		3,305	0,496	2,029	0,139
4BR		3,283	0,809	2,307	0,114
4BLL		3,313	1,019	3,346	0,106
4BRR		3,474	0,674	1,683	0,119

• · · ·

5AN	žádná	0,075	0,023	0,001	0,126
5AL		0,005	0,016	‘0,002	0,881
5AR		0,011	0,008	‘0,001	0,839
5ARR		0,005	0,007	0,000	0,834
5BN		0,033	0,016	0,001	0,134
5BL		0,013	0,009	0,004	0,814
5BR		0,025	0,014	0,007	0,833
5BLL		0,028	0,019	0,008	0,155
5BRR		0,095	0,012	0,003	0,818
6AN	25 μ9 5 x IN	3,353	0,680	0,498
6AL	200 1 x IG	3,470	0,248	0,100
6AR		3,387	1,236	0,741
6ALL		3,362	0,409	0,322
6ARR		3,244	1,036	1,056
6BN		3,211	2,749	2,014
6BL		3,286	0,360	0,328
6BR		3,269	0,749	1,882
6BLL		3,347	0,275	0,030
6BRR		3,321	0,311	0,989

• ·

7AN	25 μ9 4	χ ΙΝ	3,415	0,756	2,584
7AL	s 2 μ9	LT	3,428	3,080	3,287
7AR		3,249	2,054	3,188
7ALL		3,269	1,010	3,240
7ARR		3,255	0,713	3,243
7BN		3,310	3,081	3,274
7BL		3,439	2,298	3,222
7BR		3,359	1,026	1,7'57
7BLL		3,370	1,441	3,025
7BRR		3,330	0,689	1,169
8AN	200 μ9 4	X IG	0,281	0,031	0,000
8AL	s 10 μ9	ΙΖΓ	3,234	0,925	1,872
8AR		3,285	0,827	2,751
8ALL		3,313	0,547	0,395
8ARR		3,363	0,382	1,144
8BN		3,407	1,189	1,880
8BR		3,315	1,608	2,536
8BLL		3,271	0,438	0,599

- 40 • ·

9AN	žádná	0,011	0,003	0,000
9AL		0,017	0,005	0,001
9AR		0,007	0,002	0,001
9ALL		0,011	0,013	0,000
9ARR		0,006	0,019	‘0,002
9BN		0,017	0,010	‘0,001
9BL		0,020	0,008	‘0,002
9BR		0,031	0,012	‘0,002
9BLL		0,005	0,016	0,005
9BRR		0,019	0,011	0,000

Další podpora pro účinnost intranasální imunizace je předvedena v Obr. 11. Ve stručnosti: Tento experiment ukázal, že rekombinantní ureasa (10 pg), podávaná intranasální cestou s CT (5 pg) je při prevenci infekce H. felis přinejmenším tak účinná, jako rekombinantní ureasa (25 pg), podávaná orální cestou s CT (10 pg).

Výběr mukosálního adjuvans

Termolabilní toxin E. coli (LT) je multi-subjednotkový toxin, jenž je blízce příbuzný (jak biochemicky tak imunologicky) s CT. Protože toxicita LT je nižší než CT, LT je praktickým mukosálním adjuvans pro použití u lidí (Walker a Clements, Vaccine Res. 2: 1-10, 1993).

Myši byly orálně imunizovány 5 pg, 25 pg, nebo 100 pg rekombinantní ureasy s 25 pg rekombinantního LT (Švýcarský • · · · · ·

- 41 - ............ ústav sér a vakcín, Bern, Švýcarsko) celkově ve čtyřech týdenních dávkách. Kontrolní myši obdržely jen LT nebo 25 μ9 ureasovou vakcínu s CT. Myši byly vystaveny infekci dva týdny po čtvrté dávce a pitvány dva týdny po tomto vystavení.

Testy na žaludeční ureasu ukázaly významnou ochranu nebo potlačení infekce u všech dávek vakcíny (Tabulka 6). Histologická zjištění potvrdila významné snížení bakteriálních hodnot u myší, jež obdržely < 5 μg ureasy a LT. Ochrana byla přímo svázána s dávkou, což bylo stanoveno jak testy na žaludeční ureasu, tak histologickým zkoumáním, přičemž nejvyšší ochrana odpovídala 100 μg ureasy podané spolu s LT. Stanovení protilátek potvrdila vztah dávky a odezvy, s nejvyššími mukosálními imunitními odezvami při dávce 100 μ9· Když se rekombinantní ureasa podávala v ekvivalentních dávkách (25 μ9), LT byl jak mukosální adjuvans lepší než CT. Tato data ukazují, že i když CT zesiluje mukosální imunitní odezvy k orálně podávané rekombinantní urease, LT je lepším mukosálním adjuvans a je tedy výhodnější než CT pro společné podávání s rekombinantní ureasou.

Tabulka 6

Termolabilní enterotoxin E. coli (LT) jako mukosální adjuvans pro imunizaci ekombinantní ureasou H. pylori

VAKCÍNA	ADJUVANS	PROCENTO CHRÁNĚNÝCH (POČET CHRÁNÉNÝCH/CELK.)a
ureasový test	histologie
žádná	25 μg LT	0 (0/9)	0 (0/9)
25 μ9 rUre	10 μg CT	70 (7/10)*	60 (6/10)*
5 μ9 rUre	10 μ9 LT	78 (7/9)*	56 (5/9)*
25 μ9 rUre	10 μg LT	90 (9/10)*	80 (8/10)*
100 μg rUre	10 μg LT	100 (8/8)*	100 (8/8)*

Procento chráněných (počet myší s negativním ureasovým testem nebo bakteriální hodnotou 0 - 1+ / počet testovaných) podle stanovení bakteriálních hodnot stříbrem barvených řezů žaludku.

Srovnání s naprázdno imunizovanými kontrolami, Fisherův exaktní test, p < 0,03.

K určení adjuvanční aktivity nižších dávek LT byly myši orálně imunizovány s 25 qg rekombinantní ureasy podávanými s 1, 5, 10 nebo 25 μg LT. U všech dávek LT byly pozorovány podobné podíly ochrany a protilátkové odezvy.

Bylo provedeno několik studií ke zjištění adjuvans jiných než CT a LT a ke stanovení, zda by daný požadavek na mukosální

- 43 adjuvans mohl být eliminován podávání samotného antigenu ve vysoké dávce. Podjednotka B choleratoxinu (CTB) byla srovnávána s CT jako mukosální adjuvans pro ureasovou imunizaci. Když bylo intragastricky podáváno 200 gg ureasy spolu s 100 μ9 CTB (Calbiochem, La Jolla, CA) v 0,24 M hydrogenuhličitanu sodném nebyl pozorován žádný ochranný účinek, zatímco stejné množství ureasy s 10 μ9 CT dalo 100 % ochranu, jak bylo stanoveno podle aktivity žaludeční ureasy.

Orálně aktivní, semisyntetický analog muramyldipeptidu, GMDP (N-acetylglukosaminyl-(bl-4)-N-acetylmuramyl-L-alanylD-isoglutamin) byl podáván spolu s 25 μ9 ureasy v dávkách 2, 20 a 200 μ9- GMDP podávaný s rekombinantní ureasou neměl schopnost chránit myši proti vystavení H. felis.

Vysoké dávky rekombinantní ureasy (200 μg, 1 mg nebo 5mg) s nebo bez CT byly intragastricky podávány myším jednou týdně po čtyři týdny. Tato intragastrická cesta byla potřebná, protože objemy pro vysoké dávky antigenu převyšovaly objemy, jež by mohly být podávány orálně reprodukovatelným způsobem. Společně byl podáván NaHCO₃ k neutralizaci žaludeční kyseliny. Krev, stolice a sliny byly sbírány pět až osm dní po poslední imunizaci. Zvířata byla vystavena 1 x 10 H. felis a infekce byla stanovována ureasovou aktivitou v žaludeční tkáni.

V nepřítomnosti CT neposkytovaly vysoké dávky antigenu ochranu před vystavením H. felis, zatímco kontroly, jež dostaly 200 pg rekombinantní ureasy s CT, byly významně chráněny (Tabulka 7). Sérové IgG specifické na ureasu byly indukovány při vysokých dávkách rekombinantní ureasy bez adjuvans, ale odezvy IgA v séru, stolici a slinách nenastaly nebo byly minimální. Histologické zkoumání kódovaných vzorků ze zvířat, jež dostala 5 mg dávky ureasy, neprokázala žádné rozdíly v bakteriálních hodnotách nebo leukocytárních infiltrátech, ve srovnání se zvířaty imunizovanými naprázdno.

Tabulka 7

Mukosální adjuvans umožňuje ochranu pomocí rekombinantní ureasy

VAKCÍNA	ADJUVANS	% CHRÁNĚNÝCH (POČET CHRÁN./CELK.)	Střední hladina protilátek (+SD) před vystavením a
IgG v séru	IgA v séru	IgA ve stolici	IgA ve slinách
žádná	PBS	0 (0/5)	0,01 (+0,00)	0,03 (±0,07)	0,01 (±0,02)	0,02 (±0,03)
200 μg rUre	10 μυ CT	88 (7/8)*	>2,97 (±1,84)	>1,02 (±1,41)	0,16 (±0,14)	0,59 (±0,73)
200 μg rUre	žádné	0 (0/9)	>2,06 (±1,98)	0,07 (±o,n)	0,02 (±0,02)	0,06 (±0,13)
1 mg rUre	žádné	0 (0/9)	>3,28 (±1,48)	0,12 (±0,17)	0,02 (±0,03)	0,18 (±0,40)
5 gg rUre	žádné	0 (0/9)	>2,68 (±1,98)	>0,22 (±0,17)	0,02 (±0,02)	0,08 (±0,11)

^a Střední (±SD) sérové IgG nebo IgA vyjádřené jako A_4Q5 jednotky pro sérum (ředěné 1:100), fekální extrakty (ředěné 1:20) nebo sliny (ředěné 1:5). U středních hodnot je vyznačeno > tehdy, když byly do výpočtu středních hodnot zahrnuty jednotlivé hodnoty 4.0 (maximální čtení A₄₀₅).

* Srovnání s naprázdno imunizovanými kontrolami, Fisherův exaktní test, p = 0,05.

• · · · • ·

- 45 «·· · · · · · · ♦ • ···· · · · · »·· • · · ··* · ·· ···» * ···· · · · · ·»·

Terapeutická imunizace myší s H. felis qastritidou

Účinnost rekombinantní ureasové vakcíny při léčbě infekce Helicobacter u myší byla hodnocena pomocí intragastrické infekce Balb/c myší s 10⁷ H. felis a, čtyři týdny po infekci, orálního podávání čtyř týdenních dávek 100 pg rekombinantní ureasy a 10 pg LT těmto infikovaným myším. Kontrolní myši obdržely jen 10 pg LT (Obr. 12).

Deset z myší z každé skupiny bylo pitváno čtyři týdny po poslední imunizaci ke zkoumání stupně infekce Helicobacter pomocí kvantitativního stanovení žaludeční ureasy. Devět z deseti Balb/c myší bylo -prosto infekce, jak byla měřena kvantitativním ureasovým testem, zatímco všechny kontroly byly inf ikovány.

Ve čtyřech týdnech bylo reinfikováno H. felis dvanáct zvířat, jež obdržela LT a 40 zvířat, jež obdržela ureasu + LT. Dva týdny po vystaveni byla zvířata utracena ke stanovení rozsahu infekce pomocí kvantitativního ureasového testu. Z devíti zvířat, jimž byla dána ureasa + LT, ale jež nebyla vystavena reinfekci, bylo stále 5 prosto infekce (57 %), jak bylo stanoveno pomocí aktivity žaludeční ureasy. Všech dvanáct zvířat, jež dostala LT a jež byla znovu vystavena infekci, bylo infikováno. Třicet sedm ze 40 myší (93 %), jimž byla dána ureasa + LT a jež byly pak znovu vystaveny H. felis, bylo chráněno, jak bylo stanoveno podle snížené aktivity žaludeční ureasy. Tento pokus ukazuje, že vakcinace ureasou nejen eradikuje existující infekci Helicobacter, ale též chrání hostitele před reinfekci.

Pět ze čtrnácti (36 %) imunizovaných myší Swiss-Webster bylo vyléčeno nebo mělo sníženou infekci, zatímco všechna kontrolní zvířata byla infikována, ale tyto rozdíly v podílu infekce mezi skupinami nejsou významné (p = 0,26, Fisherův exaktní test, dvoustranný). Infekce byla silnější u Swiss-Webster myší než u Balb/c myší, jak bylo změřeno pomocí vyšší střední aktivity ureasy u neimunizovaných zvířat • · · ·

(p < 0,0001, jednocestný ANOVA), což podíl vyléčení u Swiss-Webster myší možná vysvětluje nižší versus Balb/c. Rozdíly v susceptibilitě myší kmenů k H. felis byly již zaznamenány (Sakagami et al. , Am. J. Gastroenterol. 89: 1345, 1994).

Podle histologických zjištění, všechny neimunizované

Balb/c myši měly 4+ infekce (> 100 bakterií / řez), zatímco snížené bakteriální hodnoty byly pozorovány ve čtyřech týdnech u 43 % imunizovaných myší. V deseti týdnech měly čtyři ze šesti sníženou ureasovou aktivitu, i když jen jedna ze šesti měla sníženou bakteriální hodnotu.

Role protilátek v terapii Helicobacter

Role protilátek proti urease v terapii Helicobacter, t.j. v odstraňování H. felis z infikovaných myší, byla zkoumána tak, že napřed byly myši Balb/c infikovány 10

H. felis. Čtyři týdny po infekci byly myši orálně imunizovány s 200 gg rekombinantní ureasy plus 10 gg CT. Kontrolní myši dostaly jen 10 gg CT. Antigen byl podán 4 krát v jednotýdenních intervalech. Zvířata byla utracena 4a 10 týdnů po poslední imunizaci a byly sbírány sérové a fekální vzorky pro ELISA.

Myši infikované H. felis produkovaly sérové anti-ureasové IgG protilátky, ale nebyla detegována žádná sekretorní anti-ureasová IgA odezva. Infikovaná zvířata imunizovaná s ureasou/CT však vykazovala vysoké odezvy sekretorních anti-ureasových IgA protilátek (Obr. 12). Nebylo žádných významných rozdílů v hladinách mukosálních IgA specifických na ureasu mezi imunizovanými myšmi, jež zůstaly infikované a těmi, jež měly snížené bakteriální hodnoty.

Tato data ukazují, že infekce H. felis sekretorní anti-ureasovou odezvu. Tedy: Potlačení nevyvolává odezvy IgA protilátek může hrát určitou roli ve schopnosti H. felis uniknout odstraňování imunitním systémem. Naproti tomu imunizace myší infikovaných H. felis ureasou a mukosálním • · · · • · ··· ·· · · · · * • · · · » · · · · * · · • ·· ··· · ·· ···· · adjuvans vedla k silným mukosálním anti-ureasovým odezvám, jež souvisely s odstraňováním infekce H. felis.

Vztah ochrany proti infekci Helicobacter a qastrickych imunitních odpovědí

Několik pokusů s použitím myšího modelu infekce ukázalo, že některá zvířata, jimž byla vakcínou rekombinantní ureasy dána resistence, neměla detekovatelnou protilátkovou odezvou nebo měla nízké hladiny protilátek v séru, slinách nebo stolici. Imunitní odezva byla tedy měřena v žaludeční sliznici samotné, aby se stanovilo, zda měření imunitní odezvy může být přesněji korelováno s ochranou.

Imunitní odezvy v žaludeční sliznici byly zjišťovány detekcí IgA protilátek a IgA-pozitivních secernujících buněk v myší střevní a žaludeční tkáni pomocí imunohistochemie. Části žaludku obsahující duodendum proximální k pyloru, antrum, korpus a kardia byly obaleny v OCT, prudce zmraženy a kryosekcionovány. Řezy (tloušťky 7 gm) byly fixovány v chladném acetonu a IgA-pozitivní buňky byly identifikovány barvením s biotinylovanou monoklonální anti-IgA, následovaným avidinem konjugovaným k biotinylované glukoso oxidase (ABC-GO, Vector Laboratories, Burlingame, CA) a proti-barveny methylovou zelení. Buňky secernující protilátky specifické k urease (ASC) byly identifikovány postupnými inkubacemi řezů s rekombinantní ureasou, králičí anti-ureasovou protilátkou, biotinylovanými oslími proti-králičími Ig (Amersham, Arlington Heights, IL), ABC-GO, TNBT a methylovou zelení. Kontrolní řezy byly inkubovány bez ureasy plus králičí anti-ureasové protilátky ke stanovení reaktivity s oslím sekundárním reagens a pozadí endogenní aktivity glukoso oxidasy. Jako pozitivní resp. negativní kontroly sloužily kryořezy buněčných sedimentů z hybridomu, jenž produkuje monoklonální IgA protilátku proti ureB H. felis (HNK71) resp. irelevantní IgA monoklonální • · • · · · • · • ·

- 48 protilátku (HNK20) proti F glykoproteinu respiratorního syncitiálního viru.

Myši Swiss-Webster byly imunizovány orálně čtyřmi týdenními dávkami 100 μg rekombinantní ureasy plus adjuvans (CT). Kontrolní myši dostaly jen adjuvans. Skupiny po třech myších byly pitvány ve dnech 3,7, 14 nebo 21 po poslední imunizaci. Peyerovy polštářky byly ze střev odstraněny a lymfocyty lamina propria (LPL) byly izolovány separací na gradientu 40 - 70 % Percollu. IgA pozitivní B buňky byly detegovány pomocí testů ELISPOT na 96-jamkových filtračních destičkách pokrytých 1 μg/jamku rekombinantní ureasy a blokovaných bovinním sérovým albuminem. Do jamek byly přidány LPL v seriálním ředění s faktorem 10, počínaje 1 x 10° buněk. IgA-pozitivní ASC byly detegovány s biotinylovaným anti-myším IgA reagens, následovaným streptavidin-alkalickou fosfatasou, a pozitivní buňky byly počítáni mikroskopií.

ASC pozitivní na anti-ureasové IgA byly nalezeny tak časně, jako je tři dny po poslední imunizaci, měly vrchol u sedmi dnů, a pak se snižovaly (Tabulka 8). ASC specifické na ureasu představovaly - 10 % celkových IgA pozitivních buněk pozorovaných imunohistochemicky. Dvoubarevná imunofluorescenční mikroskopie potvrdila, že ASC specifické na ureasu byly intenzivní antigenové též IgA-pozitivní. Tato pozorování potvrzuj i, že anti-ureasová IgA odezva nastává po orální stimulaci na úrovni intestinální sliznice.

Chronologie a kinetika této odezvy byly podobné těm, jež jsou popsány pro jiné orální vakcíny (Czerkinsky et al., Infect.

Inanun. 59: 996-1001, 1991; McGhee a Kyono, Infect. Agents Huni.

Dis. 2: 55-73, 1993).

Tabulka 8

Kinetika indukce buněk secernujicich anti-ureasové IgA po orální imunizaci rekombinantní ureasou

IMUNIZACE	POČET ASC / 106 LYMFOCYTŮ LAMINA PROPRIA
den 3a	den 7	den 14	den 21
rekombinantní ureasa + CTb	17c	7400	10	2
PBS + CT	1	200	0	0

^a Den po poslední orální imunizaci.

b Cholera toxin.

^c Průměrná hodnota z duplikátních jamek obsahujících intestinální lymfocyty ze tří samostatných myší.

K stanovení, zda IgA-pozitivní buňky jsou zabírány do žaludeční sliznice, žaludky orálně imunizovaných myší byly zkoumány pomocí imunohistochemie, jak je popsána shora. IgA-pozitivní buňky nebyly přítomné v žaludeční sliznici myši jen imunizovaných nebo kontrolních, což ukazuje, že žaludek je imunologicky mlčící dokud není stimulován vystavením Hel i cobac ter.

Byla zkoumána role žaludku jako imunologicky efektorového orgánu u imunizovaných, infekci vystavených myší. Myši dostaly čtyři týdenní dávky 200 μg rekombinantní ureasy s 10 μ9 CT. Kontrolní myši obdržely jen CT. Jeden týden po imunizaci byly myši vystaveny infekci. Myši byly pitvány před tímto vystavením ve dnech 7, 14, 28, 70 a 133 po něm.

Před vystavením infekci nebyly nalezeny žádné IgA-pozitivní ASC. Ve všech časových intervalech po vystavení byly v žaludeční sliznici přítomné IgA-pozitivní ASC ve • · • · · • ·

velkých počtech, s vrcholem u sedmi dní (Obr. 14). Počet IgA pozitivních ASC vysoce přesahoval počet v neimunizovaných (jen CT) myších, obzvláště 7-28 dní po vystavení. Anatomická lokalizace IgA-pozitivních ASC se rovněž lišila, přičemž imunizované myši měly tyto buňky po celé sliznici, v lamina propria a kolem krypt, ale zřídka pod povrchovým epitheliem. ASC specifické na ureasu a IgA-pozitivní ukazovaly na to, že většina buněk specifických na ureasu v žaludeční sliznici byla IgA-pozitivních.

Tato pozorování ukazují, že žaludeční sliznice zvířet spuštěných předchozí imunizací začíná být imunologicky aktivovanou pouze po antigenické stimulaci H. felis. Výsledná tkáňová odezva je charakterizována rychlým, intenzivním a dlouhotrvajícím zavzetím IgA-pozitivních B buněk, z nichž mnohé jsou specifické na ureasu. Tato odezva je kvantitativně větší než u imunologicky naivních myší po vystavení infekci, Navíc: Lokalizace IgA-pozitivních buněk se liší u imunizovaných myší od lokalizace u imunologicky naivních myší, jež jsou vystaveny infekci a stanou se perzistentně infikovanými H. felis. Zesílená odezva IgA-pozitivních ASC v žaludeční sliznici napovídá základ ochrany proti vystavení H. felis, poskytované imunizací. Tato data jsou v souladu se studiemi cholerové vakcíny, u níž imunologické paměťové odezvy spuštěné během několika hodin po bakteriálním vystavení jsou dostatečné pro poskytnutí ochrany (Lycke a Holmgren, Scand. J. Iimminol. 25: 407-412, 1987.

Korelace žaludeční imunitní odezvy a bakteriální zátěže

Vztah mezi imunitní odezvou žaludeční tkáně a bakteriální infekcí byl definován na strukturní úrovni. Myši Swiss-Webster byly imunizovány čtyřmi týdenními dávkami 200 μg rekombinantní ureasy s 10 μg CT. Jeden týden po poslední imunizaci byly myši vystaveny 1 x 10⁷ H. felis. Zvířata byla utracena ve dnech 0, 1, 7, 14, 28, 70 a 133 • · • ♦ • · · · • ·

- 51 po tomto vystavení a kolonizace H. felis byla zjištována světelnou a elektronovou mikroskopií.

Do 24 hodin po vystavení měly jak imunizované, tak neimunizované myši podstatné počty H. felis v lumenu žaludečních krypt (Obr. 15). Do sedmi dnů po vystavení byly bakterie odstraněny z imunizovaných myší, ale stále přítomné ve vysokých počtech v žaludečních kryptách a lumenu neimunizovaných myší. Bakterie byly též spojeny s apikální membránou sliz secernujících buněk neimunizovaných myší. Odstraňování bakterií z žaludeční sliznice imunizovaných myší odpovídalo objevování se IgA-pozitivních ASC a anti-ureasových ASC v žaludeční tkáni.

Tyto výsledky napovídají následující sled událostí: 1) vystavení imunizovaných myší infekci vede k přechodné kolonizaci žaludečního epithelu H. felis, 2) neimunizovaná zvířata zůstávají infikována, zatímco zvířata imunizovaná rekombinantní ureasou odstraňují bakterie z žaludku během prvního týdne po vystavení infekci, a 3) odstranění infekce je spojeno se zavzetím IgA-pozitivních, na ureasu specifických ASC do žaludeční tkáně. Podobný mechanismus může být zodpovědný za odstraňování bakterií z žaludeční sliznice chronicky infikovaných zvířat, jež jsou podrobena terapeutické imunizaci.

Antigenní konzervace ureasy mezi kmeny H. pylori

Byla testována schopnost různých antisér vázat četné klinické izoláty H. pylori. Tato antiséra zahrnovala MPA3, hyperimunní králičí sérum připravené proti purifikované urease H. pylori, a séra a sekrety (vzorky odebrané z žaludku a sliny) z myší imunizovaných rekombinantní ureasou. Preparáty protilátek byly testovány imunoblotem na rozeznávání homologního kmene H. pylori (HP630), kmene typu ATCC 43504 • · • · · · • ·

- 52 a pěti klinických izolátů z pacientů St. Bartholomew’s Hospital, Londýn, s žaludečními vředy ze odebraných v průběhu posledních pěti let.

Všechna antiséra rozeznávala podjednotky UreA a UreB všech kmenů H. pylori, jakož i purifikovanou nativní a rekombinantní ureasu H. felis, a nativní ureasu H. mustelae. Navíc: Na ureasu specifické IgA protilátky v žaludeční štávě a slinách imunizovaných myší reagovaly jak s UreA, tak s UreB všech kmenů H. pylori, jakož i s heterologními ureasami. Imunologické rozeznávání bylo vyšší pro UreB než pro UreA. Naprázdno imunizované myši nevykazovaly žádnou reaktivitu s žádnou ureasovou podjednotkou. Tyto výsledky ukazují, že kmeny H. pylori exprimují ureasy, jež jsou na antigeničké úrovni vysoce konzervovány. Antigeničké variace tedy nejsou významným faktorem pro vývoj rekombinantní ureasové vakcíny.

Kombinační způsoby a prostředky pro léčbu infekce Helicobacter

Gastroduodendální infekce, jako je infekce Helicobacter, lze léčit orálním podáváním antigenu vakcíny (např. ureasy H. pylori) a mukosálního adjuvans, v kombinaci s antibiotikem, antisekrečním agens, solí vizmutu, antacidem, sukralfatem a jejich kombinacemi. Příklady takovýchto sloučenin, jež mohou být podávány s antigenem vakcíny a adjuvans jsou: Antibiotika, včetně např. makrolidů, tetracyklinů, β-laktamů, aminoglykosidů, chinolinů, penicilinů a jejich derivátů (konkrétní příklady antibiotik, jež mohou být použity v tomto vynálezu zahrnují např. amoxicillin, klarithromycin, tetracyklin, metronidizol, erythromycin a cefuroxin), antisekreční činidla, zahrnující např. antagonisty H₂-receptoru (např. cimetidin, ranitidin, famotidin, nizatidin a roxatidin), inhibitory protonové pumpy (např. omeprazol, lansoprazol a pantoprazol), prostaglandinová analoga (např. misoprostil a enprostil) a anticholinergická činidla (např.

• · · · • · « · • · · · • » · · • · * · · • · · , a soli dicitrátu pirenzepin, telenzepin, karbenoxolon a proglumid) vizmutu, včetně koloidního subcitrátu vizmutu, vizmutátu trojdraselného, subsalicylátu bicitropeptidu a pento-bismolu (viz např.

Helicobacter pylori, Biology and Clinical Practice, Boča Raton, FL, str. 366-395, 1993;

Reference, 49. vydání, Medical Economics Company, Montvale, New Jersey, 1995). Navíc sloučeniny obsahující více než jednu ze složek vzájemně vázaných, např. ranitidin vázaný k vi zmutu.

vizmutu,

Goodwin et al.,

CRC Press,

Physicians' Desk Data Production mohou být použity shora uváděných subcitrátu

Množství a prostředcích kdo je zběhlý snadno navrhnout shora uváděných sloučenin podle vynálezu mohou v oboru. Navíc:

schémata ve stanoveny tím, v oboru může způsobech mohou být + adj uvans

Nevakcínové složky a antigen vakcíny 7, 14, 21 a 28.

Navíc k urease mohou být zahrnujících být snadno

Kdo je zběhlý léčby/imunizace. Například:

podávány ve dnech 1 — 14, mohou být podávány ve dnech ve způsobech a prostředcích podle vynálezu, zahrnujících kombinační terapii, používány jiné antigeny Helicobacter. Použity mohou být například: bílkoviny tepelného šoku Helicobacter (HspA nebo WO 94/26901), Helicobacter anhesní lipoprotein A nukleotidová sekvence kódující AlpA se udává v SEKV. a odpovídající aminokyselinová sekvence AlpA je v SEKV. ID. Č. 7), Helicobacter (např. H. pylori) clp B (clpB je kódován insertem v plasmidu v bakteriální kmenu XLOLR HP CP6, jenž je uložen u National Collection of Industrial & Marině Bacteria v Aberdeenu, 40748), nebo monoklonální

HspB; (AlpA; ID. Č. 6

NCIMB přístupovým číslem Helicobacter, rozpoznávaný 50 (IgG 50 lze získat “θ-Βγ , jež byla uložena a označena ATTC přístupovým číslem HB-11952). Navíc mohou být jako antigeny vakcíny podle vynálezu použity povrchově exponované nebo secernované antigeny Helicobacter, identifikované přehazovací transposonovou mutagenisační z hybridomové u ATTC

Skotsko, a označen

16-19 kD antigen protilátkou IgG buněčné linie #50-G_fi-B • · • · · ·

metodou Haase et al. (Haas et al., Gene 130: 23-31, 1993; Haas et al., abstrakt z VI^th Workshop on Gastroduodendal Pathology and Helicobacter pylori, Brusel, 21.- 25. září 1993; Odenbreit et al., Gut, An International Journal of Gastroenterology nad Hepatology, abstrakt z VIII^¹ Workshop on Gastro-duodendal Pathology and Helicobacter pylori, Edinburgh, Skotsko, 7.-9. července 1995). U této metody jsou klonované geny H. pylori mutagenisovány transposonovou inserční mutagenesou v Escherichia coli. Inaktivované geny jsou znovu zaváděny do H. pylori transformací DNA, a alelická náhrada vede k vytváření odpovídajících nutant H. pylori. Transposon použitý v jedné variantě této metody nese blaM, což jest 5'-zkrácená verze β-laktamasového genu. Použití tohoto transposonu umožňuje označení genů kódujících exportované bílkoviny, jež obsahují zaváděcí peptid, a tedy přímou selekci klonů obsahujících mutanty exportovaných bílkovin (např. bílkovin buněčného povrchu, jako jsou adhesiny a cytotoxiny, jakož i jiných buněčně-povrchových potenciálních faktorů virulence); tyto exportované bílkoviny jsou silnými kandidáty

Helicobacter lze ve nebo léčbu infekcí používat antigeny než Helicobacter. protektivní nebo na antigeny vakcín. Navíc k antigenům způsobech a prostředcích pro prevenci způsobovaných příslušnými patogeny gastroduodendálních patogenů jiných Polypeptidové fragmenty obsahující terapeutické epitopy shora uváděných antigenů mohou být rovněž používány v tomto vynálezu.

Adjuvans, jichž lze používat ve způsobech a prostředcích vynálezu, zahrnují mukosální enterotoxin E. coli (LT) a jejich deriváty (např.

aktivitu) podle termolabilní

C. difficile, nebo nebo toxoidy mající kombinace. Například: karboxyterminálních (viz např. Dove et toxinu A). Množství antigenů a adjuvans adjuvanční Lze použít aminokyselin al., výše, adj uvans, např.

choleratoxin, toxin fragmenty, mutanty nebo jejich fragment obsahující 794 C. difficile toxinu A k sekvenci C. difficile vakcíny, jichž lze

- 55 • ·

používat v těchto způsobech a prostředcích podle vynálezu, jsou popsána shora.

Účinnost prostředku obsahujícího vakcínu (ureasu H. pylori + LT), antibiotikum (amoxicillin) a sůl vizmutu (pepto-bismol) v léčbě infekce Helicobacter je ilustrována níže.

Kombinační terapie infekce Helicobacter u myší amoxicillinem /30 g myš) vakcinačním

H. felis byly myši léčeny g myš) nebo pepto-bismolem (0,2 mg 1 - 14) nebo rekombinantní

Jeden měsíc po infekci ~ 10?

(1,5 mg / 30 jednou denně po 14 dní prostředkem obsahuj ícím ureasy H. pylori +5 qg LT ve dnech Tabulku 9 k ilustraci použitých myších byla výše) 1 týden a ilustrováno

Helicobacter v těchto ureasovým testem (viž léčby (den 28). Jak je a 28 (viz

Infekce (dny

100 gg

7, 14, kombinací).

měřena kvantitativním týdny po ukončení v Tabulce 9, nejúčinnější léčebný režim, dosahující 100 % odstraněni, zahrnoval podávání vakcíny (ureasy + LT), antibiotika (amoxicillinu) a soli v i zmutu (pepto-bisrno1u).

• · • · • · « ·

Tabulka 9

Procento myší zbavených infekce H. felis

Léčba	1 týden	4 týdny
amoxicillin	60 %	40 %
pepto-bismol	0 %	0 %
amoxicillin + pepto-bismol	80 %	40 %
vakcína	70 %	70 %
vakcína + amoxicillin	89 %	56 %
vakcína + pepto-bismol	-70 %	-70 %
vakcína + amoxicillin + pepto-bismol	100 %	100 %

(vakcína = ureasa + adjuvans)

Identifikace lidských pacientů pro podávání vakcíny rekombinantní ureasy H. pylori

Vakcína rekombinantní ureasy H. pylori může být podávána neinfikovaným jednotlivcům jako profylaktické opatření nebo jednotlivcům infikovaným Helicobacter jako antibakteriální terapie. Jednotlivci vybraní pro profylaktické podávání rekombinantní ureasy zahrnují jakékoli jednotlivce s rizikem infekce Helicobacter, jak se zakládá na věku, geografickém místě nebo přítomnosti podmínek, jež činí jednotlivce susceptibilními k infekci Helicobacter. Jednotlivci s obzvlášť:

vysokým rizikem infekce, nebo ti, na něž infekce bude mít nejsilnější účinky zahrnují jednotlivce v rozvojových zemích, kojence a děti v rozvojových a vyspělých zemích, jednotlivce s přirozeně nebo arteficiálně nízkým pH žaludeční kyseliny, posádky ponorek a vojenský personál.

Jednotlici, jež mohou dostávat vakcínu rekombinantní ureasy H. pylori jako terapeutické činidlo, zahrnují jednotlivce se symptomy gastritidy nebo jiných gastrointestinálních poruch, jež mohou být spojeny s infekcí H. pylori. Klinické symptomy spojené s gastritidou, zánětem žaludeční sliznice, zahrnují široký rozsah špatně definovaných a obecně nedostatečně léčených symptomů, jako jsou špatné trávení, pálení žáhy, dyspepsie a nadměrná říhání. Obecný rozbor gastritidy se objevuje v Sleisenger a Fortran, in Gastrointestinal Disease, 4. vydání, Saunders Publishing Co., Philadelphia, PA, str. 772-902, 1989.

Jednotlivci, jež mají gastrointestinální poruchy, mohou být rovněž léčeni podáváním vakcíny podle vynálezu. Gastrointestinální poruchy zahrnují jakoukoli nemoc nebo poruchu gastrointestinálního traktu člověka nebo jiného savce.

Gastrointestinální poruchy zahrnují například poruchy, jež se nemanifestuj i (neulcerativní či atrofické přítomností ulcerace v žaludeční sliznici gastrointestinální poruchy), včetně chronické gastritidy, gastroenteritidy, neulcerativní dyspepsie, refluxní choroby jícnu, a peptické ulcerativní choroby a dvanácterníkových vředů). Peptické poruch hybnosti žaludku (např. žaludečních vředy zahrnují ulceraci a tvorbu lézí ve slizniční membráně jícnu, žaludku a dvanácterníku, a jsou obecně charakterizovány ztrátou tkáně zapříčiněnou působením faktorů. Alternativně trávicích kyselin, muže být žádoucí asymptomatickým jednotlivcům, obzvláště pepsinu a jiných podávat vakcínu tam, kde daný jednotlivec může být vystaven H. pylori nebo být v podmínkách, jež činí daného jednotlivce susceptibilním k infekci.

• · • · · · • · · · • « · • ···· · · · · · ·· • · · ··· · · · ···· ·

- 58 - ’..**..*

Infekci Helicobacter lze snadno diagnostikovat řadou způsobů dobře známých v oboru, včetně např. sérologie, ¹³C dechové testu nebo gastroskopické prohlídky.

Příprava purifikované rekombinantní ureasy pro podávání pacientům

Postup pro formulaci rekombinantní ureasy zahrnuje spojení ureasy se stabilizátorem (např. cukrem manitolem) a mrazovou sublimaci (t.j. lyofilizaci) produktu. Tento postup zabraňuje degradaci agregací a fragmentací. Navíc je daný produkt stabilní po měsíce od lyofilizace. Proces, jenž vede k nestabilitě, zahrnuje tvorbu disulfidových vazeb mezi bílkovinnými podjednotkami, a je účinně inhibován lyofilizaci.

Rekombinantní ureasa je lyofilizována po konečném purifikačním kroku. Purifikovaný bílkovinný produkt (přibližně 4 mg/ml) se dialyzuje proti 2 % sacharose a tento roztok se přenese do lyofilizačních ampulí. Roztok v ampulích se buď

1) zmrzne v kapalném dusíku a pak dá do lyofilizátoru, anebo

2) ochladí na 4’C a pak dá do lyofilizátoru, kde se zamrazí na -40 °C nebo níž. Lyofilizace se provádí standardním způsobem. Lyofilizovaný produkt lze rekonstituovat ve vodě.

Způsob podávání pacientům

Rekombinantní ureasa H. pylori je podávána na slizniční povrch jednotlivce ke stimulaci mukosální imunitní odezvy účinné v ochraně k následné expozici k Helicobacter nebo ve zbavování se již existující infekce Helicobacter. Výhodně je rekombinantní ureasa podávána tak, že vyvolává mukosální imunitní odezvu spojenou s produkcí anti-ureasových IgA protilátek nebo s infiltrací lymfocytů do žaludeční sliznice. Rekombinantní ureasa může být podávána na jakýkoli slizniční povrch pacienta. Výhodné slizniční povrchy jsou intranasální,

orální a rektální (např. použití análního čípku). Navíc k podávání na jednotlivý slizniční povrch může být vakcína podle vynálezu podávána na více povrchů kombinovaně (např. na orální + rektální, orální + intranasální nebo rektální + intranasální). V případě orálního podávání je s výhodou, když podávání zahrnuje polknutí vakcíny, ale vakcína může být rovněž podávána jako ústní voda (výplach), takže imunitní odezva je stimulována ve slizničním povrchu ústní dutiny, bez skutečného polknutí vakcíny. Alternativně lze systémovou mukosální imunitní odezvu dosáhnout podáváním vakcíny ke slizničnímu povrchu oka ve formě např. očních kapek nebo itraokulárního implantátu.

Dávkování rekombinantní ureasy H. jednotlivci jako bud profylaktická pylori podávané terapie, anebo antibakteriální terapie, může stanovit kdokoli zběhlý v oboru.

Obecně bude dávkování obsahovat mezi 10 μ9 a

000 mg, mezi

ureasy

Pacientovi

podána

jedna

rekombinantní ureasy H. pylori, například přinejmenším dvě dávky, přinejmenším čtyři dávky, nebo až po šest nebo více celkově podaných dávek. Může být žádoucí podávat zesilovací dávky rekombinantní ureasy v intervalech jednoho nebo dvou týdnů po poslední imunizaci, přičemž jedna zesilovací dávka bude obecně obsahovat menší nebo stejné množství rekombinantní ureasy H. pylori jako počáteční podaná dávka. Například: Vakcinačním režimem může být podávání čtyř dávek v jednotýdenních intervalech. Spouštěcí a zesilovací dávky mohou být podávány na stejné nebo na různé slizniční povrchy. V případě různých slizničních povrchů může například být orální spouštěcí dávka následována intranasálními nebo rektálními zesilovacími dávkami, intranasální spouštěcí dávka následována orálními nebo rektálními zesilovacími dávkami, nebo rektální spouštěcí dávka následována orálními nebo intranasálními zesilovacími dávkami.

• · • · · ·

- 60 Rekombinantní ureasa H. pylori může být podávána spolu s mukosálním adjuvans. Můkosálním adjuvans může být kterékoli mukosální adjuvans známé v oboru, jež je vhodné k humánnímu použití. Například: Mukosálním adjuvans může být choleratoxin (CT), termolabilní toxin enterotoxigenní E. coli (LT), nebo derivát, podjednotka nebo fragment CT nebo LT, jenž si zachovává funkci adjuvans. Mukosální adjuvans se podává společně s rekombinantní ureasou H. pylori v množství účinném k vyvolání nebo zesílení mukosální imunitní odezvy, obzvláště humorální a/nebo mukosální imunitní odezvy. Poměr adjuvans k rekombinantní urease může být stanoven standardními metodami kýmkoli zběhlým v oboru. Například: Adjuvans může být přítomné v poměru 1 díl adjuvans na 10 dílů rekombinantní ureasy.

K neutralizaci nebo zvýšení pH žaludeční kyseliny lze před podáváním rekombinantní ureasy H. pylori podávat pufr. Lze použít jakéhokoli pufru, jenž je účinný pro zvýšení pH žaludeční kyseliny a jenž je vhodný k humánnímu použití. Lze použít například pufry jako je hydrogenuhličitan sodný, hydrogenuhličitan draselný, fosforečnan sodný a fosforečnan draselný. V případě orálního podávání může být vakcína prosta pufru, t.j. pacientovi se ani před podáváním ani souběžně s podáváním rekombinantní ureasy nepodává žádné množství pH-zvyšující pufrační sloučeniny, schopné významně ovlivnit pH žaludeční kyseliny.

Formulace vakcíny obsahující rekombinantní ureasu mohou obsahovat řadu dalších složek, včetně stabilizátorů, složek zlepšujících chuť (např. cukru) nebo, tak, kde se vakcína podává jako antibakteriální terapie, jiné sloučeniny účinné ve zbavování se nebo eradikaci infukujících baktérií.

V profylaktické terapii lze vakcínu obsahující rekombinantní ureasu H. pylori podávat kdykoli před kontaktem s Helicobacter nebo vznikem infekce. Protože tato vakcína může působit rovněž jako antibakteriální terapie, neexistuje žádná kontraindikace pro podávání když je okrajový důkaz nebo podezření na pre-existující infekci Helicobacter (např. asymptomatickou infekci).

• · · · ··· ·· · ♦·· • ···· · · · · « · · ··»···· ······ — οχ — ♦······· ··

Pro použití vakcíny jako antibakteriální terapie lze rekombinantní ureasu H. pylori podávat kdykoli před, v průběhu nebo po objevení se příznaků spojených s infekcí Helicobacter nebo s gastritidou, peptickými vředy nebo jinými gastrointestinálními poruchami. I když to není nutným předpokladem pro začátek léčby, může se diagnóza infekce Helicobacter potvrzovat pomocí např. C dechového testu, sérologie, gastroskopie, odběru tkáně, nebo jiné detekce Helicobacter známé v oboru. Zlepšování stavu imunizovaných pacientů lze sledovat obecným lékařským hodnocením a hodnocením infekce H. pylori pomocí sérologie, C dechove testu nebo gastroskopické prohlídky.

Příklad podávání rekombinantní ureasy H. pylori lidskému subj ektu

Pacientovi se podává vakcína složená z 60 mg rekombinantní ureasy H. pylori v celkovém objemu 15 ml vody obsahující 2 % hmotn./objem sacharosy, pH 7,5. Podávání této vakcíny se opakuje v týdenních intervalech do celkem 4 dávek. Příznaky se u pacienta zaznamenávají denně. Ke stanovení nežádoucích účinků se lékař na ně dotazuje každý týden během období podávání vakcíny, jakož i 1 týden a 1 měsíc po poslední imunizaci. Anti-ureasové protilátky se měří v séru a slinách, a buňky secernující protilátky se monitorují v periferální krvi odebrané 7 dnů po poslední imunizaci.

• ·

Seznam sekvencí

SEKV. ID. Č. 1

TAATACGACT	CACTATAGGG	GAATTGTGAG	CGGATAACAA	TTCATCCACC	TTGATTGCGT	60
TATGTCTTCA	AGGAAAAACA	CTTTAAGAAT	AGGAGAATGA	GATGAAACTC	ACCCCAAAAG	120
AGTTAGATAA	GTTGATGCTC	CACTACGCTG	GAGAATTGGC	TAAAAAACGC	AAAGAAAAAG	180
GCATTAAGCT	TAACTATGTA	GAAGCAGTAG	CTTTGATTAG	TGCCCATATT	ATGGAAGAAG	240
CGAGAGCTGG	TAAAAAGACT	GCGGCTGAAT	TGATGCAAGA	AGGGCGCACT	CTTTTAAAAC	300
CAGATGATGT	GATGGATGGC	GTGGCAAGCA	TGATCCATGA	AGTGGGTATT	GAAGCGATGT	360
TTCCTGATGG	GACTAAACTC	GTAACGGTGC	ATACCCCTAT	TGAGGCCAAT	GGTAAATTAG	420
TTCCTGGTGA	GTTGTTCTTA	AAAAATGAAG	ACATCACTAT	CAACGAAGGC	AAAAAAGCCG	480
TTAGCGTGAA	AGTTAAAAAT	GTTGGCGACA	GACCGGTTCA	AATCGGCTCA	CACTTCCATT	540
TCTTTGAAGT	GAATAGATGC	CTAGACTTTG	ACAGAGAAAA	AACTTTCGGT	AAACGCTTAG	600
ACATTGCGAG	CGGGACAGCG	GTAAGATTTG	AGCCTGGCGA	AGAAAAATCC	GTAGAATTGA	660
TTGACATTGG	CGGTAACAGA	AGAATCTTTG	GATTTAACGC	ATTGGTTGAT	AGACAAGCAG	720
ACAACGAAAG	CAAAAAAATT	GCTTTACACA	GAGCTAAAGA	GCGTGGTTTT	CATGGCGCTA	780
AAAGCGATGA	CAACTATGTA	AAAACAATTA	AGGAGTAAGA	AATGAAAAAG	ATTAGCAGAA	840
AAGAATATGT	TTCTATGTAT	GGTCCTACTA	CAGGCGATAA	AGTGAGATTG	GGCGATACAG	900
ACTTGATCGC	TGAAGTAGAA	CATGACTACA	CCATTTATGG	CGAAGAGCTT	AAATTCGGTG	960
GCGGTAAAAC	CCTAAGAGAA	GGCATGAGCC	AATCTAACAA	CCCTAGCAAA	GAAGAGTTGG	1020
ATTTAATTAT	CACTAACGCT	TTAATCGTGG	ATTACACCGG	TATTTATAAA	GCGGATATTG	1080
GTATTAAAGA	TGGCAAAATC	GCTGGCATTG	GTAAAGGCGG	TAACAAAGAC	ATGCAAGATG	1140
GCGTTAAAAA	CAATCTTAGC	GTAGGTCCTG	CTACTGAAGC	CTTAGCCGGT	GAAGGTTTGA	1200
TCGTAACGGC	TGGTGGTATT	GACACACACA	TCCACTTCAT	TTCACCCCAA	CAAATCCCTA	1260
CAGCTTTTGC	AAGCGGTGTA	ACAACCATGA	TTGGTGGTGG	AACCGGTCCT	GCTGATGGCA	1320
CTAATGCGAC	TACTATCACT	CCAGGCAGAA	GAAATTTAAA	ATGGATGCTC	AGAGCGGCTG	1380
AAGAATATTC	TATGAATTTA	GGTTTCTTGG	CTAAAGGTAA	CGCTTCTAAC	GATGCGAGCT	1440
TAGCCGATCA	AATTGAAGCC	GGTGCGATTG	GCTTTAAAAT	TCACGAAGAC	TGGGGCACCA	1500
CTCCTTCTGC	AATCAATCAT	GCGTTAGATG	TTGCGGACAA	ATACGATGTG	CAAGTCGCTA	1560
TCCACACAGA	CACTTTGAAT	GAAGCCGGTT	GTGTAGAAGA	CACTATGGCT	GCTATTGCTG	1620
GACGCACTAT	GCACACTTTC	CACACTGAAG	GCGCTGGCGG	CGGACACGCT	CCTGATATTA	1680
TTAAAGTAGC	CGGTGAACAC	AACATTCTTC	CCGCTTCCAC	TAACCCCACC	ATCCCTTTCA	1740
CCGTGAATAC	AGAAGCAGAG	CACATGGACA	TGCTTATGGT	GTGCCACCAC	TTGGATAAAA	1800
GCATTAAAGA	AGATGTTCAG	TTCGCTGATT	CAAGGATCCG	CCCTCAAACC	ATTGCGGCTG	1860
AAGACACTTT	GCATGACATG	GGGATTTTCT	CAATCACCAG	TTCTGACTCT	CAAGCGATGG	1920
GCCGTGTGGG	TGAAGTTATC	ACTAGAACTT	GGCAAACAGC	TGACAAAAAC	AAGAAAGAAT	1980
TTGGCCGCTT	GAAAGAAGAA	AAAGGCGATA	ACGACAACTT	CAGGATCAAA	CGCTACTTGT	2040

• «

CTAAATACAC	CATTAACCCA	GCGATCGCTC	ATGGGATTAG	CGAGTATGTA	GGTTCAGTAG	2100
AAGTGGGCAA	AGTGGCTGAC	TTGGTATTGT	GGAGTCCAGC	ATTCTTTGGC	GTGAAACCCA	2160
ACATGATCAT	CAAAGGCGGA	TTCATTGCGT	TAAGCCAAAT	GGGCGATGCG	AACGCTTCTA	2220
TCCCTACCCC	ACAACCGGTT	TATTACAGAG	AAATGTTCGC	TCATCATGGT	AAAGCTAAAT	2280
ACGATGCAAA	CATCACTTTT	GTGTCTCAAG	CGGCTTATGA	CAAAGGCATT	AAAGAAGAAT	2340
TAGGACTTGA	AAGACAAGTG	TTGCCGGTAA	AAAATTGCAG	AAATATCACT	AAAAAAGACA	2400
TGCAATTCAA	CGACACTACT	GCTCACATTG	AAGTCAATCC	TGAAACTTAC	CATGTGTTCG	2460
TGGATGGCAA	AGAAGTAACT	TCTAAACCAG	CCAATAAAGT	GAGCTTGGCG	CAACTCTTTA	2520
GCATTTTCTA	GGATTTTTTA	GGAGCAACGC	TTCCTTAAAT	CCTGAATTCG	AGCTCCGTCG	2580
ACAAGCTTGC	GGCCGCACTC	GAGCACCACC	ACCACCACCA	CTGAGATCCG	GCTGCTAACA	2640
AAGCCCGAAA	GGAAGCTGAG	TTGGCTGCTG	CCACCGCTGA	GCAATAACTA	GCATAACCCC	2700
TTGGGGCCTC	TAAACGGGTC	TTGAGGGGTT	TTTTG			2735

SEKV. ID. Č. 2

Met. Lys Leu Thr 1

Pro Lys 5

Glu Leu Asp Lys 10

Leu Met Leu His

Tyr 15

Ala

Gly

Glu

Leu

Ala

Lys

Lys

Arg

Lys

Glu

Lys

Gly

Ile

Lys

Leu

Asn

Tyr

20

25

30

Val

Glu

Ala

Val

Ala

Leu

Ile

Ser

Ala

His

Ile

Met

Glu

Glu

Ala

Arg

35

40

45

Ala

Gly

Lys

Lys

Thr

Ala

Ala

Glu

Leu

Met

Gin

Glu

Gly

Arg

Thr

Leu

50

55

60

Leu

Lys

Pro

Asp

Asp

Val

Met

Asp

Gly

Val

Ala

Ser

Met

Ile

His

Glu

65

70

75

80

Val

Gly

Ile

Glu

Ala

Met

Phe

Pro

Asp

Gly

Thr

Lys

Leu

Val

Thr

Val

85

90

95

His

Thr

Pro

Ile

Glu

Ala

Asn

Gly

Lys

Leu

Val

Pro

Gly

Glu

Leu

Phe

100

105

110

Leu

Lya

Asn

Glu

Asp

Ile

Thr

Ile

Asn

Glu

Gly

Lys

Lys

Ala

Val

Ser

115

120

125

Val

Lya

Val

Lys

Asn

Val

Gly

Asp

Arg

Pro

Val

Gin

Ile

Gly

Ser

His

130

135

140

Phe 145

His

Phe Phe

Glu Val Asn Arg Cys Leu Aep

Phe

Asp

Arg

Glu Lys 160

150

155

Thr

Phe

Gly

Lys

Arg

Leu

Asp

Ile

Ala

Ser

Gly

Thr

Ala

Val

Arg

Phe

165

170

175

Glu

Pro

Gly

Glu

Glu

Lys

Ser

Val

Glu

Leu

Ile

Asp

Ile

Gly

Gly

Αβη

180

185

190

Arg

Arg

Ile

Phe

Gly

Phe

Asn

Ala

Leu

Val

Asp

Arg

Gin

Ala

Asp

Aan

195

200

205

Glu

Ser

Lys

Lys

Ile

Ala

Leu

His

Arg

Ala

Lys

Glu

Arg

Gly

Phe

His

210

215

220

Gly

Ala

Lys

Ser

Asp Asp

Asn

Tyr

Val

Lys

Thr

Ile

Lys

Glu

225

230

235

SEKV. ID. Č. 3

Met Lys Lys 1

Ile

Ser Arg Lys Glu Tyr Val

Ser Met

Tyr Gly

Pro 15

Thr

5

10

Thr

Gly

Aep

Lys 20

Val

Arg

Leu

Gly

Asp 25

Thr

Asp

Leu

Ile

Ala 30

Glu

Val

Glu

His

Asp 35

Tyr

Thr

Ile

Tyr

Gly 40

Glu

Glu

Leu

Lys

Phe 45

Gly Gly Gly

Lys

Thr 50

Leu

Arg

Glu

Gly

Met 55

Ser

Gin

Ser

Asn

Asn 60

Pro

Ser

Lys

Glu

Glu 65

Leu

Asp

Leu

Ile

Ile 70

Thr

Asn

Ala

Leu

Ile 75

Val

Asp

Tyr

Thr

Gly 80

Ile

Tyr

Lys

Ala

Asp 85

Ile

Gly

Ile

Lys

Asp 90

Gly

Lys

Ile

Ala

Gly 95

Ile

Gly

Lys

Gly

Gly 100

Asn

Lys

Asp

Met

Gin 105

Asp

Gly

Val

Lys

Asn 110

Asn

Leu

Ser

Val

Gly 115

Pro

Ala

Thr

Glu

Ala 120

Leu

Ala

Gly

Glu

Gly 125

Leu

Ile

Val

Thr

Ala 130

Gly

Gly

Ile

Asp

Thr 135

His

Ile

His

Phe

Ile 140

Ser

Pro

Gin

Gin

Ile 145

Pro

Thr

Ala

Phe

Ala 150

Ser

Gly

Val

Thr

Thr 155

Met

Ile

Gly

Gly

Gly 160

Thr

Gly

Pro

Ala

Asp 165

Gly

Thr

Asn

Ala

Thr 170

Thr

Ile

Thr

Pro

Gly 175

Arg

Arg

Asn Leu

Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala

Glu Glu

Tyr Ser 190

Met

Asn

180

185

Leu

Gly

Phe 195

Leu

Ala

Lys

Gly

Asn 200

Ala

Ser

Asn

Asp

Ala 205

Ser

Leu

Ala

Asp

Gin 210

Ile

Glu xAla

Gly

Ala 215

Ile

Gly

Phe

Lys

Ile 220

His

Glu

Asp

Trp

Gly 225

Thr

Thr

Pro

Ser

Ala 230

Ile

Asn

His

Ala

Leu 235

Asp

Val

Ala

Asp

Lys 240

Tyr

Asp

Val

Gin

Val 245

Ala

Ile

His

Thr

Asp 250

Thr

Leu

Asn

Glu

Ala 255

Gly

Cys

Val

Glu

Asp 260

Thr

Met

Ala

Ala

Ile 265

Ala

Gly

Arg

Thr

Met 270

His

Thr

Phe

His

Thr 275

Glu

Gly

AXa

Gly

Gly 280

Gly

His

Ala

Pro

Asp 285

Ile

Ile

Lys

Val

Ala 290

Gly

Glu

His

Asn

Ile 295

Leu

Pro

Ala

Ser

Thr 300

Asn

Pro

Thr

Ile

Pro 305

Phe

Thr

Val

Asn

Thr 310

Glu

Ala

Glu

His

Met 315

Asp

Met

Leu

Met

Val 320

Cys

His

His

Leu

Asp 325

Lys

Ser

Ile

Lys

Glu 330

Asp

Val

Gin

Phe

Ala 335

Asp

Ser

Arg

Ile

Arg 340

Pro

Gin

Thr

Ile

Ala 345

Ala

Glu

Asp

Thr

Leu 350

His

Asp

Met

Gly

Ile 355

Phe

Ser

Ile

Thr

Ser 360

Ser

Asp

Ser

Gin

Ala 365

Met

Gly

Arg

Val

Gly 370

Glu

Val

Ile

Thr

Arg 375

Thr

Trp

Gin

Thr

Ala 380

Asp

Lys

Asn

Lys

Lys 385

Glu

Phe

Gly

Arg

Leu 390

Lys

Glu

Glu

Lys

Gly 395

Asp

Asn

Asp

Asn

Phe 400

Arg

Ile

Lys

Arg

Tyr 405

Leu

Ser

Lys

Tyr

Thr 410

Ile

Asn

Pro

Ala

Ile 415

Ala

His

Gly

Ile

Ser 420

Glu

Tyr

Val

Gly

Ser 425

Val

Glu

Val

Gly

Lys 430

Val

Ala

Asp

Leu

Val 435

Leu

Trp

Ser

Pro

Ala 440

Phe

Phe

Gly

Val

Lys 445

Pro

Asn

Met

Ile

Ile 450

Lys

Gly

Gly

Phe

Ile 455

Ala

Leu

Ser

Gin

Met 460

Gly

Asp

Ala

Asn

Ala 465

Ser

Ile

Pro

Thr

Pro 470

Gin

Pro

Val

Tyr

Tyr 475

Arg

Glu

Met

Phe

Ala 480

His

His

Gly

Lys

Ala 485

Lys

Tyr

Asp

Ala

Asn 490

Ile

Thr

Phe

Val

Ser 495

Gin

Ala

Ala

Tyr

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys

Glu

Glu

Leu

Gly

Leu

Glu

Arg

Gin

500 505 510

Val	Leu	Pro 515	Val	Lys	Asn	Cys	Arg 520
Phe	Asn 530	Asp	Thr	Thr	Ala	His 535	Ile
Val 545	Phe	Val	Asp	Gly	Lys 550	Glu	Val
Ser	Leu	Ala	Gin	Leu 565	Phe

Asn	Ile	Thr	Lys	Lys 525	Asp	Met	Gin
Glu	Val	Asn	Pro 540	Glu	Thr	Tyr	His
Thr	Ser	Lys 555	Pro	Ala	Asn	Lys	Val 560

SEKV. ID. Č. 4

CGGGATCCAC CTTGATTGCG TTATGTCT

SEKV. ID. Č. 5

CGGAATTCAG GATTTAAGGA AGCGTTG

SEKV. ID. Č. 6

ATGATAAAAA	AGAATAGAAC	GCTGTTTCTT	AGTCTAGCCC	TTTGCGCTAG	CATAAGTTAT	60
GCCGAAGATG	ATGGAGGGTT	TTTCACCGTC	GGTTATCAGC	TCGGGCAAGT	CATGCAAGAT	120
GTCCAAAACC	CAGGCGGCGC	TAAAAGCGAC	GAACTCGCCA	GAGAGCTTAA	CGCTGATGTA	180
ACGAACAACA	TTTTAAACAA	CAACACCGGA	GGCAACATCG	CAGGGGCGTT	GAGTAACGCT	240
TTCTCCCAAT	ACCTTTATTC	GCTTTTAGGG	GCTTACCCCA	CAAAACTCAA	TGGTAGCGAT	300
GTGTCTGCGA	ACGCTCTTTT	AAGTGGTGCG	GTAGGCTCTG	GGACTTGTGC	GGCTGCAGGG	360

- 67 • · · · · ·

ACGGCTGGTG	GCACTTCTCT	TAACACTCAA	AGCACTTGCA	CCGTTGCGGG	CTATTACTGG	420
CTCCCTAGCT	TGACTGACAG	GATTTTAAGC	ACGATCGGCA	GCCAGACTAA	CTAGGGCACG	480
AACACCAATT	TCCCCAACAT	GCAACAACAG	CTCACCTACT	TGAATGCGGG	GAATGTGTTT	540
TTTAATGCGA	TGAATAAGGC	TTTAGAGAAT	AAGAATGGAA	CTAGTAGTGC	TAGTGGAACT	600
AGTGGTGCGA	CTGGTTCAGA	TGGTCAAACT	TACTCCACAC	AAGCTATCCA	ATACCTTCAA	660
GGCCAACAAA	ATATCTTAAA	TAACGCAGCG	AACTTGCTCA	AGCAAGATGA	ATTGCTCTTA	720
GAAGCTTTCA	ACTCTGCCGT	AGCCGCCAAC	ATTGGGAATA	AGGAATTCAA	TTCAGCCGCT	780
TTTACAGGTT	TGGTGCAAGG	CATTATTGAT	CAATCTCAAG	CGGTTTATAA	CGAGCTCACT	840
AAAAACACCA	TTAGCGGGAG	TGCGGTTATT	AGCGCTGGGA	TAAACTCCAA	CCAAGCTAAC	900
GCTGTGCAAG	GGCGCGCTAG	TCAGCTCCCT	AACGCTCTTT	ATAACGCGCA	AGTAACTTTG	960
GATAAAATCA	ATGCGCTCAA	TAATCAAGTG	AGAAGCATGC	CTTACTTGCC	CCAATTCAGA	1020
GCCGGGAACA	GCCGTTCAAC	GAATATTTTA	AACGGGTTTT	ACACCAAAAT	AGGCTATAAG	1080
CAATTCTTCG	GGAAGAAAAG	GAATATCGGT	TTGCGCTATT	ATGGTTTCTT	TTCTTATAAC	1140
GGAGCGAGCG	TGGGCTTTAG	ATCCACTCAA	AATAATGTAG	GGTTATACAC	TTATGGGGTG	1200
GGGACTGATG	TGTTGTATAA	CATCTTTAGC	CGCTCCTATC	AAAACCGCTC	TGTGGATATG	1260
GGCTTTTTTA	GCGGTATCCA	ATTAGCCGGT	GAGACCTTCC	AATCCACGCT	CAGAGATGAC	1320
CCCAATGTGA	AATTGCATGG	GAAAATCAAT	AACACGCACT	TCCAGTTCCT	CTTTGACTTC	1380
GGTATGAGGA	TGAACTTCGG	TAAGTTGGAC	GGGAAATCCA	ACCGCCACAA	CCAGCACACG	1440
GTGGAATTTG	GCGTAGTGGT	GCCTACGATT	TATAACACTT	ATTACAAATC	AGCAGGGACT	1500
ACCGTGAAGT	ATTTCCGTCC	TTATAGCGTT	TATTGGTCTT	ATGGGTATTC	ATTCTAA	1557

SEKV. ID. Č. 7

Met 1

Ile

Lys

Lys

Asn 5

Arg

Thr

Leu

Phe

Leu 10

Ser

Leu

Ala

Leu

Cys 15

Ala

Ser

Ile

Ser

Tyr 20

Ala

Glu

Asp

Asp

Gly 25

Gly

Phe

Phe

Thr

Val 30

Gly

Tyr

Gin

Leu

Gly

Gin

Val

Met

Gin

Asp

Val

Gin

Asn

Pro

Gly

Gly

Ala

Lys

40 45

Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Αβπ Ile 50 55 60 ·· c·»·

Leu Asn 65

Asn

Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly

Ala Leu

Ser

Asn

Ala 80

70

75

Phe

Ser

Gin

Tyr

Leu 85

Tyr

Ser

Leu

Leu

Gly 90

Ala

Tyr

Pro

Thr

Lys 95

Leu

Asn

Gly

Ser

Aep 100

Val

Ser

Ala

Asn

Ala 105

Leu

Leu

Ser

Gly

Ala 110

Val

Gly

Ser

Gly

Thr 115

Cys

Ala

Ala

Ala

Gly 120

Thr

Ala

Gly

Gly

Thr 125

Ser

Leu

Asn

Thr

Gin 130

Ser

Thr

Cys

Thr

Val 135

Ala

Gly

Tyr

Tyr

Trp 140

Leu

Pro

Ser

Leu

Thr 145

Asp

Arg

Ile

Leu

Ser 150

Thr

Ile

Gly

Ser

Gin 155

Thr

Asn

Tyr

Gly

Thr 160

Asn

Thr

Asn

Phe

Pro 165

Asn

Met

Gin

Gin

Gin 170

Leu

Thr Tyr

Leu

Asn 175

Ala

Gly

Asn

Val

Phe 180

Phe

Asn

Ala

Met

Asn 185

Lys

Ala

Leu

Glu

Asn 190

Lys

Asn

Gly

Thr

Ser 195

Ser

Ala

Ser

Gly

Thr 200

Ser

Gly

Ala

Thr

Gly 205

Ser

Asp

Gly

Gin

Thr 210

Tyr

Ser

Thr

Gin

Ala 215

Ile

Gin

Tyr

Leu

Gin 220

Gly

Gin

Gin

Asn

Ile 225

Leu

Asn

Asn

Ala

Ala 230

Asn

Leu

Leu

Lys

Gin 235

Asp

Glu

Leu

Leu

Leu 240

Glu

Ala

Phe

Asn

Ser 245

Ala

Val

Ala

Ala

Asn 250

Ile

Gly

Asn

Lys

Glu 255

Phe

Asn

Ser

Ala

Ala 260

Phe

Thr

Gly

Leu

Val 265

Gin

Gly

Ile

Ile

Asp 270

Gin

Ser

Gin

Ala

Val 275

Tyr

Asn

Glu

Leu

Thr 280

Lys

Asn

Thr

Ile

Ser 285

Gly

Ser

Ala

Val

Ile 290

Ser

Ala

Gly

Ile

Asn 295

Ser

Asn

Gin

Ala

Asn 300

Ala

Val

Gin

Gly

Arg 305

Ala

Ser

Gin

Leu

Pro 310

Asn

Ala

Leu

Tyr

Asn 315

Ala

Gin

Val

Thr

Leu 320

Asp

Lys

Ile

Asn

Ala 325

Leu

Asn

Asn

Gin

Val 330

Arg

Ser

Met

Pro

Tyr 335

Leu

Pro

Gin

Phe

Arg 340

Ala

Gly

Asn

Ser

Arg 345

Ser

Thr

Asn

Ile

Leu 350

Asn

Gly

Phe

Tyr

Thr 355

Lys

Ile

Gly

Tyr

Lys 360

Gin

Phe

Phe

Gly

Lys 365

Lys

Arg

Asn

Ile

Gly 370

Leu

Arg

Tyr

Tyr

Gly 375

Phe

Phe

Ser

Tyr

Asn 380

Gly

Ala

Ser

Val

Gly 385

Phe

Arg

Ser

Thr

Gin 390

Asn

Asn

Val

Gly

Leu 395

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Val 400

• · • · • · · · • «>

Glv Thr Asp Val Leu

Tyr

Asn

Ile

Phe

Ser Arg Ser Tyr Gin Asn Arg

405

410

415

Ser

Val

Asp

Met

Gly

Phe

Phe

Ser

Gly

I.le

Gin

Leu

Ala

Gly

Glu

Thr

420

425

430

Phe

Gin

Ser

Thr

Leu

Arg

Asp

Asp

Pro

Asn

Val

Lys

Leu

His

Gly

Lys

435

440

445

Her

Aen

Aen

Thr

His

Phe

Gin

Phe

Leu

Phe

Asp

Phe

Gly

Met

Arg

Met

450

455

460

Asn

Phe

Gly

Lys

Leu

Asp

Gly

LyB

Ser

Asn

Arg

His

Asn

Gin

His

Thr

465

470

475

480

Val

Glu

Phe

Gly

Val

Val

Val

Pro

Thr

Ile

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Lys

485

490

495

Ser

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

LyB

Tyr

Phe

Arg

Pro

Tyr

Ser

Val

Tyr

Trp

500

505

510

Ser

Tyr

Gly

Tyr

Ser

Phe

515

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vakcína k vyvolání imunitní odezvy k Helicobacter u pacienta vyznačující se tím, že obsahuje:

   a) multimerní komplexy rekombinantní, enzymaticky inaktivní ureasy Helicobacter,

   b) farmaceuticky přijatelný nosič a zředovadlo.
2. 2. Vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje multimerní komplex sestávající z osmi A podjednotek ureasy a osmi B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající z šesti A podjednotek ureasy a šesti B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající ze čtyř A podjednotek ureasy a čtyř B podjednotek ureasy, nebo jejich kombinace.
3. 3. Vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje multimerní komplex sestávající z osmi A podjednotek ureasy a osmi B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající z šesti A podjednotek ureasy a šesti B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající ze čtyř A podjednotek ureasy a čtyř B podjednotek ureasy.
4. 4. Vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále obsahuje mukosální adjuvans.
5. 5. Vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je termolabilní enterotoxin enterotoxigenní Escherichia coli, choleratoxin, toxin Clostriditm difficile, jejich podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale stále mají aktivitu adjuvans, nebo jejich směs.

   • ·
6. 6. Vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je termolabilní enterotoxin enterotoxigenní Escherichia coli, choleratoxin, toxin Clostridium difficile, jejich podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale zachovávají si aktivitu adjuvans.
7. 7. Vakcína podle nároku 4 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je choleratoxin, nebo jeho podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale zachovávají si aktivitu adjuvans.
8. 8. Vakcína podle nároku 4 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je toxin Clostridium difficile, nebo jeho podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale zachovávají si aktivitu adjuvans.
9. 9. Vakcína podle nároku 8 vyznačující se tím, že řečené mukosální adjuvans obsahuje cukr-vážící doménu A toxinu Clostridium difficile.
10. 10. Vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že řečené multimerní komplexy rekombinantní, enzymaticky inaktivní ureasy Helicobacter jsou lyofilizovány.
11. 11. Vakcína podle nároku 1 vyznačující se tím, že řečenou ureasou Helicobacter je ureasa Helicobacter pylori.
12. 12. Prostředek k léčbě gastroduodendální infekce u pacienta, vyznačující se tím, že obsahuje a) antigen gastroduodendálního patogenu a b) antibiotikum, antisekretorní činidlo, sůl vizmutu nebo jejich kombinaci.
13. 13. Prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že řečený patogen je Helicobacter.

    • ·

    14. Prostředek podle nároku 13 vyznač u j í c í s e t í m , že řečený Helicobacter je Hel icobacter pylori. 15. Prostředek podle nároku 13 v y z nač u j í c í s e t í m , že řečený antigen je ureasa. 16. Prostředek podle nároku 13 v y z nač u j í c í s e t í m , že řečený antigen obsahuje multimerní komplexy

    rekombinantní, enzymaticky inaktivní ureasy Helicobacter.
14. 17. Prostředek podle nároku 13 vyznačující se tím, že obsahuje multimerní komplex sestávající z osmi A podjednotek ureasy a osmi B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající z šesti A podjednotek ureasy a šesti B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající ze čtyř A podjednotek ureasy a čtyř B podjednotek ureasy, nebo jejich kombinace.
15. 18. Prostředek podle nároku 13 vyznačující se tím, že obsahuje multimerní komplex sestávající z osmi A podjednotek ureasy a osmi B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající z šesti A podjednotek ureasy a šesti B podjednotek ureasy, multimerní komplex, sestávající ze čtyř A podjednotek ureasy a čtyř B podjednotek ureasy.
16. 19. Prostředek podle nároku 12 tím, že řečenou infekcí Helicobacter pylori.
17. 20. Prostředek podle nároku 12 tím, že dále obsahuje mukosální vyznačující se Helicobacter je infekce vyznačující se adjuvans.
18. 21. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je termolabilní enterotoxin enterotoxigenní Escherichia coli, choleratoxin, toxin Clostridium difficile, jejich podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale stále mají aktivitu adjuvans, nebo jejich směs.
19. 22. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je termolabilní enterotoxin enterotoxigenní Escherichia coli, choleratoxin, toxin Clostridium difficile, jejich podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale stále mají aktivitu adjuvans.
20. 23. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je choleratoxin, nebo jeho podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale stále mají aktivitu adjuvans.
21. 24. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že řečeným mukosálním adjuvans je toxin Clostridium difficile, nebo jeho podjednotka nebo derivát, jež nejsou toxické, ale stále mají aktivitu adjuvans.
22. 25. Prostředek podle nároku 24 vyznačující se tím, že řečené mukosální adjuvans obsahuje cukr-vážíci doménu A toxinu Clostridium difficile.
23. 26. Prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že řečené antibiotikum je vybráno ze skupiny sestávající z amoxicillinu, klarithromycinu, tetracyklinu, metronidizolu a erythromycinu.
24. 27. Prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že řečené sůl vizmutu je vybrána ze skupiny sestávající ze subcitrátu vizmutu a subsalicylátu vizmutu.

    • w • ·
25. 28. Prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že řečeným antisekretorním činidlem je inhibitor protonové pumpy.
26. 29. Prostředek podle nároku 28 vyznačující se tím, že řečený inhibitor protonové pumpy je vybrán ze skupiny sestávající z omeprazolu, lansoprazolu a pantoprazolu.
27. 30. Prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že řečeným antisekretorním činidlem je antagonista H₂-receptoru.
28. 31. Prostředek podle nároku 30 vyznačující se tím, že řečený antagonista H₂~receptoru je vybrán ze skupiny sestávající z ranitidinu, cimetidinu, famotidinu, nizatidinu a roxatidinu.

    32. Prostředek podle nároku 12 vyznačující se tím, že řečeným prostaglandinu. antisekretorním činidlem je analog 3 3. Prostředek podle nároku 32 v y z n a č u j í c í se

    t í m , že řečeným analogem prostaglandinu je misoprostil nebo enprostil.