KR20030084904A - 헬리코박터 단백질, 핵산 및 그의 용도 - Google Patents

헬리코박터 단백질, 핵산 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 HP30 또는 HP56 폴리펩티드, 이로부터 유도된 폴리펩티드(HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드), 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 상기 HP30, HP56, HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 및 HP30, HP56, HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드에 특이적인 T 세포를 개시한다. 또한 HP30, HP56, HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드, 상기를 암호화하는 핵산, 또는 이에 대한 항체를 포함하는 면역원 조성물, 예를 들어 백신을 포함한 예방 또는 치료 조성물을 개시한다. 본 발명은 또한 동물에서 헬리코박터 세포 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 개시한다.

Description

헬리코박터 단백질, 핵산 및 그의 용도{HELICOBACTER PROTEINS, NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF}
본 출원은 2000년 12월 7일자로 출원된 출원 제 09/732,091 호의 일부 계속 출원이며, 이의 내용은 본 발명에 참고로 인용되어 있다.
헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)는 만성 위염 환자의 위 생검으로부터 1982년에 최초로 단리된, 곡선모양의 미호기성 그람 음성 세균이다(Warren et al., 1983, Lancet:1273). 원래의 이름은 캄필로박터 파이로리(Campylobacter pylori)로, 헬리코박터라 명명하는 별도의 속의 일부인 것으로 인식되었었다(Goodwin et al. Int. J. Syst. Bacteriol., 1989, 39:397).
상기 세균은 인간의 위 점막에 군체를 형성하여 10년간 감염을 지속시킬 수 있다. 에이치 파이로리에 의한 감염은 전 세계적으로 가장 만연해 있는 감염들 중 하나로, 선진국에서는 성인의 약 50%가, 개발 도상국에서는 주민의 90% 이상의 감염되어 있다. 에이치 파이로리에 의한 만성 감염은 B형 위염, 펩티드 궤양, 위암, 예를 들어 선암 및 저 등급 B 세포 림프종의 원인이거나 보조인자인 것을 여겨진다(Blaser, 1987, Gastroenterology 93:371; Dooleye et al., 1989, New Eng. J. Med. 321:1562; Personnet et al., 1991, New Engl. J. Med. 325:1127).
에이치 파이로리는 경구 경로로 전염되는 것으로 여겨지며 나이에 따라 감염 위험성이 증가한다(Graham et al., 1991, Gastroenterology 100:1495). 선진국에서, II 형 파이로리 항원에 대한 항체의 존재는 30 세 및 60 세의 사람들에서 각각 20% 미만에서 50% 이상으로 증가한다(Jones et al., 1986, Med. Microbiol 22:57). 개발 도상국에서는 인구의 80% 이상이 이미 20세 이전에 감염된다(Graham et al., 1991, Digestive Diseases and Sciences 36:1084).
에이치 파이로리의 독성 인자의 성질 및 역할에 대한 이해는 여전히 불충분하다. 지금까지 확인된 인자들로는 추정 상 점액 층을 가로질러 이동하는데 필요한 편모, 위의 산성 환경을 중화시키고 초기 군락 형성을 허용하는데 필요한 우레아제, 및 진핵 상피 세포에서 액포를 형성시키는 87 Kda의 분자량을 갖는 단량체들에 의해 형성되고 질병과 관련된 에이치 파이로리 균주에 의해 생산되는 고 분자량 세포독성 단백질이 있다(Leying et al. Mol. Microbiol., 1992, 6:2863; Cussac et al., 1992, J. Bacterol. 174:2466; Perez-Perez et al., 1992, J. Infect. Immunol. 60:3658; Cover et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10570).
다수의 치료제들을 현재 생체 외에서 에이치 파이로리 감염을 근절하는데 이용할 수 있다(Hopkins et al., 1994, Am. J. Med97:265). 그러나, 이들 치료제들 중 다수는 세균 내성, 변경된 약물 분배, 환자 비 순응성 또는 불충분한 약물 유용성으로 인해 생체 내 효력이 부분적으로 최적이다(상기 Hopkins et al.). 항생제를 비스무스와 복합 투여하는 것은 에이치 파이로리 감염의 치료에 사용되는 표준 섭생의 일부를 형성한다(Malfertheiner et al., 1993, Clinical Therapeutics 15: Supp. B 37-48). 최근의 양자 펌프 억제제와 단일 항생제의 조합은 십이지장 궤양 질환을 개선시키는 것으로 나타났다(상기 Malfertheiner et al.). 면역화를 통한 에이치 파이로리 감염의 예방과 치료는 약물 요법의 고 비용, 항생제 내성 균주의 출현 및 재 감염을 방지하기 위한 약물 요법의 실패를 고려할 때 바람직하다.
우레아제, 열 충격 단백질 및 카탈라제를 포함한 에이치 파이로리 단백질에 의한 면역화로, 에이치 파이로리에 대해서는 면역 반응을 일으키지만, 에이치 파이로리 접종 시 군락 형성을 방지하지 않는 백신이 생성되었다(Solnick et al., 2000, Infection and Immunol. 68:2560). 따라서, 다른 항원(들)에 대한 면역 반응을 유도함으로써 에이치 파이로리 감염을 예방 또는 치료하는 백신의 개발에 대한 필요성이 여전히 남아있다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 목적은 헬리코박터로부터 HP56 및 HP30 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 보다 특히, 본 발명은 헬리코박터 파이로리의 HP56 및 HP30 폴리펩티드뿐만 아니라 이들 폴리펩티드의 단편을 포함하며, 이때 상기 폴리펩티드들은각각 약 56 및 30 kDa의 분자량을 갖고, 단리되거나 재조합체 형태로 서열 식별 번호: 2(HP56) 또는 서열 식별 번호: 4 또는 48(HP30)의 추론된 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명은 단리되거나 정제된 HP30 및 HP56 폴리펩티드, 이들로부터 유도된 폴리펩티드(HP30-유도 및 HP56-유도된 폴리펩티드, 예를 들어 비 제한적으로 HP-30 및 HP-56의 단편들을 포함한다), 및 상기 폴리펩티드와 유도된 폴리펩티드의 제조 방법을 포함한다.
바람직하게는, 상기 HP56 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열 식별 번호: 2와 거의 같다. 상기 폴리펩티드의 바람직한 단편은 서열 식별 번호: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15를 포함한다.
바람직하게는, 상기 HP30 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 4 또는48에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열 식별 번호: 4와 거의 같다. 상기 폴리펩티드의 바람직한 단편은 서열 식별 번호: 16, 17, 18, 19 또는 20을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 B 및/또는 T 세포 자극 활성을 갖는 에이치 파이로리 융합 펩티드, 바람직하게는 상기 폴리펩티드 부분들의 천연 구성과 상이한 구성으로 배열된 상기 에이치 파이로리 또는 상이한 에이치 파이로리 폴리펩티드로부터 유도된 2 개 이상의 T 또는 B 세포 에피토프를 포함하는 상기 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 2 개 이상의 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드이며, 상기 펩티드들은 각각 서열 식별 번호: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 서열 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지나, 단 상기 융합 폴리펩티드의 펩티드들은 HP30 또는 HP56의 천연 구성과 상이한 구성으로 배열된다.
바람직하게는, 본 발명의 HP30- 또는 HP56-유도된 폴리펩티드는 상기가 유도되고 동물에서 에이치 파이로리에 대한 면역 반응을 유도해낼 수 있는 에이치 파이로리 펩티드/단백질과 면역학적으로 교차 반응성이다. 본 발명의 바람직한 HP30- 또는 HP60- 유도된 폴리펩티드는 IgM, IgG, IgA, IgE 항체, 지연된 과민성 T 세포 반응 및/또는 에이치 파이로리 항원을 발현하는 세포(비 제한적으로, 항원 제공 세포, 예를 들어 대식세포, 수지상 세포, B 세포, 또는 에이치 파이로리 항원을 나타내는 합성 항원 제공 세포 포함), 상기 폴리펩티드가 유도된 HP30 또는 HP56 단백질, 에이치 파이로리 세포 또는 에이치 파이로리 세포 용해물에 대한 세포독성 T 세포 반응을 유도한다.
본 발명은 또한 항혈청 및 항체, 예를 들어 비 제한적으로 HP30 또는 HP56 폴리펩티드, HP30- 또는 HP56-유도된 폴리펩티드 및/또는 그의 단편과 결합하고 이들에 특이적인 중화, 세포독성 또는 살균성의 다클론 또는 단클론 항체이다.
바람직하게는, 상기 항체들은 서열 식별 번호: 2(HP56) 또는 4 또는 48(HP30)의 아미노산 서열을 갖는 HP56 또는 HP30 폴리펩티드와 결합한다. 또한 HP30- 또는 HP56-유도된 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 다클론 또는 단클론 항체, 예를 들어 비 제한적으로 서열 식별 번호: 2, 4, 5-20 및 48 중 임의의 것과 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 포함된다. 또한 다클론 또는 단클론 항체들의 항원 결합 단편들, 즉 Fv, Fab, Fab'F(ab')2 단편들이 포함된다. 본 발명의 추가의 태양은 상기 항-HP30 또는 HP56 항체의 항원 결합 부분들 중 하나 이상이 이종(예를 들어 인간) 항체의 하부구조내에 도입된 키메릭 또는 인간화된 항체이다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 항원 또는 면역원 조성물(들)에 대해 야기된 T 세포, 또는 본 발명의 항원 또는 면역원 폴리펩티드 또는 에이치 파이로리 항원을 발현하는 세포(예를 들어 비 제한적으로 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 제공하는 항원 제공 세포, 예를 들어 수지상 세포, B 세포, 또는 합성 항원 제공 세포), 에이치 파이로리 세포 또는 에이치 파이로리 세포 용해물에 대해 특이적인 T 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HP30 또는 HP56 폴리펩티드, HP56-유도된 폴리펩티드, HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자(DNA 또는 RNA), 상기 핵산 분자를 갖는 벡터, 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포, 이로부터 생성된 재조합 폴리펩티드, 및 상기 핵산 분자, 벡터 및 세포의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 암호화된 HP56 또는 HP30 단백질 또는 폴리펩티드가 서열 식별 번호: 2, 4, 5-20 및 48 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 핵산 서열이 바람직하다. 또한, 서열 식별 번호: 1 및 3, 및 이들의 상보 서열 중 임의의 것의 DNA 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 서열 식별 번호: 1, 3 및 47, 및 이들의 상보 서열 중 임의의 것의 핵산 서열을 갖는 DNA 서열의 단편; 및 상술한 서열들 중 임의의 한 서열과 엄격한 조건 하에서 하이브리드를 형성하는 핵산 분자가 포함된다. 상기 엄격한 조건 하에서 하이브리드를 형성하는 핵산은 바람직하게는 상기 식별된 임의의 서열들과 약 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%, 보다 바람직하게는 90%의 서열 상동성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 HP30, HP56, HP30- 및 HP56-유도된 폴리펩티드 중 하나 이상을 임의로 하나 이상의 다른 성분(들), 예를 들어 지질, 인지질, 피로다당류를 포함하는 탄수화물, 당해 분야의 숙련가들에게 공지되거나 새로운 임의의 단백질(들), 불활성화된 전체 또는 감독된 유기체, 예를 들어 비 제한적으로 임의의 바이러스(들), 효모(들), 진균 및 세균, 예를 들어 비 제한적으로 캄필로박터 스페시즈, 시겔라 스페시즈, 장 병을 일으키는 이 콜라이 스페시즈, 비브리오 콜레라 또는 로타바이러스와 함께 포함하는, 백신을 포함한 면역원 조성물일 수 있는 예방 또는 치료 조성물을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 HP30, HP56 폴리펩티드, HP30- 및 HP56-유도된 폴리펩티드 및 감독되거나 불활성화된 에이치 파이로리, 또는 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 야생형 에이치 파이로리에 비해 보다 많은 양으로 발현하는 감독되거나 불활성화된 에이치 파이로리 배양종 중 하나 이상을 포함하는, 백신을 포함한 면역원 조성물일 수 있는 예방 또는 치료 조성물을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 에이치 파이로리 감염을 탐지하거나 이에치 파이로리 또는 에이치 펠리스에 의한 감염과 관련된 질병 또는 질환을 예방, 치료 또는 그의 중증도를 감소시키기 위한 방법에 사용될 수 있는 본 발명의 HP30, HP56 폴리펩티드,HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 상기와 같은 조성물은 비 제한적으로 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 재조합 숙주 세포 또는 숙주를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 언급한 태양들 중 임의의 하나 이상, 예를 들어 고유 HP30 또는 HP56 단백질, 재조합 HP30 또는 HP56 단백질, HP30-유도되거나 또는 HP56-유도된 폴리펩티드, 핵산 분자, 면역원 조성물, 항원 조성물, 항혈청, T 세포, 항체, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 포함할 수 있는 진단 시약을 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 시험 샘플 중의 HP30 또는 HP56 단백질 또는 HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 존재를 측정하기 위한 방법, HP30 또는 HP56 단백질 또는 HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 존재를 측정하기 위한 진단 키트 및 시약을 제공한다.
본 발명은 또한 헬리코박터 스페시즈에 대한 면역 반응을 유도하는 방법, 및 유효량의 본 발명의 약학 또는 백신 조성물을 투여함을 포함하는, 헬리코박터와 관련된 질환 또는 질병의 치료가 필요한 포유동물에서 상기 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법을 포함한다. 바람직한 질환 또는 질병으로는 B형 위염, 펩티드 궤양, 위암, 예를 들어 선암 및 저 등급 B 세포 림프종이 있다. 본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 "치료"라는 용어는 존재하는 유기체 또는 다수의 유기체들에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 유발된 질병 증상의 중증도를 제거 또는 감소시키거나 상기 증상을 개선시킴을 포함한다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 활성 또는 발현을 억제 또는 향상시키는 작용물질 또는 길항물질이다. 세균 발육 저지 또는 살균 작용물질 또는 길항물질이 바람직하다.
본 발명의 추가의 태양은 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 포함하는 조성물과 선별하려는 화합물을 상기 화합물과 상기 폴리펩티드 EH는 핵산 분자간의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 접촉시켜 화합물의 상호작용을 평가함을 포함하는, 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자와 상호작용하고 이들의 활성을 억제 또는 활성화하는 화합물을 식별하는 방법이다. 상기 화합물과 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자와의 상호작용을, 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자와 상기 화합물과의 상호작용에 반응하여 검출 가능한 신호를 제공할 수 있는 제 2 성분(예를 들어 항체)과의 회합에 의해; 상기 화합물과 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자와의 상호작용으로부터 발생되는 신호의 존재 또는 부재를 측정함으로써 측정한다. 한편으로, 상기 화합물과 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자와의 상호작용을 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 활성을 억제하는 상기 화합물의 능력에 의해 측정한다.
1. 약어
항-HP30 = HP30 폴리펩티드 항체 또는 항혈청
항-HP56 = HP56 폴리펩티드 항체 또는 항혈청
ATCC = 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션
kD 또는 kDa = 킬로달톤
PBS = 인산염 완충 염수
PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
폴리펩티드 = 바람직하게는 8 개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 임의의 길이의 펩티드
SDS = 나트륨 도데실설페이트
SDS-PAGE = 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
본 원에 정의된 뉴클레오티드 또는 핵산 서열을 하기와 같이 염기에 대한 1 자 기호로 나타낸다:
A(아데닌)
C(시토신)
G(구아닌)
T(티민)
U(우라실)
M(A 또는 C)
R(A 또는 G)
W(A 또는 T/U)
S(C 또는 G)
Y(C 또는 T/U)
K(G 또는 T/U)
V(A 또는 C 또는 G; T/U는 아님)
H(A 또는 C 또는 T/U; G는 아님)
D(A 또는 G 또는 T/U; C는 아님)
B(C 또는 G 또는 T/U; A는 아님)
N(A 또는 C 또는 G 또는 T/U) 또는 (미지의 것)
본 원에 정의된 펩티드 및 폴리펩티드 서열을 하기와 같이 아미노산 잔기에 대한 1 자 기호로 나타낸다:
A(알라닌)
R(아르기닌)
N(아스파라긴)
D(아스파르트산)
C(시스테인)
Q(글루타민)
E(글루탐산)
G(글리신)
H(히스티딘)
I(이소류신)
L(류신)
K(리신)
M(메티오닌)
F(페닐알라닌)
P(프롤린)
S(세린)
T(Tm레오닌)
W(트립토판)
Y(티로신)
V(발린)
X(미지의 것)
본 발명을 하기 본 발명의 상세한 설명, 본 발명의 특정 실시태양에 대한 비 제한적인 실시예 및 첨부된 도면을 참고로 보다 충분히 이해할 수 있다.
본 발명은 특정한 헬리코박터 종 단백질, 및 진단 및 백신용으로 사용하기 위한 이들 단백질의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HP56 계열 및 HP30의 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질과 특이적으로 반응하는 세포독성 및 중화 항체를 포함한 항체들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 단백질에 특이적인 T 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 헬리코박터 파이로리 감염과 관련된 포유동물의 질환을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법, 및 헬리코박터 파이로리에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 암호화하는 단리된 뉴클레오티드 서열 및 변성 서열, 상기 서열들을 함유하는 벡터, 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 진단 방법 및 키트가 또한 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명 단백질의 활성에 대한 물질의 효과를 평가함으로써, 상기 물질의 항균 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시태양들에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 선별하려는 화합물을 상기 화합물과 상기 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드간의 결합을 허용하거나 또는 다른 상호작용을 허용하는 조건 하에서 접촉시키고, 상기 화합물이 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 결합하는지 혹은 달리 상호 작용하는 지와, 상기의 활성을 활성화시키는지 혹은 억제하는지를 측정함을 포함하는, 상기 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 결합하거나, 또는 상기의 활성을 달리 억제 또는 활성화시키는 화합물을 식별하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 예를 들어 이 콜라이에서 발현될 수 있는, "M15(PRE4)PQE/HP30" 또는 보다 간단히 "PQE/Hp30"으로 나타내는, 에이치 파이로리 HP30 발현 플라스미드의 도식적인 지도이다. 예에서, 상기 에이치 파이로리 단백질은 이 콜라이에서 MRGS-(H)6GS 도메인을 수반하는 융합 단백질로서 발현된다. 전형적으로 발현된 재조합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산의 서열들을 서열 식별 번호: 44 및 43 및 46 및 45로 나타낸다. 이 콜라이 M15(PRE4)PQE/HP30에 의해 발현된 단백질의 처음 12 개 아미노산 잔기는 벡터에 의해 제공되며 6X HIS 도메인, BamHI 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 상기 도식적 지도의 마지막 9 개 핵산잔기들은 벡터의 정지 코돈(*)과 Sal I 부위에 상응한다.
도 2는 예를 들어 이 콜라이에서 발현될 수 있는, "M15(PRE4)PQE/HP56" 또는 보다 간단히 "PQE/Hp56"으로 나타내는, 에이치 파이로리 HP56 발현 플라스미드의 도식적인 지도이다. 예에서, 상기 에이치 파이로리 단백질은 이 콜라이에서 MRGS-(H)6GS 도메인을 수반하는 융합 단백질로서 발현된다. 발현된 재조합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산의 서열들을 서열 식별 번호: 42 및 41로 나타낸다. 상기 발현된 단백질의 처음 12 개 아미노산 잔기는 벡터에 의해 제공되며 6X HIS 도메인, BamHI 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 상기 도식적 지도의 마지막 9 개 핵산 잔기들은 벡터의 정지 코돈과 Sal I 부위에 상응한다.
도 3은 이 콜라이 M15(PRE4)PQE/HP30으로부터 발현된 겔-정제된 에이치 파이로리 HP30 단백질의 웨스턴 블럿이다. 레인 1은 분자량 마커(Novex MultiMark); 레인 2는 유도되지 않은 세포; 레인 3 및 4는 IPTG 유도된 세포를 나타낸다. HP30은 화살표로 나타낸다. 분자량 마커(레인 1)는 미오신(∼250 kDa), 포스포릴라제 B(∼148 kDa), GDH(∼60 kDa), CAH(∼42 kDa), 미오글로빈-블루(∼30 kDa), 미오글로빈-레드(∼22 kDa), 리소자임(∼17 kDa), 아프로티닌(∼6 kDa) 및 인슐린(∼6 kDa)이다.
도 4는 이 콜라이에서 M15(PRE4)PQE/HP30 플라스미드로부터 발현된 겔-정제된 에이치 파이로리 HP30 재조합 단백질의 쿠마씨 블루 염색된 SDS-Gel이다. 상기단백질은 30kDa 단백질로서 이동한다. 레인 1은 분자량 마커(Novex MultiMark); 레인 2는 IPTG 유도된 세포를 나타낸다. HP30은 화살표로 나타낸다. 분자량 마커(레인 1)는 미오신(∼250 kDa), 포스포릴라제 B(∼148 kDa), GDH(∼60 kDa), CAH(∼42 kDa), 미오글로빈-블루(∼30 kDa), 미오글로빈-레드(∼22 kDa), 리소자임(∼17 kDa), 아프로티닌(∼6 kDa) 및 인슐린(∼6 kDa)이다.
도 5는 이 콜라이 M15(PRE4)PQE/HP56으로부터 발현된 겔-정제된 에이치 파이로리 HP56 재조합 단백질의 웨스턴 블럿이다. 레인 1 및 2는 IPTG 유도된 세포이다. 레인 3은 분자량 마커(Novex MultiMark)이다. HP56은 화살표로 나타낸다. 분자량 마커(레인 1)는 미오신(∼250 kDa), 포스포릴라제 B(∼148 kDa), GDH(∼60 kDa), CAH(∼42 kDa), 미오글로빈-블루(∼30 kDa), 미오글로빈-레드(∼22 kDa), 리소자임(∼17 kDa), 아프로티닌(∼6 kDa) 및 인슐린(∼6 kDa)이다.
도 6은 HP56 발현 플라스미드 M15(PRE4)PQE/HP56을 수반하는 이 콜라이 세포의 쿠마씨 블루 염색된 SDS-Gel이다. 레인 1은 분자량 마커(Novex MultiMark); 레인 2는 유도되지 않은 세포; 레인 3은 IPTG 유도된 세포를 나타낸다. HP56은 화살표로 나타낸다. 분자량 마커(레인 1)는 미오신(∼250 kDa), 포스포릴라제 B(∼148 kDa), GDH(∼60 kDa), CAH(∼42 kDa), 미오글로빈-블루(∼30 kDa), 미오글로빈-레드(∼22 kDa), 리소자임(∼17 kDa), 아프로티닌(∼6 kDa) 및 인슐린(∼6 kDa)이다.
도 7a 및 7b는 HP56 폴리펩티드(서열 식별 번호: 1 및 서열 식별 번호: 2)의 전체 길이 핵산 서열 및 상응하는 아미노산 서열이다.
도 8a 및 8b는 HP30 폴리펩티드(서열 식별 번호: 3 및 서열 식별 번호: 4)의 전체 길이 핵산 서열 및 상응하는 아미노산 서열이다.
도 9에서, 여러 그룹의 마우스에게 HP30 재조합 단백질을 단독으로(50 ㎍ 단백질/용량) 또는 여러 개의 비 경구 아주반트[알룸, 프로인트 완전 아주반트(CFA) 또는 알룸과 이 콜라이 열 불안정성 장독소(LT)]와 함께 함유하는 백신을 투여하였다. 3 회 용량의 백신을 0 일, 21 일 및 42 일에 피하 제공하였다. 세 번째 투여 후 약 14 일째에 동물들을 3 일 연속해서 약 5.0 x 108cfu 에이치 파이로리(시드니 균주)로 경구 접종하였다. 동물들을 상기 세 번째 접종 후 약 14 일째에 죽이고 위를 균질화시켰다. 위 중의 에이치 파이로리의 적재 수준을 에이치 파이로리를 선택적으로 증식시키는 6 개의 항생제와 배합시킨 브루셀라 혈액 한천 플레이트 상에 도말하여 정량분석하였다. 그래프 상의 점들은 개별적인 동물들의 위 균질물에서 측정된 에이치 파이로리 cfu의 수를 나타내는 반면 막대들은 상기 그룹 당 평균 cfu를 나타낸다.
도 10에서, 여러 그룹의 마우스에게 에이치 파이로리 조 세포 용해물 또는 HP30 및 HP56 재조합 단백질을 함유하는 복합 서브유닛 제제를 함유하는 경구 백신을 투여하였다. 상기 용해물(100 ㎍ 단백질/용량) 및 HP30/HP56 항원(50 ㎍ 단백질/용량)을 단독으로 또는 아주반트로서 이 콜라이 열 불안정성 장독소의 변형된 형태(AB5) 25 ㎍과 함께 투여하였다. 백신을 0 일, 14 일 및 28 일 째 3 회 제공하였다. 세 번째 투여 후 약 14 일째에 동물들을 3 일 연속해서 약 5.0 x 108cfu 에이치 파이로리(시드니 균주)로 경구 접종하였다. 동물들을 상기 세 번째 접종 후 약 14 일째에 죽이고 위를 멸균적으로 회수하여 균질화시켰다. 위 중의 에이치 파이로리의 적재 수준을 에이치 파이로리를 선택적으로 증식시키는 6 개의 항생제와 배합시킨 브루셀라 혈액 한천 플레이트 상에 도말하여 정량분석하였다. 그래프 상의 점들은 개별적인 동물들의 위 균질물에서 측정된 에이치 파이로리 cfu의 수를 나타내는 반면 막대들은 상기 그룹 당 평균 cfu를 나타낸다.
도 11은 M15(PRE4)PQE/HP30의 HP30 암호화 삽입물에 의해 암호화된 HP30 폴리펩티드의 전체 길이 핵산 서열 및 상응하는 아미노산 서열이다. 플라스미드 pQE/Hp30은 Hp30 암호화 핵산의 N-말단 부분에서 히스티딘 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 도면에 나타낸 상기 HP30 암호화 핵산(서열 식별 번호: 47)은 뉴클레오티드 37에서 출발하는 ATG로 시작하고 HP30을 포함하는 아미노산 서열(서열 식별 번호: 48)은 두 번째 M, 즉 도면의 아미노산 잔기 13에서 시작한다. 히스티딘 표지를 갖는 상기 삽입물의 핵산과 아미노산 서열은 각각 서열 식별 번호: 45와 46이다.
1. 에이치 파이로리 HP30 및 HP56 폴리펩티드
본 발명은 일반적으로 헬리코박터 감염의 진단, 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 하나의 태양에서, 본 발명의 조성물은 헬리코박터 항원의 하나 이상의 면역원 부분을 포함하는 단리되거나 순수한 고유(야생형) 또는재조합적으로 생산된 HP30 및 HP56 폴리펩티드를 제공한다.
특정한 실시태양에서, "헬리코박터"란 용어는 비 제한적으로 헬리코박터 파이로리 또는 헬리코박터 펠리스를 포함하는 임의의 헬리코박터 종들을 지칭한다.
임의의 이들 유기체로부터의 균주를 세계적으로 임의의 생물학적 기탁기관들로부터, 특히 ATCC 기탁된 헬리코박터 43504, 43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D 및 700932의 균주로부터 수득할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 상기 헬리코박터 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 2로 나타낸 추론된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 2 또는 그의 일부와 거의 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 식별 번호: 1 또는 그의 일부를 갖는 뉴클레오티드 서열과 거의 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 헬리코박터 단백질 또는 폴리펩티드는서열 식별 번호: 4 또는 48로 나타낸 추론된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 3 또는 47의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 헬리코박터 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 4 또는 그의 일부와 거의 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 식별 번호: 3 또는 47 또는 그의 일부를 갖는 뉴클레오티드 서열과 거의 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
본 원에 사용된 "거의 같은" 서열은 정렬이나 비교를 당해 분야에 공지된 컴퓨터 상동 관계 프로그램 또는 탐색 연산에 의해 수행 시 기준 서열에 비해 같은 크기의 기준 아미노산 또는 핵산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 또는 95% 이상 동일하다. 예로서 비 제한적으로 유용한 컴퓨터 상동 관계 프로그램은 하기와 같다: 문헌[Karlin and Altschul 1990, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA90:5873-77]의 통계적 방법을 사용하여 중요하게 생각되는 서열 유사성의 탐색을 위해 맞추어진 발견적인 탐색 연산인 베이직 로칼 얼라인먼트 써치 툴(BLAST)(Altschul et al., 1990, J. of Molec. Biol. 215:403-410, "The BLAST Algorithm; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402). 5 개의 특정 BLAST 프로그램들은 하기의 임무를 수행한다:
1) BLASTP 프로그램은 아미노산 의문 서열을 단백질 서열 데이터베이스에 비교한다.
2) BLASTN 프로그램은 뉴클레오티드 의문 서열을 뉴클레오티드 서열 데이터베이스에 비교한다.
3) BLASTX 프로그램은 뉴클레오티드 의문 서열의 6-프레임 개념 번역 산물(2 가닥 모두)을 단백질 서열 데이터 베이스에 비교한다.
4) TBLASTN은 단백질 의문 서열을 모든 6 개 판독 프레임(2 가닥 모두)에서 번역된 뉴클레오티드 서열 데이터베이스에 비교한다.
5) TBLASTX는 뉴클레오티드 의문 서열의 6-프레임 번역을 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 6-프레임 번역에 비교한다.
스미스-워터맨(Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol. 147:195-197)(데이터베이tm: 유럽 바이오 정보 연구소)이 서열 정렬에 대해 수리적으로 엄밀한 연산방식이다.
FASTA(문헌[Pearson et al., 1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444-2448] 참조)는 상기 스미스-워터맨 연산방식에 발견적으로 근사하다. 상기 BLAST, 스미스-워터맨 및 FASTA 연산방식의 과정과 이점에 대한 일반적인 논의에 대해서 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Nicholas et al., 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods"]을 참조하시오.
추가의 예로서 제한 없이, 일치율을 측정하는데 유용한 컴퓨터 상동관계 연산방식 및 변수들은 하기와 같다:
예를 들어 HP56 또는 HP30 서열과 다른 공지된 서열들간의 2 개의 아미노산 서열 또는 2 개의 핵산 서열의 일치율을 측정하기 위해서, 상기 서열들을 최적의 비교 목적을 위해 정렬시킨다(예를 들어 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 첫 번째 아미노산 또는 핵산 서열에 틈을 도입시킬 수 있다). 이어서 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드들을 비교한다. 상기 첫 번째 서열 중의 위치를 두 번째 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지하고 있는 경우, 상기 분자는 상기 위치에서 동일하다. 상기 두 서열들간의 일치율은 서열들이 공유하고 있는 동일한 위치들의 수의 함수이다(즉, 일치율(%) = 동일한 위치의 #/전체 위치의 #(예를 들어, 중복 위치) x 100). 하나의 실시태양에서, 상기 2 개의 서열은 길이가 동일하다.
2 개 서열들간의 일치율의 측정을 수리적인 연산방식을 사용하여 수행할 수 있다. 2 개 서열의 비교에 사용되는 수리적 연산 방식의 바람직한, 비 제한적인 예는 카를린과 알츌(Karlin and Altschul)(Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:58/3-77에 의해 수정됨)의 연산방식이다. 상기와 같은 연산방식은 알츌(1990, J. of Molec. Biol. 215:403-410)의 NBLAST 와 XBLAST 프로그램에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 탐색은 NBLAST 프로그램(등급=100, 워드 길이=12)에 의해 수행되어 본 발명의 핵산 분자와 일치하는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 탐색은 XBLAST 프로그램(등급=50, 워드 길이=3)에 의해 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 일치하는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교를 위한 틈이 있는 정렬을 얻기 위해서, 틈이 있는 BLAST를 문헌[Alschul, 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]에 개시된 바와 같이 이용할 수 있다. 한편으로, PSI-BLAST를 사용하여 분자들간의 떨어진 관계(Id)를 탐지하는 반복 탐색을 수행할 수 있다. BLAST, 틈이 있는 BLAST 및 PSI-BLAST를 사용하는 경우, 각 프로그램들의 디폴트값 변수를 사용할 수 있다. 서열들의 비교에 사용되는 수리적인 연산방식의 또 다른 바람직한, 비 제한적인 예는 마이어스와 밀러(Myers and Miller, CABIOS(1989))의 연산 방식이다. 상기와 같은 연산방식은 CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있다. 아미노산 서열들의 비교를 위해 상기 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 틈 길이 벌점 및 4의 틈 벌점을 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가적인 연산방식들이 당해 분야에 공지되어 있으며 여기에는 문헌[Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosc., 10;3-5]에 개시된 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85; 2444-2448]에 개시된 FASTA가 있다. FASTA 내에서, ktup는 탐색의 감도와 속도를 정하는 조절 옵션이다. ktup=2이면, 비교하는 2 개 서열들 중의 유사 영역을 정렬된 잔기들의 쌍을 고찰함으로써 발견하며; ktup=1인 경우에는 단일의 정렬된 아미노산을 검사한다. ktup를 단백질 서열의 경우에는 2 또는 1로 정하거나, 뉴클레오티드 서열의 경우는 1 내지 6으로 정할 수 있다. ktup가 명시되지 않은 경우 디폴트값은 단백질의 경우 2이고 뉴클레오티드의 경우 6이다. 한편으로, 단백질 서열 정렬을 문헌[Higgins et al., 1996, Methods Enzymol., 266:383-402]에 개시된 바와 같이 CLUSTAL W 연산방식을 사용하여 수행할 수 있다.
2 개 서열간의 일치율을 상술한 기법들과 유사한 기법을 사용하여 틈을 허용하거나 틈 없이 측정할 수 있다. 일치율의 계산에서, 오직 정확한 합치만을 카운트한다.
본 발명의 다양한 태양들에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드들을 공지된 분자량 마커의 이동에 대해 SDS-PAGE에서의 폴리펩티드의 이동을 근거로 겉보기 분자량에 의해 특성화한다. 당해 분야에 공지된 임의의 분자량 기준을 SDS-PAGE와 함께 사용할 수 있지만, 바람직한 분자량 마커는 포스포릴라제 B, GDH, CAH, 미오글로빈-블루, 미오글로빈-레드 및 리소자임을 포함한다.
당해 분야의 숙련가는 본 발명의 폴리펩티드가 상이한 유형의 겔 시스템들(예를 들어 상이한 완충액; 상이한 유형 및 농도의 겔, 가교결합제 또는 SDS 등)에서 상이하게 이동함을 알 것이다. 당해 분야의 숙련가는 또한 폴리펩티드가 SDS-PAGE에 사용된 상이한 분자량 마커로 인해 상이한 겉보기 분자량을 가질 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 분자량 특성화는 임의의 SDS-PAGE 시스템 상에서 본 원에 개시된 것들과 약간 상이한 폴리펩티드의 겉보기 분자량을 가리킬 수 있는 임의의 분자량 마커 세트를 사용하여 동일한 폴리펩티드를 포괄하는 것에 관한 것이다.
특정한 실시태양들에서, 본 발명은 헬리코박터 항원의 면역원 부분을 포함하는 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 개시하며, 여기에서 상기 헬리코박터 항원은 (a) 서열 식별 번호: 1 또는 서열 식별 번호: 3 또는 서열 식별 번호: 47에 인용된 뉴클레오티드 서열, (b) 상기 뉴클레오티드 서열들의 상보물, 및 (c) 상기와 같은 서열들의 변형물, 예를 들어 비 제한적으로 대립 유전자 변체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다.
2. 헬리코박터 유도된 폴리펩티드
본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 "항원" 및 그의 관련된 "항원성"이란 용어는 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합하는 물질을 지칭한다. 본 원에 사용된 항혈청, 항체 및 T 세포는 이들이 항원과 특이적으로 결합하거나 또는 이와 반응하고 관련되지 않은 단백질과는 탐지할 정도로 반응하지 않는 경우 "항원-특이적"이다.
본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 "면역원"이란 용어는 동물, 바람직하게는 포유동물에서 면역 반응, 예를 들어 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하는 능력을 지칭한다.
본 발명의 특정한 실시태양에서, HP56 단백질의 8 개 이상(연속적인)의 아미노산으로 이루어진 상기 HP56 단백질의 단편으로 이루어지거나 또는 상기를 포함하는 헬리코박터 유도된 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양들에서, 상기 단편은 서열 식별 번호: 2의 적어도 10 내지 500 개 아미노산으로 이루어진다. 특정한 실시태양에서, 상기와 같은 단편들은 10, 11, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400, 425 또는 450 개 이하의 아미노산이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 단편은 HP56 폴리펩티드의 항원성 또는 면역원성 에피토프를 포함한다.
특정한 실시태양에서, HP56-유도된 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 5 내지 15중 임의의 것을 포함하는 HP56의 단편이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 HP56-유도된 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 5 내지 15 중 임의의 것을 포함하지만 또한 추가적인 상부 또는 하부 HP56 서열을 포함하는 HP56의 단편이다.
본 발명의 특정한 실시태양에서, HP30 단백질의 8 개 이상(연속적인)의 아미노산으로 이루어진 상기 HP30 단백질의 단편으로 이루어지거나 또는 상기를 포함하는 헬리코박터 유도된 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시태양들에서, 상기 단편은 서열 식별 번호: 4 또는 48의 적어도 10 내지 200 개 아미노산으로 이루어진다. 특정한 실시태양에서, 상기와 같은 단편들은 10, 11, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250 개 이하의 아미노산이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 단편은 HP30 폴리펩티드의 항원성 또는 면역원성 에피토프를 포함한다.
특정한 실시태양에서, HP30-유도된 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 16 내지 20 중 임의의 것을 포함하는 HP30의 단편이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 HP30-유도된 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 16 내지 20 중 임의의 것을 포함하지만 또한 추가적인 상부 또는 하부 HP30 서열을 포함하는 HP30의 단편이다.
바람직하게는, 본 발명의 HP56-유도된 폴리펩티드는 HP56 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이며, 동물에서 헬리코박터, 헬리코박터 세포 용해물 또는 헬리코박터 항원(들)을 발현하는 항원 제공 세포에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 HP30-유도된 폴리펩티드는 HP30 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이며, 동물에서 헬리코박터, 헬리코박터 세포 용해물 또는 헬리코박터 항원(들)을 발현하는 항원 제공 세포에 대해 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 HP30-유도되거나 HP56-유도된 폴리펩티드는 헬리코박터의 고유 HP56 또는 HP30 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프(즉 완전한 헬리코박터 세포 중에 존재하는 HP56 또는 HP30 폴리펩티드의 에피토프)를 형성하는 서열들을 포함한다. 상기와 같은 바람직한 HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 HP56 또는 HP30 폴리펩티드와 교차 반응성인 면역 반응을 유도하고 완전한 헬리코박터 세포에 대해 발생한 항체(예를 들어 포름알데히드 또는 글루타르알데히드 고정된 헬리코박터 세포 또는 헬리코박터 세포 용해물에 의해 유도된 항체; 상기와 같은 항체를 본 원에서는 "항-완전 세포" 항체라 칭한다)에 특이적으로 결합하는 능력에 의해 식별할 수 있다. 예를 들어, HP56 폴리펩티드 또는 HP30 폴리펩티드를 표준 방법을 사용하여 분류하고, 항-완전 세포 항체에 결합하는 능력에 대해 시험한다. 반응성 폴리펩티드를 단리시키고 그의 아미노산 서열을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정한다.
폴리펩티드 유도체를 또한 목적하는 특이적인 항원성을 유지하면서 모 폴리펩티드의 일부를 제거하는 결실에 의해 제작할 수 있다. 결실은 또한 균주들 중에서 고도의 변이성을 갖는 부분들을 제거할 수 있다.
또한 바람직하게는, 본 발명의 헬리코박터 유도된 폴리펩티드는 살균, 중화 또는 식균 항체를 매개하는 고유 헬리코박터 폴리펩티드(HP30 또는 HP56)의 하나 이상의 에피토프를 형성하는 서열들을 포함한다. 상기와 같은 바람직한 헬리코박터 유도된 폴리펩티드를 헬리코박터 스페시즈, 특히 헬리코박터 파이로리 또는 헬리코박터 펠리스 세포를 죽이는 항체를 생산하는 그의 능력에 의해 식별할 수 있다. 예를 들어, HP56 또는 HP30 폴리펩티드의 제한된 또는 완전한 프로테아제 절단 또는 화학적 절단으로부터의 폴리펩티드를 표준 방법을 사용하여(예를 들어 트립신, 파파인 또는 관련된 단백질 분해 효소와 같은 효소를 사용하여 제한된 단백질 분해적 절단에 의해, 또는 시아노겐 브로마이드와 같은 시약을 사용하여 화학적으로 절단시킨 후에 절단 산물들을 분류함으로써) 분류하고, 동물에게 주입하고 이로부터 생산된 항체들을 헬리코박터 세포를 손상시키거나 죽이는 그의 능력에 대해 시험한다. 일단 식별되고 단리되면, 상기와 같은 바람직한 헬리코박터-유도된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 표준 서열화 방법을 사용하여 측정한다. 상기 측정된 서열을 사용하여 합성 화학 및/또는 유전자 공학 수단에 의해 상기와 같은 폴리펩티드의 생산을 가능하게 할 수 있다.
이러한 바람직한 헬리코박터-유도된 폴리펩티드들을 또한 항-완전 세포 항체를 사용하여 식별하여 HP56 또는 HP30 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화하는 헬리코박터 게놈 DNA 또는 클로닝된 뉴클레오티드 서열의 랜덤 단편을 발현하는 세균 라이브러리를 선별할 수 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, NY, Vol. 1, Chapter 12]을 참조하시오. 반응성 클론들을 식별하고 그의 삽입물을 삽입하고 서열화하여 상기와 같은 바람직한 헬리코박터-유도된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정한다.
본 발명에 의해 고려되는 항원들의 면역원 부분에 대한 예로는 표 1 및 2에 나타낸 단편들을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드들이 있으며, 표에서 HP56(표 1, 컬럼 1) 또는 HP30(표 2, 컬럼 1) 옆의 숫자들은 각각 서열 식별 번호 2 또는 4의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 본 원에 개시된 하나 이상의 헬리코박터 항원의 하나 이상의 면역원 부분 또는 면역원 부분들을 포함하는 폴리펩티드를 일반적으로는 단독으로 또는 함께 사용하여 헬리코박터 감염을 탐지, 예방, 치료하거나 또는 그의 중증도를 감소시킬 수 있다.
HP56 단편
HP56 단편 서열 식별 번호
HP56 10-63 5
HP56 70-100 6
HP56 100-125 7
HP56 140-180 8
HP56 185-215 9
HP56 240-262 10
HP56 270-305 11
HP56 320-360 12
HP56 350-380 13
HP56 385-420 14
HP56 420-440 15
HP30 단편
HP30 단편 서열 식별 번호
HP30 1-30 16
HP30 53-90 17
HP30 121-150 18
HP30 145-185 19
HP30 203-251 20
본 발명의 폴리펩티드들 중 하나와 일치하는 서열을 갖는 폴리펩티드는 천연 대립 유전자 변이체를 포함하며, 뿐만 아니라 본 발명의 HP56 또는 HP30 폴리펩티드와 유사한(즉 교차 반응하는) 돌연변이체, 변이체 또는 임의의 다른 비 천연 변이체가 본 발명에 포함된다.
대립 유전자 변이체가 실제로 매우 통상적이다. 예를 들어, 세균 종들, 예를 들어 에이치 파이로리는 작은 대립 유전자 변이에 의해 서로 상이한 다양한 균주 또는 혈청형의 예이다. 실제로, 상이한 균주들에서 동일한 생물학적 기능을 만족시키는 폴리펩티드는 각각의 균주에서 동일하지 않은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기와 같은 대립 유전자 변이는 핵산 분자 수준에서 동등하게 반영될 수 있다.
대립 유전자 변이체는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 실질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것으로서 특성화되는 상기 폴리펩티드의 교번 형태이다. "생물학적 기능"이란 상기 기능이 세포의 성장이나 생존에 필요하지 않다 하더라도 세포에서 자연적으로 일어나는 상기 폴리펩티드의 기능을 의미한다.
대립 유전자 변이체를 암호화하는 핵산 분자, 예를 들어 DNA 분자는 통상적인 방법에 의해 추출된 게놈 세균 DNA의 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 쉽게 회복될 수 있다. 이는 상기 암호화 도메인의 5' 및 3' 단부의 상부 및 하부 서열들에 부합하는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 수반한다. 전형적으로는 프라이머는 10 내지 40, 바람직하게는 15 내지 25 개의 뉴클레오티드들로 이루어질 수 있다. 또한 효율적인 하이브리드화를 보장하는데 충분한 비율(예를 들어 전체 뉴클레오티드 양의 40% 이상, 바람직하게는 50%의 C 및 G 뉴클레오티드 양)로 C 및 G 뉴클레오티드를 함유하는 프라이머를 선택하는 것이 유리할 수있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 핵산 분자와 서열 상동성 또는 일치성을 공유하는 에이치 파이로리 변이체가 또한 본 발명에 포함된다. 당해 분야에 공지된 컴퓨터 상동 관계 프로그램 또는 탐색 연산 방식을 사용하는 정렬 또는 비교에 의해 또는 동일한 크기의 기준 서열에 대한 상동 또는 일치%를 측정하는 예시적인 방법에 대해 발명의 상세한 설명의 섹션 1을 참조하시오. 바람직하게는, 혈청형 상동물은 본 원에 개시된 상응하는 폴리펩티드 서열(들)에 대해 70, 80, 85, 90, 95 또는 99% 상동 또는 일치를 나타낸다. 가장 바람직하게는, 상기 혈청형 상동물은 본 원에 개시된 상응하는 폴리펩티드 서열(들)에 대해 95 내지 99% 상동성을 나타낸다. 또한, 뉴클레오티드 서열 상동물은 본 원에 개시된 상응하는 폴리펩티드 서열 또는 서열들에 대해 70, 80, 85, 90, 95 또는 99% 일치를 나타낸다.
헬리코박터-유도된 HP56 또는 HP30 폴리펩티드는 그의 단편 또는 변이체, 즉 야생형 헬리코박터 서열의 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 또는 생체 내 또는 생체 외에서 화학적으로 변경된 아미노산을 갖는 HP56-유도되거나 또는 HP30-유도된 폴리펩티드 또는 단편을 포함한다. 상기와 같은 변경은 생성된 헬리코박터-유도된 폴리펩티드 산물의 면역원성을 향상시키거나 또는 상기와 같은 활성에 영향을 미치지 않을 수도 있다. 본 원에 사용된 "면역원성을 향상시키는"이란 표현은 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 포르말린 또는 글루타르알데히드 고정된 헬리코박터에 의해 유도된 면역 반응에 비해 증가된 항체 역가 또는 증가된 세포 면역 반응을 의미한다. 사용될 수 있는 변경 기법으로는 비 제한적으로,본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 4,526,716 호에 개시된 것들이 있다.
예시적인 비 제한 예로서, HP56- 또는 HP30-유도된 폴리펩티드 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 기능상 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 또 다른 아미노산으로 치환시켜 잠복성 변경을 생성시킬 수 있다. 상기 서열에서 아미노산에 대한 치환체를 상기 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원들 중에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 비 극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 극성의 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민이 있다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 있다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있다.
예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 지질화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질 분해적 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에의 결합 등에 의해 번역 도중 또는 번역 후에 상이하게 변경된 HP30 또는 HP56의 폴리펩티드 단편 또는 다른 유도체 또는 동족체인 HP30-유도되거나 또는 HP56-유도된 폴리펩티드가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 임의의 다수의 화학적 변경들을 공지된 기법, 예를 들어 비 제한적으로 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특이적인 화학적 절단; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 투니카마이신 존재 하에서의 대사 합성; 등에 의해 수행할 수 있다.
더욱 또한, 경우에 따라 비 전형적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 동족체들을 헬리코박터 폴리펩티드 서열 내로의 치환 또는 부가로서 도입시킬 수 있다. 비 전형적인 아미노산으로는 비 제한적으로 통상적인 아미노산들의 D-이성체, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, α-Abu, α-Ahx, 6-아미노 헥사노산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예를 들어 메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, PNA 및 일반적인 아미노산 동족체들이 있다. 더욱 또한, 상기 아미노산은 D(우선형) 또는 L(좌선형)일 수 있다.
HP56 또는 HP30-유도된 폴리펩티드는 또한 완전한 HP56, 또는 HP30 폴리펩티드, HP56-유도되거나 또는 HP30-유도된 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카복실-말단 또는 내부 아미노산에 융합된, 헬리코박터 기원 또는 또 다른 세균 또는 바이러스 기원의 하나 이상의 이종 폴리펩티드, 지질, 인지질 또는 리포다당류를 포함하는 키메릭 폴리펩티드일 수 있다. 상기와 같은 키메릭 폴리펩티드를 포함하는 유용한 이종 폴리펩티드에는 비 제한적으로 a) 숙주 세포에서 완전한 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드의 운반, 전좌 및/또는 진행을 촉진시키는 이전- 및/또는 전구-서열들, b) 친화성 정제 서열들, 및 c) 임의의 유용한 면역원 서열들(예를 들어 미생물 병원체의 표면 노출된 단백질의 하나 이상의 에피토프를 암호화하는 서열들)이 포함된다. 상기 키메릭 폴리펩티드의 하나의 바람직한이종 단백질은 Hin47(본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,679,547 호 및 제 5,721,115 호를 참조하시오)이다. 상기 키메릭 폴리펩티드의 또 다른 바람직한 이종 단백질은 아데노바이러스 캡시드(피막) 단백질, 예를 들어 단백질 II(헥손), 단백질 III(펜톤); 단백질 IV(섬유); 단백질 VI; 단백질 VIII 또는 단백질 IX이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 이종 단백질은 아데노바이러스 캡시드 단백질 헥손, 펜톤 또는 섬유이다. 문헌[Vaccines, 3d, ed; Plokin and Orenstein, 1999, pp. 609-628, 특히 612]; 크리스탈(Crystal) 등의 미국 특허 제 6,127,525 호 및 6,153,435 호를 참조하시오(상기 참고 문헌들은 본 발명에 참고로 인용되어 있다).
HP56- 또는 HP30-유도된 폴리펩티드로는 또한 비 제한적으로 헬리코박터 단백질로부터 유도된 2 개 이상의 부분들을 포함하는 융합 폴리펩티드가 있으며, 상기 부분들은 각각 T 세포 또는 항체 자극 활성을 갖는다. 상기 부분들은 동일한 헬리코박터 단백질로부터 유도되거나, 또는 하나 이상의 헬리코박터 항원으로부터의 부분들을 포함할 수도 있다. 상기 폴리펩티드들은 비 순차적인 순서로 또는 비 연속적인 순서로(예를 들어 고유 단백질의 아미노산들의 순서와 다른 순서로) 배열된다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 2 개 이상의 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드이며, 상기 펩티드는 서열 식별 번호: 5 내지 20으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 펩티드로 이루어지나, 단 상기 폴리펩티드의 펩티드들은 천연 구성과 상이한 구성으로 배열된다.
본 발명의 다른 바람직한 HP30 또는 HP56 유도된 폴리펩티드는 단리된 융합폴리펩티드이며, 여기에서 상기 폴리펩티드는 임의의 서열 식별 번호 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 중 하나 이상, 바람직하게는 2 개 이상을 포함하나, 단 상기 융합 폴리펩티드의 펩티드들은 천연 구성과 상이한 구성으로 배열된다.
경우에 따라, 상기 부분들의 아미노산 서열을 생성시키고 링커에 의해 연결시킬 수 있다. 적합한 펩티드 링커 서열을 하기 인자들을 기준으로 선택할 수 있다: (1) 가요성의 확장된 형태를 채택하는 능력; (2) 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 작용성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2 차 구조를 채택하는 능력; (3) 폴리펩티드 작용성 에피토프와 반응할 수도 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 결여; (4) 용해도를 증가시키는 능력; 및 (5) 항원 제공 세포에 의한 진행 감도를 증가시키는 능력. 상기와 같은 링커들은 임의의 아미노산 서열 또는 다른 적합한 링커 또는 연결 인자일 수 있다. 본 발명에 유용한 링커로는 하전된 아미노산 쌍, 예를 들어 KK 또는 RR을 포함하는 링커, 카텝신 및/또는 다른 트립신 유사 효소에 민감한 링커, 트롬빈, 인자 Xa 또는 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 링커가 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열에는 문헌[Maratea et al., 1985, Gene 40:39-46; Murphy et al., 1986, Proc. Nat. Acad Sci USA 83:8258-8562, 미국 특허 제 4,935,233 호 및 제 4,751,180 호에 개시된 것들이 포함된다. 상기 링커 서열은 길이가 1 내지 약 50 아미노산일 수 있다.
본 발명에 포함되는 융합 폴리펩티드의 또 다른 특정한 예는 아주반트 활성을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 콜레라 독소 또는 이 콜라이 열 불안정성 독소의서브유닛 B, 또는 mLT에 융합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체이다. 융합 폴리펩티드의 또 다른 특정한 예로는 시토킨(예를 들어, 비 제한적으로 IL-2, IL-10, IL-12, IL-4, 인터페론)에 융합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체가 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 아주반트 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단 단부에 융합시킬 수 있다. 한편으로, 본 발명의 폴리펩티드를 아주반트 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에 융합시킬 수 있다.
또한 바람직하게는, 본 발명의 헬리코박터 유도된 융합 폴리펩티드는 살균 또는 식균 항체 및/또는 T 세포를 매개하는 고유 헬리코박터 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프를 형성하는 서열들을 포함한다. 상기와 같은 바람직한 헬리코박터-유도된 폴리펩티드를 HP56 또는 HP30 에피토프를 발현하는 헬리코박터 스페시즈 또는 세포를 죽이는 항체 및/또는 T 세포를 생성시키는 능력에 의해 식별할 수 있다.
3. HP56, HP30, HP56 유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드의 단리 및 정제
본 발명은 단리된 HP56, HP30 폴리펩티드, HP56 유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드를 제공한다. 본 원에 사용된 "단리된"이란 용어는 생성물이 천연 적으로 회합된 다른 생물 물질로부터 회수 및 분리되거나, 또는 예를 들어 생성물을 발현하도록 유전자 조작된 재조합 숙주 세포로부터 유도된 다른 생물 물질로부터 분리되거나 이러한 물질이 없거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질들로부터 분리되거나 이러한 물질이 없는 것; 즉 생성물의 합성에수반되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 것을 의미한다. 본 원에 사용된 "정제된"이란 용어는 생성물이 천연 적으로 회합된 다른 생물 물질이 거의 없거나, 또는 예를 들어 생성물을 발현하도록 유전자 조작된 재조합 숙주 세포로부터 유도된 다른 생물 물질이 거의 없거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질들이 없는 것; 즉 생성물의 합성에 수반되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 것을 의미한다. "거의 없는"이란 용어는 생성물이 조성물의 70 중량% 이상, 바람직하게는 95 중량% 이상을 차지함을 의미한다. 즉, 정제된 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 조성물은 70 내지 95 중량% 이상 순수한 HP30 또는 HP56 폴리펩티드, 바람직하게는 75 중량% 이상 순수한 HP30 또는 HP56 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 95 중량% 이상 순수한 HP30 또는 HP56 폴리펩티드이다. 따라서 헬리코박터 용해물 또는 헬리코박터의 막 제제의 하나 이상의 단백질 밴드를 함유하는 겔 부분을 포함한 아크릴아미드 겔(SDS 존재 또는 부재) 상의 헬리코박터 용해물 또는 막 제제는 HP30 또는 HP56의 정제된 제제 또는 조성물이 아닌데, 그 이유는 상기 겔이 다른 헬리코박터 단백질을 포함하며 HP30 또는 HP56의 중량이 70 중량% 이상 또는 95 중량% 이상 순수한 HP30 또는 HP56을 구성하지 않기 때문이다. 그러나, 상기 HP30 또는 HP56 밴드를 아크릴아미드 겔로부터 용출시켜 수득한 HP30 또는 HP56의 제제는 HP30 또는 HP56의 정제된 제제이다.
본 발명의 HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 임의의 헬리코박터 종, 예를 들어 비 제한적으로 헬리코박터 파이로리 또는 헬리코박터 펠리스의 전 세포 추출물을포함한 단백질 추출물로부터 단리시킬 수 있다. 임의의 이들 유기체로부터의 균주는 전 세계적으로 임의의 생물학적 기탁기관들로부터, 특히 ATCC 기탁된 헬리코박터 43504, 43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D 및 700932의 균주로부터 수득할 수 있다.
HP56- 또는 HP30- 폴리펩티드의 또다른 출처는 HP56, HP30, HP56-유도된 폴리펩티드 또는 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 클로닝된 서열을 발현하는 유전자 발현 시스템으로부터의 단백질 제제이다(하기 상세한 설명의 섹션 5 참조).
HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 임의의 생화학 기법 및 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 접근법을 사용하여 원 물질로부터 단리 및 정제할 수 있다. 하나의 접근법에서, 헬리코박터 세포를 용해시키고 세포 잔해를 바람직하게는 원심분리에 의해 회수한다. 추출액 중의 폴리펩티드를 농축시키고, 100 ℃에서 5 분간 SDS-함유 램리(Laemmli) 겔 샘플에서 배양시키고, 이어서 환원제 없이 또는 이를 사용하여 약 4 내지 약 12%의 변성 나트륨 도데실설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔(PAG) 중에서 전기 영동에 의해 분류시킨다(Laemmli, 1970, Nature227:680-685). 이어서 상술한 바와 같이, 30 kd(HP30) 또는 56 kDa(HP56)의 겉보기 분자량을 갖는 HP30 또는 HP56 폴리펩티드로서 확인된 밴드 또는 분획을 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 함유하는 분획 또는 겔 조각으로부터 직접 단리시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, HP30 폴리펩티드는 약 30 kDa의 겉보기 분자량을 가지며, 이는 미오신(∼250 kDa), 포스포릴라제 B(∼148 kDa), GDH(∼60 kDa), CAH(∼42 kDa), 미오글로빈-블루(∼30 kDa), 미오글로빈-레드(∼22 kDa), 리소자임(∼17 kDa), 아프로티닌(∼6 kDa) 및 인슐린(∼6 kDa)에 대한 변성 SDS-PAGE에서의 그의 이동 거리 또는 속도를 비교함으로써 측정할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, HP56 폴리펩티드는 약 56 kDa의 겉보기 분자량을 가지며, 이는 미오신(∼250 kDa), 포스포릴라제 B(∼148 kDa), GDH(∼60 kDa), CAH(∼42 kDa), 미오글로빈-블루(∼30 kDa), 미오글로빈-레드(∼22 kDa), 리소자임(∼17 kDa), 아프로티닌(∼6 kDa) 및 인슐린(∼6 kDa)에 대한 변성 SDS-PAGE에서의 그의 이동 거리 또는 속도를 비교함으로써 측정할 수 있다.
HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 정제하는 또 다른 방법은 항-HP56 또는 HP30 항체를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의한 것이다(하기 상세한 설명의 섹션 4 참조). 다클론 또는 단클론 항-HP56 또는 HP30 항체를 사용한다. 바람직한 것은 하나 이상의 단클론 항체이다. 상기 항체들을 시아노겐 브로마이드 또는 숙신아미드 에스테르(Affi-Gel, BioRad, Inc.)에 의해 또는 당해 분야의 숙련가들에 공지된 다른 방법에 의해 활성화된 아가로스 겔에 공유 결합시킨다. 단백질 추출물을 상술한 바와 같이 겔의 상단에 적재한다. 접촉은 HP56 또는 HP30 폴리펩티드가 항체에 결합하기에 충분한 기간동안 수행한다. 바람직하게는, 고체 지지체는 크로마토그래피 컬럼에 사용되는 물질이다. 이어서 HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 항체로부터 제거하여, HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 단리된, 또는 바람직하게는 정제된 형태로 회수한다.
본 발명의 HP30 또는 HP56 유도된 폴리펩티드를 단리되거나 정제된 폴리펩티드의 화학적 및/또는 효소적 절단 또는 분해에 의해 생성시킬 수 있다. HP56 또는 HP30-유도된 폴리펩티드는 또한 이종 펩티드에 융합된 HP56 또는 HP30 폴리펩티드일 수 있으며 상기 이종 폴리펩티드의 아미노산 서열을 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다(Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY).
HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 또한 HP30 또는 HP56-유도된 폴리펩티드(들)를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 구조물을 발현하는 유전자 발현 시스템에서 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 기법에 따라 합성하거나 클로닝시키고 발현시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, Chapter 9]을 참조하시오.
본 발명의 HP56 유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드를 표준 단백질 정제 기법을 적용시켜 분류 및 정제하고, 본 원에 개시된 발견 및 교시에 따라 변경 및 적용할 수 있다.
경우에 따라, 본 발명의 폴리펩티드를 표준 단백질 또는 펩티드 정제 기법, 예를 들어 비 제한적으로 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 친화성 크로마토그래피, 염료 결합 크로마토그래피, 크기 배재 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 역상 고 성능 액체 크로마토그래피 및 겔 투과성 고 성능 액체 크로마토그래피), 등전점 초점 조절 및 이들의 변형 및 조합을 사용하여 추가로 정제시킬 수 있다.
이들 기법들 중 하나 이상을 본 발명의 HP56, HP30 폴리펩티드, HP56 유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 그의 물리적 또는 화학적 특성에 따라 단리 및/또는 정제하도록 고안된 절차로 순차적으로 사용할 수도 있다. 이러한 특성들로는 단백질의 소수성, 전하, 결합 능력 및 분자량이 있다. 각각의 기법 후에 수득된 물질들의 다양한 분획들을 항-HP56 또는 HP30 항체에 결합하거나 또는 작용 활성("시험" 활성, 예를 들어 헬리케이스 활성)을 갖는 능력에 대해 시험한다. 이어서 상기와 같은 활성을 보이는 분획들에 대해 연속적으로 다음 기법을 가하고, 새로운 분획들에 대해 다시 시험한다. 이러한 과정을 상술한 "시험" 활성을 갖는 오직 하나의 분획만이 남고 상기 분획이 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 크로마토그래피를 가할 때 오직 단일 밴드 또는 존재만을 생성시킬 때까지 반복한다.
4. HP56 또는 HP30 면역원 및 항체
본 발명은 HP56, HP30, HP56 유도된 폴리펩티드 또는 HP30 유도된 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기와 같은 항체의 제조를 위해, HP56, HP30, HP56 유도된 폴리펩티드 또는 HP30 유도된 폴리펩티드의 단리 또는 바람직하게는 정제된 제제를 면역원 조성물에서 면역원으로서 사용한다.
실시태양에서, HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 SDS-PAGE를 사용하여 헬리코박터 세포의 추출물 중에 존재하는 다른 단백질로부터 분리시키고(상기 상세한 설명의 섹션 3 참조), HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 함유하는 겔 조각을 면역원으로서 사용하고 동물(예를 들어 토끼)에 주입하여 다클론 HP56 또는 HP30 항체를 함유하는 항혈청을 제조한다. 동일한 면역원들을 사용하여 단클론성 항-HP56 또는 HP30 항체를 생산하는 하이브리도마 주의 제조를 위해 마우스를 면역시킬 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 면역원은 임의의 헬리코박터 균주, 예를 들어 비 제한적으로 헬리코박터 파이로리 또는 헬리코박터 펠리스로부터 단리된 HP56 또는 HP30을 함유하는 PAGE 조각이다. 특히 바람직한 것은 헬리코박터 파이로리 ATCC: 43504, 43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D 및 700932의 균주이다.
다른 실시태양에서, HP56 또는 HP30 폴리펩티드의 펩티드 단편들을 면역원으로서 사용한다. 바람직하게는, 정제된 HP56 또는 HP30의 펩티드 단편들을 사용한다. 상기 펩티드들을 프로테아제 절단, 화학적 합성 또는 재조합적으로 제조할 수 있으며 이어서 단리 및 정제시킨다. 상기와 같은 단리 및 정제된 펩티드들을 면역원으로서 직접 사용할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 유용한 펩티드 단편은 길이가 6 이상의 아미노산이다. 합텐 단백질 배합체에 대한 논의에 대해서, 예를 들어 문헌[Hartlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 또는 표준 면역학 교과서, 예를 들어 문헌[Roitt et al., 1985, IMMUNOLOGY, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO 또는 Klein, J., 1990, IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA]을 참조하시오.
더욱 또 다른 실시태양에서, 고유 HP56 또는 HP30 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체들의 제조를 위해서, 완전 헬리코박터 또는 헬리코박터 세포 용해물을 면역원으로서 사용한다. 상기 세포들을 면역화전에 포름알데히드 또는 글루타르알데히드와 같은 시약으로 고정시킬 수 있다(Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Chapter 15). 상기와 같은 항-완전 세포 항체들은 단클론 항체인 것이 바람직하다. 목적하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 주들을 선별 리간드로서 정제된 HP56 또는 HP30 폴리펩티드, 완전 헬리코박터 세포, 이로부터 제조된 헬리코박터 세포 용해물 또는 헬리코박터 항원을 발현하는 세포를 사용하여 식별할 수 있다. 이들 항체를 유도하기 위한면역원은 임의의 헬리코박터, 예를 들어 비 제한적으로 헬리코박터 파이로리 또는 헬리코박터 펠리스의 완전 세포, 추출물 또는 용해물이다. 바람직한 종들은 43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D 및 700932이다.
헬리코박터 세포 면역화에 의해 생산된 다클론 항체는 다른 헬리코박터 단백질과 결합하는 항체("비 항-HP56 또는 HP30 항체")를 함유하며 따라서 샘플이 다른 헬리코박터 단백질 또는 이들 다른 단백질과 교차 반응성인 물질을 함유하는 것으로 추정되거나 공지된 경우를 이용하는 것은 보다 성가신 일이다. 이러한 상황 하에서, 소정의 샘플 또는 밴드의 항-완전 세포 항체에 의한 임의의 결합을 HP56 또는 HP30 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체들(예를 들어 항-HP56, 항-HP30, 항-HP56 유도되고/되거나 항-HP30 유도된 폴리펩티드)에 의한 동일한 샘플 또는 밴드의 일치하는 결합에 의해서, 또는 경쟁자로서 항-HP56, 항-HP30, 항-HP56 유도되고/되거나 항-HP30을 사용하는 경쟁 시험(즉 항-HP56 항체, 항-HP30 항체, HP56 유도된 폴리펩티드, HP30-유도된 폴리펩티드를 반응 혼합물에 가하여 항-완전 세포 항체에 의한 샘플 결합을 강하시키거나 제거함)에 의해 확인해야 한다. 한편으로, "비-항-HP56 또는 HP30" 항체를 함유하는 상기와 같은 다클론 항혈청들을 표준 접근법 및 방법에 의해 상기와 같은 항체들로부터 제거할 수도 있다. 예를 들어, 상기 비-항-HP30 또는 HP56 항체들을 HP56 또는 HP30 폴리펩티드를 갖지 않는 것으로 공지된 헬리코박터 균주의 세포와의 침전에 의해서; 또는 상기와 같은 세포 또는 그의 세포 용해물을 포함하는 컬럼에의 흡수에 의해 제거할 수도 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 항체를 유도하는데 유용한 면역원은 상기 언급한 개별적인 면역원들 중 임의의 2 개 이상의 혼합물을 포함한다.
본 원에 개시된 면역원들에 의한 동물, 바람직하게는 인간, 토기, 래트, 흰족제비, 마우스, 양, 염소, 소 또는 말의 면역을 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 주 또는 다클론 항체를 함유하는 항혈청을 수득하기 위해서 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 절차에 따라 수행한다.
단클론 항체를 표준 기법에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 예를 들어 미국 특허 제 4,271,145 호 및 4,196,265 호에 개시되어 있다. 간단히, 동물을 면역원으로 면역시킨다. 하이브리도마를 골수종 세포를 갖는 면역된 동물의 비장 세포를 융합시킴으로써 제조한다. 상기 융합 산물을 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 것에 대해 선별한다. 양성 하이브리도마 클론들을 단리시키고 단클론 항체들을 상기 클론들로부터 회수한다.
다클론 및 단클론 항체 모두의 생산을 위한 면역화 섭생은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 면역원을 다수의 경로들, 예를 들어 피하, 정맥 내, 복강 내, 피내, 근육 내, 점막 또는 이들의 조합에 의해 주입할 수 있다. 상기 면역원을 당해 분야에 널리 공지된 방법 및 물질을 사용하여 가용성 형태, 물리적 담체에 부착된 응집체 형태, 겔 조각으로서, 또는 아주반트와 혼합하여 주입할 수 있다. 상기 항혈청 및 항체들을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제할 수 있다.
상기 항체들을 또한 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화하는 삽입물을 갖는 발현 라이브러리 중의 클론을 식별하기 위한 탐침으로서 사용할 수 있다. 항체, HP56, HP30, HP56-유도된 폴리펩티드 또는 HP30-유도된 펩티드를 또한 면역분석(예를 들어 ELISA, RIA, 웨스턴)에 사용하여 생물 시편 중의 헬리코박터 또는 항-헬리코박터 항체를 검출 및/또는 정량화할 수 있다. 본 발명의 항-HP56 또는 HP30 항체들은 헬리코박터 파이로리 또는 헬리코박터 펠리스로부터의 HP56 또는 HP30 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 따라서, 항-HP30 또는 HP56 항체를 헬리코박터 감염의 진단에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체, 예를 들어 비 제한적으로 세포독성, 세포 발육 정지 또는 중화 항체들을 또한 수동 면역화에 사용하여 인간을 포함한 동물의 헬리코박터 감염을 예방 또는 감독시킬 수 있다. (본 원에 사용된 세포독성 항체는 상기 항체에 의해 결합된 세균의 식균 및/또는 완전한 치사를 향상시키는 것이다. 본 원에 사용된 중화 항체는 헬리코박터의 감염성을 감소시키고/시키거나 헬리코박터의 표적 세포에의 결합을 차단하는 것이다). 본 발명의 면역원에 대해 생성된 유효 농도의 다클론 또는 단클론 항체를 숙주에게 투여하여 상기와 같은 효과를 얻을 수 있다. 투여되는 항체의 정확한 농도는 각각의 특정한 항체 제제에 따라다양할 것이나, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 기법을 사용하여 결정할 수 있다. 항체의 투여를 다양한 기법, 예를 들어 비 제한적으로 백신 전달에 대한 발명의 상세한 설명의 섹션 7에 개시된 것들을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 항원 또는 면역원 조성물에 대해 생성된 항혈청, 및 HP56 또는 HP30 단백질 또는 그의 단편 또는 동족체에 특이적으로 결합하는 항혈청 중에 존재하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 항체는 서열 식별 번호: 2 및 4-20로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 HP56-유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드와 결합한다. 또한 서열 식별 번호: 2 및 4-20로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 단클론 항체들이 포함된다.
"항체"란 용어는 모든 형태, 예를 들어 비 제한적으로 다클론, 단클론, 정제된 IgG, IgM 또는 IgA 항체 및 이들의 단편, 예를 들어 비 제한적으로 항원 결합 단편, 예를 들어 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), F(ab)2, Fab 및 F(ab)' 단편(Harlow et al., 1988, Antibody, Cold Spring Harbor); 단일 쇄 항체(미국 특허 제 4,946,778 호) 및 상보적인 결정 부분(CDR)(Verhoeyen and Windust, 1996, Molecular Immunology 2 ed., B.D. Hames and D.M. Glover, IRL Press, Oxford University Press, pp. 283-325) 등을 포함시키고자 한다.
본 발명의 추가의 태양은 항-HP56 또는 항-HP30 항체의 항원 결합 부분 중 하나 이상의 이종(예: 인간) 항체의 하부구조 부분에 도입된 키메릭 또는 인간화된 항체(Morrison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA81:6851, 1984; Neuberger etal., Nature 81:6851, 1984)이다. 본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체는 비-인간 항체보다 인간에서 덜 항원성이나 목적하는 항원 결합 및 다른 활성, 예를 들어 비 제한적으로 중화 활성, 세포독성 활성, 식균 활성 또는 보호 활성을 갖는다.
본 발명의 추가의 태양은 헬리코박터에 특이적인 T 세포 또는 헬리코박터 항원을 나타내는 항원 제공 세포이다. HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드에 특이적인 T 세포가 풍부한 T 세포 제제를 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조 또는 단리시킬 수 있다(상세한 설명의 섹션 8 참조).
5. HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산
DNA 및 RNA를 비롯한, HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 본 발명의 단리된 핵산을 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 통상적인 화학적 접근법 또는 편리한 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 및 한 조의 연속적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 리가제 쇄 반응을 사용하여 합성할 수 있다. 상기 서열을 또한 헬리코박터의 임의의 종들로부터 HP56 또는 HP30 단백질 유전자를 식별 및 클로닝하는데, 예를 들어 헬리코박터 게놈 라이브러리 또는 발현 라이브러리를 선별하는데 사용한다.
특정한 실시태양에서, 상기 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 2 또는 4 또는 48로 나타낸 추론된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 핵산은 상기 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. HP56 또는 HP30의 특히 바람직한 단편은 서열 식별 번호: 2 또는 4로 나타내는 것들 또는 이와 거의 일치하는 서열로부터의 6, 7 또는 8 개 이상의 추론된 아미노산을 가지며 본 발명은 상기 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 폴리펩티드는 서열 식별 번호: 1 또는 3 또는 47의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 특히 바람직한 단편은 서열 식별 번호: 21-36 또는 이와 거의 같은 서열이다.
"단리된 핵산", "단리된 핵산 분자", "단리된 뉴클레오티드" 또는 "단리된 뉴클레오티드 분자"란 용어는 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 분자로서 정의된다. 예를 들어, 살아있는 세균의 게놈 또는 유전자 은행의 일부로서 존재하는 천연 DNA 분자는 단리되지 않으며, 예를 들어 클로닝 사건(증폭)의 결과로서 상기 세균 게놈의 나머지 부분으로부터 분리된 동일한 분자가 단리된다. 전형적으로는, 단리된 DNA 분자는 천연 게놈에서 5' 또는 3' 단부에 바로 인접한 DNA 부분(예를 들어 암호화 부분)이 없다. 상기와 같은 단리된 핵산 분자, 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 분자는 벡터 또는 조성물의 일부일 수 있으며 상기와 같은 벡터 또는 조성물이 그의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다.
본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명은 또한 서열 식별 번호: 1, 3, 47 또는 그의 단편에 하이브리드 형성될 수 있거나 또는 이에 상보적인 핵산을 제공한다. 특정한 태양에서, HP56, HP30, HP56 유도된 폴리펩티드 또는 HP30 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 적어도 10, 15, 25, 50, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850,900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300 또는 1400 연속적인 뉴클레오티드들에 완전히 상보적이거나 상보적인 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 낮은, 보통의 또는 매우 엄격한 조건 하에서 HP56 또는 HP30을 암호화하는 핵산(예를 들어 서열 식별 번호: 1 또는 3을 갖는), 또는 HP56 유도되거나 HP30 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 하이브리드 형성될 수 있는 핵산을 제공한다.
예로서 비 제한적으로, 낮은 엄격성 조건을 사용하는 과정은 하기와 같다(Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:6789-6792): DNA를 함유하는 필터를 35% 포름아미드, 5X SSC, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% 피콜, 1% BSA 및 500 ㎍/㎖의 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 40 ℃에서 6 시간 동안 예열시킨다. 하이브리드화를 동일한 용액에서 하기와 같이 변형시켜 수행한다: 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.2% BSA, 100 ㎍/㎖의 연어 정자 DNA, 10%(중량/부피)의 덱스트란 설페이트 및 5-20 X 106cpm32P-표지된 탐침을 사용한다. 필터를 40 ℃에서 18 내지 20 시간동안 하이브리드화 혼합물에서 배양시키고, 이어서 2X SSC, 25mM 트리스-HCl(pH 7.4), 5mM EDTA 및 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 55 ℃에서 1.5 시간 동안 세척한다. 상기 세척액을 새로운 용액으로 교환하고 60 ℃에서 추가로 1.5 시간 동안 배양시킨다. 필터를 블롯팅 건조시키고 방사능 사진 촬영한다. 경우에 따라, 필터를 65 내지 68 ℃에서 세 번째 세척하고 필름에 재 노출시킨다. 사용될 수 있는 낮은 엄격성에 대한 다른 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 교차 종 하이브리드화에사용되는 것들).
또 다른 특정한 실시태양에서, 매우 엄격한 조건 하에서 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 또는 HP30 또는 HP56-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 하이브리드 형성될 수 있는 핵산을 제공한다. 예로서 비 제한적으로, 상기와 같은 매우 엄격산 조건을 사용하는 과정은 하기와 같다: DNA를 함유하는 필터를, 복원 온도를 50 ℃로 낮추로 6X SSC, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.02% BSA 및 500 ㎎/㎖의 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 완충액을 제외하고, 상술한 바와 같이 65 ℃에서 8 시간 내지 밤새 예비 하이브리드화를 수행한다. 필터를 100 ㎎/㎖의 변성된 연어 정자 DNA 및 5-20 X 106cpm32P-표지된 탐침을 함유하는 예비 하이브리드화 혼합물에서 65 ℃에서 16 또는 48 시간 동안 하이브리드화시킨다. 필터를 2X SSC, 0.01% PVP, 0.01% 피콜 및 0.01% BSA를 함유하는 용액에서 37 ℃에서 1 시간 동안 세척한다. 이어서 방사능 사진 촬영 전에 0.1X SSC에서 50 ℃에서 45 분간 세척한다. 사용될 수 있는 매우 엄격한 다른 조건들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 보통의 엄격한 조건 하에서 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 또는 HP30 또는 HP56-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 하이브리드 형성될 수 있는 핵산을 제공한다.
핵산 하이브리드화를 촉진시키는 다양한 다른 엄격성 조건들을 사용할 수 있다. 예를 들어 하이브리드화를 약 45 ℃에서 6x SSC에서 수행한 다음 50 ℃에서 2x SSC 중에서 세척을 수행할 수 있다. 한편으로, 세척 단계의 염 농도 범위는 50 ℃, 약 5x SSC의 낮은 엄격함에서부터, 50 ℃, 약 2x SSC의 보통의 염격함, 50 ℃, 약 0.2x SSC의 매우 엄격함까지일 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도를 실온에서의 낮은 엄격한 조건에서부터 약 42 ℃의 보통의 엄격한 조건, 약 65 ℃의 매우 엄격한 조건까지 증가시킬 수 있다. 다른 조건들에는 비 제한적으로 0.5M NaHPO4(pH 7.2)/1mM EDTA/7% SDS 중에서 68 ℃에서 하이브리드화, 또는 50% 포름알데히드/0.25M NaHPO4(pH 7.2)/0.25M NaCl/1mM EDTA/7% SDS 중에서 하이브리드화; 이어서 40mM NaHPO4(pH 7.2)/1mM EDTA/5% SDS 중에서 42 ℃에서 세척 또는 40mM NaHPO4(pH 7.2)/1mM EDTA/1% SDS 중에서 50 ℃에서의 세척이 있다. 온도와 염을 모두 변화시키거나, 또는 한편으로 하나 또는 다른 하나의 변수를 일정하게 하면서 다른 것을 변화시킬 수도 있다.
낮은, 보통의 및 매우 엄격한 조건들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며, 특정한 핵산 서열의 염기 조성 및 상기 핵산 서열이 유도되는 특정 유기체에 따라 추정 가능하게 변할 것이다. 상기와 같은 조건들에 대한 지침에 대해서 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57; 및 Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.]을 참조하시오.
게놈 라이브러리의 제조에서, DNA 단편을 제조하며 이 중 일부는 헬리코박터HP30 또는 HP56 단백질의 일부 또는 전부를 암호화할 것이다. 상기 DNA를 다양한 제한 효소들을 사용하여 특정한 부위에서 절단시킬 수 있다. 한편으로, 망간의 존재 하에서 DNase를 사용하여 DNA를 단편화하거나, 또는 상기 DNA를 예를 들어 초음파 처리에 의해 물리적으로 전단시킬 수 있다. 이어서 DNA 단편들을 표준 기법, 예를 들어 비 제한적으로 아가로스 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피 및 슈크로즈 구배 원심분리에 의해 크기에 따라 분리시킬 수 있다. 이어서 DNA 단편들을 적합한 벡터, 예를 들어 비 제한적으로 플라스미드, 코스미드, 박테리오파아지 람다 또는 T4, 박크미드 및 효모 인공 염색체(YAC)에 삽입할 수 있다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; Glover, D.M.(ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II.). 상기 게놈 라이브러리를 표지된 탐침에 대한 핵산 하이브리드화에 의해 선별할 수 있다(Benton and Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961).
상기 게놈 라이브러리를 당해 분야에 널리 공지된 최적의 접근법을 사용하여 HP56 또는 HP30 단백질 중 임의의 펩티드의 아미노산 서열에 상응하는 표지된 변성 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 선별할 수 있다. 사용되는 임의의 탐침은 바람직하게는 15 뉴클레오티드 이상이다.
본 원에 사용된 "탐침"이란 용어는 상기 정의된 바와 같은 엄격한 조건들 하에서 서열 식별 번호: 1 또는 3, 또는 상보적인 서열 또는 안티 센스 서열과 같거나 상동성인 서열을 갖는 핵산에 하이브리드화되는 DNA(바람직하게는 단일 가닥) 또는 RNA 분자를 지칭한다. 일반적으로, 탐침은 서열 식별 번호: 1 또는 3에 나타난 전체 길이 서열보다 현저하게 짧다. 예를 들어, 상기는 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10 내지 약 80 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 특히, 탐침은 서열 식별 번호: 1 또는 3으로 나타낸 서열 또는 상기와 같은 서열에 상보적인 서열의 일부와 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 동일한 서열을 갖는다. 탐침은 이노신, 메틸-5-데옥시시티딘, 데옥시유리딘, 디메틸아미노-5-데옥시유리딘 또는 디아민-2,6-퓨린과 같은 변경된 염기를 함유할 수 있다.
HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA가 삽입된 라이브러리 중의 클론들은 하나 이상의 변성 올리고뉴클레오티드 탐침에 하이브리드 형성할 것이다. 상기와 같은 올리고뉴클레오티드 탐침의 게놈 라이브러리에 대한 하이브리드화는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들어 2 개의 상기 언급한 올리고뉴클레오티드 탐침과의 하이브리드화를 50 ℃에서 2X SSC, 1.0% SDS에서 수행하고 동일한 조건을 사용하여 세척할 수 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 부분 또는 전체 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 클론들을 또한 헬리코박터 발현 라이브러리를 선별함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, 헬리코박터 DNA 또는 RNA로부터 생성된 헬리코박터 cDNA를 단리시키고 랜덤한 단편을 제조하고, 벡터 중에 삽입된 서열이 상기 벡터가 도입되는 숙주 세포에 의해 발현될 수 있도록발현 벡터(예를 들어 박테리오파아지, 플라스미드 파지미드 또는 코스미드)에 연결시킨다. 이어서 다양한 선별 분석들을 사용하여 발현된 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 선택할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 당해 분야에 공지된 방법으로 본 발명의 다양한 항-HP56 또는 HP30 항체를 사용하여 목적하는 클론들을 식별할 수 있다(Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix IV). 상기 라이브러리로부터의 클론 또는 플라크들을 항체와 접촉시켜 결합된 클론들을 식별한다.
실시태양에서, HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 함유하는 콜로니 또는 플라크를 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Olsvick et al., 1989, 29th ICAAC, Houston, Tex.]에 따라 DYNA 비드를 사용하여 검출할 수 있다. 항-HP56 또는 HP30 항체를 DYNA 비드 M280에 가교결합시키고 이들 항체 함유 비드를 사용하여 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 발현하는 콜로니 또는 플라크를 흡착시킨다. HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 발현하는 콜로니 또는 플라크를 상기 비드와 결합하는 것들 중 임의의 것으로서 식별한다.
한편으로, 항-HP56 또는 HP30 항체를 적합한 지지체, 예를 들어 실리카 또는 셀라이트(tm) 수지에 비 특이적으로 고정화시킬 수 있다. 이러한 물질을 사용하여 선행 단락에서 개시한 바와 같이 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 발현하는 세균 콜로니에 흡착시킬 수 있다.
또 다른 태양에서, PCR 증폭을 사용하여 헬리코박터 게놈 DNA로부터 HP56 또는 HP30 단백질의 일부 또는 전부를 암호화하는 실질적으로 순수한 DNA를 제조할 수 있다. 공지된 HP56 또는 HP30 단백질 서열에 대해 변성되거나 또는 달리 상응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 프라이머로서 사용할 수 있다.
예로서, N-말단 프라이머를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 내부의 하부 단백질 암호화 서열에 상보적인 3' 역 PCR 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하여 N-말단-특이적인 HP56 또는 HP30 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 한편으로, 내부 HP56 또는 HP30 암호화 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 하부의 내부 HP56 또는 HP30 단백질 암호화 서열에 상보적인 3' 역 PCR 올리고뉴클레오티드와 함께 5' 전방 PCR 프라이머로서 사용하여 내부 HP56 또는 HP30 특이적인 DNA 단편을 PCR 증폭시킬 수 있다. 한편으로, 상기 전방 프라이머를 C-말단 HP56 또는 HP30 단백질에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 함께 결합시켜 HP56 또는 HP30 단백질 ORF를 PCR 증폭시킬 수 있다. 이들 HP56 또는 HP30 단백질 특이적인 PCR 산물들을 적합한 발현 벡터 내로 클로닝시켜 별도의 단백질 또는 융합 단백질로서 상기 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드의 전부 또는 일부의 합성을 조절할 수 있다. 한편으로, 이들 HP56 또는 HP30 단백질 특이적인 PCR 산물들을 적합하게 표지하고 하이브리드화 탐침으로서 사용하여 상기 HP56 또는 HP30 단백질 유전자의 일부 또는 전부를 게놈 DNA 라이브러리로부터 식별할 수 있다.
PCR을 예를 들어 퍼킨-엘머 세투스 열 순환기와 Taq 폴리머라제(Gene Amp(tm))를 사용하여 수행할 수 있다. PCR 반응에 사용하기 위해서 다수의 상이한 변성 프라이머들을 합성하는 것을 선택할 수 있다. 또한, PCR 반응의 기폭에 사용되는 하이브리드화 조건들의 엄격성을 변화시켜 변성 프라이머들과 헬리코박터 DNA 중의 상응하는 서열들간의 뉴클레오티드 서열 유사성의 정도를 보다 크게 또는 보다 작게 조절할 수 있다. HP56 또는 HP30 단백질을 암호화하는 서열의 분절을 성공적으로 증폭시킨 후에, 상기 분절을 분자적으로 클로닝 및 서열화시키고, 탐침으로서 사용하여 완전한 게놈 클론을 단리시킬 수 있다. 이는 차례로 하기에 개시하는 바와 같이 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열의 결정, 그의 발현에 대한 분석, 및 기능 분석을 위한 그의 단백질 산물의 생산을 허용할 것이다.
일단 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드 암호화 서열이 하나의 헬리코박터 종, 균주 또는 배양종으로부터 단리되었으면, 동일한 접근법을 사용하여 다른 헬리코박터 종, 균주 및 배양종으로부터 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드 암호화 서열을 단리시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드(또는 그의 단편)을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 사용하여, 당해 분야에 공지된 일반적인 기법(상기 참조)을 사용하여 보통 내지 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드 형성하는 다른 DNA 또는 RNA 서열을 수득할 수 있다. 매우 엄격한 조건 하에서 하나의 헬리코박터 균주 또는 배양종으로부터 HP56 또는 HP30 단백질 서열과의 하이브리드화로 다른 균주 및 배양종으로부터의 상응하는 서열을 식별할 것이다. 높은 엄격성 조건은 탐침 길이 및 염기 조성에 따라 변한다. 상기와 같은 조건을 결정하기 위한 공법은 당해 분야에 널리 공지되어있다(Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Chapter 11). 예로서, 길이가 300 염기 이상인 탐침에 적용되는 매우 엄격한 하이브리드화 조건은 68 ℃에서 1 시간 이상 동안 0.1 × SSC/0.1% SDS에서의 최종 세척을 포함한다(Ausbel, et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. New York, p. 2.10.2).
당해 분야의 숙련가는 당해 분야에 널리 공지된 접근법을 사용하여 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드 암호화 서열의 완전한 클론들을 식별할 수 있을 것이다. 단리된 클론 중에 함유된 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드 암호화 서열의 정도를 상기 클로닝된 삽입물을 서열화하고 개방 판독 프레임(ORF)에 의해 암호화된 폴리펩티드의 추론된 크기를 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드의 것과 비교하고/하거나 상기 추론된 아미노산 서열을 정제된 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드의 공지된 아미노산 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드 암호화 서열의 부분 클론들이 단리된 경우, 완전한 클론들을 하이브리드화 탐침으로서 상기 부분 클론의 삽입물을 사용함으로써 단리시킬 수 있다. 한편으로, 완전한 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드 암호화 서열을 그의 클로닝된 HP56 또는 HP30 단백질 삽입물과 함께 이음으로써 중복되는 부분 클론들로부터 다시 제작할 수 있다.
완전한 클론들은 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드의 추론된 아미노산 서열, 또는 상기의 완전한 아미노산 서열을 얻을 수 없는 경우 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드의 펩티드 단편 및 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드의 서열에 상응하는 분자량을 갖는 것의 서열과 합치되거나 거의 일치하는 추론된 아미노산 서열이 있는 ORF를 갖는 것일 수 있다. 더욱이, 완전한 클론들을 발현 벡터 중에 놓인 경우 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드에 특이적인 항체 및 HP56 또는 HP30 단백질 폴리펩티드의 카복시 말단에 특이적인 항체와 결합하는 폴리펩티드를 생산하는 삽입물의 능력에 의해 식별할 수 있다.
HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 및 그의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 하나의 태양에서, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 서열들을 본 원에 교시된 교시에 비추어 재조합 DNA 방법에 의해 HP56 또는 HP30 폴리펩티드 암호화 서열로부터 유도할 수 있다. 예를 들어 HP56 또는 HP30 폴리펩티드의 암호화 서열을 변경시켜 상기 폴리펩티드의 면역원성에 영향을 미치지 않거나 또는 그의 면역원성을 개선시킬 수 있는 아미노산 치환, 예를 들어 상술한 바와 같은 보존성 또는 반 보존성 치환을 일으킬 수 있다. 다양한 방법들, 예를 들어 비 제한적으로 올리고뉴클레오티드 조정된, 부위 특이적인 돌연변이를 사용할 수 있다. 이들 및 당해 분야에 공지된 다른 기법들을 사용하여 단일 도는 다수의 돌연변이, 예를 들어 치환, 삽입, 결실 및 전위를 일으킬 수 있다(Botstein and Shortle, 1985, Science 229:1193-1210).
더욱이, HP30 또는 HP56 폴리펩티드 암호화 서열의 DNA를 제한 효소 또는 엑소뉴클레아제 절단에 의해 불활성화시킬 수 있다. 이종 암호화 서열을 연결 또는 PCR 증폭에 의해 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 암호화 서열에 가할 수 있다. 더욱이, HP30 또는 HP56-유도된 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 DNA를 화학적으로 합성하거나 또는 상기 폴리펩티드의 공지되거나 추론된 아미노산 서열 및 상기 서열에 대한 임의의 목적하는 변경을 근거로 PCR 증폭을 사용하여 합성할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, HP30 또는 HP56 단백질을 암호화하는 DNA는 코돈들이 상기를 생산하는 숙주 세포에서 발현의 증가에 최적화된 합성 DNA이다. 유전자 코드의 변성은 고유 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드로서 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 여전히 생산하면서 뉴클레오티드 서열의 변화를 허용한다. 아미노산에 대한 개별적인 같은 의미의 코돈의 빈도는 원핵생물과 진핵생물 중에서 게놈에 따라 광범위하게 다양하다(Wada et al. Nucleic Acid Research 20:S211-2118, 1992 and Ayers et al. Virology 202:586, 1994; 본 발명에 참고로 인용되어 있다). 코돈 선택 패턴에서 이러한 차이는 펩티드 신장 속도를 조절하는 개별적인 유전자들의 전체 발현 수준에 기여하는 것으로 보인다. 이러한 이유 때문에, 핵산 분자를 코돈 빈도가 단백질이 발현되는 숙주 세포 또는 유기체의 tRNA 빈도를 반영하는 특정한 발현 시스템이 되도록 고안하는 것이 바람직하고 유용하다. 고유 코돈을 숙주 세포에서 고도로 발현되는 유전자의 코돈으로 교환한다. 예를 들어 핵산 분자를 세균 세포(예: 이 콜라이), 효모(예: 피키아), 곤충 세포(예: 드로소필라), 또는 포유동물 세포 또는 동물(예: 인간, 양, 소 또는 마우스 등의 세포 또는 동물)에서 암호화된 단백질의 발현에 최적화시킬수 있다.
유전자 합성 및 DNA 조작에 중요한 제한 효소 부위를 보존 또는 파괴하여 핵산 및 벡터 제작 및 암호화된 단백질의 발현을 용이하게 한다. 본 발명의 합성 유전자 또는 핵산의 제작에서, CpG 서열은 유전자 침묵을 일으킬 수 있으므로 피하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 합성 핵산 분자의 암호화 부분은 서열 "cg"를 포함하지 않거나 서열 "cg"의 발생을 5 개 미만으로 포함한다. 코돈 최적화된 서열을 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 통상적인 기법을 사용하여 합성하고 조립하여 적합한 발현 벡터에 삽입한다.
특히 바람직한 실시태양에서, HP30 또는 HP56 단백질을 암호화하는 합성 핵산은 단백질을 암호화하는 천연 유전자 중의 바람직하지 않거나 덜 바람직한 코돈들이 동일한 아미노산을 암호화하는 바람직한 코돈으로 대체된 하나 이상의 코돈 치환을 포함한다. 예를 들어 인간에서 바람직한 코돈은 Ala(gcc); Arg(cgc); Asn(aac); Asp(gac) Cys(tgc); Gln(cag); Gly(ggc); His(cac); Ile(atc); Leu(ctg); Lys(aag); Pro(ccc); Phe(ttc); Ser(agc); Thr(acc); Tyr(tac); 및 Val(gtg)이다. 덜 바람직한 코돈은 Gly(ggg); Ile(att); Leu(ctc); Ser(tcc); Val(gtc); 및 Arg(cgg)이다. 바람직한 코돈 또는 덜 바람직한 코돈의 설명에 맞지 않는 모든 코돈들은 바람직하지 않은 코돈이다. 일반적으로, 특정 코돈의 바람직한 정도는 고도로 발현된 유전자에서 상기 코돈의 우세에 의해 지시된다. 고도로 발현된 인간 유전자에 대한 코돈 선호는 표 3에 나타낸 바와 같다. 예를 들어, "atc"는 고도로 발현된 포유동물 유전자에서 Ile 코돈의 77%를 나타내고 바람직한 Ile 코돈이며; "att"는 고도로 발현된 포유동물 유전자에서 Ile 코돈의 18%를 나타내고 덜 바람직한 Ile 코돈이다. 서열 "ata"는 고도로 발현된 인간 유전자에서 Ile 코돈의 단지 5%만을 나타내며 바람직하지 않은 Ile 코돈이다. 고도로 발현된 인간 유전자에서 보다 우세한 또 다른 코돈으로 코돈이 치환되면 일반적으로 포유동물 세포에서 상기 유전자의 발현이 증가할 것이다. 따라서, 본 발명은 덜 바람직한 코돈의 바람직한 코돈으로의 치환뿐만 아니라 바람직하지 못한 코돈의 바람직하거나 덜 바람직한 코돈으로의 치환을 포함한다.
합성 핵산을 암호화된 단백질의 발현에 최적화시키며, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자에서 하나 이상의 바람직하지 않거나 또는 덜 바람직한 코돈을 동일한 아미노산을 암호화하는 바람직하거나 보다 바람직한 코돈으로 대체시킨다. 상기 합성 핵산은 상기 암호화된 단백질을 동일한 조건 하에 생체 외 세포 배양 시스템에서 상기 최적화되지 않은 핵산 분자에 의해 발현되는 것의 110% 이상, 125%, 150%, 200%, 500%의 수준으로 발현시킨다. 바람직하게는 상기 핵산 분자의 바람직하지 않은 코돈 및 덜 바람직한 코돈의 10% 이상, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 바람직한 코돈 또는 보다 바람직한 코돈으로 대체시켰다.
특히 바람직한 실시태양에서, 상기 핵산을 인간 또는 포유동물 세포 또는 유기체에서 상기 암호화된 단백질의 발현을 위해 최적화시켰다.
[표 3]
고도로 발현된 인간 유전자에서 코돈 빈도
HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 식별되고 단리된 DNA를 적합한 클로닝 벡터에 삽입시킬 수 있다. 당해 분야에 공지된 다수의 벡터 숙주 시스템을 사용할 수 있다. 본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 "숙주"란 용어는 동물의 생체 내 또는 포유동물 세포 배양액의 생체 외를 지칭한다.
가능한 벡터로는 비 제한적으로 플라스미드 및 변경된 바이러스가 있으나, 상기 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 상용성이어야 한다. 상기와 같은 벡터들에는 비 제한적으로 박테리오파아지, 예를 들어 람다 유도체 또는 플라스미드, 예를 들어 pET, pBAD, pTrcHis, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체가 있다. 클로닝 벡터 내로의 삽입을 예를 들어 DNA 단편을 상보적인 결합성 말단을 갖는 클로닝 벡터에 연결시킴으로써 수행할 수 있다. 그러나, 상기 DNA를 단편화하는데 사용되는 상보성 제한 부위들이 클로닝 벡터에 존재하지 않는 경우, 상기 DNA 분자의 단부들을 효소적으로 변경시킬 수 있다. 한편으로, 임의의 목적하는 부위들을 뉴클레오티드 서열(링커)을 DNA 말단에 연결시킴으로써 생성시킬 수 있으며; 이들 연결된 링커들은 특정한 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 암호화제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 방법에서, 절단된 DNA를 단독중합체성 표지화에 의해 변경시킬 수 있다. 재조합 분자를 형질전환, 형질감염, 감염, 일렉트로포레이션 등을 통해 숙주 세포에 도입시켜 상기 유전자 서열의 다수의 사본들을 생성시킬 수 있다.
또 다른 방법에서, HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 목적하는 DNA를 "산탄 총" 접근법으로 적합한 클로닝 벡터에 삽입시킨 후에 식별 및 단리시킬 수 있다. 예를 들어 크기 분류에 의한 목적하는 서열의 농축을 클로닝 벡터 내로의 삽입 전에 수행할 수 있다.
특정한 실시태양에서, HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자에 의한 숙주 세포의 형질감염으로 상기와 같은 암호화 서열의 다수개의 사본들을 생성시킬 수 있다. 따라서, 상기 암호화 서열을, 형질전환체를 증식시키고, 상기 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자들을 단리하고, 경우에 따라 상기 단리된 재조합 DNA로부터 삽입된 암호화 서열을 회수함으로써 다량으로 수득할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열들은 다른 단백질 유전자의 상보성 연장부를 갖는 2 중 분자를 선택적으로 형성하는 능력으로 인해 유용하다. 용도에 따라, 다양한 하이브리드화 조건들을 사용하여 가변적인 서열 일치를 얻을 수 있다. 특정한 태양에서, HP56 또는 HP30 단백질 암호화 핵산 분자의 10 이상, 15, 25, 50, 100, 200 또는 250 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함하는 핵산들을 제공한다. 특정한 실시태양에서 낮거나, 보통의 또는 매우엄격한 복원 조건 하에서 HP56 또는 HP30 단백질 핵산(예를 들어 서열 식별 번호: 1 또는 3을 갖는 것)에 하이브리드 형성하는 핵산을 제공한다.
고도의 선택성을 위해서, 중복체의 제조에 비교적 엄격한 조건, 예를 들어 비 제한적으로 저염 및/또는 고온 조건, 예를 들어 0.02M 내지 0.15M NaCl에 의해 약 50 내지 70 ℃의 온도를 사용한다. 일부의 용도에 대해서, 덜 엄격한 하이브리드화 조건, 예를 들어 비 제한적으로 0.15M 내지 0.9M의 염, 약 20 내지 55 ℃ 범위의 온도가 요구된다. 하이브리드화 조건을 또한 증가량의 포름아미드를 첨가하여 보다 엄격하게 만듦으로써 하이브리드 중복체를 탈안정화시킬 수 있다. 따라서, 특정한 하이브리드화 조건을 용이하게 조작할 수 있으며, 일반적으로는 이는 목적하는 결과에 따라 선택되는 방법일 것이다.
6. HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드의 재조합 생산
본 발명에 따라, 본 발명의 헬리코박터 단백질을, 특히 천연 단백질을 미량의 독성 물질 또는 다른 오염물질을 포함할 수 있는 헬리코박터 종의 배양액으로부터 단리시키는 경우, 재조합 방법에 의해 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 문제는 단리된 물질 중의 오염물질을 최소화시키는 방식으로 숙주로부터 단리시킬 수 있는 이종 시스템에서 본 발명의 재조합적으로 생산된 단백질을 사용함으로써 피할 수 있다. 이 경우에, 상기는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 의해 형질전환된 적합한 숙주 세포에 의해 생산된다.
본 발명의 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 적합한 발현 벡터, 즉 삽입된 폴리펩티드-암호화 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소들을 함유하는 벡터에 삽입시킬 수 있다. HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 상기가 적합한 조건(예를 들어 적합한 배향 및 정확한 판독 프레임) 하에서 발현되는 방식으로 벡터에 삽입한다. 상기 재조합 발현 벡터는 또한 "발현 수단"을 포함한다. "발현 수단"이란 용어는 단백질을 암호화하는 핵산의 전사 및 번역에 필요한 벡터의 요소, 예를 들어 비 제한적으로 프로모터/인헨서 요소, 복제 부위, RNA 폴리머라제 결합 서열, 리보솜 결합 서열, 표현형 선택(예를 들어 암피실린 또는 테트라사이클린 내성)을 제공할 수 있는 서열, 및 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 레플리콘 및 조절 서열을 지칭한다. 상기 발현 수단을 삽입된 핵산 분자를 발현 벡터에 연결시킴으로써 핵산 분자에 작용적으로 커플링시킨다.
삽입된 서열의 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 프로모터/인헨서 요소들로는 비 제한적으로 동물 세포에서의 발현을 위한 SV40 초기 프로모터 부분(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 세균 세포에서의 발현을 위한 락타마제(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), tac(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25) 또는 trc의 프로모터("재조합 세균으로부터의 유용한 단백질" in Scientific American, 1980, 242:74-94 참조); 식물 세포에서의 발현을 위한 노팔린 합성효소 프로모터 부분 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), 및 광합성 효소 리불로즈 비포스페이트 카복실라제의 프로모터(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); 효모 또는 다른 진균에서의 발현을 위한 Gal4 프로모터, ADC(알콜 데하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터가 있다.
사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소들 중 임의의 하나를 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 서열 및 숙주 세포의 이전 및/또는 전구 서열을 포함하는 키메릭 서열을 발현시킨다. 다른 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 친화성 정제 펩티드, 예를 들어 비 제한적으로 말토오즈 결합 단백질, 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 티오레독신 및 히스티딘 표지와 융합된 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 단백질을 발현시킨다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 키메릭 단백질 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 서열 및 유용한 면역원 펩티드 또는 단백질을 발현시킨다.
DNA 단편을 벡터에 삽입시키기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 적합한 전사/번역 조절 신호 및 폴리펩티드 암호화 서열로 이루어진 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 암호화 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이러한 방법으로는 생체 외 재조합 DNA 및 합성 기법및 생체 내 재조합(유전자 재조합)이 있을 수 있다.
외래 DNA를 효모 숙주에 조입시키는 방법은 알칼리 양이온으로 처리된 완전 효모 세포 또는 스페로플라스트의 형질전환을 포함한다. 형질전환 과정은 대개 형질전환시킬 효모의 종들에 따라 변할 것이다(Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol. 25:141, for Candida; Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:302, for Hansenula; Das et al., 1984, J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology 8:135, for Kluyveromyces; Cregg et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol. 25:141; 미국 특허 제 4,837,148 호 및 4,929,555 호, for Pichia; Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA75;1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153:163, for Saccharomyces; Beach et al., 1981, Nature 300:706, for Schizosaccharomyces; Davidow et al., 1985, Curr. Genet. 10:39를 참조하시오).
HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 3 가지 일반적인 접근법에 의해 식별할 수 있다: (a) 핵산 하이브리드화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 첫 번째 접근법에서, 발현 벡터에 삽입된 외래 유전자의 존재를 상기 삽입된 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 암호화 서열과 상동성인 서열 포함하는 탐침을 사용하여 핵산 하이브리드화에 의해 탐지할 수 있다. 두 번째 접근법에서, 재조합 벡터/숙주 시스템을 상기 벡터 중의 외래 유전자의 삽입에 의해 야기된 특정한 "마커" 유전자 기능(예를 들어 티미딘 키나제 활성, 항생제 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스 중의 흡장체의 형성 등)의 존재 또는 부재를 근거로 식별 및 선택할 수 있다. 예를 들어, 이 콜라이를 암피실린 및 테트라사이클린 내성 세포에 대한 유전자를 함유하는 pBR322를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 암호화 서열을 벡터의 마커 유전자 서열 내에 삽입하는 경우, 상기 삽입체를 함유하는 재조합체를 상기 마커 유전자 기능의 부재에 의해 식별할 수 있다. 세 번째 접근법에서, 재조합 발현 벡터를 상기 재조합체에 의해 발현된 외래 유전자 산물을 분석하여 식별할 수 있다. 상기와 같은 분석은 예를 들어 생체 외 분석 시스템에서 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드의 물리적 또는 작용 활성, 예를 들어 컬럼에 대한 His 표지의 결합, 리간드 또는 수용체에 대한 결합, 또는 본 발명의 항-HP56 또는 HP30 항체와의 결합을 기본으로 할 수 있다.
세균 숙주에서 이종 단백질을 발현시키기 위한 상업적으로 입수할 수 있는 벡터로는 비 제한적으로 pZERO, pTrc99A, pUC19, pUC18, pKK223-2, pEX1, pCAL, pET, pSPUTK, pTrxFus, pFastBac, pThioHis, pTrcHis, pTrcHis2 및 pLEx가 있다. 예를 들어 람다 GEM(tm)-11의 파아지를 숙주 세포, 예를 들어 이 콜라이 LE392의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 파지 벡터의 제조에 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 벡터는 pQE30 또는 pBAD/ThioE이며, 이를 숙주 세포, 예를 들어 이 콜라이의 형질전환에 사용할 수 있다.
다수의 효모로의 형질전환을 위한 발현 및 형질전환 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들어 발현 벡터들이 하기의 효모들에 대해서 개발되었다: 칸디다 알비칸스, Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:142; 칸디다 말토사, Kunze, et al., 1985, J. Basic Microbiol. 25:141; 한세눌라 폴리모르파, Gleeson, et al., 1986, J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:302; 클루이베로마이세스 프라질리스, Das, et al., 1984, J. Bacteriol. 158:1165; 클루이베로마이세스 락티스, De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg, et al., 1990, Bio/Technology 8:135; 피키아 퀼레리몬디, Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol. 25:141; 피키아 파스토리스, Cregg, et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3376; 미국 특허 제 4,837,148 호 및 4,929,555 호; 사카로마이세스 세레비지아에, Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153:163; 시조사카로마이세스 폼베, Beach et al., 1981, Nature 300:706; 및 야로위아 리폴리티카, Davidow, et al., 1985, Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin et al., 1985, Curr. Genet. 10:49.
다양한 숙주-벡터 시스템을 사용하여 폴리펩티드 암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 여기에는 비 제한적으로 바이러스(예를 들어 우두 바이러스, 아데노 바이러스 등)로 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들어 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 미생물, 예를 들어 호모 벡터 함유 효모, 또는 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균, 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물이 있다. 본 발명의 핵산 분자, 그의 단편, 동족체 또는 변체의 발현에 적합한 숙주로는 이 콜라이, 바실러스 종, 헤모필루스, 진균, 효모, 예를 들어 사카로마이세스, 피키아, 보르데텔라, 또는 칸디다가 있을 수 있으며, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 효모 또는 세균이다. 이와 관련하에 발현에 특히 바람직한 숙주는 LPS를 갖지 않는, 따라서 내독소가 없는 그람 양성 세균을 포함한다. 가장 바람직하게는 세균은 이 콜라이, 비 서브틸리스 또는 살모넬라이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 또한 하나 이상의 다른 이종 단백질, 예를 들어 비 제한적으로 에이치 파이로리 세포독소(Covacci et al. 2000 미국 특허 제 6,130,059 호), 에이치 파이로리 열 충격 단백질(hsp60)(Covacci et al., 2000 미국 특허 제 6,077,706 호), 에이치 파이로리 CagA(Covacci et al., 2000 미국 특허 제 5,928,865 호), 에이치 파이로리 우레아제(Michetti et al. 1999 미국 특허 제 5,972,236 호), 에이치 파이로리 카탈라제(Doidge et al. 1999 미국 특허 제 6,005,000 호), 에이치 파이로리 니켈 결합 단백질(Plaut et al. 1999 미국 특허 제 5,972,348 호), 에이치 파이로리 tagA(Cover et al. 1999 미국 특허 제 5,876,943 호), 에이치 파이로리 에놀라제(Thompson et al., 1997 미국 특허 제 5,703,219 호), 장 병원성 이 콜라이 HtrA(a/k/a Deg P; Seol et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:730; Lipinska et al., 1990. J. Bacteriol. 172:1791; Pallen et al. 1997, Molecular Microbiol. 26:209)을 발현한다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 목적하는 특정한 방식으로 유전자산물을 변경 및 처리하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 특정한 프로모터로부터의 발현은 몇몇 유발인자의 존재 하에서 상승될 수 있으며; 따라서 유전 공학적인 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드의 발현을 조절할 수 있다. 더욱 또한, 상이한 숙주 세포들은 단백질의 번역 및 후 번역 처리 및 변경을 위한 특성과 특정한 기전을 갖는다. 적합한 세포 주 또는 숙주 시스템을 발현된 외래 단백질의 목적하는 변경과 처리를 보장하도록 선택할 수 있다.
일단 적합한 숙주 시스템 및 생육 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터들을 다량으로 번식 및 제조할 수 있다. 발현 시 본 발명의 재조합 폴리펩티드가 생산되며 이를 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 세포 페이스트, 세포 추출액 또는 재조합 세포 배양액의 원심분리 후 상등액으로부터 실질적으로 정제된 형태로 회수할 수 있다. 예를 들어 재조합 폴리펩티드를 항체-기재 친화성 정제, 예비 겔 전기영동, 또는 상기 재조합 폴리펩티드 중에 포함된 표지(예: 6X 히스티딘 표지)를 사용하는 친화성 정제에 의해 정제할 수 있다(상세한 설명의 섹션 3 참조).
7. 조성물
본 발명은 또한 동물, 예를 들어 인간, 보다 구체적으로는 설치류 및 인간을 포함한 영장류의 헬리코박터 감염에 대한, 백신을 포함한 항원 조성물 및 바람직하게는 면역원 조성물일 수 있는 치료 및 예방 조성물을 제공한다. 바람직한 면역원 조성물은 인간에 사용하기 위한 백신을 포함한다. 본 발명의 항원, 바람직하게는 면역원 조성물을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법에 의해 제조할 수 있으며, 예를 들어 상세한 설명의 섹션 1 또는 2에 개시된 면역학적 유효량의 임의의 HP30 또는 HP56 면역원을 임의로, 융합되거나 또는 결합된 하나 이상의 다른 면역원, 예를 들어 지질, 인지질, 탄수화물, 리포다당류, 헬리코박터 기원 또는 다른 세균 기원의 불활성화되거나 감독된 완전 유기체(들) 및 다른 단백질(들)과 함께, 약학적으로 허용 가능한 담체, 임의로 적합한 아주반트, 및 임의로 백신에서 통상적으로 발견되는 다른 물질들과 함께 포함한다. 상기와 같은 칵테일 백신(다수의 면역원들을 포함하는)은 단일 병원체 또는 하나 이상의 병원체의 하나 이상의 균주에 대한 면역을 단일 투여에 의해 얻을 수 있다는 이점을 갖는다. 다른 면역원들의 예로는 비 제한적으로 공지된 DPT 백신에 사용되는 것들, 에이치 파이로리 세포독소(Covacci et al. 2000 미국 특허 제 6,130,059 호), 에이치 파이로리 열 충격 단백질(hsp60)(Covacci et al., 2000 미국 특허 제 6,077,706 호), 에이치 파이로리 CagA(Covacci et al., 2000 미국 특허 제 5,928,865 호), 에이치 파이로리 우레아제(Michetti et al. 1999 미국 특허 제 5,972,236 호), 에이치 파이로리 카탈라제(Doidge et al. 1999 미국 특허 제 6,005,000 호), 에이치 파이로리 니켈 결합 단백질(Plaut et al. 1999 미국 특허 제 5,972,348 호), 에이치 파이로리 tagA(Cover et al. 1999 미국 특허 제 5,876,943 호), 에이치 파이로리 에놀라제(Thompson et al., 1997 미국 특허 제 5,703,219 호), 장 병원성 이 콜라이 HtrA(a/k/a Deg P; Seol et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:730; Lipinska et al., 1990. J. Bacteriol. 172:1791; Pallen et al. 1997,Molecular Microbiol. 26:209), 캄필로박터 종, 시겔라 종, 장 병원성 이 콜라이 종, 비브리오 콜레라 또는 로타바이러스의 전체 감독되거나 사멸된 유기체 또는 이로부터의 서브유닛이 있다.
본 원에 사용된 "면역학적 유효량"이란 용어는 항체, T 세포, 및/또는 시토킨 및 다른 세포 면역 반응 성분들을 생성시키는 면역 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 바람직하게는, 상기 면역원 조성물은 헬리코박터 감염을 예방하거나 임의의 기존의 또는 후속적인 헬리코박터 감염의 중증도를 감독시키는 것이다. 백신에 사용되는 면역학적 유효량의 면역원은 본 원의 교시에 비추어 당해 분야에 공지된 수단에 의해 결정된다. 정확한 농도는 투여되는 특정한 면역원에 따라 변할 것이나, 면역 반응의 개선을 분석하기 위해 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 기법을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 조성물은 환자에서 면역 반응을 유도한다. 항-HP56 또는 항-HP30 단백질 항체 및 중화, 식균 또는 살균 항체를 포함한 항체를 유도하는 조성물은 본 발명의 하나의 태양이다. 본 발명의 바람직한, 비 제한적인 실시태양들에 따라서, 본 발명 조성물의 유효량은 항체 역가를 투여전 항체 역가의 3 배 이상으로 상승시킨다. 본 발명의 바람직한, 특정의 비 제한적인 실시태양에서, 대략 0.01 내지 2000 ㎍, 바람직하게는 0.1 내지 500 ㎍을 숙주에게 투여한다. 헬리코박터 항원(들)을 발현하는 세포(예를 들어 항원 제공 세포, 예를 들어 비 제한적으로 수지상 세포 및 대식세포)와 반응성이거나 살균성인 T 세포 반응을 유도하는 조성물이 또한 본 발명의 태양이다. 아주반트를 또한 포함하는 조성물이 바람직하다. 에이치 파이로리에 대해 살균 활성을 갖는 항생제, 예를 들어 비 제한적으로 메프라졸, 클라리쓰로마이신, 오메프라졸, 메트로니다졸, 테트라사이클린, 란소프라졸 또는 아목시실린을 또한 포함하는 조성물이 바람직하다.
배합된 면역원 및 담체 또는 희석제는 수용액, 유화액 또는 현탁액이거나, 또는 건조된 제제일 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 면역원의 양은 용량 당 0.1 내지 500 ㎍일 것이다. 담체는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 안정화제, 희석제 및 완충제를 포함한다. 적합한 안정화제로는 탄수화물, 예를 들어 솔비톨, 락토오즈, 만니톨, 전분, 슈크로즈, 덱스트란 및 글루코즈, 및 단백질, 예를 들어 알부민 또는 카제인이 있다. 적합한 희석제로는 염수, 행크 평형 염, 및 링거액이 있다. 적합한 완충액으로는 알칼리 금속 포스페이트, 알칼리 토 카보네이트, 또는 알칼리 토금속 카보네이트가 있다.
본 발명의 면역원 조성물, 예를 들어 백신을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법에 의해 제조한다. 일반적으로는, 면역원을 담체와 혼합하여 용액, 현탁액 또는 유화액을 제조한다. 상기 논의된 첨가제들 중 하나 이상이 담체 중에 존재하거나 또는 후속적으로 첨가할 수 있다. 상기 백신 조성물을 예를 들어 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 보관 또는 제형화를 목적으로 건조시킬 수 있다. 상기를 후속적으로 적합한 액체 담체의 첨가에 의해 액체 백신으로 재 조성시키거나 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 건조 제형, 특히 캡슐 또는 정제 형태로 투여할 수 있다.
유효량의 본 발명의 항원, 면역원, 약제 조성물(비 제한적으로 백신 포함)을투여해야 하며, 이때 "유효량"이란 환자에게 목적하는 예방, 치료 또는 개선 반응, 예를 들어 비 제한적으로 면역 반응을 생성시키기에 충분한 양으로서 정의된다. 필요한 양은 HP56, HP30 단백질, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드, 사용된 핵산 및 종들의 면역원성, 및 투여하려는 환자의 체중에 따라 변할 것이나, 표준 기법을 사용하여 확인할 수도 있다.
면역원, 항원, 약학 및 백신 조성물은 하나 이상의 보조 물질, 예르 들어 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 또는 이들의 효과를 향상시키기 위한 아주반트를 또한 함유할 수도 있다. 면역원, 항원, 약학 및 백신 조성물을 인간 또는 다른 포유동물, 예를 들어 반추 동물, 설치류 또는 영장류에게 비 경구, 피내, 복강 내, 피하 또는 근육 내로 투여할 수 있다.
한편으로, 본 발명에 따른 면역원, 항원, 약학 및 백신 조성물을 점막 표면(들)에서 면역 반응을 일으키는 방식으로 제형화 및 전달할 수 있다. 따라서, 상기 면역원, 항원, 약학 및 백신 조성물을 예를 들어 코, 구강, 눈, 기관지, 질 내 또는 직장 내 경로에 의해 점막 표면(들)에 투여할 수 있다. 한편으로, 좌약 및 경구 제형을 포함한 다른 투여 방식이 바람직할 수도 있다. 좌약의 경우, 결합제 및 담체는 예를 들어 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있다. 경구 제형은 통상적으로 사용되는 성분들, 예를 들어 약제 등급의 사카린, 셀룰로즈 및 마그네슘 카보네이트를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 미소구, 나노구, 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며 약 0.001 내지 95%의 HP56, HP30 단백질, HP56-유도되거나HP30-유도된 단백질을 함유할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 경구 제형은 장용 보호된, 예를 들어 장용 코팅된 제형의 형태이다. 상기 면역원, 항원, 약학 및 백신 조성물을 상기 투여 제형과 상용성인 방식, 및 치료 또는 예방학적으로 효과적이거나, 보호성이거나 면역원성인 양으로 투여한다. 아주반트를 추가로 함유하는 조성물이 바람직하다.
더욱이, 상기 면역원, 항원, 약학 및 백신 조성물을 점막 표면과 같은 면역 시스템의 특정한 세포로 전달하기 위해 하나 이상의 표적 분자와 함께 또는 이에 결합시켜 사용할 수 있다. 몇몇 예로서 비 제한적으로 비타민 B12, 세균 독소 또는 그의 단편, 단클론 항체 및 다른 특정한 표적화 지질, 단백질, 핵산 또는 탄수화물이 있다.
투여되는 양은 치료하려는 환자, 예를 들어 항체를 합성하는 개인 면역 시스템의 능력, 및 경우에 따라 세포 매개된 면역 반응을 생성시키는 능력에 따라 변한다. 투여가 필요한 유효 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따른다. 그러나, 적합한 용량 범위는 당해 분야의 숙련가들에 의해 쉽게 측정이 가능하며, HP56, HP30 단백질, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드의 0.1 내지 1000 ㎍ 정도일 수 있다. 초기 투여 및 두 번째 예방 주사에 적합한 섭생도 또한 가변적이나, 초기 투여에 이은 후속적인 투여를 포함할 수 있다. 상기 용량은 또한 투여 경로(들)에 따라 변할 수 있으며 숙주의 크기에 따라 변할 것이다. 본 발명에 따른 항원, 면역원 또는 약학 조성물 중의 HP56, HP30 단백질, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드의 농도는 일반적으로 약 0.001 내지 95%이다.
백신을 포함한 상기 항원, 면역원 또는 약학 제제는 면역자극 물질로서 HP56, HP30 단백질, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부를 포함하는 뉴클레오티드 벡터를 포함할 수 있다.
백신은 하나 이상의 HP56, HP30 단백질, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 또는 본원에 개시된 융합 단백질들을 암호화하는 핵산 분자를 포함하여, 상기 폴리펩티드를 동일 반응계에서 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 백신에서, 상기 핵산 분자는 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 임의의 다양한 전달 시스템 내, 예를 들어 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스 발현 시스템 내에 존재할 수 있다. 적합한 핵산 발현 시스템은 적합한 프로모터 및 종결 신호와 같이 환자에서의 발현에 필요한 핵산 분자 서열을 함유한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 핵산 분자를 비 병원성(결함) 바이러스의 사용을 수반할 수 있는 바이러스 발현 시스템(예를 들어 우두 또는 다른 수두 바이러스, 알파바이러스 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입시킬 수 있다. 핵산 분자를 상기와 같은 발현 시스템에 도입시키기 위한 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 상기 핵산 분자를 또한 예를 들어 문헌[Ulmer et al., 1992, Science 259:1745-1749]에 개시되고 문헌[Cohen, 1993, Science 259:1691-1692]에 의해 재 고찰된 "노출" 플라스미드 벡터로서 투여할 수 있다. DNA를 상기와 같은 벡터에 결합시키는 기법들은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 레트로바이러스 벡터는 선택성 마커(형질도입된 세포의 식별 또는 선택을 돕기 위해서) 및/또는 표적 잔기, 예를 들어 특정한 표적 세포 상의 수용체에 대한리간드를 암호화하는 유전자를 추가로 전달 또는 결합시켜 상기 벡터를 표적 특이적으로 만들 수 있다. 표적화를 또한 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 치료 또는 예방을 목적으로 백신으로서 투여할 수 있다. 전형적으로는 DNA 분자를 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 프로모터의 통제 하에 둔다. 상기 프로모터는 편재되거나 조직 특이적으로 작용할 수 있다. 비-조직 특이적인 프로모터의 예로는 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(미국 특허 제 4,168,062 호에 개시됨) 및 라우스 육종 바이러스 프로모터(Norton and Coffin, 1985, Molec. Cell Biol. 5:281)가 있다. 데스민 프로모터(Li et al., 1989, Gene 78:243, Li Paulin, 1991, J. Biol Chem 266:6562 및 Li & Paulin, 1993, J. Biol Chem 268:10401)는 조직 특이적이며 근육 세포에서 발현을 구동한다. 보다 일반적으로는, 유용한 벡터들이 WO94/21797 및 문헌[Hartikla et al., 1996, Human Gene Therapy 7:1205]에 개시되어 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 함유할 수 있다. 상기는 또한 또 다른 헬리코박터 항원 또는 단편 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 에이치 파이로리 세포독소(Covacci et al. 2000 미국 특허 제 6,130,059 호), 에이치 파이로리 열 충격 단백질(hsp60)(Covacci et al., 2000 미국 특허 제 6,077,706 호), 에이치 파이로리 CagA(Covacci et al., 2000 미국 특허 제 5,928,865 호), 에이치 파이로리 우레아제(Michetti et al. 1999 미국 특허 제 5,972,236 호), 에이치 파이로리 카탈라제(Doidge et al. 1999 미국 특허 제 6,005,000 호), 에이치 파이로리 니켈 결합 단백질(Plaut et al. 1999 미국 특허 제 5,972,348 호), 에이치 파이로리 tagA(Cover et al. 1999 미국 특허 제 5,876,943 호) 및 에이치 파이로리 에놀라제(Thompson et al., 1997 미국 특허 제 5,703,219 호) 또는 장 병원성 이 콜라이 HtrA를 암호화하는 하나 이상의 추가적인 핵산 분자를 함유할 수 있다. 시토킨, 예를 들어 인터류킨-1, 인터류킨-4, 인터류킨-12 또는 인터페론을 암호화하는 핵산 분자를 상기 조성물에 첨가하여 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 DNA 분자 및/또는 추가적인 DNA 분자는 동일한 조성으로 상이한 플라스미드 또는 벡터 상에 있거나 또는 동일한 플라스미드 또는 벡터 중에 수반될 수 있다.
치료용 핵산 분자의 다른 제형들은 멸균 염수 또는 멸균 완충 염수, 콜로이드 분산 시스템, 예를 들어 거대분자 복합체, 나노캡슐, 실리카 미세입자, 텅스텐 미세입자, 금 미세입자, 미소구, 비드 및 지질 기재 시스템, 예를 들어 수중 유적형 유화액, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜을 포함한다. 생체 외 및 생체 내 전달 비히클로서 사용하기에 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜(즉 인공 소낭)이다. 노출된 핵산 분자의 흡수는 상기 핵산 분자를 생분해성 비이드(세포 내로 효율적으로 운반된다) 내 및/또는 상으로 혼입시킴으로써 증가될 수 있다. 상기와 같은 시스템의 제조 및 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
핵산 분자를 세포 흡수를 돕는 시약(들)과 회합시킬 수 있다. 상기를 세포 투과성을 변경시키는 화학 시약, 예를 들어 부피바카인(예를 들어 WO94/16737 참조)과 배합시킬 수 있다.
양이온성 지질이 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 DNA 전달에 통상적으로사용된다. 상기와 같은 지질로는 DOTMA(N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP(1,2-비스(올레일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판, DDAB(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드), DOGS(디옥타데실아미돌로그리실 스페르민) 및 콜레스테롤 유도체, 예를 들어 DC-Chol(3 베타-(N-(N',N'-디메틸 아미노메탄)-카바모일)콜레스테롤로서도 공지된 리포펙틴TM이 있다. 이들 양이온성 지질에 대한 설명은 EP187,702, WO90/11092, 미국 특허 제 5,283,185 호, WO91/15501, WO95/26356 및 미국 특허 제 5,527,928 호에서 찾을 수 있다. DNA 전달을 위한 양이온성 지질을 예를 들어 WO90/11092에 개시된 바와 같이 DOPE(디올레일 포스파티딜에탄올아민)과 같은 중성 지질과 함께 사용하는 것이 바람직하다.
다른 형질감염 촉진 화합물(들)을 양이온성 리포솜을 함유하는 제형에 첨가할 수 있다. 상기는 핵 막을 통해 DNA의 운반을 촉진시키는데 유용한 스페르민 유도체(WO93/18795 참조) 및 막-투과 화합물, 예를 들어 GALA, 그라미시딘 S 및 양이온성 담즙 염(WO93/19768 참조)을 포함한다.
백신 수용자에 사용되는 핵산 분자의 양은 예를 들어 DNA 구조물에 사용되는 프로모터의 강도, 발현되는 유전자 산물의 면역원성, 투여 방식 및 제형의 유형에 따라 변한다. 일반적으로 인간 성인에게 약 0.1 내지 약 110 ㎎, 바람직하게는 약 10 내지 약 80 ㎎, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 25 ㎎의 치료 또는 예방 유효량을 투여할 수 있다. 상기 투여는 단일 용량으로 또는 나누어 반복 투여할 수 있다.
투여 경로는 백신 분야에 사용되는 임의의 통상적인 경로일 수 있다. 일반적인 지침으로서, 본 발명의 핵산 분자를 점막 표면, 예를 들어 눈, 비 내, 폐, 구강, 장, 직장, 질 및 요관 표면을 통해서; 또는 비 경구 경로, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내, 피내, 상피 내 또는 근육 내 경로를 통해 투여할 수 있다. 투여의 선택은 선택되는 제형에 따라 변할 것이다. 예를 들어 부피바카인과 관련하여 제형화된 핵산 분자는 근육에 투여하는 것이 유리하다.
시겔라, 살모넬라, 비브리오 콜레라, 락토바실러스, BCG 및 스트렙토코커스를 포함한, HP56, HP30 단백질, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 재조합 발현을 위해 유전자 조작된 재조합 세균 백신을 또한 헬리코박터 감염의 예방 또는 치료를 위해 사용할 수 있다. 생 경구 백신으로서 유용한 비-독물 발생의 비브리오 콜레라 변이주가 문헌[Mekalanos et al., Nature 306:551 1983] 및 미국 특허 제 4,882,278 호에 개시되어 있다. 본 발명의 DNA 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체를 발현할 수 있는 비브리오 콜레라 균주의 유효 백신 용량을 투여할 수 있다. 바람직한 투여 경로로는 모든 점막 경로, 가장 바람직하게는 비 내 또는 경구 경로가 있다.
이종 항원의 재조합 발현을 위해 유전자 조작되거나 되지 않은 감독된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 경구 백신으로서의 그의 용도가 문헌[Nakayama et al., 1988, Bio/Technology 6:693] 및 WO92/11361에 개시되어 있다. 바람직한 투여 경로는 모든 점막 경로, 가장 바람직하게는 비 내 또는 경구 경로를 포함한다.
백신 벡터로서 유용한 다른 세균 균주들이 문헌[High et al., 1992, EMBO 11:1991; Sizemore et al., 1995, Science 270:299(시겔라 플렉스네리); Medagliniet al., 1995, Proc Natl. Acad. Sci. US92:6868(스트렙토코커스 고르도니); 및 Flynn, 1994, Cell Mol. Biol. 40:31], WO88/6626, WO90/0594, WO91/13157, WO92/1796 및 WO02/21237(Bacille Calmette Guerin)에 개시되어 있다.
유전자 조작된 재조합 세균 벡터에서, 본 발명의 핵산 분자(들)를 세균 게놈에 삽입하거나, 플라스미드 상에 싣거나 또는 유리 상태로 있게 할 수 있다.
백신제로서 사용되는 경우, 본 발명의 재조합 세균 백신, 핵산 분자 및 폴리펩티드를 다단계 면역 과정의 일부로서 순차적으로 또는 동시에 사용할 수 있다. 예를 들어, 포유동물을 먼저 본 발명의 백신 벡터, 예를 들어 수두 바이러스에 의해 비 경구 경로를 통해 개시시키고, 이어서 폴리펩티드에 의해 예를 들어 점막 경로를 통해 수회 부양시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 포유동물을 점막 경로를 통해 폴리펩티드로 백신 접종하고 동시에 또는 조금 후에, 근육 내 경로를 통해 핵산 분자로 백신 접종할 수 있다.
아주반트를 또한 재조합 세균을 함유하는 백신 조성물에 가할 수 있다. 체액 면역 반응(HIR)과 세포 매개된 면역(CMI)을 효율적으로 유도하기 위해서, 면역원들을 전형적으로는 아주반트로 유화시킨다. 면역원성은 면역원이 아주반트와 동시에 투여되는 경우 상당히 개선될 수 있다. 아주반트는 투여 부위 부근에서 면역원을 국소적으로 유지시켜 저장소 효과를 형성시킴으로써 면역 시스템 세포로의 항원의 서방성 방출을 용이하게 하는 작용을 한다. 아주반트는 또한 상기 면역 시스템의 세포들을 면역원 저장소로 모아 상기와 같은 세포들이 면역 반응을 도출시키도록 자극할 수 있다.
다수의 아주반트는 독성이어서, 육아종, 급성 및 만성 염증(프로인트 완전 아주반트, FCA), 세포분해(사포닌 및 플루로닉 중합체) 및 발열, 관절염(LPS 및 MDP)을 유발한다. FCA가 탁월한 아주반트이며 연구에 널리 사용된다 하더라도, 그의 독성으로 인해 인간 또는 수의학적 백신에 사용이 허가되지 않는다.
면역자극제 또는 아주반트는 수년간 예를 들어 백신에 대한 숙주 면역 반응을 개선시키기 위해서 사용되어 왔다. 고유 아주반트, 예를 들어 리포다당류가 통상적으로 백신으로서 사용된 사멸되거나 감독된 세균의 성분이다. 외래 아주반트는 전형적으로 항원에 비 공유적으로 결합된 면역조절제이며 숙주 면역 반응을 향상시키기 위해 제형화된다. 따라서, 아주반트는 비 경구 전달되는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 것으로 확인되었다. 수산화 알루미늄, 산화 알루미늄 및 인산 알루미늄(집합적으로 통상 알룸이라 지칭한다)이 인간 및 수의학적 백신에 아주반트로서 통상적으로 사용된다. 디프테리아 및 파상풍 변성 독소에 대한 항체 반응을 증가시킴에 있어서 알룸의 효능이 잘 확립되어 있으며 HBsAg 백신에 알룸이 도움이 되어 왔다.
다른 외래 아주반트로는 케모킨, 시토킨(예: IL-2), 막 단백질 항원에 착화된 사포닌(면역 자극 착체), 무기오일과의 복수 중합체, 무기 오일 중의 사멸된 마이코박테리아, 프로인트 완전 아주반트, 세균 산물, 예를 들어 뮤라밀 디펩티드(MDP) 및 리포다당류(LPS)뿐만 아니라 지질 A 및 리포솜이 있을 수 있다.
본 원에 참고로 인용된 국제 특허 출원 PCT/US95/09005 및 미국 특허 제 6,019,982 호에는 장 병원성 이 콜라이의 열 불안정성 독소의 변성된 형태("mLT")가 개시되어 있다. 본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,057,540 호에는 남아메리카 나무인 퀼리아자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터의 사포닌의 HPLC 정제된 무독성 분획인 QS21 아주반트가 개시되어 있으며, 3D-MPL이 영국 특허 제 2,220,211 호(본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 개시되어 있다.
1989년 8월 8일자로 록호프(Lockhoff)에게 허여된 미국 특허 제 4,855,283 호(본 발명에 참고로 인용되어 있다)는 N-글리코실아미드, N-글리코실우레아 및 N-글리코실카바메이트를 포함한 당지질 동족체가 개시되어 있으며, 이들은 각각 당 잔기가 면역 조절제 또는 아주반트로서 아미노산으로 치환된다. 록호프는 N-글리코포스포리피드 및 글리코글리세로리피드가 헤르페스 단일체 바이러스 백신 및 슈도라비에스 바이러스 백신 모두에서 강한 면역 반응을 유도할 수 있음을 보고하였다. 일부 당지질들을 천연 지질 잔기의 기능을 모의하기 위해서 변형 탄소원자를 통해 당과 직접 결합된 장 쇄 알킬아민과 지방산으로부터 합성하였다.
본 발명에 참고로 인용된 몰로니(Moloney)에게 허여된 미국 특허 제 4,258,029 호는 옥타데실 티로신 하이드로클로라이드(OTH)가 테타누스 변성 독소 및 포르말린 불활성화된 유형 I, II 및 III 소아마비 바이러스 백신과 착화 시 아주반트로서 작용함을 교시한다. 합성 펩티드의 지질화를 또한 사용하여 그의 면역원성을 증가시켰다.
따라서, 본 발명에 따라, HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편, 이를 발현하는 벡터 또는 세포을 암호화하는 핵산을 포함하는 백신을 포함한 면역원, 항원, 약학 조성물은 아주반트, 예를 들어 비 제한적으로 알룸, mLT(장 병원성 이 콜라이의 변형된 불안정 독소), QS21, MMPL, CpG DNA, MF59, 인산 칼슘, PLG 및 상기 열거된 모든 것들을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 아주반트를 하기의 것들 중 하나 이상으로부터 선택한다: 알룸, QS21, CpG DNA, PLG, LT, 3D-mPL, 또는 BCG 및 이들, 특히 mLT의 변이되거나 변경된 형태,예를 들어 LTR192G 또는 AB5. 본 발명의 조성물은 또한 적합한 약학 담체, 예를 들어 비 제한적으로 염수, 비카보네이트, 덱스트로즈 또는 다른 수용액을 포함할 수 있다. 다른 적합한 약학 담체들이 본 분야의 표준 교과서인 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company](본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 개시되어 있다.
백신을 포함한 면역원, 항원 및 약학 조성물을 적합한 무독성 약학 담체로 투여할 수 있으며, 미세캡슐에 포함시키고/시키거나 서방성 임플란트에 포함시킬 수 있다.
백신을 포함한 면역원, 항원 및 약학 조성물을 항체 수준 및/또는 T 세포 수준을 지속시키기 위해서 수회 간격으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 백신을 포함한 면역원, 항원 및 약학 조성물을 다른 살균 또는 세균 발육 정지 방법에 함께 사용할 수 있다.
본 발명 백신의 또 다른 실시태양은 하기 중 하나 이상을 포함하고:
a) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정 시 56 kDa의 분자량을 갖는, 헬리코박터 종의 단리된 HP56;
b) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정 시 30 kDa의 분자량을 갖는,헬리코박터 종의 단리된 HP30;
c) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정 시 56 kDa의 분자량을 갖는, 헬리코박터 종의 단리된 HP56 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산; 또는
d) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정 시 30 kDa의 분자량을 갖는, 헬리코박터 종의 단리된 HP30 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산;
mLT, QS21, MF59, CpG DNA, PML, 인산 칼슘, 황산 칼슘 이수화물 및 PLG로 이루어진 그룹 중에서 선택된 한 이상의 성분을 또한 포함하는 백신이다.
본 발명은 동물을 유효량의 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드들 중 하나를 암호화하는 핵산 분자, 이를 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 백신으로 면역시킴을 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 생성시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 이를 포함하는 조성물 및 백신을 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 동시에 투여되는 예로는 동일하거나 상이할 수 있는 2 개 이상의 폴리펩티드, 핵산, 조성물 또는 백신을 동일하거나 상이한 제형으로 투여하거나 또는 별도로, 예를 들어 상이하거나 동일한 제형으로 단시간(예를 들어 수분 또는 수 시간)에 투여하는 경우가 있다. 순차적인 투여의 예로는 동일하거나 상이할 수 있는 2 개 이상의 폴리펩티드, 핵산, 조성물 또는 백신을 서로 단시간 안에 함께 투여하지 않지만, 예를 들어 수일, 수주, 수 개월 또는 수 년의 간격으로 별도로 투여할 수 있는 경우를 포함한다.
본 발명은 또한 헬리코박터 살균 활성을 갖는 항생제를 본 발명의 임의의 백신 조성물과 함께 이의 투여 전, 투여와 동시에 또는 순차적으로 투여하여 헬리코박터 감염과 관련된 질병을 치료 또는 개선시킴을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 재조합 세균 백신이 또한 상술한 항체 또는 T 세포의 생산에 유용하다. T 세포의 경우, 인간을 포함한 동물을 상술한 바와 같이 면역시킨다. 면역에 이어서, 말초 혈액 세포(PBL), 비장 세포 또는 림프절 세포를 수확하고 다수의 림프구를 혈청을 함유하는 매질을 갖는 플레이크에 놓아 생체 외에서 자극한다. 본 발명의 폴리펩티드를 가한다. T 세포를 수확하고 X-조사된 말초 혈액 단핵구가 있는 새로운 플레이크에 놓는다. 폴리펩티드를 직접 가한다. 세포를 IL-2의 존재 하에서 증식시킨다. 세포가 헬리코박터 특이적인 T 세포인 것으로 나타나는 즉시, 상기는 보다 높은 IL-2(20 단위)와 함께 자극 주기로 변하여 이들을 확장시킨다.
한편으로, 본 발명의 폴리펩티드의 존재 하에서 증식하는 하나 이상의 T 세포를 클로닝에 의해 수적으로 확장시킬 수 있다.
세포의 클로닝 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, T 세포주를 생체 외에서 확립시키고 제한 희석에 의해 클로닝시킬 수 있다. 응답 T 세포를 조사된 자가 이식 충전 세포의 존재 하에서 공칭 항원으로 자극함으로써 배양액에서 확립된 말초 혈액으로부터 정제시킨다. CD4+ T 세포 주를 생성시키기 위해서, 헬리코박터 폴리펩티드를 항원 자극으로서 사용하고 엡스타인 바 바이러스에 의해 고정화된 자가 이식 PBL 또는 림프모세포성 세포 주(LCL)를 항원 제공 세포로서 사용한다. CD8+ T 세포주를 생성시키기 위해서, 적합한 헬리코박터 폴리펩티드를 생산하는 발현 벡터로 형질감염된 자가이식된 항원 제공 세포를 자극세포로서 사용할 수 있다. T 세포 주를 PBL 또는 LCL 세포 및 재조합 인터류킨-2(rIL2)(50 U/㎖)가 있는 96-웰 평판 플레이트에 자극된 T 세포를 도말함으로써 항원 자극에 이어 확립시킨다. 확립된 클론 성장을 갖는 웰을 초기 도말 및 자가이식 항원 제공 세포의 존재 하에서 적합한 항원에 의해 재 자극시킨 후에 대략 2 내지 3 주 후에 식별하고, 이어서 저 용량의 rIL2를 첨가하여 후속적으로 확장시킨다. T 세포 클론들을 대략 매 2 주 마다 항원 및 rIL2로 주기적으로 재 자극하여 24-웰 플레이트에 유지시킨다.
T 세포 제제를 켄드릭스(Kendricks) 등의 미국 특허 제 5,595,881 호에 개시된 방법을 사용하여 항원 반응성에 특이적인 T 세포를 단리시킴으로써 추가로 농축시킬 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 헬리코박터 감염과 관련된 질병 또는 질환에 걸린 동물에서 질병 증상을 예방, 치료 또는 개선시키는데 유용하다. 이러한 질병 또는 질환에는 비 제한적으로 헬리코박터 세균 감염, B형 위염, 펩티드 궤양, 위암, 예를 들어 선암 및 저 등급 B 세포 림프종이 있다.
8. 면역 분석 및 진단 시약
HP56 또는 HP30 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산 및 이들의 단편은 진단 시약으로서 유용하다. 항-HP56 또는 항-HP30 항체의 생성을 위한 항원 또는 면역원, 또는 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA), 방사능면역분석(RIA) 및 다른 비 효소 결합된 항체 결합 분석 또는 항균, 항-헬리코박터 및 항-HP56 또는 HP30 단백질 항체의 검출을 위해 당해 분야에 공지된 절차를 포함한 면역분석에서 항원으로서의 항원 또는 면역원이 본 발명에 포함된다.
ELISA 분석에서, 단백질을 소정의 표면, 예를 들어 폴리스티렌 미세적정 플레이트의 웰과 같은 단백질과 결합할 수 있는 표면 상에 고정화시킨다. 불완전하게 흡착된 단백질을 제거하기 위해서 세척한 후에, 시험 샘플에 대해 항원적으로 중성인 것으로 공지된 비 특이적인 단백질 용액을 상기 소정의 표면에 결합시킬 수 있다. 이에 의해 상기 고정화 표면에 비 특이적인 흡착 부위가 봉쇄되며 따라서 상기 표면으로의 항혈청의 비 특이적인 결합에 의해 야기되는 백그라운드가 감소된다.
이어서 상기 고정화 표면을 샘플, 예를 들어 시험하려는 임상적 또는 생물학적 물질과 면역 복합체(항원/항체) 형성을 수행하는 방식으로 접촉시킨다. 이는 샘플을 희석제, 예를 들어 소 감마 글로불린(BGG) 및/또는 인산염 완충 염수(PBS)/트윈의 용액으로 희석함을 포함할 수 있다. 이어서 상기 샘플을 약 20 내지 37 ℃ 정도의 온도에서 2 내지 4 시간 동안 배양시킨다. 배양에 이어서, 상기 샘플 접촉 표면을 세척하여 비 면역착화된 물질을 제거한다. 세척 과정은 PBS/트윈 또는 보레이트 완충액과 같은 용액으로의 세척을 포함할 수 있다. 시험 샘플과 결합된 단백질간의 특이적인 면역 복합체의 형성 및 후속적인 세척에 이어서, 면역복합체 형성의 발생 및 심지어 정도를 상기 면역복합체를 첫 번째 항체에 대한 특이성을 갖는 두 번째 항체에 가함으로써 측정할 수 있다. 상기 시험 샘플이 인간 기원의 것인 경우, 상기 두 번째 항체는 인간 면역글로불린에 대해특이성을 갖는 항체이며, 일반적으로 IgG이다.
탐지 수단을 제공하기 위해서, 상기 두 번째 항체는 예를 들어 적합한 색원체 기질과 배양 시 발색되는 효소 활성과 같은 관련 활성을 가질 수 있다. 이어서 색상 발생을 탐지함으로써 탐지를 수행할 수 있다. 이어서 정량분석을 예를 들어 가시 분광광도계를 사용하여 색상 발생 정도를 측정하고 적합한 기준과 비교함으로써 수행할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 다른 탐지 수단을 포함한다.
웨스턴 블럿 분석에서, 정제된 제제 또는 세포 추출물로서 폴리펩티드를 문헌[Laemmli, 1970, Nature 227:690]에 개시된 바와 같이 SDS-PAGE 전기영동에 제공한다. 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮긴 후에, 상기 물질을 약 1:5 내지 1:5000, 바람직하게는 약 1:100 내지 약 1:500의 희석비로 희석한 혈청 샘플, 다클론 항체 제제 또는 단클론 항체와 추가로 배양시킨다. 상기 반응은 표준 과정에 따라 밝혀진다. 예를 들어 인간 항체를 사용한 경우, 상기 멤브레인을 적합한 기간 동안 염소 항-인간 페록시다제 복합체와 배양시킨다. 상기 멤브레인을 세척한다. 상기 반응을 적합한 기질과 함께 진행시키고 정지시킨다. 반응을 착색된 밴드의 출현에 의해 예를 들어 비색측정에 의해 가시적으로 측정한다.
도트 블럿 분석에서, 정제되거나 부분 정제된 폴리펩티드 또는 세포 추출물을 사용할 수 있다. 간단히, 약 100 ㎍/㎖의 항원 용액을 50mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 연속해서 2 배 희석한다. 각 희석액 100 ㎖을 96-웰 도트 블럿 장치에서 니트로셀룰로즈 멤브레인 0.45 um 세트에 건다. 상기 완충액을 시스템에 진공을 걸어 제거한다. 웰을 50 μM 트리스-HCl(pH 7.5)을 첨가하여 세척하고 멤브레인을 공기 건조시킨다. 상기 멤브레인을 차단 완충액(50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.15M NaCl 및 10 g/ℓ의 탈지우유)으로 포화시키고 약 1:50 내지 약 1:500의항혈청 희석액과 함께 배양한다. 상기 반응은 표준 과정에 따라 밝혀진다. 예를 들어, 토끼 항체를 사용하는 경우 염소 항-토끼 페록시다제 복합체를 상기 웰에 가한다. 배양을 37 ℃에서 90 분간 수행하고 블럿을 세척한다. 반응을 적합한 기질을 사용하여 진행시키고 정지시킨다. 반응을 착색된 반점의 출현에 의해 예를 들어 비색측정에 의해 가시적으로 측정한다.
HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산 및 이들의 단편이 또한 항-HP56 또는 HP30 단백질 T 세포 반응의 생산을 위한 항원 또는 면역원으로서, 또는 T 세포 증식 분석, 시토킨 생산, 지연된 과민성 반응 또는 세포독성 T 세포(CTL) 반응을 포함한 면역분석의 항원으로서 유용하다.
헬리코박터 펩티드 특이적인 T 세포 증식성 반응의 분석을 위해서, 새로운 말초 혈액, 비장 또는 림프절 세포를 수확한다. 세포를 96-웰 환저 미세적정 플레이트에 도말하고 펩티드와 함께 배양시킨다. 데이터를 자극 지수(SI)로서 나타내며, 이때 상기 지수는 실험 웰의 평균을 대조용 웰(항원 없음)의 평균으로 나눈 것으로서 정의된다. 헬리코박터 특이적인 T 세포의 표현형(예를 들어 CD4+ 또는 CD8+)의 분석을 면역형광 염색, FACS 분석 또는 적합한 항혈청에 의한 고갈에 의해 측정할 수 있다.
헬리코박터 폴리펩티드에 반응하는 T 세포의 시토킨 방출의 분석을 위해서,응답 세포를 폴리펩티드와 혼합한다. 상등액을 모으고 시토킨에 대한 항체(예: 항-IFN-γ 또는 항-IL-2)로 코팅된 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA)에 가한다. 세척 후에, 토끼 항-시토킨 다클론 항체(예: 항-IFN-γ 또는 항-IL-2)를 가한다. 표지된 염소 항-토끼 IgG 다클론 항체를 가한다. 기질을 가하고 상등액 내로 방출된 시토킨의 양을 ELISA 시험에서 나타난 색의 양을 근거로 측정한다.
또 다른 실시태양은 본 발명에 따른 목적하는 면역분석을 수행하는데 필요한 모든 필수 시약들을 포함하는 진단 키트를 포함한다. 상기 진단 키트는 필수 시약들을 보유하는 하나 이상의 용기들의 조합으로서 상업적으로 패키징된 형태로 제공될 수 있다. 상기와 같은 키트는 HP56, HP30, HP56-유도되거나 HP30-유도된 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산 또는 본 발명의 단클론 또는 다클론 항체를 다수의 통상적인 키트 성분들과 함께 포함한다. 통상적인 키트 성분들은 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 자명할 것이며 다수의 문헌들, 예를 들어 본 발명에 참골 인용된 항체 실험 매뉴얼(E. Harlow, D. Lane, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 개시되어 있다. 통상적인 키트 성분은 예를 들어 미세적정 플레이트, 분석 혼합물의 pH를 유지시키는 완충액(예를 들어 비 제한적으로 트리스, HEPES 등), 결합된 2 차 항체, 예를 들어 페록시다제 결합된 항-마우스 IgG(또는 1 차 항체가 유도된 동물에 대한 임의의 항-IgG) 등, 및 다른 표준 시약들뿐만 아니라 목적하는 분석 또는 시험을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열을 하이브리드화를 측정하기 위해서 적합한 지시 수단, 예를 들어 표지와 함께 사용할 수 있다. 광범위하게 적합한 지시 수단들, 예를들어 방사능, 효소 또는 다른 리간드, 예를 들어 아비딘/비오틴 및 디곡시제닌-표지(이들은 탐지가능한 신호를 제공할 수 있다)가 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 진단 실시태양에서, 우레아제, 알칼리 포스파타제 또는 페록시다제와 같은 효소 표지를 방사능 표지 대신에 사용할 수 있다. 효소 표지의 경우에, HP56 또는 HP30 단백질 유전자 서열을 함유하는 샘플과의 특이적인 하이브리드화를 식별하기 위해서 인간의 눈으로 볼 수 있거나 분광광도측정에 의해 볼 수 있는 수단을 제공하는데 사용될 수 있는 비색측정 지시 기재가 공지되어 있다.
본 발명의 탐침을 진단 시험에 포착 또는 검출 탐침으로서 사용할 수 있다. 상기와 같은 포착 탐침은 공유 결합 또는 수동 흡착에 의해 직접 또는 간접적으로 고체 지지체 상에 통상적으로 고정화될 수 있다. 검출 탐침을 방사능 동위원소, 효소, 예를 들어 페록시다제, 알칼리 포스파타제, 및 색원, 형광 또는 발광 기질을 가수분해시킬 수 있는 효소; 색원성, 형광성 또는 발광성인 화합물; 뉴클레오티드 염기 동족체; 및 비오틴 중에서 선택된 검출 마커에 의해 표지할 수 있다.
본 발명의 탐침을 임의의 통상적인 하이브리드화 기법, 예를 들어 도트 블럿(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), 서던 블럿(Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503), 노던 블럿(RNA를 표적으로서 사용함을 제외하고 서던 블럿과 동일함) 또는 샌드위치 기법(Dunn et al., 1977, Cell 12:23)을 사용할 수 있다.
고상 과정을 포함한 실시태양에서, 샘플, 예를 들어 임상 샘플, 예를 들어삼출액, 체액(예: 혈청, 양막액, 중이 삼풀액, 타액, 정액, 뇨, 눈물, 점액, 기관지 폐포 세척액) 또는 심지어 조직으로부터의 시험 DNA(또는 RNA)를 소정의 기질 또는 표면에 흡착시키거나 또는 달리 부착시킨다. 이어서 상기 고정된 단일 가닥 핵산을 목적하는 조건 하에서 본 발명의 단백질 암호화 유전자 또는 그의 단편 또는 동족체의 핵산 서열을 포함하는 소정의 탐침과 특이적으로 하이브리드화시킨다. 상기 소정의 조건은 예를 들어 G+C 내용물, 표적 핵산의 유형, 핵산의 출처, 하이브리드화 탐침의 크기 등에 따라 필요한 특정 기준을 근거로 특정한 상황에 따라 변할 것이다. 비 특이적으로 결합된 탐침 분자를 제거하기 위해서 상기 하이브리드화 표면을 세척한 다음에, 표지의 수준에 의해 특이적인 하이브리드화를 탐지, 또는 심지어 정량화한다. 헬리코박터 종들 중에서 보존되는 핵산 서열 부분을 선택하는 것이 바람직하다. 상기 소정의 탐침은 15 bp이상일 수 있으며 약 30 내지 90 bp의 범위일 수 있다.
9. 적용
본 발명의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, T 세포 및 핵산은 헬리코박터 감염의 임상학적 또는 의학적 진단, 및 헬리코박터의 병원성, 독성 및 감염성의 성질뿐만 아니라 숙주 방어 기전에 대한 연구를 위한 시약으로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 및 RNA를 하이브리드화 또는 PCR 증폭에 의한 생물학적 시편 중의 헬리코박터의 존재를 식별하기 위한 탐침으로서 사용할 수 있다. 상기 DNA 및 RNA를 또한 헬리코박터 HP56 또는 HP30 단백질과 관련된 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 다른 세균들을 동정하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질을 친화성 크로마토그래피에 의한 본 발명의 단백질을 함유하는 조성물의 추가의 정제 또는 진단용으로 또는 예방 또는 치료용으로서 사용될 수 있는 다클론 및 단클론 항체의 제조에 사용할 수 있다. 상기 단백질을 또한 생물학적 샘플 중의 헬리코박터에 대한 항체 또는 T 세포의 존재를 선별하기 위한 표준 면역분석에 사용할 수 있다.
10. 생물학적 기탁물
본 발명의 헬리코박터 단백질을 암호화하는 HP30 및 HP56 유전자의 개방 판독 프레임을 갖는 유전자의 부분을 함유하는 몇몇 플라스미드를 이 콜라이에 삽입하였으며 이는 부다페스트 조약 하에 37 CFR 1.080에 속하는 아메리칸 타임 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불리바드 10801 소재)에 본 원의 출원 전에 기탁되었다. 이들 플라스미드 중에 존재하는 유전자의 각 부분들에 대한 동정은 하기에 나타낸다.
기탁된 물질의 샘플은 본 미국 특허 출원에 근거한 특허의 허여 시 대중에게 입수 가능해 질 것이다. 개시되고 청구된 본 발명을 상기 기탁된 플라스미드의 범위에 의해 한정하지 않는데, 그 이유는 상기 기탁된 실시태양은 단지 본 발명의 예시일 뿐이기 때문이다. 본 원에 개시된 유사하거나 등가의 단백질 또는 그의 단편 또는 동족체를 암호화하는 임의의 등가의 또는 유사한 플라스미드가 본 발명의 범위 내에 있다.
생물학적 기탁물 ATCC 수탁 번호 기탁일
대장균 M15(PRE4)PQE/HP30 ATCC PTA-2670 2000년 11월 15일
대장균 M15(PRE4)PQE/HP56 ATCC PTA-2669 2000년 11월 15일
상기 내용은 본 발명을 일반적으로 개시한다. 보다 완전한 이해를 하기 실시예를 참고로 얻을 수 있다. 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 개시하며 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는다. 등가물의 형태의 변화 및 치환은 상황의 제시 또는 방편으로서 간주된다. 특정한 용어들이 사용되었지만, 이러한 용어는 설명적인 의미이며 제한을 목적으로 하지 않는다.
본 내용 및 실시예에 사용되었지만 명백하게 개시되지는 않은 분자 유전학, 단백질 생화학 및 면역학적 방법은 과학 문헌에 충분히 보고되어 있으며 당해 분야의 숙련가들의 능력 안에 있다.
1. 에이치 파이로리의 생육
에이치 파이로리 G1-4(이후 G1-4로서 지칭함)를 십이지장 궤양 환자로부터 단리하였다. G1-4의 모 배양액을 -70 ℃에서 15% 글리세롤 및 4% 열 불활성화된 송아지 혈청이 보충된 뇌 심장 침출 브로쓰(Difco Laboratories, Sparks, MD)에서 보관하였다. 에이치 파이로리를 미호기성 분위기 하에서 4% 열 불활성화된 송아지 혈청이 보충된 BHI 배지에서 24 내지 48 시간 동안 배양시켰다. 2 ㎖의 해동된 모 배양액을 열 불활성화된 송아지 태아 혈청 또는 송아지 혈청이 보충된 BHI 50 ㎖을 함유하는 500 ㎖ 진탕 플라스크로 옮겼다. 상기 배양액을 혼합된 기체(5% O2, 10% CO2및 85% N2)로 플러싱시키고 37 ℃에서 150 rmp으로 교반하면서 배양시켰다.
2. HP30 및 HP56 폴리펩티드의 아미노 말단 서열화
N-말단 아미노산 서열을 수득하기 위해서, 충분량의 HP30 또는 HP56 단백질(>5 ㎎)을 PVDF 멤브레인(Applied Biosystems) 상에 전기 블럿팅시키고 쿠마씨 블루로 염색한다. 고정화된 단백질을 상기 멤브레인으로부터 방출시키고 동일 반응계에서 낮은 수준의 엔도펩티다제 Lys-C, 엔도펩티다제 Arg-C 및/또는 엔도펩티다제 Glu-C로 처리하여 고유 단백질을 단편화한다. 생성된 펩티드 단편들을 HPLC에 의해 정제하고 그의 N-말단 아미노산 서열을 ABI 430 단백질 서열화기 및 표준 단백질 서열화 방법을 사용하여 측정한다.
3. 헬리코박터 파이로리 염색체 DNA의 단리
헬리코박터 파이로리 균주 G1-4를 TVAP(Remel)를 함유하는 캄필로박터 쵸콜레이트 한천 플레이트 상에 단일 콜로니로 스트리킹시켰다. 3 또는 4 개의 단일 콜로니를 골라 ∼1.5 ㎖ 브로쓰 종자 배양액(4% 송아지 혈청을 함유하는 BHI 브로쓰)의 접종에 사용하였으며, 이를 밤새 진탕 배양기에서, 37 ℃에서 ∼150 rmp에서 증식시켰다. ∼50 ㎖의 BHI 브로쓰를 함유하는 500 ㎖의 삼각 플라스크를상기 종자 배양액으로 접종하고 진탕 배양기에서 미호기성 분위기 하에 37 ℃에서 ∼175 rmp에서 24 내지 48 시간 동안 증식시켜 DNA 단리를 위한 세포 덩어리를 생성시켰다. 세포를 소르발 GSA 로터에서 15 분간 실온에서 ∼2000 ×g에서 원심분리에 의해 수거하였다. 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 ∼5.0 ㎖의 멸균 수에 현탁시켰다. 동등한 부피의 용해 완충액(200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.5%(w/v) SDS, 0.5%(v/v) 2-머캅토에탄올, 및 250 ㎍/㎖의 프로테이나제 K)을 가하고 세포를 느린 교반과 연마에 의해 현탁시켰다. 이어서 세포 현탁액을 50 ℃에서 ∼12 시간 배양시켜 세균을 용해시키고 염색체 DNA를 유리시켰다. 단백질성 물질을 포화된 NaCl(멸균 수 중의 ∼6.0 M) 0.5 ㎖의 첨가 및 실온에서 소르발 SS34 로터에서 ∼5,500 ×g에서 원심분리에 의해 침전시켰다. 염색체 DNA를 2 부피의 100% 에탄올의 첨가에 의해 등명한 상등액으로부터 침전시켰다. 응집된 DNA를 수거하고 작은 부피의 70% 에탄올 용액에서 서서히 교반시켜 세척하였다. 정제된 염색체 DNA를 멸균 수에 현탁시키고 서서히 흔들면서 4 ℃에서 밤새 용해시켰다. 용해된 DNA의 농도를 1.0 O.D 단위 ∼50 ㎎/㎖의 흡광 계수를 사용하여 260 ㎚에서 분광광도 측정에 의해 측정하였다.
4. 리슈마니아의 LeIF와 상동성인 에이치 파이로리의 개방 판독 프레임의 식별
리슈마니아의 리슈마니아 주요 개시 인자 4A(LeIF)가 T 세포 면역 반응을 향상시키는 아주반트인 것으로 나타났다(WO99/29341). 상동 단백질이 에이치 파이로리에서 생산되는지를 결정하기 위해서, GeneBank로부터 입수할 수 있는 LeIF아미노산 서열을 상기 LeIF 단백질과 약간의 유사성을 공유할 수도 있는 선형 아미노산 서열을 잠재적으로 확인하기 위해서 헬리코박터 파이로리 게놈 서열 데이터베이스(The Institute for Genomic Research, Rockville, MD)를 연구하기 위한 의문의 BLAST(TBLASTN) 대상으로서 사용하였다. 상기 에이치 파이로리 데이터베이스로부터의 예견된 아미노산 서열은 상기 LeIF 단백질 서열과 50 내지 55% 이상의 유사성을 보이지 않았다. 상기 헬리코박터 파이로리 데이터베이스로부터의 후보 아미노산 서열은 특정한 게놈 DNA 서열 "인접부" 및 짧은 관련 서열을 암호화하는 추정상의 개방 판독 프레임 내에서 컴퓨터에 의해 유추하였다. 이어서 L. 주요 LeIF의 크기인 ∼50 kDa의 단백질을 암호화할 수 있는 것으로 여겨지는 추정상의 ORF를 선택하였다. 다수의 추정 상 개방 판독 프레임을 이러한 기준을 만족하는 에이치 파이로리 게놈으로부터 식별하였다. 대부분의 상기 연구 기준을 만족시키는 단백질을 암호화하는 하나의 추정 상의 에이치 파이로리 ORF를 HP56으로 표시하고 아주반트로서 후속의 클로닝, 발현 및 분석을 위해 선택하였다.
5. HP56 ORF-특이적인 DNA 단편의 PCR 증폭
발현 클로닝 및 유전자 변이성 분석을 위해 HP56 특이적인 DNA 단편을 생성시키는데 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 사용하였다. 단백질의 처음 ∼7 개 아미노산에 대한 DNA서열(즉 Met 번역 개시를 시작하는 ∼21 뉴클레오티드)을 암호화하는 N-말단 PCR 전방 프라이머를 화학적으로 합성하였다. ORF-특이적인 서열 이외에, 상기 전방 PCR 프라이머는 또한 효율적인 PCR 증폭을 위해서 짧은 5' G/C 클램프(∼6 뉴클레오티드)를 함유하였다. 서브클로닝에 사용하기 위한 BamHI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 G/C 클램프와 ORF-특이적인 서열 사이의 상기 프라이머에 적합하게 조작하였다.
HP56 N-말단 PCR 전방 가닥 프라이머의 서열은 하기와 같다:
HP56-Bam-F
5'-CAG AGGGGA TCC ATG GAA TTG AAT CAA CCA CCA-3'(서열 식별 번호: 37)
ORF-특이적 서열은 굵게, BamHI 제한 부위는 밑줄을 그었다.
내부 정지 코돈(TAA)에서 시작하는, HP56 ORF 단백질의 마지막 ∼7 아미노산을 암호화하는 것에 상보적인 DNA 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 역 PCR 프라이머로서 사용하였다. 전방 PCR 프라이머와 같이, 상기 역 프라이머는 효율적인 DNA 증폭을 위한 짧은 G/C 클램프(∼6 뉴클레오티드) 및 서브클로닝에 적합하게 위치한 SalI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하였다.
HP56 C-말단 PCR 역 가닥 프라이머의 서열은 하기와 같다:
HP56-Sal-RC
5'-CAG AGGGTC GAC TTA ACG GCG TTT GGG TTT TTT AGA-3'(서열 식별 번호: 38)
ORF-특이적 서열은 굵게, SalI 제한 부위는 밑줄을 그었다.
올리고뉴클레오티드를 0.2 nmol 규모의 컬럼(종결 방식: 트리틸-온, 자동-절단) 및 표준 포스포아미다이트 화학을 사용하여 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(ABI) 모델 380B DNA 합성기 상에서 합성하였다. 조 올리고뉴클레오티드를 제조자에 의해 개시된 바와 같이 C18 역 상 주사기 컬럼(OPC 컬럼, ABI) 상에서 수동으로 정제하였다. 순도 및 수율을 분광광도 측정에 의해 확인하였다(230/260/280 비). 표준 PCR 증폭 반응(2mM Mg+2, 200 μ몰 dNTP, 2.5 단위의 재조합 AmpliTaq(PE Biosystems), 최종 반응 부피 200 ㎕)을 약 0.5 ㎍의 에이치 파이로리 G1-4 염색체 DNA(단일 사본인 경우 LeIF-형 유전자의 약 3X10-7 사본) 및 약 100 pmol의 각각의 전방(N-말단 특이적 올리고) 및 역(C-말단 특이적인 올리고) PCR 프라이머를 사용하여 프로그래밍하였다. 통상적인 농도 이상의 프라이머(∼100 pmol/200 ㎕ rxn)를 PCR 프라이머와 표적 유전자 서열간의 임의의 가능한 서열 변화를 보상하기 위해서 증폭에 사용하였다. 이는 게놈 서열화에 의해 측정된 추정 HP56 ORF의 DNA 서열이 100% 정확할 수는 없기 때문에 필요하였다. 또한, 게놈 서열화에 사용되는 것과 상이한 에이치 파이로리 균주를 후속의 PCR 증폭 프로그램에 사용되는 염색체 DNA의 소스로서 사용하였다. 표적 서열의 증폭은 증폭 반응을 95 ℃에서 ∼1.0 분 동안 가열하여 염색체 주형 DNA를 충분히 변성시키고, 이어서 32 주기의 3-단계 열 증폭 프로파일, 즉 95 ℃, 45 초; 60 ℃, 45 초, 72 ℃, 1 분을 수행하여 성취하였다. 증폭을 PE 바이오시스템스 모델 9700 열 순환기를 사용하여 밀폐된 200 ㎕ 박층 폴리프로필렌 반응 튜브에서 수행하였다. PCR 증폭에 이어서, 반응물 분액(∼20 ㎕)을 아가로스 겔 전기영동(트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액 중의 0.8%)에 의해 약 1.3 kbp DNA 단편의 생산을 위해 검사하였다. DNA 분자 크기 표준(1 kb DNA 사다리, Life Technologies)을 PCR 샘플과 병행하여 전기영동시켰다. 겔 중의 DNA의 가시화는 에티디움 브로마이드 염색 및 자외선 조사에 의해 수행하였다.
6. POE30 발현 벡터 내로의 HP56 PCR 산물의 클로닝
전방 및 역 증폭 프라이머 각각으로 조작된 BamHI 및 SalI 제한 부위는 ∼1.3 kbp PCR 산물의 상업적으로 입수할 수 있는 이 콜라이 발현 플라스미드 pQE30(Qiagen, 암피실린 내성) 내로의 지향 클로닝을 허용하여 상기 HP56 단백질이 N-말단에서 (His)6 친화성 크로마토그래피 표지를 함유하는 융합 단백질로서 발현될 수 있게 한다. 상기 1.3 Kbp HP56 PCT 산물을 제조자의 지시에 따라 실리카겔 -기재 스핀 컬럼(Qiagen)을 사용하여 증폭 반응으로부터 정제하였다. 클로닝에 필요한 BamHI 및 SalI 말단을 생성시키기 위해서, 정제된 PCR 산물을 순차적으로 절단하여 제조자(Life Technologies)가 권장하는 대로 BamHI 및 Sal 제한 효소로 종결시켰다. 첫 번째 제한 절단에 이어서, PCR 산물을 상기와 같은 스핀 컬럼을 통해 정제하여 염을 제거하고 두 번째 효소 절단 전에 멸균 수로 용출시켰다. 절단된 DNA 단편을 다시 실리카겔-기재 스핀 컬럼을 사용하여 정제시킨 후에 pQE30 플라스미드와 연결시켰다. 연결을 위한 발현 플라스미드 pQE30을 제조하기 위해서, 상기를 유사하게 BamHI과 SalI 모두로 절단 완료하고, 이어서 자가 연결을 방지하기 위해서 제조자가 지시하는 대로 송아지 장 포스파타제(CIP, ∼0.02 단위/pmol의 5' 단부, Life Technologies)로 처리하였다. 상기 제조된 벡터에 대해 5 배 몰 과잉의 절단된 단편을 사용하여 연결 반응을 프로그래밍하였다. 문헌[Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 개시된 바와 같은 표준 ∼20 ㎖ 연결 반응(∼16 ℃, ∼16 시간)을 T4 DNA 리가제(∼2.0 단위/반응, Life Technologies)를 사용하여 수행하였다. 연결 분액(∼5 ㎖)을 사용하여 표준 방법으로 전기-수용 M15(pREP4) 세포를 형질전환시켰다. LB 브로쓰 ∼1.0 ㎖ 중에서 37 ℃에서 2 내지 3 시간의 성장에 이어서, 형질전환된 세포를 가나마이신(40 ㎍/㎖) 및 암피실린(100 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 도말하였다. 상기 두 항생제를 모두 선택 배지에 포함시켜 모든 형질전환된 세포가 pREP4 플라스미드(KnR)(pQE30 및 pQE30-HP56 플라스미드(ApR) 상에서의 단백질의 IPTG-유도성 발현에 필요한 lacIq 유전자를 수반한다)를 수반하게 하였다. 플레이트를 37 ℃에서 ∼16 시간 동안 밤새 배양시켰다. 개별적인 KnR/ApR 콜로니를 멸균 이쑤시게로 골라 사용하여 새로운 LB KnR/ApR 플레이트뿐만 아니라 ∼1.0 ㎖ LB KnR/ApR 브로쓰 배양액을 "패치" 접종하였다. 상기 패치 플레이트와 브로쓰 배양액을 모두 표준 배양기(플레이트) 또는 진탕 수욕에서 37 ℃에서 밤새 배양시켰다.
전체 세포 기재 PCR 분석을 사용하여 HP56 DNA 삽입물이 함유된 형질전환체를 확인하였다. 여기에서, ∼1.0 ㎖의 밤새 LB Kn/Ap 브로쓰 배양액을 1.5 ㎖폴리프로필렌 튜브로 옮기고 세포를 벡크만 미세원심분리기(3 분 이하, 실온, 12K x g까지)에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠릿을 멸균 수 ∼200 ㎖에 현탁시키고 ∼10 ㎖의 분액을 사용하여 HP56-Bam-F 전방 및 HP56-Sal-RC 역 증폭 프라이머 모두를 함유하는 ∼50 ㎖의 최종 부피의 PCR 반응을 프로그래밍하였다. PCR반응 성분들의 최종 농도는 ∼5.0 단위의 ampliTaq 폴리머라제를 사용함을 제외하고 실시예 5에 개시된 것들과 필수적으로 동일하였다. 초기 95 ℃ 변성 단계를 3 분으로 증가시켜 세균 세포의 열 파괴와 플라스미드 DNA의 유리를 보장하였다. ABI 모델 9700 열 순환기 및 32 주기, 3 단계 열 증폭 프로파일, 즉 95 ℃, 45 초; 60 ℃, 45 초, 72 ℃, 1 분을 사용하여 HP56 단편으로 용해된 형질전환체 샘플로부터 증폭시켰다. 열 증폭에 이어서, ∼20 ㎖ 분액의 반응을 아가로스 겔 전기영동(트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액 중의 0.8% 아가로스)에 의해 분석하였다. DNA 단편을 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색 후에 UV 조사에 의해 가시화하였다. DNA 분자 크기 표준(1 Kb 사다리, Life Technologies)을 시험 샘플과 병행하여 전기영동시키고 이를 PCR 산물의 크기를 추정하는데 사용하였다. 예상되는 ∼1.3 Kbp PCR 산물을 생산하는 형질전환체를 HP56 발현 구조물을 함유하는 균주로서 동정하였다. 발현 플라스미드에 대한 도식적인 지도를 도 2에 나타낸다. 이어서 발현 플라스미드 함유 균주를 헬리코박터 파이로리 LeIF-유사 재조합 단백질의 유도성 발현에 대해 분석하였다.
7. PCR-양성 형질전환체의 발현 분석
상기 동정된 각각의 PCR-양성 형질전환체에 대해서, 가나마이신(40 ㎎/㎖) 및 암피실린(100 ㎎/㎖)을 함유하는 ∼0.5 ㎖의 LB 브로쓰에 상기 패치 플레이트로부터의 세포를 접종하고 진탕시키면서(∼250 rpm) 37 ℃에서 밤새 증식시켰다. 밤새 종자 배양액(∼1.0 ㎖)의 분액을 ∼25의 LB Kn/Ap 브로쓰를 함유하는 125 ㎖의 삼각 플라스크에 접종하고 배양액 혼탁도가 ∼0.5의 O.D. 600, 즉 중간 대수기(대개 약 1.5 내지 2.0 시간)에 도달할 때까지 진탕(∼250 rpm)시키면서 37 ℃에서 증식시켰다. 이 때에 배양액의 약 반(∼12.5 ㎖)을 두 번째 125 ㎖ 플라스크로 옮기고 재조합 헬리코박터 파이로리 LeIF-유사 HP56 재조합 단백질의 발현을 최종 농도 1.0 mM로 IPTC(멸균 수 중에서 제조된 1.0 M 모액, Sigma)를 첨가하여 유도하였다. IPTG-유도된 것 및 유도되지 않은 배양액 모두의 배양을 진탕시키면서 추가로 4 시간 까지 37 ℃에서 속행하였다. 유도 및 유도되지 않은 배양액의 샘플(∼1.0 ㎖)을 유도 기간 후에 제거하고 세포를 실온에서 3 분까지 미세원심분리기에서 원심분리에 의해 수거하였다. 개별적인 세포 펠릿을 멸균 수 ∼50 ㎖에 현탁시키고, 이어서 2-머캅토에탄올을 함유하는 같은 부피의 2×Lamelli SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합하여, 비등 수욕에서 3 분까지 두어 단백질을 변성시켰다. 각 부피(15 ㎖ 까지)의 상기 조 IPTG-유도된 것과 유도되지 않은 세포 용해물 모두를 중복 12% 트리스/글리신 폴리아크릴아미드 겔(1 ㎜ 두께의 미니-겔, Novex)에 걸었다. 상기 유도 및 유도되지 않은 용해물 샘플을 미리 염색시킨 분자량 마커(SeeBlue, Novex)와 함께 통상적인 조건 하에서 표준 SDS/트리스/글리신 실험 완충액(BioRad)를 사용하여 전기영동시켰다. 전기 영동에 이어서, 하나의 겔을 쿠마씨 브릴리언트 블루 R250(BioRad)로 염색하고 이어서 메탄올:아세트산:물(30%:10%:60%)로 염색을 제거하여 대략 50 kDa의 새로운 헬리코박터 파이로리 LeIF-유사 재조합 단백질을 가시화하였다(도 6). 두 번째 겔을 BioRad Mini-Protean II 블럿팅 장치와 타우빈(Towbin)의 메탄올(20%) 전달 완충액을 사용하여 2 시간 까지 4 ℃에서 PVDF 멤브레인(0.45 미크론 기공 크기, Novex) 상에 전기블럿팅하였다. 상기 멤브레인의 봉쇄와 항체 배양을 통상적인 방법을 사용하여 수행하였다. HRP(Qiagen)에 결합된 단클론 항-RGS(His)6 항체를 1/5,000 희석비로 사용하여 발현을 확인하고 HP56 재조합 단백질로서 ∼50 kDa 유도성 단백질(들)을 동정하였다. 항체 반응성 패턴의 가시화를 에머샴 ECL 화학발광 시스템을 사용하여 하이퍼필름 상에서 성취하였다.
8. 재조합 이 콜라이 HP56 세포 덩어리의 생산
에이치 파이로리로부터의 LeIF-유사 유전자를 암호화하는 재조합 플라스미드를 함유하는 이 콜라이 M15(pREP4)의 재조합 균주를 사용하여 재조합 단백질의 정제를 위한 세포 덩어리를 생성시켰다. 상기 발현 균주(이 콜라이 M15pRE4PQE/HP56)를 가나마이신(50 ㎍/㎖) 및 암피실린(100 ㎎/㎖)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 배양하여 pREP4 lacIq 대조용 플라스미드 및 pQE30-HP56 ORF 발현 구조물 모두가 유지되는 것으로 확실히 하였다. -80 ℃에서 냉동보존을 위해서, 상기 균주를 동일한 농도의 항생체를 함유하는 LB 브로쓰에서 증식시키고, 이어서 30%(w/v) 글리세롤을 함유하는 같은 부피의 LB 브로쓰와 혼합하였다.
재조합 단백질의 생산을 위해 사용된 발효 배지는 가나마이신(50 ㎍/㎖) 및 암피실린(100 ㎎/㎖)을 함유하는 2XYT 브로쓰(Difco)로 이루어졌다. 소포제를 0.25 ㎖/ℓ(Antifoam 204, Sigma)로 발효기용 배지에 가하였다. HP56 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해서, IPTG(이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드)를발효기에 가하였다(1 mM, 최종 농도).
50 ㎖의 작용 부피를 함유하는 500 ㎖ 삼각 종자 플라스크를 고속 해동/동결된 배양액 0.3 ㎖ 또는 선택성 한천 플레이트 배양액으로부터의 다수개의 콜로니로 접종하고, 150 rpm에서 진탕 플랫폼 상에서(Innova 2100, New Brunswick Scientific) 37 ±1 ℃에서 약 12 시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 종자 배양액을 사용하여 2XYT 브로쓰 및 Kn과 Ap 항생제를 모두 함유하는 5 ℓ 작용 부피 발효기에 접종하였다. 상기 발효기(Bilflo 3000, New Brunswick Scientific)를 37 ±1 ℃에서, 0.2 내지 0.4 VVM 공기 살포로, 250 rpm(러쉬톤 추진기에서 2 x yyy)에서 작동하였다. pH는 플라스크 종자 배양액이나 발효기에서 조절하지 않았다. 배양 기간 동안 pH의 범위는 배양기에서 6.5 내지 7.3이었다. IPTG(멸균 수 중에서 제조된 것, 1.0M 모액)를 배양액이 중간 대수 증식기(∼0.7 O.D. 600 단위)에 도달할 때까지 발효기에 가하였다. 세포를 2 내지 4 시간 동안 유도하고 28RS Heraeus(Sepatech) 또는 RC5C 초고속 원심분리기(Sorvall Instruments)를 사용하여 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 페이스트를 가공할 때까지 -20 ℃에서 보관하였다.
9. HP30 개방 판독 프레임의 식별
에이치 파이로리 세포(HWC) + 아주반트(HWC 단독은 아님)로 면역시킨 마우스를 헬리코박터 세포로 접종 시 헬리코박터 감염에 의한 감염으로부터 보호하였다. 에이치 파이로리 세포(HWC) + 아주반트를 접종한 마우스의 혈청과 HWC 단독으로 면역된 마우스의 혈청을 웨스턴 블럿 분석에 의해 에이치 파이로리 세포 용해물 상에서 반응성에 대해 선별하였다. HWC + 아주반트로 면역시킨 마우스의 혈청의 IgA 항체는 약 30 kDa의 분자량을 갖는 단백질과 반응성이었다. HWC 단독으로 면역시킨 마우스의 혈청의 IgA 항체는 30 kDa 단백질과 반응성이 아니었다. HP30 단백질에 대한 면역 반응의 유도는 감염으로부터의 보호와 상관이 있기 때문에, HP30 단백질의 추가적인 특성화를 수행하였다. 웨스턴 블럿 상의 밴드로부터의 단백질을 전기용출시키고 상기 섹션 2에 개시된 방법을 사용하여 N-말단 서열을 측정하였다. 헬리코박터 파이로리 게놈 서열 데이터베이스(The Institute for Genomic Research, Rockville, MD)를 30 kDa 단백질의 N-말단 서열을 갖는 아미노산 서열을 식별하기 위해 의심하였다. 상기 단백질을 HP30으로 나타낸다.
10. HP30 ORF-특이적인 DNA 단편의 PCR 증폭
폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 사용하여 발현 클로닝과 유전자 변이성 분석을 위한 HP30 특이적인 DNA 단편을 제조하였다. 단백질의 처음 ∼7 개 아미노산에 대한 DNA서열(즉 Met 번역 개시를 시작하는 ∼21 뉴클레오티드)을 암호화하는 N-말단 PCR 전방 프라이머를 화학적으로 합성하였다. ORF-특이적인 서열 이외에, 상기 전방 PCR 프라이머는 또한 효율적인 PCR 증폭을 위해서 짧은 5' G/C 클램프(∼6 뉴클레오티드)를 함유하였다. 서브클로닝에 사용하기 위한 BamHI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 G/C 클램프와 ORF-특이적인 서열 사이의 상기 프라이머에 적합하게 조작하였다.
HP30 N-말단 PCR 전방 가닥 프라이머의 서열은 하기와 같다:
5'-GCG GGA TCC ATG GCA TAC AAA TAT GAT AGA-3'(서열 식별 번호: 39).
내부 정지 코돈(TAA)에서 시작하는, HP30 단백질의 마지막 ∼7 아미노산을 암호화하는 것에 상보적인 DNA 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 역 PCR 프라이머로서 사용하였다. 전방 PCR 프라이머와 같이, 상기 역 프라이머는 효율적인 DNA 증폭을 위한 짧은 G/C 클램프(∼6 뉴클레오티드) 및 서브클로닝에 적합하게 위치한 SalI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하였다.
HP30-말단 PCR 역 가닥 프라이머의 서열은 하기와 같다:
5'-GCG GTC GAC TTA AAT GGA TTC TAT TTG CAA CG-3'(서열 식별 번호: 40).
올리고뉴클레오티드를 0.2 nmol 규모의 컬럼(종결 방식: 트리틸-온, 자동-절단) 및 표준 포스포아미다이트 화학을 사용하여 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(ABI) 모델 380B DNA 합성기 상에서 합성하였다. 조 올리고뉴클레오티드를 제조자에 의해 개시된 바와 같이 C18 역 상 주사기 컬럼(OPC 컬럼, ABI) 상에서 수동으로 정제하였다. 순도 및 수율을 분광광도 측정에 의해 확인하였다(230/260/280 비). 표준 PCR 증폭 반응(2mM Mg+2, 200 μ몰 dNTP, 2.5 단위의 재조합 AmpliTaq(PE Biosystems), 최종 반응 부피 200 ㎕)을 약 0.5 ㎍의 에이치 파이로리 G1-4 염색체 DNA 및 약 100 pmol의 각각의 전방(N-말단 특이적 올리고) 및 역(C-말단 특이적인 올리고) PCR 프라이머를 사용하여 프로그래밍하였다. 통상적인 농도 이상의 프라이머(∼100 pmol/200 ㎕ rxn)를 PCR 프라이머와 표적 유전자 서열간의 임의의 가능한 서열 변화를 보상하기 위해서 증폭에 사용하였다. 이는 게놈 서열화에 의해 측정된 추정 HP30 단백질의 DNA 서열이 100% 정확할 수는 없기 때문에 필요하였다. 또한, 게놈 서열화에 사용되는 것과 상이한 에이치 파이로리 균주를 후속의 PCR 증폭 프로그램에 사용되는 염색체 DNA의 소스로서 사용하였다. 표적 서열의 증폭은 증폭 반응을 95 ℃에서 ∼1.0 분 동안 가열하여 염색체 주형 DNA를 충분히 변성시키고, 이어서 32 주기의 3-단계 열 증폭 프로파일, 즉 95 ℃, 45 초; 60 ℃, 45 초, 72 ℃, 1 분을 수행하여 성취하였다. 증폭을 PE 바이오시스템스 모델 9700 열 순환기를 사용하여 밀폐된 200 ㎕ 박층 폴리프로필렌 반응 튜브에서 수행하였다. PCR 증폭에 이어서, 반응물 분액(∼20 ㎕)을 아가로스 겔 전기영동(트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액 중의 0.8%)에 의해 적합한 DNA 단편의 생산을 위해 검사하였다. DNA 분자 크기 표준(1 kb DNA 사다리, Life Technologies)을 PCR 샘플과 병행하여 전기영동시켰다. 겔 중의 DNA의 가시화는 에티디움 브로마이드 염색 및 자외선 조사에 의해 수행하였다.
11. OE30 발현 벡터 내로의 HP30 PCR 산물의 클로닝
전방 및 역 증폭 프라이머 각각으로 조작된 BamHI 및 SalI 제한 부위는 ∼1 kbp PCR 산물의 상업적으로 입수할 수 있는 이 콜라이 발현 플라스미드 pQE30(Qiagen, 암피실린 내성) 내로의 지향 클로닝을 허용하여 상기 HP30 단백질이 N-말단에서 (His)6 친화성 크로마토그래피 표지를 함유하는 융합 단백질로서 발현될 수 있게 한다. 상기 ∼1 Kbp HP30 PCT 산물을 제조자의 지시에 따라 실리카겔 -기재 스핀 컬럼(Qiagen)을 사용하여 증폭 반응으로부터 정제하였다. 클로닝에 필요한 BamHI 및 SalI 말단을 생성시키기 위해서, 정제된 PCR 산물을 순차적으로 절단하여 제조자(Life Technologies)가 권장하는 대로 BamHI 및 Sal 제한 효소로 종결시켰다. 첫 번째 제한 절단에 이어서, PCR 산물을 상기와 같은 스핀 컬럼을 통해 정제하여 염을 제거하고 두 번째 효소 절단 전에 멸균 수로 용출시켰다. 절단된 DNA 단편을 다시 실리카겔-기재 스핀 컬럼을 사용하여 정제시킨 후에 pQE30 플라스미드와 연결시켰다. 연결을 위한 발현 플라스미드 pQE30을 제조하기 위해서, 상기를 유사하게 BamHI과 SalI 모두로 절단 완료하고, 이어서 자가 연결을 방지하기 위해서 제조자가 지시하는 대로 송아지 장 포스파타제(CIP, ∼0.02 단위/pmol의 5' 단부, Life Technologies)로 처리하였다. 상기 제조된 벡터에 대해 5 배 몰 과잉의 절단된 단편을 사용하여 연결 반응을 프로그래밍하였다. 문헌[Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 개시된 바와 같은 표준 ∼20 ㎖ 연결 반응(∼16 ℃, ∼16 시간)을 T4 DNA 리가제(∼2.0 단위/반응, Life Technologies)를 사용하여 수행하였다. 연결 분액(∼5 ㎖)을 사용하여 표준 방법으로 전기-수용 M15(pREP4) 세포를 형질전환시켰다. LB 브로쓰 ∼1.0 ㎖ 중에서 37 ℃에서 2 내지 3 시간의 성장에 이어서, 형질전환된 세포를 가나마이신(40 ㎍/㎖) 및 암피실린(100 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 도말하였다. 상기 두 항생제를 모두 선택 배지에 포함시켜 모든 형질전환된 세포가 pREP4 플라스미드(KnR)(pQE30 및 pQE-HP30 플라스미드(ApR) 상에서의 단백질의 IPTG-유도성 발현에 필요한 lacIq 유전자를 수반한다)를 수반하게 하였다. 플레이트를 37 ℃에서 ∼16 시간 동안 밤새 배양시켰다. 개별적인 KnR/ApR 콜로니를 멸균 이쑤시게로 골라 사용하여 새로운 LB KnR/ApR 플레이트뿐만 아니라 ∼1.0 ㎖ LB KnR/ApR 브로쓰 배양액을 "패치" 접종하였다. 상기 패치 플레이트와 브로쓰 배양액을 모두 표준 배양기(플레이트) 또는 진탕 수욕에서 37 ℃에서 밤새 배양시켰다.
전체 세포 기재 PCR 분석을 사용하여 HP30 DNA 삽입물이 함유된 형질전환체를 확인하였다. 여기에서, ∼1.0 ㎖의 밤새 LB Kn/Ap 브로쓰 배양액을 1.5 ㎖폴리프로필렌 튜브로 옮기고 세포를 벡크만 미세원심분리기(3 분 이하, 실온, 12K x g까지)에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠릿을 멸균 수 ∼200 ㎕에 현탁시키고 ∼10 ㎖의 분액을 사용하여 HP56-Bam-F 전방 및 HP56-Sal-RC 역 증폭 프라이머 모두를 함유하는 ∼50 ㎖의 최종 부피의 PCR 반응을 프로그래밍하였다. PCR 반응 성분들의 최종 농도는 ∼5.0 단위의 ampliTaq 폴리머라제를 사용함을 제외하고 실시예 1에 개시된 것들과 필수적으로 동일하였다. 초기 95 ℃ 변성 단계를 3 분으로 증가시켜 세균 세포의 열 파괴와 플라스미드 DNA의 유리를 보장하였다. ABI 모델 9700 열 순환기 및 32 주기, 3 단계 열 증폭 프로파일, 즉 95 ℃, 45 초; 60 ℃, 45 초, 72 ℃, 1 분을 사용하여 HP30 단편으로 용해된 형질전환체 샘플로부터 증폭시켰다. 열 증폭에 이어서, ∼20 ㎕ 분액의 반응을 아가로스 겔 전기영동(트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액 중의 0.8% 아가로스)에 의해 분석하였다. DNA 단편을 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색 후에 UV 조사에 의해 가시화하였다. DNA 분자 크기 표준(1 Kb 사다리, Life Technologies)을 시험 샘플과 병행하여 전기영동시키고 이를 PCR 산물의 크기를 추정하는데 사용하였다. 예상되는 ∼1 Kbp PCR 산물을 생산하는 형질전환체를 HP30 발현 구조물을 함유하는 균주로서 동정하였다. HP30 발현 플라스미드에 대한 도식적인 지도를 도 1에 나타낸다. HP30 발현 플라스미드 pQEHp30에 의해 암호화된 히스티딘 표지를 갖는 HP30의 전체 길이 핵산 및 아미노산 서열을 도 11에 나타낸다. 이어서 발현 플라스미드 함유 균주를 헬리코박터 파이로리 HP30 재조합 단백질의 유도성 발현에 대해 분석하였다.
12. HP30 PCR-양성 형질전환체의 발현 분석
상기 동정된 각각의 PCR-양성 형질전환체에 대해서, 가나마이신(40 ㎍/㎖) 및 암피실린(100 ㎍/㎖)을 함유하는 ∼5.0 ㎖의 LB 브로쓰에 상기 패치 플레이트로부터의 세포를 접종하고 진탕시키면서(∼250 rpm) 37 ℃에서 밤새 증식시켰다. 밤새 종자 배양액(∼1.0 ㎖)의 분액을 ∼25의 LB Kn/Ap 브로쓰를 함유하는 125 ㎖의 삼각 플라스크에 접종하고 배양액 혼탁도가 ∼0.5의 O.D. 600, 즉 중간 대수기(대개 약 1.5 내지 2.0 시간)에 도달할 때까지 진탕(∼250 rpm)시키면서 37 ℃에서 증식시켰다. 이 때에 배양액의 약 반(∼12.5 ㎖)을 두 번째 125 ㎖ 플라스크로 옮기고 재조합 헬리코박터 파이로리 HP30 재조합 단백질의 발현을 최종 농도 1.0 mM로 IPTC(멸균 수 중에서 제조된 1.0 M 모액, Sigma)를 첨가하여 유도하였다. IPTG-유도된 것 및 유도되지 않은 배양액 모두의 배양을 진탕시키면서 추가로 4 시간 까지 37 ℃에서 속행하였다. 유도 및 유도되지 않은 배양액의 샘플(∼1.0 ㎖)을 유도 기간 후에 제거하고 세포를 실온에서 3 분까지 미세원심분리기에서 원심분리에 의해 수거하였다. 개별적인 세포 펠릿을 멸균 수 ∼50 ㎕에 현탁시키고, 이어서 2-머캅토에탄올을 함유하는 같은 부피의 2×Lamelli SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합하여, 비등 수욕에서 3 분까지 두어 단백질을 변성시켰다. 각 부피(15 ㎕ 까지)의 상기 조 IPTG-유도된 것과 유도되지 않은 세포 용해물 모두를 중복 12% 트리스/글리신 폴리아크릴아미드 겔(1 ㎜ 두께의 미니-겔, Novex)에 걸었다. 상기 유도 및 유도되지 않은 용해물 샘플을 미리 염색시킨 분자량 마커(SeeBlue, Novex)와 함께 통상적인 조건 하에서 표준 SDS/트리스/글리신 실험 완충액(BioRad)를 사용하여 전기영동시켰다. 전기 영동에 이어서, 하나의 겔을 쿠마씨 브릴리언트 블루 R250(BioRad)로 염색하고 이어서 메탄올:아세트산:물(30%:10%:60%)로 염색을 제거하여 30 kDa의 새로운 헬리코박터 파이로리 재조합 단백질을 가시화하였다(도 4). 두 번째 겔을 BioRad Mini-Protean II 블럿팅 장치와 타우빈(Towbin)의 메탄올(20%) 전달 완충액을 사용하여 2 시간 까지 4 ℃에서 PVDF 멤브레인(0.45 미크론 기공 크기, Novex) 상에 전기블럿팅하였다. 상기 멤브레인의 봉쇄와 항체 배양을 통상적인 방법을 사용하여 수행하였다. HRP(Qiagen)에 결합된 단클론 항-RGS(His)6 항체를 1/5,000 희석비로 사용하여 발현을 확인하고 HP30 재조합 단백질로서 ∼30 kDa 유도성 단백질(들)을 동정하였다. 항체 반응성 패턴의 가시화를 에머샴 ECL 화학발광 시스템을 사용하여 하이퍼필름 상에서 성취하였다.
13. 재조합 이 콜라이 HP30 세포 덩어리의 생산
에이치 파이로리로부터의 30 kDa 단백질을 암호화하는 재조합 플라스미드를 함유하는 이 콜라이 M15(pREP4)의 재조합 균주를 사용하여 재조합 단백질의 정제를 위한 세포 덩어리를 생성시켰다. 상기 발현 균주(이 콜라이 M15pRE4PQE/HP30)를 가나마이신(50 ㎍/㎖) 및 암피실린(100 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 배양하여 pREP4 lacIq 대조용 플라스미드 및 pQE30-HP30 ORF 발현 구조물 모두가 유지되는 것으로 확실히 하였다. -70 ℃에서 냉동보존을 위해서, 상기 균주를 동일한 농도의 항생체를 함유하는 LB 브로쓰에서 증식시키고, 이어서 30%(w/v) 글리세롤을 함유하는 같은 부피의 LB 브로쓰와 혼합하였다.
재조합 단백질의 생산을 위해 사용된 발효 배지는 가나마이신(50 ㎍/㎖) 및 암피실린(100 ㎎/㎖)을 함유하는 2XYT 브로쓰(Difco)로 이루어졌다. 소포제를 0.25 ㎖/ℓ(Antifoam 204, Sigma)로 발효기용 배지에 가하였다. HP30 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해서, IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드)를 발효기에 가하였다(1 mM, 최종 농도).
50 ㎖의 작용 부피를 함유하는 500 ㎖ 삼각 종자 플라스크를 고속 해동/동결된 배양액 0.3 ㎖ 또는 선택성 한천 플레이트 배양액으로부터의 다수개의 콜로니로 접종하고, 150 rpm에서 진탕 플랫폼 상에서(Innova 2100, New Brunswick Scientific) 37 ± 1 ℃에서 약 12 시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 종자 배양액을 사용하여 2XYT 브로쓰 및 Kn과 Ap 항생제를 모두 함유하는 5 ℓ 작용 부피발효기에 접종하였다. 상기 발효기(Bilflo 3000, New Brunswick Scientific)를 37 ±1 ℃에서, 0.2 내지 0.4 VVM 공기 살포로, 250 rpm(러쉬톤 추진기에서 2 x yyy)에서 작동하였다. pH는 플라스크 종자 배양액이나 발효기에서 조절하지 않았다. 배양 기간 동안 pH의 범위는 배양기에서 6.5 내지 7.3이었다. IPTG(멸균 수 중에서 제조된 것, 1.0M 모액)를 배양액이 중간 대수 증식기(∼0.7 O.D. 600 단위)에 도달할 때까지 발효기에 가하였다. 세포를 2 내지 4 시간 동안 유도하고 28RS Heraeus(Sepatech) 또는 RC5C 초고속 원심분리기(Sorvall Instruments)를 사용하여 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 페이스트를 가공할 때까지 -20 ℃에서 보관하였다.
14. HP56 및 HP30 재조합 단백질의 정제
약 15 g의 냉동 세포 페이스트를 와동 및 빙냉 50 mM 인산 나트륨 완충액(pH 8.0), 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl ∼40 ㎖ 중에서 연마에 의해 재 현탁시키고, 제조사의 권장(∼5 ㎖ 유속, ∼450 바)에 따라 니로-소아비(Niro-Soavi) 고압 균질화기에 통과시켜 파괴하였다. 이어서 세포 용해물을 소르발 SS34 로터에서 ∼550 ×g(4 ℃)에서 5 분간 원심분리시켜 파괴되지 않은 세포를 제거하였다.
이어서 등명한 균질물을 3 내지 5 ㎖의 Ni-NTA 세파로즈 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수지(QiaGen)와 혼합하고, 250 ㎖의 삼각 플라스크로 옮기고, 플랫폼 회전기 상에 놓고 N-말단(His)6 친화성 표지를 함유하는 재조합 HP56또는 HP30을 상기 수지와 16 시간 까지 4 ℃에서 결합시켰다. 배치 결합에 이어서, 상기 균질물-수지 슬러리를 통상적인 유리 크로마토그래피 컬럼(BioRad Econo Colum)으로 옮기고 용해물을 배수시켰다. 결합되지 않은 오염 단백질을 상기 컬럼을 2 내지 100 ㎖ 부피의 세척 완충액(50 mM NaH2PO4, pH 7.0; 100 mM NaCl)으로 서서히 세척하여 상기 수지로부터 제거하였다.
상기 수지에 결합된 재조합, 친화성 표지된 HP56 또는 HP30을 이미다졸-기재 용출 완충액(20 mM 트리스-HCl, pH 8.0; 100 mM NaCl; 100 내지 200 mM 이미다졸)을 사용하여 2 ㎖ 부피로 용출시켰다. 각 용출 분획의 분액들을 4 내지 20% 트리스-글리신 구배 겔(Novex) 및 상업적으로 제조된 예비 염색한 분자량 마커 세트(MultiMark, Novex, San Diego, CA)를 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 전기 영동에 이어서, 상기 겔을 쿠마씨 블루 R250 용액(BioRad)으로 염색하고 염색을 제거하여 용출된 단백질을 가시화하였다. 재조합 HP56 또는 HP30 단백질이 >80% 순수한 분획들을 모으고 트리스-HCl(pH 7.3)에 대해 상업적인 투석 카세트(MWCO=10 kDa; Slidalyzer, Pierce Chem)에서 밤새(14 내지 18 시간) 투석시켜 잔류 이미다졸과 염을 제거하였다. 이어서 투석된 용출물을 30 kDa 스핀 농축기(Centricon-30; Amicon)를 사용하여 한외여과에 의해 농축시켰다.
상기 농축된 HP56 또는 HP30의 단백질 농도를 마이크로 BCA 방법(Pierce Chem.) 및 표준으로서 BSA를 사용하여 측정하였다. 정제된 HP56 또는 HP30(∼1.0 ㎎/㎖의 단백질 농도)를 각각 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿, 및 비색측정 내독소 분석(Bio Whittaker)에 의해 순도, 존재 및 잔류 내독소에 대해서 평가하였다. 상기 겔 정제된 HP56 또는 HP30 물질은 겔 분석에 의해 예상되는 분자 크기(각각 50 kDa 또는 30 kDa)의 단일 밴드로서 80%의 순도를 나타내었으며 웨스턴 블럿에서 항-RGS-(His)6 항체와 격렬히 반응하였다. 잔류 내독소는 <0.05 EU/㎍인 것으로 산정되었다.
15. HP30 및 HP56의 성질
HP30 폴리펩티드는 에이치 파이로리의 추출물에 대한 웨스턴 블럿을 통해 측정 시 고유 상태에서 약 30 kDa의 단백질로서 존재한다. HP56 폴리펩티드는 에이치 파이로리의 추출물에 대한 웨스턴 블럿을 통해 측정 시 고유 상태에서 약 56 kDa의 단백질로서 존재한다.
16. 항-HP30 또는 항-HP56 항혈청
HP30 또는 HP56에 대한 항 혈청을 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 동물, 예를 들어 토끼, 마우스 또는 기니 피그에게 아주반트와 함께 또는 상기 없이, 당해분야의 숙련가들에게 일반적으로 공지된 임의의 방법에 의해 주입하여 제조하였다. 예를 들어, HP30을 프로인트 완전 아주반트와 함께 토끼에 주입하고 이어서 HP30을 프로인트 불완전 아주반트와 함께 주입하였다. 통상적으로는, 상기 단백질의 반-정제되거나 정제된 형태를 주입한다. 예를 들어, HP30 폴리펩티드를 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 기법(Laemmli, 1970, Nature 227:680-685)에 따라 변성 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔을 사용하고 상기 HP30-함유 밴드를 상기 겔로부터 절단하여 다른 단백질들로부터 분리시켰다. 상기 HP30을 함유하는 절제된 밴드를 부드럽게 만들어 동물에게 주입하여 상기 폴리펩티드에 대한 항혈청을 생성시켰다. 한편으로, rHP30 또는 rHP56을 상술한 바와 같이 정제하여 동물에게 주입하였다. 상기 항혈청을 널리 공지되고 일반적으로 승인된 ELISA를 사용하여 검사하여 역가를 측정하고, 웨스텃 블럿에 의해 단백질에 대한 결합을 측정하고, 면역형광 염색과 헬리코박터에 대한 상보성 매개된 세포독성 활성을 사용하여 검사하였다.
17. 엘리사
항-HP30 또는 항 HP56 항체 적정은 정제한 PH30 또는 HP56 단백질(∼1 ㎍/웰)을 사용하는 엘리사에 의하여 측정되고, 선택적으로,H, pylori(전체 세포 준비 또는 조(crude) 셀 여액)은 당업자에게 알려진 방법으로 포획된 리간드로서 사용된다. 항혈청(antisera)의 연속 희석은 PBS를 사용하고, 엘리사의 2반복하여 테스트하였다. 희석된 HRP-연접 항체는 이러한 에세이에서 이차적 리포터 항체로 사용되었다. 적정은 양성 엘리사 반응을 보이는 희석물에서 가장 크게 나타나서, 평균 음성 조절 수치보다 O.D. 450 >2SD 이상을 보였다(예를 들어 채혈한 토끼 혈청).
18. 웨스턴 블랏
H, pylori는 6.1 항에서 서술한 대로 배양하고H, pylori여액을 제조하였다. 선택적으로, HP56 또는 HP30으로 인코딩된 플라스미드가 잠복된 대장균의 여액을 제조하였다. 용해된 세포는 Laemmli 당 4 내지 12 % 폴리아크릴 아미드 겔에서 재분해되었다. 상술한 바와 같이 분리된 단백질은 100 V에서 1.5 시간동안 PVDF 멤브레인으로 전기영동적으로 전이되었다(Thebaine et al., 1979, Proc, natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). 상기 PVDF 멤브레인은 이후 25 ㎖의 불베코 포스페이트로 완충되며 0.5 % 소디움 카제인, 0.5% 송아지 혈청 알부민과 1% 염소 혈청을 포함하는 식염수로 전처리 되었다. 모든 연속적인 배앙은 상기 전처리 완충액을 사용하여 수행되었다.
PVDF 멤브레인은 먼저 면역화된 혈청이나 실온에서 1 시간동안 상기한 바와 같이 HP30 또는 HP56 폴리펩티드로 면역화된 동물 유래의 혈청의 희석물 25 ㎖로 전처리되었다. PVDF 멤브레인은 세척 완충액(150 mM의 염화나트륨과 0.05%의 Tween-20 포함하는 20 mM 트리스 완충액[pH 7.5])으로 2차례 세척하였다.
PVDF 멤브레인은 25 ㎖의 퍼옥시다제가 표지된 염소 항-토끼(또는 머린 항체에 대한 항-마우스) 면역글로불린(예를 들어, 항-IgG 또는 kd-IgA)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Wes Grove, PA)을 사용하여 30 분동안 실온에서 배양하였다. PVDF 멤브레인은 이후 4 차례 세척 완충액으로 세척하고, 3,3'디아미노벤지딘 테트라-하이드로 클로라이드와 Sigma Chemical Co(St. Louise, Mo. 카다록 제 D-4418)에서 공급하는 우레아 퍼옥사이드로 각각 4 분 동안 전개시켰다.
과면역 항혈청 또는 머린 항체(면역화된 마우스 또는 모노클론 항체로부터 유래된 혈청을 포함하지만 이로써 제한되지 않은)는 HP30 또는 HP56 단백질에 대한항혈청을 생성하는 단백질이라고 알려진 조H. pyroli추출물의 웨스턴 블랏을 탐침하기 위하여 사용되었다.
19. 우레아제 에세이
동물조직은 0.5 ㎖의 우레아제 실험 용액(.0468% NaH2PO42H2O, .0007% 페놀 레드, 2.4% 우레아)에 넣어서 약 4시간동안(H. felis) 또는 약 24 시간동안(H, pylori) 배양하였다. 분홍색의 존재는 테스트 샘플 내에 우레아의 존재를 지시하다.
20.H. pyroli집락형성 에세이
H, pylori또는H. felis를 사용한 면역성 테스트 이후, 마우스의 위를 적축하여 PBS 로 음식물 찌꺼기를 제거하기 위하여 세척하였다. 위는 레이저로 종단면으로 분리하여, 무게측정하고 균질화시켰다. 위를 연속희석하고, 선택배지에 이식하였다. 37 ℃에서 7일 동안 배양하고, 이식을 제거한 후 집락을 계수하였다.
21.H, pylori감염된 마우스 모델의 백신 효율성
H, pylori감염에 대한 동물을 보호하는 HP30과 HP56의 효율성을 측정하기 위하여 헬리코박터가 없는 마우스를 사용하였다. 예방적인 연구를 위하여, 마우스의 시험 그룹에 PBS 내에 보조약을 사용 또는 비사용한 백식 0.25 ㎖를 주입한 후 10 분 이후에 5% 소디움 비카보네이트 0.5 ㎖을 경구적으로 투여하였다. 경구 백신 투여는 0, 14, 그리고 28일에 세 번씩 투여되었다. 경비 백신 투여는 HP30, HP56 또는 PBS 내에 보조약을 사용 또는 비사용한 채 헬리코박터 전체 세포(HWC) 투여에 의하여 수행되었다. 백신의 피하 주입은 0, 21 및 35일에 각 마우스의 두군데의 피하 부위(예를 들어 뒷목과 복부)에 투여하였다. 최후 백신 투여(치료상의) 2 주일 후, 마우스에 107의H. felis또는 108의H, pylori를 5 일 동안에 투여하는 위장내 접종에 의하여 면역성을 테스트하였다. 치료적인 연구에서, 마우스는 상기한 대로H. felis또는H, pylori로 먼저 집락화 시키고(0일) 그 후 면역성 테스트 21, 35 및 49일에 경구적으로 백신 투여하고, 21일에 경비 투여하거나 21, 42 및 56 일에 피하주입하여 백신투여하였다. 면역성 테스트 2 주일 후(예방적인) 또는 최후 백신 투여후(치료적인), 마우스는 CO2로 안락사시키고 전체 위장H, pylori) 또는 뼈의 공동(H. felis)을 적출하여 종단면으로 잘라내었다. 우레아제 활성의 결정을 위하여, 위는 6.19에서 서술한 바에 따라 에세이하였다.H, pylori의 정량을 위하여, 위는 상기 6.20에서 서술한 바에 따라 에세이 되었다.
상기H, pylori에 감염된 마우스의H, pylori집락을 감소 또는 제거시키는 치료제로서 역할하는 rHP30과 rHP56의 능력을 다음 표 3에 나타내었다. 기록상으로 마우스는 약 106내지 107CFU/ml의 살아있는H, pylori가 집락되었다. 상기한 0일과 같이 마우스는 살아있는H, pylori로 집락되었고, 보조약(알룸, CFA 또는 알룸 + AB5)을 함유하는 rHP30, rHP56 또는 rHP30과 rHP56 양자로 21, 42 및 56일에 피하에 백신투여되었다. 마이스는 감소된 헬리코박터 수준을 가지는 보조약으로서 알룸을 사용하여 rHP30, rHP56 또는 rHP30과 rHP56 양자로 백신투여되었다. 마우스가 보조약으로써 알룸과 AB5를 사용한 rHP30과 rHP56 으로 면역화되었을 때, 헬리코박터 감염은 완전하게 제거되었다. 보조약으로써 CFA를 사용한 rHP30 또는 rHP56 으로 면역화된 마우스에서 헬리코박터 감염 또한 완전하게 제거되었다.
rHP30 또는 rHP56으로 비강용 백신에 의해 헬리코박터 파이로리를 지닌 콜로니화된 쥐 치료법
백신 유레아제 시험 양성/총 위 배양 CFU/㎖
rHP30 + 알룸 1/5 1 ×104
rHP56 + 알룸 1/5 4 ×104
rHP30 + rHP56 2/5 1 ×105
rHP30 + rHP56 + 알룸 0/5 1×103
rHP30 + rHP56 + 알룸 + AB5 0/5 0
rHP30 + CFA 0/5 0
rHP56 + CFA 0/5 0
rHP30 또는 rHP56의H, pylori의 연속적인 감염으로부터 마우스를 보호하는 능력은 표 4와 도 9 및 10에 나타내었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 보조약으로써 AB5를 사용한 rHP30 또는 rHP56를 경비로 백신투여된 마우스는 헬리코박터의 집락화에 대하여 보호되지 않았다. 반면에, 헬리코박터로 면역성을 테스트한경우, 경비 내로 rHP30 과 rHP56 양자와 보조약 AB5 를 백신투여한 경우에는 집락화로부터 보호되었다.
도 9의 데이타는 재조합된 HP30으로 피하로 백신투여된 동물의 ≥50% 가 연속적인H, pylori의 위장내 집락화로부터 보호되거나 대조군 마우스보다 낮은 수준으로 집락하됨을 명확하게 나타낸다. 이러한 결과들은 HP30 항원의 보호적인 효율성이 비경구적 보조약의 보조-주입의 사용 또는 비사용한 피하 면역화에 의하여 달성됨을 나타낸다.
도 10의 데이터는 재조합된 HP30과 HP56을 경구로 백신투여된 동물의 ≥50% 가 연속적인H, pylori의 위장내 집락화로부터 보호되고 남아있는 동물은 조H, pylori세포 여액으로 면역화된 마우스보다 낮은 수준으로 집락화됨을 명확하게 나타낸다. 이러한 결과들은 HP30과 HP56 항원의 보호적인 효율성이 사용 또는 비사용한 보조약의 보조-주입에 의하여 달성됨을 또한 나타낸다.
rHP30 또는 rHP56으로 비강용 백신에 의해 헬리코박터 보호율
백신 %보호율*
rHP30 + AB5 0
rHP56 + AB5 0
rHP30 + rHP56 + AB5 100
* 보호율은 헬리코박터 펠리스 투입 후 21일 유레아제 시험으로 음성의 동물수에 의해 결정함.
rHP30 또는 rHP56 항-헬리코박터 체액 반응을 설명하기 위한 혈액 샘플은 원심분리에 의해서 제조된 레트로오비탈과 세럼에 의한 면역과 자극이 형성되는 동안 일정간격으로 수집되어진다. 엘리사에 의해 반응하는 항체의 양(Ab)은 6.17 단락 의해 나타낸 바로 수행되었다. 항체 레벨의 설명을 위한 마이크로웰 엘리사 플레이트(Maxisorb, NUNC)는 정제된 rHP30, rHP56 또는 H ~ 0.5 ∼ 10 g으로 4 ℃에서 밤샘 도포된다. 10 mM 카보네이트/바이카보네이트 완충용액(pH 9.6) 안의 필로리 전체 셀(웰당 ~6 ×108셀)은 0.1% 트윈-20(세척하는 완충용액)을 포함하는 PBS 용액에 의해 세척되고 3% BSA를 포함하는 PBS용액으로 37 ℃에서 1시간동안 블록화되었다. 항원 특이적 혈청 IgG 레벨을 설명하기 위한 테스트 세럼들은 0.5% BSA와 알리쿼트(37 ℃에서 ~2시간동안 도포된 웰에 배양된 항원 100 ㎕)를 포함하는 완충세척액으로 연속적으로 희석된다. 플레이트는 세척되고 염소 항-쥐 IgG 2차 항체(시그마)가 콘쥬게이트된 호르세라디시 퍼옥사이다세(HRP)으로 37 ℃에서 ~1시간동안 배양되었다. 염소 항-쥐 IgA 2차 항체가 콘쥬게이트된 HRP는 rHP30 또는 rHP56 특이적 IgA의 존재 감지를 위해 사용되어진다. 대략적인 2차 항제가 배양된 후, 플레이트는 세척되고 TMB 지지체(시그마)에 실온에서 ~20 ∼ 30 분 동안 배양하였다. 반응은 2M H2SO4첨가에 의해 중지되고 마이크로플레이트 리더의 흡수파장은 450 nm이었다. 역가는 450 nm에서 광학밀도가 1.0으로 교환되는 샘플 희석액의 상반적 관계로 설명된다.
쥐의 항-헬리코박터 IgG 항체 반응은 rHP30, rHP56 또는 표 5에 나타낸 보조제인 알룸, 알룸 + AB5 또는 CFA가 사용된 rHP30, rHP56의 피하주사로 예방되었다. 보조제인 알룸이 사용으로 rHP30, rHP56으로 면역된 쥐는 보조제로 CFA가 사용된 rHP30, rHP56사용하여 면역된 쥐와 동일한 항-헬리코박터 IgG 항체의 높은 역가를가진다. 알룸과 AB5를 사용하는 rHP 30, rHP 56으로 면역된 쥐는 더 낮은 IgG 항체 역가를 가진다.
재조합 HP30 또는 HP56로 피하 백신화에 의해 유도된 헬리코박터 파이롤리 전체 세포 여액에 대한 항체
백신 IgG 반응*
rHP30 9,000
rHP30 + 알룸 40,000
rHP56 + 알룸 14,000
rHP30 + rHP56 20,000
rHP30 + rHP56 + 알룸 390,000
rHP30 + rHP56 + 알룸 + AB5 65,000
rHP30 + AB5 46
rHP56 + AB5 30
rHP30 + rHP56 + AB5 33,938
rHP30 + CFA 390,000
rHP56 + CFA 390,000
* 항체 반응은 포획 항원으로서 헬리코박터 파이로리 전체 세포를 사용하여 엘리자법으로 역가를 나타냄.
22 HP30 또는 HP56 의 특이적 세포반응 측정.
쥐의 그룹을 rHP30, rHP56 그리고 보조제를 포함하는 백신으로 면역하였다. 가령, 쥐는 HP30과 보조제로 면역된다. 마지막 면역 후 7일째에, 각 그룹의 동물은 간편한 방법으로 사용되어 준비된 CO2질식, 지라 제거 그리고 단일 세포 현탁물에 의해 희생된다. 면역된 동물의 지라세포는 분리되어 분석되거나 2동물들의 지라는 수집되었다. 긍정적으로 조절된 그룹(샴 면역되고 샴 감염된)과 부정적으로 조절된 그룹(샴 면역되고 감염된)의 두 경우 지라 세포는 수집되어가 재자극 테스트가 행해진다.
지라 세포 분열을 측정하기 위하여, 지라는 10% 태아의 어린 세럼이 부충된 RPMI 1640 글루타막스 I 5 ㎖, 소디움 피루베이트 1 mm, 부가적으로 아미노산과 50M 2-머캅토에탄올(Gibco-BRL) 안에 놓인다(5에서 10개 부분으로). 간 세포는 트리판 블루 스테이닝과 밀도가 1.0 ∼ 2.0 ×106세포/㎖에 도달된 밀도를 가지는 희석액에 의해 수를 측정한다(팔콘 2063 폴리프로필렌 튜브). 트리플리케이트 배양은 중간체 200 ㎕안에 웰당 ~5 ×105반응체로 사용되는 96-웰 배양판 둥근 바닥에 장치된다. 세포는 긍정적 자극조절인 rHP30 또는 rHP56(항 특이적 분열)의 1.0 ㎍/㎖ 또는 콘카나발린 A 4 ㎍/㎖로 자극되어진다; 재자극이 안된 세포배양은 세포적 활성의 부정적 조절에 의해 사용되어진다. 세포가 5% CO2안에서 37 ℃로 배양된 72 ∼ 96 시간 후에 웰당 1.0 Ci3H-티미딘(어메르샴) ~18시간동안 압력을 받는다. 가압된 세포는 톤텍 셀 하르베스터(MKⅢ)유리섬유 시트위에서 수득되고 3-채널 왈락스 1450 트리럭스 리퀴드 사인틸레이션 카운터안에서 베타 발산을 위해 계산된다. 샘플(각각 또는 수집된)을 위한 자극표(SI)는 항원 또는 트리플리케이트 웰의 흡수가 무자극 형성에 의해 분할되는 트리플리케이트 웰의3H-티미딘이 흡수된 콘A-자극된 T-세포의 의미로 정의된다. 항원 특이성(rHP 30 또는 rHP 56 특이성)과 콘A 특이성 분할을 위해 SI가 설명된다.
사이토킨 레벨의 측정을 위하여 지라와 림프 노드 세포는 마지막 백신 처리 후 10일 후에 수거된다. 세포들은 적절한 항원에 의해 자극되어지고 상층액은 24,48 그리고 72 시간 배양이 수집된다. 사이토킨 레벨은 샌드위치된 엘리사 킷트에 의해 측정된다. 생성된 사이토킨의 단위는 자극세포의 표준 곡선으로부터 흡광도 45 nm와 비교하여 측정된다.
23 보조제 활성의 상승
헬리코박터 펠리스 동 전이증식 모델은 재조합형 HP56의 보조 효과를 평가하기 위해 사용되었다. 암컷 Balb/C 마우스(나이 ∼6주, 잭슨 랩) 4 그룹은 이 평가를 위해 사용되었다. 5 마리 동물의 한 그룹은 포르말린-비활성화 헬리코박터 파일로리 전 세포(HWC) 항원(∼1.0 ×109HWC 입자)과 재조합형, 순수 HP56(총 부피 ∼30 ㎖, 멸균 PBS)의 ∼10 ㎍으로 구성된 백신을 2번 비강내 복용하였다. 각 그룹마다 5 마리 수컷 마우스의 두 그룹은 유사하게 면역되었다; 한 그룹은 단지 HP56 원형 아주반트(∼10 ㎍, 전 세포 항원 없음)를 함유하는 제제를 받았으며, 다른 그룹은 조정 점막 아주반트로서 대장균 이열성 독소(mLT)의 개질된 형태 ∼5 ㎍과 함께 HWC 항원(∼1.0 ×109입자)으로 구성된 백신을 받았다. 5 마리 동무의 네 번째 그룹은 무표지 아주반트 검정으로 제공되었으며, 불활성화된 HWC 항원과 아주반트 활성을 갖지않는 재조합성 단백질 ∼10 ㎍으로 구성된 백신으로 면역되었다. 면역은 따로 14일 주었다. 면역 전, 마우스는 발열인자가 없는 PBS(100 ㎖ i.p./동물) 중에 16% 케타젝트(Ketaject)와 16% 실라젝트(Xylaject)로 구성된 마취 칵테일을 사용하여 안정시켰다. 안정된 동물은 등으로 위치시키고, 그들의 실험실 표준 피펫을 사용하여 백신 제형을 투여하였다; 콧구멍마다 백신 용액 ∼10 ㎕.
2차 면역 후 대략 10일, 혈액을 레트로오비탈 출혈에 의해 모으고 혈청을 원심분리로 준비하였다. HWC 시험 항원 또는 HP56 원형 보조제 중 하나를 지시한 각각의 혈청 IgG 및 IgA 역가를 엘리자에 의해 결정하였다. 항체(Ab) 레벨 결정용 마이크로웰 엘리자 플레이트(맥시소브, NUNC)를 불활성화된 HWC 항원 또는 10 mM 카보네이트/비카보네이트 버퍼(pH 9.6) 웰당 재조합 HP56 중 하나의 ∼0.5-1.0 ㎍로 4 ℃에서 하룻밤 입혔다. 포착 항원으로 입히고, 마이크로타이터 플레이트를 0.1% 트윈20(세척 버퍼)를 함유한 PBS로 세척하고, 3% BSA를 함유한 PBS로 37 ℃에서 ∼1시간동안 차당하였다. 혈청 IgG과 IgA 레벨 결정을 위해 시험 혈청을 0.5% BSA를 함유한 세척 버퍼로 순차적으로 희석하고 아리쿠트(100㎕)가 37 ℃에서 ∼2시간동안 항원코팅된 웰에서 배양되었다. 그 다음 플레이트를 세척하고 염소 항-쥐 IgG 2차 항체(시그마)가 콘쥬게이트된 호르세라디시 퍼옥사이다세(HRP)로 37 ℃에서 ∼1시간동안 배양하였다. 염소 항-쥐 IgG 2차 항체가 콘쥬게이트된 HRP를 질 분비 내에 HWC 특이 IgA의 존재를 검출하기위해 사용하였다. 적절한 2차 항체의 배양 후, 플레이트를 세척하고 TMB 기질(시그마)로 실온에서 ∼20-30분동안 배양하였다. 2M H2SO4로 반응을 멈추고 흡수도를 분자 장치 스펙트로맥스 마이크로플레이트 리더 상에 450 nm에서 결정하였다. 역가를 450nm에서 1의 흡광도로 반응하는 샘플 희석액의 레시프로칼(reciprocal)로결정하였다. 다음 표 6에 나타낸 바와 같이, 재조합 HP56의 비강 투여는 대량 10-접힘과 35-접힘 각각의 HWC 특이 혈청 IgA와 IgG 레벨의 생성을 자극하였다.
재조합 HP56의 보조 활성
샘플 HWC IgA 역가 HWC IgG 역가 HP56 IgA 역가 HP56 IgG 역가
rHWC + HP56 3770 65610 15 ±11 28782+21870
PBS + HP56 16±36 10±0 72±34 31247±50208
HWC + AB5 7290±0 81732±58683 10±0 10±0
HWC + mSLTiiv 43±69 1757±26978 10±0 4209±2806
23 방사성표지 선별 탐침 생성
상기 시퀀스 정보는 비퇴화 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 디자인된다. DNA 단편의 PCR 증식을 복원 온도가 50 ℃ 보다 낮은 것을 제외하고 상기에서 설명한 바와 같이 동일한 조건 하에서 수행한다. DNA 단편을 표준방법에 따라 [32P]-감마-ATP 및 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제를 사용하여 방사능표시 전과 후를 아가로스 겔로 분리한다. 포함되지 않은 방사성표지를 G25 세파로스 스핀 컬럼 상에 탐침으로부터 분리한다. 사용 전에, 탐침을 복원 온도가 50 ℃ 보다 낮은 것을 제외하고 상기에서 설명한 95 ℃에서 2분동안 변성시키고 연속적으로 얼음(4℃)에서 냉각시킨다.
24 용균반-리프트 필터의 하이브리다이제이션 및 방사성표지 탐침을 사용한 써든 블랏
라이브러리 플레이팅으로의 파지 용균반을 당업자에게 잘 알려진 표준 이전조약을 사용하여 나일론 필터 상에서 고정화시킨다. 분해된 박테리아 게놈 DNA, 파지 또는 플라스미드 DNA를 0.8% TAE-아가로스 겔 상에서 전기영동하고 제조업자의 권장에 따라 압력 블랏터(스트라타젠)를 사용하여 나일론 필터로 옮긴다. 선별된 탐침으로 하이브리다이제이션을 복원 온도가 50 ℃ 보다 낮은 것을 제외하고 상기 설명된 37 °에서 수행한다. 다른 탐침으로 하이브리다이제이션을 복원 온도가 50 ℃ 보다 낮아지는 것을 제외하고 상기 설명된 60°에서 일반적으로 수행한다. 비특이적 배경을 최소한도로까지 상대적인 하이브리다이제이션 온도에서 엄격하게 세척하였다.
25 헬리코박터 파이로리 게놈 DNA 라이브러리 구축
게놈 라이브러리를 스트랏젠으로부터 얻은 λZAPⅡ치환 벡터 내에 구축한다. 벡터 팔은 EroR1으로 분해된다. EroR1에 의해 헬리코박터 파이로리 DNA의 분해산물을 1kb와 5kb의 단편을 얻도록 수행한다. 벡터 팔 및 삽입 DNA의 연결은 표준 조약에 따라 수행한다. 연결 반응을 스트라타젠 기가팩 골드 Ⅲ 추출액을 사용하여 생체 외에서 실시한다. 연결된 파지를 대장균 X1 블루 MRA(P2)(스트라타젠)에 플레이트한다. 초기 라이브러리 역가가 결정되고 pfu의 수로 나타낸다.
라이브러리를 8 ×103pfu/130 mm 플리에트의 밀도로 플레이트되어진 4 ×104pfu를 사용하여 선별한다. 몇몇의 추정 양성 파지 용균반이 위치되고 가장 강한 하이브리다이징 파지를 뽑아낸 아가로스 플러그로부터 용출하고 적정하고 2차 선별을 위해 판에 놓는다. 선별된 파지를 저밀도(대략 100 pfu/플레이트)로 놓고 용균반을 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 분석한다. 이동한 플라스미드(파지미드) 삽입물들이 적절한 헬퍼 바이러스와 함께 감염 대장균 세포에 의해 선별된 파지로부터 구조된다.
26 삽입 크기 결정 및 DNA 단편 맴핑(MAPPING)
삽입크기를 측정하기 위하여, 파지미드 DNA는 NotI으로 잘라내고 잘라낸 산물을 적절한 DNA 마커를 가지고 0.5% TAE-아가로스 겔 상에서 한 단계씩 분석한다. 프로브로 하이브리다이즈한 제한 단편을 지도화하기 위해 파지미드 분리물로부터의 DNA를 단독으로 또는 NotI를 결합하여 통상적인 제한 효소의 수로 잘라낸다. 이러한 접근의 이유로는 삽입/파지미드 벡터 연접을 측정하는 단편과 NotI 삽입 상에서 지도화하는 단편 모두 구별하는 것이다. 하나 그리고 두 개의 분해산물시리즈는 한 단계씩 각 파지 분리물에 넣고 방사성 표지 탐침를 가지고 써든 분석으로 분석한다.
27 HP30 또는 HP56 유전자 시퀀싱
rHP30 또는 rHP56을 코드하는 핵산의 시퀀싱을 제조자의 설명서에 따른 퍼킨-엘머의 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 킷트를 사용하여 수행한다. 시퀀싱 작업은 ABI 프리즘 310 유전학 분석기를 사용하여 이루어진다. ABI 프리즘310 시퀀서로 제공된 오토어셈블러 소프트웨어(퍼킨-엘머)를 사용하여 배열한다.
본 발명은 다음의 실시예 또는 미생물 기탁에 의해 제한되는 것이 아니다. 기능적으로 동등한 변화들이 이 발명의 범위 내에 있음을 알 것이다. 추가로 다음 설명되고 나타낸 이 발명의 다양한 추가사항이 실제로들 범위 내에 선행기술과 그에 따른 도면으로부터 명백한 기술 차이를 가진다. 그러한 추가사항은 추가된 청구범위 내에 들어가는 것이다.
참고문헌에 포함된 설명은 다양한 공개문헌을 인용한 것이다.
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미생물
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Claims (80)

  1. 헬리코박터(Helicobacter) 종의 단리된 HP30 또는 HP56 폴리펩티드로, 상기 HP30이 30 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며, 상기 HP56kDa가 56 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 2의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며, 이때 상기 분자량은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정되는 HP30 또는 HP56 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 헬리코박터 종이 헬리코박터 파이로리(pylori) 및 헬리코박터 펠리스(felis)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HP30 또는 HP56 폴리펩티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 헬리코박터 종이 헬리코박터 파이로리인 HP30 또는 HP56 폴리펩티드.
  4. 서열 식별 번호: 2 또는 4 또는 48의 서열, 그의 단편; 서열 식별 번호: 1 또는 3 또는 47의 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화된 서열; 또는 (a) DNA를 함유하는 필터를 50 ℃에서 6X SSC, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.02% BSA 및 500 ㎎/㎖의 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 완충액 중에서 예비 하이브리드화시키고; (b) 65 ℃에서 100 ㎎/㎖의 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 예비 하이브리드화 혼합물에서 하이브리드화시키고; (c) 필터를 2X SSC, 0.01% PVP, 0.01% 피콜 및 0.01% BSA를 함유하는 용액에서 37 ℃에서 세척함을 포함하는 매우 엄격한 조건 하에서 서열 식별 번호: 1 또는 3 또는 47의 서열을 포함하는 핵산 분자와 하이브리드를 형성하는 핵산 분자에 의해 암호화된 서열을 포함하고, 이때 상기 각각의 단편들이 적어도 6 이상의 아미노산 길이를 가지며 서열 식별 번호: 2 또는 4 또는 48의 단백질 서열에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하는, 단리된 HP56 또는 HP30 폴리펩티드.
  5. 서열 식별 번호: 2 및 4 및 48로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하는, 제 1 항의 HP56 또는 HP30 폴리펩티드 또는 그의 적어도 6 이상의 아미노 펩티드 단편.
  6. 펩티드 단편이 적어도 6 이상의 아미노산 길이를 갖는 제 1 항의 HP30 또는 HP56 폴리펩티드의 펩티드 단편.
  7. 제 6 항에 있어서, 서열 식별 번호: 5 내지 20의 서열을 포함하는 펩티드 단편.
  8. 적어도 2 개 이상의 펩티드를 포함하고, 상기 펩티드 각각이 서열 식별 번호: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드들의 그룹 중에서 선택되나, 단 상기 펩티드들이 천연 구성과 상이한 구성으로 배열되는 단리된 융합 폴리펩티드.
  9. 제 8 항에 있어서, 서열 식별 번호: 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11을 포함하나, 단 펩티드들이 천연 구성과 상이한 구성으로 배열되는 단리된 융합 폴리펩티드.
  10. 제 8 항에 있어서, 서열 식별 번호: 16, 17, 18, 19 및 20을 포함하나, 단 펩티드들이 천연 구성과 상이한 구성으로 배열되는 단리된 융합 폴리펩티드.
  11. 제 1 항의 HP56 또는 HP30 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제 6 항의 펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 서열 식별 번호: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포독성, 세포 발육 정지 또는 중화 항체인 항체.
  15. 제 1 항의 HP30 폴리펩티드 및 HP56 폴리펩티드를 포함하는 제 1 항 또는 제 4 항의 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 또한 포함하는 백신.
  17. 제 16 항에 있어서, 아주반트 또는 면역자극 화합물이 알룸, mLT, QS21, MF59, CpG DNA, PML, 인산 칼슘, 황산 칼슘 이수화물, PLG, CT, LTB 및 CT/LT로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신.
  18. 제 16 항에 있어서, 하나의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  19. 제 16 항에 있어서, 2 개의 상이한 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  20. 제 5 항 또는 제 6 항의 펩티드 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신.
  21. 제 20 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 또한 포함하는 백신.
  22. 제 21 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물이 알룸, mLT, QS21, MF59, CpG DNA, PML, 인산 칼슘, 황산 칼슘 이수화물, PLG, CT, LTB 및 CT/LT로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신.
  23. 제 21 항에 있어서, 하나의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  24. 제 21 항에 있어서, 2 개의 상이한 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  25. 제 8 항의 단리된 융합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신.
  26. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 또한 포함하는 백신.
  27. 제 26 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물이 알룸, mLT, QS21, MF59, CpG DNA, PML, 인산 칼슘, 황산 칼슘 이수화물, PLG, CT, LTB 및 CT/LT로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신.
  28. 제 26 항에 있어서, 하나의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  29. 제 26 항에 있어서, 2 개의 상이한 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  30. 제 11 항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신.
  31. 제 15 항, 제 20 항 및 제 25 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질, 지단백질, 인지질, 리포올리고당류, 단백질, 감독된 유기체 및 불활성화된 완전 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 면역원을 또한 포함하는 백신.
  32. 제 15 항, 제 20 항 및 제 25 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 에이치 파이로리 세포독소, 에이치 파이로리 hsp60, 에이치 파이로리 CagA, 에이치 파이로리 우레아제, 에이치 파이로리 카탈라제, 에이치 파이로리 니켈 결합 단백질, 에이치 파이로리 tagA, 에이치 파이로리 에놀라제, 캄필로박터 종, 시겔라 종, 장 병원성 이 콜라이 종, 비브리오 콜레라 또는 로타바이러스의 전체 감독되거나 사멸된 유기체 또는 서브유닛으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 면역원을 또한 포함하는 백신.
  33. 헬리코박터 종의 단리된 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 또는 그의 적어도 6 이상의 아미노산 단편을 암호화하는 헬리코박터 종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는단리된 핵산 분자, 또는 서열 식별 번호: 2 또는 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 핵산의 단편으로, 상기 HP30이 30 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며, 상기 HP56이 56 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 2의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며, 이때 상기 분자량은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정되는 단리된 핵산 분자.
  34. 서열 식별 번호: 1 또는 3 또는 47의 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 서열 식별 번호: 2 또는 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는, 헬리코박터 종의 상기 핵산 분자의 적어도 18 이상의 뉴클레오티드 단편, 또는 그의 상보물.
  35. 제 33 항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물.
  36. 제 33 항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 백신.
  37. 제 1 항의 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산, 또는 서열 식별 번호: 1 또는 3 또는 47의 서열을 포함하는 단리된 핵산, 또는 서열 식별 번호: 2 또는 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는, 상기 어느 한 핵산의 적어도 18 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하고, 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 또한 포함하는 백신.
  38. 제 37 항에 있어서, 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물이 알룸, mLT, QS21, MF59, CpG DNA, PML, 인산 칼슘, 황산 칼슘 이수화물, PLG, CT, LTB 및 CT/LT로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신.
  39. 제 37 항에 있어서, 하나의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  40. 제 37 항에 있어서, 2 개의 상이한 아주반트 또는 면역자극 화합물을 포함하는 백신.
  41. 헬리코박터 종의 단리된 HP30 또는 HP56 폴리펩티드(여기에서 상기 HP30은 30 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며, 상기 HP56kDa는 56 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 2의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하고 서열 식별 번호: 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며; 이때 상기 분자량은 폴리아미드 겔 전기 영동의 SDS로 측정된다); 및 HP30 또는 HP56 폴리펩티드 헬리코박터 종을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산(여기에서 상기 HP30은 30 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 4 또는 48의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며, 상기 HP56kDa는 56 kDa의 분자량을 갖고 서열 식별 번호: 2의 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합하며; 이때 상기 분자량은 폴리아미드 겔 전기 영동의 SDS로 측정된다) 중 하나 이상을 포함하고; 알룸, mLT, QS21, MF59, CpG DNA, PML, 인산 칼슘, 황산 칼슘 이수화물, PLG, CT, LTB 및 CT/LT로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아주반트 또는 면역자극 화합물을 또한 포함하는 백신.
  42. 제 15 항, 제 20 항, 제 25 항, 제 30 항, 제 36 항, 제 37 항 및 제 41 항중 어느 하나의 항에 있어서, 미소구 또는 나노구로서 제형화된 백신.
  43. 제 42 항에 있어서, 미소구 또는 나노구가 장용 코팅된 백신.
  44. 동물에게 면역원 량의 제 1 항의 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 투여함을 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 생성시키는 방법.
  45. 동물에게 면역원 량의 제 6 항의 펩티드 단편을 투여함을 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 생성시키는 방법.
  46. 동물에게 면역원 량의 제 8 항의 단리된 융합 폴리펩티드를 투여함을 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 생성시키는 방법.
  47. 동물에게 면역원 량의 제 33 항 또는 제 34 항의 핵산 분자를 투여함을 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 생성시키는 방법.
  48. 동물에게 면역원 량의 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 하나의 항의 백신을 투여함을 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 생성시키는 방법.
  49. 동물에게 면역원 량의 제 15 항, 제 20 항, 제 25 항, 제 30 항, 제 36 항, 제 37 항, 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 하나의 항의 하나 이상의 백신을 투여함을 포함하는, 상기 동물에서 면역 반응을 생성시키는 방법으로, 상기 백신을 동시에 또는 연속적으로 투여하는 방법.
  50. ATCC에 수탁 번호 PTA-2670으로 기탁된, 이 콜라이로부터 수득할 수 있는 플라스미드 M15(PRE4)PQE/HP30.
  51. ATCC에 수탁 번호 PTA-2669로 기탁된, 이 콜라이로부터 수득할 수 있는 플라스미드 M15(PRE4)PQE/HP56.
  52. 제 33 항 또는 제 34 항의 핵산 분자를 포함하는 숙주의 형질전환에 적합한 재조합 발현 벡터.
  53. 제 52 항에 있어서, HP30 또는 HP56 단백질 또는 그의 적어도 6 이상의 아미노산 단편의 숙주에 의한 발현을 위해 핵산 분자에 작용적으로 커플링된 발현 수단을 또한 포함하는 재조합 발현 벡터.
  54. 제 53 항에 있어서, 발현 수단이 HP30 또는 HP56 단백질의 정제를 위한 서열을 암호화하는 핵산 부분을 포함하는 발현 벡터.
  55. 제 53 항에 있어서, 발현 수단이 HP30 또는 HP56 폴리펩티드의 숙주로부터의 분비를 조정하는 핵산 부분을 또한 포함하는 발현 벡터.
  56. 제 52 항의 발현 벡터를 함유하는 형질전환된 숙주 세포.
  57. 제 50 항 또는 제 51 항의 플라스미드를 함유하는 형질전환된 숙주 세포.
  58. 이종 프로모터에 작용적으로 결합된 제 33 항 또는 제 34 항의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
  59. 제 56 항의 형질전환된 숙주 세포를 HP30 또는 HP56 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양시키고 상기 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 회수함을 포함하는 방법에 의해 제조된, 헬리코박터 종의 단리된 재조합 HP30 또는 HP56 폴리펩티드.
  60. 제 57 항의 형질전환된 숙주 세포를 HP30 또는 HP56 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양시키고 상기 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 회수함을 포함하는 방법에 의해 제조된, 단리된 재조합 HP30 또는 HP56 폴리펩티드.
  61. 제 58 항의 형질전환된 숙주 세포를 HP30 또는 HP56 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양시키고 상기 HP30 또는 HP56 폴리펩티드를 회수함을 포함하는 방법에 의해 제조된, 단리된 재조합 HP30 또는 HP56 폴리펩티드.
  62. 유효량의 제 1 항 또는 제 4 항의 폴리펩티드를 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  63. 유효량의 제 6 항의 폴리펩티드 단편을 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  64. 유효량의 제 8 항의 단리된 융합 폴리펩티드를 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  65. 유효량의 제 30 항의 백신을 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  66. 유효량의 제 31 항의 백신을 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  67. 유효량의 제 32 항의 백신을 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  68. 유효량의 제 37 항의 백신을 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  69. 유효량의 제 41 항의 백신을 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  70. 유효량의 제 15 항의 백신을 투여함으로써 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  71. 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병의 예방, 치료 또는개선이 필요한 환자에게 유효량의 제 15 항, 제 20 항, 제 25 항, 제 30 항, 제 31 항, 제 36 항, 제 41 항 내지 제 43 항 중 하나 이상의 백신(이들은 각각 지질, 지단백질, 인지질, 리포올리고당류, 단백질, 감독된 유기체 및 불활성화된 완전 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 면역원을 임의로 포함한다)을 동시에 또는 순차적으로 투여함으로써 상기 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 헬리코박터 살균 활성을 갖는 하나 이상의 항생제를 투여함을 또한 포함하고, 이때 상기 항생제를 하나 이상의 백신의 투여 전, 투여와 동시에 또는 순차적으로 투여하는 방법.
  73. 제 72 항에 있어서, 하나 이상의 항생제를 메프라졸, 클라리쓰로마이신, 오메프라졸, 메트로니다졸, 테트라사이클린, 란소프라졸 및 아목시실린으로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
  74. 제 1 항 또는 제 4 항의 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 억제하는 길항물질.
  75. 제 33 항의 핵산의 발현을 억제하는 길항물질.
  76. 제 1 항의 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 상기 화합물과 상기 폴리펩티드간의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 선별하려는 화합물과 접촉시키고 상기 화합물과 상기 폴리펩티드의 상호작용을 탐지함을 포함하는 방법.
  77. 제 33 항의 핵산 분자의 활성과 상호작용하는 화합물을 식별하는 방법으로, 상기 핵산을 포함하는 조성물을 상기 화합물과 상기 핵산간의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 선별하려는 화합물과 접촉시키고 상기 화합물과 상기 핵산의 상호작용을 탐지함을 포함하는 방법.
  78. 헬리코박터에 의한 동물의 감염과 관련된 질환 또는 질병의 예방, 치료 또는 개선이 필요한 환자에게 유효량의 하나 이상의 제 32 항의 백신(이들은 각각 지질, 지단백질, 인지질, 리포올리고당류, 단백질, 감독된 유기체 및 불활성화된 완전 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 면역원을 임의로 포함한다)을 동시에 또는 순차적으로 투여함으로써 상기 질환 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 헬리코박터 살균 활성을 갖는 하나 이상의 항생제를 투여함을 또한 포함하고, 이때 상기 항생제를 백신의 투여 전, 투여와 동시에 또는 순차적으로 투여하는 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 하나 이상의 항생제를 메프라졸, 클라리쓰로마이신, 오메프라졸, 메트로니다졸, 테트라사이클린, 란소프라졸 및 아목시실린으로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020107368A1 (en) * 2000-12-07 2002-08-08 Jing-Hui Tian Helicobacter proteins, gene sequences and uses thereof
HUE026171T2 (en) * 2003-02-03 2016-05-30 Cerebus Biologicals Inc A method for treating, preventing and detecting Helicobacter infection
GB0423681D0 (en) * 2004-10-26 2004-11-24 Sec Dep For Environment Food & Vaccine and nucleic acids
MX2012001312A (es) * 2009-07-31 2012-06-01 Nat Research Council Epitope externo de nucleo de lipopolisacarido de helicobacter pylori.
CN109180786B (zh) * 2015-11-20 2021-06-18 深圳市南山区人民医院 用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段
CN108181248A (zh) * 2017-12-20 2018-06-19 河南联博生物科技有限公司 一种胶乳增强免疫比浊法定量检测沙丁胺醇的试剂

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5459041A (en) * 1988-02-18 1995-10-17 Enteric Research Laboratories, Inc. Campylobacter pylori antigens and uses thereof for detection of Campylobacter pylori infection
DE4139840B4 (de) * 1990-12-04 2005-06-02 Quidel Corp., San Diego Antigen-Zubereitung zum Nachweis von H. pylori
US5262156A (en) * 1991-08-12 1993-11-16 Hycor Biomedical, Inc. Antigenic compositions and their use for the detection of Helicobacter pylori
EP0967279B1 (en) * 1992-03-02 2008-01-02 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Helicobacter pylori cytotoxin useful for vaccines and diagnostics
IT1262895B (it) * 1992-03-02 1996-07-22 Proteina estratta da ceppi citotossici di helicobacter pylori, gene che la esprime, uso della proteina come vaccino o diagnostico.
MX9301706A (es) * 1992-04-13 1994-05-31 Oravax Inc Composicion de vacuna para el tratamiento de la infeccion por helicobacter.
US5972336A (en) * 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
NZ314585A (en) * 1993-07-27 2000-08-25 Univ New South Wales Method of treating H. Pylori associated gastroduodenal disease
US5876735A (en) * 1994-04-22 1999-03-02 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
AUPM612494A0 (en) * 1994-06-08 1994-06-30 Csl Limited Treatment or prevention of helicobacter infection
JPH10502366A (ja) * 1994-07-01 1998-03-03 リカン・リミテッド ヘリコバクター・ピロリ抗原タンパク質調製品およびイムノアッセイ
US5679564A (en) * 1994-10-05 1997-10-21 Antex Biologics, Inc. Methods for producing enhanced antigenic campylobacter bacteria and vaccines
NZ295877A (en) * 1994-10-05 1999-03-29 Antex Biolog Inc A vaccine comprising the helicobacter bacterium and its use
JP4368944B2 (ja) * 1995-04-21 2009-11-18 シーエスエル、リミテッド 防御用ヘリコバクター抗原
AR003125A1 (es) * 1995-06-01 1998-07-08 Astra Ab Antigenos bacterianos para el diagnostico de infecciones con helicobacter pylori, una molecula de adn que lo codifica, un vector, una celula huesped,procedimiento para producir el polipeptido, composiciones para vacunas adecuadas para uso terapeutico y profilactico, el uso del polipeptido en la
SK165197A3 (en) * 1995-06-07 1999-01-11 Astra Ab Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
WO1997019098A1 (en) * 1995-11-17 1997-05-29 Astra Aktiebolag Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics
US5705344A (en) * 1996-03-14 1998-01-06 Tularik, Inc. High-throughput screening assay for inhibitors of nucleic acid helicases
US5989858A (en) * 1997-10-28 1999-11-23 Smithkline Beecham Corporation Dead-type ATP-dependent RNA helicase (DbpB) from Staphylococcus aureus
US20020151462A1 (en) * 1998-02-19 2002-10-17 Ling Lissolo Helicobacter pylori membrane proteins
US6083924A (en) * 1998-03-12 2000-07-04 Smithkline Beecham Corporation DnaB of staphylococcus aureus
US6569619B1 (en) * 1998-07-29 2003-05-27 Tularik, Inc. High-throughput in vitro screening assays for modulators of nucleic acid helicases
US6204014B1 (en) * 1998-11-13 2001-03-20 Smithkline Beecham Corporation DnaB
AU2001249345A1 (en) * 2000-03-21 2001-10-03 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in prokaryotes
WO2002005845A1 (en) * 2000-07-05 2002-01-24 Merieux Oravax Immunological combinations for prophylaxis and therapy of helicobacter pylori infection
US20020107368A1 (en) * 2000-12-07 2002-08-08 Jing-Hui Tian Helicobacter proteins, gene sequences and uses thereof
US20040029129A1 (en) * 2001-10-25 2004-02-12 Liangsu Wang Identification of essential genes in microorganisms

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