CN116240145A - 一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用，属于生物技术领域。本发明首先利用超速离心法对外膜囊泡进行粗提取，获得粗提外膜囊泡，再制作碘克沙醇密度梯度溶液，利用密度梯度法对粗提的外膜囊泡进行纯化，最终得到纯化的外膜囊泡。本发明将超速离心技术和碘克沙醇密度梯度离心技术相结合，有效解决了具核梭杆菌外膜囊泡提取量少、毒性杂质存留的问题。细胞实验结果表明，本发明纯化的具核梭杆菌外膜囊泡对人正常结直肠上皮细胞毒性低，同时能促进其释放促炎因子IL‑8，利用其制备的抗体能够显著降低具核梭杆菌对结直肠癌细胞的黏附。本发明为制备促进释放促炎因子药物以及疫苗开发方面的应用提供技术基础。

Description

一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法及应用。
背景技术
近年来，结直肠癌严重影响人类身体健康。结直肠癌最常用的预防策略是化学预防，如服用阿司匹林和其他非甾体抗炎药，然而长期使用阿司匹林(或其他非甾体抗炎药)会导致不良反应，包括胃出血、腹痛、消化不良、恶心和呕吐等，并且还会产生耐药性，因此迫切需要更为安全的替代方法。研究表明，具核梭杆菌与结直肠癌的发生和转移直接相关，因此，基于免疫方法控制、减少或根除具核梭杆菌在肠道的定植可有效预防结直肠癌的发生与发展。
细菌外膜囊泡(OMVs)是由细菌分泌产生的脂双层近球形膜囊泡，大小为10～300nm，其组成成分包括外膜蛋白、脂多糖、周质蛋白、内膜蛋白、核酸及肽聚糖等。OMVs中的脂多糖、蛋白质、毒力因子以及遗传物质等在细菌侵染过程中发挥了重要作用，包括促进发病、使细菌在应激条件下存活、向临近细胞传递遗传物质以及调节细菌群落相互作用等。由于细菌外膜囊泡自身的结构与特性，使其在疫苗开发方面具备诸多潜力。一是其表面存在多种抗原，可降低病原体引发的，疫苗中靶抗原发生突变的可能性，进而降低疫苗产生逃逸变体的可能性；二是外膜囊泡具有内在佐剂的能力，相较于传统佐剂，外膜囊泡佐剂具有安全性高、能够引起全面免疫等特点；三是外膜囊泡可作为粘膜转运蛋白，将抗原转运至粘膜屏障；四是外膜囊泡没有生命力且不能复制，具有安全性。此外，外膜囊泡分离成本相对较低，可大大降低疫苗生产成本。因此，外膜囊泡已成为疫苗开发的热门研究对象。例如，基于野生型脑膜炎奈瑟球菌外膜囊泡的疫苗已用于临床，用于预防脑膜炎球菌病。
基于外膜囊泡的生物学功能，其临床应用前景可期。但有关具核梭杆菌外膜囊泡的相关研究较少，对于具核梭杆菌外膜囊泡在人结直肠癌的预防和治疗方面的研究更是鲜有耳闻。并且目前对细菌外膜囊泡提取的方法多为超速离心法，这种方法分离得到的外膜囊泡数量较少，且含有鞭毛和细胞碎片等杂质，导致提取的外膜囊泡质量较差，细胞毒性较大。因此，建立一种能够快速获得大量低毒外膜囊泡的提取和纯化技术是目前亟待解决的问题。
发明内容
为解决传统结直肠癌化学预防的缺陷以及原有外膜囊泡提取方法产量低、毒性大、杂质多的问题，本发明提供了一种具核梭杆菌外膜囊泡及其提取纯化方法及应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明技术方案一：一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法，包括以下步骤：
a.取具核梭杆菌菌种进行培养，获得菌液；
b.取菌液第一次离心，过滤得上清液，浓缩滤液，将浓缩后的滤液第二次离心，去掉上清液，重悬沉淀后获得粗提的外膜囊泡；
c.制作碘克沙醇密度梯度离心液，浓度由上至下依次增大，最上层加入粗提的外膜囊泡，进行密度梯度离心纯化，即得纯化后的外膜囊泡。
碘克沙醇密度梯度离心的原理是，利用缓冲液将碘克沙醇稀释到不同浓度，不同浓度溶液具有不同密度。粗提液中含有多种组分，包括外膜囊泡、细菌细胞碎片、细菌鞭毛等，这些组分也具有不同的密度。离心过程中，在离心力的作用下，密度不同的颗粒将沉降到与其密度相等的离心液中，收集外膜囊泡聚集区域的离心液，去除离心液后，得到外膜囊泡。
进一步地，步骤a中所述培养为将具核梭杆菌菌种加入到30mLTSB培养基中，37℃培养9h，获得种子液；取330mLTSB培养基，按1％接种种子液，充氮气5min，37℃培养40h。
进一步地，步骤b中所述过滤为将上清液通过0.22μm水系膜过滤；所述浓缩为利用中空纤维膜浓缩滤液。
进一步地，步骤b中所述第一次离心为4℃，8500rpm离心25min；所述第二次离心为4℃，200000×g离心4h。
进一步地，步骤c中所述碘克沙醇密度梯度离心液的具体制作方法为将碘克沙醇离心液用含0.85wt％NaCl的30mMHEPS缓冲液稀释，分别得到质量浓度为40％、35％、30％、25％、20％、15％的稀释液。
本发明技术方案二：一种具核梭杆菌外膜囊泡。
本发明技术方案三：一种所述的具核梭杆菌外膜囊泡在制备促进释放促炎因子药物中的应用。
进一步地，所述促炎因子包括白细胞介素IL-8。
本发明技术方案四：一种所述的具核梭杆菌外膜囊泡在制备降低具核梭杆菌对结直肠癌细胞黏附作用的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明首先对具核梭杆菌菌液进行超速离心，得到粗提取的外膜囊泡后利用碘克沙醇密度梯度离心技术进行纯化。将超速离心技术和碘克沙醇密度梯度离心技术相结合，有效解决了具核梭杆菌外膜囊泡提取量少、毒性杂质存留的问题。
(2)本发明提取的外膜囊泡与传统方法相比纯度更高，蛋白质含量更高。
(3)本发明提取的具核梭杆菌外膜囊泡对人正常结直肠上皮细胞毒性较低，且能够促进其细胞促炎因子IL-8的分泌，为其在制备促进释放促炎因子药物以及疫苗开发方面的应用提供技术基础。
(4)本发明提取的具核梭杆菌外膜囊泡可有效引起新西兰大白兔的免疫反应，利用其制备的抗体能够显著降低具核梭杆菌对结直肠癌细胞的黏附。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为具核梭杆菌分泌外膜囊泡扫描电镜图；
图2为纯化外膜囊泡SDS-PAGE电泳图，M表示Maker；1-9分别表示梯度离心得到的9管分装液；
图3为实施例1纯化的膜囊泡对HCoEpiC细胞毒性检测结果；
图4为对比例1获得的外膜囊泡对HCoEpiC细胞毒性检测结果；
图5为实施例1纯化外膜囊泡透射电镜图(左)和对比例1纯化外膜囊泡透射电镜图(右)，右图中箭头标注为存在的杂质；
图6为实施例1纯化的外膜囊泡对HCoEpiC细胞释放促炎因子IL-8的影响；
图7为对比例1获得的外膜囊泡对HCoEpiC细胞释放促炎因子IL-8的影响；
图8为新西兰大白兔血清P/N值随时间变化情况；
图9为利用外膜囊泡制备的抗体对具核梭杆菌粘附结肠癌细胞的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例所用具核梭杆菌菌种购自美国菌种保藏中心(Americantypeculturecollecion，ATCC)。
本发明实施例所用HCoEpiC细胞由中国科学院大连化学物理研究所赠予。
本发明实施例所用人IL-8试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司。
实施例1外膜囊泡的提取纯化
1.培养具核梭杆菌，获得菌液
将具核梭杆菌菌种从-80℃冰箱取出，加入到30mLTSB培养基中，充氮气1min，置于37℃培养箱培养9h至OD600为0.7，获得种子液。随后进行扩大培养，取330mLTSB培养基，按1％接种，加入3.3mL种子液，充氮气5min，37℃培养40h至OD600为1.0，获得菌液。
取1mLOD600为1.0的菌液，用4％多聚甲醛固定12h，依次用25％、50％、75％、无水乙醇脱水10min，4℃，6000×g离心5min，重复两次，最后用无水乙醇重悬沉淀，取样品反复滴加至硅片，利用扫描电镜检测。结果如图1所示。
2.提取菌液外膜囊泡，获得粗提的外膜囊泡
将培养好的菌液转移到350mL离心瓶中，4℃，8500rpm离心25min，除去大部分菌体，取上清液，上清液经0.22μm的水系膜过滤，除去大部分细胞碎片和鞭毛等杂质，获得滤液共350mL，接着利用中空纤维膜浓缩滤液，直至总体积为30mL。浓缩后的液体分装至离心管中，4℃，200000×g离心4h，去掉上清液，沉淀用400μL10mM的PBS溶液重悬，获得粗提的外膜囊泡。
3.纯化粗提的外膜囊泡
将碘克沙醇离心液用含0.85wt％NaCl的30mMHEPS缓冲液稀释至以下质量浓度：40％、35％、30％、25％、20％、15％，并按浓度由大到小加入到离心管中，每个梯度500μL，最后加入粗提的400μL外膜囊泡。4℃，35000×g离心16h，离心完成后，去掉最上层1mL液体，将剩下的液体由上至下每200μL分装一管，最终获得9管分装液，弃去离心管底部剩余液体。将9管分装液进行SDS-PAGE蛋白电泳实验，并对蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，观察到外膜囊泡主要集中在1-4泳道，大小集中在35kDa-45kDa(图2)。
4.收集纯化外膜囊泡
收集蛋白条带所对应的样品，用20倍体积的PBS溶液稀释，稀释后的液体分装至离心管中，4℃，200000×g离心4h，去掉上清液，沉淀用400μL10mM PBS溶液重悬，获得纯化的外膜囊泡。
对比例1传统方法提取纯化外膜囊泡
取实施例1中步骤1所得菌液，采用传统方法(超速离心)提取纯化，得纯化后的外膜囊泡。具体方法为：
将实施例1中培养好的菌液转移到350mL离心瓶中，4℃，8500rpm离心25min，除去大部分菌体，取上清液，上清液经0.22μm的水系膜过滤，除去大部分细胞碎片和鞭毛等杂质，获得滤液，接着利用中空纤维膜浓缩滤液，直至总体积为30mL。浓缩后的液体分装至离心管中，4℃，200000×g离心4h，去掉上清液，沉淀用400μL10mM的PBS溶液重悬，获得粗提的外膜囊泡。
试验例纯化的外膜囊泡对人正常结直肠上皮细胞(HCoEpiC)影响
1.MTT法检测外膜囊泡对HCoEpiC细胞的影响
对数增长期的HCoEpiC细胞经胰酶消化后，用细胞计数板计数，以100μL/孔(每孔细胞数为1.0×104个)接种于96孔平底培养板中，每组设6个复孔。各组接种细胞后置于37℃、CO2饱和湿度为5％的培养箱中无菌培养12h，去掉原培养液。分别换成实施例1和对比例1中提取的外膜囊泡(设置浓度梯度为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，分别对应泳道1、2、3和4中的样品)，每孔100μL，加样后继续培养24h，于实验结束前4h吸去上清，每孔加入100μL5mg/mLMTT，37℃孵育4h，吸尽上清，加入100μL二甲基亚砜，振荡10min，沉淀溶解完全后用自动酶标比色仪在波长490nm处读取吸光值(A490)，结果如图3和图4所示。
结果显示实施例1提取的外膜囊泡对HCoEpiC细胞基本无毒性。而对比例1提取的外膜囊泡对细胞的毒性随浓度增加而增大。
2.将实施例1与对比例1纯化的外膜囊泡进行纯度、密度、蛋白质含量以及免疫原性分析。
2.1.透射电镜拍摄纯化的外膜囊泡
分别取10μL实施例1与对比例1纯化的外膜囊泡于封口膜表面，将铜网正面置于液滴表面，静止10min。用滤纸吸去铜网表面残余液体，滴加PBS缓冲液进行漂洗5min，漂洗结束后使用1％戊二醛固定5min。滤纸吸去残液，用超纯无菌水漂洗8次，每次2min。最后采用醋酸双氧铀进行负染2min，染色结束后将铜网放置在干燥箱中进行室温干燥。制好样品的铜网送去透射电镜实验室进行观察。结果如图5所示，通过图5可以看出纯化后的外膜囊泡颗粒呈球状，颗粒完整，存在少量形状不规则颗粒；传统方法提取的外膜囊泡颗粒呈球状，但存在大量杂质，如细胞碎片，鞭毛等(杂质用箭头标出)。
2.2.蛋白质含量以及免疫原性检测
取对数生长期的HCoEpiC细胞，常规消化。用细胞计数板计数，以100μL/孔(每孔细胞数为1.2×104个)接种于96孔平底培养板中，每组设3个复孔。各组接种细胞后置于37℃、5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中无菌培养12h，去掉原培养液，换成实施例1中纯化的不同浓度的外膜囊泡和对比例1提取的不同浓度的外膜囊泡，每孔100μL，加样后继续培养24h，取上清。用人IL-8试剂盒定量检测上清中IL-8的含量，用自动酶标比色仪在波长450nm处读取吸光值(A450)。
结果如图6-7所示，可以看出实施例1提取的外膜囊泡可引起人正常上皮细胞HCoEpiC释放促炎因子IL-8，并且随着外膜囊泡浓度增大，IL-8的浓度增大(图6)。而对比例1提取的外膜囊泡对HCoEpiC释放促炎因子IL-8呈现抑制作用(图7)。
实施例2纯化的外膜囊泡在抗体制备方面的应用
1.具核梭杆菌外膜囊泡的动物免疫
(1)挑选两只健康的新西兰大白兔(南京巴傲得生物科技有限公司)，对未免疫的兔进行采血，作为免疫阴性对照。
(2)将实施例2纯化的外膜囊泡进行分装，首次免疫，每只兔子准备500μg抗原蛋白，三次加强免疫每只兔子每次各准备800μg抗原蛋白，提前分装至EP管中，备做加强免疫用。
(3)对准备好的抗原进行乳化处理，乳化前检查装有外膜囊泡的EP管是否有颗粒状沉淀，如有沉淀将其超声粉碎后，立即溶解在0.01MPH7.2的无菌PBS中，用注射器取含抗原的PBS，另一支注射器取(等体积)弗氏完全佐剂或不完全佐剂，用不锈钢连接接头连接，反复推拉混合约10-30分钟，平放静置30分钟，如水乳相不再分离，即可进行注射。
(4)乳化后的抗原蛋白进行背部皮下多点注射，本实验在兔子背部脊柱两侧皮下各三个点平均注射；首次免疫21天后进行第一次加强免疫，之后每次免疫间隔为10-14天。
(5)在第三次加强免疫7天后进行阳性血的采集。
(6)阳性血在3500转的转速下离心15min，两次离心后放入灭菌后的50毫升冻存管，并加入适量体积的0.02％叠氮钠溶液，然后放入-20℃冰箱保存。
2.白兔血清抗体水平的检测(ELISA法)
(1)抗原包被：用包被液稀释外膜囊泡，浓度为5μg/mL,按照100μL/孔加入到96孔酶标板孔中，做好标记。4℃湿盒过夜或37℃孵育2h。
(2)洗涤：室温下，用PBST洗涤液200μL/孔，3min/次，洗涤3次。
(3)封闭：取封闭液(1×PBS含5％脱脂奶粉)以150μL/孔加入酶标板孔，37℃湿盒孵育1.5h或4℃过夜。
(4)洗涤：室温下，用PBST洗涤液200μL/孔，3min/次，洗涤3次。
(5)包被抗原保存：可提前将抗原包被好，加3％蔗糖。把酶标条放于-20℃保存。测定时把相应的抗原取出，嵌入酶标板中，各个酶标板做好序号标记。
(6)一抗反应：用稀释液(1×PBS含0.05％Tween-20,1％BSA)将待测样品(抗体)按预定稀释度稀释样品。以100μL/孔，把待测样品加入对应包被抗原的孔，37℃湿盒孵育1.5h或4℃过夜。
(7)洗涤：室温下，用PBST洗涤液200μL/孔，3min/次，洗涤3次。
(8)二抗反应：HRP-羊抗兔IgG二抗以1:20,000用适量稀释液稀释，按200μL/孔加入孔中，37℃湿盒孵育1h。
(9)洗涤：室温下，用PBST洗涤液200μL/孔，3分钟/次，洗涤3次。
(10)底物反应：配制新鲜的底物液，按酶标序号顺序，按150μL/孔加入孔中，室温反应20min。
(11)终止反应：按酶标序号顺序，往酶标板孔中加入终止液(NH2SO4)，50μL/孔。
(12)测定：按酶标序号顺序，把酶标板正确放置在酶标仪上，运行电脑程序，读取450nm处OD值。保存结果，处理数据。
结果如图8所示。根据ELISA试验的阴性、阳性判定标准判定：(阳性血清OD值-空白对照OD值)/(阴性血清OD值-空白对照OD值)＝P(阳性值)/N(阴性值)≥2.1。结果显示，试验组结果均为阳性，表明兔体内已有抗体产生，经过三次加强免疫后，试验组和阳性对照组的兔都已经有较高抗体水平，48天时各组抗体水平达到最高峰。
3.细胞粘附抑制实验
(1)具核梭杆菌F.nucleatum23726(购于美国菌种保藏中心，Americantypeculturecollection)在TSPC培养基中培养10h至OD600为0.8，6000×g离心5min，去掉上清，1×PBS重悬沉淀至OD600为0.5。
(2)用适量Dio染料标记F.nucleatum23726，常温染色15min。室温下6000×g离心5min，去掉上清，用1×PBS重悬沉淀，6000×g离心5min，除去未结合的染料，加入适量PRIM1640培养基重悬沉淀至OD600为0.2。
(3)利用PRIM1640的培养基将抗体稀释为1％(v/v)，0.25％(v/v)，0.0625％(v/v)三个浓度梯度，37℃下，与荧光标记的具核梭杆菌1：1孵育1h。
(4)100μL细菌/血清混合物与DLD-1细胞(购自武汉尙恩生物科技有限公司)共培养，感染细胞在37℃下孵12h。经过大量洗涤去除未结合的细菌后，用酶标仪在激发/发射484/550nm处测量荧光。
结果如图9所示。将Dio荧光标记抗体进行梯度稀释，随后与F.nucleatum23726在37℃共孵育1h。结果表明，随着抗体浓度的增加，F.nucleatum23726对结直肠癌DLD-1细胞的粘附明显减少，说明抗体与具核梭杆菌表面的外膜囊泡发生结合，有效阻断了具核梭杆菌对结直肠癌细胞的黏附。
上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具核梭杆菌外膜囊泡的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.取具核梭杆菌菌种进行培养，获得菌液；
b.取菌液第一次离心，过滤得上清液，浓缩滤液，将浓缩后的滤液第二次离心，去掉上清液，重悬沉淀后获得粗提的外膜囊泡；
c.制作碘克沙醇密度梯度离心液，浓度由上至下依次增大，最上层加入粗提的外膜囊泡，进行密度梯度离心纯化，即得纯化后的外膜囊泡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述培养为将具核梭杆菌菌种加入到30mLTSB培养基中，37℃培养9h，获得种子液；取330mL TSB培养基，按1％接种种子液，充氮气5min，37℃培养40h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述过滤为将上清液通过0.22μm水系膜过滤；所述浓缩为利用中空纤维膜浓缩滤液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述第一次离心为4℃，8500rpm离心25min；所述第二次离心为4℃，200000×g离心4h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述碘克沙醇密度梯度离心液的具体制作方法为将碘克沙醇离心液用含0.85wt％NaCl的30mM HEPS缓冲液稀释，分别得到体积浓度为40％、35％、30％、25％、20％、15％的稀释液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中所述密度梯度离心条件为4℃，35000×g离心16h。
7.一种如权利要求1-6任一项所述方法获得的具核梭杆菌外膜囊泡。
8.一种如权利要求7所述具核梭杆菌外膜囊泡在制备促进释放促炎因子药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促炎因子包括白细胞介素IL-8。
10.一种如权利要求7所述具核梭杆菌外膜囊泡在制备降低具核梭杆菌对结直肠癌细胞黏附作用的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117844704A (zh) * 2024-01-18 2024-04-09 广东工业大学 幽门螺旋杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用
CN118185873A (zh) * 2024-03-26 2024-06-14 大连理工大学 一种突触囊泡的提取方法

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