CN117065011A - MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫技术领域，具体涉及MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用。本发明以MOMP蛋白为抗原制备mRNA疫苗，具有高度灵活性，可经酶促体外转录反应生产，无细胞扩增依赖性，可快速、大量生产，可避免感染及插入诱变等潜在基因整合风险，具有较高的安全性。实施例结果表明，利用基于MOMP蛋白得到的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗进行免疫反应后，可以提高抗体水平，诱导较强的偏向CD4+的T淋巴细胞免疫应答，具有较强的T淋巴细胞增殖能力，能有效清除肺部Cps的效力，降低IFN‑γ和IL‑6细胞因子水平，预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染性疾病，提高鹦鹉热衣原体感染性疾病的防控效果。

Description

MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用
技术领域
本发明属于免疫技术领域，具体涉及MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用。
背景技术
鹦鹉热衣原体是一种具有独特双相发育周期，多宿主的革兰氏阴性胞内寄生人畜共患病原体，感染人类及动物后可引起呼吸道感染性疾病及相关并发症。衣原体感染常呈现轻微症状甚至无症状，抗生素治疗后常出现感染反复持续、迁延难愈现象，不仅对人类公共卫生造成威胁，家禽业、畜牧业等相关行业也遭受巨大经济损失。因此，亟需研发安全高效的疫苗来对鹦鹉热衣原体感染性疾病进行有效防控。
mRNA疫苗作为近年疫苗领域的研究热点，目前已被广泛用于癌症防治，抗病毒及抗传染性病原体等多方面研究，并取得长足进步。研究表明，mRNA可在动物及人类中诱导产生安全且持久的免疫保护。与灭活疫苗、减毒活性疫苗、亚单位疫苗以及DNA疫苗相比，mRNA疫苗在安全性、免疫性、生产灵活性等性能方面更具优势。作为鹦鹉热衣原体mRNA疫苗研发的首要关键环节，目标抗原的选择至关重要，目标抗原选择不合理，不仅无法得到理想的免疫效果，而且难以制备，甚至可能存在一定安全风险，因而导致现有研究中，尚未有鹦鹉热mRNA疫苗相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用，快速大量生产鹦鹉热衣原体mRNA疫苗，降低安全风险，提高鹦鹉热衣原体感染性疾病的防控效果。
本发明提供了MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用，编码所述MOMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗的重组载体，包括基础载体、5'-UTR、3'-UTR和MOMP基因CDS序列；
所述MOMP基因CDS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述5'-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述3'-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述5'-UTR、MOMP基因CDS序列和3'-UTR顺次连接。
优选的，所述基础载体包括pGEM-3zf(+)。
本发明还提供了上述技术方案所述的重组载体在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用。
本发明还提供了一种鹦鹉热衣原体mRNA疫苗，包括mRNA分子和递送载体；所述mRNA分子编码MOMP蛋白；
编码所述MOMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述递送载体包括LNP；
所述LNP由摩尔比为50：50：1的DOTAP阳离子脂质体、DOPE辅助磷脂和DSPE-PEG-Mannose功能化PEG磷脂修饰甘露糖组成。
本发明还提供了一种鹦鹉热衣原体mRNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：
对上述技术方案所述的重组载体进行酶切处理，得到线性化重组载体；
对所述线性化重组载体进行体外转录，得到转录后的mRNA；
对所述转录后的mRNA进行加帽反应和加尾反应，得到mRNA分子；
将所述mRNA分子和递送载体混合，得到所述鹦鹉热衣原体mRNA疫苗。
优选的，所述酶切处理的酶切位点位于3'-UTR的3'末端。
优选的，所述递送载体和mRNA分子按照N/P摩尔比为10:1进行混合。
本发明还提供了上述技术方案所述的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗在制备用于预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用。
有益效果：
MOMP蛋白是鹦鹉热衣原体的主要外膜蛋白，约占衣原体外膜蛋白成分的60％，是一种多功能蛋白，与抗原性、外膜结构稳定性、生长代谢调节和毒力密切相关，在感染过程中起重要作用，且含特异性抗原表位，能诱导机体产生细胞免疫反应和中和抗体，产生抗衣原体感染的保护性免疫，为衣原体疫苗研究的主要优势候选抗原。基于MOMP蛋白制备得到的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗能够解决传统衣原体疫苗研发过程中存在的抗原制备困难且不可快速大量生产、存在安全风险等难题，并且得到的mRNA疫苗能够有效预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染性疾病，提高鹦鹉热衣原体感染性疾病的防控效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为重组质粒pGEMMOMP示意图；
图2为实施例1步骤1.10双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定；其中，泳道M：DNAmarker；泳道1：经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶双酶切的pGEMMOMP；泳道2：未酶切的pGEMMOMP；
图3为pGEMMOMP重组质粒线性电泳结果；
图4为蛋白质印迹鉴定mRNAMOMP在HeLa细胞表达情况的结果；
图5为透射电子显微镜下观察到的LNP形态；
图6为LNP细胞毒性检测结果；
图7为LNP及LNP-mRNA的分散性、粒径及Zeta电位测定结果；其中A为LNP的粒径及多分散指数结果；B为LNP-mRNAMOMP的粒径及多分散指数结果；C为LNP与LNP-mRNAMOMP的粒径分析结果；D为LNP与LNP-mRNAMOMP的表面电位分析结果；所有数据以平均值±标准差表示，并通过t检验进行统计学分析(n＝3，***：P<0.001，ns：P＞0.001)；
图8为凝胶阻滞实验结果；
图9为蛋白质印迹鉴定LNP-mRNAMOMP在HeLa细胞中的表达情况；
图10为小鼠免疫及攻毒流程；
图11为不同疫苗免疫后的抗体水平检测结果；
图12为流式细胞术检测脾组织T淋巴细胞亚群的流式细胞仪测定结果；
图13为流式细胞术检测脾组织T淋巴细胞亚群的细胞水平分析结果；其中，B为CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞水平分析结果；C为CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值分析结果；
图14为不同处理组脾组织淋巴细胞增殖能力；
图15为qPCR法测定肺组织Cps载量的结果；
图16为ELISA法对不同处理组肺组织IFN-γ及IL-6表达水平的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用，编码所述MOMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述编码MOMP蛋白的核苷酸序列长1209bp，具体为5’-ATGAAAAAACTCTTGAAATCGGCATTATTGTTTGCCGCTACGGGTTCCGCTCTCT CCTTACAAGCCTTGCCTGTAGGGAACCCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATGGCACTATGTGGGAAGGTGCTTCAGGAGATCCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGTGACGCCATTAGCATCCGCGCAGGATACTACGGAGATTATGTTTTCGATCGTGTATTAAAAGTTGATGTGAATAAAACTTTTAGCGGCATGGCTGCAACTCCTACGCAGGCTACAGGTAACGCAAGTAATACTAATCAGCCAGAAGCAAATGGCAGACCGAACATCGCTTACGGAAGGCATATGCAAGATGCAGAGTGGTTTTCAAATGCAGCCTTCCTAGCCTTAAACATTTGGGATCGCTTCGACATTTTCTGCACCTTAGGGGCATCCAATGGATACTTCAAAGCAAGTTCGGCTGCATTCAACTTGGTTGGGTTAATAGGGTTTTCAGCTGCAAGCTCAATCTCTACCGATCTTCCAATGCAACTTCCTAACGTAGGCATTACCCAAGGTGTTGTGGAATTTTATACAGACACATCATTTTCTTGGAGCGTAGGTGCACGTGGAGCTTTATGGGAATGTGGTTGTGCAACTTTAGGAGCTGAGTTCCAATACGCTCAATCTAATCCTAAGATTGAAATGCTCAACGTCACTTCAAGCCCAGCACAATTTGTGATTCACAAACCAAGAGGCTATAAAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTTACCTATAACGGCTGGAACAACAGAAGCTACAGACACCAAATCAGCTACAATTAAATACCATGAATGGCAAGTAGGCCTCGCCCTGTCTTACAGATTGAATATGCTTGTTCCATATATTGGCGTAAACTGGTCAAGAGCAACTTTTGATGCTGATACTATCCGCATTGCTCAACCTAAATTAAAATCGGAGATTCTTAACATTACTACATGGAACCCAAGCCTTATAGGATCAACCACTGCTTTGCCCAATAATAGTGGTAAGGATGTTCTATCTGATGTCTTGCAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAGTCTAGAAAAGCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAACGTTAATCGACGCTGACAAATGGTCAATCACTGGTGAAGCACGCTTAATCAATGAAAGAGCTGCTCACATGAATGCTCAATTCAGATTCTAA-3’(SEQ ID NO.1)。
MOMP蛋白是鹦鹉热衣原体的主要外膜蛋白，约占衣原体外膜蛋白成分的60％，是一种多功能蛋白，与抗原性、外膜结构稳定性、生长代谢调节和毒力密切相关，在感染过程中起重要作用，且含特异性抗原表位，能诱导机体产生细胞免疫反应和中和抗体，产生抗衣原体感染的保护性免疫，为衣原体疫苗研究的主要优势候选抗原。基于MOMP蛋白制备得到的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗能够解决传统衣原体疫苗研发过程中存在的抗原制备困难且不可快速大量生产、存在安全风险等难题，并且得到的mRNA疫苗能够有效预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染性疾病，提高鹦鹉热衣原体感染性疾病的防控效果。
本发明还提供了一种制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗的重组载体，包括基础载体、5'-UTR、3'-UTR和MOMP基因CDS序列；
所述MOMP基因CDS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述5'-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述3'-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述5'-UTR、MOMP基因CDS序列和3'-UTR顺次连接。
本发明所述5'-UTR的核苷酸序列长104bp，具体为5’-AGAGCGGCCGCTTTTTCAGCAAGATTAAGCCCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明所述3'-UTR的核苷酸序列长266bp，具体为5’-AGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC-3’(SEQ ID NO.3)。
本发明所述5'-UTR和3'-UTR能够维持mRNA的稳定性，防止核酸酶对mRNA的破坏，并且在mRNA上同一个目的基因搭配不同类型的UTR能够极大地提高蛋白表达量，提高翻译表达效率。
在本发明中，所述基础载体优选包括pGEM-3zf(+)。本发明所述5'-UTR优选位于所述pGEM-3zf(+)的EcoRI和AscI之间；所述3'-UTR优选位于所述pGEM-3zf(+)的PacI和BamHI之间；所述MOMP基因CDS序列优选位于所述pGEM-3zf(+)的AscI和PacI之间。本发明优选利用上游引物和下游引物对MOMP基因进行扩增，得到带有酶切位点的MOMP基因CDS序列后连接到所述基础载体。本发明所述上游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示(5’-AGGCGCGCCATGAAAAAACTCTTGA-3’，其中下划线部分为AscⅠ酶切位点)；所述下游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示(5’-CCTTAATTAATTAGAATCTGAA-3’，其中下划线部分为PacⅠ酶切位点)。
本发明还提供了上述技术方案所述的重组载体在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用。
本发明还提供了一种鹦鹉热衣原体mRNA疫苗，包括mRNA分子和递送载体；所述mRNA分子编码MOMP蛋白；
编码所述MOMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述递送载体优选包括LNP；所述LNP优选由摩尔比为50：50：1的DOTAP阳离子脂质体、DOPE辅助磷脂和DSPE-PEG-Mannose功能化PEG磷脂修饰甘露糖组成。本发明所述LNP是一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，能够包裹mRNA分子，实现mRNA分子的递送。
本发明还提供了一种鹦鹉热衣原体mRNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：
对上述技术方案所述的重组载体进行酶切处理，得到线性化重组载体；
对所述线性化重组载体进行体外转录，得到转录后的mRNA；
对所述转录后的mRNA进行加帽反应和加尾反应，得到mRNA分子；
将所述mRNA分子和递送载体混合，得到所述鹦鹉热衣原体mRNA疫苗。
本发明对上述技术方案所述的重组载体进行酶切处理，得到线性化重组载体。在本发明中，所述酶切处理的酶切位点优选位于3'-UTR的3'末端，例如当所述基础载体为pGEM-3zf(+)时，所述酶切处理酶切处理的酶切位点为BamHI。本发明在所述3'-UTR的3'末端进行酶切，实现重组载体的线性化能够获得确定长度及序列的mRNA转录本。
得到所述线性化重组载体后，本发明对所述线性化重组载体进行体外转录，得到转录后的mRNA。本发明进行体外转录，能够简单快速获得大量的编码目标抗原蛋白的目的mRNA。本发明对所述体外转录的方式没有严格要求，采用本领域常规的方式即可。
得到所述转录后的mRNA后，本发明对所述转录后的mRNA进行加帽反应和加尾反应，得到mRNA分子。在本发明中，所述加帽反应优选包括：在转录后的mRNA的5'端加上帽子结构；所述帽子结构优选包括m7G(5')ppp(5')G帽结构类似物。本发明在5'端加上帽子结构能够促进体外翻译系统更高效地翻译。本发明对所述加帽反应的方式没有严格要求，采用本领域常规的方式即可。
在本发明中，所述加尾反应优选包括：在转录后的mRNA的3'端加上尾结构；所述尾结构优选包括poly(A)尾。本发明在3'端加上尾结构能够保护目的mRNA不易被核酸酶降解，提高mRNA的翻译效率。本发明对所述加尾反应的方式没有严格要求，采用本领域常规的方式即可。
得到所述mRNA分子后，本发明将所述mRNA分子和递送载体混合，得到所述鹦鹉热衣原体mRNA疫苗。在本发明中，所述递送载体优选包括LNP；所述LNP优选由摩尔比为50：50：1的DOTAP脂质体、DOPE脂质体和DSPE-PEG-Mannose组成。本发明所述LNP是一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，能够包裹mRNA分子，实现mRNA分子的递送。
在本发明中，所述递送载体和mRNA分子的N/P摩尔比优选为10:1。本发明通过控制N/P摩尔比能够保护目的mRNA不易被核酸酶降解，并将其有效递送至宿主体内。
本发明得到的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗类似球状颗粒，多分散指数为0.132，粒径分布较为均匀，组内颗粒大小较为相近，平均直径为299.533nm，，显著大于LNP本身粒径，表明结合mRNA分子后，LNP颗粒粒径有所增大；表面电位为20.133mV，略低于LNP自身表面电位，表明LNP与mRNA分子是通过静电作用相结合；凝胶阻滞实验表明，LNP与mRNA分子结合较紧密，LNP可有效阻滞mRNA分子的迁移。
本发明还提供了上述技术方案所述的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗在制备用于预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用。
本发明利用上述鹦鹉热衣原体mRNA疫苗进行免疫反应，结果表明抗体水平增加，可诱导较强的偏向CD4+的T淋巴细胞免疫应答，具有较强的T淋巴细胞增殖能力，能有效清除肺部Cps的效力，降低IFN-γ和IL-6细胞因子水平，预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染性疾病，提高鹦鹉热衣原体感染性疾病的防控效果。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例中均使用GraphPad 8软件对实验数据进行统计学分析，所有实验数据均以Mean±SD表示，选用T检验(Student t-test)、单因素方差分析(One-wayAnova)或双因素方差分析(Two-way Anova)统计学方法进行组间分析比较，P<0.05表示差异具备统计学意义。
实施例1
1.基于鹦鹉热衣原体MOMP的mRNA序列构建及鉴定
1.1重组载体pGEMUTRs的构建
委托上海生工生物工程有限公司合成重组载体pGEMUTRs，具体的：
将5’-UTR(β-globin-2)基因序列插入克隆载体pGEM-3zf(+)的EcoR I和AscI之间；将3’-UTR(2β-globin)基因序列插入克隆载体pGEM-3zf(+)的PacI和BamHI之间，构成重组载体pGEMUTRs，其中5’-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，3’-UTR的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
1.2MOMP基因特异性引物设计
登录GenBank查询Cps 6BC MOMP基因编码序列信息(GenBank:X56980.1)，使用Primer Primer6.0软件设计SEQ ID NO.4所示的上游引物MOMP-F和SEQ ID NO.5所示的下游引物MOMP-R，具体序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.3MOMP基因PCR扩增
以Cps 6BC基因组DNA为模板扩增MOMP基因，使用Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase试剂盒在无菌无酶的0.2mLPCR管中进行PCR扩增，得到PCR产物。
其中，PCR反应体系为Cps 6BC DNA 1μL，MOMP-F(10μM)2μL，MOMP-R(10μM)2μL，dNTP Mix(10mM)1μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，Phanta Max Super-Fidelity DNApolymerase 1μL，ddH2O补足至50μL；
PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃彻底延伸5min。
扩增反应结束后取部分产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像系统观察结果并保存，余下产物置于-20℃保存以待备用。
1.4PCR扩增产物纯化
使用Cycle-Pure Kit试剂盒对步骤1.3得到的PCR产物进行纯化，实验步骤如下所示：
(1)将适量体积的PCR扩增产物置于无菌无酶的1.5mL EP管中，加入5倍体积的CPBuffer，充分混匀后进行瞬离；
(2)将HiBind管插入干净的2mL收集管中后，将混匀后的样品转入HiBind管，随后在25℃，13000rcf条件下离心1min；
(3)将收集管中的滤液弃掉，于HiBind管中加入700μL含无水乙醇的DNAWashBuffer，随后在25℃，13000rcf条件下离心1min；
(4)重复(3)1次；
(5)在25℃，13000rcf条件下空离2min，随后将HiBind管插入新的无菌无酶1.5mLEP管中；
(6)洗脱：于HiBind管中加入30-50μL Elution Buffer，在25℃下静置5min；
(7)在25℃，13000rcf条件下离心1min，将滤液重新加入HiBind管中，在25℃，13000rcf条件下离心1min，收集滤液；
(8)使用超微量分光光度计对步骤(7)收集的滤液进行浓度测定，得到MOMP PCR纯化产物，置于-20℃保存备用。
1.5pGEMUTRs载体质粒小量提取
使用质粒小提采用Omega PlasmidMini Kit试剂盒小量提取pGEMUTRs质粒，实验步骤如下所示：
(l)培养含有pGEMUTRs质粒的E.coli JM109(由上海生工生物工程有限公司提供)，从平板中挑取含pGEMUTRs质粒的E.coli JM109单菌落，接种于6mL含Amp+的LB液体培养基中，置于振荡培养箱以37℃、220rpm条件振荡过夜；
(2)从上述过夜培养的菌液中取2mL转移至干净的无菌无酶Ep管，在25℃，10000rcf，条件下离心1min，随后弃去上清液，保留菌体沉淀；
(3)重复(2)步骤，直至获得过夜培养的6mL菌液中的全部菌体沉淀；
(4)利用250μL含RNaseA的SolutionI溶液重悬步骤(4)菌体沉淀并充分混合；
(5)向步骤(4)Ep管中加入250μL SolutionII溶液，避免剧烈振荡，轻轻倒置混匀约2-3min，获得澄清液体；加入350μL SolutionIII溶液，倒置混匀8-10次，直至白色絮状沉淀形成，以25℃，13000rcf条件离心10min，形成团状白色聚集物后立即进行下一步；
(6)小心吸取上清液并将其置于干净的HiBind管中，以25℃，13000rcf条件离心1min，弃去滤液；向HiBind管中加入500μL含异丙醇的HBC Buffer溶液，以25℃，13000rcf条件离心1min，弃滤液；
(7)向步骤(6)HiBind管中加入700μL含无水乙醇的DNAWashing Buffer溶液，以25℃，13000rcf条件离心1min，弃去滤液；
(8)重复(7)1次；
(9)HiBind管以25℃，13000rcf条件空离2min以弃去残存乙醇；将HiBindB管插入新的无菌无酶1.5mL Ep管，取35μLElution Buffer溶液滴至HiBindB管中膜正中央，静置5min；以25℃，13000rcf条件离心1min，吸取滤液重新置于HiBindB管中，以25℃，13000rcf条件离心1min，收集滤液；
(10)使用超微量分光光度计对步骤(7)收集的滤液进行浓度测定，得到重组质粒pGEMUTR PCR纯化产物，置于-20℃保存备用。
1.6pGEMUTRs载体质粒及MOMP目的基因双酶切
分别将pGEMUTRs载体质粒及MOMP目的基因进行双酶切，反应体系为：步骤1.5得到的pGEMUTRs PCR纯化产物或步骤1.5得到的MOMP目的基因1μg，EcoRⅠ1μL，BamHⅠ1μL，10×NEBuffer 5μL，ddH2O补足至50μL；
将上述体系置于无菌无酶的200μLPCR管充分混匀，瞬离后置于37℃恒温水浴箱酶切4h，随后进行65℃恒温水浴20min以灭活酶，酶切产物按“步骤1.4PCR扩增产物纯化”方法进行纯化及浓度测定。随后取适量纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余产物置于-20℃以待备用。
1.7连接pGEMUTRs载体质粒及MOMP目的基因双酶切产物
使用T4连接酶将纯化后的pGEMUTRs载体质粒及MOMP目的基因双酶切产物进行连接，得到重组质粒pGEMMOMP(即连接产物)。其中，反应体系为：pGEMUTRs双酶切产物2μL，MOMP双酶切产物2μL，T4 DNAligase 1μL，10×T4 DNAligase Buffer 2μL，Nuclease-freewater补足至20μL，重组质粒pGEMMOMP的示意图如图1所示。
将上述体系置于无菌无酶的200μLPCR管充分混匀，瞬离后置于25℃连接2，随后进行65℃恒温水浴10min以灭活酶。
1.8转化连接产物
(1)将冻存于-80℃的200μL感受态细菌取出，冰上溶解后加入10μL步骤1.7得到的连接产物，混匀(需无菌操作)；
(2)将混合菌液置于冰上孵育30min，再在42℃恒温水浴锅中热休克感受态细菌90s，随后即刻置于冰上孵育3min；
(3)将混合菌液加入800μL阴性LB培养基中(需无菌操作)，置于振荡培养箱以37℃、180rpm条件振荡培养2h；25℃，12000rpm条件离心2min，弃上清，用200μL阴性LB培养基重悬菌体沉淀(需无菌操作)；
(4)小心吸取200μL步骤(3)得到的重悬菌液至含Amp+的LB固体培养基中，用L型涂布器涂布均匀后，将平板倒置，放于37℃恒温培养箱中培养过夜。
1.9pGEMMOMP重组质粒大量提取
使用Endo-Free PlasmidMaxi Kit试剂盒对pGEMMOMP重组质粒进行大量提取，实验步骤如下所示：
(1)从步骤1.8的平板中挑取含pGEMMOMP重组质粒的单菌落，将其转移至适量含Amp+的LB液体培养基，置于振荡培养箱以37℃、180rpm条件振荡活化过夜；
(2)将活化的菌液转接于300mL新的含Amp+LB培养基中，置于振荡培养箱以37℃、180rpm条件振荡4-6h，进行扩菌培养；
(3)将菌液收集至干净的50mL离心管中，以25℃、6000rpm条件离心10min，弃去上清液，保留菌体沉淀，重复此步骤直至将300mL菌液中的菌体沉淀全部收集；
(4)向离心管中加入10mL SolutionI溶液重悬沉淀，反复吹打混匀至无明显沉淀，可进行旋涡振荡促进重悬充分；
(5)加入10mL SolutionII溶液，避免剧烈振荡，轻轻上下颠倒混匀10次后，于室温下静置3min；
(6)加入5mL预冷的N3 Buffer溶液，轻轻上下颠倒混匀直至有白色絮状物形成，于室下静置2min；
(7)将50mL针筒过滤器插入新的50mL离心管后，将混合溶液倒入针筒过滤器，缓慢轻推活塞，使流出液被收集至离心管中；
(8)加入0.1倍体积的ETR溶液，轻缓颠倒混匀10次直至溶液浑浊，立即进行10min冰浴，期间不断轻缓颠倒混匀，直至液体恢复澄清；
(9)对混合溶液进行5min42℃恒温水浴，溶液再次变得浑浊，以25℃，4000rcf条件离心5min；
(10)小心吸取上清液至新的50mL离心管，避免吸取底部蓝色沉淀；
(11)向离心管中加入0.5倍体积无水乙醇，充分混匀，于室温中静置2min；
(12)将HiBind DNA柱插入新的50mL离心管，吸取3mL GPS Buffer溶液加入柱中后，于室温下静置4min，随后以25℃，4000rcf条件离心3min，弃去滤液，将柱子重新插入离心管中；
(13)每次转移20mL上述混合溶液至HiBind DNA柱，以25℃，4000rcf条件离心3min，弃去滤液，直至将混合溶液全部离心过滤；
(14)向柱中加入10mL HBC Buffer，以25℃，4000rcf条件离心3min，弃滤液；加入15mL DNA Washing Buffer，以25℃，4000rcf条件离心3min，弃滤液；加入10mL DNAWashing Buffer，以25℃，4000rcf条件离心3min，弃滤液；
(15)HiBind DNA柱继续以25℃，4000rcf条件离心10min，除去残余液体；将HiBindDNA柱插入无菌无酶的50mL离心管，随后吸取1mL Elution Buffer溶液滴至柱中的过滤膜中央，于室温下静置5min，以25℃，4000rcf条件离心5min，收集流出液；取流出液重滴至柱中过滤膜，25℃，4000rcf条件离心5min，收集流出液；
(16)使用核酸蛋白仪对流出液进行DNA浓度测定后，将流出液冻存于-20℃保存以待备用。
1.10 pGEMMOMP重组质粒双酶切鉴定
参考“1.6pGEMUTRs载体质粒及MOMP目的基因双酶切、1.4PCR扩增产物纯化”方法对pGEMMOMP重组质粒进行双酶切及纯化后，取适量酶切产物进行0.5％琼脂糖凝胶电泳，并以未经酶切的pGEMMOMP重组质粒为对照，在凝胶成像系统下观察并保存结果，结果如图2所示。
根据图2可以看出，泳道1双酶切后得到的空载体片段约为3176bp，UTRs-MOMP目的基因片段约为1591bp，所得条带大小与预期相符合，表明pGEMMOMP重组质粒构建成功。
1.11 pGEMMOMP重组质粒和pGEMUTRs重组质粒线性化
为使后续体外转录实验高效进行，需对pGEMMOMP重组质粒进行单酶切，使其线性化，具体酶切体系为：pGEMMOMP或pGEMUTRs2μg，BamH Ⅰ 2μL，10×NEBuffer 5μL，Nuclease-free water补足至50μL。将上述体系置于无菌无酶的200μL EP管充分混匀，瞬离后置于37℃恒温水浴箱酶切4h，随后进行20min 65℃恒温水浴以灭活酶。取适量纯化产物进行0.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余产物置于-20℃以待备用，其中pGEMMOMP重组质粒线性化结果如图3所示，其中泳道1～9均为经BamHI限制性内切酶单酶切的pGEMMOMP重组质粒。
根据图3可以看出，单酶切后可获得大小约为4767bp的单一载体片段，与预期相符合，表明线性化成功。
1.12苯酚氯仿法纯化线性化pGEMMOMP重组质粒和pGEMUTRs重组质粒
(1)吸取20μL步骤1.11得到的线性化pGEMMOMP重组质粒或pGEMUTRs重组质粒至无菌无酶1.5mLEP管中，加入160μL无酶水进行稀释；
(2)加入20μL 3M的醋酸钠溶液(pH 5.2)，充分混匀；
(3)加入200μL苯酚/氯仿混合液(苯酚、氯仿的体积比为1:1)，充分混匀，以25℃，10000rpm条件离心5min；
(4)将上层水相溶液小心转移至新的无菌无酶1.5mLEP管，加入等体积的氯仿抽提2次，小心收集上层水相溶液至新的无菌无酶1.5mLEP管；
(5)加入2倍体积的无水乙醇进行充分混匀，置于-20℃静置30min后，以4℃，15000rpm条件离心15min，小心弃去上清液，保留核酸沉淀；
(6)加入500μL预冷的70％乙醇润洗核酸沉淀，以4℃，15000rpm条件离心15min，小心弃去上清液；
(7)打开EP管管盖，静置干燥5min直至无液体残留，加入20-50μL无酶水溶解沉淀，使用核酸蛋白仪对产物进行核酸浓度测定后，取适量产物进行0.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将剩余产物冻存于-80℃保存以待备用。
1.13体外转录反应
使用HiScribeTM T7 Quick HighYieldRNA Synthesis Kit对纯化后的线性化pGEMMOMP重组质粒和pGEMUTRs重组质粒进行体外转录，并在转录过程中进行加帽反应，反应体系为：线性化pGEMMOMP或pGEMUTRs 1μg，NTPbuffer Mix 8μL，CapAnalog(40mM)5μL，T7RNApolymerase Mix 2μL，Nuclease-free water补足至25μL。
将上述体系置于无菌无酶EP管中充分混匀，瞬离后置于37℃恒温培养箱中孵育过夜；向EP管中加入2μL DNaseⅠ，混匀充分后置于37℃恒温培养箱中孵育15min，以去除产物中的DNA，得到mRNA产物(mRNA-UTRs的mRNA-MOMP)；
使用苯酚氯仿法(参考“1.11苯酚氯仿法纯化线性化pGEM重组质粒”)对mRNA产物进行纯化，使用核酸蛋白仪对mRNA产物进行浓度测定后，将流出液冻存于-20℃保存以待备用。
1.14mRNA加尾反应
使用E.coli Poly(A)Polymerase试剂盒对步骤1.13的mRNA产物进行加尾反应，最终获得加帽加尾、可编码MOMP蛋白的mRNA分子(记为mRNAUTRs和mRNAMOMP)，其中反应体系为：mRNA-UTRs或mRNA-MOMP 120μg，10×E.coli polymerase Reaction Buffer 10μL，ATP(10mM)16μL，E.coli Poly(A)polymerase 4μL，Nuclease-free water补足至100μL。
将上述体系置于无菌无酶EP管中充分混匀，瞬离后置于37℃恒温培养箱中孵育2h；
使用苯酚氯仿法(参考“1.11苯酚氯仿法纯化线性化pGEM重组质粒”)对mRNAMOMP进行纯化，使用核酸蛋白仪对mRNA产物进行浓度测定后，将流出液冻存于-20℃保存以待备用。
1.15mRNA体外真核细胞转染
(1)以1×106细胞/孔的密度将真核HeLa细胞接种于无菌6孔细胞培养板中，使用含10％FBS的DMEM培养基进行培养，将孔板置于含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱培养过夜；
(2)观察到孔板中细胞密度约为80％时，小心弃去培养基，用PBS轻缓润洗2次，2mLPBS/次，弃去PBS后加入500μL Opti-MEMTM减血清培养基，随机分为实验组和对照组；
(3)溶液1配制：吸取125μL Opti-MEMTM减血清培养基至无菌EP管中，随后加入3.75μLLipofectamineTM 3000试剂，充分混匀；
(4)溶液2-A配制：吸取250μL Opti-MEMTM减血清培养基至新的无菌EP管中，加入5μg步骤1.14得到的mRNAMOMP及10μL P3000TM，充分混匀；
溶液2-B配制：吸取250μL Opti-MEMTM减血清培养基至新的无菌EP管中，加入5μg步骤1.14得到的mRNAUTRs及10μL P3000TM，充分混匀；
(5)溶液3-A配制：吸取125μL溶液1至新的无菌EP管中，随后加入等体积的溶液2-A，充分混匀后，于室温下静置15min；
溶液3-B配制：吸取125μL溶液1至新的无菌EP管中，随后加入等体积的溶液2-B，充分混匀后，于室温下静置15min；
(6)将溶液3-A加至实验组细胞培养孔中，溶液3-B加至对照组细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀后，均置于含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱培养48h。
1.16Western Blot鉴定
为了鉴定mRNAMOMP的生物功能，使用Western Blot方法测定mRNAMOMP经体外转染后是否可在真核HeLa细胞中翻译表达MOMP蛋白，具体实验步骤如下所示：
(1)制样：
A.步骤1.15中6孔板细胞培养结束后，弃去培养基，用PBS轻缓润洗2次，2mLPBS/次，弃去PBS后每孔加入100μL裂解液(99μLRIPALysis Buffer+1μL蛋白酶抑制剂)；
B.将孔板静置于冰上裂解30min，随后用细胞刮将细胞从板上刮落并转移至新的1.5mL EP管，进行5s 20％功率的冰上超声裂解，以4℃，14000rcf条件离心10min，小心吸取上清液至新的Ep管，依据明书对上清液进行BCA蛋白浓度测定；
C.将各组蛋白稀释至同一浓度后，分别加入1/4体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀后进行10min 100℃恒温水浴；
(2)12.5％SDS-PAGE凝胶电泳：分别取相同体积的样品进行上样，80V电压下电泳30min后，将电压调至120V继续电泳，直至条带即将接近胶底时停止电泳；
(3)转膜：依据MOMP蛋白分子量大小及蛋白marker进行切胶，裁剪相应大小的PVDF膜，0.25A电流条件下，使用半干转法转膜50min，使胶条中的蛋白转移至PVDF膜上；
(4)封闭：将PVDF膜放入含5％脱脂乳的TBST中，在室温下封闭2h；
(5)洗膜：将PVDF膜放入适量TBST中，置于摇床上进行3次洗涤，5min/次；
(6)孵育一抗：使用一抗稀释液将兔抗Cps血清按1：500稀释，置于4℃孵育过夜；
(7)洗膜：将PVDF膜放入适量TBST中，置于摇床上进行3次洗涤，5min/次；
(8)孵育二抗：使用二抗稀释液将HRP标记的羊抗兔IgG按1：5000稀释，置于37℃恒温培养箱中孵育1h；
(9)洗膜：将PVDF膜放入适量TBST中，置于摇床上进行3次洗涤，5min/次；
(10)显影：用干净滤纸适度干燥PVDF膜，在膜上均匀滴加ECL显影液后，将膜平整放入仪器中进行成像观察，结果如图4所示。
根据图4可以看出，在MOMP蛋白43KDa处，实验组样品(泳道1)可见目的条带，而对照组(泳道2)未见特异性条带，表明mRNAMOMP经转染后可在真核HeLa细胞中翻译表达目的抗原MOMP蛋白。
实施例2
1.LNP的制备及鉴定
1.1LNP的制备
(1)据摩尔比DOTAP脂质体：DOPE脂质体：DSPE-PEG2000-Mannose＝50:50:1，计算各组分固体化合物所需质量，使用电子天平进行称量，将各化合物小心加至圆底烧瓶；
(2)吸取8mL氯仿加至烧瓶中，进行30min水浴超声直至化合物完全溶解；
(3)将烧瓶小心安装至旋转蒸发仪，瓶内溶液需没入水中，以100rpm转速进行15min旋转蒸发；
(44)小心取出烧瓶并静置于通风橱内干燥，待瓶中无残留液体后，加入适量无菌HEPES缓冲液，进行30min水浴超声直至瓶内油状薄膜充分溶解；
(5)使用0.22μm滤膜对溶液进行3次过滤，所得滤液即为所需LNP，将LNP收集至干净EP管中，保存于4℃以待备用。
1.2LNP的形态观察
将1.1得到的LNP进行适度稀释后滴至铜网上，于室温下风干，使用透射电镜对LNP进行形态鉴定，结果如图5所示。
根据图5可以看出，得到的LNP类似球状颗粒。
1.3LNP细胞毒性分析
使用Cell Counting Kit-8试剂盒对LNP进行细胞毒性评估，方法如下所示：
(1)接种约2.5×103个真核HeLa细胞于无菌96孔细胞培养板，使用含10％FBS的无菌DMEM培养基进行培养，并置于含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱培养过夜；
(2)待孔板中细胞密度约为80％时，小心弃去培养基，用PBS轻缓润洗2次，2mLPBS/次，弃去PBS，随机随分实验组和阴性对照组，并以不含细胞，含培养的培养空作为空白对照组；
(3)按实验分组分别进行加样：
A.实验组：向细胞培养孔中加入LNP、10μLCCK-8试剂以及500μL含10％FBS的MEM培养基，LNP的浓度如图10所示；
B.阴性对照组：向含细胞的培养孔中加入10μL CCK-8试剂以及500μL含10％FBS的MEM培养基；
C.空白对照组：向不含细胞的培养孔中加入10μL CCK-8试剂及500μL含10％FBS的MEM培养基；
(4)将孔板置于含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱培养24h；
(5)使用酶标仪检测各组450nm处吸光值，按Cell Counting Kit-8试剂盒说明书进行细胞存活率计算，结果如图6和表1所示。
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100，其中As为实验组吸光度，Ab为空白对照组吸光度，Ac为阴性对照组吸光度。
表1不同浓度对细胞存活率的影响
根据表1和图6可以看出，当LNPs浓度低于25nmol/104个细胞时，细胞存活率高于70％，而随着LNP浓度的增加，细胞存活率呈下降趋势。
实施例3
鹦鹉热衣原体mRNA疫苗的制备
(1)以实施例2得到的LNP和实施例1得到的mRNAMOMP为原料，依据LNP与mRNAMOMP的摩尔比N/P＝10：1，对所需的LNP与mRNAMOMP的体积进行计算；
(2)分别吸取所需体积的LNP与mRNA至干净EP管中，加入等体积无菌10mM HEPES进行稀释，充分混匀后将两种溶液混合至同一EP管中，进行1min漩涡振荡后于室温下静置30min，得到鹦鹉热衣原体mRNA疫苗(记为LNP-mRNAMOMP)
(3)将制备好的LNP-mRNAMOMP保存于4℃以待备用。
对比例1
同实施例3，唯一区别在于，将mRNAMOMP替换为实施例1得到的mRNAUTRs，得到的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗(记为LNP-mRNAUTRs)。
测试例1
LNP、LNP-mRNAMOMP的粒径与电位分析
选择Malvern ZetasizerNano ZS90仪对LNP、mRNAMOMP的粒径、分散性及表面电势进行检测，结果如图7和表2所示。
表2LNP、LNP-mRNAMOMP的粒径与电位分析结果
根据图7和表2可以看出，LNP与LNP-mRNAMOMP的多分散指数分别为0.169和0.132，两组数值均较小，表明两组样品的颗粒粒径分布都较为均匀，组内颗粒大小均较为相近。LNP的颗粒平均直径为264.133nm，而LNP-mRNAMOMP的平均直径为299.533nm，显著大于LNP本身粒径，表明结合mRNA后，LNP颗粒粒径有所增大，与预期相符合。因为LNP的组成成分之一为带阳离子的DOTAP，所以其Zeta电位应为正值，经检测发现LNP的表面电位为21.966mV，数值为正值，与预期相符合。而由于mRNA自带负电荷，其Zeta电位应为负值，经检测发现LNP-mRNAMOMP的表面电位为20.133mV，略低于LNP自身表面电位，表明通过静电作用可使LNP与mRNAMOMP相结合
测试例2
胶阻滞分析
为检测LNP与mRNA的结合紧密度，以实施例3得到的LNP-mRNAMOMP和实施例1得到的mRNAMOMP为样品，进行100V，45min条件下的1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将胶块小心置于凝胶成像系统中分析结果，结果如图8所示，其中泳道1为mRNAMOM，泳道2～3均为LNP-mRNAMOMP。
根据图8可以看出，随着琼脂糖凝胶电泳的进行，未与LNP混合的mRNAMOMP条带会逐渐进行迁移，且条带较为弥散，而与LNP混合的LNP-mRNAMOMP则完全滞留于上样孔中，表明LNP与mRNAMOMP结合较紧密，LNP可有效阻滞mRNAMOMP的迁移。
测试例3
LNP-mRNAMOMP体外真核细胞转染与鉴定
(1)以1×106细胞/孔的密度将真核HeLa细胞接种于无菌6孔细胞培养板中，使用含10％FBS的DMEM培养基进行培养，将孔板置于含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱培养过夜；
(2)观察到孔板中细胞密度约为80％时，小心弃去培养基，用PBS轻缓润洗2次，2mLPBS/次，弃去PBS后加入500μL Opti-MEMTM减血清培养基，随机分为阳性对照组、实验组、对照1组、对照2组和空白组；
(3)阳性对照组每孔加入5μg原核表达MOMP蛋白(记为MOMP)，具体参照Zhou P,WuH,Chen S,Bai Q,Chen X,Chen L,Zeng X,Liu L,Chen L.MOMP and MIP DNA-loadedbacterial ghosts reduce the severity of lung lesions in mice after Chlamydiapsittaci respiratory tract infection.Immunobiology.2019Nov；224(6):739-746.doi:10.1016/j.imbio.2019.09.002.Epub 2019Sep 6.PMID:31561842.制备得到；
对照1组加入5μg对比例1得到的LNP-mRNAUTRs，轻轻摇晃混匀；
对照2组加入5μg实施例1得到的mRNAMOMP，轻轻摇晃混匀；
实验组每孔加入5μg上述实施例3得到的LNP-mRNAMOMP；空白组加入PBS；
(4)将孔板置于含5％CO2的37℃恒温细胞培养箱培养24h；
(5)培养结束后进行样品收集，并进行Western Blot鉴定(具体操作方法参考实施例1中的“1.14Western Blot鉴定”部分)，结果如图9所示，其中A为免疫印迹法鉴定结果，B为灰度值扫描结果分析，泳道1～5依次为阳性对照组、对照2组、空白组、对照1组和实验组；B中各组数据均用平均值±标准差表示，并采用单因素方差分析(n＝3；****：p<0.0001；*：P<0.05；ns：P>0.05)。
根据图9可以看出，相比mRNAMOMP，LNP-mRNAMOMP具备更强的翻译表达MOMP蛋白能力，而LNP-mRNAUTRs及PBS为阴性对照组未见明显特异性条带，与预期相符。
应用例1
动物免疫及免疫效果评估
1.动物分组及免疫、攻毒流程
按照图10的步骤进行免疫和攻毒实验，具体的将32只6周龄BALB/c雌性小鼠随机均分为4组，依次为实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白对照组，每组8只；实验组利用实施例3得到的LNP-mRNAMOMP进行，阴性对照组利用对比例1得到的LNP-mRNAUTRs进行免疫，空白对照组免疫PBS，阳性对照组免疫原核表达MOMP蛋白(参照Zhou P,Wu H,Chen S,Bai Q,Chen X,Chen L,Zeng X,Liu L,Chen L.MOMP and MIP DNA-loaded bacterial ghostsreduce the severity of lung lesions in mice after Chlamydia psittacirespiratory tract infection.Immunobiology.2019Nov；224(6):739-746.doi:10.1016/j.imbio.2019.09.002.Epub 2019Sep 6.PMID:31561842.制备得到)；所有组均通过肌肉注射方式免疫3次，每次免疫间隔2周，单次免疫剂量如表3所示。
表3各处理组小鼠免疫的剂量
每次免疫前选择割尾采血方式收集血清，通过血清中检测特异性抗体以评估疫苗诱导的体液免疫应答。末次免疫后2周，各组随机选取4只小鼠进行安乐处死，无菌分离脾组织用于流式检测及淋巴细胞增殖实验以评估疫苗诱导的细胞免疫应答，各组剩余的4只小鼠每只经滴鼻方式感染5×105IFUs Cps。于感染后第10天安乐处死小鼠，无菌分离肺组织用于分析评估疫苗诱导的抗感染免疫保护作用。
测试例4
血清中特异性抗体效价检测
应用例中各处理组每次免疫前对各组小鼠进行割尾采血，将血液样品收集至干净EP管中，静置于37℃培养箱30min，于4℃，6000rpm条件下离心10min，分别收集上层血清保存于-20℃以待备用；
(1)使用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将去内毒素的纯化重组MOMP蛋白稀释至10μg/mL，以100μL/孔标准将蛋白稀释液加入96孔ELISA酶标板，置于4℃过夜；
(2)弃去孔板中的蛋白稀释液，加入PBST润洗2次(200μL/孔，3min/次)，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(3)以200μL/孔标准将PBST(含5％脱脂牛乳)加入孔中，将孔板静置于37℃恒温培养箱中封闭2h；弃去孔板中的液体，加入PBST润洗2次(200μL/孔，3min/次)，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(4)以含5％脱脂牛乳的PBST作为稀释液，对收集的各组小鼠血清进行倍比稀释，每孔液体体积最终均为100μL，将孔板静置于37℃恒温培养箱中孵育2h；
(5)弃去孔板中的液体，每孔加入200μLPBST润洗2次，每次3min，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(6)使用含5％脱脂牛乳的PBST作为稀释液，按1：10000比例将HRP标记的羊抗鼠IgG抗体稀释，并以100μL/孔标准将稀释后抗体加入孔中，将孔板静置于37℃恒温培养箱中孵育2h；弃去孔板中的液体，每孔加入200μLPBST润洗2次，每次3min，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(7)以100μL/孔标准将TMB加入孔中，将孔板进行避光处理并静置于37℃恒温培养箱中反应15min；
(8)以100μL/孔标准将终止液加入孔中；
(9)使用酶标仪检测各组450nm处吸光值，将PBS阴性对照组的吸光值作为标准，若实验分组/阴性对照组吸光值>2.1，则表示该组具有阳性抗体效价，其呈阳性的最高血清稀释倍数即为特异性IgG抗体效价，具体结果如图11和表4所示。
表4不同疫苗免疫后的抗体水平(最高血清稀释倍数)
注：表中时间以第一次免疫结束后的时间计。
根据表4和图11可以看出，第1次免疫后2周采集的血清中，与PBS空白对照组相比，其它3组疫苗均无显著性差异；第2次免疫后2周(第1次免疫后4周)采集的血清中，与PBS空白对照组相比，只有重组MOMP蛋白组具有显著性差异；在第3次免疫后2周(第1次免疫后6周)采集的血清中，与PBS空白对照组相比，LNP-mRNAUTRs组无显著性差异，而MOMP蛋白组与LNP-mRNAMOMP组均具有显著性差异，且MOMP蛋白组抗体滴度显著高于LNP-mRNAMOMP组。
测试例4
1.收集、处理脾组织细胞
(1)应用例1各处理组小鼠感染后第10天，对各组小鼠进行安乐处死，经75％酒精消毒后，将小鼠置于生物安全柜内进行无菌分离脾组织操作；
(2)将脾组织置于无菌细胞培养皿中，加入2mL无菌RPMI-1640培养基进行清洗；
(3)将脾组织小心转移至无菌70μm细胞筛网进行研磨，期间加入适量无血清RPMI-1640培养基，将细胞悬液收集于无菌EP管中，于4℃，1000rcf条件下离心5min；
(4)小心弃去上清液，加入适量无菌红细胞裂解液重悬细胞沉淀，裂解5min后加入2倍体积的无菌RPMI-1640培养基终止反应，于4℃，1000rcf条件下离心5min；
(5)小心弃去上清液，加入适量Hanks缓冲液(含青链霉素：Hanks缓冲液＝1：100)重悬细胞沉淀，于4℃，1000rcf条件下离心5min；
(6)小心弃去上清液，加入适量无菌RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，于4℃，1000rcf条件下离心5min；
(7)小心弃去上清液，加入300μL含10％FBS的无菌培养基重悬细胞沉淀，制成细胞悬液用于后续实验。
2.流式检测脾组织T细胞亚群
(1)单管样品的染色液制备：在避光条件下，各取0.2μL鼠源FITC-CD3ε抗体、鼠源PerCP-CD4Antibody及鼠源APC-CD8a抗体加至干净EP中，随后补加PBS至50μL，充分混匀；
(2)从步骤1得到的脾细胞悬液中取出5μL，转移至干净流式管中，随后向每管中加入50μL染色液，充分混匀后置于4℃避光反应30min；
(3)在避光条件下，向每管中加入200μLPBS以终止反应，并于12h内进行上机检测，结果如图12和图13和表5所示。
表5不同处理组淋巴细胞水平的表达结果、
根据图12～13和表5可以看出，与PBS组相比，仅LNP-mRNAMOMP组的CD3+CD4+T淋巴细胞亚群水平均具有显著性差异。此外，与PBS组相比，余下3组疫苗的CD3+CD8+水平均具无显著性差异。值得注意的是，与PBS组相比，仅有LNP-mRNAMOMP组的CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群比值具有显著性差异。上述结果提示LNP-mRNAMOMP组可诱导较强的偏向CD4+的T淋巴细胞免疫应答。
3.脾组织淋巴细胞增殖实验
(1)使用牛鲍计数法分别对步骤1剩余脾细胞悬液密度进行计算，并用无菌RPMI-1640培养基将其稀释成合适浓度；
(2)分组：从每管稀释后脾细胞悬液中取样，以约2×106个细胞/孔条件接种于无菌于96孔细胞培养板，每管样品共接种3个孔用于设置刺激组、未刺激组和不含脾细胞，只含培养基的空白组；
刺激组：每孔加入10μg MOMP蛋白刺激脾细胞；
未刺激组：无需加入蛋白进行刺激；
空白组：无需加入蛋白进行刺激；
充分混匀后，将孔板置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中培养48h；
(3)步骤(2)培养48h后，于每孔中加入10μL CCK8试剂，充分混匀后，在避光条件下置于含5％CO2的37℃恒温培养箱中培养1～4h，培养期间注意观察溶液颜色变化，若颜色过深则停止培养以避免后续吸光度值测定；
(4)使用酶标仪检测各孔450nm处吸光值，按照Cell Counting Kit-8试剂盒说明书进行刺激指数(SI)计算：SI＝(刺激组OD值-空白组OD值)/(未刺激组OD值-空白组OD值-空白组OD值)，结果如图14和表6所示。
表6不同处理组脾组织淋巴细胞增殖能力
根据图14和表6可以看出，与PBS组刺激指数SI(0.72±0.09)相比，LNP-mRNAUTRs组(SI:0.85±0.03)无显著性差异，而MOMP蛋白组(SI:1.60±0.04)与LNP-mRNAMOMP组(SI:1.29±0.11)均具有显著性差异，且MOMP蛋白组SI略高于LNP-mRNAMOMP组。结果提示，MOMP蛋白组与LNP-mRNAMOMP组均具有较强的T淋巴细胞增殖能力。
测试例5
1.肺组织DNA提取
(1)应用例1感染后第10天，对各组小鼠进行安乐处死，经75％酒精消毒后，将小鼠置于生物安全柜内进行无菌分离肺组织操作，并将肺组织小心转移至无菌细胞培养皿中，加入2mL无菌RPMI-1640培养基进行润洗；
(2)各组小鼠均剪取相同质量的肺组织转移至无菌70μm细胞筛网进行研磨，期间加入适量无血清RPMI-1640培养基，将细胞悬液收集于无菌EP管中，于4℃，10000rpm条件下离心1min；
(3)小心弃去上清液，向管中加入200μL GA缓冲液重悬沉淀，进行振荡重悬；
(4)吸取200μLProteinase K溶液加入管中并进行充分混匀；
(5)吸取200μL GB缓冲液加入管中并进行充分混匀，并于70℃静置10min，待溶液变清亮后，瞬离；
(6)吸取200μL无水乙醇加入管中并进行振荡混匀，随后进行瞬离(在此过程中若有絮状沉淀出现，属正常现象)；
(7)将吸附柱CB3插入收集管后，将溶液及絮状沉淀全部小心转移至吸附柱CB3中，并以12000rpm转速离心30sec，弃去上清液，将吸附柱重新插入收集管中；
(8)吸取500μL GD缓冲液加至吸附柱CB3，以12000rpm转速离心30sec，弃去上清液，将吸附柱CB3重新插入收集管中；
(9)吸取600μLPW漂洗液加至吸附柱CB3，以12000rpm转速离心30sec，弃去上清液，将吸附柱CB3重新插入收集管中后，重复此步骤1次；
(10)将吸附柱CB3插入收集管中后，以12000rpm转速离心2min，弃去上清液，并于室温下静置干燥，直至吸附柱CB3中无液体残留；
(2)将吸附柱CB3插入另一干净收集管后，滴加50-200μL TE洗脱液至柱中吸附膜中央，于室温下静置5min，随后以12000rpm转速离心2min，收集滤液，即DNA产物；
(2)使用核酸蛋白仪对DNA产物进行浓度测定后，将DNA产物冻存于-20℃保存以待备用。
2.qPCR法测定肺组织Cps载量
(1)登录GenBank查询Cps 6BC 16S rRNA，并通过使用Primer Primer6.0软件对其进行特异性引物设计，并与生工生物工程(上海)股份有限公司合作合成相应引物，具体引物序列为：
16s rRNA-F：5’-TCCGCAAGGACAGATACACA-3’(SEQ ID NO.6)
16s rRNA-R：5’-ACCCAGGCAGTCTCGTTAGA-3’(SEQ ID NO.7)
(2)qPCR反应体系：肺组织DNA2μL，16s rRNA-F 0.5μL，16s rRNA-R 0.5μL，2×SuperReal PreMix Plus 10μL，ddH2O 7μL；
qPCR反应程序：95℃预变性15min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃循环5min；
同时设置空白对照组(不含DNA模板或不含引物)及阳性对照组(含已知Cps载量的DNA模板)，对107～101的线性化Cps 6BC 16S rRNA基因组DNA进行10倍稀释，建立Cps 6BC16SrRNA基因的标准曲线：y＝-0.3546x+12.994，R2＝0.9932。
(3)反应结束后，将相关数据结果代入Cps 6BC 16S rRNA基因的标准曲线，得出y值后代入Excel表格中进行载量计算：f(X)＝POWER(10,y)，获得对应的Cps载量，结果如图15和表7所示。
表7肺组织Cps载量
根据图15和表7可以看出，LNP-mRNAMOMP、LNP-mRNAUTRs组与MOMP蛋白组的肺组织Cps载量均显著低于PBS组。值得注意的是，LNP-mRNAMOMP组的Cps载量显著性低于LNP-mRNAUTRs组，而MOMP蛋白组具有最低的Cps载量。结果提示，LNP-mRNAMOMP和LNP-mRNAUTRs具有有效清除肺部Cps的效力。
3.肺组织匀浆上清细胞因子水平检测
使用ELISA试剂盒对步骤1得到的肺组织匀浆的细胞因子水平进行测定，具体方法如下：
(1)各组小鼠均从上述无菌分离的肺组织剪取相同质量组织，将其转移至无菌70μm细胞筛网进行研磨，期间加入适量无血清RPMI-1640培养基，将细胞悬液收集于无菌EP管中，于4℃，6000rpm条件下离心15min，收集上清液以待后续使用；
(2)使用ddH2O将10×Coating Buffer稀释至1×；
(3)依据试剂盒说明书中的稀释比例，分别使用1×Coating Buffer将Captureantibody(IFN-γ、IL-6)稀释，并按100μL/孔条件将稀释后Capture antibody加入96孔ELISA酶标板中，置于4℃包被过夜；
(4)小心弃去孔内液体后，每孔加入200μLPBST润洗2次，每次3min，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(5)按200μL/孔条件将1×ELISPOT溶液加至孔中，并静置于室温下进行1h封闭；
(6)小心弃去孔内液体后，每孔加入200μLPBST润洗2次，每次3min，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(7)向孔中分别加入等体积的各组肺组织细胞上清液，并补加1×ELISPOT溶液至100μL/孔，同时，在标准孔中加入相应的细胞因子标准品，并使用1×ELISPOT溶液进行倍比稀释以建立标准曲线，充分混匀后，将孔板静置于室温下进行2h封闭；
(8)小心弃去孔内液体后，加入PBST润洗5次(300μL/孔，3min/次)，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(9)使用1×ELISPOT溶液将Detection antibody按说明书比例稀释，按100μL/孔条件将稀释后Detection antibody加至孔中，并静置于室温下进行1h封闭；
(10)小心弃去孔内液体后，加入PBST润洗5次(300μL/孔，3min/次)，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(11)使用1×ELISPOT溶液将Avidin-HRP按说明书比例稀释，按100μL/孔条件将稀释后Avidin-HRP加至孔中，并静置于室温下进行30min封闭；
(12)小心弃去孔内液体后，每孔加入200μLPBST润洗2次，每次3min，弃去孔内液体，并通过拍板尽量避免液体残留；
(13)在避光条件下，按100μL/孔条件将TMB加入孔中，并静置于室温下避光反应15min；
(14)在避光条件下，按100μL/孔条件将终止液加入孔中，随后使用酶标仪对各孔进行450nm处吸光度值测定，将吸光度值代入标准曲线即可对细胞因子水平进行评估，结果如表8和图16所示。
表8不同处理组肺组织IFN-γ及IL-6表达水平
根据图16和表8可以看出，LNP-mRNAUTRs组、LNP-mRNAMOMP组及MOMP蛋白组的肺组织匀浆上清IFN-γ水平分别为(727.90±36.58)、(679.70±82.68)及(198.80±9.77)pg/mL，均显著低于PBS组IFN-γ水平(1207.00±337.50)pg/mL。MOMP蛋白组的IFN-γ水平最低，且显著低于LNP-mRNAUTRs组与LNP-mRNAMOMP组，而后两者间无显著性差异；LNP-mRNAUTRs组、LNP-mRNAMOMP组及MOMP蛋白组的肺组织匀浆上清IL-6水平分别为(71.27±17.50)、(34.59±9.64)及(23.29±2.50)，均显著低于PBS组IL-6水平(261.00±29.28)pg/mL。MOMP蛋白组的IL-6水平最低，且显著低于LNP-mRNAUTRs组，而与LNP-mRNAMOMP组相比无显著性差异。
根据上述内容可以看出，本发明得到的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗可经酶促体外转录反应生产，无细胞扩增依赖性，可快速、大量生产，免疫后可以提高抗体水平，诱导较强的偏向CD4+的T淋巴细胞免疫应答，具有较强的T淋巴细胞增殖能力，能有效清除肺部Cps的效力，降低IFN-γ和IL-6细胞因子水平，预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染性疾病，提高鹦鹉热衣原体感染性疾病的防控效果。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.MOMP蛋白在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用，编码所述MOMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗的重组载体，其特征在于，包括基础载体、5'-UTR、3'-UTR和MOMP基因CDS序列；
所述MOMP基因CDS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述5'-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述3'-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述5'-UTR、MOMP基因CDS序列和3'-UTR顺次连接。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述基础载体包括pGEM-3zf(+)。
4.权利要求2或3所述的重组载体在制备鹦鹉热衣原体mRNA疫苗中的应用。
5.一种鹦鹉热衣原体mRNA疫苗，包括mRNA分子和递送载体；所述mRNA分子编码MOMP蛋白；
编码所述MOMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗，其特征在于，所述递送载体包括LNP；
所述LNP由摩尔比为50：50：1的DOTAP阳离子脂质体、DOPE辅助磷脂和DSPE-PEG-Mannose功能化PEG磷脂修饰甘露糖组成。
7.一种鹦鹉热衣原体mRNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：
对权利要求2或3所述的重组载体进行酶切处理，得到线性化重组载体；
对所述线性化重组载体进行体外转录，得到转录后的mRNA；
对所述转录后的mRNA进行加帽反应和加尾反应，得到mRNA分子；
将所述mRNA分子和递送载体混合，得到所述鹦鹉热衣原体mRNA疫苗。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酶切处理的酶切位点位于3'-UTR的3'末端。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述递送载体和mRNA分子按照N/P摩尔比为10:1进行混合。
10.权利要求5或6所述的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗或权利要求7～9任一项所述的制备方法得到的鹦鹉热衣原体mRNA疫苗在制备用于预防和/或治疗鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用。
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