CN117844704A

CN117844704A - 幽门螺旋杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN117844704A
Application number: CN202410072065.0A
Authority: CN
Inventors: 赵静静; 刘进; 陈舍青; 李清兰
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2024-01-18
Filing date: 2024-01-18
Publication date: 2024-04-09

Abstract

本发明公开了一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用；旨在提供一种简单、快捷且经济从幽门螺旋杆菌中分离出omv，并将其纯化的方法；其制备的外膜囊泡轮廓清晰，结构完整的幽门螺旋杆菌外膜囊泡；其可以作为幽门螺杆菌外膜囊泡作为制备抑制MC3T3‑E1细胞的成骨分化药物的应用；该方法1）幽门螺杆菌复苏，2）细菌传代；3）幽门螺杆菌的液体培养；4）幽门螺杆菌外膜囊泡的提取；5）幽门螺杆菌外膜囊泡的纯化；属于细胞生物学技术领域。

Description

幽门螺旋杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡，本发明还涉及该幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法以及应用。

背景技术

幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性、微需氧细菌，定植于人体胃黏膜，通常感染胃上皮，在它转移到胃腔后，会在胃窦和胃体等特定的部位定植；因其具有良好的适应机制，可以在严酷的胃酸条件下生存并形成永久性感染。幽门螺杆菌定植引起的永久性感染常常是无症状感染，某些条件下也可导致慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌甚至免疫性血小板减少性紫癜等。1994年WHO将幽门螺杆菌定为胃癌的一类致癌因子，2021年美国卫生及公共服务部将其列为胃癌的明确致癌物，根除幽门螺杆菌可显著降低人群胃癌的发生率及死亡率。

外膜囊泡是由蛋白质脂双层包围的纳米颗粒，由革兰氏阴性细菌自然释放。它们携带来自亲代细菌的各种生物分子，包括脂多糖、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白、细胞壁成分、蛋白质（周质、细胞质和膜结合蛋白）、核酸（DNA、RNA）、离子代谢物和信号分子等多种亲本菌体成分酶和毒素。外膜囊泡携带多种物质，这些物质可以影响宿主细胞中不同的信号通路从而引起炎症性肠病、代谢紊乱包括糖尿病、肥胖症、肝病以及自身免疫性和心血管或过敏性疾病。

外膜囊泡具有较好的免疫原性，高剂量的外膜囊泡可以作为疫苗抗原组分而保护机体减弱或抑制致病菌的感染。外膜囊泡一方面具备免疫刺激能力，另一方面也可大大降低安全性风险。因此，外膜囊泡可被设计为疫苗佐剂进行研究。

OMVs能够与宿主细胞相互作用并粘附在宿主细胞上，并且可作为宿主产生的抗体和防御素的诱饵，使细菌无法持久存在。它们参与细菌存活、DNA转移、抗生素耐药性的获得以及免疫和非免疫细胞凋亡的诱导。

目前分离OMVs的方法多种多样且耗时耗力，分离的OMVs中含有细菌碎片或者鞭毛等污染物。

发明内容

针对上述不足，本发明的第一个目的是提供一种简单、快捷且经济从幽门螺旋杆菌中分离出幽门螺旋杆菌外膜囊泡(OMVs)，并将其纯化的方法。

本发明的第二个目的是提供一种轮廓清晰，结构完整的OMVs。

本发明的第三个目的是的OMVs作为制备抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化药物的应用。

本发明第一个目的是通过以下技术方案来实现上述技术目的：

一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，依次包括下述步骤：

1）幽门螺杆菌复苏

2）细菌传代

取步骤1）复苏后的幽门螺杆菌，灭菌冷却后挑取菌落，再次转接在新鲜配制的哥伦比亚血琼脂平板上，继续培养3天进行扩增；

3）幽门螺杆菌的液体培养

取步骤2）扩增后的菌体置于培养基中，培养72h后达到对数生长期，得到幽门螺杆菌细菌悬液；

4）幽门螺旋杆菌外膜囊泡的提取

取幽门螺杆菌细菌悬液，离心分离过滤，取滤液；将滤液再次离心分离后弃上清液，加入PBS缓冲液重悬沉淀再次离心，弃上清液，再次加入PBS缓冲液重悬，收集沉淀得到外膜囊泡；

5）幽门螺旋杆菌外膜囊泡的纯化

以HEPES 缓冲液作为稀释液，在超速离心管内由下往上依次加入 2 mL 45w/v%碘克沙醇，2 mL42w/v%碘克沙醇，2 mL39w/v% 碘克沙醇，2 mL36w/v%碘克沙醇，2 mL32w/v%碘克沙醇，2 mL28w/v%碘克沙醇，2 mL24w/v%碘克沙醇，2 mL20w/v%碘克沙醇得到密度梯度离心装置，并将步骤4）收集得到的外膜囊泡加在密度梯度离心装置最上层进行离心分离，离心条件为 200,000g，4°C 过夜离心分离沉淀物；用PBS 洗涤沉淀物三次，得到纯化后的OMVs。

进一步的，上述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，所述的幽门螺杆菌复苏的方法为：将冻存的幽门螺旋杆菌菌株从冰箱中取出，于冰上解冻，用移液器吸取幽门螺旋杆菌冻存液滴于新鲜配制的哥伦比亚血琼脂基上，涂布器涂布均匀，置于 37℃、微氧环境中培养 48-72 h。

进一步的，上述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，所述的微氧环境为各个气体的体积比为：5％O₂、10％CO₂、85％N₂。

进一步的，上述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，步骤3）所述的所述的对数生长期为OD600为1.5。

进一步的，上述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，步骤4）所述的离心分离过滤方法为：在温度为4 ℃，离心力为 10000 xg 的条件下离心两次，每次 30min，取上清液；用 0.22 μm 微孔精密过滤器过滤 2 次，收集滤液。

进一步的，上述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，步骤4）所述的悬重方法为向收集的滤液中加入无菌PBS缓冲液重悬沉淀，并再次于4℃，200000g 离心2h，弃上清液，加入无菌PBS缓冲液重悬沉淀，重复两次。

进一步的，上述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，所述的培养基添加有10wt%无外泌体的胎牛血清。

本发明提供的第二个技术方案是上述方法制备得到的一种OMVs。

本发明提供的第三个技术方案是上述的OMVs作为制备抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化药物的应用。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

1、本发明提供的技术方案首先将幽门螺杆菌复苏纯化和扩大培养，经低速离心、过滤、高速离心、密度梯度离心并且纯化得到幽门螺杆菌的外膜囊泡，该方法简单、快捷且经济。

2、本发明提供的技术方案得到的外膜囊泡轮廓清晰，结构完整；提取得到的外膜囊泡可以抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。

附图说明

图1是OMVs的在500nm透射电子显微镜显微照片；

图2是OMVs的在50nm透射电子显微镜显微照片；

图3是OMVscontrol组相机和显微镜采集ALP染色图像；

图4是OMVs成骨诱导组的相机和显微镜采集ALP染色图像；

图5是OMVsOMV组相机和显微镜采集ALP染色图像；

图6是OMVscontrol组相机和显微镜采集茜素红染色图像；

图7是OMVs成骨诱导组相机和显微镜采集茜素红染色图像；

图8是OMVsOMV组相机和显微镜采集茜素红染色图像。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但是不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例提供的OMVs，其通过下述方法制备的：

1）幽门螺杆菌复苏

将冻存的实验菌株从-80℃冰箱中取出，于冰上解冻，用移液器吸取 100 μL 细菌冻存液滴于新鲜配制的哥伦比亚血琼脂基上，涂布器涂布均匀，置于 37℃、微氧环境（5％O₂、10％CO₂、85％N₂）中培养 48-72 h。

2）细菌传代

从培养箱中取出涂布的幽门螺杆菌哥伦比亚血琼脂培养基平板，经确认为幽门螺杆菌后，将接种环经酒精灯外焰灭菌，冷却后挑取少许菌落转接在新鲜配制的哥伦比亚血琼脂平板上继续培养3天进行扩增。

3）幽门螺杆菌的液体培养

取适量在哥伦比亚血琼脂平板上生长3天的菌体置于添加了10wt%无外泌体的胎牛血清的脑心浸出液肉汤培养基中，培养72h后达到对数生长期，即 OD600 = 1.5；

该步骤采用外泌体血清培养幽门螺杆菌，排除胎牛血清中外泌体的存在造成OMV的不纯。

4）OMVs的提取

取幽门螺杆菌细菌悬液（OD600=1.5），在温度为4 ℃，离心力为 10000 xg 的条件下离心两次，每次 30min，取上清液；用 0.22 μm 微孔精密过滤器过滤 2 次，取滤液。该步骤采用离心除去上清液中的细菌，过滤除去大粒径细菌及其碎片。将滤液在温度为4℃且离心力为200000g的条件下，在超速离心管中离心2h，弃上清液，加入无菌PBS缓冲液重悬沉淀并再次于4℃，200000g 离心2h，弃上清液，加入无菌PBS缓冲液重悬沉淀。

4）OMVs的纯化

沉淀用 500 μl 新鲜配制的无菌 PBS 缓冲液重悬，置于冰上，以10 m M HEPES缓冲液作为稀释液，在超速离心管内由下往上依次加入 2 mL 45w/v% 碘克沙醇，2 mL42w/v%碘克沙醇，2 mL39w/v% 碘克沙醇，2 mL36w/v%碘克沙醇，2 mL32w/v%碘克沙醇，2 mL28w/v%碘克沙醇，2 mL24w/v%碘克沙醇，2 mL20w/v%碘克沙醇得到密度梯度离心装置，并将步骤4）收集得到的外膜囊泡加在密度梯度离心装置最上层进行离心分离，离心条件为 200,000g，4°C 过夜离心分离沉淀物；用PBS 洗涤沉淀物三次，得到纯化后的OMVs。

对上述制备的OMVs进行透射电子显微镜分析，将OMVs采用透射电子显微镜进行观察，得到的透射电子显微镜显微照片如图1，2所示，可以看出采用超速离心法从H . pylori菌株中提取OMVs。采用TEM对纯化后的OMVs进行形态表征。结果表明，分离的OMVs呈圆形，具有双层膜结构，直径约为50-100 nm，外膜囊泡轮廓清晰，结构完整。

实施例2

OMVs对MC3T3-E1细胞的影响

1、碱性磷酸酶染色和茜素红染色

采用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑（BCIP/NBT）默沙克生物碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒

默沙克生物碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒对MC3T3-E1细胞的ALP活性进行染色；将MC3T3-E1在4%对甲醛中固定30 min后，加入预处理好的BCIP/NBT染色，与样品孵育1 h，染色ALP，去除BCIP/NBT染色，用蒸馏水冲洗，终止染色反应。

相机和显微镜采集ALP染色图像如图3至图5所示，茜素红染色检测矿化结节形成的性质；将MC3T3-E1细胞用4wt%多聚甲醛溶液固定30 min，加入茜素红染色液，室温孵育1h，镜下观察染色结果；相机和显微镜采集茜素红染色图像如图6至图8所示；通过3至图8在成骨诱导组中检测到最高的ALP和茜素红表达，其次是OMV组和对照组；染色结果表明HPOMV 抑制前成骨细胞的成骨分化作用。

Claims

1.一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1）幽门螺杆菌复苏；

2）细菌传代

3）幽门螺杆菌的液体培养

4）幽门螺旋杆菌外膜囊泡的提取

取幽门螺杆菌细菌悬液，离心分离过滤，取滤液，将滤液再次离心分离后弃上清液，加入PBS缓冲液重悬沉淀后再次离心，弃上清液，再次加入PBS缓冲液重悬，收集沉淀得到外膜囊泡；

5）幽门螺旋杆菌外膜囊泡的纯化

以HEPES 缓冲液作为稀释液，在超速离心管内由下往上依次加入 2 mL 45w/v% 碘克沙醇，2 mL42w/v%碘克沙醇，2 mL39w/v% 碘克沙醇，2 mL36w/v%碘克沙醇，2 mL32w/v%碘克沙醇，2 mL28w/v%碘克沙醇，2 mL24w/v%碘克沙醇，2 mL20w/v%碘克沙醇得到密度梯度离心装置，并将步骤4）收集得到的外膜囊泡加在密度梯度离心装置最上层进行离心分离，离心条件为 200,000g，4°C 过夜离心分离沉淀物；用PBS 洗涤沉淀物三次，得到纯化后的OMVs。

2.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述的幽门螺杆菌复苏的方法为：将冻存的幽门螺旋杆菌菌株从冰箱中取出，于冰上解冻，用移液器吸取幽门螺旋杆菌冻存液滴于新鲜配制的哥伦比亚血琼脂基上，涂布器涂布均匀，置于37℃、微氧环境中培养 48-72 h。

3.根据权利要求2所述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述的微氧环境为各个气体的体积比为：5％O₂、10％CO₂、85％N₂。

4.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的所述的对数生长期为OD600为1.5。

5.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤4）所述的离心分离过滤方法为：在温度为4 ℃，离心力为 10000 xg 的条件下离心两次，每次30min，取上清液；用 0.22 μm 微孔精密过滤器过滤 2 次，收集滤液。

6.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，步骤4）所述的悬重方法为向收集的滤液中加入无菌PBS缓冲液重悬沉淀，并再次于4℃，200000g离心2h，弃上清液，加入无菌PBS缓冲液重悬沉淀，重复两次。

7.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述的培养基添加有10wt%无外泌体的胎牛血清。

8.一种幽门螺旋杆菌外膜囊泡，其特征在于，由权利要1-7任一所述的方法制备得到的。

9.权利要求8所述的幽门螺旋杆菌外膜囊泡作为制备抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化药物的应用。