CN115429817A - γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用，属于生物技术领域。本发明公开的γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用，γδT细胞培养上清液在斑马鱼损伤模型中也能显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复，表现出良好的促进组织损伤修复的潜力。本发明公开的γδT细胞培养上清液在促进组织损伤修复方面有巨大的潜在应用前景。

Description

γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用。
背景技术
淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系，分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞。其中T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分，在外周血中占淋巴细胞总数的65％-75％，具有多种生物学功能。γδT细胞(T细胞亚群)是执行固有免疫功能的T细胞，是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的杀伤性较强的免疫细胞。它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。另外，有证据表明，γδT细胞分泌的各类细胞因子有助于诱发获得性免疫反应，在机体的抗肿瘤、抗感染、自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。
细胞因子在人体内含量极少，但生物活性极高，具有很多重要的生物学效应和生理功能。它们与皮肤细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移等有关，可以有效地与皮肤细胞发生作用，发挥突出的美容护肤功效。培养干细胞的培养液上清液，含有数百种成长因子。分泌液中富含细胞活性关键的信息传递物质，这种传递物质被称为细胞因子。对体内受到损伤的组织和细胞的功能恢复起到重要作用。然而，目前γδT细胞的培养液上清液在组织损伤修复中的研究和应用较少。
因此，提供γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用，γδT细胞是从外周血中分离诱导得到的，经离心获得γδT细胞培养上清液。
进一步，所述γδT细胞培养上清液的制备方法如下：
(1)获取外周血单个核细胞；
(2)细胞接种：使用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度，加入唑来膦酸、白细胞介素-2，使唑来膦酸的终浓度为20μmol/mL，白细胞介素-2的终浓度为20μg/mL；将细胞接种于细胞培养板中，置于CO2培养箱中培养；
(3)细胞培养：于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换含有终浓度为1μg/mL白细胞介素-2的新鲜完全培养基，对细胞进行扩增培养；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天用含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基调整细胞浓度为1×108个/mL，经离心获得γδT细胞培养上清液。
所述γδT细胞培养上清液在斑马鱼损伤模型中，可显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复，表现出良好的促进组织损伤修复的潜力。
本发明所述在斑马鱼损伤模型中能显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复的细胞培养上清液，为γδT细胞的培养上清液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用，γδT细胞培养上清液是从外周血中分离诱导γδT细胞得到的，在斑马鱼损伤模型中能显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复，具备应用于体内促进组织修复的潜能，此为利用γδT细胞培养上清液开发促进组织损伤修复的药品提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果图；
图2附图为本发明γδT细胞培养上清液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的直观图；
图3附图为本发明γδT细胞培养上清液液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1γδT细胞培养上清液的制备
FICOLL分离液购自GE Healthcare Life Sciences China；红细胞裂解液购自天根生化科技有限公司。
(1)获取外周血单个核细胞，步骤如下：
a.取适量体积外周血于无菌离心管中，按照V:V＝1:1比例加入RPMI 1640培养基进行稀释，混合均匀，获得血液混合液；
b.取15mL无菌离心管，加入3mL FICOLL分离液；
c.缓慢地向15mL无菌离心管中加入8mL血液混合液，使其分布在分离液上层；
d.以离心力550g，时间30min，升加速度6g/min，降加速度2g/min条件离心后，可见无菌离心管中液体分为4层，从下至上依次为红细胞层，分离液层，单个核细胞层，血浆层；
e.吸取单个核细胞层液体转移至新的无菌离心管中，按照V:V＝1:5比例加入RPMI1640培养基，以1500rpm，时间8min；升加速度5g/min，降加速度5g/min条件离心后弃上清；
f.向细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液，重悬细胞混合均匀后，室温裂解5min，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，1500rpm离心弃上清；
g.在所得细胞沉淀中加入适量含10％FBS的RPMI 1640培养基，重悬细胞，获得外周血单个核细胞(PBMC)；
(2)细胞接种：
将细胞悬液稀释为合适浓度，约为4×106个/mL；在细胞悬液中添加唑来膦酸、IL-2，接种于24孔细胞培养板；各培养孔最终体积为1mL，唑来膦酸、IL-2的终浓度分别为20μmol/mL、20μg/mL；置于CO2培养箱中培养，培养条件为：5％CO2、37℃；
(3)细胞培养：
于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换一次添加IL-2的新鲜完全培养基(为添加10％胎牛血清、1％抗生素溶液的RPMI 1640培养基；抗生素溶液含10000U/mL青霉素(碱)、10000μg/mL链霉素(碱)、25μg/mL两性霉素B，购自ThermoFisher scientific)，于培养箱中培养；
具体操作步骤如下：
A、第3天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
B、第5天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
C、第7天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
D、第9天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
E、第11天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
其中IL-2的终浓度为1μg/mL，CO2培养箱条件为5％CO2、37℃；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天用含有白细胞介素-2(终浓度为1μg/mL)的新鲜完全培养基调整细胞浓度为1×108个/mL，经离心(转速1500-1700rpm、时间5-8min)获得γδT细胞的培养上清液用于实施例2。
γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果见图1，图1结果表明该方法培养的γδT细胞纯度达到96.4％。
实施例2γδT细胞培养上清液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响
挑选发育正常野生型AB系斑马鱼(3dpf)置于6孔细胞培养板中，于体视显微镜下用手术刀将斑马鱼尾鳍切断，并在0dpa(day post amputation)时拍照记录，然后转移至96孔细胞培养板中，模型组加入经PBS稀释为8％含有白细胞介素-2(终浓度为1μg/mL)的RPMI1640培养基(V/V)，2％γδT细胞培养上清液组加入经PBS稀释为2％γδT细胞培养上清液(V/V)，4％γδT细胞培养上清液组加入经PBS稀释为4％γδT细胞培养上清液(V/V)，8％γδT细胞培养上清液组加入经PBS稀释为8％γδT细胞培养上清液(V/V)，每孔200μL，每组15条，孵育至3dpa后，用三卡因将斑马鱼麻醉，置于体视显微镜下拍照记录。利用Image J软件分别统计在0dpa和3dpa时斑马鱼尾鳍长度为D1和D2。D1和D2之间的差值就是斑马鱼尾鳍再生长度。采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure BDA0003861626910000051
数据表示，用单因素方差分析。各实验组与模型组比较：*P<0.05，***P<0.005。
结果见图2和图3；由图2和图3可知，模型组的斑马鱼尾鳍未长完整，尾鳍再生长度为59.32±2.91μm。2％γδT细胞培养上清液组、4％γδT细胞培养上清液组、8％γδT细胞培养上清液组的斑马鱼尾鳍几乎已经长完整，尾鳍再生长度分别为70.83±2.43μm、75.46±3.27μm、76.82±1.99μm，与模型组(59.32±2.91μm)相比差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明γδT细胞培养上清液能够促进斑马鱼尾鳍的损伤修复，具有增强损伤组织的自身修复能力的潜力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的γδT细胞培养上清液在制备促进组织损伤修复药物中的应用，其特征在于，所述γδT细胞培养上清液的制备方法如下：
(1)获取外周血单个核细胞；
(2)细胞接种：使用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度，加入唑来膦酸、白细胞介素-2，使唑来膦酸的终浓度为20μmol/mL，白细胞介素-2的终浓度为20μg/mL；将细胞接种于细胞培养板中，置于CO2培养箱中培养；
(3)细胞培养：于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换含有终浓度为1μg/mL白细胞介素-2的新鲜完全培养基，对细胞进行扩增培养；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天用含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基调整细胞浓度为1×108个/mL，经离心获得γδT细胞培养上清液。
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