CN112831470A - 一种γδT细胞的体外培养方法 - Google Patents

一种γδT细胞的体外培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种γδT细胞的体外培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明公开的一种γδT细胞的体外培养方法，步骤如下：获取外周血单个核细胞；使用含胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞密度，加入唑来膦酸、白细胞介素‑2，培养；期间更换新鲜完全培养基，对细胞进行扩增培养；流式检测细胞纯度；收获成熟γδT细胞。本发明公开的一种γδT细胞的体外培养方法，采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞，简单易行；γδT细胞体外诱导培养体系清晰明了，扩增倍数高；利用本发明制备的γδT细胞免疫效果好，安全风险低。

Description

一种γδT细胞的体外培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，更具体的说是涉及一种γδT细胞的体外培养方法。
背景技术
外周血单个核细胞为外周血中具有单个核的细胞，其中包括淋巴细胞和单核细胞。淋巴细胞是白细胞即免疫细胞的一种，为机体产生免疫应答功能的重要细胞成分。
淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系，分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞。其中T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分，在外周血中占淋巴细胞总数的65％-75％，具有多种生物学功能。
γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成，是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的杀伤性较强的免疫细胞。它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。但是现有存在的γδT细胞体外分离培养体系复杂、体外扩增倍数低、免疫效果差、安全方面存在风险。
因此，提供一种简单易行的γδT细胞的体外培养方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种γδT细胞的体外培养方法，为用于基础研究的大规模γδT细胞的生产起重要推动作用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种γδT细胞的体外培养方法，具体步骤如下：
(1)获取外周血单个核细胞(PBMC)；
(2)使用含7-10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基调整细胞密度，加入唑来膦酸(Zol)、白细胞介素-2(IL-2)，使唑来膦酸的终浓度为2-200μmol/mL，白细胞介素-2的终浓度为2-200μg/mL；将细胞接种于细胞培养板中，置于CO2培养箱中培养；
(3)于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换含有终浓度为1-50μg/mL白细胞介素-2的新鲜完全培养基，对细胞进行扩增培养，培养条件为5％CO2、36-38℃；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天收获成熟γδT细胞。
进一步，步骤(1)所述获取外周血单个核细胞的方法为密度梯度离心法，具体操作如下：
①取外周血于无菌离心管中，按照V:V＝1:1比例加入RPMI 1640培养基进行稀释，混合均匀，获得血液混合液；
②取15mL无菌离心管，加入3-5mL FICOLL分离液；
③缓慢地向15mL无菌离心管中加入8-10mL步骤①获得的血液混合液，使其分布在FICOLL分离液上层；
④以合适离心力离心，无菌离心管中液体分为4层，从下至上依次为红细胞层，分离液层，单个核细胞层，血浆层；
⑤吸取步骤④的单个核细胞层液体转移至新的无菌离心管中，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，离心后弃上清；
⑥向步骤⑤获得的细胞沉淀中加入红细胞裂解液，重悬细胞混合均匀后，室温裂解，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，离心弃上清；离心条件为1500-1700rpm；
⑦在步骤⑥所得细胞沉淀中加入含7-10％FBS的RPMI 1640培养基，重悬细胞，获得外周血单个核细胞。
进一步，步骤④所述离心条件为离心力550-650g，时间20-30min，升加速度6-8g/min，降加速度2-4g/min。
进一步，步骤⑤所述离心条件为1500-1700rpm，时间5-8min；升加速度5-8g/min，降加速度5-8g/min。
进一步，步骤⑥所述红细胞裂解液体积为5-8mL，裂解时间为5-8min。
进一步，步骤(2)所述细胞密度为3-4x106个/mL。
进一步，步骤(2)所述细胞培养板为24孔细胞培养板，培养基体积为1mL。
进一步，步骤(2)所述CO2培养箱的培养条件为5％CO2、36-38℃。
进一步，步骤(3)所述更换新鲜完全培养基的具体操作如下：
A、第3天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
B、第5天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
C、第7天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
D、第9天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
E、第11天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养。
进一步，步骤(3)所述完全培养基为添加7-10％胎牛血清、1％抗生素溶液的RPMI1640培养基；所述抗生素溶液含有10000U/mL青霉素(碱)、10000μg/mL链霉素(碱)、25μg/mL两性霉素B。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种γδT细胞的体外培养方法，采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞，简单易行；γδT细胞体外诱导培养体系清晰明了，扩增倍数高；利用本发明制备的γδT细胞免疫效果好，安全风险低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明流程示意图；
图2附图为本发明实施例1中γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果图；
图3附图为本发明实施例1中γδT细胞培养13天流式细胞术检测活率结果图；
图4附图为本发明实施例2中γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果图；
图5附图为本发明实施例2中γδT细胞培养13天流式细胞术检测活率结果图；
图6附图为本发明实施例2中使用CCK8法检测γδT细胞作为效应细胞对靶细胞K562细胞杀伤率结果图；
图7附图为本发明实施例3中γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果图；
图8附图为本发明实施例3中γδT细胞培养13天流式细胞术检测活率结果图；
图9附图为本发明实施例3中γδT细胞培养12天显微镜下观察图；
图10附图为本发明实施例3中γδT细胞培养扩增图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
FICOLL分离液购自GE Healthcare Life Sciences China；红细胞裂解液购自天根生化科技有限公司。
实施例1
一种γδT细胞的体外培养方法，流程示意图见图1，具体步骤如下：
(1)获取外周血单个核细胞，步骤如下：
a.取适量体积外周血于无菌离心管中，按照V:V＝1:1比例加入RPMI 1640培养基进行稀释，混合均匀，获得血液混合液；
b.取15mL无菌离心管，加入3mL FICOLL分离液；
c.缓慢地向15mL无菌离心管中加入8mL血液混合液，使其分布在分离液上层；
d.以离心力550g，时间30min，升加速度6g/min，降加速度2g/min条件离心后，可见无菌离心管中液体分为4层，从下至上依次为红细胞层，分离液层，单个核细胞层，血浆层；
e.吸取单个核细胞层液体转移至新的无菌离心管中，按照V:V＝1:5比例加入RPMI1640培养基，以1500rpm，时间8min；升加速度5g/min，降加速度5g/min条件离心后弃上清；
f.向细胞沉淀中加入5mL红细胞裂解液，重悬细胞混合均匀后，室温裂解5min，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，1500rpm离心弃上清；
g.在所得细胞沉淀中加入适量含10％FBS的RPMI 1640培养基，重悬细胞，获得外周血单个核细胞(PBMC)；
(2)细胞接种：
将细胞悬液稀释为合适浓度，约为4x106个/mL；在细胞悬液中添加唑来膦酸、IL-2，接种于24孔细胞培养板；各培养孔最终体积为1mL，唑来膦酸、IL-2的终浓度分别为20μmol/mL、20μg/mL；置于CO2培养箱中培养，培养条件为：5％CO2、37℃；
(3)细胞培养：
于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换一次添加IL-2的新鲜完全培养基(为添加10％胎牛血清、1％抗生素溶液的RPMI 1640培养基；抗生素溶液含10000U/mL青霉素(碱)、10000μg/mL链霉素(碱)、25μg/mL两性霉素B，购自ThermoFisher scientific)，于培养箱中培养；
具体操作步骤如下：
A、第3天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
B、第5天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
C、第7天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
D、第9天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
E、第11天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
其中IL-2的终浓度为1μg/mL，CO2培养箱条件为5％CO2、37℃；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天收获成熟γδT细胞。
γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果见图2，图2结果表明该方法培养的γδT细胞纯度达到97.7％。
γδT细胞培养13天流式细胞术检测活率结果见图3，图3结果表明该方法培养的γδT细胞活率达到98.6％。
表1为使用CCK8法检测γδT细胞作为效应细胞对靶细胞K562细胞的杀伤率结果，发现随着γδT细胞浓度增加，对K562细胞杀伤活性越高，效靶比为25:1时的杀伤活性可达90％以上。
表1γδT细胞对K562细胞杀伤率
Figure BDA0002992715950000071
表2为γδT细胞培养扩增结果，结果表明该方法培养的γδT细胞扩增倍数可达50-60倍。
表2γδT细胞培养扩增结果
Figure BDA0002992715950000072
实施例2
一种γδT细胞的体外培养方法，具体步骤如下：
(1)获取外周血单个核细胞，步骤如下：
a.取适量体积外周血于无菌离心管中，按照V:V＝1:1比例加入RPMI 1640培养基进行稀释，混合均匀，获得血液混合液；
b.取15mL无菌离心管，加入4mL FICOLL分离液；
c.缓慢地向15mL无菌离心管中加入9mL血液混合液，使其分布在分离液上层；
d.以离心力650g，时间20min，升加速度8g/min，降加速度4g/min条件离心后，可见无菌离心管中液体分为4层，从下至上依次为红细胞层，分离液层，单个核细胞层，血浆层；
e.吸取单个核细胞层液体转移至新的无菌离心管中，按照V:V＝1:5比例加入RPMI1640培养基，以1700rpm，时间5min；升加速度8g/min，降加速度8g/min条件离心后弃上清；
f.向细胞沉淀中加入6mL红细胞裂解液，重悬细胞混合均匀后，室温裂解7min，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，1600rpm离心弃上清；
g.在所得细胞沉淀中加入适量含7％FBS的RPMI 1640培养基，重悬细胞，获得外周血单个核细胞(PBMC)；
(2)细胞接种：
将细胞稀释为合适浓度，约为3x106个/mL；在细胞悬液中添加唑来膦酸、IL-2，接种于24孔细胞培养板；各培养孔最终体积为1mL，唑来膦酸、IL-2的终浓度分别为200μmol/mL、200μg/mL；置于CO2培养箱中培养，培养条件为：5％CO2、36℃；
(3)细胞培养：
于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换一次添加IL-2的新鲜完全培养基(为添加7％胎牛血清、1％抗生素溶液的RPMI 1640培养基，抗生素溶液含10000U/mL青霉素(碱)、10000μg/mL链霉素(碱)、25μg/mL两性霉素B)，于培养箱中培养；
具体操作步骤如下：
A、第3天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
B、第5天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
C、第7天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
D、第9天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
E、第11天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
其中IL-2的终浓度为50μg/mL，CO2培养箱条件为5％CO2、36℃；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天收获成熟γδT细胞。
γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果见图4，图4结果表明该方法培养的γδT细胞纯度达到97.1％。
γδT细胞培养13天流式细胞术检测活率结果见图5，图5结果表明该方法培养的γδT细胞活率达到96.5％。
使用CCK8法检测γδT细胞作为效应细胞对靶细胞K562细胞的杀伤率，结果见表3和图6；结果表明随着γδT细胞浓度增加，对K562细胞杀伤活性越高，效靶比为25:1时的杀伤活性可达90％以上。
表3γδT细胞对K562细胞杀伤率
Figure BDA0002992715950000091
表4为γδT细胞培养扩增结果，结果表明该方法培养的γδT细胞扩增倍数可达50-60倍。
表4γδT细胞培养扩增结果
Figure BDA0002992715950000092
实施例3
(1)获取外周血单个核细胞，步骤如下：
a.取适量体积外周血于无菌离心管中，按照V:V＝1:1比例加入RPMI 1640培养基进行稀释，混合均匀，获得血液混合液；
b.取15mL无菌离心管，加入5mL FICOLL分离液；
c.缓慢地向15mL无菌离心管中加入10mL血液混合液，使其分布在分离液上层；
d.以离心力600g，时间25min，升加速度7g/min，降加速度3g/min条件离心后，可见无菌离心管中液体分为4层，从下至上依次为红细胞层，分离液层，单个核细胞层，血浆层；
e.吸取单个核细胞层液体转移至新的无菌离心管中，按照V:V＝1:5比例加入RPMI1640培养基，以1600rpm，时间6min；升加速度7g/min，降加速度7g/min条件离心后弃上清；
f.向细胞沉淀中加入8mL红细胞裂解液，重悬细胞混合均匀后，室温裂解8min，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，1700rpm离心弃上清；
g.在所得细胞沉淀中加入适量含8％FBS的RPMI 1640培养基，重悬细胞，获得外周血单个核细胞(PBMC)；
(2)细胞接种：
将细胞稀释为合适浓度，约为4x106个/mL；在细胞悬液中添加唑来膦酸、IL-2，接种于24孔细胞培养板；各培养孔最终体积为1mL，唑来膦酸、IL-2的终浓度分别为50μmol/mL、50μg/mL；置于CO2培养箱中培养，培养条件为：5％CO2、38℃；
(3)细胞培养：
于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换一次添加IL-2的新鲜完全培养基(为添加8％胎牛血清、1％抗生素溶液的RPMI 1640培养基，抗生素溶液含10000U/mL青霉素(碱)、10000μg/mL链霉素(碱)、25μg/mL两性霉素B)，于培养箱中培养；
具体操作步骤如下：
A、第3天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
B、第5天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
C、第7天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
D、第9天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
E、第11天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
其中IL-2的终浓度为20μg/mL，CO2培养箱条件为5％CO2、38℃；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天收获成熟γδT细胞。
γδT细胞培养10天流式细胞术检测表面抗原结果见图7，图7结果表明该方法培养的γδT细胞纯度达到95.9％。
γδT细胞培养13天流式细胞术检测活率结果见图8，图8结果表明该方法培养的γδT细胞活率达到98.4％。
γδT细胞培养12天后在显微镜下进行观察，结果见图9。
表5为使用CCK8法检测γδT细胞作为效应细胞对靶细胞K562细胞的杀伤率结果，发现随着γδT细胞浓度增加，对K562细胞杀伤活性越高，效靶比为25:1时的杀伤活性可达90％以上。
表5γδT细胞对K562细胞杀伤率
Figure BDA0002992715950000111
Figure BDA0002992715950000121
γδT细胞培养扩增结果见表6和图10，结果表明该方法培养的γδT细胞扩增倍数可达50-60倍。
表6γδT细胞培养扩增结果
Figure BDA0002992715950000122
收获实施例1-3成熟的γδT细胞前检测乙肝表面抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、真菌、细菌，检测结果均呈阴性。
对实施例1-3中培养成熟的γδT细胞用流式细胞仪检测细胞表面抗体即分化率检测，检测结果分化率均>90％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)获取外周血单个核细胞；
(2)使用含7-10％胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度，加入唑来膦酸、白细胞介素-2，使唑来膦酸的终浓度为2-200μmol/mL，白细胞介素-2的终浓度为2-200μg/mL；将细胞接种于细胞培养板中，置于CO2培养箱中培养；
(3)于第3天、第5天、第7天、第9天、第11天更换含有终浓度为1-50μg/mL白细胞介素-2的新鲜完全培养基，对细胞进行扩增培养；
(4)第10天随机收集部分细胞，流式检测细胞纯度；
(5)第13天收获成熟γδT细胞。
2.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(1)所述获取外周血单个核细胞的方法为密度梯度离心法，具体操作如下：
①取外周血于无菌离心管中，按照V:V＝1:1比例加入RPMI 1640培养基进行稀释，混合均匀，获得血液混合液；
②取15mL无菌离心管，加入3-5mL FICOLL分离液；
③缓慢地向15mL无菌离心管中加入8-10mL步骤①获得的血液混合液，使其分布在FICOLL分离液上层；
④以合适离心力离心，无菌离心管中液体分为4层，从下至上依次为红细胞层，分离液层，单个核细胞层，血浆层；
⑤吸取步骤④的单个核细胞层液体转移至新的无菌离心管中，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，离心后弃上清；
⑥向步骤⑤获得的细胞沉淀中加入红细胞裂解液，重悬细胞混合均匀后，室温裂解，按照V:V＝1:5比例加入RPMI 1640培养基，离心弃上清；
⑦在步骤⑥所得细胞沉淀中加入含7-10％FBS的RPMI 1640培养基，重悬细胞，获得外周血单个核细胞。
3.根据权利要求2所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤④所述离心条件为离心力550-650g，时间20-30min，升加速度6-8g/min，降加速度2-4g/min。
4.根据权利要求2所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤⑤所述离心条件为1500-1700rpm，时间5-8min；升加速度5-8g/min，降加速度5-8g/min。
5.根据权利要求2所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤⑥所述红细胞裂解液体积为5-8mL，裂解时间为5-8min。
6.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞密度为3-4x106个/mL。
7.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞培养板为24孔细胞培养板，培养基体积为1mL。
8.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(2)所述CO2培养箱的培养条件为5％CO2、36-38℃。
9.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(3)所述更换新鲜完全培养基的具体操作如下：
A、第3天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
B、第5天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
C、第7天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
D、第9天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养；
E、第11天，移液器轻轻吹打细胞，吸出悬液转移至50mL无菌离心管中，离心后弃上清，加入含有白细胞介素-2的新鲜完全培养基，吹打混匀，补足培养基至24mL，按每孔1mL体积于24孔细胞培养板中继续培养。
10.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(3)所述完全培养基为添加7-10％胎牛血清、1％抗生素溶液的RPMI 1640培养基；所述抗生素溶液含有10000U/mL青霉素(碱)、10000μg/mL链霉素(碱)、25μg/mL两性霉素B。
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