CN112080476B - 一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法。该方法包括牡蛎组织匀浆、牡蛎组织样品中弧菌裂解、噬菌体粒子释放、离心获得包含噬菌体粒子的上清液、噬菌体富集扩大培养、双层平板分离、双层平板纯化、纯化噬菌体增殖等关键步骤。本发明提供的利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法具有高效、简单、快速、成功率高等优点。

Description

一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法。
背景技术
随着我国水产养殖业的快速发展，水产养殖规模和产量也不断提高，高密度养殖成为水产养殖的主要方式。在高密度养殖模式下极易爆发病害，其中弧菌病是海水养殖中最为常见的细菌性病害，弧菌种类众多，弧菌病爆发对我国以及世界水产养殖业均造成了巨大的损失。
当前弧菌病防治主要采用化学和生物方法。化学方法主要是采用消毒剂和抗生素药物，抗生素药物在水生环境的应用造成了种种问题，包括水产品安全、细菌耐药和耐药基因的快速传播等。以前的许多研究表明，环境分离的弧菌株已经呈现广泛的耐药性。因此，在社会日益注重环境保护和食品安全的背景下，抗生素药物在水产养殖中使用日益受到严格限制。发展替代抗生素的生物防治技术逐渐成为研究和应用的热点。其中，应用噬菌体生物防治弧菌被认为是一种环保、高效和特异的方式。
噬菌体制剂开发的核心是获得用于高效裂解致病菌的噬菌体，然而由于弧菌噬菌体在天然水体中的丰度较低，经多次实验发现，很难通过海水富集的方法得到弧菌噬菌体。专利（CN102524131B)公开了一种利用海水富集弧菌噬菌体与生物防制宿主菌的方法，该方法是在海区或者养殖池进行，占地面积大，通过复杂的程序和长期累积富集分离弧菌噬菌体，其操作难度大、过程繁琐、耗时非常长（长达数月）、效率低，因此并不适合作为一种常规和频繁使用的方法进行操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法。该方法包括牡蛎组织匀浆、牡蛎组织样品中弧菌裂解、噬菌体粒子释放、离心获得包含噬菌体粒子的上清液、噬菌体富集扩大培养、双层平板分离、双层平板纯化、纯化噬菌体增殖等关键步骤。使用该方法可以大幅提高分离获得弧菌噬菌体的成功率。
具体的，所述的一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：
（1）将牡蛎组织匀浆，往牡蛎匀浆糊状物中加入灭菌海水，震荡混匀，离心，取上清液，将上清液过滤，收集噬菌体初级滤液；
（2）使用LB或2216E培养基培养弧菌，将弧菌菌液加至步骤（1）的噬菌体初级滤液，得到混合液，然后加入高倍数浓缩的LB或2216E培养基，培养3~48 h，离心，取上清液，将上清液过滤，取滤液，然后进行梯度稀释，得到各级稀释滤液；
（3）使用LB或2216E培养基培养弧菌，培养至OD600nm为0.6~1.0，得到宿主菌；分别将步骤（2）的各级稀释滤液与宿主菌混合，得到混合液；将混合液加至一定温度的含琼脂的LB或2216E培养基中，迅速混匀，立即倾倒在LB或2216E固体培养基上，待冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；
（4）取噬菌斑数量为50~500PFU的双层平板，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑进行纯化；
（5）取纯化后的噬菌斑，经磨碎后，加入LB或2216E培养基和弧菌菌液培养至透明裂解，离心，取上清液，将上清液过滤，收集过滤液，即得到弧菌噬菌体。
优选，步骤（1）中，将牡蛎组织匀浆具体为：取鲜活牡蛎，撬开牡蛎，用灭菌的解剖刀切除外套膜、腮、消化腺及肠道，取牡蛎组织按100 g/1.5 mL的比例加入氯仿，研磨匀浆至糊状，得到牡蛎匀浆糊状物。
优选，步骤（1）中，牡蛎匀浆糊状物与灭菌海水是按1g:2~4 mL比例混合；所述的离心是在10000 g，离心5~15 min。
优选，步骤（2）中，所述的弧菌菌液的加入量为噬菌体初级滤液体积的1%；所述的高倍数浓缩的LB或2216E培养基为10×LB培养基或10×2216E培养基；所述的混合液与10×LB培养基或10×2216E培养基的体积比为9:1；所述的培养3~48 h是在30℃、200 rpm摇床培养3~48 h；所述的离心是在12000 g、离心5~10 min；所述的梯度稀释是将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释。
优选，步骤（3）中，所述的各级稀释滤液与宿主菌混合的体积比为10:1；所述的一定温度的含琼脂的LB或2216E培养基的温度为45℃、琼脂含量为0.7 wt%；所述的混合液与含琼脂的LB或2216E培养基的体积比为0.11:5；所述的LB或2216E固体培养基为LB或2216E培养基中加入1.5 wt%琼脂制得。
优选，步骤（4）中，所述的挑取噬菌斑进行纯化的方法为：无菌条件下，用灭菌剪刀将移液器吸头剪平，对准噬菌斑垂直按下，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到离心管中，采用塑料研磨棒磨成粉末，加入500 μL LB或2216E培养基，旋涡振荡，再做10-2、10-3、10-4梯度稀释，按照权利要求1所述的步骤（3）和（4）进行噬菌斑的培养和纯化，共进行4次，得到纯化的噬菌斑。
优选，步骤（5）中，所述的LB或2216E培养基和弧菌菌液的体积比为100:1；所述的离心是在12000 g、离心10 min。
优选，所述的将上清液过滤是将上清液用0.45 μm一次性过滤器过滤。
本发明的主要原理是：牡蛎体内含有多样且丰富的弧菌和噬菌体，弧菌和噬菌体丰度远高于养殖和天然海水；弧菌噬菌体的裂解量一般达到100左右，表明单个感染弧菌细胞内可装配噬菌体粒子的数量一般可达到100个，因此牡蛎体内弧菌是噬菌体潜在的最大来源，而这部分在以往的分离方法均因离心沉淀和过滤步骤损失掉，因此释放牡蛎体内弧菌细胞内的噬菌体粒子可以大幅提高分离获得弧菌噬菌体的成功率。
本发明的技术效果为：（1）分离富集噬菌体的样品广泛存在，可随时获得，无需大体积近海水域，因此大大简化了操作程序，减少了工作量，大幅缩减了分离获得噬菌体的时间；（2）相对于利用海水分离弧菌噬菌体，分离获得弧菌噬菌体的成功率大幅提高；（3）在本发明中采用了高倍数浓缩的培养基，大幅度提高了单次分离中样品容量，因此也提高了单次样品的含有弧菌噬菌体的机率；（4）本发明中采用了氯仿对匀浆液进行处理，一方面可裂解杀死原样品中的弧菌，防止污染，另外一方面可大量释放样品中弧菌细胞内的噬菌体，大幅提高样品中有效噬菌体的含量，而在以往的噬菌体分离方法中，样品中弧菌细胞内潜在的大量噬菌体粒子因离心和过滤掉弧菌细胞而损失掉。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。
实施例1 溶藻弧菌噬菌体分离
一种利用牡蛎富集分离溶藻弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：
（1）取1个鲜活牡蛎（壳长10 cm以上），撬开牡蛎，以灭菌的解剖刀切除外套膜、腮、消化腺及肠道，称取5 g牡蛎组织，按100 g/1.5 mL的比例加入氯仿75 μL，用研钵或组织匀浆机研磨匀浆至糊状，得到牡蛎匀浆糊状物。
（2）按1g:4 mL比例往牡蛎匀浆糊状物中加入灭菌海水20 mL，充分震荡混匀5min， 于10000 g，离心5 min，小心吸除最上层300 µL的液体，再小心吸取剩下的上清液至另一个新的离心管，用0.45 μm一次性过滤器过滤，收集噬菌体初级滤液，4℃保存备用。
（3）使用LB培养基、30℃过夜培养溶藻弧菌E06333，按溶藻弧菌菌液占噬菌体初级滤液体积的1%的比例，取200 µL溶藻弧菌菌液加至步骤（2）的噬菌体初级滤液，得到混合液；取混合液18 mL，按体积比9:1加入10×LB培养基2 mL，作为实验组；作为对照组，将噬菌体初级滤液替换为灭菌海水即可。
（4）30℃摇床培养（转速200 rpm），摇床培养过程中观察实验组与对照组的差异，如果对照组的溶藻弧菌生长良好，而实验组的溶藻弧菌生长慢或出现澄清（有沉淀的残渣），说明噬菌体感染富集成功，立即停止培养，所需培养时间为3小时。
（5）于12000 g、离心 5 min，小心吸取上清液，将上清液用0.45 μm一次性过滤器过滤，取滤液，将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，得到各级稀释滤液，备用。
（6）以LB固体培养基（含1.5 wt%琼脂）制备下层培养基平板备用，每个平板培养基用量为10 mL。
（7）使用LB培养基、30℃过夜培养溶藻弧菌，次日再按1% v/v接种量接种于新鲜LB培养基中，培养至OD600nm约为0.6，得到宿主菌。
（8）取步骤（5）的各级稀释滤液100 μL分别与步骤（7）的宿主菌10 μL混合，得到混合液；将混合液加入到降温至45℃的5 mL LB培养基（含0.7 wt%琼脂）中，迅速以移液枪混匀，立即倾倒在步骤（6）制备的下层培养基平板上，待冷却凝固后，30℃倒置培养过夜，得到双层平板。
（9）取噬菌斑数量50-500PFU的双层平板，进行噬菌体的纯化及分离，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑进行纯化，具体步骤为：无菌条件下，用灭菌剪刀将移液器吸头剪平，对准噬菌斑垂直按下，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到1.5 mL离心管中，采用一次性塑料研磨棒磨成粉末，加入500 μL LB培养基，旋涡振荡，再做10-2、10-3、10-4梯度稀释，按照上述步骤（6）-（9）进行噬菌斑的培养和纯化，共进行4次，得到纯化的噬菌斑。
（10）取纯化后的噬菌斑，经一次性塑料研磨棒磨碎后加入1 mL LB培养基，混匀，取100 μL加入5 mL LB培养基，加入50 μL过夜培养的溶藻弧菌菌液，培养至透明裂解，于12000 g、离心10 min，取上清液，将上清液用0.45 μm一次性过滤器过滤，收集过滤液即为分离获得的溶藻弧菌噬菌体。
实施例2 副溶血弧菌噬菌体分离
一种利用牡蛎富集分离副溶血弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：
（1）取2个鲜活牡蛎（壳长10 cm以上），每一只牡蛎作为一个样品。撬开牡蛎，以灭菌的解剖刀切除外套膜、腮、消化腺及肠道，各称取5 g牡蛎组织，按100 g/1.5 mL的比例加入氯仿75 μL，用研钵或组织匀浆机研磨匀浆至糊状，得到牡蛎匀浆糊状物。
（2）按1g:3 mL比例往牡蛎匀浆糊状物中加入灭菌海水15 mL，充分震荡混匀5min，于10000 g，离心10 min，小心吸除最上层200 µL的液体，再小心吸取剩下的上清液至另一个新的离心管，用0.45 μm一次性过滤器过滤，收集噬菌体初级滤液，4℃保存备用。
（3）使用LB培养基、30℃过夜培养副溶血弧菌ATCC 33847，按副溶血弧菌菌液占噬菌体初级滤液体积的1%的比例，取200 µL副溶血弧菌菌液加至步骤（2）的噬菌体初级滤液，得到混合液；取混合液9 mL，按体积比9:1加入10×LB培养基1 mL，作为实验组；作为对照组，将噬菌体初级滤液替换为灭菌海水即可。
（4）30℃摇床培养（转速200 rpm），摇床培养过程中观察实验组与对照组的差异，如果对照组的副溶血弧菌生长良好，而实验组的副溶血弧菌生长慢或出现澄清（有沉淀的残渣），说明噬菌体感染富集成功，立即停止培养，所需培养时间约为24小时。
（5）于12000 g、离心 8 min，小心吸取上清液，将上清液用0.45 μm一次性过滤器过滤，取滤液，将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，得到各级稀释滤液，备用。
（6）以LB固体培养基（含1.5 wt%琼脂）制备下层培养基平板备用，每个平板培养基用量为10 mL。
（7）使用LB培养基、30℃过夜培养副溶血弧菌，次日再按1% v/v接种量接种于新鲜LB培养基中，培养至OD600nm约为0.8，得到宿主菌。
（8）取步骤（5）的各级稀释滤液100 μL分别与步骤（7）的宿主菌10 μL混合，得到混合液；将混合液加入到降温至45℃的5 mL LB培养基（含0.7 wt%琼脂）中，迅速以移液枪混匀，立即倾倒在步骤（6）制备的下层培养基平板上，待冷却凝固后，30℃倒置培养过夜，得到双层平板。
（9）取噬菌斑数量50-500PFU的双层平板，进行噬菌体的纯化及分离，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑进行纯化，具体步骤为：无菌条件下，用灭菌剪刀将移液器吸头剪平，对准噬菌斑垂直按下，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到1.5 mL离心管中，采用一次性塑料研磨棒磨成粉末，加入500 μL LB培养基，旋涡振荡，再做10-2、10-3、10-4梯度稀释，按照上述步骤（6）-（9）进行噬菌斑的培养和纯化，共进行4次，得到纯化的噬菌斑。
（10）取纯化后的噬菌斑，经一次性塑料研磨棒磨碎后加入1 mL LB培养基，混匀，取100 μL加入8 mL LB培养基，加入80 μL过夜培养的副溶血弧菌菌液，培养至透明裂解，于12000 g、离心10 min，取上清液，将上清液用0.45 μm一次性过滤器过滤，收集过滤液即为分离获得的副溶血弧菌噬菌体。
实施例3 哈氏弧菌噬菌体分离
一种利用牡蛎富集分离哈氏弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：
（1）取3个鲜活牡蛎（壳长10 cm以上），每一只牡蛎作为一个样品。撬开牡蛎，以灭菌的解剖刀切除外套膜、腮、消化腺及肠道，各称取5 g牡蛎组织，按100 g/1.5 mL的比例加入氯仿75 μL，用研钵或组织匀浆机研磨匀浆至糊状，得到牡蛎匀浆糊状物。
（2）按1g:2 mL比例往牡蛎匀浆糊状物中加入灭菌海水10 mL，充分震荡混匀5min， 于10000 g，离心10 min，小心吸除最上层100 µL的液体，再小心吸取剩下的上清液至另一个新的离心管，用0.45 μm一次性过滤器过滤，收集噬菌体初级滤液，4℃保存备用。
（3）使用2216E培养基（青岛海博，HB0132-1），30℃过夜培养哈氏弧菌（CCTCCAB2010412），按哈氏弧菌菌液占噬菌体初级滤液体积的1%的比例，取200 µL哈氏弧菌菌液加至步骤（2）的噬菌体初级滤液，得到混合液；取混合液9 mL，按体积比9:1加入10×LB培养基1 mL，作为实验组；作为对照组，将噬菌体初级滤液替换为灭菌海水即可。
（4）30℃摇床培养（转速200 rpm），摇床培养过程中观察实验组与对照组的差异，如果对照组的哈氏弧菌生长良好，而实验组的哈氏弧菌生长慢或出现澄清（有沉淀的残渣），说明噬菌体感染富集成功，立即停止培养，所需培养时间约为48小时。
（5）于12000 g、离心 10 min，小心吸取上清液，将上清液用0.45 μm一次性过滤器过滤，取滤液，将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，得到各级稀释滤液，备用。
（6）以2216E固体培养基（含1.5 wt%琼脂）制备下层培养基平板备用，每个平板培养基用量为10 mL。
（7）使用2216E培养基、30℃过夜培养哈氏弧菌，次日再按1% v/v接种量接种于新鲜2216E培养基中，培养至OD600nm约为1.0，得到宿主菌。
（8）取步骤（5）的各级稀释滤液100 μL分别与步骤（7）的宿主菌10 μL混合，得到混合液；将混合液加入到降温至45℃的5 mL 2216E培养基（含0.7 wt%琼脂）中，迅速以移液枪混匀，立即倾倒在步骤（6）制备的下层培养基平板上，待冷却凝固后，30℃倒置培养过夜，得到双层平板。
（9）取噬菌斑数量50-500PFU的双层平板，进行噬菌体的纯化及分离，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑进行纯化，具体步骤为：无菌条件下，用灭菌剪刀将移液器吸头剪平，对准噬菌斑垂直按下，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到1.5 mL离心管中，采用一次性塑料研磨棒磨成粉末，加入500 μL 2216E培养基，旋涡振荡，再做10-2、10-3、10-4梯度稀释，按照上述步骤（6）-（9）进行噬菌斑的培养和纯化，共进行4次，得到纯化的噬菌斑。
（10）取纯化后的噬菌斑，经一次性塑料研磨棒磨碎后加入1 mL 2216E培养基，混匀，取100 μL加入10 mL 2216E培养基，加入100 μL过夜培养的哈氏弧菌菌液，培养至透明裂解，于12000 g、离心10 min，取上清液，将上清液用0.45 μm一次性过滤器过滤，收集过滤液即为分离获得的哈氏弧菌噬菌体。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取鲜活牡蛎，撬开牡蛎，用灭菌的解剖刀切除外套膜、腮、消化腺及肠道，取牡蛎组织按100 g/1.5 mL的比例加入氯仿，研磨匀浆至糊状，得到牡蛎匀浆糊状物，按1g:2~4 mL比例往牡蛎匀浆糊状物中加入灭菌海水，震荡混匀，在10000 g，离心5~15 min，取上清液，将上清液过滤，收集噬菌体初级滤液；
（2）使用LB或2216E培养基培养弧菌，将弧菌菌液加至步骤（1）的噬菌体初级滤液，弧菌菌液的加入量为噬菌体初级滤液体积的1%，得到混合液，然后加入10×LB培养基或10×2216E培养基，混合液与10×LB培养基或10×2216E培养基的体积比为9:1，在30℃、200 rpm摇床培养3~48 h，于12000 g、离心5~10 min，取上清液，将上清液过滤，取滤液，然后进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，得到各级稀释滤液；
（3）使用LB或2216E培养基培养弧菌，培养至OD600nm为0.6~1.0，得到宿主菌；分别将步骤（2）的各级稀释滤液与宿主菌按体积比为10:1混合，得到混合液；将混合液加至45℃含0.7wt%琼脂的LB或2216E培养基中，混合液与含琼脂的LB或2216E培养基的体积比为0.11:5，迅速混匀，立即倾倒在含1.5 wt%琼脂的LB或2216E固体培养基上，待冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；
（4）取噬菌斑数量为50~500PFU的双层平板，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑进行纯化，具体步骤为：无菌条件下，用灭菌剪刀将移液器吸头剪平，对准噬菌斑垂直按下，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到离心管中，采用塑料研磨棒磨成粉末，加入500 μL LB或2216E培养基，旋涡振荡，再做10-2、10-3、10-4梯度稀释，按照步骤（3）和（4）进行噬菌斑的培养和纯化，共进行4次，得到纯化的噬菌斑；
（5） 取纯化后的噬菌斑，经磨碎后，加入LB或2216E培养基和弧菌菌液培养至透明裂解，离心，取上清液，将上清液过滤，收集过滤液，即得到弧菌噬菌体。
2.根据权利要求1所述的利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的LB或2216E培养基和弧菌菌液的体积比为100:1；所述的离心是在12000 g、离心10 min。
3.根据权利要求1所述的利用牡蛎富集分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）、（5）中的过滤是用0.45 μm一次性过滤器过滤。
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