CN114807055A - 一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种对虾肠道内弧菌噬菌体快速分离的方法。具体包括以下步骤：步骤1：对虾肠道匀浆；步骤2：目标弧菌的裂解观察；步骤3：子代噬菌体的获取；步骤4：双层平板获得包含噬菌体粒子的上清液；步骤5：噬菌体的纯化；步骤6：噬菌体的富集；本发明提供的利用对虾肠道高效富集分离弧菌噬菌体的方法能够快速、高效、简单的初步分离弧菌噬菌体，解决了取样少，初步分离噬菌体困难的现象。

Description

一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及到一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法。
背景技术
我国是水产养殖业大国，在世界水产养殖中扮演着不可或缺的角色。随着海水养殖业的迅猛发展，弧菌病呈现传播速度快和多发性等趋势，给我国乃至世界水产养殖业带来了不可估量的经济损失。迄今为止，已报道的致病性弧菌种类达到数十种之多；目前在实际生产中，抗生素和化学药物仍然是防治弧菌病最常见和有效的手段，而传统抗生素和化学药物的长期使用，产生了环境污染、细菌耐药性及食品安全等诸多问题。因此，寻找绿色安全的防治弧菌病的手段迫在眉睫。
噬菌体作为细菌的天敌可快速消杀细菌，且具有自我复制、特异性强、筛选周期短、生产成本低、安全无毒等抗生素无法比拟的优点。噬菌体作为一种新型的抗生素替代策略在水产养殖已有着广泛的应用研究基础，其良好的抑菌效果已引起人们的广泛关注。近年来，噬菌体在水产养殖领域的应用报道越来越多。总体来看，水产领域噬菌体研究呈逐年上升趋势，截止2019年4月有关研究论文己达100余篇。
噬菌体制剂开发的核心是获得用于高效裂解致病菌的噬菌体，然而由于弧菌噬菌体在天然水体中的丰度较低，经多次实验发现，很难通过海水富集的方法得到弧菌噬菌体。因此需要一种快速高效，低成本初步分离弧菌噬菌体的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种快速高效，低成本的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，解决初步分离噬菌体困难的现象。以此为基础，为以后优化分离噬菌体提供新思路。
本发明提供的技术方案如下：
一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：取对虾肠道，加入氯仿后研磨匀浆，加入海水并离心后取上清液并过滤，得到噬菌体初级滤液；将噬菌体初级滤液与所靶向的目标弧菌菌液混合培养，离心取上清液，将上清液过滤，将获取的滤液进行梯度稀释，得到各级稀释滤液；分别将各级稀释滤液与宿主菌混合，并向混合液中加入LB液体培养基，迅速混匀后立刻倾倒在LB固体培养基上，冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；在双层平板中挑取噬菌斑，捣碎后加入缓冲液中，离心获得包含噬菌体粒子的上清液并将噬菌体纯化并富集，得到弧菌噬菌体。
具体的，所述的一种对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，包括以下步骤：
步骤1：对虾肠道匀浆：对虾肠道匀浆：取对虾肠道，加入氯仿后，用研钵研磨匀浆至糊状，往匀浆糊状物中，加入灭菌海水，震荡混匀，离心，取上清液，将上清液过滤，收集噬菌体初级滤液；
步骤2：目标弧菌的裂解观察：将步骤(1)的噬菌体初级滤液与目标弧菌菌液混合培养3～12h，离心，取上清液，将上清液过滤，将获取的滤液进行梯度稀释，得到各级稀释滤液。
步骤3：子代噬菌体的获取：使用LB培养基培养目标弧菌至OD600为0.6～1.0，得到宿主菌；分别将步骤(2)的各级稀释滤液与宿主弧菌混合，之后向混合液中加入一定温度的含琼脂的LB液体培养基中，迅速混匀，立即倾倒在LB固体培养基上，冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；
步骤4：离心获得包含噬菌体粒子的上清液:取噬菌斑数量为50～500PFU的双层平板，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形态的噬菌斑，捣碎加入SM缓冲液中，离心获取含有噬菌体粒子的上清液。
步骤5：噬菌体的纯化：用SM缓冲液对噬菌体液进行倍比稀释，取适宜梯度加
入宿主菌制成双层平板，重复此步骤4～5次，直至得到均一噬菌斑。
步骤6：噬菌体的富集；取纯化后多个大小一致的噬菌斑，磨碎后，重复步骤5，将上清液过滤，收集过滤液，即得到弧菌噬菌体。
优选，步骤(1)中，所述对虾肠道匀浆具体为：取鲜活对虾，用灭菌的解剖刀和镊子取出对虾肠道，按质量体积比(W/V)1.0～1.5％加入氯仿，研磨匀浆至糊状，得到对虾肠道匀浆糊状物；所述的离心是在10000g，离心2～10min；所述的过滤是用0.45μm一次性过滤器过滤。
优选，步骤(2)中，所述的弧菌菌液的加入量为噬菌体初级滤液体积的1％；所述的培养3～12h是在30℃、200rpm摇床培养3～12h；所述的离心是在10000g、离心5～10min；所述的梯度稀释是将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释。
优选，步骤(3)中，所述的各级稀释滤液与宿主菌混合的体积比为10:1；所述的一定温度的含琼脂的LB液体培养基的温度为50℃、琼脂含量为0.7％；所述的LB液体培养基含2％NaCl；所述的LB固体培养基为LB培养基中加入1.5％琼脂制得。
优选，步骤(4)中，所述的挑取噬菌斑的方法为：无菌条件下，首先用灭菌牙签按照菌斑形状划破，后用无菌的镊子轻轻夹出，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到离心管中，采用塑料研磨棒磨成粉末，加入1mL SM缓冲液，旋涡振荡，离心获取含有噬菌体粒子的上清液。
优选，步骤(5)中，所述的适宜梯度是10-2、10-3、10-4梯度稀释。
本发明的主要原理是：弧菌作为一种条件致病菌，易导致对虾等经济养殖动物患病。因此相比于天然海水，弧菌在对虾体内的丰度相对较高，弧菌噬菌体的裂解量一般达到100左右，表明单个感染弧菌细胞内可装配噬菌体粒子的数量一般可达到100个，因此对虾体内的弧菌是噬菌体潜在的最大来源，可以大幅提高分离获得弧菌噬菌体的成功率。
有益效果
(1)分离富集噬菌体的样品对虾广泛存在，可随时获得，减少了工作量，大幅缩减了分离获得噬菌体的时间；
(2)本发明中采用了氯仿对匀浆液进行处理，一方面可裂解杀死原样品中的弧菌，防止污染，另外一方面可大量释放样品中弧菌细胞内的噬菌体，大幅提高样品中有效噬菌体的含量；
(3)相对于利用海水分离弧菌噬菌体，分离获得弧菌噬菌体的成功率大幅提高。
附图说明
图1为使用双层平板法分离得到的溶藻弧菌E110噬菌体噬菌斑。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。
实施例1副溶血弧菌噬菌体的分离
一种利用对虾肠道高效富集、快速分离副溶血弧菌噬菌体的方法
步骤1：对虾肠道匀浆：取10只对虾肠道，加入氯仿50μL后，用研钵研磨匀浆至糊状，往匀浆糊状物中，加入8mL灭菌海水，震荡混匀，于10000g，离心5min，小心吸除最上层400μL的液体，再小心吸取剩下的上清液至另一个新的离心管，用0.45μm一次性过滤器过滤，收集噬菌体初级滤液，4℃保存备用。
步骤2：以对虾急性肝胰腺坏死病的病原菌--副溶血弧菌SHY1833为裂解靶弧菌，初步分离噬菌体过程：使用含2％NaCl的LB培养基，30℃培养副溶血弧菌3～4h，按副溶血弧菌菌液占噬菌体初级滤液体积的1％的比例，取80μL副溶血弧菌菌液加至步骤(2)的噬菌体初级滤液，得到混合液；取混合液5mL，加入含2％NaCl LB培养基2mL，作为实验组；作为对照组，将噬菌体初级滤液替换为灭菌海水即可。37℃摇床培养(转速200rpm)，摇床培养过程中观察实验组与对照组的差异，如果对照组的副溶血弧菌生长良好，而实验组的副溶血弧菌生长慢或出现澄清，表明噬菌体感染富集成功，立即停止培养，所需培养时间为3h。于12000g、离心5min，小心吸取上清液，将上清液用0.45μm一次性过滤器过滤，取滤液，将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，得到各级稀释滤液，备用。
步骤3：使用含2％NaCl的LB培养基、30℃过夜培养副溶血弧菌，次日再按1％v/v接种量接种于含2％NaCl的新鲜LB培养基中，培养至OD600 nm约为0.6，得到宿主菌。以LB固体培养基(含1.5％琼脂和2％NaCl)制备下层培养基平板备用，每个平板培养基用量为6mL。分别将步骤(2)的各级稀释滤液100μL与宿主菌10μL混合，得到混合液，将混合液加入到温度至50℃的6mL LB培养基(含0.7％琼脂和2％NaCl)中，迅速上下颠倒混匀，立即倾倒在制备的下层培养基平板上，待冷却凝固后，30℃倒置培养过夜，得到双层平板。
步骤4：离心获得包含噬菌体粒子的上清液:取噬菌斑数量为50～500PFU的双层平板，进行噬菌体的纯化及分离，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形状的噬菌斑进行纯化，具体步骤为：无菌条件下，首先用灭菌牙签按照菌斑形状划破，后用无菌的镊子轻轻夹出，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到离心管中，采用塑料研磨棒磨成粉末，加入1mL SM缓冲液，旋涡振荡，离心获取含有噬菌体粒子的上清液。
步骤5：噬菌体的纯化：使用SM缓冲液对步骤4中获取的含噬菌体的上清液做10-2、10-3、10-4梯度稀释，按照步骤3至4进行噬菌斑的培养与纯化，重复此步骤4～5次，直至得到均一噬菌斑。
步骤6：噬菌体的富集；取纯化后多个大小一致的噬菌斑，经一次性塑料研磨棒磨碎后加入1mL SM缓冲液磨碎后，于12000g、离心2min。取100μL上清与50μL过夜培养的副溶血弧菌菌液混匀，加入到5mL含2％NaCl的LB培养基中，37℃培养3～6h，至菌液透明裂解。于12000g、离心2min，取上清液，将上清液用0.45μm一次性过滤器过滤，收集过滤液即为分离获得副溶血弧菌噬菌体。
实施例2溶藻弧菌E110噬菌体的分离
一种利用对虾肠道高效富集、快速分离溶藻弧菌E110噬菌体HH109的方法
步骤1：对虾肠道匀浆：取10只对虾肠道，加入氯仿50μL后，用研钵研磨匀浆至糊状，往匀浆糊状物中，加入8mL灭菌海水，震荡混匀，于10000g，离心5min，小心吸除最上层400μL的液体，再小心吸取剩下的上清液至另一个新的离心管，用0.45μm一次性过滤器过滤，收集噬菌体初级滤液，4℃保存备用。
步骤2：以致病菌溶藻弧菌E110为裂解靶弧菌，分离噬菌体过程：使用含2％NaCl的LB培养基，30℃培养溶藻弧菌E110 3-4h，按溶藻弧菌菌液占噬菌体初级滤液体积的1％的比例，取80μL溶藻弧菌菌液加至步骤(2)的噬菌体初级滤液，得到混合液；取混合液5mL，加入含2％NaCl LB培养基2mL，作为实验组；作为对照组，将噬菌体初级滤液替换为灭菌海水即可。30℃摇床培养(转速200rpm)，摇床培养过程中观察实验组与对照组的差异，如果对照组的溶藻弧菌E110生长良好，而实验组的溶藻弧菌生长慢或出现澄清，表明噬菌体感染富集成功，立即停止培养，所需培养时间为3h。于12000g、离心5min，小心吸取上清液，将上清液用0.45μm一次性过滤器过滤，取滤液，将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释，得到各级稀释滤液，备用。
步骤3：使用含2％NaCl的LB培养基、30℃过夜培养溶藻弧菌，次日再按1％v/v接种量接种于含2％NaCl的新鲜LB培养基中，培养至OD600 nm约为0.6，得到宿主菌。以LB固体培养基(含1.5％琼脂和2％NaCl)制备下层培养基平板备用，每个平板培养基用量为6mL。分别将步骤(2)的各级稀释滤液100μL与宿主菌10μL混合，得到混合液，将混合液加入到温度至50℃的6mL LB培养基(含0.7％琼脂和2％NaCl)中，迅速上下颠倒混匀，立即倾倒在制备的下层培养基平板上，待冷却凝固后，30℃倒置培养过夜，得到双层平板。
步骤4：离心获得包含噬菌体粒子的上清液:取噬菌斑数量为50～500PFU的双层平板，进行噬菌体的纯化及分离，根据噬菌斑的大小，挑取数个不同形状的噬菌斑进行纯化，具体步骤为：无菌条件下，首先用灭菌牙签按照菌斑形状划破，后用无菌的镊子轻轻夹出，即可获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到离心管中，采用塑料研磨棒磨成粉末，加入1mL SM缓冲液，旋涡振荡，离心获取含有噬菌体粒子的上清液。
步骤5：噬菌体的纯化：使用SM缓冲液对步骤4中获取的含噬菌体的上清液做10-2、10-3、10-4梯度稀释，按照步骤3至4进行噬菌斑的培养与纯化，重复此步骤4～5次，直至得到均一噬菌斑。
步骤6：噬菌体的富集；取纯化后多个大小一致的噬菌斑，经一次性塑料研磨棒磨碎后加入1mL SM缓冲液磨碎后，于12000g、离心2min。取100μL上清与50μL过夜培养的溶藻弧菌菌液混匀，加入到5mL含2％NaCl的LB培养基中，37℃培养3～6h，至菌液透明裂解。于12000g、离心2min，取上清液，将上清液用0.45μm一次性过滤器过滤，收集过滤液即为分离获得溶藻弧菌噬菌体。
以上是本发明的原理和最佳实施例，应当指出的是，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (10)

1.一种利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：取对虾肠道，加入氯仿后研磨匀浆，加入海水并离心后取上清液并过滤，得到噬菌体初级滤液；将噬菌体初级滤液与所靶向的目标弧菌菌液混合培养，离心取上清液，将上清液过滤，将获取的滤液进行梯度稀释，得到各级稀释滤液；分别将各级稀释滤液与宿主菌混合，并向混合液中加入LB液体培养基，迅速混匀后立刻倾倒在LB固体培养基上，冷却凝固后，倒置培养过夜，得到双层平板；在双层平板中挑取噬菌斑，捣碎后加入缓冲液中，离心获得包含噬菌体粒子的上清液并将噬菌体纯化并富集，得到弧菌噬菌体。
2.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，将对虾肠道匀浆具体为：取鲜活对虾，用灭菌的解剖刀和镊子取出多只对虾肠道，按质量体积比(W/V)1.0～1.5％加入氯仿，研磨匀浆至糊状，得到对虾肠道匀浆糊状物。
3.根据权利要求1或2所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，所述海水为灭菌海水，对虾肠道匀浆糊状物与海水的质量体积比为1:4；离心速度为10000g，时间为5～15min；对虾肠道匀浆糊状物离心后采用0.45μm一次性过滤器过滤。
4.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，目标弧菌菌液的加入量为噬菌体初级滤液体积的1％；噬菌体初级滤液与所靶向的目标弧菌菌液混合后在30℃、200rpm摇床培养3～12h；之后在转速12000g的条件下离心2～5min；所述梯度稀释是将滤液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释。
5.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，所述各级稀释滤液与宿主菌混合的体积比为10:1；所述LB液体培养基的温度为50℃，琼脂含量为0.7％，并含有2％NaCl；所述的LB固体培养基为LB培养基中加入1.5％琼脂制得。
6.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，挑取噬菌斑的方法为：无菌条件下，首先用灭菌牙签按照菌斑形状划破，后用无菌的镊子轻轻夹出，获得整个噬菌斑；将含有噬菌斑的胶块转移到离心管中，采用塑料研磨棒磨成粉末，加入1mL SM缓冲液，旋涡振荡，离心获取含有噬菌体粒子的上清液。
7.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，噬菌体纯化的步骤为：用SM缓冲液对噬菌体液进行倍比稀释，取适宜梯度加入宿主菌制成双层平板，重复此步骤4～5次，直至得到均一噬菌斑；所述适宜梯度是10-2、10-3、10-4梯度稀释。
8.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，宿主菌的培养步骤为：使用LB培养基培养目标弧菌至OD600为0.6～1.0，得到宿主菌。
9.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，取噬菌斑数量为50～500PFU的双层平板，挑取数个不同形状的噬菌斑，捣碎后加入SM缓冲液中。
10.根据权利要求1所述的利用对虾肠道高效富集、快速分离弧菌噬菌体的方法，其特征在于，噬菌体的富集步骤包括：取纯化后多个大小一致的噬菌斑，磨碎后进行纯化，将上清液过滤，收集过滤液，得到弧菌噬菌体。
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