CN107119024A

CN107119024A - 杀鲑气单胞菌噬菌体、包含其的杀菌组合物及其应用

Info

Publication number: CN107119024A
Application number: CN201710250594.5A
Authority: CN
Inventors: 马迎飞; 陈玲; 袁盛建
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2017-04-17
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2017-09-01
Anticipated expiration: 2037-04-17
Also published as: CN107119024B

Abstract

本发明涉及杀鲑气单胞菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物和应用。该噬菌体可在短时间内快速抑制大西洋杀鲑气单胞菌的生长，并抑制该病原菌噬菌体抗性的产生。此外，该噬菌体的杀菌组合物安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。

Description

杀鲑气单胞菌噬菌体、包含其的杀菌组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及杀鲑气单胞菌噬菌体、包含其的杀菌组合物及其应用。

背景技术

大西洋杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)属于变形菌门下气单胞菌属的革兰式阴性杆菌，在水环境中分布极为广泛，尤其是水生动物的肠道中，是导致鲑鳟鱼类发生疖疮病及溃肠病的主要致病菌。杀鲑气单胞菌的宿主范围广，在某些情况下，能引发让人和动物肠道内外的多种感染性疾病。在高密度养殖的条件下，由于杀鲑气单胞菌具有很高的致死性和发病率，该类致病菌被认为是引起多种水生动物爆发性死亡的主要原因之一，每年对鲑鳟鱼类造成十分严重的损失。此外，该类致病菌能感染非鲑科鱼类，给水产养殖带来了巨大的经济损失。

临床上由于对发病鱼的病因没有明确的认识，导致抗生素的滥用，既造成养殖户经济损失，也影响了水产品的质量安全。针对水产养殖中鲑鳟鱼类出现的疖疮病及溃肠病，采用的主要预防和控制方式即大量投入使用抗生素。虽然使用抗生素被认为是当前治疗细菌感染最有效的方式，但庞大的抗生素生产和消耗模式同时也极大助长了耐药菌的形成，并使得致病菌的耐药性问题日益严重。目前报道，在罹患病的动物体内已发现一株广谱耐药性杀鲑气单胞菌，其耐药性范围多达9种以上。

噬菌体是一类能感染细菌的病毒，在环境中广泛存在。噬菌体具有极高的宿主特异性，通过感染特定靶向宿主实现自我生长和繁殖，并最终导致宿主菌的裂解死亡，而对其他菌群和人体无影响。噬菌体疗法是指利用噬菌体专一裂解性杀死病原菌以治疗病原菌感染导致的疾病的治疗手段。利用噬菌体控制致病菌的理论，早在噬菌体被发现后不久即被提出，并成功用于细菌感染性疾病的治疗案例中。然而，由于抗生素的发现，削弱了噬菌体在这方面的应用，但在东欧国家噬菌体作为抗菌剂的应用一直持续至今。

近十年来，由于抗生素滥用导致大量耐药菌甚至超级细菌的出现，针对细菌感染性疾病的噬菌体疗法又重新回归人们的视线，并逐渐受到高度重视。当前，在大部分东欧国家及美国，噬菌体已广泛应用于环境、工业和农业等领域，尤其是食品加工生产过程中对食源性疾病的预防控制。此外，当前各国科学家致力于通过构建模型研究噬菌体侵染宿主菌的机理特性，并试图将噬菌体产品应用于临床上预防控制流行病学的研究中。作为应对抗生素抗性的重要武器之一，噬菌体的临床应用潜力巨大。但就其当前单一噬菌体疗法的应用而言，其在应用过程中逐渐出现一些潜在的缺点，如可裂解宿主谱范围窄，裂解一定量宿主需要的剂量高，宿主短时间内进化出噬菌体的抗性等。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一方面提供除了专一性裂解气单胞菌属例如杀鲑气单胞菌外，还对肠杆菌科例如沙门氏杆菌、弧菌及大肠杆菌有一定裂解性的噬菌体。

本发明一方面涉及杀鲑气单胞菌噬菌体(Aeromonas salmonicida phage)，保藏名为AS-YJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为： CCTCC M 2017095；保藏时间为：2017年3月6日。

该噬菌体均保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏时间为：2017年3月6日。经保藏中心于2017年3月11日检测为存活菌株。

本发明的噬菌体不仅能裂解气单胞菌属例如杀鲑气单胞菌，而且还能裂解肠杆菌科例如沙门氏杆菌、弧菌及大肠杆菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中的噬菌体筛选流程图；

图2为杀鲑气单胞菌噬菌体的噬菌斑形态；

图3为杀鲑气单胞菌噬菌体的吸附曲线；

图4为杀鲑气单胞菌噬菌体的一步生长曲线；

图5为宿主与单株杀鲑气单胞菌噬菌体混合的感染曲线图；A： MOI＝0.1；B：MOI＝1；

图6为宿主与杀鲑气单胞菌噬菌体鸡尾酒混合的感染曲线图。

本发明所提供的杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ(Aeromonas salmonicida phage AS-YJ)，保藏号为CCTCC NO:M 2017095；

本发明所提供的杀鲑气单胞菌噬菌体AS-GZ(Aeromonas salmonicida phage AS-GZ)，保藏号为CCTCC NO:M 2017094；

本发明所提供的杀鲑气单胞菌噬菌体AS-SW(Aeromonas salmonicida phage AS-SW)，保藏号为CCTCC NO:M 2017093；

本发明所提供的杀鲑气单胞菌噬菌体AS-SZW(Aeromonas salmonicida phage AS-SZW)，保藏号为CCTCC NO:M 2017092；

本发明所提供的杀鲑气单胞菌噬菌体AS-ZJ(Aeromonas salmonicida phage AS-ZJ)，保藏号为CCTCC NO:M 2017091；

上述菌株的保藏地址均为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏时间均为：2017年3月6日。均经保藏中心于2017年3月16日检测为存活菌株。

具体实施方式

本发明的第一方面提供除了专一性裂解杀鲑气单胞菌属例如杀鲑气单胞菌外，还对肠杆菌科例如沙门氏杆菌、弧菌及大肠杆菌裂解性的噬菌体。

含有如上所述噬菌体的杀菌组合物。

本发明建立了一种可行的方法从环境中高效快速的分离广谱耐药大西洋杀鲑气单胞菌的噬菌体。在一种实施方式中，通过认识单一噬菌体对于侵染宿主的特性，评估单一噬菌体的感染能力，采用一定的混合方法构建噬菌体鸡尾酒，最后通过特定指标确定最佳的鸡尾酒组成，该噬菌体鸡尾酒既具有噬菌体的专一性特征，又弥补了单一噬菌体疗法易导致宿主菌抗性的不足，应用前景广泛。

本发明提供的噬菌体杀菌组合物可在短时间内快速抑制大西洋杀鲑气单胞菌的生长，并抑制该病原菌噬菌体抗性的产生。此外，该噬菌体鸡尾酒安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。

本发明还涉及一种含有如上所述噬菌体和/或其突变体的杀菌组合物，用于治疗和/或预防动物例如鱼类疖疮病或溃疡病。

本发明还涉及一种含有如上所述噬菌体和/或其突变体的杀菌组合物，用于杀灭和/或预防杀鲑气单胞菌、沙门氏杆菌、弧菌及大肠杆菌。

优选的，所述杀菌组合物还包括杀鲑气单胞菌噬菌体AS-GZ，保藏号为：CCTCC M2017094；

杀鲑气单胞菌噬菌体AS-SW，保藏号为CCTCC M 2017093；

杀鲑气单胞菌噬菌体AS-ZJ，保藏号为CCTCC M 2017091；以及

杀鲑气单胞菌噬菌体AS-SZW，保藏号为CCTCC M 2017092中的一种或多种；

上述噬菌体均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为：2017年 3月6日。经保藏中心于2017年3月11日检测为存活菌株。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ以及AS-GZ。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-GZ以及AS-ZJ。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-GZ以及AS-SW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-GZ以及AS-SZW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-GZ、AS-SW以及AS-ZJ。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-GZ、AS-SW以及AS-SZW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-GZ、AS-ZJ以及AS-SZW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-GZ、AS-SW、AS-SZW以及AS-ZJ。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ以及AS-ZJ。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ以及AS-SW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ以及AS-SZW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-SW以及AS-ZJ。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-SW以及AS-SZW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-ZJ以及AS-SZW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物中的有效成分主要为杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、AS-SW、AS-ZJ以及AS-SZW。

在本发明的一些实施方式中，所述杀菌组合物还包括AS-GZ的突变体、 AS-SZW的突变体、AS-YJ的突变体、AS-ZJ的突变体以及AS-SW的突变体中的一种或多种

优选的，所述突变体序列至少90％与相应的噬菌体的天然序列相同。

由于病毒在复制过程中非常容易发生突变，因而优选的，上述噬菌体的突变体也在本申请请求保护的范围内。AS-GZ、AS-SZW、AS-YJ、AS-ZJ、 AS-SW的突变体至少90％与所述噬菌体的天然序列相同；且所述突变体具有与最初的噬菌体大致相同的灭杀病原菌的功能。更优选的，突变体有 92％、94％、96％、98％或99％与各自对应的噬菌体的天然序列相同。

噬菌体AS-GZ、AS-SZW、AS-YJ、AS-ZJ、AS-SW的突变体可为点突变、缺失突变或添加突变，相对于最初的噬菌体序列，有1个、2个、3个、 4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多碱基可发生变化。对于本领域技术人员来说，根据本发明提供的噬菌体筛选出与其性状相似的突变体并不需要付出创造性的劳动。

如上所述，噬菌体可以以足够高的浓度存在以诱导溶菌作用，当混配成混合物时，优选的，如上所述的杀菌组合物，所述组合物中每种杀鲑气单胞菌噬菌体的含量≥10⁶PFU/mL；

优选的，如上所述的杀菌组合物，所述组合物中每种杀鲑气单胞菌噬菌体的含量为10⁶PFU/mL～10¹⁰PFU/mL，更优选为10⁶PFU/mL～10⁹PFU/mL，更优选为10⁶PFU/mL～10⁸PFU/mL，更优选为10⁶PFU/mL～10⁷PFU/mL，还可以取2×10⁶PFU/mL，3×10⁶PFU/mL，4×10⁶PFU/mL，5×10⁶PFU/mL，6 ×10⁶PFU/mL，7×10⁶PFU/mL，8×10⁶PFU/mL，9×10⁶PFU/mL，5×10⁷PFU/mL，5×10⁸PFU/mL，5×10⁹PFU/mL等中间数值。

优选的，当AS-YJ与AS-GZ，AS-SW，AS-ZJ，AS-SZW中的一种或多株进行混配时，按感染复数等比的方式进行混合。

优选的，如上所述的杀菌组合物，所述杀菌组合物还包括辅料；

所述辅料为SM缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种；

SM缓冲液的配制方法为常规方法，例如：NaCl 5.8g，MgSO₄·7H₂O 2g， 1mol/L的Tris·HCl 50ML(pH＝7.0)，5mL 2％gelatin，加入纯净水补足至 1000mL。

优选的，所述杀菌组合物还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。

上述杀菌组合物可作为病毒制剂使用，所用剂型可为各种常见剂型，例如粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂、膏剂等。

优选的，如上所述的杀菌组合物在杀灭杀鲑气单胞菌、沙门氏杆菌、弧菌及大肠杆菌中的应用；所述应用为治疗用途或非治疗用途。

优选的，如上所述的杀鲑气单胞菌噬菌体、或杀菌组合物在制备用于防治动物疖疮病或溃疡病的药物中的应用；

优选的，如上所述的应用，所述动物包括：温血性动物和部分冷血性动物

优选的，如上所述的应用，所述动物为鱼类；

优选的，如上所述的应用，所述鱼类为鲑科鱼类；

更优选的，如上所述的应用，所述鲑科鱼类包括马苏大麻哈鱼、驼背大麻哈鱼、大麻哈鱼、石川哲罗鱼，哲罗鱼、虎嘉鱼、细鳞鲑、白斑红点鲑、花羔红点鲑、北鲑、乌苏里白鲑、卡达白鲑，大西洋鲑、太平洋鲑、银鲑、虹鳟、河鳟、金鳟。

一种防治鱼类疖疮病或溃疡病的方法，将如上所述的杀菌组合物作为药物添加到鱼饲料中，或对鱼类体表喷雾，或给鱼类灌服，或给鱼类注射，或将所述杀菌组合物溶于水中再与鱼类接触。

优选的，如上所述的方法，所述鱼类为鲑科鱼类；

更优选的，如上所述的方法，所述鲑科鱼类包括马苏大麻哈鱼、驼背大麻哈鱼、大麻哈鱼、石川哲罗鱼，哲罗鱼、虎嘉鱼、细鳞鲑、白斑红点鲑、花羔红点鲑、北鲑、乌苏里白鲑、卡达白鲑，大西洋鲑、太平洋鲑、银鲑、虹鳟、河鳟、金鳟。

在一些实施方式中，本发明针对由大西洋杀鲑气单胞菌导致水产品鲑鳟鱼类发生疖疮病及溃肠病的问题，在抗生素滥用引起的杀鲑气单胞菌耐药性出现及单一噬菌体应用缺陷的基础上，以从皮肤溃烂的大西洋鲑肌肉、肝、肾病灶中分离得到的一株致病性杀鲑气单胞菌为宿主，采用双层平板法，从水环境中分离得到10株裂解性噬菌体，通过认识单一噬菌体的侵染特性，从而评估其对宿主菌的感染能力，最后采用一定的混合方法构建并确定最佳的鸡尾酒组成。该噬菌体鸡尾酒可在短时间内快速抑制大西洋杀鲑气单胞菌的生长，并抑制该病原菌噬菌体抗性的产生。该噬菌体鸡尾酒安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明公开了一种用于高效裂解大西洋杀鲑气单胞菌噬菌体鸡尾酒制剂研究。以从皮肤溃烂的大西洋鲑肌肉、肝、肾分离的一株广谱耐药的致病性杀鲑气单胞菌为宿主，从水环境中分离得到10株裂性噬菌体，裂解直径均大于0.3mm，以单株噬菌体裂解效率评价得到最佳感染比例MOI为 0.1，参考单株噬菌体的吸附曲线、一步生长曲线和最高效价等指标筛选可加入噬菌体鸡尾酒的单株噬菌体为AS-SZW，AS-YJ，AS-ZJ，AS-SW， AS-GZ。通过排列组合，以宿主菌与噬菌体共培后宿主菌的裂解量及裂解时间为依据，得到一组短时间内高效裂解大西洋杀鲑气单胞菌的噬菌体鸡尾酒组合。此外，为进一步分析该噬菌体鸡尾酒的环境耐受性分析，确定了从以上两组噬菌体鸡尾酒组合的pH耐受性范围为3～11，70℃温度下仍具有一定的活性，且海水中培养7d效价略有降低，约为80％。采用常规液体混合的方式，该噬菌体鸡尾酒可快速抑制大西洋杀鲑气单胞菌的生长，在80h范围内生长曲线OD600值为0.05以下。以上五株噬菌体AS-SZW， AS-YJ，AS-ZJ，AS-SW，AS-GZ均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年3月6日，保藏编号分别为CCTCC M 2017092、CCTCC M 2017095、CCTCC M 2017091、CCTCC M 2017093、CCTCC M 2017094。本发明噬菌体的筛选流程图如图1所示。具体的，本发明以市面上常用抗生素种类为基础，采用扩散法(K-B法)检测该致病菌对氯霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、四环素、头孢噻肟、多西环素、吡哌酸、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢唑肟、头孢唑啉、庆大霉素、复方新诺明、利福平、万古霉素、红霉素、链霉素、新霉素、卡纳霉素、妥布霉素、青霉素、新霉素、呋喃唑酮、呋喃妥因等24种药物的药敏试验，确认该致病性杀鲑气单胞菌对前11种抗生素具有很强的耐药性。

以上步中确认的杀鲑气单胞菌为宿主，采用双层平板法并结合样品特征从海水样品中分离噬菌体，通过多次感染确定透明斑，挑取单一噬菌斑进行分离纯化，最终于-80℃甘油(20％)保存。本次分离及后续分析所用培养基均为LB肉汤/琼脂培养基，双层平板中，底层为1.5％LB琼脂培养基，上层为0.7％琼脂培养基。

采用噬菌体基因组抽提试剂盒(Aidlab,DN22)提取各噬菌体的基因组，后用Miseq平台进行全基因组测序，对测序结果进行序列的拼接及注释，序列经Blastn比对后确定AS-SZW，AS-YJ，AS-ZJ，AS-SW和AS-GZ 五株噬菌体均为杀鲑气单胞菌噬菌体，其中前4株噬菌体与已报道的 Aeromanas phage CC2全基因组序列相似性分别为97％，97％，96％，96％，AS-GZ与已报道的杀鲑气单胞菌噬菌体phiAS4的相似性为97％。

单一噬菌体形态学和微生物学水平的评价：1)形态观察：单一噬菌体感染宿主菌后，铺双层平板，30℃培养12h后，用游标卡尺测定原始透明斑大小，得到噬菌体AS-SZW，AS-YJ，AS-ZJ，AS-SW，AS-GZ的大小分别为0.83mm，0.48mm，0.5mm，0.5mm，1mm。噬菌斑形态如图2所示。 2)吸附能力的测定：以MOI＝0.005混合噬菌体与对数期的宿主菌(杀鲑气单胞菌)，按照预设置时间点(0，1，2，3，4，5，6，10，20，30min) 取混合培养液，16000g离心后，采用双层平板法测定游离态噬菌体，根据减法得到AS-SZW，AS-YJ，AS-ZJ，AS-SW，AS-GZ吸附时间分别为5min， 10min，10min，5min，20min；噬菌体的吸附曲线如图3所示。3)噬菌体一步生长曲线的测定，MOI为0.01(宿主OD600＝0.5)，宿主菌与噬菌体预先30℃下孵育5min，然后12000r/min离心30s，去掉清液，加入5ml LB 悬浮，最后30℃下培养，每隔10min取样，共培养90min(AS-SW为120min)。测定样品的效价，得到AS-SZW，AS-YJ，AS-ZJ，AS-SW，AS-GZ的裂解周期分别为80min、40min、40min、100min和60min，裂解量分别为145、 98、86、86和135；噬菌体的一步生长曲线如图4所示。4)宿主谱的测定，并根据感染培养后双层平板上透明斑形成的特征，评价噬菌体对选定的40 株指示菌的敏感性(表1所示)，得到以上5株噬菌体除能专一性裂解气单胞菌属下的杀鲑气单胞菌外，对肠杆菌科下的部分沙门氏杆菌、弧菌及大肠杆菌具有微弱的裂解性。此外，采用通用方法测定上述实验结果中确定的最佳噬菌体鸡尾酒AS-cocktail2-2,5的宿主谱范围，得到宿主谱为单株噬菌体AS-YJ和AS-GZ的叠加。

表1本发明提供的5株噬菌体及最佳鸡尾酒组合的宿主谱

注：“-”表示不具有感染性，“+”表示有感染性，形成透明圈，但未形成透明斑，“++”表示有强烈的感染性，能形成透明斑；“*”表示为本专利内容噬菌体的宿主菌

噬菌体鸡尾酒的组合方法：以四种感染复数(MOI＝0.01，0.1，1或10) 混合单株噬菌体与宿主菌，根据宿主菌感染噬菌体后的生长曲线(图5)测定(OD600值)评价噬菌体裂解效率，确定最佳MOI值，并根据最佳MOI 进行宿主菌的噬菌体感染，以排列组合方式将预选噬菌体进行混合，各组合按照1:1，1:1:1，1:1:1:1或1:1:1:1:1进行混合后，将对数期的宿主菌与噬菌体进行混合共培养。

最佳噬菌体鸡尾酒的确定：噬菌体与宿主菌混合共培养后，通过测定培养液OD600值的变化，绘制宿主菌的生长曲线(图6)，确定最佳噬菌体鸡尾酒组合；其中图中标号1、2、3、4、5依次代表AS-SZW，AS-YJ， AS-ZJ，AS-SW和AS-GZ五株噬菌体。测定时长为80h。得到最佳噬菌体鸡尾酒组合为Cocktail2-2,5(即AS-YJ与AS-GZ)，其在80h范围内生长曲线OD600值为0.01以下

最佳噬菌体鸡尾酒环境因子耐受性的评价：测定上述实验结果中最佳鸡尾酒组合的pH、温度及在海水中的耐受性。其中pH、温度耐受性的测定为：一定量效价的噬菌体(100ul，10⁸PFU/mL)加入到含900ul液体(LB 液体培养基)的1.5mL的EP管中，在不同pH(pH＝2，4，6，8，10，12；用0.1mol的HCl或NaOH调节至指定pH)和温度(4℃，20℃，37℃，60℃，80℃)下培养，后取样稀释适当倍数并立刻铺双层平板确定效价。其中pH 的测定时间为3h，温度设置时间为每隔15min取样，共测定45min。海水环境中的耐受性测定与温度测定一致，一定量效价的噬菌体(100ul， 10⁸PFU/mL)加入到含900uL海水(海水样品取自深圳湾、深圳大梅沙、惠州巽寮湾和珠海口岸，8000r/min离心10min，0.22μm过滤)的1.5mL的 EP管中，于20℃下培养，每隔1d取样，培养一周(7d)，测定噬菌体活性，测定噬菌体活性。得到该噬菌体鸡尾酒在pH 3～11之间仍具有活性，其最适pH值为8，在60℃温度下30min仍保持一定的裂解活性，约为70％， 37℃及以下温度对其活性影响不大，80℃下30min失活，其裂解活性低于检测线，海水中培养7d中的效价无显著降低，且各海水样品之间无差异。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.杀鲑气单胞菌噬菌体(Aeromonas salmonicida phage)，保藏名为AS-YJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2017095；保藏时间为：2017年3月6日。

2.含有权利要求1所述的杀鲑气单胞菌噬菌体的杀菌组合物。

3.根据权利要求2所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物还包括杀鲑气单胞菌噬菌体AS-GZ，保藏号为：CCTCC M 2017094；

杀鲑气单胞菌噬菌体AS-SW，保藏号为CCTCC M 2017093；

杀鲑气单胞菌噬菌体AS-ZJ，保藏号为CCTCC M 2017091；以及

上述噬菌体均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为：2017年3月6日。

4.根据权利要求3所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物包括所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ以及所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-GZ；

或，所述杀菌组合物包括所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-ZJ以及所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-GZ；

或，所述杀菌组合物包括所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-YJ、所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-SW以及所述杀鲑气单胞菌噬菌体AS-GZ。

5.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物中还包括各噬菌体突变体中的一种或多种。

优选的，所述突变体至少90％与对应的杀鲑气单胞菌噬菌体的天然序列相同。

6.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物中每种杀鲑气单胞菌噬菌体的含量≥10⁶PFU/mL；

优选的，所述组合物中每种杀鲑气单胞菌噬菌体的含量为10⁶PFU/mL～10⁷PFU/mL。

7.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物还包括辅料；

优选的，所述辅料为SM缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种；

8.根据权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物的剂型为粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂、膏剂。

9.权利要求1所述的杀鲑气单胞菌噬菌体、或权利要求2～8任一项所述的杀菌组合物在杀灭和/或预防杀鲑气单胞菌、沙门氏杆菌、弧菌及大肠杆菌中的应用。

10.权利要求1所述的杀鲑气单胞菌噬菌体、或权利要求2～8任一项所述的杀菌组合物在制备用于治疗和/或预防动物例如鱼类疖疮病或溃疡病的药物中的应用；

优选的，所述鱼类为鲑科鱼类；

更优选的，所述鲑科鱼类包括马苏大麻哈鱼、驼背大麻哈鱼、大麻哈鱼、石川哲罗鱼，哲罗鱼、虎嘉鱼、细鳞鲑、白斑红点鲑、花羔红点鲑、北鲑、乌苏里白鲑、卡达白鲑，大西洋鲑、太平洋鲑、银鲑、虹鳟、河鳟、金鳟。