JPS6384484A - 特殊なマイコプラズマ膜抗原および抗体とその臨床的応用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 マイコプラズマ（ミコプラズマ）は、人ｍＫ知られてい
る最小の独立して生存する微生物である。これは、バク
テリヤよシも小さく、大ていのウィルスよシ大きく、約
１０　Ｘ　２００　ｎｍの寸法をもつ。固い細胞壁をも
たず、極めて多形態であシ、染色しにくいため、各個体
を光学顕微鏡で確認するのは極めて困難である。事実ヒ
トの初期の変則的肺炎および上部気管の感染を起こす病
原菌であるマイコプラズマニューモニアエ（Ｍ、ニュー
モニア二）種ハ、イー）ン試剤および胸膜肺炎状の生体
（ＰＰＬＯ）というような悪名を初めに与えられた。細
胞を含まない培地中でのこの生体の培養は１０００年代
初期までは成功しなかった。患者の分泌物からＭ、ニュ
ーモニア二を単離し、増殖し、特定する方法は、高度に
技術的であシ、二三の研究所でだけ日常的に実施された
。大ていの臨床実験室は冷凝集素試験およびＭＧストレ
プトコッカヌ試験のような非特異的血清学試験か、また
はヒトのＭ、ニューモニアエ感染の診断を確定するため
の相補固定試験にたよっている。〔Ｐ。

Ｂ１ビーソンおよびＷ１マツクデルモット著、１９７５
年フィラデルフィア、ＷｌＢ、サランダースカンパニー
刊、医学テキストブック２７０〜２７４頁、Ａ、Ｉ、ブ
ラウト著、１９８１年フィラデルフィア、Ｗ、Ｂ、サウ
ンダーヌ力ンパニー刊、医療微生物学および伝染病、９
２５〜９２９頁、Ｊ、Ｅ、ペニングトン著、１９８３年
ニューヨーク、ラーベンプレス刊、呼吸器伝染病：診断
および処置、２５１〜２５７頁〕 多くの研究者が、固形または液状の培地中で生長したＭ
１１ニューモニア二抗原として用いる間接螢光抗体法を
使おうとした。１９６２年に、ンヤノック、ベイフリッ
クおよびパライルは、固形の寒天培地からガラススライ
ドへのマイコプラズマ集落の移植および、Ｍ、ニューモ
ニア二の感染から回復しつつある患者の回復期の血清試
料中のこれらの集落に対する特異的抗体の表示の成功を
報告している（Ｒ，Ｍ’、シャノック、ＬＮペイフリッ
ク、およびＭ’、Ｆ、パ〕。しかし、微生物の集落はほ
とんど寒天の中に埋まっておシ、機械的なかきとシでは
簡単に除去されないので、研究者は成長した集落をもっ
た寒天培地をスライドの上に置き、寒天を除くために、
その温度を少くとも８０’ないし８５°Ｃに上げること
によって寒天を溶融しなければならなかった。残念なが
ら、それによって、抗原は部分的に変性され、この方法
は、臨床実験室において診断の目的で付着した集落をも
った多数のスライドをつくるのに使うことは出来ない。

１９７８年に、シリスおよびアンドリュウスは、固形培
地中で成長した集落の代わりに、間接螢光抗体試験のた
めの抗原として、Ｍ、ニューモニアエの液状培養物から
の粒状沈降物を使用して加熱工程を省きうろことを示唆
している。

この粒状沈降物は多分マイコプラズマ集落である〔Ｍ１
シリスおよびＢｌＥ、アンドリュウヌ：マイコプラズマ
ニューモニアエ・ＩｆＭＶ）７’ｃメの簡単な試験、ツ
エントラルプラットフユアバクテリオロジー、■、アブ
タイ請ネ゛オリシナール、２４１：２３９〜２４０頁１
９７８年〕。

しかし、この方法は、その沈降物または全集落の抗原特
異性が立証されていないので広く使用されてはいない。

この著者らの原抄録は抗原の調製法について詳細な技術
を何も含んでいない。

一般に、使用される方法は、方法の詳細を記述している
最近の２件の論文に示されているようなアセトン固定で
ある（Ｄ、Ｗ、バック、Ｒ％Ｈ１ヶネットおよびＧ、マ
ツクガリテイ：細胞培養マイコプラズマに特異的なモノ
クローナル抗体、インビトロ、１８巻３７７〜３８１頁
、１９８２年、Ｋ、リント、Ｂ１　リンドハμト、Ｈ，
Ｊ、シュラテン、Ｊ　％ブロムおよびＣ，クリステイア
ンセン：マイコプラズマゲニタリアムおよびマイコプラ
ズマニューモニアエの間の血清学的相互反応、ジャーナ
ルオプマイクロバイオロジ−２０巻：１０３６〜１ｏ４
３頁、１９８４年〕。同様のアセトン固定抗原が非淋疾
性の尿道炎を起こす微生物であるマイコプラズマゲニタ
リアムに対する抗体の検出に使用されてきた（Ｐ、Ｍ１
ファーおよびＤ１テイラーロビンソン：マイコプラズマ
ゲニタリアムニ対スる抗体の検出のためのミクロ免疫螢
光法、ジャーナルオプクリニ力ルパトロジ−３７巻１０
７２〜ＩＱ７４頁、１９８４年）、これらの著者の誰も
、液状培地中に成長したミクロ集落が、シャノック、ヘ
イフリックおよびパライルの報告したような固形培地中
で成長したものと異なる結果を与えるという記述をして
いない（前述のプロシーデインダスオプナショナルアカ
デミーオブサイエンシズ、４８巻：４１〜４９頁、１９
６２年を参照のこと）。液状培地中では、マイコプラズ
マ微生物のうちわずかなパーセンテージだけが小球体ま
たはミクロ集落の形で成長する（Ｅ、Ｓ、ポートマンお
よび０１ケニイ：マイコプラズマニューモニアエ小球体
の形態学および超微細構造、ジャーナルオプパクテリオ
ロジー、１０６巻、１ｏ○５〜１ｏ１５頁、１９７１年
）。臨床実験室での使用のために、これらのミク罠集落
抗原を大量生産するコストは禁止的である。

臨床実験室における間接螢光抗体試験のために多量のＭ
、ニューモニアエ抗原を得るだめの別の方法は、カータ
ーおよびカーターが報告しているように、液状培地中で
成長し、遠心分離および冷凍乾燥され、リサーチトライ
アングルパークウエルカムラボラトリーヌから市販され
ているＭ、ニューモニアエ製剤を使うことである［：Ｊ
、Ｂ、カーターおよびＳ、Ｌ１カーター：マイコプラズ
マニューモニアエ感染症の診断のだめの急性相、間接螢
光抗体法、アンナールスオプクリニカルアンドラボラト
リーサイエンス、１３巻、１５０〜１５５頁、１９８３
年〕。

表金ながら、この物質を抗原として使うことによって、
著者らは、「Ｍ１ニューモニアエ微生物の極微小の形態
学と一致する粒状物の淡黄緑色の螢光ヌラリーとして陽
性の結果が現われる」と報告している（１５２頁）。言
いかえれば著者らは、Ｎ１、ニューモニアエ微生物を液
状培地からの他の粒状物と確信をもって区別するのが困
難なことを見出した。培養中の攪拌された液状培地中に
は、マイコプラズマ微生物以外の沈澱が必ず生成するこ
とは、マイコプラズマ研究分野の研究者によってよく認
められていることである。この沈澱は、極めて多形性の
微小な微生物と容易には区別できない。リューマチ様因
子のような非特異的免疫グロブリンＭ、の高滴定量を含
む血清試料は、陽性の結果を与えないことがある（　Ｍ
’Ｐ　−１−ＩｆＭ、ゼウヌ１　テクノロジースインコ
ーポレーション、フリースナンバ−１フ０００ ーション」＆６を参照のこと）、私書箱１７７、ラリタ
ン、ニューシャーシー州０８８６９）。

これらの他者による初期の発表論文から、Ｍ１ニューモ
ニアエ微生物を認知するための唯一の信頼できる形態学
的基準は、その集落形成特性によってであシ、すなわち
、濃縮され精製されたミクロ集落を研究することである
ことが明らかになってきた。しかし、全集落を大量生産
することは困難であシ、それは非特異的抗原と形態学的
に区別できる多量の種特異的抗原を含まないであろう。

一連の副次培養物を介して単一の生長単位を「除去Ｊ　
（　ｗｅｅｄｉｎｇ　ｏｕｔ　）することによって、透
析された粒子を含まない液状培地中での集落形成マイコ
プラズマの選択的増殖の方法を提供することが本発明の
目的である。

本発明の別の目的は、小さな断片（ｆｒａｇｍｅ−ｎｔ
　）　　にではあるが単一の成長単位にではなく静かに
ホモゲナイズすることによってマイコプラズマの塊状浮
遊集落を破壊して、接種剤（ｉ−（Ｉｏｃｕｌｕｍ　）
　ｆつくる方法を提供することにある。

接種剤は、各断片が４〜５日内にクラゲ吠物に成長する
最終の培養物（　ｃｕｌｔｕｒｅ　）の種（ｓ６−ｅｄ
　）　　として使用される。

本発明の別の目的は、特異的膜抗原の同定である。

本発明のもう一つの目的は、マイコプラズマの特異的膜
抗原を安定にするためにアルデヒド好ましくはグルター
ルアルデヒド とにある。

本発明は、顕微鏡的に容易に同定でき、高含量の種特異
的膜抗原を有するミクロ集落またはクラゲ状物中で活発
に成長するマイコプラズマ微生物を多量に産出し、安定
化する方法を提供する。患者の血清試料中のマイコプラ
ズマに対する特異的抗体を検出するために特異的膜抗原
が使用できる。それはまた、動物中での抗体泥中でトレ
ーサーとして動物抗体を使用して、マイコプラズマの特
定の膜抗原を検出できる。

本発明は、種特異的膜抗原によるマイコプラズマ集落の
多量の増殖のための技術を使う試験およびこれらの抗原
または抗体による特異的抗原−抗体反応の認知を可能に
する方法に関する。

マイコプラズマ微生物およびその抗体の検出のための免
疫螢光法の重要性はマイコプラズマニューモニアエと初
期の変則的肺炎との間の因果関係を確定することにおけ
るその役割によって強調される〔Ｃ１リュー：ジャーナ
ルオプエキスベリメンタルメデインン、１０６巻：４５
５〜４６６頁，１９５７年〕。この試験は、専問家に託
されて最適の条件下で種特異的であるようである。

免疫螢光抗原の調製用の一般的な溶剤系固定剤であるア
セトンはこれらの周辺細胞から特異的膜抗原を除去する
傾向がある。ガラスフライド上に膜抗原を保持するため
には、マイコプラズマのクラゲ状物は、アルデヒドのよ
うな非溶剤系の固定剤で固定しなければならない。使用
されるアルデヒドは、有効な結果に対して臨界的ではな
く、現在グルタールアルデヒドが選ばれたアルデヒドで
ある。ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよび
アジパルプヒトのようなジアルデヒドなどの他の脂肪族
アルデヒドも使用できる。これらのアルデヒド固定のク
ラゲ状物を抗原として使うと、Ｍ１ニューモニアエに感
染した患者の血清試料の中およびＭ１ニューモニアエク
ラゲ状物で免疫されたウサギの免疫血清の中のＭ１ニュ
ーモニアエ膜に特異的な免疫グロブリンＭおよびＧ抗体
全検出できる。

アルデヒド、トくにグルタールアルデヒドハ古い集落に
しばしば見られる非特異的体細胞（ｓ−ｏｍａｔｉｃ　
）　　抗原を抑止する。

他の研究者は、全集落（粒状沈降物）の形でか、または
スラリーとしてマイコプラズマ抗原を不活性化し保持す
るために固定剤として有機溶剤、特にアセトンを使用し
た。本発明は、この伝統的な手法が少くとも二つの概念
的および技術的欠点をもつとの認識から一部発展した。

まず、マイコプラズマ膜中の糖脂質のような二三の重要
な成分は有機溶剤で除去される。構造上、微生物の表面
に位置する膜抗原は、宿主の受容性の細胞との最初の相
互作用に最も重要な役割を演じなければならない。糖脂
質の除去は、膜の抗原の決定子の大部分を必ず分裂させ
る。ウサギ免疫およびヒト回復期の血清の両方で測定し
たＭ１ニューモニアエの主要抗原は、微生物の脂質成分
の中に見出されているＫＧ１Ｅ１Ｇ１−およびＪ、Ｔ、
グレーヌトン：ジャーナルオブイミュノロジ＋、９５巻
、１９〜２５頁、１９６５年、特に２３〜２４頁〕。

第二に、全集落または培養物スラリーを抗ふとして使用
するのは、マイコプラズマ微生物の年令が考慮に入らな
い。マイコプラズマ培養物中のエージングの過程は、膜
に付随する酵素の活性の著しい減少および滲透圧的に溶
解された細胞懸濁物から単離された膜成分中の蛋白質−
脂質比の増加を伴ない、若い生体は、古い細胞よシずつ
と生理活性が高く、脂質分の多い膜を含まねばならない
ことを示唆している〔マイコプラズマ−細胞生物学、Ｅ
ｄ、Ｍ、Ｆ、バライルおよび８１ラツイン、アカデミッ
クプレヌ、ニューヨーク、１９７９年、３１５〜３１９
頁〕。

長い複製時間のために、マイコプラズマ培養物（普通少
くとも数日令）から回収された各々の集落または粒子は
必ず、種々の年令の微生物から構成される。対数複製期
にある最も若い細胞は、論理的に最も特異的な膜抗原を
与える最も価値ある生体である。

この新しい技術は、Ｍ１ニューモニアエのようなマイコ
プラズマが塊状浮遊集落の形または塊状浮遊集落の断片
が約５日間断しい培地で培養したときにはクラゲ状ミク
ロ集落の形で選択的に培養できるという発見にもとづく
。単一の成長単位は、Ｍ１ニューモニアエの成長速度が
おそいだめ、この短時間ではクラゲ状物を形成できない
。これらの選ばれた培養物においてはマイコプラズマ微
生物の個々のまたは単離された成長単位は比較的少数に
保たれ、そのため栄養剤のためのまたは他の成長因子の
ための浮遊集落またはクラゲ状物とそれらの競合が最小
にされる。この方法で成長したマイコプラズマ微生物は
、特徴的な集落の形で存在するので、顕微鏡下に容易に
認識されうる。培地の基剤は透析されているため、また
つ々の血清は濾過されておシ、培養は攪拌なしに行なわ
れているため微生物以外に粒状物はこの培養物中には生
成しない。

マイコプラズマの膜は微生物の最も重要な構造として知
られているが、従来法は、膜、その成分およびその化学
的成分の抗原性を研究するのに化学分析を用いてきた。

これらの初期の技法は、集落またはクラゲ状物の生長エ
ツジにおいて極めて若い年令の細胞すなわちわずか二三
時間令ないし１方今のものだけが特異的膜抗原を含むと
いう、現在認められている事実を無視している。全培養
物または全集落集団から単離された膜成分の化学分析は
特異的膜抗原と非特異的成分とを区別できない。本発明
の全く新しい方法は、自然の空間関係に含まれる極めて
若いＭ１ニューモニアエのもとのままの膜、ポリプまた
は小胞、多糖類、蛋白質および脂質の抗原性をとシあつ
かう。

Ｍ１ニューモニアエのクラゲ状物でウサギを免疫するこ
とによって特異的Ｍ１ニューモニア工膜抗体を産生でき
、非特異的抗体は、古いＭ。

ニューモニアエ培養物カラ収獲したアセトン−固定した
集落で吸収することで除去できる。吸収された特異的抗
体を使用して、唾液中のＭ１ニューモニアエ膜抗原は、
　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　（酵素結合免疫吸収試験）〔ランセ
ット、１９７６年８月２１日、４０６〜４０７頁〕また
は免疫螢光法によって検出できる。

この新しい技術の臨床的応用は、Ｍ１ニューモニアエ感
染症の早期診断および早期治療の正確さを改良できる。

特異的膜■ダＭ抗体の同定または患者の血清中の特異的
膜工ｇｑ抗体の上昇する滴定量の観察は、患者がＭ、ニ
ューモニアエによって起こった急性の強い感染から回復
しつつあるか、ちょうど回復したところであることを示
している。唾液または唾液培養物中のＭ。

ニコーモニアエ抗原または特徴的膜で輪郭づけられた成
長単位の血清学的または免疫螢光による同定も、また、
急性感染の証拠と思われる上部気管中のこの微生物の強
い細胞増殖（ｐｒｏｌ−２ｆｅｒａｔｊｏ（１）を示シ
テイル。

本発明はさらに、現行のハイブリドーマ法を使っての特
異的にマイコプラズマ膜抗原に対するモノクローナル抗
体の開発の基礎を提供する。

この場合、ここに提供されたグルタールアルデヒドで固
定したクラゲ状物は、ポリプまたは小胞の膜に対する特
異的モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞
系統（ｌｉｎｅ）を選択するだめの抗原として使用でき
る。

マイコプラズマニューモニアエオヨヒマイコプラズマゲ
ニタリアムは、クラゲ状集落の膜中にあるものを含めて
多くの普通の抗原の仲間に入るため、Ｍ、ニューモニア
エに感染した患者中の抗体を検出するのに推賞される同
じ抗原が非淋疾性尿道炎を起こす微生物であるＭ、ゲニ
タリアムの抗体としても使える。Ｍ、ニューモニアエに
よってつくられた特異的抗膜抗体は尿道滲出物中のＭ、
ゲニタリアムの特異的膜の検出にも使用できる。

本発明は、本発明の実施を例示する下記の実施例によっ
て説明されるが、それらに限定されるものではない。

実施例Ａ 工　培地の調製 １　下記の成分を半透性管の中に置く ブロスペース、すなわち市販のＰＰＬＯブロスベーヌの
ようなペプトンを含む 酵１１−キヌ、イーストレート（ディフコ、ラボラトリ
）３０ ダラム 酢酸タリウム　　　　　　　　　　　　　　　　４１２
．５ミリクツム 蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００
ミリリツトル ２　上記管を管内容物を含めた総容積１０リツトルの蒸
留水中で２〜５°Ｃで３日間透析する。

Ｓ　管とその内容物を捨てる。透析液の容積はこのとき
約８，５００ミリリツトルである。

４　透析液をｌ　Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ約７．８に調整し
、ｐ紙で炉して微量の粒状物を除く。

５　つぎに透析液を１２１°Ｃで２０分間オートクレー
ブ中で滅菌する。

６　透析液８０ミリリツトμ、淵過されたガンマ・グロ
ブリンを含まないウマ血清２Ｑミリリツトルおよびペニ
シリン５００単位／ミリリット／ｌ／またはそれと同じ
成分比になるように最終培地を調製する。

的単離 Ｍ、ニューモニアエの標準系統（５ｔｒａｉｎ）のスト
ック培養物を約１０ミリリツトルの液状培地の入った試
験管中で接種し、ゆつくシ回転しなから３７°Ｃで４日
間培養（ｉｌｃｕｂａ−ｔｅ　）　　する。約０．５ミ
リリットルの最初の培養物を４日間の培養のあと新しい
培地の入った第二の試験管に移す。この方法による約３
回分の副次培養物は、液状培地中にＭ１ニューモニアエ
の強く生長する微生物を産出するであろう。最終の副次
培養物中の４日間の培養の後、その液状培養物を、それ
以上回転または攪拌なしに２−３週間培養器中に放置す
る。培地中の沈降物をサンプリングし、約２５〜５０μ
ｍ径のＭ、ニューモニアエの塊状浮遊集落または集落の
集合体の外観を顕微鏡的に観察する。その存在を確認し
たら、沈降物をもう一度懸濁させ、その懸濁物を１．５
００ｒｐｍの速度で２０分間遠心分離する。つぎに、上
澄液を新しい液状培地で置換し、−日一回試験管をさか
さにして混合してさらに約７日間沈降物を培養する。上
澄液は７日目毎に新しい培地で置き換える。約３週間の
ちとマイコプラズマの塊状浮遊集落は成長の優れた形と
なシ、多くは１００μｍ径以上の集合体を形成する。つ
ぎにさらに増殖させるために、それを平底のさらに大き
い組織培養フラスコに移す。

新しい液状培地中で４〜５日間培養され、遠心分離によ
って収獲された約５００個の塊状浮遊マイコプラズマ集
落を約２ミリリツトルの液状培地の入ったボッター−エ
ルベニヘム、ガラス組織磨砕器に移し、１１００−２０
Ｏｒｐ回転のモーターで駆動するテフロン乳棒で１分以
下の間ホモゲナイズする。ホモゲナイズの終シに、すべ
ての集落は崩壊されていなければならない。これは顕微
鏡で確認できる。つぎに、このホモゲナイズされたもの
は約５０ミリリツ）／Ｌ／の新しい培地と混合して密栓
したプラスチックのベトリ皿または平底のプラスチック
組織培養フラスコ中で培養する。培養物中の培地は約３
朋の高さに調節される。３７°Ｃで５日間の培養の後、
５〜２５μｍ径を主とする円形または卵形のミクロ集落
またはミクロ集落の集合体が液状培養物中に自由に浮遊
した形でかまたは容器の底にゆるく付着した形で形成さ
れる。付着した集落は、Ｉ）Ｈ７，４のシん酸塩緩衝塩
水（ＰＢＳ）で底から洗い出す。つぎに、ミクロ集落は
低速遠心分Ｒ（約２，５００〜３．００　Ｏｒｐｍ　）
で収獲する。高速遠心分離、たとえば１１．００ｏ　ｒ
ｐｍ（１５，ＯＯＯＸｇ）は、ポリプ様の成長形を破壊
し、クラゲ状物の表面で膜抗原の損失を来たす（下記参
照）。

ＰＢＳ中で３回洗浄したあと、ミクロ集落の濃い懸濁物
の滴をガラススライド上に置き、室温で乾燥する。それ
らは、非固定の抗原製剤として使用でき、または好まし
くは、ＰＢＳ中の１％グルタ−μアルデヒド中での２分
間の固定のあと使用できる。これらのミクロ集落は主と
して免疫螢光着色のちと０．１〜０゜２μｍ厚の膜で輪
郭づけられる１〜１０μｍの多数の小さいボリプまたは
小胞から成るため、また、それらは殆んど必ず明らかに
活性の小さい微生物の密につまったコアをとシまく（こ
うして小さいクラゲに見える）ため、それらはここでは
クラゲ状ミクロ集落またはクラゲ状物と呼ぶ。

■　患者血清中の特異的抗マイコプラズマ抗体マイコプ
ラズマ感染について試験されるべき患者の血清試料をＰ
ＢＳで１＝１０．１：をまず抗原としての、スライド上
で乾燥したマイコプラズマクラゲ状ミクロ集落と反応さ
せる。患者の血清を洗い流したあと、抗原を動物（ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、ブタなど）中でつくった螢光化され
た抗ヒｌ−ＩダＧまたはＩｆＭ抗体でおおう、未結合の
螢光抗体を洗い落としたあと、スライドを緩衝刺入りの
グリセリン中に置く。こうして調製され反応されたミク
ロ集落を、つぎに螢光顕微鏡で検査して、ミクロ集落の
膜壁光特性を測定する。

かなりの濃度のＭ、ニューモニアエ抗体（ＩｆＧまたは
１９Ｍまたは両方）が患者の血清中に存在する場合は、
クラゲ状物の表面または周囲にあるこれらのポリプまた
は小胞の膜そして膜だけが螢光を発する。抗体の量は滴
定量（稀釈率）によって反映される。正常のまたは対照
の血清試料と反応したクラゲ状物の膜は螢光を発せず、
そのため目に見えない。

浮遊する集落を培養物中で３週間以上熟成させると、周
辺の若いマイコプラズマ細胞はもはや、免疫螢光法では
表示されず、特異的膜抗原が著しく消失したことを示す
。

しかし、新しい培地中で２〜４日間再培養したあと、こ
れらの集落の表面に特異的膜抗原をもった強く生長する
小胞細胞が成長するため、これらの古い集落は死んでは
いない。

との比較 グルタールアルデヒド中で固定されたクラゲ状物の特異
的膜抗原は、抗原製剤をアセトンに２分間浸漬したあと
はもはや表示すレナい。エタノールとクロロホルムもア
セトンと同様の効果がある。

■　抗体の産生 Ｍ１ニューモニアエの特異的膜抗原に対する抗体を産生
ずるために、４日培養の洗浄した生きたＭ１ニューモニ
アエクラゲ状ミクロ集落を１０〜１４日おきにウサギに
静脈注射した。６回ないし７回の注射のあと、免疫した
ウサギの血清試料を前述の免疫螢光法を使って特異的膜
抗原に対する抗体について試験した。マイコプラズマク
ラゲ状ミクロ集落の膜への工ｙＧおよびＩｆＭ抗体の結
合を螢光ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体によって表示
する。ウサギ免疫グロブリンを標準の硫酸アンモニウム
法を使って単離する。細胞質およびマイコプラズマ細胞
の不活性形に対して指向する非特異的抗体全４週令の培
養物を洗浄し、アセトン固定した塊状集落によって吸収
した。

吸収のあと、ウサギ免疫グロブリンはＭ、ニューモニア
エの膜抗原について極めて特異的であシ、唾液その他の
滲出物中のＭ、二二一モニアエの可溶物または膜抗原を
検出するのに使用できる。

その−例を下記に説明する。

実施例Ｂ １　検体の調製 Ｍ１ニューモニアエに感染した患者の唾液または実験室
で成育したＭ１ニューモニアエを含む唾液の粘い油状物
を時計皿上で３７°Ｃをガラスの試験管に移し、試験管
を加熱ブロック中にさしこんで約３７°Ｃで溶剤を蒸発
さセル。１％ウシ血清フルプミン（ＢＳＡ）？。

含むＩ）Ｈ７，４のＰＢＳＩミリリット／ｌ’を加えて
残香と混合し、試験管を３７°Ｃの水浴中で１時間振盪
して可溶性脂質成分を得る。不溶性残香は遠心分離のあ
と沈降物として捨てる。

２　抗体でコートした試験管または膜フィルターの調製 グルタールアルデヒド処理した試験管法（Ｍ、Ｊ、パレ
ットら、米国特許第４，００１，５８３号、酵素学実験
法７３巻、２３４〜２３５頁、１９８１年に引用）を実
施する。この方法で、特異的Ｍ、ニューモニアエ膜抗体
（ウサギ免疫グロブリン）はポリプロピレン試験管の底
に結合する。別の方法として、ボーＭ ルパイオダイン　　免疫親和性膜（バイオテクノロジー
事業部、ポールウルトラファインフイμトレージョンコ
ーポレーション、クレンコープ、ニューヨーク１１５４
２）のような市販の蛋白質−結合膜も使用できる。目的
は、抗体を固体表面に付着させて、その特異的抗原結合
能力を保持させることである。

次に、下記の工程を行なう： （ａ）　　室温で３０分間プラスチック管表面上または
膜フィルター上に固定した抗体で、唾−％ 液の可溶性脂質分、または細胞溶解物′°ゝを培養する
。

※別の方法として、気管支洗浄検体上の深い唾液１ＰＢ
ｓ中で遠心分離して剥離された上皮細胞を得る。沈降物
を０．１ミリリットルの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（０，
１Ｍ’。

ｐＨ１０）中に解離させる。唾液解離物のｐＨは、ｏ、
ｘＮＨｃ＄で約７．２〜７．４のｐＨにする。これは脂
質分の代わシに使われる水性抽出物を表わす。

（ｂ）　　試験管または膜をＰＢＳで完全に洗う。

（ｃ）　　免疫グロブリン分子に共有結合したアルカリ
ホスファターゼをもつ酵素標識シーｋＭ’。

ニューモニアエ特異的抗体（上記参照）（Ｓ１アプラメ
アス、免疫化学第６巻、４３〜５２頁、１９６９年）を
試験量または膜に加える。

（ｄ）３０分間培養したあと、未結合のホスファターゼ
標識した抗体６ｐＨ７，ａ、　のトリス−ＨＣＩ緩衝塩
水で洗い落とす。結合した標識された抗体ハ、アルカリ
ホスファターゼについての標準ボダンスキー法その他の
方法で定量する。高いアルカリホスファターゼ活性の存
在は、患者の唾液中の高滴定量のアセトン抽出性Ｍ、ニ
ューモニアエ抗厚を示している。Ｍ、ニューモニアエを
含まない対照検体は陰性であるべきである。

実施例Ｃ 直接または液状培地の中での培養のあとに唾液または他
の滲出物中のＭ、ニューモニアエ特異的膜抗原を検出す
るのに特異的抗体を使う別の例は、間接免疫螢光法で唾
液抽出物または唾液の液状培養物の沈降物を着色するこ
とである。

この方法では唾液の油状物または唾液の液状培養物の沈
降物を顕微鏡スライド上でまず風乾し、ｐＨ７，４のＰ
ＢＳ中１％グμターｐアルデヒドで２分間固定する。特
異的ウサギ抗Ｍ、二二−モニアエ免疫グロブリンをまず
油状物と反応させ、つぎに結合した免疫グロブリンを螢
光ヤギ抗ウサギガンマグロブリン抗体で（上述の方法で
）視覚化する。房状の「クラゲ状物」に並び、特異的に
着色した膜にかこまれた１〜１０μｍ径のポリプまたは
小胞状微生物が見出されるかまたは螢光顕微鏡下に剥離
された上皮細胞の表面に膜にかこまれたポリプ状の生体
が見出されるならば、唾液中のＭ、ニューモニアエの存
在が診断できる。

実施例Ｄ マイコプラズマの特異的膜抗体を得る別の方法は融合細
胞の連続的培養物、すなわち、まずＧ、ケーラーおよび
Ｃ，ミルスタイン（ネイチュア２５６巻、４９５〜４９
７頁、１９７４年）が紹介し、その後、Ｄ、Ｗ、パック
、Ｒ，Ｈ。

ケネットおよびＧ、マツクガリテイ（インビトロ１８巻
＝３７７〜３８１頁、１９８１年）が改良したハイブリ
ドーマ法を使うことである。

−例を下記に説明する。

微生物の調製 Ｍ１ニューモニアエのクラゲ状集落の５日令の古い液状
培養物全ＰＢＳ中で５回静かに洗い毎回２，５００〜３
．○ＯＯｒｐｍで３０分間遠心分離する。最終の懸濁物
を前述の間接螢光抗体法によって膜抗原に富むことが示
される１０　個のクラゲ状集落に調整される。

免疫化アブトコ−μ ８〜１０ケ月令の雄のＢＡＬＢ／Ｃマウスにそれぞれ第
１日、第１２日および第２１日に１ミリリツトルのマイ
コプラズマ懸濁物を腹膜内注射した。

交配（細胞融合）およびハイブリドーマ細胞選択 最終免疫化の３日後、マウス全般し、三個の牌臓を、血
清を含まぬ完全ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ
）にューヨーク州、グランドアイランド、ギプコラボラ
トリーヌから購入）中で結合させた。牌臓は滅菌した彎
曲鉗子で梳き分け、単一細胞懸濁物をＤＭＥＭ中で洗っ
た。

牌臓リンパ球をマウス骨髄腫細胞（ＮＳＯｉ胞）と融合
させるために、これらの二種の細胞″ｆ、まず、５０ミ
リリツトルの遠心分離管中に懸濁させ、５：１の比率（
１０個の牌臓細胞と２Ｘ１０　　個のＮＳＯ細胞）で混
合する。１１０００ｒｐで１０分間遠心分離したあと、
細胞ベレットを２ミリリツトルの予め加温した（３７’
Ｃ）ポリエチレングリコ−／ｖ　（Ｄ　Ｍ’　Ｅ　Ｍ中
４１％）に再び懸濁させ、３７°Ｃで１分間培養した。

約３５ミリリツトルの予め加温したＤＭＢＭｙ細胞懸濁
物に滴加して、ポリエチレングリコールを稀釈する。遠
心分離後、上澄液を除き、細胞ベレットを１５ミリリツ
）／Ｌ／の予め加温したＤＭ’、ＥＭ−Ｉ（ＡＴ　（１
５％熱不活性化ウマ血清、１０　Ｍのハイポキサンティ
ン、４Ｘ１０　　Ｍアミノプリテン、および１．６Ｘ１
０　　Ｍティミジンを含む完全Ｄ　Ｍ−Ｅ　Ｍ　）中に
再懸濁させ、ＤＭＥＭ　−ＨＡ　Ｔ巾約３×１０　の生
育しうるＮＳＯ骨髄腫細胞／ミリリットルの濃度に調整
する。最終の細胞懸濁物を９６個のウニ／Ｉ／’ｉもつ
平底ミクロ培養プレートのウェル中に各０．１ミリリツ
トルづつ分配する。プレートを加湿培養器中８％Ｃ０２
中で３７°Ｃで培養する。

雑種細胞の生長は、普通融合後１０〜１４日目の培養物
中の色の黄変によって示される。抗原としてのグρター
ルアρヂヒド固定りラゲ状集落および二次抗体としての
ＦＩＴＣ標識ウサギつマウヌＩｆＧを使った間接螢光抗
体法によって膜抗体活性をヌクリーニングするために上
澄液の分割物をとり出す。つぎに、特異的膜抗体を産生
ずる細胞培養物を含むウェルの中の培地をウマ血清、ハ
イポキサンティンおよびティミジンを含む（アミノプテ
リンを含まない）ＤＭＢＭで置きかえる。１０日後に、
正規のＤ　Ｍ’　ＥＭウマ血清培地を使用し、Ｍ１ニュ
ーモニアエの膜抗体の産生を間接螢光抗体試験によって
連続的に監視する。

培養物は、０．２％寒天を含むＤ　Ｍ’　Ｅ　Ｍウマ血
清で細胞を稀釈してクローン化し、それによって、培養
の後、単離した細胞集落は、ペトリ皿中に半固状培地の
薄い層中に現われる。単一細胞集落は毛細管パスツール
ベットでと）出して、それぞれ０．１ミリリツトルの新
しい培地を含むウニμに、増殖のために移す。それぞれ
のウェル中の純粋のハイブリドーマ細胞培養物ヲ１０〜
１４日の培養のあと膜抗体のためにスクリーニングする
。

水量生産のためには、上記の抗体は、ＢＡＬＢ／Ｃマウ
ヌの腹膜腔および腹水から収獲した抗体中でハイブリド
ーマ細胞を増殖させることで産生でき、または上述の抗
体は組織培養フラスコ中、好ましくは血清を含まない培
地中で産生できる。抗体の滴定量が低すぎるときは、抗
体は限外濾過で濃縮できる。

実施例Ｅ マイコプラズマニューモニアエの膜抗原とマイコプラズ
マゲニタリアムのそれの間の相互反応性を説明するため
に、この二つの微生物のクラゲ状集落を１％グルタール
アルデヒド中ニ固定し、Ｍ１ニューモニアエ患者の回復
期の血清’Ｊたは、Ｍ、ニューモニアエの生きたクラゲ
状集落からつくった免疫ウサギ血清と反応させる。

抗原抗体反応は、間接螢光抗体法で示される。

結果は、Ｍ１ニューモニアエおよびＭ１ゲニタリアムの
膜による特異的ＩｆＧおよびＨ’Ｍヒトおよびウサギ抗
体の類似の結合パターンを示す。

マイコプラズマホミニヌ、マイコプラズマオラール、お
よびマイコプラズマサリバリアムのような他のマイコプ
ラズマ種は、これらの抗体と反応しない。この例は、Ｍ
１ゲニタリア・ムに感染した患者中の抗体の存在を検出
するために、Ｍ１ニューモニアエクラゲ状抗原を使うこ
と、および尿道分泌物中のマイコプラズマゲニタリアム
の膜を検出するためにマイコプラズマニューモニアエの
特異的膜モノクローナル抗体を使うことの可能性を示し
ている。

上述の方法は、他のマイコプラズマ感染にも応用できる
ことに注意すべきである。

本発明は、好ましい実施態様と考えられるものについて
記述してきたが、本発明は、開示した実施態様に限定さ
れるものではなく、添付の特許請求の範囲の精神および
範囲の中に含まれる種々の改変および等価のプロセヌを
カバーすることを意図していると理解されるべきであ）
、その特許請求の範囲の広がシは、そのような改変およ
び等価のプロセスのすべてを包含するように最も広い解
釈を与えられるべきである。

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）透析した粒子を含まない液状培地中に標準
   系統のマイコプラズマの培養物を形成し、その中でその
   培養物を培養し、 （ｂ）この培養した培養物の一部を上記液状培地の新し
   い回分に移して、それを、その中でもう一度培養して副
   次培養物を形成し、 （ｃ）（ｂ）の工程を少くとも一回くりかえして、少く
   とも３つの培養体および最終の副次培養物を与え、 （ｄ）上記最終の副次培養物を、充分な時間培養して、
   約２５〜５０μｍ径のマイコプラズマの塊状集落または
   その集落の集合体を形成させ、 （ｅ）上記塊状集落を分離し、それをマイコプラズマの
   塊状浮遊集落が主な生長形態であるようになるまでその
   あとにつづく培地の新しい回分中で再培養し、 （ｆ）上記塊状浮遊集落を収獲し、それをホモゲナイズ
   し、新しい培地中で再培養して５〜２５μｍ径の円形ま
   たは卵形のミクロ集落またはそのミクロ集落の集合体を
   形成し、そして （ｇ）それを収獲し、洗浄して、膜によって輪郭づけら
   れた１〜１０μｍ径のポリプまたは小胞から成るクラゲ
   状のミクロ集落を得る、 ことを特徴とする高含量の種特異的膜抗原をもち、強力
   に生長するマイコプラズマ微生物をそのあとの抗原−抗
   体同定のために産生する方法。
2. （２）上記マイコプラズマがマイコプラズマニューマニ
   アエであることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
   の方法。
3. （３）上記マイコプラズマがマイコプラズマゲニタリア
   ムであることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項の
   方法。
4. （４）収獲したクラゲ状ミクロ集落が、つづいて脂肪族
   アルデヒド中に固定されることを特徴とする特許請求の
   範囲第（１）項の方法。
5. （５）アルデヒドがグルタールアルデヒドであることを
   特徴とする特許請求の範囲第（１）項の方法。
6. （６）収獲を約２，５００〜３，０００ｒｐｍ（７００
   〜１，０００×ｇ）の遠心分離で行なうことを特徴とす
   る特許請求の範囲第（１）項の方法。
7. （７）上記液状培地が、（１）ブロス、酵母エキス、酢
   酸タリウムおよび蒸留水の滅菌透析物、（２）ガンマ・
   グロブリンを含まない馬の血清、および、（３）ペニシ
   リンを含有し、かつ上記液状培地が７．０〜７．８のｐ
   Ｈに調整されていることを特徴とする特許請求の範囲第
   （１）項の方法。
8. （８）（ａ）患者の血清の試料を稀釈し、 （ｂ）稀釈した血清試料の一部を特許請求の範囲第（１
   ）項で調製したクラゲ状ミクロ集落の試料と反応させ脂
   肪族アルデヒドで固定し、 （ｃ）患者の血清を洗い落とし、 （ｄ）残査を螢光抗ヒト免疫グロブリン抗体で処理し、 （ｅ）未結合の螢光抗体を洗い落とし、そして （ｆ）このようにして調製され反応されたミクロ集落を
   検査して、その膜の螢光特性を測定する、 ことを特徴とする患者の血清試料中のマイコプラズマ膜
   に対する特異的抗体を検出することによるマイコプラズ
   マ感染の試験法。
9. （９）上記マイコプラズマがマイコプラズマニューモニ
   アエであることを特徴とする特許請求の範囲第（８）項
   の方法。
10. （１０）上記マイコプラズマがマイコプラズマゲニタリ
    アムであることを特徴とする特許請求の範囲第（８）項
    の方法。
11. （１１）上記アルデヒドがグルタールアルデヒドである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第（８）項の方法。
12. （１２）上記マイコプラズマに対する特異的抗体の滴定
    量がつゞいて測定されることを特徴とする特許請求の範
    囲第（８）項の方法。
13. （１３）（ａ）それぞれ１〜１０μｍの大きさのホリプ
    または小胞をもつクラゲ状の集落の形でまず生きたマイ
    コプラズマを動物に注射し、 （ｂ）動物の免疫グロブリンを単離し、そして （ｃ）マイコプラズマ培養物のアセトン固定集落によっ
    て非特異的抗体を吸収する、 ことを特徴とするマイコプラズマの特異的膜抗原に対す
    る抗体を得る方法。
14. （１４）上記マイコプラズマがマイコプラズマニューモ
    ニアエであることを特徴とする特許請求の範囲第（１３
    ）項の方法。
15. （１５）上記マイコプラズマがマイコプラズマゲニタリ
    アムであることを特徴とする特許請求の範囲第（１３）
    項の方法。
16. （１６）上記マイコプラズマのクラゲ状ミクロ集落が特
    許請求の範囲第（１）項のようにして調製されることを
    特徴とする特許請求の範囲第（１３）項の方法。
17. （１７）上記動物がウサギであることを特徴とする特許
    請求の範囲第（１３）項の方法。
18. （１８）上記動物に約１０〜１４日毎に注射することを
    特徴とする特許請求の範囲第（１３）項の方法。
19. （１９）上記動物に６〜７回注射することを特徴とする
    特許請求の範囲第（１３）項の方法。
20. （２０）その吸収するマイコプラズマ培養物が約４週令
    であることを特徴とする特許請求の範囲第（１３）項の
    方法。
21. （２１）（ａ）滲出物からマイコプラズマの膜抗原を単
    離し、 （ｂ）表面上に特異的マイコプラズマ膜抗体を固定し、 （ｃ）その表面上に固定された抗体でマイコプラズマの
    膜抗原を培養して、表面上に固定された抗体をマイコプ
    ラズマの膜抗原と反応させ、ついで洗浄し、 （ｄ）それに、酵素標識されたマイコプラズマ特異的抗
    体を加え、 （ｅ）出来た組合わせを培養し、未結合の酵素標識抗体
    をそれから洗い落とし、そして （ｆ）結合した酵素標識抗体の滴定量を測定することを
    特徴とする患者の唾液または他の滲出物中のマイコプラ
    ズマの膜抗原を検出する方法。
22. （２２）単離工程が、 （ａ）滲出物試料の濃厚な油性物を乾燥し、 （ｂ）その油性物を溶剤で抽出し、 （ｃ）溶剤を蒸発させ、 （ｄ）残査をウシの血清アルブミンで処理し、 （ｅ）その残査とそのウシの血清アルブミンを混合し、 （ｆ）混合物を振盪して、可溶性の脂質分および不溶性
    分を得る、 ことを特徴とする特許請求の範囲第（２１）項の方法。
23. （２３）単離工程が、 （ａ）唾液試料を遠心分離して、剥離した上皮細胞を得
    、そして （ｂ）沈降物を解離（ｌｙｓｅ）させる ことから成ることを特徴とする特許請求の範囲第（２１
    ）項の方法。
24. （２４）上記マイコプラズマがマイコプラズマニューモ
    ニアエであることを特徴とする特許請求の範囲第（２１
    ）項の方法。
25. （２５）上記マイコプラズマがマイコプラズマゲニタリ
    アムであることを特徴とする特許請求の範囲第（２１）
    項の方法。
26. （２６）上記溶剤がアセトンであることを特徴とする特
    許請求の範囲第（２２）項の方法。
27. （２７）上記表面がポリプロピレン試験管であることを
    特徴とする特許請求の範囲第（２１）項の方法。
28. （２８）上記表面が蛋白質結合性膜であることを特徴と
    する特許請求の範囲第（２１）項の方法。
29. （２９）上記酵素がアルカリホスファターゼであること
    を特徴とする特許請求の範囲第（２１）項の方法。
30. （３０）上記特定のマイコプラズマ膜抗体および／また
    はその酵素標識マイコプラズマ特異的抗体がモノクロー
    ナル抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第（２
    １）項の方法。
31. （３１）（ａ）液状培養物の滲出物または沈降物の油性
    物をアルデヒドで固定し、 （ｂ）特定の第一の動物抗マイコプラズマ免疫グロブリ
    ンをその油性物と反応させ、 （ｃ）結合した免疫グロブリンを螢光第二動物抗第一動
    物ガンマグロブリン抗体と反応させ、そして （ｄ）調製され反応された油性物を検査してその螢光特
    性を測定する ことを特徴とする、直接または液状培地中での培養の後
    に、唾液または他の滲出物中のマイコプラズマの特異的
    膜抗原を検出する方法。
32. （３２）上記マイコプラズマがマイコプラズマニューモ
    ニアエであることを特徴とする特許請求の範囲第（３１
    ）項の方法。
33. （３３）上記マイコプラズマがマイコプラズマゲニタリ
    アムであることを特徴とする特許請求の範囲第（３１）
    項の方法。
34. （３４）アルデヒドがグルタールアルデヒドであること
    を特徴とする特許請求の範囲第（３１）項の方法。
35. （３５）上記第一の動物がウサギであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第（３１）項の方法。
36. （３６）上記第二の動物がヤギであることを特徴とする
    特許請求の範囲第（３１）項の方法。
37. （３７）上記第一の動物の抗マイコプラズマ免疫グロブ
    リンがハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクロ
    ーナル抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第（
    ３１）項の方法。
38. （３８）（ａ）ブロス、酵母エキス、酢酸タリウムおよ
    び蒸留水を透析し、 （ｂ）透析物を約７．０〜７．８のｐＨに調整し、 （ｃ）上記透析物をろ過して微量の粒子を除き、 （ｄ）上記透析物を滅菌し、 （ｅ）上記透析物、ガンマグロブリンを含まないウマの
    血清、およびペニシリンから成る液状培地を調製し、 （ｆ）標準系統のマイコプラズマおよびその液状培地の
    培養物を形成し、 （ｇ）上記培養物をその中で培養し、ゆっくり回転させ
    、 （ｈ）培養し回転する培養物の出来上りの一部を上記液
    状培地の新しい回分に移して、それをその中で再び培養
    して副次培養物を形成し、 （ｉ）工程（ｈ）を少くとも一回くりかえして、少くと
    も３つの培養物および最終の副次培養物を与え、 （ｊ）この最終の副次培養物を充分な時間培養して回転
    または攪拌なしに約２５〜５０μｍ径のマイコプラズマ
    の塊状集落またはその集落の集合体を形成し、 （ｋ）その円形の集落を分離し、それをマイコプラズマ
    の塊状浮遊集落が主な生長形態であるようになるまであ
    とにつづく液状培地の回分中で再培養する。 ことを特徴とするマイコプラズマ微生物の塊状浮遊集落
    を産生する方法。
39. （３９）上記マイコプラズマがマイコプラズマニューモ
    ニアエであることを特徴とする特許請求の範囲第（３８
    ）項の方法。
40. （４０）上記マイコプラズマがマイコプラズマゲニタリ
    アムであることを特徴とする特許請求の範囲第（３８）
    項の方法。
41. （４１）（ａ）マイコプラズマの特異的膜抗原に対する
    特異的抗体を産生する細胞を、腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｔ
    ｉｃ）細胞と融合させ、そして （ｂ）上記マイコプラズマの特異的膜抗原に対する特異
    的モノクローナル抗体を収獲する ことを特徴とするマイコプラズマの特異的膜抗原に対す
    る特異的モノクローナル抗体を得る方法。
42. （４２）（ａ）マイコプラズマ抗原に対する抗体を産生
    する細胞を腫瘍細胞と融合させ、そして （ｂ）アルデヒド固定したクラゲ状物を使って、その特
    定の膜抗原に対する特異的モノクローナル抗体を産生す
    るハイブリドーマ細胞系統（ｌｉｎｅ）を選択する。 ことを特徴とするマイコプラズマの特異的膜抗原に対す
    る特異的モノクローナル抗体を得る方法。