JP2005515759A - ＧｒｏＥＬキメラ蛋白質およびワクチン - Google Patents

Abstract

例えば病原性微生物の抗原決定基を含む表面に露出した外因性アミノ酸配列を含むキメラＧｒｏＥＬ蛋白質が提供される。外因性アミノ酸配列をＧｒｏＥＬ蛋白質の親水性領域に挿入して、抗原決定基に特異的に反応する免疫応答を誘発するための抗原決定基表出手段を提供することができる。これは、誘発した免疫応答に細胞性の偏りを提供し、したがって細胞内寄生生物に対して特に有用であると考えられる。

Description

本発明は、哺乳動物の抗原に対する免疫応答を誘発する方法において用いることができるＧｒｏＥＬキメラ蛋白質およびワクチン、特に微生物またはアレルゲンの免疫原決定基（immunogenic determinant）が挿入された蛋白質または核酸を有するキメラＧｒｏＥＬ蛋白質または核酸を提供することにより、微生物またはアレルゲンに対する免疫応答を促進することに関する。

哺乳動物の特定の微生物疾患は、高リスク群にワクチン接種することにより適切に予防される。ワクチンの型は伝統的に死滅または弱毒生菌である。このアプローチは、感染時に存在する抗原はワクチン量産中にはマスクされているか、または存在しない可能性があるために、すべての病原体に対して成功しているわけではない。加えて、ワクチン接種群の死滅したと推定された生菌への偶発的曝露、および微生物全体から製造された製剤の成分、特にエンドトキシンに対する有害反応に関連するリスクがある。

微生物全体から製造されたワクチンの使用に関連する問題を回避するために、数十年にわたって主に努力されてきたのは感染微生物の表面上に存在する特定の抗原決定基を同定することであり、この抗原決定基に対する抗体が感染のリスクを低下させ、好ましくは除去することができる。この目的は、オプソニン化と感受性群の免疫系による処分とのために抗体と相互作用するために、微生物上に安定に存在する１つまたは複数の主要な抗原決定基を同定すること；および１つまたは複数の主要抗原決定基に対する適切な免疫応答を誘発することを試みることである。

この主要な抗原決定基を使用することにより、関係している微生物に対する適切な応答を得ることも期待される。したがって、細胞内の病原体に対しては細胞性免疫に偏った免疫応答が好ましい。あるいは、病原体の侵入に対する特定の障壁を示す粘膜免疫を提供することも好ましいと考えられる。

いくつかの重要な蛋白質が主要抗原として同定されており、または実際には腸内病原体におけるトキシンおよび線毛蛋白質などの原因として同定されている。全蛋白質、または修飾蛋白質がワクチン接種試験の基礎として用いられている。しかし、免疫プログラムに対する免疫応答は低く、予防効果を提供するには不十分であると判断されているケースもある。

特定の抗原決定基についての理解がさらに正確になっており、特にいくつかの蛋白質の場合には特定の直鎖アミノ酸配列であることが判明している。これは微生物ならびにアレルゲンについてあてはまる。したがって、これらのアミノ酸配列を感受性群において免疫応答を誘発する形態で存在させることが期待される。１つのアプローチにおいて、これらの直鎖抗原決定基を、表面に露出し、それによって適当な免疫応答を引き起こすように、別の蛋白質に挿入する。そのようなキメラ蛋白質を含む製剤による免疫によって誘発される免疫応答の性質には不確定な点がある。例えば、応答の種類が適当であるかどうか、または十分に強い応答が提供されるかどうかは確かではない。加えて、１つだけの抗原決定基に対する免疫応答では、必要とされる防御を提供するのに十分ではないと考えられる。

キメラ蛋白質を標的動物内に存在させることで、強い免疫応答が誘発されることが明らかにされている。このキメラ蛋白質は毒性を伴う蛋白質ＶａｐＡの抗原決定基をロドコッカスエクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｉ）のＧｒｏＥＬ２蛋白質に挿入したものである。

この知見は、子ウマのＲ．エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉｉ）感染症に対処する有望なアプローチを示しているが、抗原決定基、または通常は抗原性の低い肝抗原を挿入したキメラＧｒｏＥＬ蛋白質を用いて他の感染に対する免疫応答を増強するメカニズムも示している。データ、特にＤＮＡワクチン接種のデータはＴｈ１応答の増強を示しているが、これは体液性免疫に比べて細胞性免疫が大きいことを示すものであり、したがって一般的アプローチは特に細胞内感染症に対して適用可能であると考えられる。この知見は、微生物感染症だけでなく、より一般的に免疫応答を誘発することも示唆しており、例えばアレルゲンの場合に望ましいと考えられる様々な抗原に対する低免疫応答の誘発に適用可能である。

したがって、第１の態様の広範な形態において、本発明は哺乳動物において抗原決定基に対する免疫応答を誘発する方法であって、哺乳動物に免疫反応を誘発するための経路および形態で抗原決定基と反応するキメラ蛋白質を供給する工程を含むとともに、このキメラ蛋白質がその中に挿入されて表面に露出した外因性アミノ酸配列を有するＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であり、前記外因性アミノ酸配列が抗原決定基に特異的な抗体と反応するものに属するということができる。

しかし、本発明は特に微生物感染症に適用可能であり、したがって、第２の態様の広範な形態において、本発明は哺乳動物において微生物の抗原決定基に対する免疫応答を誘発する方法であって、哺乳動物にキメラ蛋白質を投与する工程を含むとともに、このキメラ蛋白質がその中に挿入されて表面に露出した外因性アミノ酸配列を有するＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であり、前記外因性アミノ酸配列が微生物の抗原決定基に特異的な抗体と反応する免疫応答を誘発するよう構成されたものに属するということができる。

第３の態様の広範な形態において、本発明は、その中に挿入されて表面に露出した外因性アミノ酸配列を有するＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であるキメラ蛋白質であって、前記外因性アミノ酸配列が抗原決定基に特異的に反応する免疫応答を誘発するよう構成されたものに属すると言うことができる。

第４の態様の広範な形態において、本発明はキメラ蛋白質をコードする核酸であって、このキメラ蛋白質がその中に挿入されて表面に露出した外因性アミノ酸配列を有するＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であって、前記外因性アミノ酸配列が抗原決定基に特異的に反応する免疫応答を誘発するよう構成されたものに属すると言うことができる。

第５の態様の広範な形態において、本発明は哺乳動物において微生物またはアレルゲンに対する免疫応答を誘発するための組成物であって、薬学的に許容される担体中のキメラ蛋白質を含み、このキメラ蛋白質がその中に挿入されて表面に露出した外因性アミノ酸配列を有するＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であり、前記外因性アミノ酸配列が微生物またはアレルゲンの抗原決定基に特異的な抗体と反応するものに属すると言うことができる。

略記法により、アミノ酸残基についての下記の三文字および一文字略号を表１の定義のとおりに本明細書で用いる。

特定のアミノ酸残基を蛋白質のポリペプチド内のその位置によって言及する場合、アミノ酸の略号に残基番号を上付き文字で添えて（すなわちＸａａ^ｎ）用いる。

ＧｒｏＥＬ蛋白質は最初、大腸菌中で溶菌感染中のバクテリオファージカプシド構築に必要とされる宿主因子の１つとして同定された。ｇｒｏＥＬ２遺伝子は種間で高度に保存されており、系統発生研究において用いられている（Ｇｕｐｔａ、１９９５、Ｇｕｐｔａ、２０００）。ＧｒｏＥＬファミリーのメンバーはすべての真正細菌細胞ならびに真核生物のミトコンドリアおよび葉緑体で見いだされる（Ｇｕｐｔａ、１９９５）。

ＧｒｏＥＬは様々な細菌蛋白質の正しい折りたたみを促進し、同様にＡＴＰ依存性メカニズムにより変性蛋白質の凝集を防ぐことが知られている（Ｃｒａｉｇら、１９９３）。ＧｒｏＥＬ蛋白質は中心に空洞を有する七量体の環状に配置された１４のサブユニットからなる。この中心の空洞は「アンフィンセンのかご（Anfinsen cage）」と呼ばれ、蛋白質の再折りたたみのための保護された環境を提供する（Ｍａら、２０００）。

ほとんどの真正細菌において、サイズが約６０〜６５ｋＤａの蛋白質をコードするｇｒｏＥＬ（Ｌ−大きい）遺伝子は、小さい蛋白質（Ｈｓｐ１０）をコードするｇｒｏＥＳ（Ｓ−小さい）遺伝子と共にｇｒｏＥオペロン中に存在する（ＳｅｇａｌおよびＲｏｎ、１９９６）。オペロン中にｇｒｏＥＬ遺伝子のコピーを１つだけ含む生物もある（ＳｅｇａｌおよびＲｏｎ、１９９６）。しかし、ミコバクテリア属（Ｒｉｎｋｅ ｄｅ Ｗｉｔら、１９９２）や、特に窒素固定ダイズ根粒菌であるＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍなどのα−プロテオバクテリアを含む生物で、その染色体にＧｒｏＥＬをコードする遺伝子の２つまたはそれ以上のコピーを有するものがある（ＫａｒｌｉｎおよびＢｒｏｃｃｈｉｅｒｉ、２０００）。ミコバクテリア属および他の放線菌類などの生物は２つのｇｒｏＥＬ遺伝子を含む。これらの１つはｇｒｏＥＬ２と命名され、通常は２シストロン性（bicistronic）のオペロンにおけるｇｒｏＥＳ遺伝子とは関係ない。オペロン中のｇｒｏＥＳと関係するｇｒｏＥＬ１と同様に、ｇｒｏＥＬ２も熱ショックおよび他の生理的ストレス後に誘導される（Ｄｕｃｈｅｎｅら、１９９４、Ｍａｚｏｄｉｅｒら、１９９１）。

ＧｒｏＥＬ蛋白質の発現は、さまざまな細菌性病原体による宿主の感染中にアップレギュレートされることが知られている（Ｎｏｌｌら、１９９９）。重要なことに、これらの蛋白質は多くの細菌、特にレジオネラニューモフィラなどのさまざまな細胞内病原体に対する宿主の体液性および細胞性両方の応答における主要抗原（immunodominant antigen）であることが明らかにされている（Ｓａｍｐｓｏｎら、１９８６、ＺｕｇｅｌおよびＫａｕｆｍａｎｎ。１９９９ｂ）。

生物が高温などの環境ストレスにさらされると、ｇｒｏＥＬ２はｇｒｏＥＬ１に比べてはるかに速い速度で転写されるようである（ｄｅ Ｌｅｏｎら、１９９７）。加えて、感染中に両方の蛋白質に対する抗体が観察されるが、ｇｒｏＥＬ２によりコードされる蛋白質はｇｒｏＥＬ１によりコードされる蛋白質よりも免疫優性であると考えられる（Ｌａｔｈｉｇｒａら、１９９１、Ｒｉｎｋｅ ｄｅ Ｗｉｔら、１９９２、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ、１９９１）。

ＧｒｏＥＬはヒトの結核予防薬として結核菌に対する免疫の手段としてそれ自体で用いられている（Ｌｏｗｒｉｅら、１９９７、１９９９）。

ＧｒｏＥＬは免疫原性の低い抗原の免疫応答を増強するために結合体で用いられている（Ｃｏｈｅｎら米国特許第５８６９０５８号）。

本発明は、キメラ蛋白質の表面への露出を導くＧｒｏＥＬ蛋白質の１つまたは複数の領域への微生物の表面蛋白質の抗原決定基に対する抗体と反応する外因性アミノ酸配列を挿入することによって、ＧｒｏＥＬの免疫原性を利用する。発明者らは、このアプローチを用いた免疫反応増強についてのいかなる他の報告も知らない。

このアプローチにはさまざまな適用例がある。１つの特定の態様において、適用はロドコッカスエクイによる子ウマの感染症に限定されるが、他のより広範な態様において、本発明はさまざまな病原体、他の微生物、または実際にさまざまなアレルゲンに存在しうるような他の抗原決定基に関する。

外因性アミノ酸配列により少なくとも１つの主要抗原決定基が運び込まれたＧｒｏＥＬは、免疫応答の誘発に関係する微生物種により運ばれたＧｒｏＥＬと免疫原として同一であることが好ましい。種特異的ＧｒｏＥＬのすべての主要抗原決定基が運ばれる必要はない。したがって、哺乳動物において誘発される免疫応答が部分的にＧｒｏＥＬ抗原決定基にも向けられることが好ましい。そのようなＧｒｏＥＬを提供する最も有効な方法は、キメラ蛋白質を形成するために、免疫が望まれる微生物のＧｒｏＥＬに外因性アミノ酸を挿入することである。したがって、例えば、Ｒ．エクイにおいて免疫反応を誘導することが望まれる場合、Ｒ．エクイ由来のアミノ酸配列に加えてＲ．エクイ由来のＧｒｏＥｌを用いる。

免疫反応の特異性が完全に主要抗原決定基に対するものであることが望ましいが、ＧｒｏＥＬの保存的性質を考慮すると、ＧｒｏＥＬの種特異性は、外因性アミノ酸配列内の抗原決定基が哺乳動物中に存在する様式に特に影響をおよぼすことはないと思われる。

キメラ蛋白質の基礎を形成するＧｒｏＥＬは、病原性微生物によってコードされるいかなるＧｒｏＥＬであってもよい。微生物は、リステリアイバノビイ、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラエンテリカ、ボルダテラ属菌種、ミコバクテリア属菌種、ノカルジア属菌種、赤痢菌属菌種、腸病原性大腸菌、エルシニア属菌種、レジオネラ属菌種、フランシセラツラレンシス、ブルセラ属菌種、クラミジア、リケッチアを含む微生物の群より選択することができる。

多くのＧｒｏＥＬ遺伝子のＤＮＡ配列が知られており、Ｇｕｐｔａ、１９９５およびＧｕｐｔａ、２０００、ならびにＲｉｃｈａｒｄｏｎら、（１９９８）およびＳａｉｂｉｌ（２０００）で多くが言及されている。ＤＮＡ／アミノ酸配列の具体例は下記のとおりである：ミコバクテリウムマリナム（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ５５８３１）、結核菌Ｈ３７Ｒｖ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＬ０２１９３２）、ウシ結核菌（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１７７０５）、トリ結核菌（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２８１６５０）、ツカムレラチロシノソルベンス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ９０２０４）、ロドコッカスエクイ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２３３３８７）、ストレプトミセスリビダンス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ９５９７１）、ストレプトミセスアルブス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ７６６５８）、コリネバクテリウムアクアチクム（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１８４０９２）、緑膿菌（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ６３９５７）、ヘリコバクターピロリ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ７３８４０）、ボレリアブルグドルフェリ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ６５１３９）。

生物が２つのｇｒｏＥＬ遺伝子を有する場合、ｇｒｏＥＬ遺伝子はｇｒｏＥＬ２を発現している遺伝子であることが好ましい。そのような生物にはミコバクテリア属ならびに他の放線菌類およびα−プロテオバクテリアが含まれると考えられる。

ＧｒｏＥＬ蛋白質の変異および改変がキメラ蛋白質の妥当な基礎を形成するであろうことも予想される。蛋白質、特に蛋白質の必須でない部分における保存的置換（conservative substitution）があっても機能には差し支えないことが知られており、事実、これらのキメラ蛋白質が導入される哺乳動物はＧｒｏＥＬ機能についてこれらに依存してはおらず、したがって少なくとも特定の部分における置換は構成性である必要はない。したがって、点突然変異などの遺伝子改変、ならびに欠失、切断、置換、逆位および重複などの再配列が起こったｇｒｏＥＬ遺伝子は、挿入された外因性アミノ酸配列と、好ましくは１つまたは複数の主要ＧｒｏＥＬ抗原決定基も適切に呈示する機能を有すると予想される。例えば、ＧｒｏＥＬ蛋白質は抗原決定基を規定している既存の親水性領域またはアミノ酸配列の部分的欠失を含みうるため、外因性アミノ酸配列はその中で部分的または完全に置換されていてもよい。これに関して、キメラ蛋白質は二重の七量体の環を形成し、それにより外因性アミノ酸配列の実質的な露出を提供しうることが好ましい。

前述の外因性アミノ酸配列は、キメラ蛋白質の表面に露出されるように、ＧｒｏＥＬアミノ酸配列に挿入される。したがって、外因性アミノ酸配列は、所望の免疫応答の誘導を担う受容体に接近可能なように存在する。より好ましくは前述のとおり、外因性アミノ酸配列をＧｒｏＥＬが生成される二重七量体環構造の表面に露出させる。

挿入に適した部位を決定するための１つのアプローチは、当該蛋白質の予測アミノ酸配列から疎水性プロットを計算し、１つまたは複数の親水性領域に外因性アミノ酸配列を挿入することである。したがって、複数の挿入部位を選択することが望ましいと考えられる。事実、当該微生物が複数の主要抗原決定基を有する場合、複数のさらなる抗原決定基を提供する複数の外因性アミノ酸配列を発現するために、多価挿入を形成することが望ましいと考えられる。

これに対するもう１つのアプローチは、外因性アミノ酸配列をそれ自体が抗原決定基であることが知られているＧｒｏＥＬ配列に挿入することである。これらはＰａｎｃｈａｎａｔｈａｎら、（１９９８）において同定されているとおりである。しかし、この後者のアプローチは必ずしも好ましくない。なぜなら、既存の主要抗原ＧｒｏＥＬ決定基ならびに外因性アミノ酸配列によって提供されるものの両方を有し、２つの抗原決定基が免疫応答のために提供される方がより好ましいためである。

ロドコッカスエクイＧｒｏＥＬに関して、親水性領域を下記の複数から選択することができる：Ｖ２６〜Ｓ５４、Ｖ７３〜Ｔ９０、Ｇ１０９〜Ａ１４４、Ｍ１９１〜Ｌ２４６、Ｒ２７０〜Ｉ２９０、Ｇ３４２〜Ａ３９７およびＶ４１５〜Ｎ４６８。
特に、Ｍ１９１〜Ｌ２４６が選択されうる。

他のＧｒｏＥＬ蛋白質におけるこれらまたは類似の親水性領域を、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（１９８１）の方法を用いて予測することができ、この方法はどのアミノ酸が抗原決定基でありうるかを予測するために用いることもできる。

このことに関して、ＧｒｏＥＬについてのアミノ酸／核酸の比較およびモデル研究において行われた詳細な研究が役立つ（Ｒｉｃｈａｒｄｏｎら、１９９８；Ｓａｉｂｉｌ、２０００）。これらのモデルおよび／または蛋白質配列の比較を用いて、外因性アミノ酸配列の良好な露出を提供する可能性が高い１つまたは複数の部位に関して、比較的詳しい情報に基づいた計算をすることができる。加えて、前述の２つの引用文献は、特定の微生物または他の標的抗原に対して用いるための適切なＧｒｏＥＬ配列を選択する際の助けとなりうる。

挿入は、既存の配列への直接挿入の形でありうる。したがって、外因性アミノ酸配列が１１アミノ酸の長さであれば、キメラ蛋白質はその基礎となるＧｒｏＥＬよりも１１アミノ酸長くなる。あるいは、いかなる表面露出ループもその元のサイズよりも小さく、またはおそらく同じサイズに保つために、外因性アミノ酸配列の挿入に加えてＧｒｏＥＬのいくつかのアミノ酸の欠失を行ってもよい。

外因性アミノ酸の選択は非常に重要であると予想される。一般的には、これらは直鎖抗原決定基であると予想される。蛋白質表面の抗原決定基は、抗体に結合することができる形状をしている。時に、露出されるアミノ酸の鎖が抗体による結合を誘発するような、直鎖のアミノ酸配列への十分な結合がある。これらの抗原決定基は直鎖抗原決定基として知られている。あるいは、連続するアミノ酸配列の複数の鎖が抗体結合に必要とされる。これらのより複雑な抗原決定基は、抗体が蛋白質表面の互いに近接するアミノ酸を認識したが、一次アミノ酸配列の折りたたみのために、同じ直鎖配列上では隣接していない場合に生じる。本発明は、より単純な直鎖抗原決定基の存在に特に関する。おそらくアミノ酸配列の２つの鎖が抗原決定基を形成し、ＧｒｏＥＬの隣接ループのスペーシングが元の抗原決定基とマッチしている場合、本発明をその目的のために適合させることができる。

直鎖抗原決定基の長さはかなり変動し、３〜４アミノ酸から約２５アミノ酸の範囲でありうる。

アミノ酸配列は病原性微生物の主要抗原決定基と反応するよう選択されると考えられる。特定の微生物菌株の感染により、一般に免疫応答はほんの少数の抗原決定基に対するものであることが判明している。実際、１つの抗原決定基が優位に立つことがある。加えて、認識される低位の抗原決定基があることもある。一般に、主要抗原決定基は感染微生物の認識および処分を担うものを含む免疫系の細胞に、より接近しやすいものである。主要抗原決定基に対する免疫を誘導することが望ましい。これらは、ワクチンとしてよりよい予防効果を提供するか、またはアレルゲンの場合にはより有効なトレランスを提供することが予想されるからである。事実、アレルゲンに対するトレランスを誘導する場合、用いる抗原決定基は当該個人がそれに対するアレルギー反応を有するものであると予想される。

したがって、外因性アミノ酸配列は、現在同定されている広範な主要抗原決定基から選択することができる。これらは例えば、下記の微生物から選択することができる。リステリアイバノビイ、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラエンテリカ、ボルダテラ属菌種、ミコバクテリア属菌種、ノカルジア属菌種、赤痢菌属菌種、腸病原性大腸菌、エルシニア属菌種、レジオネラ属菌種、フランシセラツラレンシス、ブルセラ属菌種、クラミジア、リケッチア。

本発明によって企図される適当な外因性アミノ酸配列の他の例は下記のとおりである。これらはライノウイルス、ロタウイルス、レトロウイルス、ポリウイルスなどのウイルス由来のものでありうる。ＨＩＶの適当な抗原決定基は、Ｅｎｓｈｅｌｌ−Ｓｅｉｊｆｆｅｒｓら（ＦＡＳＥＢ ２００１ １５；２０１２〜２０２０）によって同定されたものでありうる。Ｂｕｇｌｉら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１ ７５：９９８６〜９９９０）によりＥ２糖蛋白質に対して同定されたＣ型肝炎ウイルス。ＦｉｅｄｌｅｒおよびＧｏｇｇｅｎｄｏｒｆ（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）４４：１５４〜１６１）によって同定されたデルタ型肝炎ウイルス。

同様に、これらは様々なアレルゲン、例えばＦｏｃｋｅら（ＦＡＳＥＢ（２００１）１５：２０４２〜２０４４）により同定された特定の花粉抗原に対するワクチン接種のためでもある。

本発明に適した他のアミノ酸配列には、Ｉｒｖｉｎｇ、ＰａｎおよびＳｃｏｔｔ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００１）５：３１４〜３２４）によるランダムペプチドライブラリの総説、またはＰａｒｔｉｄｏ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７４〜７９）による総説において言及されているものが含まれると考えられる。

実際には外因性アミノ酸配列はさらにＧｒｏＥＬ配列であることが望ましいと考えられる。したがって、例えばＧｒｏＥＬ特異的抗原決定基の複数のコピーを提供することにより、増強された免疫反応を提供することが望ましいと考えられる。

ロドコッカスエクイは、莢膜を有する棹型のグラム陽性菌で、土壌環境で生存する土壌腐生菌であると考えられる。Ｒ．エクイは長い間ウマ、主に生後６カ月未満（特に生後１〜３カ月）の子ウマにおける病原体であると考えられていた。この菌による感染は肺外症状を伴い、しばしば細菌血症、リンパ節炎、髄膜炎および腸炎などの化膿性肉芽腫性肺炎を引き起こす（ＢａｒｔｏｎおよびＨｕｇｈｅｓ、１９８０；ＧｉｇｕｅｒｅおよびＰｒｅｓｃｏｔｔ、１９９７；Ｔａｋａｉ、１９９７）。感染症は治療しなければ致死的であることが多い。ウマで疾患の原因となる他に、Ｒ．エクイはウシ、ブタ、およびヤギの感染症も引き起こす（Ｂａｒｔｏｎ、１９９２）。Ｒ．エクイは免疫無防備状態のヒト、特にＡＩＤＳ患者で重度の肺および播種性疾患を引き起こすことも知られている（Ｃａｐｄｅｖｉｌａら、１９９７）。

オーストラリアでは、ほとんどのウマＲ．エクイ感染症は、子ウマの年齢ならびに暖かく乾燥した環境条件が動物の感染に対する感受性を高める夏（１２月から２月）に起こる（ＢａｒｔｏｎおよびＨｕｇｈｅｓ、１９８４）。

多くのワクチン候補が子ウマのＲ．エクイ感染予防について試験された。ワクチン候補は主に蛋白質サブユニットまたは全細胞製剤であった。Ｃｌｉｎｉｃａ Ｅｑｕｉｎａ（Ｃａｐｉｔａｎ Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ、アルゼンチン）により開発された「Ｒｈｏｄｏｖａｃ」として知られるワクチン製剤は、ＶａｐＡを含む可溶性の病原性Ｒ．エクイ抗原を高濃度で含む（Ｂｅｃｕら、１９９７）。他のＶａｐＡ含有抗原製剤も開発されている（Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、１９９７ａ）。加えて、死または生Ｒ．エクイを含むさまざまなワクチン製剤（Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、１９９７ｂ、Ｖａｒｇａら、１９９７）も試験されている。

Ｒ．エクイはコレステロールオキシダーゼ、ホスホリパーゼＣおよびレシチナーゼなどのさまざまな推定病原性因子を産生する（Ｓｍｏｌａら、１９９４）。しかし、より重要な推定病原性因子の１つはプラスミドによりコードされる１７ｋＤａの病原性関連蛋白質（ＶａｐＡ）であると考えられる。この蛋白質はＲ．エクイのウマ臨床単離株の９０％までにより産生されることが知られている。ＶａｐＡ産生株は疾患起因単離株の間で広く行きわたっているが、最近の研究によりＶａｐＡ蛋白質単独では子ウマで疾患を引き起こすのに十分ではなく、また不明の他のプラスミドにより生じる因子が関与している可能性があることが明らかにされている（Ｇｉｇｕｅｒｅら、１９９９）。病原性におけるＶａｐＡの役割はこれから解明されるが、この蛋白質をコードするプラスミドが微生物のマクロファージ内での生存において重要な役割を果たすことを示唆する強力な証拠がある（ＨｏｎｄａｌｕｓおよびＭｏｓｓｅｒ、１９９４）。

１つの特定の形態において、外因性アミノ酸はＶａｐＡ蛋白質の一部で、ロドコッカスエクイに関して優性であることが判明している抗原決定基でありうる（Ｖａｎｎｉａｓｉｎｋａｍら、２００１）。

Ｒ．エクイに感染したウマの血清中の抗体により認識されるＶａｐＡ蛋白質の推定２０アミノ酸領域はＴＳＬＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡＳＤＴＡＧＱ［配列番号２］と同定されているが、抗原認識のための最小領域はこの同定された配列内でさらに規定することができるか、さらに、この同定された配列が複数の別々の隣接エピトープを含みうることが理解されるであろう。したがって、アミノ酸配列はＶａｐＡ特異的免疫原性を提供するかぎり、この領域を模倣することができるいかなるペプチドであってもよい。したがって、ペプチドは本発明のアミノ酸配列ＴＳＬＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡＳＤＴＡＧＱ［配列番号２］、ならびに天然ＶａｐＡ蛋白質におけるその配列のいずれかの側の１つまたは複数のアミノ酸を含む、より大きいペプチドの一部であってもよい。

したがって、この態様の１つの形態において、アミノ酸配列は５つ以上のアミノ酸残基を有し、配列ＴＳＬＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡＳＤＴＡＧＱ［配列番号２］のすべてもしくは一部、またはその免疫学的に活性な誘導体もしくは類縁体を含む。好ましくは、ペプチドは７から３０のアミノ酸残基、より好ましくは１０から１２のアミノ酸残基を含む。最も好ましくは、ペプチド配列はＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡ［配列番号３］を含む。

本発明のペプチドがＶａｐＡ特異的免疫原性を提供するかどうかは、（Ｖａｎｎｉａｓｉｎｋａｎら２００１）に記載の方法に従って、常法により決定することができる。

本発明のこの態様のペプチドは、ペプチドがＶａｐＡ特異的免疫原性を提供するかぎり、前述のペプチドのいずれと相同であってもよい。この状況において、ペプチドはＲ．エクイＶａｐＡ蛋白質に特異的な抗体と免疫交差反応性である場合、本発明のペプチドと相同であると考えられる。当業者であれば、ペプチド内のアミノ酸配列には、ペプチドの構造または機能に著しい影響をおよぼすことなく変動しうるものもあることを理解すると思われる。したがって、例えば、「典型」アミノ酸置換は免疫交差反応性を保持し、したがってペプチドの免疫学的機能が置換によって変わらないかぎり、中性アミノ酸を別の中性天然または非天然アミノ酸と保存的に置換することができ、酸性アミノ酸を天然または非天然酸性アミノ酸と保存的に置換することができ、親水性アミノ酸を別の親水性アミノ酸と置換することができ、他も同様である、と予想される。

保存的置換として典型的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換；ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。好ましくは、相同ペプチドは本発明のペプチドと５０％の相同性を有し、より好ましくは７０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を有する。

一般に、挿入は核酸レベルで達成される。ＧｒｏＥＬ蛋白質をコードするベクターの精製ＤＮＡを用い、外因性アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を合成し、ＧｒｏＥＬ蛋白質をコードするＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼを用いて挿入部位で切断し、合成配列中に連結し、生成した組換えＤＮＡ分子を単離し、それを適当な宿主またはベクターに導入して、ＤＮＡワクチンまたは組換え蛋白質製剤を生成するためのＤＮＡを増幅する。

細胞性免疫（Ｔｈ１免疫）は本発明の使用によって増強されることが判明している。したがって、これは細胞内病原体に対してワクチン接種するための特に有用なアプローチであると予想される。免疫反応をＴｈ１免疫の方へさらに偏らせるために、ワクチンを核酸ワクチンとして提供することが望ましいと考えられる。

本発明のワクチンの予防効果を改善する様々な戦略があり、その多くは公知で、様々なアジュバントの使用を含む。研究により、ＩＬ−１８などの免疫刺激分子（Ｋｉｍら、２００１）を病原体特異的抗原をコードするＤＮＡワクチンと同時投与することで、Ｔｈ１型の防御反応を増強しうることが明らかにされている。このアプローチは、Ｒ．エクイに対する防御を提供する十分な免疫応答を誘導するために、本研究で用いるワクチンで観察されるＴｈ１型免疫のレベルを改善するのに有用であると考えられる。ワクチンの予防効果を改善するための他の戦略には、ｇｒｏＥＬ２に加えて他のＲ．エクイ遺伝子を含む多エピトープワクチンの開発、または宿主を免疫するためのプライムブースト法の使用が含まれる（ＲａｍｓｈａｗおよびＲａｍｓａｙ、２０００）。Ｉｌ−１２も長期の細胞性免疫の維持における役割が認められている（ＰａｒｋおよびＳｃｏｔｔ、２００１）。したがって、ＤＮＡワクチンまたは組換え蛋白質としてのＩＬ−１２の適当な主ワクチンと組み合わせての同時投与は、宿主におけるＲ．エクイに対する防御を増強することができる。

キメラ蛋白質は、蛋白質を精製し、免疫反応を誘発するために哺乳動物に投与するワクチン組成物を形成した後に投与してもよい。精製は公知の方法による。キメラ蛋白質は、発現微生物中に導入されるいくつかの公知の発現ベクターのいずれか１つによってコードされる。発酵の後に公知の方法による精製を行う。次いで、精製または半精製蛋白質を投与することができる。

投与は、皮下、筋肉内などの非経口であってもよく、または単純に粘膜表面に、たぶん経肺投与により供給してもよく、あるいは腹腔内投与でもよい。粘膜投与は、当該生物の侵入に対する障壁を提供するための局所粘膜免疫を誘導することを目的とすることもできる。

好ましくは、キメラ蛋白質は免疫原として有効な量のキメラ蛋白質を含む組成物または製剤としての医薬品剤形（pharmaceutical dosage form）で投与する。投与するキメラ蛋白質の量は、薬物動態パラメーター、治療する疾患の重症度、または望まれる免疫原応答に応じて変動する。用量は医師または獣医師が脊椎動物の年齢、体重、および免疫原剤形の場合には脊椎動物が過去にワクチン接種対象疾患の原因微生物に曝露されているかどうかを含む条件、ならびに本発明の医薬品剤形からのペプチドの放出特性を含む、関連因子を考慮して設定することができる。

組成物は注射してもよく、または「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、１９８０に記載されている当業者によく知られた担体であって、水、または低分子量アルカン、エチレングリコール、もしくはポリエチレングリコールやプロピレングリコールなどのポリアルカノールを含む他の極性物質、または非極性担体を含む薬学的に許容される担体に加えてもよい。

ワクチンの投与法は変動することがあり、静脈内、口腔内、経口、経皮および鼻内、ならびに筋肉内または皮下投与が含まれうる。好ましくは、ワクチンを吸入により投与し、これにより局所免疫を賦活させる。あるいは、ワクチンは他の粘膜初回抗原刺激の形式を用いて投与してもよい。

特にＧｒｏＥＬ／ｖａｐＡキメラ蛋白質の場合、肺系が病原性生物の伝播経路であるため、肺系に、おそらくはエアロゾルとして投与することが望ましい。

ワクチンはキメラ蛋白質を用いた組成物で提供してもよいが、もう１つの形態として、キメラ蛋白質は哺乳動物に対して、好ましくは適当な核酸ベクターに媒介されるキメラ蛋白質をコードする核酸の注入により提供することができる。この形態において、核酸（通常はＤＮＡベクター）は典型的には、公知の方法により筋肉内に導入する。細胞を形質転換するために細胞内に導入する核酸もある。そして、形質転換細胞はキメラ蛋白質を発現し、これは細胞表面に存在して免疫反応を誘導するか、または形質転換細胞の老化期に認められて免疫反応を誘発する。

ＤＮＡワクチンは、ウシなどの大きい動物における細菌およびウイルス感染症予防のための長期の細胞性免疫を誘導するために用いられている（Ｂａｂｉｕｋら、１９９８、Ｃｈａｐｌｉｎら、１９９９）。Ｌｏｗｒｉｅら、１９９７、１９９９はこのアプローチを用いて、ＧｒｏＥＬを基にしたＤＮＡワクチンにより結核に対する免疫を与えた。ＤＮＡの取り込みを助けるために、ブピバカインなどの物質による補助を必要とする。

ＤＮＡワクチン送達を促進するための代替法には、遺伝子銃接種（Ｙｏｓｈｉｄａら、２０００）、ワクチン担体としての弱毒細菌の使用（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、２００１）、またはプラスミドの電気導入（Ｂａｃｈｙら、２００１）などのワクチン送達法が含まれる。加えて、Ｔｈ１応答促進サイトカインまたはカチオンマンナンコーティングリポソーム（Ｔｏｄａら、１９９７）などのアジュバントの同時投与も試験することができる。あるいは、プラスミドＤＮＡを複製開始点および抗生物質耐性カセットを欠くスーパーコイル分子（ミニサークル）として投与することもできる。ミニサークルは現在用いられている多くのワクチンベクターよりも小さく、かつ安全である可能性があり、重要なことにはインビボで高レベルの発現を示すことが明らかにされている（Ｄａｒｑｕｅｔら、１９９９）。

様々な細菌病原体、特に結核菌（Ｌｏｗｒｉｅら、１９９７）およびオウム病クラミジア（Ｖａｎｒｏｍｐａｙら、１９９９）などの細胞内病原体に対するＤＮＡワクチンとなる可能性があるものが開発されている。一般に細胞内病原体は防御免疫のためにＴｈ１型応答を必要とするため、Ｔｈ１応答を誘発するために用いることができるＤＮＡワクチンアプローチは、ウシ結核菌のワクチン（ＢｅｈｒおよびＳｍａｌｌ、１９９７）で観察されたように時として効果にばらつきがあるサブユニットワクチン（Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌら、１９９７）または弱毒生ワクチンよりも有用である可能性がある、と仮定できる。しばしば、ＤＮＡワクチンで用いられる遺伝子は、主要抗原およびそれらをコードする遺伝子の同定後に選択される。これらのワクチン候補遺伝子によりコードされる蛋白質には、熱ショック蛋白質（Ｌｏｗｒｉｅら、１９９７）（Ｓｖａｎｈｏｌｍら、２０００）、分泌抗原（Ｋａｍａｔｈら、１９９９）、および外膜蛋白質（Ｐａｌら、１９９９）などのさまざまな他の免疫原を含んでいるものもあった。

本発明を下記の実施例により詳細に例示するが、どのような限定をも意図するものではない。

実施例
方法
微生物学的技術に着手するために一般的な分子生物学的方法を用いた。分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に一般的に記載されているとおりである。

実施例１ ＧＲＯＥＬのＲ．エクイのクローニングおよび配列決定
菌株およびプラスミド
ｇｒｏＥＬ２のクローニングおよび配列決定のためにＲ．エクイＡＴＣＣ ６９３９を用いた。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるヒスチジン（Ｈｉｓ）標識ＧｒｏＥＬ２の産生のためにベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いた。

細菌培養条件
細菌を蛋白質発現のためにＬ−ブロス中で培養した。形質転換体の増殖のためにコロンビア寒天を用いた。ｇｒｏＥＬ２のクローニングのために組み替えプラスミドの宿主として大腸菌ＤＨ５αを用い、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬの発現のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。

Ｒ．エクイ染色体の断片を含むｇｒｏＥＬ２遺伝子のＰＣＲ増幅
Ｒ．エクイｇｒｏＥＬ２遺伝子の断片を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマーの配列は、公知の結核菌Ｈ３７ ＲｖのｇｒｏＥＬ２の配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＬ０２１９３２）とツカムレラチロシノソルベンスのｇｒｏＥＬの配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ９０２０４）との間の相同領域に基づいている。（これらの遺伝子は、ツカムレラおよびミコバクテリア属がＲ．エクイに密接に関連しており（Ｒｕｉｍｙら、１９９５）、したがってＲ．エクイｇｒｏＥＬ２遺伝子と高度に類似したｇｒｏＥＬ２遺伝子を有する可能性があることを示す１６Ｓ ｒＲＮＡの研究に基づいて選択した。）

用いた順方向プライマーは５'−ＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧ−３'［配列番号４］で、逆方向プライマーは５'−ＧＴＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＣ−３'［配列番号５］であった。ＰＣＲ増幅は、アニーリング温度６４℃で、鋳型としてＲ．エクイ由来染色体ＤＮＡを用いて実施した。ＰＣＲ生成物を配列決定し、ジゴキシゲニンで標識した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）。次いで標識生成物をプローブに用いて、サザンブロット分析において下記の制限酵素で別々に消化したＲ．エクイ染色体ＤＮＡを調べた：ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｓｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩおよびＳｐｈＩ。消化酵素に応じてＲ．エクイ染色体ＤＮＡ中の異なる長さの断片を同定した。４．７ｋｂのサイズの単一のＳｐｈＩ断片を同定して、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（−）中にクローニングし（構築体をｐＩＭＶＳ−ＲｅＩと称する）、Ｒ．エクイ挿入のヌクレオチド配列を決定した。

ｐＩＭＶＳ−Ｒｅ１の配列決定を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｂｉｇ Ｄｙｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。

Ｒ．エクイ中でのＧｒｏＥＬ２の発現
Ｒ．エクイの１０ｍｌアリコートの２つをＬ−ブロス中、３０℃で振盪しながら一晩培養した。翌朝、それぞれのアリコートの培養物を３０℃または４２℃で２時間振盪培養した。次いで、培養物を１７，０００ｇで１５分間遠心沈降し、ペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳ中に再懸濁し、１分間超音波処理し、トラコーマ病原体Ｈｓｐ６０モノクローナル抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、米国コロラド州）を用いたウエスタンイムノブロット分析のために調製した。この抗体はトラコーマ病原体ＨＳＰ６０アミノ酸配列の５１７から５２２のアミノ酸に特異的で、大腸菌ＨＳＰ６０とは交差反応しないことが知られている。モノクローナル抗体の免疫反応性エピトープの最初の５残基（ＬＴＴＥＡＬ）［配列番号６］はＲ．エクイＧｒｏＥＬ２配列のアミノ酸残基５１２から５１６（図１）と同一で、したがってウエスタンイムノブロット分析で用いた時、この蛋白質を検出することが予想された。

配列分析を、ＧｅｎｅＢａｓｅ第１．０版（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ、Ｋｏｒｔｒｉｊｋ、ベルギー）およびＢＬＡＳＴＸ第２．０版（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を用いて実施した。ｇｒｏＥＬ２遺伝子のプロモーター領域を、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔプロモーター予測ウェブサイト（ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）を用いて解析した。

Ｒ．エクイｇｒｏＥＬ２遺伝子のサブクローニング
ｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクター中にクローニングするために、ｇｒｏＥＬ２遺伝子を、導入されたＮｃｏＩ部位（下線）を含む順方向プライマー５'−ＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣ−３'［配列番号７］および導入されたＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）を含む逆方向プライマー５'−ＣＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＣ−３'［配列番号８］を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲはＤｙＮＡｚｙｍｅ（登録商標） ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼを用い、アニーリング温度６１℃で、鋳型としてＣｓＣｌ勾配法で精製したｐＩＭＶＳ−Ｒｅ１の調製物を用いて標準的条件下で実施した。ＰＣＲ生成物およびベクターはＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで別々に消化し、連結して、構築体ｐＩＭＶＳ−Ｒｅ２を作製した（図２）。

Ｃ末端Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質の産生
プラスミドｐＩＭＶＳ−Ｒｅ２を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、下記の方法によりＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質を発現させ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。

ｐＩＭＶＳ−Ｒｅ２を含むクローンを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ−ブロス４ｍｌ中で一晩培養した。この培養物を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ−ブロス２００ｍｌに加え、３時間振盪培養した。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加えて蛋白質産生を誘導し、同じ条件下でさらに４時間培養した。次いで、培養物を３０００ｇで遠心沈降し、ペレットを−２０℃で終夜保存した。翌日、ペレットを溶解剤（lysis buffer）（２０ｍＭトリス、ｐＨ８および１００ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍｌに再懸濁し、５、１５秒パルスで超音波処理した。溶液を１７，０００ｇで１５分間遠心沈降した。上清を溶解剤中で２回洗浄（緩衝液１０ｍｌをＮｉ−ＮＴＡアガロースに加え、１７，０００ｇで１分間遠心沈降）したＮｉ−ＮＴＡアガロース１ｍｌに加えた。溶液をロータリーミキサー（２００ｒｐｍ）で２時間混合した。次いで溶液を５ｍｌのカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に導入し、カラム通過分を除去した。カラムに沈着したＮｉ−ＮＴＡスラリーを溶解剤５ｍｌで２回洗浄した（溶解剤をカラムに加え、重力で流出させた）。２５０ｍＭイミダゾール溶液の５００μｌ量を加えて、Ｎｉ−ＮＴＡスラリーから蛋白質を溶出（２回）し、蛋白質溶出液を１００μｌのアリコートに分けて−２０℃で必要時まで保存した。
ホールセルおよび蛋白質調製物を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した。

Ｃ末端６×Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２のＮ末端配列分析
精製したＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質１００μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、二フッ化ポリビニリデン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州）に転写した。次いで、蛋白質をエドマン分解法によるＮ末端アミノ酸配列決定にかけた（配列決定はＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｍａｃｑｕａｒｉｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州によって実施された）。

結果
オリゴヌクレオチドプライマーにより、Ｒ．エクイ由来の４０２塩基対（ｂｐ）ＰＣＲ生成物を増幅した。このＰＣＲ生成物はトリ結核菌およびパラ結核菌のｇｒｏＥＬ２配列と部分的に相同である（Ｐ＝６×１０^−６１）ことが判明し、推定ｇｒｏＥＬ２遺伝子を含むＲ．エクイゲノムの断片を有する形質転換体を同定するためにサザンハイブリダイゼーションにおけるプローブとして用いた。

４．７１３ｋｂの断片は、１６２３ｂｐの長さで推定分子量５６５４３．５Ｄａの蛋白質をコードするｇｒｏＥＬ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＦ２３３３８７）を含むことが判明した。この遺伝子は６８％という高いＧ＋Ｃ含有量を示したが、Ｒ．エクイはＧＣの多いゲノムを有することが知られている（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、１９８７）ため、驚くことではない。

ウエスタンイムノブロット分析から、４２℃で熱ショックを受けたＲ．エクイは約６０ｋＤａのサイズの蛋白質を産生し、この蛋白質は３０℃で培養したものには検出されないことが明らかとなった。

Ｒ．エクイＧｒｏＥＬ２のデータベース上の類似蛋白質に対する相同性
推測Ｒ．エクイＧｒｏＥＬ２蛋白質は、結核菌、ライ菌、トリ結核菌およびツカムレラチロシノソルベンスのＧｒｏＥＬ２蛋白質に、約９０％の同一性で非常に密接に関連していることが判明した。同様に、ストレプトミセスアルブス、ストレプトミセスリビダンスおよびストレプトミセスコエリコルなどの他のグラム陽性放線菌由来ＧｒｏＥＬ２様蛋白質にも関連していた（表２）。Ｒ．エクイＧｒｏＥＬ２は他の放線菌のＧｒｏＥＬ１配列に対しては相同性が低く（約６０〜６９％の同一性）、大腸菌およびヘリコバクターピロリなどの生物のＧｒｏＥＬ配列とは約６０％の同一性を有することが明らかとなった。

考察
ミコバクテリアおよびストレプトミセス属菌種などのＲ．エクイ関連生物には２つのｇｒｏＥＬ遺伝子がある（Ｒｉｎｋｅ ｄｅ Ｗｉｔら、１９９２）。これらのうちｇｒｏＥＬ１はｇｒｏＥオペロンの一部であると考えられるが、ｇｒｏＥＬ２は通常は染色体の異なる位置で見いだされる（Ｄｕｃｈｅｎｅら、１９９４）。配列決定したＲ．エクイ遺伝子は下記の理由からｇｒｏＥＬ２遺伝子と同定された。まず、他の放線菌ｇｒｏＥＬ２遺伝子と相同である（９０％の同一性）ことが判明した。さらに、上流にｇｒｏＥＳ様遺伝子を持たないようで、ｇｒｏＥオペロンの一部ではないことが示唆された。ミコバクテリアおよびストレプトミセスなどの他のＲ．エクイ関連細菌属菌種に関する過去の研究から、ｇｒｏＥＬ遺伝子の同様の配列が明らかにされている（Ｄｕｃｈｅｎｅら、１９９４、Ｒｉｎｋｅ ｄｅ Ｗｉｔら、１９９２）。Ｒ．エクイはＧｒｏＥＬをコードする少なくとも２つの遺伝子を含むようで、その１つは本研究で配列決定されたモノシストロニックなｇｒｏＥＬ２である。

推定Ｒ．エクイＧｒｏＥＬ２蛋白質と他の放線菌ＧｒｏＥＬ２蛋白質との間の高度の同一性は、熱ショック蛋白質は高度に保存されていることが知られていることから、驚くことではない。これらの蛋白質およびそれらをコードする遺伝子は高度に保存された性質を有するため、これらは細菌系統学試験において用いられることが多い（Ｇｕｐｔａ、２０００）。

実施例２
Ｒ．エクイに対するワクチン候補の開発
ｇｒｏＥＬ２を組み込んだＤＮＡワクチンの作製
ｇｒｏＥＬ２遺伝子をＰＣＲ増幅し、ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５）にクローニングした。開始コドンを含む順方向オリゴヌクレオチドプライマーは５'−ＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣ−３'［配列番号７］（ＫｐｎＩ部位に下線；開始コドンは太字）で、逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは５'−ＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＧＣ−３'［配列番号８］（ＸｂａＩ部位に下線）であった。順方向プライマーはＫｏｚａｋ配列ＣＣＡＴＧＧ（開始コドンに下線）（Ｋｏｚａｋ、１９８２）も含んでいた。

ＰＣＲは、鋳型であるＣｓＣｌ勾配法で精製したｐＩＭＶＳ−Ｒｅ１の調製物、およびＤｙＮＡｚｙｍｅ（登録商標） ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、フィンランド）を用い、アニーリング温度６５℃の標準的条件下で実施した。ＰＣＲ生成物およびｐｃＤＮＡ３ベクターはＫｐｎＩ／ＸｂａＩで別々に消化し、連結した。ワクチン調製のために、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１と命名した構築体（図３）を大腸菌ＤＨ５αにクローニングした。

もう一つのｇｒｏＥＬ２を組み込んだＤＮＡワクチン候補、すなわち理想的なＫｏｚａｋ配列を含まないものも作製した。この構築体は、ｇｒｏＥＬ２遺伝子を含む断片（約２ｋｂ、２７１４ｂｐから４７１０ｂｐ）を得るためにｐＩＭＶＳ−Ｒｅ１をＫｐｎＩ／ＸｂａＩで消化して作製した。この断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ３ベクターに連結した。この構築体をｐｃＤＮＡ３−ｈｓｐ１と命名し、次いでワクチン調製のために大腸菌ＤＨ５αにクローニングした。

ｖａｐＡを組み込んだＤＮＡワクチンの作製
ｖａｐＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５）にクローニングした。順方向オリゴヌクレオチドプライマーは５'−ＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＣＧ−３'［配列番号９］（ＢａｍＨＩ部位に下線；開始コドンは太字）で、逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは５'−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＧ−３'［配列番号１０］（ＥｃｏＲＩ部位に下線）であった。順方向プライマーはＫｏｚａｋ配列ＣＣＡＴＧＧ（開始コドンに下線）（Ｋｏｚａｋ、１９８２）も含んでいた。ＰＣＲは、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（登録商標） ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、フィンランド）、および鋳型としてＲ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１の小規模プラスミド抽出物を用い、アニーリング温度６５℃の標準的条件下で実施した。ＰＣＲ生成物およびｐｃＤＮＡ３ベクターはＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで別々に消化し、連結した。ワクチン調製のために、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２と命名した構築体を大腸菌ＤＨ５αにクローニングした（図４）。

改変Ｋｏｚａｋ配列を含まない、もう１つのｖａｐＡを組み込んだＤＮＡワクチン候補も作製した。この構築体は、制限部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを含む、ＰＣＲ増幅したｖａｐＡ遺伝子をｐｃＤＮＡ３に挿入することによって作製した。ｖａｐＡのＰＣＲ増幅のために下記のオリゴヌクレオチドを用いた：５'−ＴＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＡＴＴＡＣＣＧＧＣ−３'［配列番号１１］（順方向プライマー；ＢａｍＨＩ部位に下線）および５'−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＧ−３'［配列番号１２］（逆方向プライマー；ＥｃｏＲＩ部位に下線）。ＰＣＲ反応のために用いた鋳型はＲ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１のプラスミド抽出物で、ＰＣＲは、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（登録商標） ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、フィンランド）を用い、アニーリング温度５５℃の標準的条件下で実施した。ＰＣＲ生成物およびｐｃＤＮＡ３ベクターはいずれもＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで別々に消化し、連結した。この構築体をｐＩＭＶＳ−ｖａｐ１と命名し、ワクチン調製のために大腸菌ＤＨ５αにクローニングした。

ＶａｐＡの免疫原性を増強するための戦略
ワクチンとしてのＶａｐＡの免疫原性を高めるために、ＶａｐＡ Ｂ細胞エピトープをコードする遺伝子配列をｇｒｏＥＬ２に挿入して、キメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡ構築体を作製した。このアプローチは他の研究者らも用いており、彼らは、キメラ遺伝子構築体において、アジュバントとして作用する担体遺伝子は挿入エピトープに対する免疫応答を顕著に増強し、したがって通常のアジュバントが必要なくなることを明らかにしている（Ｆｏｍｓｇａａｒｄら、１９９８）。

過去の研究から、複合ワクチンにおける担体としての熱ショック蛋白質は複合抗原に対するＴ細胞性免疫応答を実質的に増強しうることが明らかにされている（Ｂａｒｒｉｏｓら、１９９２）ため、ｇｒｏＥＬ２遺伝子を担体として用いた。

真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡ３は他のワクチン研究においてうまく利用されている（Ｔｏｄｏｒｏｋｉら、２０００、Ｔｕｒｎｅｓら、１９９９）ため、これをＤＮＡワクチンの作製に用いた。重要なことに、このベクターはプラスミドワクチンの効果を増進すると考えられる免疫賦活性非メチル化シトシン−リン酸−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）配列を多く含むことが知られている（Ｃｏｈｅｎら、１９９８）（Ｓａｔｏら、１９９６、Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌら、１９９７）。さらに、筋肉内ワクチン接種で投与したプラスミドＤＮＡは、Ｔｈ１応答に関与するＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化すると考えられる（Ｌｅｃｌｅｒｃら、１９９７）。

用いた蛋白質ワクチンはヒスチジン残基で標識して、蛋白質を大腸菌で発現させた後にその天然の形で精製（Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いて）に便利なようにした。これは蛋白質ワクチン調製のためにこれまで他の研究者により用いられてきたアプローチである（ｖｏｎ Ｓｐｅｃｈｔら、２０００）。

キメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡを組み込んだＤＮＡワクチンの作製
キメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡワクチン構築体を、ＶａｐＡの免疫原性エピトープＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡ［配列番号３］をＧｒｏＥＬの親水性領域（ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの疎水性プロットによって示されるとおり）および予想した免疫原性エピトープ（Ｐａｎｃｈａｎａｔｈａｎによりチフス菌ＧｒｏＥＬで行われた試験に基づく）（Ｐａｎｃｈａｎａｔｈａｎら、１９９８）に挿入することによって調製した。ＶａｐＡエピトープＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡ［配列番号３］をコードするＤＮＡ配列をｇｒｏＥＬ２に、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（overlap extention PCR）突然変異生成を用いて挿入した（Ｈｏら、１９８９）（図６および図７）。最初の（２回の）ＰＣＲ反応における鋳型として構築体ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１を用いた。

これらの反応の１つで用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、５'−ＡＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＧＡＡＣＧＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴＣＣＴＣＧ−３'［配列番号１３］オリゴヌクレオチドプライマーＧＶＩＦ（挿入されるＶａｐＡエピトープに対応する配列に下線）および５'−ＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧ−３'［配列番号１４］−オリゴヌクレオチドプライマーＧＶＯＲであった。

他のＰＣＲは、５'−ＴＧＣＴＣＧＡＣＣＧＴＴＣＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＧ−３'［配列番号１５］（挿入されるＶａｐＡエピトープに対応する配列に下線）の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーＧＶＩＲおよび５'−ＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧ−３'［配列番号１６］（Ｋｏｚａｋ配列に下線）の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーＧＶＯＦを用いて実施した。

前述の両反応から得られたＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲルで分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて精製した。ＰＣＲ生成物それぞれ約１００ｎｇを最後のＰＣＲ反応の鋳型として用い、反応はオリゴヌクレオチドプライマーＧＶＯＦおよびＧＶＯＲ（前述の配列）を用いて実施した。

すべてのＰＣＲ反応はアニーリング温度５９℃の標準的条件を用いて実施した。ＰＣＲ生成物およびｐｃＤＮＡ３ベクターはＫｐｎＩ／ＸｂａＩで別々に消化し、連結した。構築体をｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３と命名し、ワクチン調製のために大腸菌ＤＨ５αにクローニングした（図８および図９）。

ＤＮＡワクチンの調製
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロスの１０ｍｌ量中、３７℃で６時間振盪しながら、ワクチン構築体を含む単コロニーを培養することにより、ワクチン構築体を増殖させた。この培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロス５００ｍｌに加え、３７℃で振盪しながら一晩培養した。翌日、大規模プラスミド抽出を実施した。プラスミド抽出物を、ＣｓＣｌ勾配遠心法で２回精製し、次いで１×ＴＥに対し一晩の透析を２回行った。

ワクチンの使用前に、プラスミド調製物を標準的技法（Ｒ．Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌ、ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ；ＤＮＡワクチン調製のプロトコル、ｈｔｔｐ：／／ｄｎａｖａｃｃｉｎｅ．ｃｏｍ）を用いて下記のとおりに処理した：ＮａＣｌ（最終濃度０．１Ｍ）および２倍量の無水エタノールをプラスミド溶液に加え、混合した。次いで、調製物を−２０℃で３０分間沈殿させた。ＤＮＡを１７，０００ｇで１５分間遠心沈降してペレットとした。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾し、１×ＰＢＳに再懸濁した（用いたＰＢＳの量は、処理したＤＮＡ調製物の元の量の半量であった）。

次いで、混入エンドトキシンを除去するために、ワクチン調製物を下記のとおりに処理した（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、１９９３）：トリトンＸ−１１４（ＴＸ−１１４）をワクチン調製物に、最終濃度１％（ｖ／ｖ）まで加え、混合した。混合物を氷上に５分間放置し、次いで４０℃で１０分間加熱して、相を分離させた。次いで、混合物を３０℃、３０００ｇで１０分間遠心沈降した。ＤＮＡを含む上部の水相を除去し、新しいＴＸ−１１４を加え、抽出工程を２回繰り返した。最後に、同量のイソプロパノールを加え、１７，０００ｇで遠心沈降してＤＮＡを沈殿させ、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１×ＰＢＳ（エンドトキシン非含有、Ｍｅｄｉａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＭＶＳ）に再懸濁した。ＤＮＡの濃度を定量し、１×ＰＢＳ中で希釈して１００μｇ／μｌに調節し、その後調節物をワクチンとして用いるために１００μｌずつに分けて−２０℃で保存した。

マウスを免疫する前に、最終ワクチン調製物中のエンドトキシンレベルが１０ｐｇ／ｍｌ未満であることを、ＱＣＬ−１０００ Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、米国メリーランド州ウォーカーズビル）（Ｌｉら、１９９９）により確認した（試験はＭｅｄｉａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＭＶＳにより実施された）。

ｇｒｏＥＬ２を組み込んだＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１）、ＶＡＰＡを組み込んだＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２）、およびキメラＧＲＯＥＬ２／ＶＡＰＡを組み込んだＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３）のＣｏｓ−７細胞における発現
Ｃｏｓ−７細胞を、Ｌ−グルタミン（ＣＳＬ、米国カンザス州）および１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含むＲＰＭＩ−１６４０細胞培地中で維持した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を確実に対数増殖期とするように継代培養した。約３×１０５細胞をＮｕｎｃ（登録商標）の３５ｍｍ細胞培養皿に加え、下記の方法を用いてｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３−ｈｓｐ１、ｐｃＤＮＡ３−ｖａｐ１、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２またはｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３ベクターで一時的にトランスフェクトした：Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の１５μｌ量を無血清細胞培地８５μｌで希釈し、室温で５分間インキュベートした。各ワクチン構築体調製物およびｐｃＤＮＡ３ベクター（ＣｓＣｌ勾配法で精製したプラスミド調製物５μｇ）をＦｕｇｅｎｅ（登録商標）混合物に別々に加え、室温で１５分間インキュベートした。次いで、混合物を新鮮培地中の細胞に加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃のインキュベーター内で４８時間インキュベートした。回収前に、細胞をコンフルエンスであるかチェックした。培地を遠沈管に移し、１×ＰＢＳ １ｍｌを細胞に加えた後、細胞培養皿の底から細胞を回収した。細胞を同じ遠沈管に加えた。次いで、遠沈管を１０，０００ｇで遠心沈降して、細胞をペレットとした。ペレットを１×ＰＢＳを加えて洗浄し、１０，０００ｇで遠心沈降した。最後に、ペレットを１×ＰＢＳ ５０μｌに再懸濁し、同量の試料緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンイムノブロットに用いた。

Ｈｉｓ標識ＶａｐＡ蛋白質をコードするプラスミドの調製
ｖａｐＡ遺伝子をｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクター中にクローニングするために、導入されたＮｃｏｌ部位（下線）を含む順方向プライマー５'−ＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＣＧ−３'［配列番号１７］および導入されたＸｈｏＩ部位（下線）を含む逆方向プライマー５'−ＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＣ−３'［配列番号１８］によるＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲは、鋳型としてＲ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１のプラスミド抽出物およびＤｙＮＡｚｙｍｅ（登録商標） ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、フィンランド）を用い、アニーリング温度６５℃の標準的条件下で実施した。ＰＣＲ生成物およびベクターをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで別々に消化し、連結して、構築体ｐＩＭＶＳ−Ｒｅ３を作製した（図５）。

Ｈｉｓ標識ＶａｐＡ蛋白質調製物
ｐＩＭＶＳ−Ｒｅ３からのＨｉｓ標識ＶａｐＡは、基本的にはＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２の産生について記載した方法を用い、下記の変更を加えて調製した：蛋白質をＮｉ−ＮＴＡアガロースから１００ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｎｉ−ＮＴＡアガロースに結合した蛋白質をうまく溶出するためにイミダゾールを用いることはできないため、ＥＤＴＡを用いた）を用いて溶出した。蛋白質溶出液を１×ＰＢＳで２回透析したが、ＴＸ−１１４を用いたエンドトキシン除去は行わなかった。この処理は、おそらくはこの蛋白質が親油性であるために、ＶａｐＡ蛋白質調製物からのエンドトキシン除去に効果的でないことが判明したためである。使用前に、蛋白質調製物中のエンドトキシンレベルを、ＱＣＬ−１０００ Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、米国メリーランド州ウォーカーズビル）を用いて定量すると（試験はＭｅｄｉａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＭＶＳによって実施された）、１００〜５００ｐｇ／ｍｌの間で変動した。Ｈｉｓ標識蛋白質を１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離し、ＶａｐＡ特異的モノクローナル抗体（Ｔａｋａｉら、１９９３ａ）を用いたウエスタンイムノブロットで検出した。

Ｈｉｓ標識キメラＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質を発現するプラスミドの作製
Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質を発現するキメラ遺伝子の調製法は、基本的にはｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３におけるｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡ産生に用いたものに、下記の変更を加えて行った：ＧＶＯＲの代わりに下記のプライマー５'−ＣＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＣ−３'［配列番号２１］（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線）を用い、その後Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ構築体（ｐＩＭＶＳ−Ｒｅ４）をｐＩＭＶＳ−Ｒｅ２について記載したように生成した。

Ｈｉｓ標識キメラＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質の調製
Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質の調製法は、基本的にはＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２生成について記載したとおりであった。精製蛋白質をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離し、ＧｒｏＥＬ２特異的モノクローナル抗体を用いてウエスタンイムノブロットで検出した。

結果
ｇｒｏＥＬ２を組み込んだＤＮＡワクチンのＣｏｓ−７細胞における発現
ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１でトランスフェクトした細胞でのみ約６０ｋＤａの大きい蛋白質バンドが観察され、ＧｒｏＥＬ２の産生が示された。この蛋白質バンドはトラコーマ病原体Ｈｓｐ６０特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンイムノブロット分析で検出した。

ＶＡＰＡを組み込んだＤＮＡワクチンのＣｏｓ−７細胞における発現
ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２でトランスフェクトした細胞において、約１９ｋＤａの蛋白質バンド、および約１５ｋＤａのより大きく拡散したバンドが発現された。ＶａｐＡ特異的モノクローナル抗体（Ｔａｋａｉら、１９９３ａ）を用いたウエスタンイムノブロット分析で検出した。ｐｃＤＮＡ３−ｈｓｐ２（理想的なＫｏｚａｋ配列を含まない構築体）でトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞またはｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトした細胞では蛋白質発現は認められなかった。ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２による１５および１９ｋＤａの蛋白質の発現は、クーマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ ＰＡＧＥでは観察されなかったが、ウエスタンイムノブロットでのみ観察された。これは、他の研究者らがクーマシーブリリアントブルー染色を用いたＳＤＳ ＰＡＧＥ上でのＶａｐＡの可視化において同様の困難を報告している（Ｓ．Ｔａｋａｉ、ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）ため、驚くことではなかった。

ＧＲＯＥＬ２／ＶＡＰＡを組み込んだＤＮＡワクチンのＣｏｓ−７細胞における発現
ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３（キメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡワクチン構築体）でトランスフェクトした細胞で、約６０ｋＤａの大きい蛋白質バンドが発現された。この蛋白質はＣｏｓ−７細胞で発現されたＧｒｏＥＬ２蛋白質よりもわずかに大きかった。

実施例３ マウス感染モデルにおいて評価したＲ．エクイ特異的ワクチンの免疫原性
ワクチンを使用する前に、蛋白質調製物をインビボでの使用に適するように下記のとおりに処理した。すべての調製物を１×ＰＢＳで２回透析した。ＴＸ−１１４を用いてＧｒｏＥＬ２およびキメラＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質調製物からエンドトキシンを除去した。Ｈｉｓ標識ＶａｐＡ調製物からはエンドトキシンを除去しなかった。ＴＸ−１１４による方法でこの調製物からエンドトキシンをうまく除去することができなかったためである。

エンドトキシンレベルをＱＣＬ−１０００ Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、米国メリーランド州）を用いて定量したところ、エンドトキシン処理した蛋白質調製物では１００ｐｇ／ｍｌ未満であり、未処理のＨｉｓ標識ＶａｐＡ蛋白質調製物では１００〜５００ｐｇ／ｍｌ前後であった。

試料の蛋白質濃度をＢｉｏｒａｄ蛋白質アッセイを用いて定量し、試料１００μｌずつに分けて必要時まで−２０℃で保存した。ワクチン接種前に、試料を室温で解凍し、１×ＰＢＳで２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。

生ワクチンにおける使用のためのＲ．エクイの調製および抗原投与試験（challenge test）
Ｒ．エクイ菌株ＡＴＣＣ ３３７０１を、過去に報告されている方法（Ｔａｋａｉら、１９９５ａ、Ｔａｋａｉら、１９９１ａ）を用いてマウスの感染のために調製した。動物試験での使用前に、Ｒ．エクイ菌株をｖａｐＡ遺伝子の存在についてＰＣＲで、ＶａｐＡの発現についてウエスタンイムノブロットで確認した。菌株を−７０℃で保存した一定量から、ＢＨＩブロス中、３７℃で撹拌しながら４８時間培養した。細菌を１０，０００ｇで１０分間遠心沈降してペレットとし、１×ＰＢＳで１回洗浄し、滅菌食塩水で希釈して、５５０ｎｍでのＯＤが約０．６の懸濁液を得た。この懸濁液を滅菌食塩水によって５０％希釈し、１００μｌ中に約１．５×１０^７の生物を含む最終接種材料を得た。懸濁液を滅菌食塩水でさらに希釈して、生ワクチンとして用いるために約１０^５の菌濃度とした。マウスに接種する直前に接種材料の一定量をＨＢＡに播種し、３７℃で４８時間インキュベートした後にコロニーを計数して、細菌の概数を遡及的に確認した。

試験に用いたマウス
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（各群５匹）を用いた。動物はＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＭＶＳ（Ｇｉｌｌｅｓ Ｐｌａｉｎｓ、南オーストラリア、アデレード）から入手した。これらは特定病原体不在（ＳＰＦ）であることが証明されていた。マウスの各群を免疫後、別々の上部にフィルターがついたケージに入れた。

マウスのＤＮＡワクチン接種
マウスの各群をｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３またはｐｃＤＮＡ３ベクター（対照群）でワクチン接種した。ＤＮＡ ５０μｇ（５０μｌ）をそれぞれの大腿四頭筋に注射した。

動物をワクチン接種前にＦｌｕｏｔｈａｎｅ（ハロタン）（登録商標）（Ｚｅｎｅｃａ、英国チェシャー州）の吸入により軽く麻酔した。これは、動物への注射を容易にするのと同時に、注射したＤＮＡが脚の動き（筋肉収縮）により排出されるのを防ぐために行った。動物に２週間の間隔で３回ワクチン接種した。

マウスの蛋白質ワクチン接種
１００μｇの濃度の蛋白質を含む蛋白質調製物５０μｌを、同量の１．３％水酸化アルミニウムゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、オーストラリア、ニューサウスウェールズ）と混合して１００μｌとし、各動物に投与した。マウスの各群にＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２、キメラＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡまたはＶａｐＡ蛋白質調製物でワクチン接種した。対照群のマウスには、１×ＰＢＳ １００μｌでワクチン接種した。２週間の間隔で３回腹腔内にワクチン接種し、各追加免疫前と投与の直前に採血した。

生Ｒ．エクイワクチン接種
マウス群を、他のワクチンとの比較のために致死量以下の生Ｒ．エクイで免疫した。動物に、約１０５の生Ｒ．エクイ菌株ＡＴＣＣ ３３７０１を腹腔内経路で投与してワクチン接種した。２週間の間隔で３回ワクチン接種し、各追加免疫前と投与の直前に採血した。ワクチンに用いた生物の数は過去の試験（Ｔａｋａｉら、１９９９ａ）に基づいて選択した。ワクチン接種前に、調製物の一定量をＨＢＡに播種し、調製物中の生菌数を遡及的に定量した。

マウスＩＬ−１２をコードするプラスミドとＤＮＡワクチン候補との同時投与
マウスサイトカインＩＬ−１２を発現するプラスミドｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国カリフォルニア州）（製造者によりこのプラスミドはマウスＩＬ−１２を分泌すると報告されており、いかなる改変もせずに用いた）を大腸菌ＤＨ５αに電気穿孔法により導入し、ＤＮＡワクチンを筋肉内注射用に前述（前述のＤＮＡワクチン調製の項を参照されたい）のとおりに調製した。ＩＬ−１２挿入断片は単一のＩＬ−１２の開いた読み枠を生成し、両サブユニットの同レベルの発現を確実にする、２つのウシエラスチンモチーフ（１０アミノ酸の長さ）で連結された２つのネズミＩＬ−１２サブユニット（ｐ３５およびｐ４０）をコードする遺伝子を含んでいた（Ｌｅｅら、１９９８）。この調製物５μｇを前述の抗原と同時に注射（筋肉内）した。

マウス血清試料の採取
各免疫の２週間後と投与の直前に、マウスの眼窩後方から血液試料を採取した。採血前に、Ｆｌｕｏｔｈａｎｅ（ハロタン）（登録商標）（Ｚｅｎｅｃａ、英国チェシャー州）の吸入により軽く麻酔した。マウス各群の血液試料を保存した（血液を含む試験管を室温で３０分間、次いで−４℃で１時間インキュベートし、最後に１０００ｇで遠心沈降して血清を除去し、必要時まで−２０℃で保存した）。

全ＩｇＧおよび免疫グロブリンサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ検出のためのＥＬＩＳＡ
免疫応答中に産生されるＩｇＧサブクラスのパターンは、その応答で産生されるサイトカインのタイプの信頼できる指標であることが広く認められている。一般に、ＩｇＧ２ａはＩＦＮ−γ応答（細胞性応答に関連）を反映すると考えられるが、ＩｇＧ１アイソタイプスイッチングはＩＬ−４（液性免疫に関連するサイトカイン）によって促進される（ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、１９８９）。

ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスのレベルの定量は下記のとおりに行った：Ｎｕｎｃ（登録商標） ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、コーティング緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３ １５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ３５ｍＭ；ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌ（各ウェル１００μｌ）のＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２またはＶａｐＡでコーティングし、ＥＬＩＳＡアッセイで用いた。マウス血清を、０．２５ｍｇ／ｍｌの大腸菌抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州）を含むＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０緩衝液で１／２５０に希釈し、室温で３０分間放置した後、ウェルに分配した。大腸菌抽出物は、血清試料中に存在する大腸菌特異的抗体とＥＬＩＳＡ抗原との交差反応により生じる可能性があるバックグラウンドの低減を助けるために用いた。用いた二次抗体はウサギ抗マウスＩｇＧ（ＨおよびＬ鎖特異的）、γ２ａ、γ２ｂまたはγ１鎖特異的ペルオキシダーゼに結合したアフィニティー精製モノクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、米国ペンシルバニア州）で、それぞれ１／５０００、１／４０００、１／５０００、および１／１０００に希釈した。反応溶液の波長４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）のＯＤをＥＬＩＳＡプレート読みとり器で読み取った。

結果をＨｉｓ標識ＶａｐＡおよびＧｒｏＥＬ２蛋白質を用いたウエスタンイムノブロットで確認した（結果は示していない）。

ＤＴＨ応答試験用の抗原の調製
Ｒ．エクイ菌株ＡＴＣＣ ３３７０１をＢＨＩブロス５００ｍｌ中３７℃で撹拌しながら４８時間培養した。培養物を１０，０００ｇで１０分間遠心沈降してペレットとし、１×ＰＢＳで２回洗浄した。ペレットを１×ＰＢＳ ２００〜５００μｌに再懸濁した。懸濁液を氷上で３０秒間超音波処理し、１０分間煮沸した。蛋白質濃度を定量し、１×ＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌに調節した。この調製物を必要時まで−２０℃で保存した。

ＤＴＨ応答試験
後足蹠のＤＴＨ応答を測定するために、２つの別々の試験（前述の異なるワクチン候補で免疫した３匹のマウス群に対して）を実施した。各マウスの右後足蹠に抗原２０μｌを注射し、対応する左後足蹠に１×ＰＢＳ ２０μｌを注射した。足蹠の厚みを２４、４８および７２時間後にＶｅｒｎｉｅｒノギスを用いて測定し（３回の測定値の平均を取った）、２４時間の時点での反応が対照に比べて最も有意であったため、この時点のＤＴＨをすべての解析で用いた。腫脹のパーセンテージを下記の式を用いて計算した：

Ｒ．エクイ抗原足蹠腫脹（ｍｍ）−ＰＢＳ足蹠腫脹／ＰＢＳ足蹠腫脹×１００

データの統計解析
データをウィルコクソンの（順位和）２標本検定を用い、有意レベルＰ≦０．０５で解析した。データは正規分布していないことが判明したため、非パラメーター検定を用いた。データをＳＡＳバージョン８．０１（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．米国ノースカロライナ州）を用いて解析した。

結果
Ｒ．エクイによる投与後にマウスで観察された症状
生Ｒ．エクイワクチンで免疫したものを除くすべての動物が、投与の２４時間後に軽度の疾患の症状を発症した。これらのマウスで有意な体重減少は認められず、感染で死亡した動物はなかった。マウスは投与後４または５日目までに完全に正常のようであった。

生Ｒ．エクイによるワクチン接種に対する免疫応答
生Ｒ．エクイでワクチン接種したマウスは、中等度に高いＩｇＧ２ａレベルおよび低いＩｇＧ１レベルによって示されるとおり、Ｔｈ１に偏った免疫応答を示した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ応答は追加免疫のたびに増大した。興味深いことに、ＶａｐＡ特異的抗体応答はＧｒｏＥＬ２特異的応答よりも高かった（表６．１）。重要なことに、有意なＤＴＨ応答もこれらのマウスで検出された。さらに、ワクチン接種したマウスは静脈内投与後にＲ．エクイのクリアランス促進を示した。

ＧｒｏＥＬ２を組み込んだワクチン候補に対する免疫応答
Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質およびＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１）ワクチン接種したマウスの双方で、Ｒ．エクイＧｒｏＥＬ２蛋白質に対するＩｇＧ２ａ抗体の有意なレベルが検出されたが、２回の追加免疫後、ＤＮＡワクチンは蛋白質ワクチンよりも高いＩｇＧ２ａ応答を誘発することが判明した（図１０Ｂ）。ＩｇＧ１（図１０Ａ）およびＩｇＧ２ａ抗体（図１０Ｂ）応答はいずれも、追加免疫毎に漸増的に高まった。最後の追加免疫後、ＤＮＡワクチンに対してＩｇＧ２ｂ応答（図１１Ａ）はＩｇＧ２ａ応答よりも低く、ＩｇＧ１応答よりも高かった。

ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２を加えると、最後の追加免疫後のＩｇＧ１応答が高まった。加えて、最後の追加免疫後、ＩｇＧ２ｂ応答も高くなった。最後の追加免疫後、ＩｇＧ２ａ応答は低かった。同時投与群のｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２におけるＤＴＨ応答はｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１で得られたものよりも低く、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１単独で得られるよりもＴｈ１への偏りが小さいことを示していた。

ＤＮＡおよびＨｉｓ標識蛋白質ワクチンで誘導されたＤＴＨ応答は、ベクターｐｃＤＮＡ３で免疫したマウスの応答に比べて有意であった（図１１Ｂ）。ＤＮＡワクチンｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１で誘導された応答はＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２でワクチン接種したマウスの応答よりも高かった。

ＶａｐＡを組み込んだワクチン候補に対する免疫応答
ＶａｐＡを組み込んだＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２）でワクチン接種したマウスにおいて、Ｈｉｓ標識ＶａｐＡ蛋白質に対する中等度のレベルのＩｇＧ２ａ抗体が検出された。ＩｇＧ１抗体のレベルはＩｇＧ２ａのレベルよりもはるかに低く（図１２Ａおよび図１２Ｂ）、Ｔｈ１に偏った免疫応答を示していた。Ｈｉｓ標識ＶａｐＡワクチンに対する免疫応答は、ＤＮＡワクチンに対するよりもＩｇＧ２ａでは高く、ＩｇＧ１応答でははるかに高く、免疫応答におけるＴｈ１型への偏りがＤＮＡワクチンで観察されるよりも弱いことを示していると考えられる。試験したＤＮＡおよび蛋白質ワクチンではいずれも、ＩｇＧ２ｂ応答（図１３Ａ）はＩｇＧ２ａよりも低く、ＩｇＧ１応答に比べるとほぼ同等またはそれよりも高く、ここでも免疫応答のＴｈ１への偏りが示された。これらの結果は、ＶａｐＡを組み込んだワクチンによって免疫応答におけるＴｈ１への偏りが誘発されたことを示すものである。ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２の同時投与は、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２へのＩｇＧ１応答を実質的に高め、同じくＩｇＧ２ａ応答も高めたが、最後の追加免疫までにすぎなかった。ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２の同時投与はＩｇＧ２ｂ応答を有意に変えることはなかった。

ｖａｐＡ ＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２）およびＨｉｓ標識ＶａｐＡワクチンでワクチン接種したマウスのＤＴＨ応答は、対照マウス（ｐｃＤＮＡ３単独でワクチン接種）よりも有意に高かった（図１３Ｂ）。

キメラＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡワクチン候補に対する免疫応答
ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３（ｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡキメラＤＮＡワクチン）およびキメラＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質ワクチンでワクチン接種したマウスにおいて、Ｒ．エクイＧｒｏＥＬ２蛋白質に対する有意なレベルのＩｇＧ２ａ抗体が検出された。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体応答はいずれも、追加免疫毎に漸増的に高まった。ＩｇＧ１抗体のレベルはＩｇＧ２ａのレベルよりもはるかに低く（図１４Ａ、図１４Ｂ）、免疫応答におけるＴｈ１への偏りを示していた。試験したＤＮＡおよび蛋白質ワクチンではいずれも、ＩｇＧ２ｂ応答（図１４Ａ）はＩｇＧ２ａよりも低く、ＩｇＧ１応答よりも高く、免疫応答のＴｈ１への偏りが示唆された。

ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３およびＨｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡでワクチン接種したマウスのＤＴＨ応答は、ｐｃＤＮＡ３ベクターでワクチン接種した対照群よりも有意に高かった（図１５Ｂ）。

ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２を加えると、最後の追加免疫後のＩｇＧ１応答が高まったが、ＩｇＧ２ａ応答は有意に変わることはなかった。最後の追加免疫後、ＩｇＧ２ｂ応答は有意に高くなった。

キメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡワクチン構築体におけるＶａｐＡ Ｂ細胞エピトープへの抗体検出アッセイ
ＶａｐＡ Ｂ細胞エピトープＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡ［配列番号３］への抗体を検出するために、キメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡ ＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３）で免疫したマウスからの血清をアッセイした。これは、標的抗原としてビオチン化ペプチドＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡ［配列番号３］によるＥＬＩＳＡを用いて実施した。加えて、別のＥＬＩＳＡでＨｉｓ標識ＶａｐＡを標的抗原として用いた。キメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡワクチンで免疫したマウスからの血清で得られたＯＤ値は、対照マウスからの血清で得られた値と有意差はなかった（結果は示していない）。これは、ＧｒｏＥＬ２に挿入したＶａｐＡエピトープがマウスにおいて検出可能なＩｇＧ応答を誘発しなかったことを示唆している。

ＤＮＡワクチンの比較
ｇｒｏＥＬ２（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１）およびキメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡ（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３）ワクチンはいずれも、有意な全ＩｇＧ、特に高いＩｇＧ２ａおよびＤＴＨ応答を生じた。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ応答は軽度から中等度であった。一般に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答はいずれもｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２存在下で増大する。ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１およびｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３によって生じた応答は一般にほぼ同等であったが、ＩｇＧ１応答は例外でｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１の方が高かった。驚くことではないが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体応答はいずれも、追加免疫毎に漸増的に高まった。

ｖａｐＡを組み込んだＤＮＡワクチンにより生じた免疫応答は他のＤＮＡワクチンよりも有意に低く、ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２を同時投与した場合、最初の追加免疫後にＩｇＧ２ａ応答で有意な増大が見られたが、ｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡ（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３）キメラワクチンで観察されたものほど高くはなかった。ｇｒｏＥＬ２を組み込んだワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１およびｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３）によって誘発されたＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩＦＮ−γ応答は、生ワクチンで観察されたものよりも有意に高く、ＤＮＡワクチンによるＴｈ１型免疫応答が有意に高いことが示唆された。これとは対照的に、生ワクチンで得られたＤＴＨ応答はどのプラスミドワクチンで観察されたものよりも有意に高かった（表３）。重要なことに、ＤＮＡワクチンは生ワクチンとは異なり、マウスのクリアランス増大を誘発するものはなかった。

蛋白質ワクチンの比較
一般に、３つのＨｉｓ標識蛋白質ワクチンはすべて主にＩｇＧ２ａ応答を誘発したが、生じたＩｇＧ１応答も対応するＤＮＡワクチン候補で観察された応答よりも実質的に高かった。これは、ＤＮＡワクチンと比較した場合に、蛋白質ワクチンによって誘発された免疫応答でＴｈ１への偏りが小さいことを示していた。

Ｈｉｓ標識ＶａｐＡワクチンは、試験した他の蛋白質ワクチンと比べて最も強いＤＴＨ応答を誘発した。しかし、この結果は部分的には、ＶａｐＡ調製物では他のワクチンに比べて比較的高レベルのエンドトキシンが存在すること（グラム陰性菌において発現された結果）が原因であると考えられる。興味深いことに、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２およびキメラＧｒｏＥＬ２ワクチンでさえも、生Ｒ．エクイ免疫マウスで観察されるよりも高い有意なＤＴＨ応答を引き起こした（表３）。

ｇｒｏＥＬ２を組み込んだＤＮＡワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１およびｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３）は、ＩｇＧをサブクラスに分けることによって示されるとおり、強いＴｈ１型免疫応答を誘発するようであった。これに関して、他の報告は他の細菌病原体に対して発生したｇｒｏＥＬ２を組み込んだＤＮＡワクチンで同様の知見を示している（Ｎｏｌｌら、１９９４）。重要なことに、これらのワクチンは、ｖａｐＡを組み込んだワクチン（ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２）よりも強くＴｈ１に偏っていると思われる免疫応答を誘発し、ｇｒｏＥＬ２がｖａｐＡよりも良好なＤＮＡワクチン候補である可能性が示唆された。

ＶａｐＡ Ｂ細胞エピトープＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡ［配列番号３］のｇｒｏＥＬ２への挿入は、より低いＩｇＧ１およびより高いＩｇＧ２ａ応答で観察されるとおり、ＧｒｏＥＬ２によって誘発されるＴｈ１応答を増強したようであった。

Ｈｉｓ標識蛋白質ワクチンは、対応するＤＮＡワクチンとは異なり、高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルで示されるとおり、有意なＴｈ１型免疫応答を誘発しなかった。他の研究者らは、感染のクリアランスに宿主のＴｈ１応答を必要とする細胞内病原体に対する蛋白質ワクチンの使用に関して、同様の知見を報告している（Ｔｕｒｎｅｒら、２０００）。

ｇｒｏＥＬ２を組み込んだＤＮＡワクチンは、ｖａｐＡを組み込んだＤＮＡワクチンよりも強くＴｈ１に偏った免疫応答を誘発することが明らかとなり、ＤＮＡワクチンとして投与した場合に、ｇｒｏＥＬ２はｖａｐＡよりも免疫原性が強いことを示していた。

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図１はロドコッカスエクイのＧｒｏＥＬ２をコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列［配列番号１］を示す図である。 図２はｐＩＭＶＳ−Ｒｅ２の物理的地図を示す図である。Ｃ末端に６個のヒスチジン残基を有するＧｒｏＥＬ２を発現するｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにＲ．エクイｇｒｏＥＬ２遺伝子を挿入した。ベクターは形質転換体選択のためのカナマイシンカセット（Ｋａｎ^ｒ）、Ｔ７プロモーター、および蛋白質発現誘導のためのＬａｃオペレーター（ｌａｃＩ）を含む。 図３は構築体ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１（改変Ｋｏｚａｋ配列を有するＲ．エクイｇｒｏＥＬ２を含むｐｃＤＮＡ３）の物理的地図を示す図である。ｇｒｏＥＬ２をクローニングするために用いた制限部位を示している。ベクターは抗生物質選択のためのアンピシリン耐性カセット（Ａｍｐ^ｒ）、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｐｃｍｖ）、およびエピソーム複製のためのＳＶ４０開始点を含む。 図４は構築体ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２（Ｒ．エクイｖａｐＡを含むＫｏｚａｋ配列を有するベクターｐｃＤＮＡ３）の物理的地図を示す図である。ｖａｐＡをクローニングするために用いた制限部位を示している。ベクターは抗生物質選択のためのアンピシリン耐性カセット（Ａｍｐ^ｒ）、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｐｃｍｖ）、およびエピソーム複製のためのＳＶ４０開始点を含む。 図５はｐＩＭＶＳ−Ｒｅ３の物理的地図を示す図である。Ｃ末端に６個のヒスチジン残基を有するＶａｐＡを発現するｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにＲ．エクイｖａｐＡ遺伝子を挿入した。ベクターは形質転換体選択のためのカナマイシンカセット（Ｋａｎ^ｒ）、Ｔ７プロモーター、および蛋白質発現誘導のためのＬａｃオペレーター（ｌａｃＩ）を含む。 図６はキメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡ ＤＮＡワクチン構築体ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３を作製するために実施したオーバーラップ伸長ＰＣＲの概略を示す図である。構築体ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１を最初の２回のＰＣＲ反応の鋳型として用い、挿入されたＶａｐＡエピトープを含む生成物を得た（破線はＶａｐＡエピトープの配列を示す）。次いで、これらの反応から得たＰＣＲ生成物を最後の反応の鋳型として用い、ワクチン構築体ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３を作製するために用いるＰＣＲ生成物を得た。 図７はＲ．エクイＧｒｏＥＬ２のアミノ酸配列を示す図である。太字の残基は免疫原性に大いに関連するＧｒｏＥＬ蛋白質内の領域に関連する親水性残基の領域を示している（他の研究者によって記載されているとおり）（Ｐａｎｃｈａｎａｔｈａｎら、１９９８）。矢印はＧｒｏＥＬ２へのＶａｐＡ免疫原性エピトープＮＬＱＫＤＥＰＮＧＲＡ［配列番号３］の挿入点を示している。 図８は構築体ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３（ｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡエピトープキメラ遺伝子を含むＫｏｚａｋ配列を有するベクターｐｃＤＮＡ３）の物理的地図を示す図である。ｖａｐＡをクローニングするために用いた制限部位を示している。ベクターは抗生物質選択のためのアンピシリン耐性カセット（Ａｍｐ^ｒ）、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｐｃｍｖ）、およびエピソーム複製のためのＳＶ４０開始点を含む。 図９はｐＩＭＶＳ−Ｒｅ４の物理的地図を示す図である。Ｃ末端に６個のヒスチジン残基を有する蛋白質を発現するｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにキメラｇｒｏＥＬ２／ｖａｐＡ遺伝子を挿入した。ベクターは形質転換体選択のためのカナマイシンカセット（Ｋａｎ^ｒ）、Ｔ７プロモーター、および蛋白質発現誘導のためのＬａｃオペレーター（ｌａｃＩ）を含む。 図１０はｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２または生Ｒ．エクイワクチンによる免疫後のＲ．エクイＧｒｏＥＬ２特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体応答を示す図である。抗体レベルを初回免疫の２、４および６週間後に定量した。データは平均および標準誤差で示している。データはウィルコクスン（順位和）２標本検定を用いて解析した（Ｐ＜０．０５）。（図１０Ａ）ＩｇＧ１応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。（図１０Ｂ）ＩｇＧ２ａ応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。ｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）（−）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１ ◆、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質 ▲、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２ ■、生Ｒ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１ ＊。 図１１はｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２または生Ｒ．エクイワクチンによる免疫後のＲ．エクイＧｒｏＥＬ２特異的ＩｇＧ２ｂ抗体応答およびＤＴＨ応答を示す図である。ＩｇＧ２ｂサブクラス抗体レベルを初回免疫の２、４および６週間後に定量した。ＤＴＨ応答を最後の追加免疫の２週間後に定量した。データは平均および標準誤差で示している。データはウィルコクスン（順位和）２標本検定を用いて解析した（Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＩｇＧ２ｂ応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。（Ｄ）遅延型過敏（ＤＴＨ）応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。 ｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）（−）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１ ◆、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質 ▲、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２ ■、生Ｒ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１ ＊。 図１２はｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２、Ｈｉｓ標識ＶａｐＡ蛋白質、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２または生Ｒ．エクイワクチンによる免疫後のＲ．エクイＶａｐＡ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体応答を示す図である。抗体レベルを初回免疫の２、４および６週間後に定量した。データは平均および標準誤差で示している。データはウィルコクスン（順位和）二標本検定を用いて解析した（Ｐ＜０．０５）。（図１１Ａ）ＩｇＧ１応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。（図１１Ｂ）ＩｇＧ２ａ応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。ｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）（−）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１ ◆、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質 ▲、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２ ■、生Ｒ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１ ＊。 図１３はｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２、Ｈｉｓ標識ＶａｐＡ蛋白質、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ２＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２または生Ｒ．エクイワクチンによる免疫後のＲ．エクイＶａｐＡ特異的ＩｇＧ２ｂ抗体応答およびＤＴＨ応答を示す図である。ＩｇＧ２ｂ抗体レベルを初回免疫の２、４および６週間後に定量した。ＤＴＨ応答を最後の追加免疫の２週間後に定量した。データは平均および標準誤差で示している。データはウィルコクスン（順位和）２標本検定を用いて解析した（Ｐ＜０．０５）。（図１２Ａ）ＩｇＧ２ｂ応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。（図１２Ｂ）遅延型過敏（ＤＴＨ）応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。ｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）（−）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１ ◆、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質 ▲、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２ ■、生Ｒ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１ ＊。 図１４はｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３、Ｈｉｓ標識キメラＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２または生Ｒ．エクイワクチンによる免疫後のＲ．エクイＧｒｏＥＬ２特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体応答を示す図である。抗体レベルを初回免疫の２、４および６週間後に定量した。データは平均および標準誤差で示している。データはウィルコクスン（順位和）二標本検定を用いて解析した（Ｐ＜０．０５）。（図１４Ａ）ＩｇＧ１応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。（図１４Ｂ）ＩｇＧ２ａ応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。ｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）（−）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１ ◆、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質 ▲、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２ ■、生Ｒ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１ ＊。 図１５はｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２／ＶａｐＡ蛋白質、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ３＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２または生Ｒ．エクイワクチンによる免疫後のＲ．エクイＧｒｏＥＬ２特異的ＩｇＧ２ｂ抗体応答およびＤＴＨ応答を示す図である。ＩｇＧ２ｂサブクラス抗体レベルを初回免疫の２、４および６週間後に定量した。ＤＴＨ応答を最後の追加免疫の２週間後に定量した。データは平均および標準誤差で示している。データはウィルコクスン（順位和）二標本検定を用いて解析した（Ｐ＜０．０５）。（図１５Ａ）ＩｇＧ２ｂ応答：キメラ蛋白質ワクチン構築体のみが対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。（図１５Ｂ）遅延型過敏（ＤＴＨ）応答：すべてのワクチン構築体は対照に比べて統計学的に有意な応答を誘発した。ｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）（−）、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１ ◆、Ｈｉｓ標識ＧｒｏＥＬ２蛋白質 ▲、ｐｃＤＮＡ３−Ｒｅ１＋ｐＯＲＦ−ｍＩＬ１２ ■、生Ｒ．エクイＡＴＣＣ ３３７０１ ＊。

Claims (42)

1. 表面に露出する外因性アミノ酸配列が挿入されたＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であり、前記外因性アミノ酸配列が抗原決定基に特異的に反応する免疫応答を誘発するよう構成されているキメラ蛋白質。
2. 前記外因性アミノ酸配列が前記ＧｒｏＥＬ蛋白質の親水性領域に挿入されている、請求項１記載のキメラ蛋白質。
3. 前記外因性アミノ酸配列がＧｒｏＥＬ抗原決定基を含む前記ＧｒｏＥＬ蛋白質の位置に挿入されている、請求項１記載のキメラ蛋白質。
4. 前記ＧｒｏＥＬがＲ．エクイ（Ｒ．ｅｑｕｉｉ）由来である、請求項２記載のキメラ蛋白質。
5. 前記親水性領域がＶ２６〜Ｓ５４、Ｖ７３〜Ｔ９０、Ｇ１０９〜Ａ１５５、Ｍ１９１〜Ｌ２４６、Ｒ２７０〜Ｉ２９０、Ｇ３４２〜Ａ１９７、およびＶ４１５〜Ｎ４６８からなる疎水性領域の群より選択される、請求項４記載のキメラ蛋白質。
6. 前記親水性領域がＭ１９１〜Ｌ２４６である、請求項４記載のキメラ蛋白質。
7. 前記外因性アミノ酸配列が３から２５アミノ酸の範囲の長さを有する、請求項１記載のキメラ蛋白質。
8. 前記外因性アミノ酸配列が約１１アミノ酸の長さを有する、請求項１記載のキメラ蛋白質。
9. 前記外因性アミノ酸配列が病原性細菌種の主要抗原決定基を含む、請求項１記載のキメラ蛋白質。
10. 前記ＧｒｏＥＬ蛋白質が前記病原性細菌種由来である、請求項９記載のキメラ蛋白質。
11. 前記病原性の種がロドコッカスエクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｉ）であり、前記主要抗原決定基がＶａｐＡ蛋白質由来である、請求項９記載のキメラ蛋白質。
12. 前記抗原決定基が配列番号２の中に存在するものである、請求項１１記載のキメラ蛋白質。
13. 前記抗原決定基が配列番号３の中に存在するものである、請求項１１記載のキメラ蛋白質。
14. キメラ蛋白質をコードする配列および前記キメラ蛋白質発現のために配置される制御因子を含む核酸分子であって、前記キメラ蛋白質は表面に露出する外因性アミノ酸配列が挿入されたＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であり、前記外因性アミノ酸配列は抗原決定基に特異的に反応する免疫応答を誘発するよう構成されている核酸分子。
15. 前記外因性アミノ酸配列が前記ＧｒｏＥＬ蛋白質の親水性領域に挿入されている、請求項１４記載の核酸分子。
16. 前記外因性アミノ酸配列がＧｒｏＥＬ抗原決定基を含むＧｒｏＥＬ蛋白質の位置に挿入されている、請求項１４記載の核酸分子。
17. 前記ＧｒｏＥＬ蛋白質がＲ．エクイ由来である、請求項１５記載の核酸分子。
18. 前記外因性アミノ酸配列が３から２５アミノ酸の範囲の長さを有する、請求項１４記載の核酸分子。
19. 前記外因性アミノ酸配列が病原性細菌種の主要抗原決定基を含む、請求項１４記載の核酸分子。
20. 前記ＧｒｏＥＬ蛋白質が前記病原性細菌種由来である、請求項１９記載の核酸分子。
21. 前記病原性の種がロドコッカスエクイであり、前記主要抗原決定基が前記ＶａｐＡ蛋白質由来である、請求項１９記載の核酸分子。
22. 前記抗原決定基が配列番号２の中に存在するものである、請求項２１記載の核酸分子。
23. 前記キメラ蛋白質が前記蛋白質の精製を助ける非ＧｒｏＥＬ配列も含む、請求項１４記載の核酸分子。
24. 複数のヒスチジン残基が前記キメラ蛋白質のＣ末端に付加されている、請求項２３記載の核酸分子。
25. 免疫応答を誘発するための宿主細胞における発現のプロモーターを含む、請求項１４記載の核酸分子。
26. 前記ＤＮＡ分子ベクターが共刺激分子をコードし、前記共刺激分子が宿主の前記免疫応答を刺激することができる、請求項２５記載の核酸分子。
27. 哺乳動物において抗原決定基に対する免疫応答を誘発する方法であって、前記哺乳動物にキメラ蛋白質を投与する工程を含むとともに、前記キメラ蛋白質が表面に露出する外因性アミノ酸配列が挿入されたＧｒｏＥＬ蛋白質、その修飾体または類縁体であり、前記外因性アミノ酸配列が抗原決定基に特異的に反応する免疫応答を誘発するよう構成されている方法。
28. 前記外因性アミノ酸配列が前記ＧｒｏＥＬ蛋白質の親水性領域に挿入されている、請求項２７記載の免疫応答誘発法。
29. 前記外因性アミノ酸配列がＧｒｏＥＬ抗原決定基を含む前記ＧｒｏＥＬ蛋白質の位置に挿入されている、請求項２７記載の免疫応答誘発法。
30. 前記外因性アミノ酸配列が３から２５アミノ酸の範囲の長さを有する、請求項２７記載の免疫応答誘発法。
31. 前記外因性アミノ酸配列が病原性細菌種の主要抗原決定基を含む、請求項２７記載の免疫応答誘発法。
32. 前記ＧｒｏＥＬ蛋白質が前記病原性細菌種由来である、請求項３１記載の免疫応答誘発法。
33. 前記病原性の種がロドコッカスエクイであり、前記主要抗原決定基が前記ＶａｐＡ蛋白質由来である、請求項３１記載の免疫応答誘発法。
34. 前記抗原決定基が配列番号２の中に存在するものである、請求項３３記載の免疫応答誘発法。
35. 前記ＧｒｏＥＬ蛋白質がＲ．エクイ由来である、請求項２８記載の免疫応答誘発法。
36. 前記免疫応答が前記抗原決定基に特異的な抗体応答を含む、請求項２７記載の免疫応答誘発法。
37. 前記抗体応答がＩｇＧ１に比べてＩｇＧ２ａで比例的に大きい、請求項３６に記載の免疫応答誘発法。
38. 前記キメラ蛋白質を薬学的に許容される担体中の精製された形で投与する、請求項２７記載の免疫応答誘発法。
39. アジュバントを同時投与する、請求項３８記載の免疫応答誘発法。
40. 哺乳動物の細胞に挿入されるとキメラ蛋白質が細胞内で発現されるように、キメラ蛋白質を発現可能な核酸分子を哺乳動物に投与する、請求項２７記載の免疫応答誘発法。
41. 前記核酸が前記細胞内で免疫刺激分子も発現する、請求項４０記載の免疫応答誘発法。
42. 前記核酸を筋肉内注射により投与する、請求項４０記載の免疫応答誘発法。

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