JP5250812B2 - ヘリコバクター・ピロリ菌由来の新規抗原、抗原組成物およびピロリ菌抗体の検出方法。 - Google Patents

Description

本発明は、ヘリコバクター感染症の血清抗体診断法に用いるヘリコバクター・ピロリ菌由来の抗原蛋白質およびその蛋白質を含有する抗原組成物に関する。

ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori、以下、ピロリ菌と称する）は、胃炎や胃潰瘍・十二指腸潰瘍などと関連性の高い菌であり、その感染者は世界人口の約40-50％に達するものと考えられている。
ピロリ菌の検出法には培養法、ウレアーゼテスト、呼気テスト、組織学的検査、血清学的方法がある。特に血清学的方法は血清中の抗ピロリ菌抗体を検出する方法であり、非侵襲的で大量の検体を処理できる点で優れている。血清中の抗ピロリ菌抗体は多様であるため、抗体測定に用いる抗原の調製方法や、種類により、その測定感度や、特異性が異なり、その結果、抗ピロリ菌抗体を測定することの臨床的意義も多種多様である。
ピロリ菌由来の抗原として、例えば、ピロリ菌の膜外層に由来する分子量３００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、等電点（ｐＩ）５.９〜６.９でウレアーゼ活性をもつもの（特許文献１）、ピロリ菌をリゾチーム処理、次いでＮ−アセチルグルコサミダーゼ処理して得られる電気泳動で６５〜７０ｋＤａ、７５〜８６ｋＤａ、約１３２ｋＤまたは約１４０ｋＤａであるもの(特許文献２）、ピロリ菌の膜破砕物から得られる分子量１０〜１００ｋＤａのもの（特許文献３）、ＣＰ２抗原と称される分子量約６０ｋＤａのもの（特許文献４）、ピロリ菌の細胞付着タンパク由来のＳＤＳ電気泳動で分子量約１６〜２００ｋＤａでウレアーゼ枯渇活性をもつもの（特許文献５）などが知られている。
一方、ピロリ菌株のゲノム解析から、ピロリ菌はアジア株、ヨーロッパ株、アフリカ株といったグループに分けられること、また、ピロリ菌の細胞空胞化毒素関連蛋白（ＣａｇＡ）多型の研究から東アジア型、アジア型、欧米型といったグループに分けられることが知られている（非特許文献１）。
ＨＭ−ＣＡＰと称される米国人に由来するピロリ菌株から得られた抗原に比して、日本人に由来するピロリ株から得られた抗原（ＪＨＭ−ＣＡＰ)で、日本人の血清中のピロリ抗体の検出を行うと偽陰性が減少することが報告されている（非特許文献２および３）。

特表平３−５０４４１２ 特開２０００−２７０６ 特開平１０−２６４５５３ 特開平９−３２２７７２ 特開平５−２６４５５３ 化学療法の領域, Vol.2, No.7, 928-934, 2005 J. Clin. Microbiol., Vol.41, No.4, 1480-1485, 2003 Helicobacter Research, vol.9, no.3, 183-185, 2005

日本人に由来するピロリ株から得られた抗原（ＪＨＭ−ＣＡＰ)で、日本人の血清中のピロリ抗体の検出を行うと偽陰性が減少することが報告されているものの、抗原の詳細についてのは不明である。

本発明の抗原組成物は、複数の異なる疾患の日本人から分離したピロリ菌株から得られた高分子蛋白質、具体的には、（Ａ）ヘリコバクター・ピロリ菌から抽出され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約１００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を示す、細胞毒素関連蛋白（ＣａｇＡ）の一部である蛋白質、（Ｂ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約１００ｋＤａの分子量を示し、等電点及び分子量に基づく二次元電気泳動で８１ｋＤａ〜１２５ｋＤａ間に３つ以上に分離され、ウレアーゼ活性を示さない蛋白質、（Ｃ）さらに、（Ａ）の蛋白質がアミノ酸配列のＮ末端から９９０番目以降のアミノ酸が欠落した細胞毒素関連蛋白（ＣａｇＡ）であること、このＣａｇＡの一部は、抗原組成物の製造工程で生成することを見出し、本発明を完成した。
以下、詳細に本発明を説明する。

本発明に使用されるピロリ菌は、胃炎、胃潰瘍・十二指腸潰瘍を患っている日本人患者の胃液または胃粘膜から分離した菌（以下、分離菌と称する。）である。
本発明の組成物（以下、ＪＨＭ−ＣＡＰと称する。）は、培養液から分離したピロリ菌を、アルキルグルコシド系界面活性剤を含有する緩衝液で処理し、可溶化された抽出物を、ゲル濾過クロマトグラフィーに供し、高分子画分を得、該画分を濃縮・脱塩して得られるものである。
アルキルグルコシド系界面活性剤として、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、n-オクチル-α-D-グルコピラノシド、n-オクチル-β-D-チオグルコピラノシド、n-へプチル-β-D-チオグルコシドなどが挙げられるが、n-オクチル-β-D-グルコピラノシドが好ましい。アルキルグルコシド系界面活性剤含有緩衝液におけるアルキルグルコシド系界面活性剤の濃度は、０.５〜１.５％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは１％である。
緩衝液として、膜タンパク質可溶化に使用されるものであれば、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝食塩液が挙げられる。
ゲル濾過クロマトグラフィーのゲルとして、デキストリンゲル、アガロースゲルなどが挙げられるが、アガロースゲルが好ましい。
濃縮・脱塩は、タンパク質の精製に用いられる方法であれば特に限定されないが、具体的には、硫酸アンモニウムを使用した塩析法とセロファンを使用した透析法を組み合わせて行えばよい。

分離菌の培養は個別に行っても複数の分離菌を混合してもよいが、個別に培養した場合には、集菌したものを混ぜ合わせて、可溶化処理を行ってもよく、また、濃縮・脱塩して得られたものを混合してもよい。
分離菌の培養は、通常、ピロリ菌の培養に使用される方法、例えば、寒天平板、液体培地のいずれでも使用することができる。具体的には、ブレインハートインフージョン(ＢＨＩ)と馬血液とで作られる血液寒天平板に分離菌を接種し、37℃、炭酸ガス下で数日培養した後、ＨＰを平板から集菌する。あるいは、馬血清、ウサギヘモグロビン、酵母エキスを含むＢＨＩからなる液体培地で、血液寒天平板と同様の条件で培養すればよい。

上記のようにして得られた本発明の抗原組成物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約１００ｋＤａの分子量を示し、等電点及び分子量に基づく二次元電気泳動で８１ｋＤａ〜１２５ｋＤａ間に３つ以上に分離される蛋白質を含んでいる。また、本発明の抗原組成物はウレアーゼ活性を示さない。さらに本発明の抗原組成物は、細胞毒素関連蛋白（ＣａｇＡ）の一部である。より具体的には、例えば、配列番号１で示されるＣａｇＡでは、９９０番目以降のアミノ酸が欠落したＣａｇＡある。また、このアミノ酸欠落ＣａｇＡは、日本人由来のピロリ菌をアルキルグルコシド系界面活性剤を含有する緩衝液で処理し、可溶化された抽出物を、ゲル濾過クロマトグラフィーに供して作製される工程でのみ生成する（図４）。アメリカ人由来のピロリ菌を原料として同様の工程で作製される抗原組成物（ＨＭ−ＣＡＰ）では、アミノ酸欠落のない約１２０ｋＤａのＣａｇＡが存在する（図５）。

本発明の抗原組成物を用いて、ピロリ菌の抗体を検出・定量するには、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、補体結合、ラテックス粒子凝集法、イムノブロット法、受動的免疫凝集法などを用いて行えばよい。好ましい方法としてＥＬＩＳＡが挙げられる。この方法は固相支持体にＪＨＭ−ＣＡＰ抗原を固定化することを含んでいる。具体的にはＪＨＭ−ＣＡＰ抗原を固定化した後、検査すべき血清試料を固定化したＪＨＭ−ＣＡＰ抗原と結合させ、それらを一定時間室温で湿潤な条件でインキュベートし、抗原−抗体結合体を形成させる。次いで酵素標識抗ヒトＩｇＧを固相支持体上の抗原−抗体結合体に加え反応させ、抗原−抗体−酵素標識抗ヒトＩｇＧ複合体を形成させる。次いで、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を加え、反応性生成物の検出・定量することにより血清中に存在する抗体を検出・定量することができる。

本発明の抗原組成物により、日本人の血清中のＨＰ抗体を測定した場合、アメリカ人由来の分離菌から得られる抗原組成物での測定に比して、高感度で特異性の高い検出が可能となり偽陰性を減少させることができる。
次に、実施例で本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。

実施例
（１）ピロリ菌の培養
北海道大学において分離された日本人由来の４種類の分離菌（１５９Ａ株、１９３Ｃ株、１９８Ｃ株、２２５株）を直径１０ｃｍの血液寒天平板（トリプチケースソイ５％ヒツジ血液寒天培地、日本ベクトン・ディッキンソン社）で、５％酸素、１０％炭酸ガス、８５％窒素の雰囲気下、３７℃、湿度１００％で４８−７２時間培養した。
平板上で増殖した分離菌を集菌し、リン酸緩衝生理食塩液で２回洗浄した後、細菌タンパク質抽出キット（Ｂ−ＰＥＲ、ピース（Ｐｉｅｒｃｅ）社）で粗抽出物を得た。

（２）抗原の作製
粗抽出物を１％−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有したリン酸緩衝食塩液に溶解させ、緩衝食塩液に対し透析および遠心分離して可溶性蛋白質を得た。次いで、可溶性蛋白質を、０.０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）で平衡化したアガロースＡ−５カラムに通した後、硫酸アンモニウムで沈殿させ、透析して、高分子量蛋白質のＪＨＭ−ＣＡＰ（蛋白質濃度：７.２ｍｇ／ｍｌ）を得た。同様にして、アメリカ人由来の分離菌（１９７ＳＲ−ＵＳ）からＨＭ−ＣＡＰ（蛋白質濃度：１１.２ｍｇ／ｍｌ）を得た。

（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＪＨＭ−ＣＡＰおよびＨＭ−ＣＡＰを適宜希釈し、５〜２０％グラジュエントゲルを使用しＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、蛋白質をニトロセルロース膜に転写し、イムノブロュティングを行った。イムノブロュティングは、５００倍希釈の小児血清、リン酸緩衝食塩液で１０００倍に希釈したパーオキサイド標識抗ヒトグロブリンＧヒツジ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．）を使用し、化学ルミネセンスにより検出した。その結果を図１に示した。

（４）二次元電気泳動
精製蛋白（ＨＭ−ＣＡＰまたはＪＨＭ−ＣＡＰ）を溶解液（８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ ＤＴＴ、０.２％Ｂｉｏ−ＬｙｔｅＲ３／１０、０.００１％ＢＰＢ）に溶解し、この溶液で固定化ｐＨ勾配プレキャストゲル［ＩＰＧ ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐＲ、１７ｃｍ、ｐＨ３−１０（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社）］を膨潤させる。等電点電気泳動装置［プロティアンＩＥＦセル（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社）］にゲルを置き、次の条件で電圧をかける。ステップ１：０〜２５０Ｖ、１５分。ステップ２：２５０Ｖ〜１００００Ｖ、２時間。ステップ３：１００００Ｖ、５００００Ｖｈｏｕｒ。終了後、ゲルを平衡化液１[６Ｍ尿素、０.３７５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８.８）、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２％ＤＴＴ]で２０分間、次いで平衡化液２［６Ｍ尿素、０.３７５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８.８）、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２.５％ヨードアセトアミド］で１０分間、平衡化する。アクリルアミドゲル（１８.３×１９.３×０.１ｃｍ、７.５％）に平衡化したゲルをセットし、ＳＤＳ電気泳動した後、ゲルを銀染色した。その結果を図２および３に示した。

（５）マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）解析
ＪＨＭ−ＣＡＰを、５〜２０％グラジュエントゲルを使用し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。次いで、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス(GE Healthcare Bio-science) 社製）で銀染色を行い、ゲルから約１００ｋＤａのバンドを切り出した。
得られたゲル切片を、Ｇｈａｒａｈｄａｇｈｉらの方法（Electrophoresis, 20:601-605,1999）に準じてトリプシンで処理した。
ペプチド混合物に、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を飽和させた33％アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸溶液を1:1で混合し、この溶液1μlをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳのサンプルプレートにのせ、解析した。

（６）ペプチドマスフィンガープリント
タンパク質の同定は、Ｍａｓｃｏｔプログラム（マトリックス・サイエンス（Matrix Science）社）によるペプチドマスフィンガープリントで行った。データベースは、ピロリ菌のＮｏ.２６６９５株およびＪ９９株のアミノ酸配列データをもつ米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＮＣＢＩｎｒを使用した。結果を表１に示す。

（７）ＪＨＭ−ＣＡＰおよびＨＭ−ＣＡＰの性能
抗原としてＪＨＭ−ＣＡＰおよびＨＭ−ＣＡＰを使用し、通常の免疫測定法により日本人小児血清中のピロリ抗体の検出を行った。その結果を表２に示す。

本発明の抗原組成物を使用して、日本人の血清中のピロリ菌抗体を測定した場合、高感度で特異性の高い検出が可能となり偽陰性を減少させることができ、ピロリ菌感染症の診断、特に日本人を含めた東アジア人のピロリ菌感染症の診断に有用である。

ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。Ｃａｓｅ１および８はＪＨＭ−ＣＡＰ陽性・ＨＭ−ＣＡＰ陰性の血清、Ｃａｓｅ２３は陽性対照血清、Ｃａｓｅ２６は陰性対照血清である。縦軸の数値は分子量（ＫＤａ）を示す。 ＪＨＭ−ＣＡＰの二次元電気泳動の写真である。四角の枠は、本発明の抗原組成物の泳動位置を見やすくしたものである。 ＨＭ−ＣＡＰの二次元電気泳動の写真である。 分離菌の粗抽出物とＪＨＭ−ＣＡＰをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウサギ抗ＣａｇＡ抗体で免疫染色した写真である。 ＪＨＭ−ＣＡＰとＨＭ−ＣＡＰをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウサギ抗ＣａｇＡ抗体で免疫染色した写真である。

Claims (2)

1. 日本人から分離した複数のヘリコバクター・ピロリ菌を培養及び増殖したヘリコバクター・ピロリ菌増殖体を、アルキルグルコシド系界面活性剤を含有する緩衝液で処理することで可溶化された抽出物から、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて得られた高分子画分を濃縮・脱塩して得られる抗原組成物であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の特性を有する抗原組成物。
   （ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約１００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を示し、等電点電気泳動装置にてタンパク質を分離し次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による二次元電気泳動でｐＩが約５.９〜６.９において３つ以上のＭＷに分離される。
   （ｂ）ウレアーゼ活性を示さない。
   （ｃ）細胞毒素関連蛋白（ＣａｇＡ）の一部である。
   （ｄ）日本人の血清中のピロリ抗体の検出を行うと米国人の血清中のピロリ抗体の検出より偽陰性の出現率が減少する。
2. 日本人から分離した複数のヘリコバクター・ピロリ菌を培養及び増殖したヘリコバクター・ピロリ菌増殖体を、アルキルグルコシド系界面活性剤を含有する緩衝液で処理することで可溶化された抽出物から、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて得られた高分子画分を濃縮・脱塩して得られる抗原組成物であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の特性を有する抗原組成物の、日本人の血清中のヘリコバクター・ピロリ菌抗体を検出するための使用。
   （ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約１００ｋＤａの分子量（ＭＷ）を示し、等電点電気泳動装置にてタンパク質を分離し次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による二次元電気泳動でｐＩが約５.９〜６.９において３つ以上のＭＷに分離される。
   （ｂ）ウレアーゼ活性を示さない。
   （ｃ）細胞毒素関連蛋白（ＣａｇＡ）の一部である。
   （ｄ）日本人の血清中のピロリ抗体の検出を行うと米国人の血清中のピロリ抗体の検出より偽陰性の出現率が減少する。