JPH04297871A

JPH04297871A - クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤

Info

Publication number: JPH04297871A
Application number: JP3091808A
Authority: JP
Inventors: Hiroo Watanabe; 渡辺　博夫; Kiyotaka Kawagoe; 川越　清隆
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1990-05-08
Filing date: 1991-04-23
Publication date: 1992-10-21
Anticipated expiration: 2015-03-13
Also published as: DE69121290T2; JP3018553B2; ES2090248T3; US5318892A; DE69121290D1; EP0456524B1; EP0456524A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、クラミジア・トラコマ
ティス感染症を診断するための特異性の高いクラミジア
・トラコマティス抗体測定方法およびそれに用いられる
診断用製剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、宿主の細
胞内でのみ生存可能な偏性細胞内寄生体である。その増
殖サイクルは特殊で、形態学的には細胞外にあるクラミ
ジア基本小体（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ　　ｂｏｄｙ：Ｅ
Ｂ）が食菌作用により細胞内に取り込まれて空胞封入体
を形成し、網膜体（ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　　ｂｏｄｙ
：ＲＢ）に変化する。ＲＢは増殖力はあるが感染力を欠
いており、細胞内で増殖したＲＢはやがてＥＢに変化し
、封入体を破り細胞膜を破壊して細胞外に出る。ＥＢは
増殖力を欠くが感染力を持つ。人がこのＥＢに感染する
と、眼のトラコーマ、性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）、
非リン菌性尿道炎（ＮＧＵ）や子宮頚管炎などの眼や生
殖器の病気を発症する。

【０００３】近年、性行為感染症（ｓｅｘｕａｌｌｙ　
　ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ）の原因微
生物の１つとしてクラミジア・トラコマティスが注目を
集めており、アメリカではクラミジア・トラコマティス
感染症の新患者数が年間３００万人から１，０００万人
（熊本悦明ら：クラミジア感染症、Ｍｅｄｉｃ、２０、
１−８、１９８５による）と言われており、わが国でも
クラミジア・トラコマティス感染症の実態が徐々に明ら
かにされるにつれて関心が高まってきている。

【０００４】クラミジア・トラコマティス感染症の最も
感度の高い血清診断法はワング（Ｗａｎｇ）およびグレ
イストン（Ｇｒａｙｓｔｏｎ）（Ｔｒａｃｈｏｍａ　　
ａｎｄｒｅｌａｔｅｄ　　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　　ｃａ
ｕｓｅｄ　　ｂｙ　　ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ　　ａｇｅ
ｎｔｓ、Ｅｘｃｅｒｐｔａ　　Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ、ｐｐ．２７３−２８８、１９７１参照）の
間接ミクロ免疫蛍光抗体測定法（マイクロ−ＩＦ法）で
ある。しかしながらマイクロ−ＩＦ法はその試験手技が
困難なため臨床検査室では診断法としては採用されてい
ない。標準的なマイクロ−ＩＦ法は１５種のクラミジア
・トラコマティス血清型の精製基本小体（ＥＢ）を必要
とする。マイクロ−ＩＦ法は、免疫蛍光反応を行うため
に同定微生物の完全な形態または構造を必要とする。し
たがってＥＢの形態または構造を変えたり破壊したりす
る方法は使用できない。このＥＢは伝染性があり、かつ
毒性をもっているため、そのまま抗原材料として使用す
るためには感染防禦を施した特別な施設を必要とする。従って、通常はホルムアルデヒドやアセトンなどの固定
化剤処理した抗原を用いている。

【０００５】一方、近年開発された酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）は、簡便かつ迅速に多数検体の処理ができる
利点を有している。このＥＬＩＳＡを用いたクラミジア
・トラコマティス抗体の測定に関する報告がなされてい
るが、そのほとんどがクラミジア・トラコマティスＬ２
株のＥＢをそのまま、または、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム、ｓｏｄｉｕｍ　　ｄｏｄｅｃｙｌ　　ｓｕｌ
ｆａｔｅ）処理してＥＬＩＳＡ用の抗原材料として用い
る。そのため、精製純度の低い抗原を用いることによるクラ
ミジア・ニューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体
との交叉反応を含む非特異的反応の存在が知られている
。これは、主としてクラミジア・トラコマティスの複雑
な抗原性に起因している。クラミジア・トラコマティス
の抗原性には、属（ｇｅｎｕｓ）特異的抗原、種（ｓｐ
ｅｃｉｅｓ）特異的抗原および血清型（ｂｉｏｂａｒ）
特異的抗原があると考えられている。代表的な属特異的
抗原として、リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）が知られており、これ
は一部腸内細菌のＲｅミュータントＬＰＳと共通抗原性
を有している。

【０００６】一方、代表的な種特異抗原、血清型特異抗
原としては、クラミジア・トラコマティス主要外膜ペプ
チド（Ｍａｊｏｒ　　Ｏｕｔｅｒ　　Ｍｅｍｂｒａｎｅ
　　Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＯＭＰ）が知られており、これ
はクラミジア・トラコマティス外膜タンパク質の約６０
％を占めるといわれている。しかしながらこのＭＯＭＰ
にも属特異的抗原性の存在が知られている（Ｃｏｌｌｅ
ｔｔ　ら、Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．Ｄ．Ｃ．、Ａ
ｂｓｔｒａｃｔ　　Ｎｏ．Ｄ−１５９、１９８６）。Ｍ
ＯＭＰ以外のクラミジア・トラコマティス外膜抗原は主
として属特異的抗原であるが、同時に種特異的抗原性の
存在するものもある。サルコシル不溶性の分子量約５９
．５ダルトンペプチドはこの範疇にはいる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上述したようにクラミ
ジア・トラコマティスのもつ抗原性は非常に複雑である
。クラミジア・トラコマティス感染者の有するクラミジ
ア・トラコマティス抗体は、クラミジア・トラコマティ
スの複雑な抗原性に対応した多様性を示し、感染者によ
ってそのパターンは異なる。そのため特定の１種類のク
ラミジア・トラコマティス蛋白を用いて、クラミジア・
トラコマティス抗体を測定することは事実上不可能であ
る。従って、クラミジア・トラコマティス感染者の有す
るクラミジア・トラコマティス抗体を高精度かつ高感度
で、クラミジア・ニューモニエ抗体及びクラミジア・シ
タシ抗体との交叉反応を含む非特異的反応を抑えて測定
するためには、用いる抗原材料の適切な選択が必要とな
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、主として少な
くとも２種以上のクラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチドからなる膜画分を抗原材料とすることによ
って、上述したＥＢそのものあるいはＳＤＳ処理したＥ
Ｂを抗原材料としてクラミジア・トラコマティス抗体を
測定する従来のＥＬＩＳＡ法におけるクラミジア・ニュ
ーモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との交叉反応
性を含む非特異的反応の問題点を解消したものである。

【０００９】すなわち本発明は、少なくとも２種以上の
クラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含
有するクラミジア・トラコマティス外膜複合体又は該複
合体から得られる、少なくとも２種以上のクラミジア・
トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物を抗原とし
て用いることを特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗
体及びクラミジア・シタシ抗体との交叉反応性を含む非
特異的反応の低い、特異性の高いクラミジア・トラコマ
ティス抗体測定方法並びに該クラミジア・トラコマティ
ス外膜複合体を固相担体に固定化した固相化抗原を含有
してなる特異性の高いクラミジア・トラコマティス感染
症診断用製剤に関する。

【００１０】以下に本発明を詳細に述べる。本発明に用
いる、少なくとも２種以上のクラミジア・トラコマティ
ス外膜構成ポリペプチドを含有するクラミジア・トラコ
マティス外膜複合体、又はクラミジア・トラコマティス
外膜構成ポリペプチド混合物は、カルドウェル（Ｃａｌ
ｄｗｅｌｌ）らのＩｎｆｅｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ．、３１、１１６１−１１７６、１９８
１等に記載される公知の方法を用いて調製することがで
きる。

【００１１】即ち、まずクラミジア・トラコマティスＥ
Ｂを常套手段により精製し、次いで精製されたクラミジ
ア・トラコマティスＥＢを、界面張力低下の作用が温和
なイオン性界面活性剤、好ましくはアニオンサルコシン
界面活性剤、特に好ましくはサルコシル（Ｎ−ラウロイ
ルサルコシンナトリウム）によって抽出し、可溶分を除
去した後の残渣成分とする。この後、好ましくはデオキ
シリボ核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ）及びリボ核酸分解酵
素（ＲＮａｓｅ）でヌクレアーゼ処理を行う。

【００１２】以上をさらに具体的に示せば、まず精製ク
ラミジア・トラコマティスＥＢを２％サルコシル、１．
５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ８．０）で抽出
し、サルコシル可溶性成分を抽出除去した後、ＤＮａｓ
ｅ　　ＲＮａｓｅ処理して、サルコシル不溶性画分（残
渣成分）として調製することができる。

【００１３】この方法は、もともとはグラム陰性菌であ
る大腸菌の外膜調製法として開発されたものである（Ｆ
ｉｌｉｐら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１５、７１
７−７２２、１９７３）。このようにして得られるクラ
ミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有す
るクラミジア・トラコマティス外膜複合体は、電子顕微
鏡による形態観察で、完全なクラミジア・トラコマティ
ス細胞（ＥＢ）から細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）と細
胞質膜（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ
）が欠落した細胞壁（ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ）であること
がわかる。このようにクラミジア・トラコマティス外膜
は、グラム陰性細菌の外膜（細胞壁）と共通した構造的
、機能的特徴を有している。

【００１４】以上のようにして得られたクラミジア・ト
ラコマティス外膜複合体（サルコシル不溶性画分）は、
このまま本発明の方法における抗原として用いることが
できるが、より本発明に好適な固層への吸着が均一とな
る抗原とするために、次いで前記のイオン性界面活性剤
より界面張力低下の作用が強力な他のイオン性界面活性
剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によ
り可溶化する。こうして本発明に使用するクラミジア・
トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物が得られる
。

【００１５】このようにして得られるクラミジア・トラ
コマティス外膜構成ポリペプチド混合物を、後述する条
件によりＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行って解
析したところ、約１５５Ｋダルトン、約１０２Ｋダルト
ン、約７９Ｋダルトン、約７５Ｋダルトン、約５９．５
Ｋダルトン、約４９．５Ｋダルトン、約４２Ｋダルトン
、約３９．５Ｋダルトン、約３１Ｋダルトン、約１２．
５Ｋダルトン等のポリペプチドから構成されている。こ
こで約３９．５Ｋダルトンペプチドは、全体の約６０％
を占め、主要外膜ペプチド（ＭＯＭＰ）と呼ばれている
ものである。一方、約１２．５Ｋダルトンペプチドは、
システィン含有量の高いペプチドでクラミジア・トラコ
マティス種に特有のペプチドでありクラミジア・シタシ
種には存在しない（Ｂａｒｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、ＣＲＣ　　Ｐ
ｒｅｓｓ　　Ｉｎｃ、Ｂｏｃａ　　Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏ
ｒｉｄａ、４８−５０、１９８８）。また、約５９．５
Ｋダルトンペプチドには、種特異的抗原性が存在するこ
とが明らかとなっている。

【００１６】本発明においては、前記のようにして調製
された、クラミジア・トラコマティス外膜複合体又は多
種のポリペプチドを含むクラミジア・トラコマティス外
膜構成ポリペプチド混合物をそのまま抗原として用いる
のが好ましいが、前述の各分子量のポリペプチドのうち
少なくとも２種以上を含んだクラミジア・トラコマティ
ス外膜複合体を抗原として用いることもできる。その場
合、抗体としてＩｇＧ又はＩｇＡを使用するときは、約
３９．５Ｋダルトンペプチド（ＭＯＭＰ）及び約５９．
５Ｋダルトンペプチドを含むのが好ましく、抗体として
ＩｇＭを使用するときは、約７５Ｋダルトンペプチド及
び約５９．５Ｋダルトンペプチドを含むのが好ましい。ここでペプチドの分子量に約をつけたのは、測定毎の誤
差を考慮したためである。また、ＳＤＳ電気泳動の分子
量の測定条件によっては、記載する分子量と異なった分
子量値となることもあるが、本発明で規定する分子量の
ポリペプチドと同一のものであるならば、それをも含む
ものである。

【００１７】なお、本発明では、前述のように少なくと
も２種以上のポリペプチドを含むクラミジア・トラコマ
ティス外膜複合体又はクラミジア・トラコマティス外膜
構成ポリペプチド混合物を抗原として用いることが重要
であり、仮にどれか１つのポリペプチド、例えば約３９
．５Ｋダルトンペプチド（ＭＯＭＰ）に精製したものを
用いたのでは、臨床上非常に大きな問題である凝陰性反
応が生じ、また、十分な種特異性が得られるものとも言
い難い。

【００１８】このようなクラミジア・トラコマティス外
膜複合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリ
ペプチド混合物をクラミジア・トラコマティス抗体測定
のための抗原原料として用いる本発明の製剤では、該抗
原を固相担体としてポリスチレンや塩化ビニールなどの
プラスチック材料、ニトロセルロースやナイロンなどの
繊維材料及びガラスやシリカゲルなどの無機材料等に固
定化することができ、その形状は、タイタープレート、
ビーズ、磁性ビーズ、ペーパーディスク、糸などあらゆ
る形が可能である。中でも特にポリスチレンビーズ又は
ポリスチレンマイクロタイタープレートが好ましいもの
として使用される。また、本発明の製剤は、上記した固
相担体に物理的吸着に基づく方法で固相化させる方法に
限らず、原理的には抗原材料をＢｒＣＮ２等を用いた共
有結合法によって担体に固相化したものでもかまわない
。

【００１９】本発明の製剤を使用するヒトのクラミジア
・トラコマティス抗体測定方法は、検体試料として主に
ヒト血清が用いられる。しかしながら本発明の方法によ
れば、非特異的反応性が低いためにクラミジア・トラコ
マティス抗体価の低い検体試料にも適用できる。従って
、ヒト涙、ヒト子宮頚管内膜分泌物及び，尿道より圧出
した前立腺液ヒト精液も検体試料として用いることがで
きる。

【００２０】上述の抗原固定化固相担体を、適当な希釈
を施したクラミジア・トラコマティスに対する抗体を含
有している疑いのある検体試料と接触させ、一定時間保
温し、反応させた後、未反応の検体試料成分を除去して
、担体上にクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペ
プチド抗原とクラミジア・トラコマティス抗体の複合体
を得る。次に、この抗原／抗体複合体に、検体試料に由
来する抗体に対する標識抗体、好ましくは酵素標識抗ヒ
トＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体と接触させ、反応さ
せる。その後、未反応の標識抗体を除去し、結合した標
識抗体上の標識物質量を測定することによって、検体試
料中に存在するＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ性のクラミ
ジア・トラコマティス抗体を測定する。

【００２１】標識物質は放射性同位元素、蛍光色素など
でもよく、酵素に限定されるものではない。また、標識
酵素としてはマレートデヒドロゲナーゼ（酵素番号１．
１．１．３７）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（
同１．１．１．４９）、グルコースオキシダーゼ（同１
．１．３．４）、西洋ワサビパーオキシダーゼ（同１．
１１．１．７）、アセチルコリンエステラーゼ（同３．
１．１．７）、アルカリフォスファターゼ（同３．１．
３．１）、グルコアミラーゼ（同３．２．１．３）、リ
ゾチーム（同３．２．１．１７）、β−ガラクトシダー
ゼ（同３．２．１．２３）などを用いることができるが
、好ましくはアルカリフォスファターゼまたは西洋ワサ
ビパーオキシダーゼを用いる。なお、標識物質の定量は
、標識物質の種類に応じて選択される常法に従って行う
ことができる。

【００２２】このようにして測定された検体試料中のク
ラミジア・トラコマティス抗体価は、クラミジア・トラ
コマティス感染症の臨床像をよく反映することが明らか
になっている。即ち、クラミジア・トラコマティスによ
る体表面への感染によりＩｇＭ抗体は感染後１〜２週間
で出現し、ＩｇＧ抗体も比較的早期に認められ時間とと
もに減少するが長時間持続すると考えられている。一方
、分泌型のＩｇＡ抗体は細胞性免疫と同様に再感染防禦
に役立っていると考えられている。クラミジア・トラコ
マティスのヒト性器感染に関しては、特に女性の場合、
血清中と子宮頚管内膜分泌物中にＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｍ抗体が検出され、ＩｇＡ抗体量は病原体クラミジア・
トラコマティスの減少と逆比例の関係にあり病原体の排
出拡散を規制していることが知られている（Ｂｒｕｎｈ
ａｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３９、１４９１
−１４９４、１９８３）。

【００２３】

【実施例】以下の実施例により、本発明に使用するクラ
ミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物の
単離、固相担体への固定化及びクラミジア・トラコマテ
ィス抗体の測定方法についてより詳細に記述するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

【００２４】Ａ）クラミジア・トラコマティス基本小体
（ＥＢ）の精製クラミジア・トラコマティス菌株はＬ２／４３４／Ｂｕ
ｂｏを用いた。上記菌株を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）
添加イーグル（Ｅａｇｌｅ）ＭＥＭ培地中で増殖したマ
ッコイ（ＭａＣｏｙ）細胞に接種した。クラミジア・ト
ラコマティスの接種には培養３日の細胞を用い、１５０
×ｇ、５分間遠心分離で収集しハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ
）ＢＳＳで３回遠心洗浄した。吸着は宿主細胞あたり１
０個のクラミジア・トラコマティスを反応させ、宿主細
胞濃度１０７／ｍｌで３７℃、２時間温水中で振とうし
つつ行った。吸着後ＦＢＳ添加培地に細胞濃度が５〜７
×１０５／ｍｌになるように再浮遊させ３７℃で２日間
培養した。培養後、その一部を採取し遠心により感染細
胞を集め塗抹標本を作成し、ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）染
色によりＥＢが十分に増殖していることを確認した。

【００２５】上記感染培養細胞懸濁液を超音波破砕機（
（株）日本精機製作所ＵＳ−３００）で２０ＫＨｚ、６
０秒間超音波破砕した後、２０℃、２０分間遠心し感染
培養上清を得た。この上清液５容を３０％ショ糖（ｗ／
ｖ）を含む０．０３３Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．２）１容に重層し、１０，０００×ｇ、
４℃、６０分間遠心した。この遠心沈渣に０．１４Ｍ食
塩を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）
（ｐＨ７．２）を加えて懸濁し、この懸濁液を３５％ウ
ログラフイン（ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ　　ｍｅｇｌｕ
ｍｉｎｅ　　ａｎｄｔｒｉｚａｔｅｓｏｄｉｕｍ）及び
０．１５Ｍ食塩を含む０．０１ＭＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−
ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’
−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　　ａｃｉｄ）溶
液に重層し、４３，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心し
た（日立工機（株）分離用超遠心機７０Ｐ−７２、スイ
ングロータＳＰＲ２８ＳＡ）。沈渣を０．２５Ｍショ糖
及び５ｍＭグルタミン酸を含む０．０１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ＳＰＧ、ｐＨ７．２）に懸濁し、ウログラ
フィン不連続密度勾配（４０％／４４％／５２％）に重
層し、４３，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心した。４
４％と５２％ウログラフィンの界面に生じるＥＢの沈降
帯を回収し、ＳＰＧで希釈し、３０，０００×ｇ、４℃
、３０分間の遠心を繰り返すことにより残留するウログ
ラフィンを除去して精製ＥＢとした。

【００２６】Ｂ）クラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチド抗原の精製精製クラミジア・トラコマティスＬ２株ＥＢを２％サル
コシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ；Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒ
ｃｏｓｉｎｅ　　ｓｏｄｉｕｍ　　ｓａｌｔ）、１．５
ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ　
　ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）及び０．１４Ｍ食
塩を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（サルコシ
ル緩衝液、ｐＨ８．０）に懸濁し、２０ＫＨｚ、６０秒
間超音波処理し、３７℃で１時間反応後、１００，００
０×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心後沈渣を再度
少量の上記サルコシル緩衝液に懸濁し、１００，０００
×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。沈渣中の過剰のサル
コシルを除くため、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で２回洗浄し
た。次に、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅを各々２．５μｇ／
ｍｌに溶解した１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２を含む０．０２
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に上記沈渣を
懸濁し３７℃で２時間反応後、１００，０００×ｇ、４
℃で６０分間遠心した。沈渣中に残存するＤＮａｓｅ、
ＲＮａｓｅを除くためＰＢＳ（ｐＨ８．０）で２回洗浄
し、サルコシル不溶性クラミジア・トラコマティス外膜
構成ポリペプチド（クラミジア・トラコマティス外膜複
合体）を得た。

【００２７】このクラミジア・トラコマティス外膜複合
体を可溶化するために、２％ＳＤＳ、１０ｍＭ　　ＤＴ
Ｔ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含む０．０１Ｍ
　　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４）に懸濁し、
３７℃，１時間反応した。次に１００，０００×ｇ、２
０℃、６０分間遠心後上清を０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ　
　ＤＴＴを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．４）に対して１晩透析し、ＳＤＳ可溶化クラミジ
ア・トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物を調製
した。図１は得られたクラミジア・トラコマティス外膜
構成ポリペプチド混合物のＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動の図である。

【００２８】この図から明らかなように、以上のような
調製方法により得られたクラミジア・トラコマティス外
膜構成ポリペプチド混合物は、１５５Ｋダルトンペプチ
ド（Ｒｆ値０．１２）、１０２Ｋダルトンペプチド（Ｒ
ｆ値０．１８）、７９Ｋダルトンペプチド（Ｒｆ値０．
２６）、７５Ｋダルトンペプチド（Ｒｆ値０．２７）、
５９．５Ｋダルトンペプチド（Ｒｆ値０．３３）、４９
．５Ｋダルトンペプチド（Ｒｆ値０．３８）、４２Ｋダ
ルトンペプチド（Ｒｆ値０．４３）、３９．５Ｋダルト
ンペプチド（Ｒｆ値０．４９）、３１Ｋダルトンペプチ
ド（Ｒｆ値０．６７）、１２．５Ｋダルトンペプチド（
Ｒｆ値０．９９）が含有されるものである。

【００２９】なお、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動は次の方法で行った。Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ、Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０〜６８５
、１９７０）の方法に準じ、１２．０％アクリルアミド
ゲル（架橋度０．８）中で泳動した。泳動条件は、濃縮
泳動時１５ｍＡ、分離泳動時２０ｍＡである。泳動試料
は、予め還元剤として、２−メルカプトエタノールを２
５％含む試料用緩衝液〔３１２．５ｍＭ　　トリス−塩
酸、ｐＨ６．８、０．１％ＢＰＢ（ブロムフェノールブ
ルー）、１０％ＳＤＳ、２０％グリセリン〕を０．２５
体積加え５０℃、３０分間処理した。泳動後、０．０５
％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　　Ｒ−２５０で室温で１晩染色
し、０．７％酢酸で脱色した。なお、分子量は、同じ条
件で泳動した分子量マーカー蛋白質の易動度より推定し
た（マーカー；ウサギ筋フォスフォリラーゼ９７．４Ｋ
Ｄａ、牛血清アルブミン６６．２ＫＤａ、卵白アルブミ
ン４２．７ＫＤａ、牛炭酸脱水酵素３１ＫＤａ、大豆ト
リプシンインヒビター２１．５ＫＤａ及び卵白リゾチー
ム１４．４ＫＤａ）。

【００３０】Ｃ）クラミジア・トラコマティス抗体測定
方法前記の方法により得られたＳＤＳ可溶化クラミジア・ト
ラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物を抗原として
担体固定用緩衝液（１ｌ中にＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ
２各々２．９３ｇ、１．５９ｇを含む）で０．５μｇ／
ｍｌに調製し９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに１００μｌずつ分注し４℃で１晩反応
した。０．０５％トウエーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（０．０５％トウエーン２０−Ｐ
ＢＳ）３００μｌで３回洗浄し未吸着抗原を除去した。次に５％ＢＳＡを含むブロッキング緩衝液（ＫＰＬ社製
）（ブロッキング／検体希釈用緩衝液）２５０μｌを各
ウェルに加え３７℃、１時間反応し、０．０５％トウエ
ーン２０−ＰＢＳ　　３００μｌで２回洗浄して抗原固
定化プレートを作成した。

【００３１】ブロッキング／検体希釈用緩衝液で希釈し
た希釈検体血清１００μｌを上記抗原固定化プレートに
加えて３７℃、１時間反応後０．０５％トウエーン２０
−ＰＢＳ　　３００μｌで３回洗浄した。西洋ワサビパ
ーオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を０．０５
％トウエーン２０−ＰＢＳで１μｌ／ｍｌに希釈し各ウ
ェルに１００μｌずつ分注し３７℃で１時間反応後、０
．０５％トウエーン２０−ＰＢＳ　　３００μｌで３回
洗浄した。次に、パーオキシダーゼの基質ＡＢＴＳ試薬
（ＫＰＬ社）１００μｌを各ウェルに加え室温で５分間
反応後、２％シュウ酸２５μｌを加えて反応を停止し、
マイクロタイタープレートリーダー（コロナ電気（株）
、ＭＴＰ−２２形）で吸光度（λ１：４１５ｎｍ、λ２
：４９２ｎｍ）を測定した。

【００３２】Ｄ）ヒト患者血清に対する感度及び特異性
（クラミジア・トラコマティスＩｇＧ抗体の測定）、ク
ラミジア・トラコマティス菌分離が確認されているクラ
ミジア・トラコマティス感染患者血清２０検体（抗原陽
性）、クラミジア・トラコマティス抗体陽性者血清９検
体（抗原陰性）、及び正常ヒト血清２３検体を用いてＣ
）に記載の測定方法（ＥＬＩＳＡ法）に従って感度及び
特異性試験を行った。対照試験法としてマイクロ−ＩＦ
法を行った。ヒト血清は１％ＢＳＡを含む検体希釈用緩
衝液で８０倍に希釈し、クラミジア・トラコマティス抗
体測定用試料液とした。測定結果を図２に示す。なお、
ＥＬＩＳＡ法は４１５ｎｍの吸光度で、マイクロ−ＩＦ
法は血清希釈倍数（力価）で示した。

【００３３】また本発明の効果をより一層に明らかにす
るために、クラミジア・トラコマティス抗体測定のため
に対照抗原として精製クラミジア・トラコマティスＬ２
株ＥＢ（精製ＥＢ）と精製クラミジア・トラコマティス
主要外膜ペプチド（精製ＭＯＭＰ）を用い、本発明で用
いたクラミジア・トラコマティス外膜複合体抗原と感度
及び特異性を比較した。結果を表１に示す。精製ＥＢの
調製法は既述の通りである。また、精製ＭＯＭＰは、カ
ルドウェル（Ｃａｌｄｗｅｌｌ）Ｈ、Ｄらの方法（特開
昭５７−１５８７２５号公報）に従って調製した部分精
製ＭＯＭＰ画分をさらに調製用ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により免疫学的に均一な状態にした標
品を用いた。尚、各試験のカットオフ値は正常ヒト血清
２３検体の吸光度の平均値に標準偏差を２倍したものを
加えた値とした。

【００３４】図２の結果は、本発明による測定法によっ
て得られた結果が、従来のマイクロ−ＩＦ法との相関が
極めて良好であることを示している。また、表１の結果
はクラミジア・トラコマティス外膜複合体抗原を用いた
本発明の方法が対照抗原として試験した精製ＥＢや精製
ＭＯＭＰに比して、マイクロ−ＩＦ法との一致率が非常
に優れていることを示している。即ち、凝陽性（ｆａｌ
ｓｅ　　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は非常に低く、特に、臨床
上問題になる凝陰性（ｆａｌｓｅ　　ｎｅｇａｔｉｖｅ
）がなく臨床的有用性が高いことを示している。

【００３５】

【表１】

【００３６】Ｅ）クラミジア・ニューモニエ抗体及びク
ラミジア・シタシ抗体との交叉反応性の検討クラミジア
・トラコマティス抗体陽性者血清７検体、クラミジア・
ニューモニエ抗体陽性者血清１７検体及びクラミジア・
シタシ抗体陽性者血清２検体を用いてＣ）に記載の測定
方法（ＥＬＩＳＡ法）に従って交叉反応性試験を行った
。対照試験法としてＭＦＡ法（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　
　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　　ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ　　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を行った。ヒト血清
は１％ＢＳＡを含む検体希釈用緩衝液でＩｇＧ抗体測定
の場合には１００倍、ＩｇＡ抗体測定の場合には２０倍
に希釈し、クラミジア・トラコマティス抗体測定用試料
液とした。測定結果を表２に示す。なお、ＥＬＩＳＡ法
は４１５ｎｍの吸光度で、またＭＦＡ法はクラミジア・
ニューモニエＴＷ株、クラミジア・シタシＭＰ株及びク
ラミジア・トラコマティスＬ２株に対する血清希釈倍数
（力価）で示した。

【００３７】表２は、本発明の測定方法の結果が、従来
のＭＦＡ法の結果と極めて高い一致率であることを示し
ている。即ちクラミジア・ニューモニエ抗体及びクラミ
ジア・シタシ抗体とほとんど交叉反応していないことを
示している。なお、各試験のカットオフ値はＩｇＧ抗体
測定の場合０．１５、ＩｇＡ抗体測定の場合０．２０と
し、それ以上を陽性と判定する。

【００３８】

【表２】

【００３９】

【発明の効果】以上から明らかなように、本発明のクラ
ミジア・トラコマティス抗体測定方法によれば、精製Ｅ
Ｂや精製ＭＯＭＰを用いる測定方法に比較して、臨床上
問題となる凝陰性がなく、凝陽性が非常に低くかつクラ
ミジア・ニューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体
との非特異的反応のほとんどない、種特異性の高い測定
を行うことができ、臨床的有用性が高いものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】クラミジア・トラコマティス外膜複合体のＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％アク
リルアミドスラブゲルの様子）を示すパターン図である
。

【図２】クラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプ
チド混合物を抗原として用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）とマイクロ−ＩＦ法との相関関係を示すグラフで
ある。

【符号の説明】

１　　…泳動開始点２　　…泳動先端（マーカー色素ＢＰＢ）３　　…１５
５Ｋダルトンペプチド４　　…１０２Ｋダルトンペプチド５　　…７９Ｋダルトンペプチド６　　…７５Ｋダルトンペプチド７　　…５９．５Ｋダルトンペプチド８　　…４９．５Ｋダルトンペプチド９　　…４２Ｋダルトンペプチド１０…３９．５Ｋダルトンペプチド１１…３１Ｋダルトンペプチド１２…１２．５Ｋダルトンペプチド

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　少なくとも２種以上のクラミジア・ト
ラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有するクラミジ
ア・トラコマティス外膜複合体又は該複合体から得られ
る、少なくとも２種以上のクラミジア・トラコマティス
外膜構成ポリペプチド混合物を抗原として用いることを
特徴とする特異性の高いクラミジア・トラコマティス抗
体測定方法。
【請求項２】　　クラミジア・ニューモニエ抗体及びク
ラミジア・シタシ抗体との非特異的反応の低い請求項１
記載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。
【請求項３】　　クラミジア・トラコマティス外膜複合
体が、クラミジア・トラコマティス基本小体を温和なイ
オン性界面活性剤によって抽出した残渣成分から得られ
るものである請求項１または２記載のクラミジア・トラ
コマティス抗体測定方法。
【請求項４】　　温和なイオン性界面活性剤がサルコシ
ルである請求項３記載のクラミジア・トラコマティス抗
体測定方法。
【請求項５】　　クラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチド混合物が、温和なイオン性界面活性剤によ
って抽出した残渣成分を、該イオン性界面活性剤よりも
強力な他のイオン性界面活性剤により可溶化して得られ
るものである請求項１記載のクラミジア・トラコマティ
ス抗体測定方法。
【請求項６】　　クラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチド混合物が、温和なイオン性界面活性剤によ
って抽出した残渣成分を、核酸分解酵素で処理し、次い
で該イオン性界面活性剤よりも強力な他のイオン性界面
活性剤により可溶化して得られるものである請求項１記
載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。
【請求項７】　　強力な他のイオン性界面活性剤がドデ
シル硫酸ナトリウムである請求項５または６記載のクラ
ミジア・トラコマティス抗体測定方法。
【請求項８】　　クラミジア・トラコマティス外膜複合
体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチ
ド混合物が、約１５５Ｋダルトン、約１０２Ｋダルトン
、約７９Ｋダルトン、約７５Ｋダルトン、約５９．５Ｋ
ダルトン、約４９．５Ｋダルトン、約４２Ｋダルトン、
約３９．５Ｋダルトン、約３１Ｋダルトン及び１２．５
Ｋダルトンの分子量をもつポリペプチドからなる群から
選択される少なくとも２種以上のクラミジア・トラコマ
ティス外膜構成ポリペプチドを含有することを特徴とす
る請求項１〜７のいずれかに記載のクラミジア・トラコ
マティス抗体測定方法。
【請求項９】　　（ａ）少なくとも２種以上のクラミジ
ア・トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有するク
ラミジア・トラコマティス外膜複合体又は該複合体から
得られる、少なくとも２種以上のクラミジア・トラコマ
ティス外膜構成ポリペプチド混合物を固相担体に固定化
し、（ｂ）固定されたクラミジア・トラコマティス外膜
複合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペ
プチド混合物を有する該固相担体をクラミジア・トラコ
マティスに対する抗体を含有している疑いのある検体試
料と接触させ、（ｃ）未反応の該検体試料成分を除去し
、（ｄ）生成したクラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチド抗原とクラミジア・トラコマティス抗体か
らなる抗原抗体複合体を該検体試料に由来する抗体に対
する標識抗体と接触させ、（ｅ）未反応の該標識抗体を
除去し、（ｆ）結合した該標識抗体上の標識物質量を測
定することによって検体試料中のクラミジア・トラコマ
ティス抗体の存在又は量を測定する各段階を含むことを
特徴とする特異性の高いクラミジア・トラコマティス抗
体測定方法。
【請求項１０】　　クラミジア・トラコマティス外膜複
合体がクラミジア・トラコマティス基本小体を温和なイ
オン性界面活性剤によって抽出した残渣成分から得られ
るものである請求項９記載のクラミジア・トラコマティ
ス抗体測定方法。
【請求項１１】　　クラミジア・トラコマティス外膜複
合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプ
チド混合物が、約１５５Ｋダルトン、約１０２Ｋダルト
ン、約７９Ｋダルトン、約７５Ｋダルトン、約５９．５
Ｋダルトン、約４９．５Ｋダルトン、約４２Ｋダルトン
、約３９．５Ｋダルトン、約３１Ｋダルトン及び１２．
５Ｋダルトンの分子量をもつポリペプチドからなる群か
ら選択される少なくとも２種以上のクラミジア・トラコ
マティス外膜構成ポリペプチドを含有することを特徴と
する請求項９又は１０記載のクラミジア・トラコマティ
ス抗体測定方法。
【請求項１２】　　検体試料がヒト涙、ヒト子宮頚管内
膜分泌物、ヒト精液及びヒト血清のいずれかである請求
項９、１０又は１１記載のクラミジア・トラコマティス
抗体測定方法。
【請求項１３】　　標識抗体が抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡま
たはＩｇＭ抗体である請求項９、１０、１１又は１２記
載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。
【請求項１４】　　標識抗体が酵素標識抗体である請求
項９、１０、１１、１２又は１３記載のクラミジア・ト
ラコマティス抗体測定方法。
【請求項１５】　　酵素標識抗体がアルカリフォスファ
ターゼまたは西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体であ
る請求項１４記載のクラミジア・トラコマティス抗体測
定方法。
【請求項１６】　　少なくとも２種以上のクラミジア・
トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有するクラミ
ジア・トラコマティス外膜複合体又は該複合体から得ら
れる、少なくとも２種以上のクラミジア・トラコマティ
ス外膜構成ポリペプチド混合物を固相担体に固定化した
固定化抗原を含有してなる特異性の高いクラミジア・ト
ラコマティス感染症診断用製剤。
【請求項１７】　　クラミジア・ニューモニエ抗体及び
クラミジア・シタシ抗体との非特異的反応の低い請求項
１６記載のクラミジア・トラコマティス感染症診断用製
剤。
【請求項１８】　　クラミジア・トラコマティス外膜複
合体がクラミジア・トラコマティス基本小体を温和なイ
オン性界面活性剤によって抽出した残渣成分から得られ
るものである請求項１６または１７記載のクラミジア・
トラコマティス感染症診断用製剤。
【請求項１９】　　クラミジア・トラコマティス外膜複
合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプ
チド混合物が、約１５５Ｋダルトン、約１０２Ｋダルト
ン、約７９Ｋダルトン、約７５Ｋダルトン、約５９．５
Ｋダルトン、約４９．５Ｋダルトン、約４２Ｋダルトン
、約３９．５Ｋダルトン、約３１Ｋダルトン及び１２．
５Ｋダルトンの分子量をもつポリペプチドからなる群か
ら選択される少なくとも２種以上のクラミジア・トラコ
マティス外膜構成ポリペプチドを含有するものである請
求項１６、１７又は１８記載のクラミジア・トラコマテ
ィス感染症診断用製剤。
【請求項２０】　　温和なイオン性界面活性剤がサルコ
シルである請求項１８又は１９記載のクラミジア・トラ
コマティス感染症診断用製剤。
【請求項２１】　　固相担体がプラスチック材料、繊維
材料及び無機材料から選択されるものである請求項１６
〜２０のいずれかに記載のクラミジア・トラコマティス
感染症診断用製剤。
【請求項２２】　　固相担体がポリスチレンビーズ又は
ポリスチレンマイクロタイタープレートである請求項１
６〜２１のいずれかに記載のクラミジア・トラコマティ
ス感染症診断用製剤。
【請求項２３】　　請求項１６記載の固定化抗原と、標
識抗体として抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体とを
組み合わせてなる特異性の高いクラミジア・トラコマテ
ィス感染症診断用製剤。
【請求項２４】　　標識抗体が酵素標識抗体である請求
項２３記載のクラミジア・トラコマティス感染症診断用
製剤。
【請求項２５】　　酵素標識抗体がアルカリフォスファ
ターゼまたは西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体であ
る請求項２３又は２４記載のクラミジア・トラコマティ
ス感染症診断用製剤。