JP2004123737A - 新規抗体及びその利用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ヘリコバクター・ピロリ菌が感染している宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されているCagAタンパク質を特異的に認識する抗体を作製した。この抗体を用いることにより、チロシンリン酸化されたCagAタンパク質を高精度で検出することができるため、種々の疾患と密接に関連するH.ピロリ菌の感染を検出可能である。
【選択図】 なし
Description
ライナー・ハス(Rainer Haas)、ブレンダン・バーンズ(Brendan P. Burns)、朝日百百代共著、「Pathogenesis of Helicobacter pylori」、Current Opinion in Gastroenterology、リピンコット・ウイリアムズ アンド ウィルキンス(Lippincott Williams & Wilkins, Inc.)、2001年、第17巻、第1号(suppl 1)、S1-S5 朝日百百代、外11名共著、「Helicobacter pylori CagA Protein Can Be Tyrosine Phosphorylated in Gastric Epithelial Cells」、Journal of Experimental Medicine、ロックフェラー大学出版(Rockefeller University Press)、2000年2月21日、第191巻、第4号、p.593-602 坂本長逸著、「H.pylori感染胃・十二指腸粘膜における組織学的変化とその除菌後におよぼす影響」、Journal of Nippon medicine School、日本医科大学、2002年、第69巻、第1号、p.67-70
本発明者は、以前、胃の上皮細胞に感染したH.ピロリ菌によって、CagAタンパク質が宿主細胞(例えば、ヒトの胃上皮細胞)の細胞質内に注入された後、宿主細胞内のタンパク質チロシンキナーゼ(PTKs)によって、リン酸化されることを明らかにした(上記非特許文献2:Asahi. M., et al. J. Exp. Med. 191, No.4: 2000 593-602)。そして、この現象に着目し、この現象を利用して効率的に、上記疾患と密接に関連するH.ピロリ菌の感染を検出する方法等を開発しようと鋭意努力を重ねた。
(2−1)ポリクローナル抗体の生産方法
本発明に係るポリクローナル抗体を生産する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、抗原タンパク質で動物を免疫した後、その動物から血清を採取し、ポリクローナル抗体を得ればよい。なお、「生産」とは、この抗体の生合成に加えて各種人為的な作用を含む、本発明に係る抗体(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を含む)を得るための全体的な流れを指すものとする。
本発明に係るモノクローナル抗体を生産する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させてなる抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を得ればよい。なお、本実施の形態における「産生」とは、ハイブリドーマによる抗体の生合成を指すものとする。
後述する実施例に示すように、本発明に係る抗体を用いて、H.ピロリ菌の感染により引き起こされた胃潰瘍、胃癌のそれぞれの患者から取り出した胃の生検組織の免疫染色を行った結果、萎縮性胃炎を裏付ける腸上皮化性細胞において、チロシンリン酸化されたCagAタンパク質を精度よく検出することができた。
上述したように、本発明に係る抗体は、チロシンリン酸化されたCagAタンパク質を特異的に認識する新規な抗体である。また、本発明者は、H.ピロリ菌が感染したヒトの胃上皮細胞において、チロシン残基がリン酸化されたCagAタンパク質が見出されることを明らかにしており、CagAタンパク質のチロシンリン酸化は、H.ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患と密接に関連していると考えられる。そのため、本発明の抗体は、以下に示すように利用することができる。
本発明に係る抗体は、H.ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出するためのH.ピロリ菌の感染検出剤として用いることができる。即ち、本発明に係るH.ピロリ菌の感染検出剤の具体的な組成は、上記抗体を含んでいればよく、特に限定されるものではない。具体的には、使用(検査)対象の生物個体、器官、組織、細胞塊、糞便、あるいは細胞等の種類に応じて、H.ピロリ菌の感染を検出するために、本発明に係る抗体の機能が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。
また、本発明に係る抗体は、H.ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出するための手段として用いることができる。即ち、本発明に係るH.ピロリ菌の感染検出方法は、上記抗体を用いていればよく、その他の構成手段は特に限定されるものではない。
また、本発明に係る抗体は、萎縮性胃炎、胃潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌等のH.ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の発症または発症危険性を判定するための手段として用いることができる。即ち、本発明に係る上記疾患の発症または発症危険性判定方法(診断方法)は、上記抗体を用いていればよく、その他の構成手段は特に限定されるものではない。
本発明に係る抗体は、さらに、H.ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の治療に利用できる可能性がある。即ち、上記疾患の原因の一つと考えられるチロシンリン酸化されたCagAタンパク質を標的として、本発明に係る抗体を用いた治療剤または治療方法等を開発することができる。
以下にポリクローナル抗体の作製方法を説明する。
具体的には、以下の方法で行った。まず、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、10番目のチロシン残基がリン酸化されている、リン酸化ペプチドを合成した。より詳細には、アミノ酸残基を活性化させるHBTU、あるいはジイソプロピルカルボジイミドを用いた、Fmoc-based化学固相法を利用した。合成したポリペプチドは保護剤(プロテクト)を外し、チオアニソール等からなるスカベンジャーを含んだトリフルオロ酢酸を用いて、レジンベースのポリスチレンからなる固相支持体から切り離した。その後、抽出したポリペプチドは、エーテル内で沈殿させ、5,000rpmにて遠心回収し、エーテルで洗浄した。その後、HPLCにて精製を行った。
上記方法により得られた合成リン酸化ポリペプチドを抗原として、メスのニュージーランド白ウサギ(平均年齢:6ヶ月、平均重量:5-6 lbs)を用いて免疫処理を行った。
以下にアフィニティ精製用カラム作製について説明する。
上記カラムの底部にキャップがされていることを確認した後、15.8mgのL-システイン-HClを2mlのカップリング溶液に添加し、上記ゲルカラムにアプライした。そして、1時間室温にてインキュベートした。その後、10〜15mlの1M NaClにて洗浄し、フィルターをセットした。次いで、10〜15mlの0.5%アザイドNaにて洗浄し、3〜4mlのアザイドNaにてカラム内を満たし、キャップをしっかり閉めて4℃にて保存した。
上記2種類のアフィニティ精製用カラムA、Bを用いて、血清精製を行った。具体的には、まず、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを結合させたアフィニティ精製用カラムAに血清を通した。次いで、前記カラムAからパスしてきた溶液を、配列番号3に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、8番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドが結合しているアフィニティ精製用カラムBに通した。そして、前記カラムBに結合した抗体を、チロシンリン酸化CagAタンパク質を特異的に認識する抗体として取得した。
IgG精製は以下の手順で行った。まず、カラムを10mlの1×PBS(pH7.3)溶液で洗浄した。次に、上記血清 3mlとPBS 3mlとを2本のIgGカラムにアプライした。カラムを透過した血清をテストチューブに集めた。この血清を再びカラムにかけるという工程を5〜6回繰り返した。
上記実施例1に記載した方法により得たポリクローナル抗体の機能を免疫組織染色法により、以下のように解析した。
Claims (7)
- ヘリコバクター・ピロリ菌が感染している宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されているCagAタンパク質を特異的に認識する抗体。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列のうち、1番目のシステイン残基を除く2〜16番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、10番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含むリン酸化CagAタンパク質を特異的に認識する抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体を含有するヘリコバクター・ピロリ菌の宿主細胞への感染検出剤。
- 請求項1または2に記載の抗体を用いて、ヘリコバクター・ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出する方法。
- 請求項1または2に記載の抗体を用いて、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌のうち、いずれかの疾患の発症または発症危険性を判定する方法。
- 請求項1または2に記載の抗体を用いて、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌のうち、いずれかの疾患を治療する方法。
- 配列番号4に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、4番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含有するワクチン。
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JP2008189648A (ja) * | 2006-04-27 | 2008-08-21 | Toyama Univ | ヘリコバクター・ピロリ菌由来の新規抗原、抗原組成物およびピロリ菌抗体の検出方法。 |
JP2016528499A (ja) * | 2013-08-13 | 2016-09-15 | テクニシェ ユニバーシタット ミュンヘン | H.ピロリ感染の検出方法 |
WO2018153991A1 (en) * | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Biotome Pty Ltd | Novel peptides and their use in diagnosis |
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