RU2549698C2 - Химерный белок боррелии, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, экспрессирующая кассета, вектор, способ и набор для диагностики лайм-боррелиоза, вакцина для профилактики боррелиоза - Google Patents
Химерный белок боррелии, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, экспрессирующая кассета, вектор, способ и набор для диагностики лайм-боррелиоза, вакцина для профилактики боррелиоза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2549698C2 RU2549698C2 RU2012111811/10A RU2012111811A RU2549698C2 RU 2549698 C2 RU2549698 C2 RU 2549698C2 RU 2012111811/10 A RU2012111811/10 A RU 2012111811/10A RU 2012111811 A RU2012111811 A RU 2012111811A RU 2549698 C2 RU2549698 C2 RU 2549698C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- seq
- proteins
- terminus
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 92
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims abstract description 64
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 title claims abstract description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 25
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 24
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 239000004571 lime Substances 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 abstract description 27
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 abstract description 21
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 abstract description 18
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 3
- 101100431670 Rattus norvegicus Ybx3 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 abstract 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 41
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 41
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 27
- 101710156960 Decorin-binding protein A Proteins 0.000 description 23
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 23
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 16
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101710105711 Outer surface protein C Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 206010052057 Neuroborreliosis Diseases 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 201000004625 Acrodermatitis Diseases 0.000 description 9
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 9
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 description 8
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 description 8
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 6
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 6
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 6
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 description 4
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003399 Arthropod bite Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 208000004374 Tick Bites Diseases 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010062488 Erythema migrans Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 2
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-2-oxochromen-7-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=C(OP(O)(O)=O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 241000833568 Borrelia afzelii PKo Species 0.000 description 1
- 206010061591 Borrelia infection Diseases 0.000 description 1
- 241000876423 Borreliella valaisiana Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011312 Vector Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 230000001301 anti-borrelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 208000013210 hematogenous Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4233—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-bacterial Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Представленная группа изобретений касается слитых белков, нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки, экспрессирующей кассеты, обеспечивающей экспрессию нуклеиновой кислоты, вектора, включающего такую кассету, способа диагностики in vitro-боррелиоза, набора для такой диагностики, в которых используют упомянутые белки, а также вакцинной композиции для профилактики боррелиоза, включающей такие белки. Охарактеризованные слитые белки включают в себя (i) по меньшей мере одну последовательность белка DbpA вида боррелии, выбранного из B. afzelii, B. burgdorferi sensu stricto и B. garinii, и (ii) по меньшей мере одну последовательность белка OspC вида боррелии, выбранного из B. afzelii, B. burgdorferi sensu stricto и B. garinii. Представленная группа изобретений позволяет проводить более чувствительные и специфичные анализы, связанные с присутствием нескольких патогенных видов Borrelia. 7 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 табл., 7 пр.
Description
Лайм-боррелиоз (LB) представляет собой неконтагиозное инфекционное заболевание, вызываемое спирохетой, называемой Borrelia burgdorferi, и передаваемое человеку при укусе клеща семейства иксодовых клещей. LB при отсутствии лечения вызывает различные патологические нарушения (дерматологического, артритического, сердечного, неврологического и иногда офтальмологического характера). Он представляет собой трансмиссионное инфекционное заболевание, наиболее часто встречающееся в США и в некоторых странах северного полушария с умеренным климатом.
В этой инфекции участвуют несколько видов боррелий, в настоящее время обозначаемых как группа burgdorferi или Borrelia burgdorferi sensu lato (включающая в себя Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii и B. afzelii). Эти виды являются патогенными для человека.
В США участвующий инфекционный вид представляет собой Borrelia burgdorferi sensu stricto. В Европе к этому виду добавляются B. garinii и B. afzelii. В Азии участвующие виды представляют собой B. garinii и B. afzelii.
В США отмечают приблизительно 10000 случаев в год. В Европе частота появления составляет менее 5 случаев на 100000.
Лайм-боррелиоз эволюционирует, проходя три различные стадии от ранней стадии инфицирования до поздней. Ранняя стадия (стадия I) может быть бессимптомной или выражаться псевдогриппозной картиной. В 50-80% случаев через несколько дней после укуса клеща на коже отмечается появление воспаленной сыпи очень специфического внешнего вида, называемой мигрирующей эритемой (EM). При отсутствии лечения гематогенная диссеминация боррелий проявляется спустя несколько недель во внезапном возникновении воспалительных артритов, неврологических (нейроборрелиоз) и менингеальных поражений, проявлений на коже и в деятельности сердца (стадия II). Через несколько месяцев или лет болезнь переходит в атрофическую хроническую форму, энцефалопатию, энцефаломиелит и хронический артрит (стадия III).
Для каждого вида Borrelia burgdorferi существует особый органический тропизм. Если первая стадия мигрирующей эритемы неясно связана с тремя видами, то переход в неврологическую форму предпочтительно связан с видом B. garinii, артриты чаще связаны с B. burgdorferi sensu stricto, атрофический хронический акродерматит специфичен для B. afzelii.
Сходство клинических симптомов между лайм-боррелиозом и другими не связанными с ним болезнями, а также изменчивость проявлений затрудняет клиническую диагностику. Если доказательства анамнеза отсутствуют (укус клеща или EM), то диагностика боррелиоза на основании клинических наблюдений может быть особенно затрудненной. Ранняя стадия болезни может быть бессимптомной до момента, когда она достигнет очень далеко зашедших клинических стадий.
Именно поэтому диагностика LB основана как на клинических признаках, так и на обнаружении в сыворотке антител, специфических для патогенных Borrelia burgdorferi, чаще всего способом ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ферментный иммуносорбентный тест)) или EIA, IFA. Антитела IgM анти-Borrelia burgdorferi появляются, в общем случае, через несколько дней или недель после начала инфицирования и могут сохраняться в течение развития болезни. Ответ IgG возникает позже. У преобладающей части больных IgG обнаруживаются приблизительно через месяц после начала активного инфицирования, и такие IgG также могут сохраняться в течение многих лет после начального воздействия и исчезновения симптомов.
В Европе оценка серологического ответа осложнена в силу существования трех патогенных видов и межвидовой изменчивости в отношении главных иммунодоминантных антигенов. Антигены, используемые в настоящее время в стандартной программе обнаружения IgG и IgM LB, представляют собой обработанные ультразвуком клеточные образцы Borrelia burgdorferi sensu lato. Результаты серологических исследований с данными антигенами в высокой степени вариативны в отношении специфичности и чувствительности. Таким образом, по причине недостаточной специфичности, вовлекающей перекрестную реактивность с антителами, связанными с различными патогенными бактериями, в частности с Treponema pallidium (этиологический агент сифилиса), спирохетами, риккетсиями, эрлихиями или Helicobacter pylori, диагностика образцов с положительным результатом в испытаниях ELISA должна быть подтверждена иммуноблоттингом. Чувствительность также представляет собой основной фактор. На практике, Borrelia burgdorferi sensu lato экспрессирует различные поверхностные белки вследствие адаптации к различным микросредам, так что генетическое различие и дифференциальная экспрессия генов Borrelia burgdorferi у больных имеют существенное значение для разработки серологических тестов LB. Липопротеин OspC (Outer-surface protein C (поверхностный белок C)) и белок DbpA (Decorin-binding protein A (декорин-связывающий белок A)) составляют часть таких белков. DbpA экспрессируется главным образом у млекопитающего после инфицирования. Данные белки обладают большой вариабельностью последовательностей в видах Borrelia burgdorferi и между видами. Белки DbpA являются особенно вариабельными и подразделяются на четыре группы: группа, соответствующая геновиду Borrelia afzelii, группа, соответствующая геновиду Borrelia sensu stricto, и две группы, соответствующие геновиду Borrelia burgdorferi garinii. Межвидовая идентичность последовательностей аминокислот между белками DbpA составляет только 40-44%. Для белков OspC она равна 54-72%.
Таким образом, требуется разработка набора, который соответствует требуемым критериям специфичности и чувствительности и, в частности, улучшает обнаружение IgM в отношении чувствительности в случае свежего инфицирования.
В настоящем изобретении предлагается устранить комплекс недостатков предшествующего уровня техники благодаря новым химерным рекомбинантным белкам, которые могут быть легко синтезированы и очищены и обладают сильной иммунореактивностью в отношении сыворотки больных, могущих быть инфицированными одним или несколькими патогенными видами Borrelia burgdorferi. Такие слитые химерные белки позволяют смягчить проблемы чувствительности и специфичности, связанные с присутствием нескольких патогенных видов Borrelia burgdorferi, с большой вариабельностью последовательностей поверхностных антигенов Borrelia burgdorferi и необходимостью применять несколько репрезентативных антигенов видов B. garinii, B. burgdorferi sensu stricto и B. afzelii, благодаря разработке диагностического теста на лайм-боррелиоз, основанного по меньшей мере на обнаружении антител анти-OspC и анти-DbpA.
Слитые химерные белки по настоящему изобретению позволяют в то же время устранить затруднения, возникающие вследствие экспрессии некоторых антигенов в рекомбинантной форме в повышенном количестве. На практике, несмотря на значительные работы по конструированию генов для обеспечения оптимизированной экспрессии их в E. coli, авторы изобретения впервые показали, что белки OspC слабо экспрессируются в рекомбинантной форме в E. coli, в то же время совершенно неожиданным образом было обнаружено, что белки DbpA могли экспрессироваться в тех же самых условиях в растворимой форме в условиях, не вызывающих денатурацию, и с более высоким выходом. Легкость экспрессии белков DbpA была использована для создания химерных белков, образующих DbpA и OspC, и авторы смогли показать, что химерные белки экспрессировались лучше, чем изолированные белки OspC, что было полностью неожиданным, поскольку никогда не было описано и даже не сделано предположение, что белки DbpA могли обладать свойствами слитых белков. В силу этого для улучшения уровней экспрессии авторами изобретения были сконструированы химерные белки DbpA-OspC за счет использования неожиданных свойств слияния белков DbpA для улучшения экспрессии и растворимости химерных белков. В молекулярной конструкции для экспрессии химерного белка по настоящему изобретению ген, кодирующий белок DbpA, предпочтительно встраивают в начале одного или нескольких генов, кодирующих один или несколько белков OspC. В зависимости от такой предпочтительной молекулярной конструкции химерный белок по настоящему изобретению на N-концевом участке содержит последовательность, принадлежащую белковой последовательности DbpA, а на C-концевом участке содержит последовательность, принадлежащую белковой последовательности OspC. Такой предпочтительный тип конструкции, помимо того, что он позволяет облегчать и оптимизировать экспрессию и растворимость химерного белка, имеет, кроме того, другое преимущество, состоящее в улучшении узнавания химеры антиборрелиозными антителами в силу лучшей демонстрации им иммунодоминантной области белка OspC. Дополнительное преимущество химерных белков по настоящему изобретению состоит в ограничении числа рекомбинантных белков в комплекте набора для диагностики лайм-боррелиоза. В то же время свойства слияния белка DbpA делают его превосходным кандидатом для экспрессии вакцинных химерных белков DbpA-OspC для профилактики инфицирования боррелиями. Следовательно, химерные белки по настоящему изобретению являются приемлемыми в качестве активного агента в профилактической вакцине против боррелиоза.
Таким образом, настоящее изобретение относится к слитому химерному белку DbpA-OspC боррелии, имеющему не природное происхождение, а являющемуся синтетическим, то есть полученным генной инженерией (рекомбинантный белок) или пептидным синтезом, причем упомянутый белок выбран из группы, в которую входят:
(a) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 1 и последовательность SEQ ID NO: 2, или вариант упомянутого белка, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 1, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 2, при условии, что этот вариант способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями, или этот вариант способен индуцировать продуцирование антиборрелиозных антител;
(b) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 3 и последовательность SEQ ID NO: 4, или вариант упомянутого белка, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 3, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 4, при условии, что этот вариант способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями, или этот вариант способен индуцировать продуцирование антиборрелиозных антител;
(c) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 5 и последовательность SEQ ID NO: 7, или вариант упомянутого белка, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 5, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 7, при условии, что этот вариант способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями, или этот вариант способен индуцировать продуцирование антиборрелиозных антител;
(d) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 6 и последовательность SEQ ID NO: 7, или вариант упомянутого белка, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 6, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 7, при условии, что этот вариант способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями, или этот вариант способен индуцировать продуцирование антиборрелиозных антител;
(e) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность SEQ ID NO: 5, последовательность SEQ ID NO: 6 и последовательность SEQ ID NO: 7, или вариант упомянутого белка, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 5, последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно SEQ ID NO: 6, и последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно SEQ ID NO: 7, при условии, что этот вариант способен образовывать иммунологический комплекс с антителами, продуцируемыми вследствие инфицирования боррелиями, или этот вариант способен индуцировать продуцирование антиборрелиозных антител;
(f) белок, аминокислотная последовательность которого включает (или состоит из нее) последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
Каждый из белков, идентифицированных ранее, включает в себя по меньшей мере одну последовательность внеклеточного домена белка DbpA вида боррелии, выбранного из B. afzelii (SEQ ID NO: 1), B. burgdorferi sensu stricto (SEQ ID NO: 3) и B. garinii (группа III: SEQ ID NO: 5) (группа IV: SEQ ID NO: 6), или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 40% относительно упомянутых последовательностей, и по меньшей мере одну последовательность белка OspC B. afzelii (SEQ ID NO: 2), B. burgdorferi sensu stricto (SEQ ID NO: 4) и B. garinii (SEQ ID NO: 7) или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50% относительно упомянутых последовательностей. Предпочтительно, одна или несколько последовательностей DbpA находятся на N-концевом участке химерного рекомбинантного белка, а последовательность OspC находится на C-концевом участке химерного рекомбинантного белка.
Последовательность по меньшей мере из 6 гистидиновых остатков может быть присоединена на уровне N-концевого или C-концевого участка белка с целью обеспечения его очистки на металлохелатной смоле. Последовательность из 6 гистидиновых остатков, идентифицированная в SEQ ID NO: 22, находится предпочтительно на N-концевом участке конструкции. В качестве примера такое расположение поясняется последовательностями SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 14, которые содержат на N-концевом участке цепочку поли-His(6). Цепочка поли-His может кодироваться любой из последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 23, 24 и 25.
Добавочные аминокислоты могут находиться в начале цепочки поли-His в результате инсерции в последовательность ДНК, кодирующей малую последовательность, которая позволяет облегчать клонирование требуемой последовательности в экспрессирующей плазмиде. Это относится, в частности, к последовательностям SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 14, содержащим звено "MRGS" (SEQ ID NO: 26) в начале цепочки поли-His. Звено "MRGS" кодируется последовательностью ATGAGGGGATCC (SEQ ID NO: 27).
Область связывания может быть введена между каждой из последовательностей DbpA и OspC, образующих химерный рекомбинантный белок. Область такого типа представляет собой область гибкого спейсера, обеспечивающую лучшую доступность потенциальных антител к каждому из доменов. Она содержит много аминокислотных остатков Gly и Ser, представляющих собой аминокислоты, охарактеризованные как аминокислоты, придающие гибкость в третичной структуре белка. Также возможно вводить в требуемую кодирующую последовательность плечо ДНК (или линкер) для облегчения связи между последовательностями, кодирующими два требуемых белка. Это относится, в частности, к последовательности SEQ ID NO: 14, содержащей звено "GSGG" (SEQ ID NO: 28), кодируемое последовательностью GGTTCCGGGGGT (SEQ ID NO: 29) и действующее в качестве плеча связывания между белками DbpA группы IV и OspC B. garinii.
Предпочтительные белки идентифицированы в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12 13 и 14. Они соответственно кодируются соответствующими последовательностями ДНК, идентифицированными в SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21.
Настоящее изобретение относится также к последовательностям ДНК, кодирующим ранее определенные белки, в частности к последовательностям, идентифицированным в SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21.
Настоящее изобретение относится также к экспрессирующей кассете, являющейся функциональной в клетке, производной от прокариотического (пример: Escherichia coli) или эукариотического организма, такого как дрожжи (пример: Pichia, Schizosaccharomyces), и обеспечивающей экспрессию ранее описанной нуклеиновой кислоты (ДНК), когда она находится под контролем элементов, разрешающих ее экспрессию, а также к вектору, включающему в себя такую кассету.
Белки по настоящему изобретению являются предпочтительно приемлемыми для диагностики инфицирования боррелиями. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro лайм-боррелиоза в биологическом образце (например, в образце сыворотки, крови, плазмы и т.д.), согласно которому биологический образец приводят в контакт по меньшей мере с одним ранее определенным белком и выявляют возможное образование иммунологического комплекса между упомянутым белком и антителами биологического образца (IgG и/или IgM), например, посредством прибавления по меньшей мере одного антииммуноглобулина человека, меченного любым приемлемым маркером. Под маркером понимают индикатор, способный генерировать сигнал. В неограничительный перечень таких индикаторов входят ферменты, производящие сигнал, детектируемый, например, колориметрией, по флуоресценции или люминесценции, такие как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; хромофоры, такие как флуоресцирующие, люминесцирующие или окрашивающие соединения; группировки, обладающие электронной плотностью, детектируемой электронной микроскопией или по их электрическим свойствам, таким как проводимость, способами амперометрии или вольтамперометрии или по измерению сопротивления; группировки, детектируемые оптическими способами, такими как дифракция, резонанс поверхностного плазмона, изменение краевого угла, или физическими способами, такими как спектроскопия атомных взаимодействий, туннельный эффект, и т.д.; радиоактивные молекулы, содержащие 32P, 35S или 125I. Один или несколько белков предпочтительно иммобилизуют на твердой подложке, которая может представлять собой конус прибора Vidas®, лунки планшета для микротитрования, гель, отдельные частицы и т.д.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биологический образец, кроме того, приводят в контакт по меньшей мере с одним химерным белком VlsE, описанным далее.
Белок VlsE (surface expressed lipoprotein with Extensive antigenic Variation (экспрессируемый поверхностью липопротеин с расширенной антигенной вариативностью) главным образом экспрессируется in vivo транзиторным образом и вскоре после инфицирования хозяина. Он является очень иммуногенным у инфицированного хозяина и вызывает продуцирование IgG и IgM. Локус Vls находится в линейной плазмиде длиной 28 т.п.о. (Ip28-1), имеющейся у трех геновидов боррелий, ответственных за лайм-боррелиоз, и состоит из молчащих кассет и экспрессирующего сайта (VlsE). In vivo нерегулярные рекомбинации между экспрессирующими и молчащими кассетами внезапно возникают в ходе инфицирования и лежат в основе антигенной вариабельности VlsE. Белок VlsE состоит из шести вариабельных областей VR1-VR6, расположенных на поверхности белка VlsE и отделенных промежутками от областей IR1-IR6, называемых константными.
Химерный белок VlsE включает (или состоит в основном из):
(i) по меньшей мере одну последовательность, выбранную из последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33 и 34, и последовательностей, имеющих степень идентичности меньшей мере 50%, предпочтительно 60 или 70% и преимущественно по меньшей мере 80 или 85% относительно SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33 и 34;
(ii) по меньшей мере одну последовательность, включающую последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90% относительно SEQ ID NO: 35, последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90% относительно SEQ ID NO: 36, последовательность SEQ ID NO: 37 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90% относительно SEQ ID NO: 37, и при необходимости последовательность SEQ ID NO: 43. Химерный белок VlsE предпочтительно включает последовательность SEQ ID NO: 43.
Соответственно описанному ранее полигистидиновая цепочка (×6) может быть присоединена на уровне N-концевого участка химерного белка с целью обеспечения его очистки на металлохелатной смоле, а также могут быть присоединены добавочные аминокислоты в начале цепочки поли-His.
Предпочтительный химерный белок включает (или состоит в основном из, или состоит из):
(i) последовательность SEQ ID NO: 30 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60 или 70% и преимущественно по меньшей мере 80 или 85% относительно SEQ ID NO: 30;
(ii) последовательность, включающую последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90% относительно SEQ ID NO: 35, последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90% относительно SEQ ID NO: 36, последовательность SEQ ID NO: 37 или последовательность, имеющую степень идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и преимущественно по меньшей мере 90% относительно SEQ ID NO: 37, и последовательность SEQ ID NO: 43.
Предпочтительный химерный белок включает (или состоит в основном из, или состоит из):
(i) последовательность SEQ ID NO: 30;
(ii) последовательность, включающую в себя последовательности SEQ ID NO: 35, 36, 37 и 43.
Белок включает или состоит из последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 38.
SEQ ID NO: 30 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pBi), укороченного в его сигнальной последовательности (aa 1-19) и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6.
SEQ ID NO: 31 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pBr), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6.
SEQ ID NO: 32 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. garinii (штамм pLi), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6.
SEQ ID NO: 33 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. afzelii (штамм pKo), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6.
SEQ ID NO: 34 соответствует последовательности внеклеточного домена VlsE B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31), укороченного в его сигнальной последовательности и C-концевой области зрелого белка, расположенной после домена IR6.
SEQ ID NO: 35 соответствует последовательности домена IR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31).
SEQ ID NO: 36 соответствует последовательности домена IR6 B. afzelii (штамм ACA-1).
SEQ ID NO: 37 соответствует последовательности домена IR6 B. garinii (штамм Ip90).
SEQ ID NO: 43 соответствует последовательности вариабельной области VR6 B. burgdorferi sensu stricto (штамм B31).
Настоящее изобретение относится также к набору для диагностики in vitro лайм-боррелиоза, содержащему по меньшей мере один химерный белок DbpA-OspC, описанный ранее, и предпочтительно содержащему по меньшей мере один вид антииммуноглобулина человека, меченного любым приемлемым маркером, соответствующим приведенным ранее определениям. Кроме того, набор может содержать химерный белок VlsE, определенный ранее.
Белки по настоящему изобретению являются также приемлемыми для применения в качестве активного ингредиента для получения вакцинной композиции для профилактики инфицирования боррелиями. Таким образом, настоящее изобретение относится также к вакцинной композиции, содержащей по меньшей мере один белок, определенный ранее, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Приведенные далее примеры даны в качестве пояснения и не имеют какой-либо ограничительный характер. Они позволяют лучше понять настоящее изобретение. Порядок последовательностей, кодирующих различные эпитопные иммунодоминантные области химерных рекомбинантных белков, может быть при необходимости изменен. Эпитопы также могут иметь изменения по сравнению с последовательностями, описанными в примерах, в зависимости от вида Borrelia burgdorferi и одного или нескольких штаммов, представляемых ими. Длина областей связывания также может быть изменена для улучшения гибкости между двумя доменами. В заключение, области фиксации могут быть вставлены внутри областей связывания.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение плазмидных конструкций, кодирующих химерные рекомбинантные белки DpbA-OspC
Последовательности ДНК, кодирующие различные описанные последовательности DpbA и OspC, идентифицированы в таблице 1. Последовательности ДНК были оптимизированы для облегчения экспрессии в E. coli с использованием набора GeneOptimizer™ и синтезированы соответственно методике GenScript corporation (Скотч-Плейнс, NJ, США) или GeneArt GmbH (Регенсбург, Германия).
Таблица 1 Происхождение последовательностей |
|||
Виды B. Burgdorferi *Изолят; **аминокислоты (aa); ***№ позиции в GenBank |
|||
Белок | B. sensu stricto | B. afzelii | B. garinii |
DbpA | *B31; **aa 2-192; ***AF069269 | *PKo; **aa 2-150; ***AJ131967 | *40; **aa 2-187; ***AF441832 *PBi; **aa 2-176; ***AJ841673 |
OspC | *B31; **aa 26-210; ***X73622 | *PKo; **aa 2-212; ***X62162 | *PEi; **aa 32-208; ***AJ749866 |
Каждый химерный рекомбинантный белок содержит по меньшей мере одну эпитопную область, соответствующую внеклеточному домену последовательности DbpA Borrelia burgdorferi sensu stricto или B. afzelii, или B. garinii, и по меньшей мере одну эпитопную область, соответствующую внеклеточному домену последовательности OspC Borrelia burgdorferi sensu stricto или B. afzelii, или B. garinii.
Ассоциации различных нуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательности DbpA и/или OspC, а также изменения нуклеотидных последовательностей, такие как делеции, добавление последовательности связывания или добавление последовательности-линкера, осуществляли путем генной инженерии с использованием методик ПЦР, хорошо известных специалистам в данной области техники и описанных, например, в Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Последовательности ДНК, кодирующие требуемые химерные белки, были введены в экспрессионный вектор pMR [2] между сайтом рестрикции BamHI в положении 5' и сайтом EcoRI или HindIII в положении 3'. Соответствующие плазмидные конструкции и белки, упомянутые в примере (bLYM114, bLYM120 и bLYM121), описаны в таблице 2. MRGS в N-концевом участке рекомбинантных белков и соответствующая нуклеотидная последовательность ATG AGG GGA TCC были введены по методике клонирования, использованной для экспрессионного вектора pMR. В данной последовательности действительно необходим только кодон инициации ATG и, следовательно, аминокислота Met.
Полигистидиновая последовательность (6×His) была введена на N-концевом участке каждого рекомбинантного белка. Данная последовательность обеспечивает очистку рекомбинантных белков на колонке для металлохелатной аффинной хроматографии. Она представляет собой область фиксации на геле Ni-NTA, что позволяет облегчать в дальнейшем стадию очистки химерного рекомбинантного белка. Данный пептид HHHHHH (SEQ ID NO: 22) кодируется нуклеотидными последовательностями CATCATCATCATCATCAT (SEQ ID NO: 23) или CATCATCATCATCATCAC (SEQ ID NO: 24), или CATCATCACCACCATCAT (SEQ ID NO: 25), или любой другой последовательностью, кодирующей последовательность SEQ ID NO: 22. Данная область особой фиксации, включающая в себя гистидиновую последовательность, обеспечивает, в частности, ориентированную фиксацию рекомбинантного белка на подложке, образованной диоксидом кремния или оксидами металлов.
Таблица 2 Соответствующие плазмидные конструкции и белки |
||||
Характеристики рекомбинантных белков | Характеристики плазмидных конструкций |
|||
Название | N- концевая метка |
Последовательность B. burgdorferi | Родительский вектор |
Сайт инсерции в векторе последовательности вставки |
bLYM114 SEQ ID NO: 9 |
6 × His | B. afzelii штамм PKo DbpA aa 2-150 + OspC aa 2-212 |
pMR78* | 5'BamHI/3'EcoRI |
bLYM120 SEQ ID NO: 11 |
6 × His | B. sensu stricto штамм B31 DbpA aa 28-192 + OspC aa 26-210 |
pMR78* | 5'BamHI/3'HindIII |
bLYM121 SEQ ID NO: 14 |
6 × His | B. garinii DbpA III aa 25-187 штамм 40 + DbpA IV aa 24-176 штамм PBi + OspC aa 32-208 штамм PEi |
pMR78* | 5'BamHI/3'HindIII |
* [2] |
Пример 2. Экспрессия рекомбинантных белков bLYM114, bLYM120 и bLYM121 примера 1 и очистка
Для трансформации бактерии E. coli (штамм BL21) согласно традиционной методике, известной специалистам в данной области техники, была использована плазмидная конструкция, соответствующая последовательности SEQ ID NO: 16, 18 или 21, вставленной в экспрессионный вектор (pMR). Трансформированные бактерии селекционировали по их резистентности к ампициллину, приданной вектором pMR.
Затем осуществляли селекцию клона рекомбинантной бактерии для посева прекультуры в 40 мл среды 2×YT (триптон 16 г/л; экстракт дрожжей 10 г/л; NaCl 5 г/л, pH 7,0), содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение 15-18 часов при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин данную прекультуру использовали для осуществления посева в 1 л среды 2×YT, содержавшей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Данную культуру инкубировали при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин до достижения оптической плотности DO при 600 нм значения 1,0/1,2. Культуру выдерживали в течение 3 часов 30 мин или 4 часов при 30°C после прибавления 0,4 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) и собирали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин. Осадок клеток хранили при -60°C. Для очистки влажную биомассу размораживали и ресуспендировали в лизирующем буферном растворе, содержавшем ингибиторы протеаз без ЭДТА (Roche) и бензоназонуклеазу (Novagen), и осуществляли разрушение клеток при 1,6 кбар в деструкторе клеток (Constant System Ltd, Давентри, Великобритания). Затем лизат центрифугировали при 10000 об/мин в течение 45 мин при 2-8°C. Полученная надосадочная жидкость содержит растворимые белки. Надосадочную жидкость фильтровали через фильтр пористостью 0,45 мкм и очищали аффинной хроматографией на металлохелатной колонке (матрица "никель-нитрилуксусная кислота" (Ni-NTA, Qiagen)). С этой целью надосадочную жидкость вводили (1 мл/мин) при 18-25°C в колонку с 8 мл геля Ni-NTA, кондиционированного буферным раствором A (см. таблицу 3). Затем колонку промывали буферным раствором A до достижения на выходе из колонки DO280 нм=0. Элюирование рекомбинантного белка осуществляли подачей буферного раствора B, соответственно указаниям, приведенным в таблице 3, а очищенный белок подвергали диализу в кассете для диализа с отсечкой 10000 или 20000 а.е.м. (Slide-A-Lyser®, Pierce) против диализного буферного раствора. Условия очистки на геле Ni-NTA описаны в таблице 3.
Таблица 3 Очистка рекомбинантных белков |
|||
Белок | bLYM114 SEQ ID NO: 14 |
bLYM120 SEQ ID NO: 11 |
bLYM121 SEQ ID NO: 14 |
Буферный раствор для лизиса и промывки | Буферный раствор A 1 | ||
Элюирующий буферный раствор | Буферный раствор B 2 | ||
Элюирование, стадия 1 | 90% буферного раствора A + 10% буферного раствора B (4CV) | 92% буферного раствора A + 8% буферного раствора B (4CV) | 100% буферного раствора B |
Элюирование, стадия 2 | 100% буферного раствора B | 100% буферного раствора B | нет данных |
Выход очистки, мг белка/г влажной биомассы | 12 | 13 | 20 |
Выход очистки, мг белка/л культуры | 80 | 122 | 245 |
1 Фосфат натрия 50 мМ, имидазол 30 мМ, NaCl 500 мМ, Tween 20 0,1%, глицерин 5%, pH 7,8 | |||
2 Фосфат натрия 50 мМ, имидазол 325 мМ, NaCl 500 мМ, глицерин 5%, pH 7,5 |
Образцы анализировали на геле NuPAGE® Novex®, 4-12%, в буферном растворе NuPAGE® MES-SDS согласно руководству изготовителя (Invitrogen). Белки окрашивали бриллиантовым синим Кумасси или электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5% (масс./об.) раствором сухого молока в PBS и инкубировали с анти-пентагистидиновым антителом (Qiagen) в PBS, содержавшем 0,05% Tween 20. Конъюгат антимышиного IgG козы, меченный пероксидазой хрена, (Jackson Immunoresearch laboratories) в PBS/Tween использовали в качестве вторичного антитела.
Определение концентрации белков осуществляли, используя набор Bradford (Pierce Coomassie Plus, Perbio Science) с BSA в качестве стандартного белка.
Пример 3. Обнаружение IgG и IgM человека с химерными рекомбинантными белками способом линейного иммуноблоттинга
Каждый рекомбинантный белок наносили на поливинилидендифторидную мембрану (PVDF, Immobilon, Millipore®, Бедфорд, Массачусетс, США) по приведенной далее методике.
Концентрацию белка в PBS с pH 7,2 устанавливали равной 1 мг/мл и разбавляли PBS с pH 7,2, дополненным 0,03% Tween 20 (разведение 1/200). Мембрану из PVDF смачивали метанолом, промывали в деминерализованной воде и накладывали на бумагу с влажным пятном. Пластмассовую линейку погружали в разбавленный раствор белков и фиксировали на мембране из PVDF. После нанесения белков и высушивания мембрану разрезали в вертикальном направлении на полоски. Перед применением полоски инкубировали с 5%-ным раствором желатина в TBS с pH 7,5 в течение 1 часа при 37°C. Процедуры иммуноблоттинга осуществляли при комнатной температуре соответственно описанному Bretz A.G. и соавт. [3]. Полоски инкубировали в течение 2 часов с пробами сыворотки человека, разбавленными в соотношении 1/200 в TBS с 1% желатина, промывали и инкубировали с антителом анти-IgG или анти-IgM человека, меченным щелочной фосфатазой (Sigma, Сент-Луис, США) и разбавленным в соотношении 1/1000 в TBS с 1% желатина. После промывки полоски инкубировали с субстратом BCIP-NBT щелочной фосфатазы (KPL, Гейтерсбург, MD, США) в течение 30 мин, затем промывали в дистиллированной воде и сушили.
Группа проб испытуемых сывороток
Пробы сыворотки человека отбирали у типичных, клинически хорошо охарактеризованных больных LB, соответствующих различным стадиям LB (22 с мигрирующей эритемой [EM], 5 с кардитом, 20 с нейроборрелиозом [NB], 20 с артритом Лайма [LA], 20 с атрофическим хроническим акродерматитом [ACA] и 10 с доброкачественной лимфоцитомой кожи [LCB]). Антиборрелиозные IgG были найдены описанным ранее иммуноблоттингом при использовании лизатов целых клеток [4] в сыворотке больных LA, ACA и кардитом. EM, NB и LCB были идентифицированы клинически, но все соответствующие пробы сыворотки не были определены как положительные ни посредством штатного иммуноблоттинга [4], ни посредством коммерческих наборов (VIDAS® Lyme (biomérieux), Borrelia IgG (Diasorin®) и Borrelia IgM (r-biopharm®)). Напротив, во всех случаях NB, включенных в исследование, имелись антитела, обнаруживаемые в спинномозговой жидкости [LCR] (индекс находился в интервале от 2 до 27,1 при определении с набором VIDAS® Lyme (biomérieux)). Присутствие IgM было определено только в клинических случаях стадий I и II, но не на хронических стадиях.
Группа отрицательного контроля включала в себя 31 пробу сыворотки, при этом пробы ранее были определены в традиционных испытаниях как отрицательные в отношении присутствия антиборрелиозных антител. Кроме того, с рекомбинантным белком были испытаны 64 пробы сыворотки здоровых доноров крови, проживающих в регионе, эндемичном в отношении болезни Лайма (Монтей, Вале, Швейцария).
Интенсивность реакции оценивали следующим образом: [+], [++], [+++], [-] или неоднозначные результаты. Неоднозначные результаты принимали за отрицательные.
Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4 Реактивность при линейном иммуноблоттинге проб сыворотки больных лайм-боррелиозом с 3 химерными рекомбинантными белками bLYM114 (SEQ ID NO: 9), bLYM120 (SEQ ID NO: 11) и bLYM121 (SEQ ID NO: 14) |
|||||||||
Белок | IgG | IgM | |||||||
Стадия I |
Стадия II |
Стадия III |
Стадия I |
Стадия II |
|||||
EM (n=22) | NB (n=20) | Кардит (n = 5) | LA (n=19) | ACA (n=20) | LCB (n=10) | EM (n=22) | NB (n=20) | Кардит (n=5) | |
bLYM114 | 5 | 10 | 0 | 7 | 12 | 2 | 7 | 7 | 2 |
bLYM120 | 6 | 7 | 0 | 8 | 6 | 0 | 11 | 7 | 2 |
bLYM121 | 2 | 10 | 5 | 9 | 8 | 0 | 7 | 7 | 2 |
Σ bLYM 114 + 120 + 121 | 9 | 13 | 5 | 18 | 17 | 2 | 11 | 7 | 2 |
Пробы сыворотки c положите-льным результа-том, в % и по интенсив-ности реакции | 40,9% 1[+++] 4[++] 4[+] | 59,1% 8[+++] 2[++] 3[+] | 100% 4[+++] 1[+] |
94,7% 7[+++] 8[++] 3[+] | 85% 8[+++] 5[++] 4[+] | 20% 1[++] 1[+] |
50% 1[+++] 7[++] 5[+] | 35% 5[++] 2[+] |
40% 2[++] |
Итого положите-льных результа-тов, в % и по интенсив-ности реакции | 66,7% 28[+++] 20[++] 16[+] |
42,5% 1[+++] 14[++] 7[+] |
Специфичность равна 100% на основании 31 пробы сыворотки, отобранной у здоровых участников и определенной как лайм-отрицательные посредством стандартных коммерческих тестов.
Обнаружение IgG
Результаты показывают, что слитые химерные рекомбинантные белки представляют собой диагностический инструмент, чувствительный в отношении IgG и IgM на всех стадиях инфицирования. Они позволяют выявить комплементарное действие трех рекомбинантных белков, основанных на последовательностях Borrelia afzelii, B. sensu stricto и B. garinii соответственно, для обнаружения IgG. Комбинированное применение трех химерных рекомбинантных белков позволяет на стадии I инфицирования обнаруживать IgG в 9 случаях больных с EM из 22 (или 40,9% чувствительности).
Обнаружение IgM
Химерные антибелки IgM найдены в 11 случаях из 22 (или 50% чувствительности). Таким образом, в сыворотке больных LB стадии I такие химерные белки позволяют обнаруживать IgM чаще, чем IgG. В испытаниях, осуществленных для контроля посредством штатного иммуноблоттинга [4] и коммерческого набора Borrelia IgM (r-biopharm®), обнаружено не большее число проб сыворотки с положительными результатами на IgM. Кроме того, 3 пробы сыворотки, которые посредством иммуноблоттинга и набора Borrelia IgM (r-biopharm®) определены как отрицательные, определены как положительные посредством трех химерных белков, упомянутых в примере (3/3), или посредством одного из трех белков, упомянутых в примере (1/3). Комбинированное применение трех рекомбинантных белков позволяет улучшить на 13,6% чувствительность обнаружения IgM на стадии I инфицирования.
Пример 4. Получение плазмидных конструкций, кодирующих химерные рекомбинантные белки VlsE
Последовательности ДНК, кодирующие различные последовательности белка, идентифицированы в таблице 5.
Таблица 5 Происхождение последовательностей |
|||
Виды B. burgdorferi
*Изолят; **аминокислоты (aa); ***№ позиции в GenBank |
|||
Белок | B. sensu stricto | B. afzelii | B. garinii |
VlsE | - | - | *PBi; **aa 20-293; ***AJ630106 (GenScript Corp) |
IR6 | *B31; **aa 274-305; ***U76405 (GeneArt GmbH) | *ACA-1; **aa 172-188; ***U76405 (GeneArt GmbH) | *Ip90; **aa 167-191; ***AAN87834 (GeneArt GmbH) |
Последовательности были оптимизированы в отношении их экспрессии в E. coli с использованием набора GeneOptimizer™ и синтезированы соответственно методике GenScript corporation (Скотч-Плейнс, NJ, США) или GeneArt GmbH (Регенсбург, Германия).
Дополнительные изменения ДНК, делеции или ассоциации различных последовательностей реализовывали способом ПЦР (PCR), применяемым в генной инженерии, с использованием методик ПЦР, хорошо известных специалистам в данной области техники и описанных, например, в Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Последовательности ДНК были связаны в экспрессионный вектор pMR [2] или pET-3d (Novagen®). Соответствующие плазмидные конструкции и белки, упомянутые в примере (bLYM110, bLYM125), описаны в таблице 6.
Таблица 6 Соответствующие плазмидные конструкции и белки |
||||
Характеристики рекомбинантных белков | Характеристики плазмидных конструкций | |||
Название | N-концевая метка | Последовательность B. burgdorferi | Родительский вектор | Сайт инсерции в векторе последовательности вставки |
bLYM110 SEQ ID NO: 39 | 6 × His | VlsE garinii pBi aa 20-293 + 3 IR6 [sensu stricto B21 aa 274-305 + afzelii ACA-1 aa 172-188 + garinii Ip90 aa 167-191] | pMR78 | 5'BamHI/3'HindIII |
bLYM125 SEQ ID NO: 41 | 8 × His | pET-3d | 5'NcoI/3'BamHI |
Пример 5. Экспрессия рекомбинантных белков примера 4 и очистка
Для трансформации бактерии E. coli (штамм BL21) согласно традиционной методике, известной специалистам в данной области техники, использовали плазмидную конструкцию, описанную в примере 4. Трансформированные бактерии селекционировали по их резистентности к ампициллину, приданной вектором pMR или pET.
Затем осуществляли селекцию клона рекомбинантной бактерии для посева прекультуры в 40 мл среды 2×YT (триптон 16 г/л; экстракт дрожжей 10 г/л; NaCl 5 г/л, pH 7,0), содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение 15-18 часов при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин данную прекультуру использовали для осуществления посева в 1 л среды 2×YT, содержавшей 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Данную культуру инкубировали при 30°C при перемешивании со скоростью 250 об/мин до достижения оптической плотности DO при 600 нм значения 1,0/1,2. Культуру выдерживали в течение 3 часов 30 мин или 4 часов при 30°C после прибавления 0,4 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) и собирали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин. Осадок клеток хранили при -60°C. Для очистки влажную биомассу ресуспендировали в лизирующем буферном растворе, содержавшем ингибиторы протеаз без ЭДТА (Roche) и бензоназонуклеазу (Novagen®), и осуществляли разрушение клеток при 1,6 кбар в деструкторе клеток (Constant System Ltd, Давентри, Великобритания). Затем лизат центрифугировали при 10000 об/мин в течение 45 минут при 2-8°C. После фильтрования через фильтр пористостью 0,22 мкм надосадочную жидкость вводили в колонку Ni-NTA (Quiagen®), кондиционированную лизирующим буферным раствором. Затем смолу промывали тем же самым буферным раствором до достижения A280 нм значения базовой линии. Элюирование осуществляли элюирующим буферным раствором, а очищенный белок подвергали диализу на кассете Pierce для диализа Slide-A-Lyser® с отсечкой 10000 или 20000 а.е.м. против диализного буферного раствора. Условия очистки на геле Ni-NTA описаны в таблице 7.
Таблица 7 Очистка рекомбинантных белков |
||
Белок | bLYM110 SEQ ID NO: 39 |
bLYM125 SEQ ID NO: 41 |
Буферный раствор для лизиса и промывки | Буферный раствор A 1 | Буферный раствор A 1 + мочевина, 2 M |
Элюирующий буферный раствор | Буферный раствор B 2 | Буферный раствор B 2, модифицированный 600 мМ имидазола |
Элюирование, стадия 1 | 86% буферного раствора A + 14% буферного раствора B (4CV) | 92% буферного раствора A + 8% буферного раствора B (4CV) |
Элюирование, стадия 2 | 100% буферного раствора B | 100% буферного раствора B |
Выход очистки, мг белка/г влажной биомассы | 0,5 | 0,8 |
Выход очистки, мг белка/л культуры | 8,7 | 17 |
1 Фосфат натрия 50 мМ, имидазол 30 мМ, NaCl 500 мМ, Tween 20 0,1%, глицерин 5%, pH 7,8 | ||
2 Фосфат натрия 50 мМ, имидазол 325 мМ, NaCl 500 мМ, глицерин 5%, pH 7,5 |
Образцы анализировали на геле NuPAGE® Novex®, 4-12%, в циркуляционном буферном растворе NuPAGE® MES-SDS согласно руководству изготовителя (Invitrogen™). Белки окрашивали бриллиантовым синим Кумасси или электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5%-ным (масс./об.) раствором сухого молока в PBS и инкубировали с анти-пентагистидиновым антителом (Qiagen®) в PBS, содержавшем 0,05% Tween 20. Конъюгат антимышиного IgG козы, меченный пероксидазой хрена, (Jackson Immunoresearch laboratories) в PBS/Tween использовали в качестве вторичного антитела.
Определение концентрации белков осуществляли, используя набор Bradford Assay Kit (Pierce Coomassie Plus, Perbio Science) с BSA в качестве стандартного белка.
Пример 6. Обнаружение IgG и IgM человека с химерным рекомбинантным белком bLYM110 примера 5 способом линейного иммуноблоттинга
Рекомбинантный белок наносили на поливинилидендифторидную мембрану (PVDF, Immobilon, Millipore®, Бедфорд, Массачусетс, США) по приведенной далее методике.
Концентрацию белка в PBS с pH 7,2 устанавливали равной 1 мг/мл и разбавляли PBS с pH 7,2, дополненным 0,03% Tween 20 (разведение 1/200). Мембрану из PVDF смачивали метанолом, промывали в деминерализованной воде и накладывали на бумагу с влажным пятном. Пластмассовую линейку погружали в разбавленный раствор белков и фиксировали на мембране из PVDF. После нанесения белков и высушивания мембрану разрезали в вертикальном направлении на полоски. Перед применением полоски инкубировали с 5%-ным раствором желатина в TBS с pH 7,5 в течение 1 часа при 37°C. Процедуры иммуноблоттинга осуществляли при комнатной температуре соответственно описанному Bretz A.G. и соавт. [3]. Полоски инкубировали в течение 2 часов с пробами сыворотки человека, разбавленными в соотношении 1/200 в TBS с 1% желатина, промывали и инкубировали с отличающимися от человеческого IgG или IgM, меченными щелочной фосфатазой (Sigma™, Сент-Луис, США) и разбавленными в соотношении 1/1000 в TBS с 1% желатина. После промывки полоски инкубировали с субстратом BCIP-NBT (KPL, Гейтерсбург, MD, США) в течение 30 минут, промывали в дистиллированной воде и сушили.
Группа проб испытуемых сывороток
Пробы сыворотки человека отбирали у типичных, клинически хорошо охарактеризованных больных LB, соответствующих различным стадиям LB (22 с мигрирующей эритемой [EM], 5 с кардитом, 20 с нейроборрелиозом [NB], 20 с артритом Лайма [LA], 20 с атрофическим хроническим акродерматитом [ACA] и 10 с доброкачественной лимфоцитомой кожи [LCB]). Антиборрелиозные IgG были найдены описанным ранее иммуноблоттингом при использовании лизатов целых клеток [4] в сыворотке больных LA, ACA и кардитом. EM, NB и LCB были идентифицированы клинически, но все соответствующие пробы сыворотки не были определены как положительные ни посредством иммуноблоттинга [4], ни посредством коммерческих наборов (VIDAS® Lyme (biomérieux®), Borrelia IgG (Diasorin®) и Borrelia IgM (r-biopharm®)). Напротив, во всех случаях NB, включенных в исследование, имелись антитела, обнаруживаемые в спинномозговой жидкости [LCR] (индекс находился в интервале от 2 до 27,1).
Группа отрицательного контроля включала в себя 31 пробу сыворотки, при этом пробы ранее были определены в традиционных испытаниях как отрицательные в отношении присутствия антиборрелиозных антител. Кроме того, с рекомбинантным белком были испытаны 64 пробы сыворотки здоровых доноров крови, проживающих в регионе, эндемичном в отношении болезни Лайма (Монтей, Вале, Швейцария). Интенсивность реакции оценивали следующим образом: [+], [++], [+++], [-] или неоднозначные результаты. Неоднозначные результаты принимали за отрицательные.
Результаты представлены в приведенной далее таблице 8.
Таблица 8 | ||||||||||
IgG | ||||||||||
Стадия I | Стадия II | Стадия III | Доноры | |||||||
EM (n=22) | NB (n=20) | Кардит (n=5) | LA (n=19) | ACA (n=20) | Лимфоцитома (n=10) | (n=64) | ||||
17 | 20 | 5 | 19 | 20 | 9 | 6 | ||||
77,3% | 100% | 100% | 100% | 100% | 90% | 9,4% | ||||
12[+++] | 11[+++] | 4[+++] | 13[+++] | 20[+++] | 3[+++] | 6[+] | ||||
4[++] | 7[++] | 1[++] | 4[++] | 2[++] | ||||||
1[+] | 2[+] | 2[+] | 4[+] | |||||||
Итого положительных реакций на IgG: 93,7% | ||||||||||
IgM | ||||||||||
EM (n=22) |
NB (n=20) |
Кардит (n=5) | (n=64) | |||||||
5 | 4 | 2 | 1 | |||||||
22% | 20% | 40% | 1,5% | |||||||
1[++] | 2[++] | 1[++] | 1[+] | |||||||
4[+] | 1[+] | 1[+] | ||||||||
Итого положительных реакций на IgM: 23,4 % |
Обнаружение IgG
Результаты показывают, что рекомбинантный белок bLYM110 представляет собой диагностический антиген, высокочувствительный в отношении IgG на всех стадиях инфицирования. На стадии I инфицирования IgG были обнаружены в 17 случаях больных с EM из 22 (или 77,3% чувствительности). У пяти больных с EM, для которых найдены отрицательные результаты с рекомбинантным белком, такие же результаты определены штатным иммуноблоттингом и с коммерческими наборами. Семь проб сыворотки с EM, найденные положительными с рекомбинантным белком, не были обнаружены иммуноблоттингом, что представляет собой улучшение чувствительности с рекомбинантным белком на 31,8%. На первой стадии инфицирования в отсутствие характерного покраснения диагностика может быть затруднена, так как другие клинические проявления болезни Лайма не являются специфическими. Кроме того, традиционными испытаниями были обнаружены только несколько больных, имевших EM. Таким образом, белок по настоящему изобретению улучшил обнаружение IgG на стадии I инфицирования, обеспечив обнаружение их более чем у 77% больных, имевших EM.
Обнаружение IgM
Химерные антибелки IgM найдены в 23,4% проб сыворотки с LB. В сыворотке больных LB стадий I и II белок позволяет обнаруживать IgG чаще, чем IgM.
Пример 7. Оценка и валидация химерных рекомбинантных белков bLYM114, bLYM120, bLYM121 и bLYM125 посредством теста VIDAS® (bioMérieux)
Данную валидацию осуществляли посредством теста VIDAS®, применяя:
1) химерные рекомбинантные белки bLYM114, bLYM120 и bLYM121, полученные согласно примерам 1 и 2, для обнаружения IgM;
2) химерные рекомбинантные белки bLYM114, bLYM120, полученные согласно примерам 1 и 2, и химерный белок bLYM125, полученный согласно примерам 4 и 5, для обнаружения IgG.
Принцип теста VIDAS® состоит в следующем: конус образует твердую подложку, которая служит также системой подачи реактивов, содержащихся в полости конуса. Один или несколько рекомбинантных белков фиксируют на конусе. После стадии разбавления образец отбирают аспирацией и вводят за несколько приемов внутрь конуса. Данная процедура позволяет антиборрелиозным иммуноглобулинам образца связываться с рекомбинантными белками. Компоненты, оставшиеся несвязанными, удаляют промывкой. Антитело антииммуноглобулинов человека, конъюгированное с щелочной фосфатазой (PAL), инкубируют в конусе, в котором оно прикрепляется к антиборрелиозным иммуноглобулинам. На стадиях промывки удаляют конъюгат, оставшийся неприкрепленным. В ходе последней стадии обнаружения субстрат щелочной фосфатазы (PAL), представляющий собой 4-метилумбеллиферилфосфат, гидролизуют до 4-метилумбеллиферона, флуоресценцию которого измеряют при 450 нм. Интенсивность флуоресценции, измеренная посредством оптической системы Vidas®, пропорциональна содержанию антиборрелиозных иммуноглобулинов, присутствующих в образце. Результаты автоматически анализируются системой VIDAS® и выражаются в RFV (Relative Fluorescent Value (относительные единицы флуоресценции)).
Таким образом, посредством системы Vidas® были проанализированы 255 положительных проб сыворотки (пробы с неоднозначным результатом + пробы с положительным результатом) и 298 отрицательных проб сыворотки (пробы с неоднозначным результатом + пробы с отрицательным результатом).
Конусы Vidas® Lyme IgG сенсибилизировали 300 мкл раствора, содержавшего белки bLYM114, bLYM120 и bLYM125 по настоящему изобретению с концентрацией каждого из них в общем сенсибилизирующем растворе, равной 1 мкг/мл.
На первой стадии пробы сыворотки инкубировали в течение 5,3 мин для образования комплексов "антигены-антитела". На второй стадии анти-IgG человека, меченные PAL, инкубировали в течение 5,3 мин.
Результаты выражали в виде индекса по отношению к порогу положительного значения, составляющего 135 RFV согласно методике.
- Из 255 испытанных положительных проб сыворотки 246 найдены положительными и 9 ложноотрицательными, что соответствует чувствительности 96,5%.
- Из 298 испытанных отрицательных проб сыворотки 284 найдены отрицательными и 14 ложноположительными, что соответствует специфичности 95,3%.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gottner G. et al., Int. J. Microbiol. 293, Suppl. 37, 172-173 (2004).
2. Arnaud N. et al., Gene 1997; 199:149-156.
3. Bretz A.G., K. Ryffel, P. Hutter, E. Dayer and O. Peter. Specificities and sensitivities of four monoclonal antibodies for typing of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates. Clin. Diag. Lab. Immunol. 2001 ; 8: 376-384.
4. Ryffel K., Peter O., Rutti B. and E. Dayer. Scored antibody reactivity by immunoblot suggests organotropism of Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii and B. valaisiana in human.J. Clin. Microbiol. 1999; 37:4086-92.
Claims (11)
1. Слитый химерный белок DbpA-OspC боррелии для диагностики лайм-боррелиоза, выбранный из группы, в которую входят:
(a) белок, аминокислотная последовательность которого включает на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 1 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 2;
(b) белок, аминокислотная последовательность которого включает на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 3 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 4;
(c) белок, аминокислотная последовательность которого включает на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 5 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 7;
(d) белок, включающий на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 6 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 7;
(e) белок, включающий на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 5, последовательность SEQ ID NO: 6 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 7;
(f) белок, аминокислотная последовательность которого включает последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
(a) белок, аминокислотная последовательность которого включает на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 1 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 2;
(b) белок, аминокислотная последовательность которого включает на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 3 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 4;
(c) белок, аминокислотная последовательность которого включает на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 5 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 7;
(d) белок, включающий на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 6 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 7;
(e) белок, включающий на своем N-конце последовательность SEQ ID NO: 5, последовательность SEQ ID NO: 6 и на своем С-конце последовательность SEQ ID NO: 7;
(f) белок, аминокислотная последовательность которого включает последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
2. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по п.1.
3. Экспрессирующая кассета, являющаяся функциональной в клетке, производной от прокариотического или эукариотического организма, обеспечивающая экспрессию нуклеиновой кислоты по п.2 и находящаяся под контролем элементов, необходимых для ее экспрессии.
4. Вектор, включающий экспрессирующую кассету по п.3.
5. Способ диагностики in vitro лайм-боррелиоза в биологическом образце, согласно которому биологический образец приводят в контакт по меньшей мере с одним белком по п.1 и выявляют возможное образование иммунологического комплекса между упомянутым белком и антителами биологического образца.
6. Способ по п.5, в котором антитела биологического образца представляют собой IgG и/или IgM.
7. Способ по п.6, в котором образование иммунологического комплекса определяют посредством прибавления по меньшей мере одного антииммуноглобулина человека, меченного любым приемлемым маркером.
8. Способ по любому из пп.5-7, в котором белок иммобилизуют на твердой подложке.
9. Набор для диагностики in vitro лайм-боррелиоза, включающий по меньшей мере один слитый химерный белок боррелии, отличающийся тем, что белок представляет собой белок по п.1.
10. Набор по п.9, включающий в себя по меньшей мере один антииммуноглобулин человека, меченный любым приемлемым маркером.
11. Вакцинная композиция для профилактики инфицирования боррелиями, содержащая по меньшей мере один белок по п.1 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0904093A FR2949472B1 (fr) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Proteines utilisees pour le diagnostic d'une borreliose de lyme |
FR0904093 | 2009-08-28 | ||
PCT/FR2010/051780 WO2011023909A1 (fr) | 2009-08-28 | 2010-08-26 | Proteines utilisees pour le diagnostic d'une borreliose de lyme |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012111811A RU2012111811A (ru) | 2013-10-10 |
RU2549698C2 true RU2549698C2 (ru) | 2015-04-27 |
Family
ID=42046350
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012111811/10A RU2549698C2 (ru) | 2009-08-28 | 2010-08-26 | Химерный белок боррелии, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, экспрессирующая кассета, вектор, способ и набор для диагностики лайм-боррелиоза, вакцина для профилактики боррелиоза |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9347943B2 (ru) |
EP (1) | EP2470907B1 (ru) |
ES (1) | ES2500651T3 (ru) |
FR (1) | FR2949472B1 (ru) |
PL (1) | PL2470907T3 (ru) |
RU (1) | RU2549698C2 (ru) |
WO (1) | WO2011023909A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2681229C1 (ru) * | 2017-11-03 | 2019-03-05 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид DBPAG, перспективный для серодиагностики клещевого боррелиоза, рекомбинантная плазмидная ДНК pETdbpagNH, кодирующая слитный полипептид DBPAG, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/ pETdbpagNH - продуцент полипептида DBPAG, полипептид DBPAG и способ его получения |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2949472B1 (fr) * | 2009-08-28 | 2013-08-09 | Biomerieux Sa | Proteines utilisees pour le diagnostic d'une borreliose de lyme |
US10294531B2 (en) * | 2013-10-07 | 2019-05-21 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Method, kits and materials for detection of Lyme disease Borrelia sp. infection |
WO2018017998A1 (en) * | 2016-07-22 | 2018-01-25 | The Research Foundation For The State University Of New York | Recombinant borrelia proteins and methods of use thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2102081C1 (ru) * | 1991-07-11 | 1998-01-20 | Иммуно АГ | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi |
WO2000078800A2 (en) * | 1999-06-18 | 2000-12-28 | Medimmune, Inc. | Combined decorin binding protein and outer surface protein compositions and methods of use |
RU2260047C2 (ru) * | 2003-10-23 | 2005-09-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез иммунодоминантного белка borrelia garinii, используемого для диагностики лайм-боррелиоза (варианты) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5620862A (en) * | 1993-11-24 | 1997-04-15 | University Of Connecticut | Methods for diagnosing early Lyme disease |
DE19632862B4 (de) * | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
US6475492B1 (en) | 1999-04-28 | 2002-11-05 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Peptides and assays for the diagnosis of lyme disease |
US7060281B1 (en) * | 1999-06-18 | 2006-06-13 | Research Foundation Of The State University Of New York | Groups of barrelia burgdorferi and borrelia afzelii that cause lyme disease in humans |
WO2007133623A2 (en) * | 2006-05-10 | 2007-11-22 | Biopeptides Corporation | Peptide diagnostic agent for lyme disease |
FR2949472B1 (fr) * | 2009-08-28 | 2013-08-09 | Biomerieux Sa | Proteines utilisees pour le diagnostic d'une borreliose de lyme |
-
2009
- 2009-08-28 FR FR0904093A patent/FR2949472B1/fr active Active
-
2010
- 2010-08-26 EP EP10763756.3A patent/EP2470907B1/fr active Active
- 2010-08-26 PL PL10763756T patent/PL2470907T3/pl unknown
- 2010-08-26 US US13/388,178 patent/US9347943B2/en active Active
- 2010-08-26 WO PCT/FR2010/051780 patent/WO2011023909A1/fr active Application Filing
- 2010-08-26 RU RU2012111811/10A patent/RU2549698C2/ru active
- 2010-08-26 ES ES10763756.3T patent/ES2500651T3/es active Active
-
2016
- 2016-02-09 US US15/019,520 patent/US9977020B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-19 US US15/957,312 patent/US20180238874A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2102081C1 (ru) * | 1991-07-11 | 1998-01-20 | Иммуно АГ | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi |
WO2000078800A2 (en) * | 1999-06-18 | 2000-12-28 | Medimmune, Inc. | Combined decorin binding protein and outer surface protein compositions and methods of use |
RU2260047C2 (ru) * | 2003-10-23 | 2005-09-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез иммунодоминантного белка borrelia garinii, используемого для диагностики лайм-боррелиоза (варианты) |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
P. SCOTT HEFTY et al., Regulation of OspE-Related, OspF-Related, and Elp. Lipoproteins of Borrelia burgdorferi Strain 297 by Mammalian. Host-Specific Signals, INFECTION AND IMMUNITY, June 2001, Vol. 69, No. 6, p. 3618"3627. Anette Hubner et al., Expression of Borrelia burgdorferi OspC and DbpA is. controlled by a RpoN"RpoS regulatory pathway, PNAS, October 23, 2001, vol. 98, no. 22, p.p.12724-12729 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2681229C1 (ru) * | 2017-11-03 | 2019-03-05 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид DBPAG, перспективный для серодиагностики клещевого боррелиоза, рекомбинантная плазмидная ДНК pETdbpagNH, кодирующая слитный полипептид DBPAG, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/ pETdbpagNH - продуцент полипептида DBPAG, полипептид DBPAG и способ его получения |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL2470907T3 (pl) | 2015-01-30 |
EP2470907A1 (fr) | 2012-07-04 |
ES2500651T3 (es) | 2014-09-30 |
US9347943B2 (en) | 2016-05-24 |
RU2012111811A (ru) | 2013-10-10 |
EP2470907B1 (fr) | 2014-06-25 |
US20120135027A1 (en) | 2012-05-31 |
FR2949472A1 (fr) | 2011-03-04 |
FR2949472B1 (fr) | 2013-08-09 |
WO2011023909A1 (fr) | 2011-03-03 |
US20170205407A1 (en) | 2017-07-20 |
US20180238874A1 (en) | 2018-08-23 |
US9977020B2 (en) | 2018-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2015504420A (ja) | ライム病抗体の検出のためのペプチドおよび方法 | |
KR102424496B1 (ko) | 신장 질환 및 치주 질환의 검출 및 진단을 위한 방법 및 조성물 | |
EP2809348B1 (en) | Diagnostic peptides for lyme disease | |
US20180238874A1 (en) | Proteins used for the diagnosis of lyme borreliosis | |
JP2022048268A (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法及びキット | |
JP5379698B2 (ja) | アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法およびキット | |
JP5442641B2 (ja) | 全インフルエンザ菌の測定方法 | |
KR20160043984A (ko) | 에이치. 필로리 감염의 검출 방법 | |
JP2011518338A (ja) | ボレリア・ブルグドルフェリ(borreliaburgdorferi)の細胞エンベロープタンパク質のアレイ | |
KR101678428B1 (ko) | 폐렴구군 검출방법 | |
JP2017531657A (ja) | 組換えボレリアタンパク質およびその使用のための方法 | |
RU2546246C2 (ru) | Химерный белок, используемый для диагностики лайм-боррелиоза. | |
WO1998029132A9 (en) | Early detection of mycobacterial disease | |
US8338566B2 (en) | Characterization of BBK07 antigen of Borrelia burgdorferi and methods of use | |
EP3077409B1 (en) | Peptides for diagnosing lyme disease | |
JP2001516458A (ja) | 診断試薬としての組換えP37/FlaA | |
Ghose et al. | Serological assays for identification of human gastric colonization by Helicobacter pylori strains expressing VacA m1 or m2 | |
WO2020158811A1 (ja) | ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法、および同定用キット | |
JP6979200B2 (ja) | レプトスピラ症の診断に用いるレプトスピラ抗原検出用抗体 | |
CN112180096A (zh) | 用于诊断线虫感染的新测定法 | |
Sukosol et al. | Fusion protein of Salmonella typhi flagellin as antigen for diagnosis of typhoid fever | |
JP2007300817A (ja) | 細菌の検出方法、検出用試薬及び検出用キット。 |