DE60120621T2

DE60120621T2 - Lawsonia intracellularis Impfstoff

Info

Publication number: DE60120621T2
Application number: DE60120621T
Authority: DE
Inventors: Antonius A. C. Jacobs; Paul Vermeij
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2000-12-20
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2021-12-15
Also published as: US6921536B2; EP1586646B1; JP2003000276A; ES2360225T3; EP1586646A2; EP1219711A2; ATE330013T1; US20050250150A1; HUP0105379A2; PL205964B1; EP1219711B1; ATE501258T1; AU783210B2; PL351277A1; DK1586646T3; PT1219711E; HUP0105379A3; DE60144201D1; ES2266090T3; DK1219711T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die neue Lawsonia intracellularis-Proteine codieren, DNS-Fragmente, rekombinante DNS-Molekühle und lebende rekombinante Träger, die diese Sequenzen umfassen, Host-Zellen, die solche Nukleinsäuresequenzen, DNS-Fragmente, rekombinante DNS-Molekühle und lebende rekombinante Träger umfassen, Proteine, die durch diese Nukleotidsequenzen kodiert werden, Impfstoffe, um Lawsonia intracellularis-Infektionen zu bekämpfen, und Verfahren zur Herstellung davon, und Diagnosewerkzeuge für die Erfassung von Lawsonia intracellularis.
Die sogenannte porcine proliferative Enteropathie (PPE oder PE) ist eine wesentliche Krankheit der modernen Schweineindustrie weltweit geworden. Die Krankheit betrifft 15% bis 50% der heranwachsenden Herden und bis zu 30% der Einzeltiere in bestehenden Problemherden. Die heute jährlichen wirtschaftlichen Verluste werden auf 5–10 US Dollar für Extrafutter und zusätzlichen Haltungskosten je betroffenem Schwein geschätzt. PPE ist eine Gruppe von chronischen und akuten Bedingungen mit sehr weit differierenden klinischen Anzeichen (Tod, Bleiche und anämische Tiere, wässerige dunkle oder sehr rote Diarrhöe, Depression, verminderter Appetit und Weigerung zur Bewegung, verzögertem Wachstum und erhöhtem FCR). Es bestehen jedoch zwei konsistente Merkmale. Das erste, ein pathologischer Wechsel, der nur in der Leichenschau sichtbar ist, betrifft eine Verdickung des Dünndarms und der Dickdarmschleimhäute. Der zweite ist das Auftreten von intrazytoplasmatischen kleinkurvigen Bakterien in den Enterozyten der betroffenen Därme. Diese Bakterien sind nun festgestellt worden als ätiologisches Agens von PPE und sind Lawsonia intracellularis genannt worden.
Über die Jahre ist für Lawsonia intracellularis festgestellt worden, dass sie fast alle Tiere beeinträchtigen kann, umfassend Affen, Kaninchen, Frettchen, Hamster, Füchse, Pferde, und andere Tiere wie den Strauss und den Emu. Lawsonia intracellularis ist ein gram-negatives Bakterium mit Geissel, das sich nur in eukariotischen Enterozyten vervielfältigen kann und es sind bis jetzt keine zellfreien Kulturen beschrieben worden. Um zu überleben und sich in der Zelle zu vervielfachen, muss Lawsonia intracellularis in sich teilende Kryptzellen eindringen. Das Bakterium assoziiert sich mit der Zellmembran und tritt in den Enterozyten über eine Eingangs-Vakuole ein. Diese bricht dann schnell zusammen (innerhalb von 3 Stunden) und das Bakterium wächst und multipliziert sich frei im Zytoplasma. Die Mechanismen, durch die es den Bakterien möglich ist, zu bewirken, dass die infizierten Zellen nicht reifen, weiterhin die Mitose durchführen und hypoplastische Kryptzellen bilden, ist noch nicht voll verstanden.
Das derzeitige Verständnis von Lawsonia intracellularis-Infektion, -Behandlung und -Kontrolle der Krankheit ist bis jetzt durch die Tatsache behindert worden, dass Lawsonia intracellularis nicht in zellfreien Medien kultiviert werden konnte. Obwohl es schon Berichte gegeben hat, dass Lawsonia intracellularis in Rattenenterozyten mitkultiviert worden sind, hat dies nicht zu einer Entwicklung von Impfstoffen geführt, mit der Lawsonia intracellularis bekämpfbar ist, obwohl ein klarer Bedarf für solche Impfstoffe besteht.
Es ist in überraschender Weise nun gefunden, dass Lawsonia intracellularis ein neues äusseres Membranprotein (OMP) produziert, welches fähig ist, eine Schutzimmunität gegen Lawsonia intracellularis zu induzieren.
Das neue äussere Membranprotein wird als das 19/21 kD-Protein bezeichnet. Das 19/21 kD-Protein wird in zwei verschiedenen Formen angetroffen, eine 19 kD-Form und eine 21 kD-Form, wobei das eine Protein eine modifizierte Form des anderen ist und beide eine identische Aminosäuresequenz umfassen.
Das 19/21 kD-Protein ist durch drei interne Aminosäuresequenzen von 7, 12 und 12 Aminosäuren gekennzeichnet. Diese Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NR: 1, 2 und 3 dargestellt.
Es ist im Stand der Technik wohl bekannt, dass viele verschiedene Nukleinsäuresequenzen ein und dasselbe Protein kodieren können. Dieses Phänomen ist allgemein als „wobble" bekannt bei der zweiten und insbesondere bei der dritten Base von jedem Triplet, welches eine Aminosäure kodiert. Dieses Phänomen kann in einer Heterologie von ungefähr 30% für zwei Nukleinsäuresequenzen resultieren, die immer noch das selbe Protein kodieren. Phänomen. Daher können zwei Nukleinsäuresequenzen, die eine Sequenz Homologie von ungefähr 70% haben, immer noch ein und dasselbe Protein kodieren.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung bezieht sich auf das neue Protein, dass 19/21 kD-Protein und auf immunogene Fragmente gemass der Erfindung.
Das Konzept der immunogenen Fragmente wird wie untenstehend definiert.
Das Ausführungsbeispiel bezieht sich auf ein Lawsonia intracellularis-äusseres Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 19/21 kD, welches äussere Membranprotein erhaltbar ist durch ein Verfahren, umfassend die Schritte von:

a) Unterwerfen einer äusseren Membran-Präparation einer SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese)
b) Herauslösen des 19/21 kD-Bandes aus dem Gel und auf immunogene Fragmente dieses Proteins.

Im Beispiel 1 ist ein Beispiel im Detail beschrieben, wie diese Schritte auszuführen sind: zuerst ist der Schritt der Isolierung von Lawsonia intracellularis aus infiziertem Schweine-Ileum beschrieben, gefolgt von einer Beschreibung, wie Lawsonia intracellularis äussere Membran Protein-Präparat erhalten werden kann. Schliesslich wird unter „äussere Membran Protein-Sequenzierung" erläutert, wie das 19 oder 21 kD-Band aus dem Gel zu isolieren ist.
Bei einer bevorzugten Form hat dieses Lawsonia intracellularis-Protein oder ein immunogenes Fragment von diesem Protein eine interne Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70% homolog ist zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist, eine interne Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70% homolog ist zu der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR: 2 dargestellt ist oder eine interne Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70% homolog ist zu der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NR: 3 dargestellt ist.
In einer bevorzugten Form hat das Lawsonia intracellularis-Protein oder ein immonugenes Fragment von diesem Protein eine Sequenzhomologie von mindestens 80%, vorzugsweise 90% und noch bevorzugter 95% Homologie mit der Aminosäuresequenz, wie sie in den SEQ ID NR: 1, 2 oder 3 dargestellt ist. Noch bevorzugter ist ein Homologie Niveau von 98% oder gar 100%.
Das Niveau der Proteinhomologie kann bestimmt werden mit dem Computerprogramm „BLAST 2 SEQUENCES" durch das Auswählen des Unterprogramms „BLASTP", das unter www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/b12.html zu finden ist.
Eine Beschreibung dieses Programms findet sich in Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247–250 (1999). Die benutzte Matrix ist: „blosum62". Die eingesetzten Parameter sind die Standardparameter:
„Open gap: 11. Extension gap: 1. Gap x_dropoff: 50."
Es ist wohl verstanden, dass für die hier umfassten bestimmten Proteine natürliche Veränderungen und Variationen zwischen einzelnen Lawsonia intracellularis-Stämmen bestehen können. Diese Variationen können durch eine oder mehrere Aminosäureunterschiede in der Gesamtsequenz oder durch Löschungen, Substitutionen, Einfügungen, Inversionen oder Hinzufügungen von einer oder mehreren Aminosäuren in die besagte Sequenz dargestellt werden. Aminosäureersetzungen, die nicht notwendigerweise biologische und immunologische Aktivitäten verändern, sind beispielsweise durch Neurath et al. in „The Proteins" Academic Press New York (1979) beschrieben worden. Aminosäureersetzungen zwischen bezogenen Aminosäuren oder Ersetzungen, die häufig in der Evolution auftreten sind, unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (siehe Dayhof, M.D., „Atlas of protein sequence and structure", Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, Band 5, suppl. 3). Andere Aminosäuresubstitutionen umfassen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val und Ala/Glu. Basierend auf dieser Information haben Lipman und Pearson ein Verfahren zum schnellen und empfindlichen Proteinvergleich (Science, 227, 1435–1441, 1985) entwickelt und bestimmen die funktionale Ähnlichkeit zwischen homologen Proteinen. Solche Aminosäuresubstitutionen sowohl des oder der beispielhaften Ausführungsbeispiele dieser Erfindung als auch Variationen, die Löschungen und/oder Einfügungen haben, liegen innerhalb des Rahmens der Erfindung, solange die sich ergebende Proteine ihre Immunreaktivität behalten. Dies erklärt, warum Lawsonia intracellularis-Proteine gemäss der Erfindung, wenn sie aus verschiedenen Feldisolaten isoliert werden, Homologie Niveaus von ungefähr 70% haben können, während sie immer noch das selbe Protein mit den selben immunologischen Charakteristika darstellen.
Diese Variationen in der Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins gemäss der Erfindung, das immer noch ein Protein liefert, welches fähig ist, eine Immunantwort gegenüber der Infektion mit Lawsonia intracellularis oder mindestens gegen klinische Manifestationen der Infektion zu induzieren, werden als „nicht wesentlich die Immunogenizität beeinflussend" betrachtet.
Wenn ein Protein beispielsweise für Impfzwecke oder zur Herstellung von Antikörpern eingesetzt wird, ist es jedoch nicht notwendig, das ganze Protein einzusetzen. Es ist möglich, ein Fragment dieses Proteins zu nutzen, welches fähig ist, als solches oder mit einem Träger gekoppelt wie beispielsweise KLH, eine Immunantwort gegen dieses Protein zu induzieren, ein sogenanntes immunogenes Fragment. Ein „immunogenes Fragment" wird als ein Fragment oder als ein Volllängenprotein verstanden, das immer noch seine Fähigkeit behalten hat, eine Immunantwort im Host zu induzieren, d.h. eine B- oder T-Zell-Epitope zu umfassen. Zu diesem Zeitpunkt stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, mit denen in einfacher Weise DNS-Fragmente, die antigene Fragmente kodieren (Determinanten), identifiziert werden können. Das Verfahren, welches von Geysen et al. (Patentanmeldung WO 84/03564, Patentanmeldung WO 86/06487, US Patent Nr. 4,833,092, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3998–4002 (1984) , J. Imm. Meth. 102, 259–274 (1987)) beschrieben worden ist, die sogenannte PEPSCAN- Verfahren, ist ein einfach durchzuführendes, schnelles und gut etabliertes Verfahren zur Feststellung von Epitopen; die immunologisch wesentlichen Bereiche des Proteins. Dieses Verfahren wird weltweit eingesetzt und ist als solches dem Fachmann wohl bekannt. Dieses (empirische) Verfahren ist insbesondere geeignet für die Feststellung von B-Zell-Epitopen. Auch unter Gabe der Sequenz des Gens, welches jegliches Protein kodiert, sind Computeralgorithmen fähig, spezifische Proteinfragmente als die immunologisch wesentlichen Epitopen auf der Basis ihrer sequenziellen und/oder strukturellen Übereinstimmung mit Epitopen zu bezeichnen, die nun bekannt sind. Die Feststellung dieser Bereiche basiert auf einer Kombination der Hydrophilizitätskriterien nach Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824–3828 (1981)) und der Sekundärstrukturaspekte nach Chou und Fasmann (Advances in Enzymology 47: 145–148 (1987) und US Patent 4,554,101). Die T-Zell-Epitopen können in gleicher Weise aus der Sequenz durch Computer mit der Hilfe von Berzofsky Amphiphilizitätskriterien vorhergesagt werden (Science 235, 1059–1062 (1987) und US Patentanmeldung NTIS US 07/005,885). Eine zusammenfassende Übersicht kann gefunden werden in: Shan Lu über gemeinsame Prinzipien: Tibtech 9: 238–242 (1991), Good et al. zu Malaria Epitopen; Science 235: 1059–1062 (1987), Lu für eine Übersicht; Vaccine 10: 3–7 (1992), Berzowsky zu HIV-Epitopen; The FASEB Journal 5: 2412–2418 (1991).
Daher bezieht sich eine Form eines anderen Ausführungsbeispiels der Erfindung auf Impfstoffe, die fähig sind, Schweine gegen Lawsonia intracellularis-Infektion zu schützen, welche Proteine oder immunogene Fragmente davon umfassen, gemäss der Erfindung, wie sie oben beschrieben worden sind, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung be zieht sich auf Proteine gemäss der Erfindung zum Einsatz in einem Impfstoff.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel bezieht sich auf den Einsatz eines Proteins gemäss der Erfindung für die Herstellung eines Impfstoffes zur Bekämpfung von Lawsonia intracellularis-Infektionen.
Ein Weg, einen Impfstoff gemäss der Erfindung herzustellen, ist durch biochemische Reinigung von Proteinen oder immunogenen Fragmenten davon gemäss der Erfindung aus Bakterien, die durch Schleimhautabstriche aus infizierten Gedärmwänden erhalten worden sind. Dies ist jedoch eine sehr zeitaufwendige Art und Weise, den Impfstoff herzustellen.
Es ist daher sehr viel einfacher, Expressionsprodukte der Gene, die die Proteine oder immunogene Fragmente davon gemäss der Erfindung zu kodieren, in Impfstoffen einzusetzen. Das Gen, das das 19/21 kD-Protein kodiert, kann in einfacher Weise lokalisiert und isoliert werden unter Mischung von einer Probenhybridisation, wie dies von Maniatis (Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual, 1989. ISBN 0-87969-309-6)) beschrieben worden ist. Die Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NR: 1, 2 und 3 dargestellt sind, bilden die Basis für gemischte Proben mit den folgenden Sequenzen:
Mit dem Einsatz dieser Sequenzen kann das Gen, welches das 19/21 kD-Protein kodiert, lokalisiert und isoliert werden, gleich auf dem Weg, auf dem die Gene, die die 37 kD- und 50 kD-Proteine kodieren, isoliert worden sind (siehe Beispiel 1; „Verstärkung der äusseren Membranprotein-Gene").
Solche Impfstoffe, die auf Expressionsprodukte dieser Gene beruhen, können in einfacher Weise durch Zumischung von einem oder mehreren Proteinen gemäss der Erfindung oder immunogenen Fragmenten davon gemäss der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie unten beschrieben hergestellt werden.
Alternativ kann ein Impfstoff gemäss der Erfindung lebende rekombinante Träger wie oben beschrieben umfassen, fähig, die Proteine gemäss der Erfindung oder immunogene Fragmente davon gemäss der Erfindung zu exprimeren. Solche Impfstoffe, beispielsweise basierend auf einem Salmonellen-Träger oder einem viralen Träger, der das gastrische Epithel oder die Darmwand infiziert, haben den Vorteil über Subunit-Impfstoffe, dass sie besser den natürlichen Infektionsweg der Lawsonia intracellularis kopieren. Darüber hinaus ist ihre Selbstausbreitung ein Vorteil, da nur geringe Mengen von rekombinantem Träger für die Immunisierung rotwendig sind.
Impfstoffe, wie sie oben beschrieben worden sind, tragen alle zu einer aktiven Impfung bei, d.h. das Immunsystem des Host's wird durch eines oder mehrere Proteine gemäss der Erfindung oder immunogene Fragmente davon angehalten, Antikörper gegen diese Proteine herzustellen. Alternativ können solche Antikörper beispielsweise in Kaninchen hergestellt werden oder können von Antikörper-produzierenden Zelllinien wie unten beschrieben erhalten werden. Solche Antikörper können dann dem Host-Tier verabreicht werden. Dieses Impfverfahren, die passive Impfung, ist die Impfung der Wahl, wenn ein Tier bereits infiziert ist und es keine Zeit mehr gibt, die natürliche Immunantwort auszulösen. Es ist auch das bevorzugte Verfahren für das Impfen von immunkompromittierten Tieren. Verabreichte Antikörper gegen Lawsonia intracellularis können in diesen Fällen direkt an die Bakterie anbinden. Diese hat den Vorteil, dass direkt das Wachstum von Lawsonia intracellularis abnimmt oder gestoppt wird. Daher ist eine andere Form diese Ausführungsbeispiel der Erfindung bezogen auf Impfstoffe, die Antikörper gegen eines der drei Lawsonia intracellularis-Proteine gemäss der Erfindung aufweisen.
Impfstoffe können auch auf Rostzellen wie oben beschrieben basieren, die die Proteine oder immunogene Fragmente davon gemäss der Erfindung enthalten.
Eine Alternative und ein effizienter Weg der Impfung ist die direkte Impfung mit DNS, die das relevante Antigen codiert. Die direkte Impfung mit DNS-codierenden Proteinen ist für viele verschiedene Proteine erfolgreich durchgeführt worden (wie beispielsweise in Donnelly et al., The Immunologist 2: 20–26 (1993) dargestellt ist).
Dieser Weg der Impfung ist sehr attraktiv für die Impfung von Schweinen gegen Lawsonia intracellularis-Infektion.
Daher beziehen sich nochmals andere Formen dieses Ausführungsbeispiels der Erfindung auf Impfstoffe, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein Protein gemäss der Erfindung codieren, oder immunogene Fragmente davon gemäss der Erfindung und auf Impfstoffe, die DNS-Fragmente umfassen, die solche Mukleinsäuresequenzen umfassen. Nochmals andere Formen dieses Ausführungsbeispiels beziehen sich auf Impfstoffe, die rekombinante DNS-Molekühle gemäss der Erfindung umfassen.
DNS-Impfstoffe können in einfacher Weise durch intradermale Anwendung verabreicht werden, beispielsweise unter Einsatz eines nadellosen Injektors. Diese Art und Weise der Verabreichung liefert die DNS direkt in die Zellen des zu impfenden Tieres. Mengen der DNS im Mikrogrammbereich zwischen 1 und 100 Mikrogramm liefern sehr gute Ergebnisse.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung zusätzlich eines oder mehrere Antigene, die sich aus anderen Schwein-pathogenen Organismen ableiten lassen und Viren oder genetische Informationen, die solche Antigene codieren.
Solche Organismen und Viren werden Vorteilhafterweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus dem Herpesvirus, dem Schweineinfluenzavirus (Porcine influenza), dem Schweineparvovirus (Porcine parvo), dem übertragbaren Gastroenteritisvirus, dem Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae und Actinobacillus pleuropneumoniae besteht.
Alle Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung umfassen einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger kann beispielsweise steriles Wasser oder eine sterile physiologische Salzlösung sein. In einer komplexeren Form kann der Träger auch ein Puffer sein.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes umfassen das Zumischen eines Proteins gemäss der Erfindung, oder eines immunogenen Fragmentes davon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Impfstoffe gemäss der Erfindung können in einer bevorzugten Präsentation auch ein Hilfsmittel oder Adjuvanz umfassen. Adjuvanzien umfassen im allgemeinen Substanzen, die die Immunantwort auf den Host in einer nicht spezifischen Weise verstärken. Eine Anzahl von verschiedenen Adjuvanzien sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele von solchen Hilfsstoffen sind Freunds Complete und Incomplete Adjuvans, Vitamin E, nicht-ionische Block-Polymere, Muramyldipeptid, Quill A^®, Mineralöle wie Bayol^®, oder Markol^®, pflanzliche Öle, und Carbopol^® (ein Homopolymer) oder Diluvac^® Forte. Der Impfstoff kann auch ein sogenanntes „Vehikel^® umfassen. Ein Vehikel ist eine Verbindung, an die Polypeptide anlagern, ohne mit ihnen kovalent gebunden zu sein. Häufig genutzte Vehikel-Verbindungen sind Aluminiumhydroxid, -Phosphat oder -Oxyd, Silizium, Kaolin und Bentonit.
Eine spezielle Form eines solchen Vehikels, bei dem das Antigen teilweise in dem Vehikel eingelassen ist, ist das sogenannte ISCOM ( EP 109 942 , EP 180 564 , EP 242 380 ). Zusätzlich kann der Impfstoff eine oder mehrere geeignete oberflächenaktive Verbindungen oder Emulgatoren wie Span oder Tween umfassen.
Häufig wird der Impfstoff mit Stabilisatoren gemischt, um ihn gegen Zersetzung durch Polypeptide zu schützen, um die Lagerfähigkeit des Impfstoffs zu erhöhen, oder um seine Möglichkeit zur Gefriergetrocknung zu verbessern. Sinnvolle Stabilisatoren sind unter anderem SPGA (Bovarnik et al.; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), Kohlenhydrate wie Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Stärke, Sucrose, Dextran oder Glucose, Proteine wie Albumin oder Kasein oder Abbauprodukte davon und Puffer wie Alkalimetallphosphate.
Zusätzlich kann der Impfstoff in einem physiologisch verträglichen Diluenten suspensiert werden.
Es ist eigentlich nicht nötig festzuhalten, dass andere Wege des Versehens mit Hilfsstoffen, des Hinzufügens von Vehikel-Verbindungen oder Diluenten, des Emulgierens oder des Stabilisierens eines Polypeptids auch in der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
Impfstoffe gemäss der Erfindung können sehr geeignet verabreicht werden in Mengen zwischen 1 und 100 Mikrogramm, obwohl auch kleinere Dosen im Prinzip eingesetzt werden können, Eine Dosis, die über 100 Mikrogramm liegt, wird, obwohl sie immunologisch sehr geeignet sein wird, allerdings in kommerzieller Hinsicht weniger attraktiv sein.
Impfstoffe, die auf lebenden gedämpften rekombinanten Trägern beruhen, wie LRC-Viren und Bakterien wie oben beschrieben, können in sehr viel geringeren Dosen verabreicht werden, weil sie sich während der Infektion selbst vervielfachen. Daher liegen sehr geeignete Bereiche zwischen 10³ und 10⁹ CFU/PFU für Bakterien beziehungsweise Viren.
Viele Verabreichungswege können angewandt werden. Systemfische Verabreichung ist ein geeigneter Weg der Verabreichung, beispielsweise durch intramuskuläre Anwendung des Impfstoffes. Falls diesem Weg gefolgt wird, sind Standardprozeduren für die systemische Anwendung wohl geeignet. Orale Verabreichung ist auch ein attraktiver Weg der Verabreichung, weil die Infektion eine Infektion des Verdauungstraktes ist. Ein bevorzugter Weg der oralen Verabreichung ist die Verpackung des Impfstoffs in Kapseln, bekannt und häufig im Stand der Technik eingesetzt, die sich nur in der hoch sauren Umgebung des Magens auflösen. Auch könnte ein Impfstoff mit Verbindungen gemischt werden, die im Stand der Technik bekannt sind und kurzzeitig den pH-Wert des Magens erhöhen. Systemische Anwendung ist auch geeignet beispielsweise durch intramuskuläre Verabreichung des Impfstoffs. Falls diesem Weg gefolgt wird, sind die Standardverfahren für systemische Anwendung wohl geeignet.
Vom Standpunkt des Schutzes gegen die Krankheit aus betrachtet, ist eine schnelle und richtige Diagnose von Lawsonia intracellularis-Infektion wesentlich.
Daher ist es weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, die Diagnosetools zu liefern, die für die Feststellung einer Lawsonia intracellularis-Infektion geeignet sind.
Ein Diagnosetest für die Feststellung von Lawsonia intracellularis ist beispielsweise basiert auf der Reaktion der bakteriellen DNS, die von dem zu testenden Tier isoliert ist, mit spezifischen Proben oder PCR-Primern, basierend auf der Codiersequenz des 19/21 kD Gens. Falls Lawsonia intracellularis DNS in dem Tier vorhanden ist, wird dies beispielsweise spezifisch an bestimmte PCR-Primer binden und nachfolgend in der PCR-Reaktion verstärkt werden. Das PCR-Reaktionsprodukt kann dann einfach in DNS-Gelelektrophorese erfasst werden.
Die DNS kann in einfachster leise von den Mikroorganismen isoliert werden, die in Abstrichen präsent sind, die aus dem Verdauungstrakt des zu testenden Tieres genommen worden sind. Standard PCR-Textbücher geben Verfahren an, um die Länge der Primen für die selektive PCR-Reaktionen mit Lawsonia intracellularis DNS zu bestimmen. Primer mit einer Nukleotidsequenz von mindestens 12 Nukleotiden werden häufig genutzt, aber Primen mit mehr als 15, vorzugsweise 18 Nukleotide sind selektiver. Insbesondere Primen mit einer Länge von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30 Nukleotide sind sehr allgemein anwendbar. PCR-Techniken werden extensiv beschrieben in (Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1995)).
Ein anderer DNS-basierter Test basiert auf dem Wachstum von bakteriellem Material, welches aus dem Abstrich erhalten worden ist, gefolgt von klassischer DNS-Reinigung, gefolgt von klassischer Hybridisierung mit radioaktiv oder farbig markierten 19/21 kD-Protein spezifischen DNS-Fragmenten. Sowohl die PCR-Reaktionen als auch die Hybridisierungsreaktionen sind im Stand der Technik wohl bekannt und beispielsweise in Maniatis/Sambrook beschrieben (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6).
Somit bezieht sich ein Ausführungsbeispiel der Erfindung auf einen Diagnosetest für die Feststellung von Lawsonia intracellularis DNS. Solch ein Test umfasst eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung oder ein Fragment davon, welche spezifisch ist für die DNS, die das 19/21 kD-Protein codiert. Ein Fragment, welches für diese DNS spezifisch ist, wird als ein Fragment verstanden, welches unter vergleichbaren Bedingungen besser an Lawsonia intracellularis DNS anbindet, als an DNS von anderen Bakterien, aufgrund von einer höheren Homologie mit der Lawsonia intracellularis DNS, beispielsweise ein Primer von mindestens 12 Nukleotiden wie oben beschrieben.
Ein Diagnosetest für die Feststellung von Lawsonia intracellularis Antikörpern in Seren kann beispielsweise ein einfacher Standard Sandwich-ELISA-Test sein, bei dem 19/21 kD-Protein oder antigene Fragmente davon gemäss der Erfindung an die wand der Proben einer ELISA-Platte beschichtet werden. Ein Verfahren zur Feststellung solcher Antikörper ist beispielsweise die Inkubation von 19/21 kD-Protein oder antigenen Fragmenten davon mit Serum von zu testenden Säugetieren, gefolgt von beispielsweise der Inkubation mit einem markierten Antikörper gegen den besagten Säugetierantikörper. Eine Farbreaktion kann dann das Vorhandensein oder Abwesenheit von Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis anzeigen. Ein anderes Beispiel eines Diagnosetestsystems ist beispielsweise die Inkubierung eines Western Blot, umfassend das 19/21 kD-Protein oder ein antigenes Fragment davon gemäss der Erfindung, mit dem Serum von zu testenden Säugetieren, gefolgt von der Analyse des Blots.
Somit bezieht sich ein anderes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung auf Diagnosetests für die Feststellung von Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis. Solche Tests umfassen ein Protein oder ein Fragment davon gemäss der Erfindung.
Auch betrifft die Erfindung Verfahren zur Feststellung in Seren von Antibodern gegen Lawsonia intracellularis, in dem das Verfahren die Inkubierung von Serum mit dem 19/21 kD oder antigenen Fragmenten davon gemäss der Erfindung umfasst.
Ein Diagnosetest, welcher auf der Erfassung von antigenem Material der spezifischen 19/21 kD-Proteine von Lawsonia intracellularis-Antigenen basiert und daher für die Erfassung von Lawsonia intracellularis-Infektion geeignet ist, kann beispielsweise ein Standard-ELISA-Test sein. In einem Beispiel von solch einem Test sind die Wände der Proben einer ELISA-Platte mit Antikörpern beschichtet, die gegen das 19/21 kD-Protein gerichtet sind. Nach der Inkubierung mit dem zu testenden Material werden markierte Anti-Lawsonia intracellularis Antikörper zu den Proben hinzugefügt. Eine Farbreaktion zeigt dann die Präsenz von antigenem Material von Lawsonia intracellularis.
Daher bezieht sich ein nochmals weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung auf Diagnosetests für die Feststellung von antigenem Material von Lawsonia intracellularis. Solche Tests umfassen Antikörper gegen ein Protein oder gegen ein Fragment davon gemäss der Erfindung.
Die Polypeptide oder immunogene Fragmente davon gemäss der Erfindung exprimiert wie oben charakterisiert, können eingesetzt werden, um Antikörper herzustellen, die polyklonal, monospezifisch oder monoklonal sein können (oder Derivate davon). Falls polyklonale Antikörper gewünscht sind, sind Techniken zur Herstellung und zur Verarbeitung von polykonalen Seren im Stand der Technik wohl bekannt (beispielsweise Mayer und Walter, Herausgeber Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987).
Monoklonale Antikörper, die gegen das Polypeptid gemäss der Erfindung reagieren (oder Varianten oder Fragmenten davon) gemäss der vorliegenden Erfindung, können hergestellt werden durch Immunisieren von gezüchteten Mäusen durch Techniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind (Kohler und Milstein, Nature, 256, 495–497, 1975).
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Feststellung von antigenem Material aus Lawsonia intracellularis, in dem das Verfahren die Inkubierung von Serum, Gewebe von Körperflüssigkeiten mit Antikörpern gegen 19/21 kD-Protein oder ein antigenes Fragment davon gemäss der Erfindung umfasst.
Beisplele:
Beispiel 1
Isolierung von Lawsonia intracellularis aus infiziertem Schweine-Ileum
Mit Lawsonia intracellularis infiziertes Ileum, bestätigt durch Histopathologie und saures schnelles Ziehl-Neelsen Färben, ist von Schweinen gesammelt worden, die an PE gestorben sind, und ist bei –80°C gelagert worden. Nach dem Zerschneiden sind Lawsonia intracellularis-Bakterien aus den Schleimhautabstrichen isoliert worden, die von den infizierten Gedärmwänden genommen worden sind. Die Ileum-Abstriche sind wiederholt in PBS in einem Omnimixer homogenisiert worden, um die intrazellulären Bakterien, wie von Lawson et al. beschrieben, freizusetzen (Vet. Microbiol. 10: 303–323 (1985)). Der Supernatant, der nach einer mit niedriger Geschwindigkeit gefahrenen Zentrifugierung erhalten worden ist, um Zellrückstände zu entfernen, ist durch 5.0, 3.0, 1.2 und 0.8 Mikrometer Filter (Millipore) gefiltert worden. Das Filtrat ist nachfolgend bei 8000 g für 30 Minuten zentrifugiert worden, um ein kleines Pellet von Lawsonia intracellularis-Bakterien zu ergeben. Diese Bakterien sind weiter gereinigt worden unter Einsatz eines Percoll-Gradienten. Die Identität der gereinigten Bakterien ist durch PCR festgestellt worden (Jones et al., J. Clin. Microbiol. 31: 2611–2615 (1993)), wobei die Reinheit der isolierten Bakterien (grösser 95%) durch Phasenkontrastmikroskopie festgestellt worden ist, um jegliche kontaminierenden Bakterien oder Gedärmrückstände anzuzeigen.
Lawsonia intracellularis-äusseres Membranprotein-Präparation
Äussere Membranproteine (OMP für „outer membrane Proteins") von Lawsonia intracellularis sind gereinigt worden, im wesentlichen wie beschrieben durch Barenkamp et al., J. Inf. Dis. 148: 1127 (1983). Kurz gesagt sind Percoll-Gradienten-gereinigte Bakterien ultrasonisch zerstört worden. Membranfragmente sind geerntet worden durch differenzielle Zentrifugierung, behandelt mit Sar kosyl und unlösliche Sarkosyl OMPs sind durch Ultrazentrifugierung pelletiert worden. Das Pellet ist in 50 mM TRIS/HCl (pH-Wert 7.5) wieder aufgelöst worden. Die OMPs sind auf einer 4–12% BIS/TRIS NuPAGE SDS Polyacrylamidgel (NOVEX) gemäss der Beschreibung des Herstellers getrennt worden (1; Band A). In der benachbarten Spur ist vollständiges Lawsonia intracellularis-Zellprotein zu Vergleichszwecken geladen worden.
Die Proteine sind unter Einsatz von Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt worden. In der äusseren Membranpräparation konnte die Verbesserung der Proteinbänder bei 50, 37 und 19/21 kDa klar ersichtlich gesehen werden im Vergleich zur Gesamtzellpräparation, anzeigend, dass diese Proteine OMPs sind.
Antiseren, die gegen gereinigte äussere Membranproteine aufgezogen worden sind und ganze Zellen, und nach dem experimentalen Challenge.
Antiseren zu Lawsonia intracellularis ganzen Zellen und gereinigten OMPs sind in Kaninchen aufgezogen worden. Kaninchen ist intermuskulär eine Präparation einer ganzen Zelle (R291) oder OMPs (R279) in n-GNE (Wasser: Oel = 45:55) injiziert worden. Blutproben sind aus den Ohrvenen vor der Immunisierung gesammelt worden. Das Serum ist von einem Schwein erhalten worden, welches in experimenteller Weise oral mit Percoll-Gradienten-gereinigten Bakterien gechallengt worden ist und welches klinische Anzeichen und post-mortem Läsionen entwickelt hat, die typisch für Lawsonia intracellularis-Infektion sind (BIG304T4).
Antigene Charakterisierung von Lawsonia intracellularis äussere Membranproteine
Um die Antigenizität der Lawsonia intracellularis OMPs zu untersuchen, ist die OMP-Präparation auf eine 4–12% BIS/TRIS NuPAGE SDS-PAGE (NOVEX) geladen worden. Nach Trennung der Proteine ist eine Immobilon-P PVDF Membrane (Millipore) in 0, 025 M TRIS/0, 192 M Glycin/20% Methanol im wesentlichen gemäss Towbin et al. (Natl. Proc, Acad. Sci., 76: 4350–4354 (1979)) geblottet worden, Die Membranen sind mit 1% Magermilchpulver in 0,04 M PBS geblockt worden, welches 0,05% Tween 20 (PBST) enthalten ist, und dann mit Kaninchen R279 Antiserum (1; Panel B) und Kaninchen R291 Antiserum (1; Panel C) für eine Stunde inkubiert worden, gefolgt von zweimaligem Waschen mit PBST. Kaninchenseren sind mit einer Verdünnung von 500 in 1% Magermilch/PBST eingesetzt worden. HRP-konjugierte Ziegen-Antikaninchen-Immunoglobine, die 1:2000 verdünnt sind, sind angewandt worden, um die Kaninchen Antikörper festzustellen. Seroreaktive Produkte sind durch ein Produkt mit dem Namen „Enhanced Chemoluminescence (ECL, Amersham) gemäss dem Protokoll des Herstellers erfasst worden. Beide Antiseren (R279 und R291) erkannten die oben beschriebenen Proteine. Signale bei 50 und 37 kDa zeigten einen starken Anstieg im Vergleich zu Ganzzellproteinen mit OMPs Präparierungen, wiederum darauf hinweisend, dass diese beiden Proteine OMPs sind.
Äussere Membranprotein-Sequenzierung
Zu Sequenzierungszwecken ist die OMP-Suspension auf einem präparativen 10% SDS-PAGE-Gel unter Einsatz des BioRad Protean II Systems gemäss der Beschreibungsanleitung geladen worden. Vier Proteinbänder (19/21, 37 und 50 kD) sind aus dem Gel ausgeschnitten worden und sind zur Firma Eurosequence (Groningen, die Niederlande) bei 4° Celsius geschickt worden. Die Proteinsequenzen des N-Terminals und der isolierten Peptide, die nach der tryptischen Verdauung des gesamten Proteins erhalten worden sind, sind durch automatisierte Edman-Degradation auf einem Applied Biosystems 120A PTH Sequenator ermittelt worden. Die erhaltenen Proteinsequenzen (Tabelle 1) sind eingesetzt worden für die Erzeugung von PCR Primern für die Verstärkung der kodierten Gene. Aus den Proteinsequenzen ist geschlossen worden, dass das 19 kD und das 21 kD Protein im wesentlichen dasselbe Protein darstellen. Der Unterschied in der Grösse ist wahrscheinlich auf posttranslationale Veränderung(en) zurück zu führen.
Vestärkung der äusseren Membran Protein-Gene
Um die OMP-Gene zu verstärken, ist die Lawsonia intracellularis genomische DNS aus Percoll-Gradienten-gereinigten Bakterien unter Einsatz von QIAGEN Genomic Tip 100 isoliert worden, wie es vom Hersteller beschrieben worden ist. Die DNS ist in PCR eingesetzt worden unter Einsatz von degenerierten Primern, basierend auf den erhaltenen Proteinsequenzen. Die DNS, die das 50 kD Protein codiert, ist unter Einsatz von Primern 911 (ggI gtI tgg gaY ttY aa) und 912 (tcc caI gcR taR tcY tt) verstärkt worden. Die DNS, die das 37 kD Protein codiert, ist unter Einsatz des Primers 990 (tcR aaI gcR aaR ttI acI cc) verstärkt worden und 1021 (gcI gaR gtI acI gcI ag) unter Einsatz des EXPAND-Systems (Boehringer Mannheim) mit 2,5 mM MgCl₂. Dann ist ein Mikroliter aus der PCR-Mischung entnommen worden und in einer verschachtelten PCR eingesetzt worden unter Einsatz derselben Primen. Dieser gab Bänder von 1260 und 656 bp für die 50 kD beziehungsweise 37 kD Proteine. PCR-Produkte sind aus dem Agarosegel ausgeschnitten worden und unter Einsatz von QIAGEN Spinprep-Kit gereinigt worden und in pCR-TOPO-blunt II (Novagen) geklont worden. Die geklonten Mischungen sind in E. coli TOP10F transformiert worden. Die mutmasslichen Transformanten sind für Einsätze durch Kolonie-PCR unter Einsatz von M13 vorwärts oder M13 rückwärts Primern gescreent worden. Aus den gewonnenen mutmasslichen Klonen, die ein Plasmid mit einem Einsatz aufweisen, ist plasmide DNS unter Einsatz von einem QIAGEN miniprep-Kit isoliert worden. Nachfolgend sind Inserts sequenziert worden unter Einsatz des PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Sequencing Kit (Applied Biosystems), welches gemäss dem Protokoll des Herstellers unter Einsatz der M13 Vorwärts- und Rückwärts-Primer eingesetzt worden ist.
Der C-terminale Teil des 50 kD Codierbereichs ist verstärkt worden unter Einsatz einer C-abtrennenden PCR unter Einsatz des Primers 923 (tat agc tgt tga tgg tgc tt) in der ersten PCR und 936 (ggt gat aat atg ctt tac t) und einem Poly-G Primer (ata tgg ggg ggg ggg ggg g) in der verschachtelten PCR. Dies gab eine Bandbreite von 840 bp, was wie oben genannt geklont und sequenziert worden ist.
Tabelle 1: erhaltene Proteinsequenzen:
Legende zu den Figuren
1 zeigt SDS-PAGE Gel Elektrophorese und Immunoblots von Lawsonia intracellularis mit ganzen Zellen und Lawsonia intracellularis äusserer Membranpräparation, die mit Antiseren vom Kaninchen geprüft worden sind. Bänder: 1, vorgefärbte Präzisi onsmarkierungen (BioRad); 2, Lawsonia intracellularis Gesamtzellenextrakt; 3, Lawsonia intracellularis äussere Membranpräparation. Bänder-Beschriftungen; A: Proteinvisualisierung mit Coomassie brilliant blue, B: Blot, getestet mit Serum, welches gegen gereinigte äussere Membranproteine (R279) aufgezogen worden ist; C, Blot, welches mit Serum überprüft worden ist, welches gegen ganze Zellen aufgezogen worden ist (R291). Das 19/21 kD, 37 kD und 50kD-Protein sind mit P1/P2, P4 beziehungsweise P5 bezeichnet.
SEQUENCE LISTING

Claims

Lawsonia intracellularis Äusseres Membranprotein, welches ein Molekulargewicht von 19/21 kD hat, wobei das besagte Äussere Membranprotein erhaltbar ist durch ein Verfahren, umfassend die Schritte a) des Unterwerfens einer Äusseren Membran Präparation einer SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese), b) des Ausschneidens des 19 oder 21 kD Bandes aus dem Gel, wobei das besagte Protein eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 70 % homolog ist zu der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr: 1 dargestellt ist, eine interne Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70 % homolog ist zu der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr: 2 dargestellt ist, oder eine interne Aminosäuresequenz, die zu mindestens 70 % homolog ist zu der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr: 3 dargestellt ist.
Lawsonia intracellularis Protein nach Anspruch 1, das eine Sequenzhomologie von mindestens 80 %, vorzugsweise 90 %, bevorzugter 95 % Homologie zu der Aminosäuresequenz hat, wie sie in SEQ ID Nr: 1, 2 oder 3 dargestellt ist.
Lawsonia intracellularis Protein nach Anspruch 1 oder 2 zum Einsatz in einem Impfstoff.
Verwendung eines Lawsonia intracellularis Proteins nach Anspruch 1 oder 2 für die Herstellung eines Impfstoffes zur Bekämpfung von Lawsonia intracellularis Infektionen.
Impfstoff zur Bekämpfung von Lawsonia intracellularis Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Protein nach An spruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Adjuvant umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass er ein zusätzliches Antigen, welches von einem Virus oder einem für Schweine pathogenen Mikroorganismus abgeleitet ist, oder genetische Information umfasst, die das besagte Antigen kodiert.
Impfstoff nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Virus oder für Schweine pathogene Mikroorganismus ausgewählt wird aus der Gruppe des Herpesvirus, des Schweineinfluenzavirus (Porcine influenza), des Schweineparvovirus (Porcine parvo), des übertragbaren Gastroenteritisvirus, des Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae und Actinobacillus pleuropneumoniae.
Impfstoff zur Bekämpfung von Lawsonia intracellularis Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass er Antikörper gegen ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Verfahren für die Herstellung eines Impfstoffes nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das besagte Verfahren das Zumischen eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 und einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren für die Herstellung eines Impfstoffes nach Anspruch 9, wobei das besagte Verfahren das zumischen von Antikörpern gegen ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 und einem pharmazeutisch verträglichem Träger umfasst.
Diagnosetest für die in-vitro Erfassung von Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis, dadurch gekennzeichnet, dass der Test ein Protein oder ein Fragment davon wie in den Ansprüchen 1 oder 2 definiert enthält.
Diagnosetest für die in-vitro Erfassung von antigenischem Material von Lawsonia intracellularis, dadurch gekennzeichnet, dass der Test Antikörper gegen ein Protein oder ein Fragment davon wie in den Ansprüchen 1 oder 2 definiert enthält.