ES2266090T3 - Vacuna contra lawsonia intracellularis. - Google Patents
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Abstract
Proteína de la Membrana Externa de Lawsonia intracellularis que tiene un peso molecular de 19/21 kD, pudiendo obtenerse dicha Proteína de la Membrana Externa por un proceso que comprende las etapas de a) someter una preparación de la membrana externa a SDS-PAGE b) escindir la banda de 19 ó 21 kD del gel donde dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal que es al menos el 70% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 1, una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70% homóloga de la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2, o una secuencia de aminoácidos interna que es al menos el 70% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 3.
Description
Vacuna contra Lawsonia
intracellularis.
La presente invención se refiere a secuencias de
ácido nucleico que codifican nuevas proteínas de Lawsonia
intracellularis, a fragmentos de ADN, moléculas de ADN
recombinante y vehículos recombinantes vivos que comprenden estas
secuencias, a células hospedadoras que comprenden dichas secuencias
de ácido nucleico, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante
y vehículos recombinantes vivos, a las proteínas codificadas por
estas secuencias de nucleótidos, a vacunas para combatir
infecciones por Lawsonia intracellularis y métodos para la
preparación de las mismas, y a herramientas de diagnóstico para la
detección de Lawsonia intracellularis.
La enteropatía proliferativa porcina (PPE o PE)
ha llegado a ser una enfermedad importante de la industria moderna
de cerdos en todo el mundo. La enfermedad afecta del 15 al 50% de
las piaras en crecimiento y hasta el 30% de los animales
individuales en piaras con un problema establecido. Las pérdidas
económicas anuales hoy en día se han estimado en
5-10 \textdollar americanos en alimento adicional
y costes de tiempo en las instalaciones por cerdo afectado. PPE es
un grupo de afecciones crónicas y agudas de signos clínicos
ampliamente diferentes (muerte, animales pálidos y anémicos,
diarrea acuosa, oscura o roja fuerte, depresión, apetito reducido y
reticencia al movimiento, crecimiento retardado y FCR aumentado).
Sin embargo, hay dos características comunes. La primera, un cambio
patológico sólo visible en la necropsia, es un engrosamiento de la
mucosa del intestino delgado y del colon. La segunda es la
existencia de bacterias curvadas pequeñas intracitoplasmáticas en
los enterocitos del intestino afectado. Estas bacterias ahora se
han establecido como el agente etiológico de PPE y se han llamado
Lawsonia intracellularis.
Con los años, se ha descubierto que Lawsonia
intracellularis afecta a casi a todos los animales incluyendo
monos, conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos y otros animales
tan diversos como avestruces y emúes. La Lawsonia
intracellularis es una bacteria flagelada
gram-negativa que sólo se multiplica en enterocitos
eucarióticos y no se ha descrito en cultivos libres de células. Para
persistir y multiplicarse en la célula, Lawsonia
intracellularis debe penetrar dividiendo las células de la
cripta. La bacteria se asocia con la membrana celular y entra
rápidamente al enterocito mediante una vacuola de entrada. Ésta
después se rompe rápidamente (en 3 horas) y las bacterias prosperan
y se multiplican libremente en el citoplasma. Los mecanismos por los
que las bacterias provocan que células infectadas no logren
madurar, continúen experimentando mitosis y formen células
crípticas hipoplásicas aún no se conocen.
Los conocimientos actuales sobre la infección
por Lawsonia intracellularis, el tratamiento y el control de
la enfermedad han estado obstaculizados por el hecho de que
Lawsonia intracellularis no puede cultivarse en medios
libres de células. Aunque hay informes de
co-cultivos exitosos de Lawsonia
intracellularis en enterocitos de rata, esto no ha conducido al
desarrollo de vacunas para combatir la Lawsonia
intracellularis, aunque hay claramente una necesidad de dichas
vacunas.
Ahora se ha descubierto sorprendentemente, que
Lawsonia intracellularis produce una nueva proteína de
membrana externa (OMP) que es capaz de inducir inmunidad protectora
contra Lawsonia intracellularis.
La nueva proteína de membrana externa se
mencionará proteína de 19/21 kD. La proteína de 19/21 kD se
encuentra en dos formas diferentes, una forma de 19 kD y una forma
de 21 kD, siendo una proteína una forma modificada de la otra y
comprendiendo ambas una secuencia de aminoácidos idéntica.
La proteína de 19/21 kD está caracterizada por
tres secuencias de aminoácidos internas de 7, 12 y 12 aminoácidos,
respectivamente. Estas secuencias de aminoácidos se presentan en las
SEC ID Nº: 1, 2 y 3.
Se sabe bien en la técnica que muchas secuencias
de ácido nucleico diferentes pueden codificar una y la misma
proteína. Este fenómeno se conoce habitualmente como balanceo en la
segunda y especialmente en la tercera base de cada triplete que
codifica un aminoácido. Este fenómeno puede provocar una heterología
de aproximadamente el 30% para dos secuencias de ácido nucleico que
aún codifican la misma proteína. Fenómeno. Por lo tanto, dos
secuencias de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia
de aproximadamente el 70% aún pueden codificar la misma
proteína.
Una realización de la invención se refiere a la
nueva proteína, la proteína de 19/21 kD y a fragmentos inmunogénicos
de la misma de acuerdo con la invención.
El concepto de fragmentos inmunogénicos se
definirá a continuación.
Esta realización se refiere a una Proteína de
Membrana Externa de Lawsonia intracellularis que tiene un
peso molecular de 19/21 kD, pudiendo obtenerse dicha Proteína de
Membrana Externa por un proceso que comprende las etapas de
a) someter una preparación de membrana externa a
SDS-PAGE
b) escindir la banda de 19 ó 21 kD del gel
y a fragmentos inmunogénicos de esa
proteína.
En el Ejemplo 1, se explica en detalle un
ejemplo de cómo realizar estas etapas: primero se describe la etapa
de aislamiento de L. intracellularis de íleos porcinos
infectados, seguido por una descripción, de cómo obtener una
preparación de proteína de membrana externa de L.
intracellularis. Finalmente, bajo el título "Secuenciación de
la proteína de membrana externa" se explica cómo aislar la banda
de 19 ó 21 kD del gel.
En una forma preferida, esta proteína de
Lawsonia intracellularis o un fragmento inmunogénico de esa
proteína tiene una secuencia de aminoácidos interna que es al menos
el 70% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada en la
SEC ID Nº: 1, una secuencia de aminoácidos interna que es al menos
el 70% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada en la
SEC ID Nº: 2, o una secuencia de aminoácidos interna que es al menos
el 70% homóloga a la secuencia de aminoácidos como se representa en
la SEC ID Nº: 3.
En una forma más preferida, esta proteína de
Lawsonia intracellularis o un fragmento inmunogénico de esa
proteína tiene una homología de secuencia de al menos el 80%,
preferiblemente el 90%, más preferiblemente el 95% de homología con
la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 1, 2 ó 3.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98% o incluso el
100%.
El nivel de homología de las proteínas puede
determinarse con el programa informático "BLAST 2 SEQUENCES"
seleccionando el subprograma: "BLASTP", que puede encontrarse
en
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.
Una referencia para este programa es Tatiana A.
Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174:
247-250 (1999): Matriz Usada: "blosum62". Los
parámetros usados son los parámetros por defecto:
Abertura de hueco: 11. Extensión de hueco: 1.
Disminución x de hueco: 50.
Se entenderá que, para las proteínas
particulares abarcadas en este documento, pueden existir variaciones
naturales entre cepas individuales de Lawsonia
intracellularis. Estas variaciones pueden demostrarse por una o
unas diferencias de aminoácidos en la secuencia global, o por
deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de
un o más aminoácidos en dicha secuencia. Se han descrito
sustituciones de aminoácidos que no alteran esencialmente las
actividades biológica e inmunológica, por ejemplo, por Neurath et
al en "The Proteins" Academic Press New York (1979). Los
remplazos de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o remplazos
que han sucedido frecuentemente en el evolución son, entre otros,
Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase, Dayhof, M.D.,
Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found.,
Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Otras sustituciones de
aminoácidos incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,
Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y Ala/Glu. En
base a esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método
para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 227,
1435-1441, 1985) y determinar la similitud
funcional entre proteínas homólogas. Dichas sustituciones de
aminoácidos de las realizaciones ejemplares de esta invención, así
como variaciones que tienen deleciones y/o inserciones, pertenecen
al alcance de la invención mientras que las proteínas resultantes
retengan su reactividad inmune. Esto explica porqué las proteínas
de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la invención,
cuando se aíslan de diferentes aislados de campo, pueden tener
niveles de homología de aproximadamente el 70%, representando aún la
misma proteína con las mismas características inmunológicas.
Esas variaciones en la secuencia de aminoácidos
de una cierta proteína de acuerdo con la invención que aún
proporcione una proteína capaz de inducir una respuesta inmune
contra infección por Lawsonia intracellularis o al menos
contra las manifestaciones clínicas de la invención se consideran
"no esencialmente influyentes en la inmunogenicidad".
Cuando se usa una proteína para, por ejemplo,
propósitos de vacunación o para producir anticuerpos, sin embargo,
no es necesario usar la proteína completa. También es posible usar
un fragmento de esa proteína que es capaz, como tal o acoplada a un
vehículo tal como, por ejemplo, KLH, de inducir una respuesta inmune
contra esa proteína, un llamado fragmento inmunogénico. Se entiende
por "fragmento inmunogénico" un fragmento de la proteína de
longitud completa que aún retiene su capacidad de inducir una
respuesta inmune en el hospedador, es decir, comprende un epítopo
de célula B o T. En este momento, está disponible una diversidad de
técnicas para identificar fácilmente fragmentos de ADN que
codifican fragmentos antigénicos (determinantes). El método descrito
por Geysen et al (Solicitud de Patente WO 84/03564,
Solicitud de Patente WO 86/06487, Patente de Estados Unidos NR.
4.833.092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998-4002
(1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), el
llamado método PEPSCAN es un método fácil de realizar, rápido y
bien establecido para la detección de epítopos; las regiones
inmunológicamente importantes de la proteína. El método se usa en
todo el mundo y como tal es bien conocido para los especialistas en
la técnica. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la
detección de epítopos de células B. Además, dada la secuencia del
gen que codifica cualquier proteína, los algoritmos informáticos
son capaces de señalar fragmentos específicos de la proteína como
los epítopos inmunológicamente importantes en base a su
coincidencia secuencial y estructural con epítopos que son
conocidos. La determinación de estas regiones se basa en una
combinación de los criterios de hidrofilicidad de acuerdo con Hopp y
Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828
(1981)), y los aspectos de estructura secundaria de acuerdo con Chou
y Fasman (Advances in Enzymology 47: 45-148 (1987)
y Patente de Estados Unidos 4.554.101). Los epítopos de células T
pueden predecirse del mismo modo a partir de la secuencia por un
ordenador con la ayuda del criterio de anfifilicidad de Berzofsky
(Science 235, 1059-1062 (1987) y la solicitud de
Patente de Estados Unidos NTIS US 07/005.885). Se encuentra una
visión global condensada en: Shan Lu sobre principios comunes;
Tibtech 9: 238-242 (1991), Good et al sobre
epítopos de la Malaria; Science 235:1059-1062
(1987), Lu para una revisión; Vaccine 10: 3-7
(1992), Berzowsky para epítopos de VIH; The FASEB Journal
5:2412-2418
(1991).
(1991).
Por lo tanto, una forma de otra realización de
la invención se refiere a vacunas capaces de proteger a cerdos
contra infección por Lawsonia intracellularis, que comprenden
una proteína o fragmento inmunogénico de la misma, de acuerdo con
la invención como se ha descrito anteriormente junto con un vehículo
farmacéuticamente acepta-
ble.
ble.
Otra realización más de la presente invención se
refiere a las proteínas de acuerdo con la invención para su uso en
una vacuna.
Otra realización más se refiere al uso de una
proteína de acuerdo con la invención para la fabricación de una
vacuna para combatir infecciones por Lawsonia
intracellularis.
Un modo de preparar una vacuna de acuerdo con la
invención es por purificación bioquímica de las proteínas o
fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención a
partir de bacterias obtenidas a través de raspados de la mucosa
tomados de la pared del intestino infectado. Sin embargo, esto es un
modo de preparar la vacuna que lleva mucho tiempo.
Por lo tanto, es mucho más conveniente usar en
vacunas los productos de expresión de los genes que codifican las
proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la
invención. El gen que codifica la proteína de 19/21 kD puede
localizarse y aislarse fácilmente usando hibridación con sonda mixta
como se describe en Maniatis (Maniatis/Sambrook (Sambrook, J.
Molecular cloning: a laboratory manual, 1989. ISBN
0-87969-309-6). Las
secuencias de aminoácidos presentadas en las SEC ID Nº: 1, 2 y 3
forman la base para sondas mixtas con las siguientes
secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
| Péptido 1 | Péptido 2 | Péptido 3 |
| Cebadores directos | Cebadores directos | Cebadores directos |
| \hskip0,3cm ggl acl caR gaR taY aaY tt | \hskip0,3cm gel taY gaY taY ttR gtl atg | \hskip0,3cm TtY taY gtI atg gtl tgg ac |
| \hskip0,3cm ggl acl caR gaR taY aaY ct | \hskip0,3cm gel taY gaY taY ctl gtl atg | |
| Cebadores inversos | Cebadores inversos | Cebadores inversos |
| \hskip0,3cm AaR ttR taY tcY tgl gtl cc | \hskip0,3cm cat lac Yaa Rta Rtc Rta Igc | \hskip0,3cm Gtc cal acc atl acR taR aa |
| \hskip0,3cm AaR ttR taY tc Y tgl gtl cc | \hskip0,3cm cat lac lag Rta Rtc Rta Igc |
\vskip1.000000\baselineskip
Con el uso de estas secuencias, el gen que
codifica la proteína de 19/21 kD puede localizarse y aislarse, del
mismo modo que se han aislado los genes que codifican las proteínas
de 37 kD y 50 kD (véase el Ejemplo 1; "Amplificación de genes de
la proteína de la membrana externa").
Dichas vacunas basadas en los productos de
expresión de estos genes pueden prepararse fácilmente mezclando una
o más proteínas de acuerdo con la invención o fragmentos
inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención con un
vehículo farmacéuticamente aceptable como se describe a
continuación.
Como alternativa, una vacuna de acuerdo con la
invención puede comprender vehículos recombinantes vivos como se ha
descrito anteriormente, capaces de expresar las proteínas de acuerdo
con la invención o fragmentos inmunogénicos de las mismas de
acuerdo con la invención. Dichas vacunas, por ejemplo, basadas en un
vehículo de Salmonella o un vehículo viral que infecta el epitelio
gástrico tienen la ventaja sobre vacunas de subunidad que imitan
mejor el modo natural de infección de Lawsonia
intracellularis. Además, su auto-propagación es
una ventaja ya que sólo son necesarias cantidades bajas del
vehículo recombinante para la inmunización.
Las vacunas descritas anteriormente contribuyen
todas a la vacunación activa, es decir, el sistema inmune del
hospedador se desencadena por una o más proteínas de acuerdo con la
invención o fragmentos inmunogénicos de las mismas, para preparar
anticuerpos contra estas proteínas.
Como alternativa, dichos anticuerpos pueden
provocarse en, por ejemplo, conejos o pueden obtenerse de líneas
celulares que producen anticuerpos como se describe a continuación.
Dichos anticuerpos pueden administrarse después al animal
hospedador. Este método de vacunación, vacunación pasiva, es la
vacunación de elección cuando un animal ya está infectado, y no hay
tiempo para permitir que se desencadene la respuesta inmune natural.
También es el método preferido para vacunar animales
inmuno-comprometidos. Los anticuerpos administrados
contra Lawsonia intracellularis pueden, en estos casos,
unirse directamente a las bacterias. Esto tiene la ventaja de que
disminuye o detiene inmediatamente el crecimiento de Lawsonia
intracellularis.
Por lo tanto, una forma distinta de esta
realización de la invención se refiere a vacunas que comprenden
anticuerpos contra cualquiera de las tres proteínas de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la invención.
Las vacunas también pueden basarse en las
células hospedadoras que se han descrito anteriormente, que
comprenden las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas
de acuerdo con la invención.
Un modo alternativo y eficaz de vacunación es la
vacunación directa con ADN que codifica el antígeno relevante. La
vacunación directa con ADN que codifica proteínas ha sido exitosa
para muchas proteínas diferentes. (Como se revisa en, por ejemplo,
Donnelly et al., The Immunologist 2: 20-26
(1993)).
Este modo de vacunación es muy atractivo para la
vacunación de cerdos contra infección por Lawsonia
intracellularis.
Por lo tanto, otras formas más de esta
realización de la invención se refieren a vacunas que comprenden
secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de acuerdo
con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma de acuerdo
con la invención, y a vacunas que comprenden fragmentos de ADN que
comprenden dichas secuencias de ácido nucleico.
Otras formas más de esta realización se refieren
a vacunas que comprenden moléculas de ADN recombinante de acuerdo
con la invención.
Las vacunas de ADN pueden administrarse
fácilmente a través de aplicación intradérmica, por ejemplo, usando
un inyector sin aguja. Este modo de administración suministra el ADN
directamente a las células del animal a vacunar. Las cantidades de
ADN en el intervalo de microgramo entre 1 y 100 \mug proporcionan
resultados muy buenos.
En una realización adicional, la vacuna de
acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente uno o
más antígenos derivados de otros organismos y virus patogénicos del
cerdo, o información genética que codifica dichos antígenos.
Dichos organismos y virus se seleccionan
preferiblemente entre el grupo de virus de la pseudorrabia, virus
de la influenza porcina, parvovirus porcino, virus de la
gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherichia coli,
Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella
cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida,
Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus
pleuropneumoniae.
Todas las vacunas de acuerdo con la presente
invención comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un
vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua
estéril o una solución salina fisiológica estéril. En una forma más
compleja, el vehículo puede, por ejemplo, ser un tampón.
Los métodos para la preparación de una vacuna
comprenden mezclar una proteína de acuerdo con la invención, un
fragmento inmunogénico de la misma, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Las vacunas de acuerdo con la presente invención
pueden, en una presentación preferida, contener también un
adyuvante. Los adyuvantes, en general, comprenden sustancias que
refuerzan la respuesta inmune del hospedador de un modo no
específico. Se conocen varios adyuvantes diferentes en la técnica.
Son ejemplos de adyuvantes, adyuvante Completo o Incompleto de
Freund, vitamina E, polímeros no iónicos de bloque,
muramildipéptidos, Quill A®, aceite mineral, por ejemplo Bayol® o
Markol®, aceite vegetal, y Carbopol® (un homopolímero), o Diluvac®
Forte. La vacuna también puede comprender un llamado
"vehículo". Un vehículo es un compuesto al que se adhiere el
polipéptido, sin estar covalentemente unido al mismo. Los compuestos
vehículo usados a menudo son, por ejemplo, hidróxido, fosfato u
óxido de aluminio, sílice, caolín, y bentonita.
Una forma especial de dicho vehículo, en la que
el antígeno se incluye parcialmente en el vehículo, es el llamado
ISCOM (documentos EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
Además, la vacuna puede comprender uno o más
compuestos tensioactivos adecuados o emulsionantes, por ejemplo,
Span o Tween.
A menudo, la vacuna se mezcla con
estabilizadores, por ejemplo, para proteger de la degradación a los
polipéptidos propensos a la degradación, para potenciar la vida
media de la vacuna, o para mejorar la eficacia del secado por
congelación. Los estabilizadores útiles son, entre otros, SPGA
(Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)),
carbohidratos, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón,
sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o
caseína, o productos de degradación de los mimos, y tampones, tales
como fosfatos de metales
alcalinos.
alcalinos.
Además, la vacuna puede suspenderse en un
diluyente fisiológicamente aceptable.
No hay que decir, que también se incluyen en la
presente invención otros medios para potenciar con adyuvante,
añadir compuestos, vehículos o diluyentes, emulsionar o estabilizar
un polipéptido.
Las vacunas de acuerdo con la invención pueden
ser muy adecuadas para administrarse en cantidades que varían entre
1 y 100 \mug, aunque en principio pueden usarse cantidades más
pequeñas. Una dosis que exceda de 100 \mug será, aunque
inmunológicamente muy adecuada, menos atractiva por razones
comerciales.
Las vacunas basadas en vehículos recombinantes
atenuados vivos, tales como los virus LRC y bacterias descritas
anteriormente, pueden administrarse en dosis mucho más bajas, porque
se multiplican por sí mismas durante la invención. Por lo tanto,
cantidades muy adecuadas variarán entre 10^{3} y 10^{9} CFU/PFU
para bacterias y virus
respectivamente.
respectivamente.
Pueden aplicarse muchos modos de administración.
La aplicación sistémica es un modo adecuado de administración, por
ejemplo, por aplicación intramuscular de la vacuna. Si se sigue esta
vía, son muy adecuados los procedimientos convencionales conocidos
en la técnica para la aplicación sistémica. La aplicación oral
también es un modo atractivo de administración, porque la infección
es una infección del tracto digestivo. Un modo preferido de
administración oral es el envasado de la vacuna en cápsulas,
conocido y frecuentemente usado en la técnica, que sólo se
disgregan en el medio altamente ácido del estómago. Además, la
vacuna podría mezclarse con compuestos conocidos en la técnica para
potenciar temporalmente el pH del estómago. La aplicación sistémica
también es adecuada, por ejemplo, por aplicación intramuscular de
la vacuna. Si se sigue esta vía, son muy adecuados los
procedimientos convencionales conocidos en la técnica para la
aplicación sistémica.
Desde un punto de vista de protección contra la
enfermedad, es importante un diagnóstico rápido y correcto de la
infección por Lawsonia intracellularis.
Por lo tanto, otro objetivo de esta invención es
proporcionar herramientas de diagnóstico adecuadas para la
detección de infección por Lawsonia intracellularis.
Un ensayo de diagnóstico para la detección de
Lawsonia intracellularis se basa, por ejemplo, en la reacción
del ADN bacteriano aislado del animal a ensayar, con sondas
específicas o cebadores de PCR basados en la secuencia codificante
del gen y la proteína de 19/21 kD. Si está presente el ADN de
Lawsonia intracellularis en el animal, se unirá
específicamente, por ejemplo, a cebadores de PCR específicos y
posteriormente llegará a amplificarse en una reacción de PCR.
Después, el producto de reacción de PCR puede detectarse fácilmente
en electroforesis en gel de ADN.
El ADN puede aislarse mucho más fácilmente de
los microorganismos presentes en frotis tomados del tracto digestivo
del animal a ensayar. Los libros de texto sobre PCR convencionales
proporcionan métodos para determinar la longitud de los cebadores
para reacciones de PCR selectivas con ADN de Lawsonia
intracellularis. Frecuentemente se usan cebadores con una
secuencia de nucleótidos de al menos 12 nucleótidos, pero cebadores
de más de 15, más preferiblemente 18 nucleótidos, son algo más
selectivos. Especialmente, son generalmente más aplicables
cebadores con una longitud de al menos 20, preferiblemente al menos
30 nucleótidos. Las técnicas de PCR están ampliamente descritas en
(Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN
0-87969-447-5
(1995)).
(1995)).
Otro ensayo basado en ADN se basa en el
crecimiento del material bacteriano obtenido del frotis, seguido por
purificación clásica de ADN seguido por hibridación clásica con
fragmentos de ADN específicos para la proteína de 19/21 kD marcados
con radioactividad o color. Las reacciones tanto de PCR como de
hibridación son bien conocidas en la técnica y se describen, entre
otros, en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular
cloning: a laboratory manual. ISBN
0-87969-309-6).
Por tanto, una realización de la invención se
refiere a un ensayo de diagnóstico para la detección de ADN de
Lawsonia intracellularis. Dicho ensayo comprende una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un
fragmento de la misma que es específico por el ADN que codifica la
proteína de 19/21 kD. Se entiende que un fragmento que es
específico para ese ADN es un fragmento que, en condiciones
comparables, se une mejor al ADN de Lawsonia intracellularis
que al ADN de otras bacterias, debido a su mayor homología con el
ADN de Lawsonia intracellularis, por ejemplo, un cebador de
al menos 12 nucleótidos como se ha descrito anteriormente.
Un ensayo de diagnóstico para la detección de
anticuerpos contra Lawsonia intracellularis en sueros puede
ser, por ejemplo, un ensayo ELISA tipo sándwich convencional simple
en el que se recubre con proteína de 19/21 kD o fragmentos
antigénicos de la misma de acuerdo con la invención la pared de los
pocillos de una placa de ELISA. Un método para la detección de
dichos anticuerpo es, por ejemplo, incubación de la proteína de
19/21 kD o fragmentos antigénicos de la misma con suero de
mamíferos a ensayar, seguido por, por ejemplo, incubación con un
anticuerpo marcado contra el anticuerpo del mamífero relevante.
Después una reacción de color puede revelar la presencia o ausencia
de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. Otro ejemplo
de un sistema de ensayo de diagnóstico es, por ejemplo, la
incubación de una transferencia de Western que comprende la proteína
de 19/21 kD o un fragmento antigénico de la misma de acuerdo con la
invención, con suero de los mamíferos a ensayar, seguido por
análisis de la transferencia.
Por tanto, otra realización de la presente
invención se refiere a ensayos de diagnóstico para la detección de
anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. Dichos ensayos
comprenden una proteína o un fragmento de la misma de acuerdo con
la invención.
Además, la invención se refiere a métodos para
la detección en suero de anticuerpos contra Lawsonia
intracellularis, donde el método comprende la incubación de
suero con la proteína de 19/21 kD o fragmentos antigénicos de la
misma de acuerdo con la invención.
Un ensayo de diagnóstico basado en la detección
de material antigénico de las proteínas de 19/21 kD específicas de
antígenos de Lawsonia intracellularis y por lo tanto adecuado
para la detección de infección por Lawsonia intracellularis puede,
por ejemplo, también ser un ensayo ELISA convencional. En un ejemplo
de dicho ensayo, se recubren las paredes de los pocillos de una
placa de ELISA con anticuerpos dirigidos contra la proteína de
19/21 kD. Después de la incubación con el material a ensayar, se
añaden los anticuerpos anti-Lawsonia intracellularis
marcados a los pocillos. Después, una reacción de color revela la
presencia de material antigénico de Lawsonia
intracellularis.
Por lo tanto, otra realización más de la
presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para la
detección de material antigénico de Lawsonia
intracellularis. Dichos ensayo comprenden anticuerpos contra una
proteína o fragmento de la misma de acuerdo con la invención.
Los polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de
los mismos de acuerdo con la invención expresados como se han
caracterizado anteriormente pueden expresarse para producir
anticuerpos, que pueden ser policlonales, monoespecíficos o
monoclonales (o derivados de los mismos). Si se desean anticuerpos
policlonales, las técnicas para producir y procesar sueros
policlonales son bien conocidas en la técnica, (por ejemplo, Mayer
and Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular
Biology, Academic Press, Londres 1987).
Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra
el polipéptido de acuerdo con la invención (o variantes o fragmentos
del mismo) de acuerdo con la presente invención, pueden prepararse
inmunizando ratones de la misma estirpe por técnicas también
conocidas en la técnica (Kohler and Milstein, Nature, 256,
497, 1975).
Otra realización más de la invención se refiere
a métodos para la detección de material antigénico de Lawsonia
intracellularis, donde el método comprende la incubación de
suero, tejido o fluidos corporales con anticuerpos contra la
proteína de 19/21 kD o un fragmento antigénico de la misma de
acuerdo con la invención.
Ejemplo
1
Se recogieron íleos infectados por L.
intracellularis, confirmado por histopatología y tinción ácido
resistente de Ziehl-Neelsen, de cerdos muertos con
PE, y se almacenaron a -80ºC. Después de descongelar, se aislaron
las bacterias L. intracellularis de raspados de la mucosa
tomados de la pared intestinal infectada. Los raspados del íleo se
homogeneizaron repetidamente en PBS en un omnimixer para liberar las
bacterias L. intracellularis como se describe por Lawson
et al. (Vet. Microbiol. 10: 303-323 (1985)).
El sobrenadante, obtenido después de centrifugación a baja
velocidad para retirar los desechos celulares, se filtró a través de
filtros de 5,0, 3,0, 1,2 y 0,8 \mum (Millipore). El filtrado se
centrifugó posteriormente a 8.000 g durante 30 min, dando un
sedimento pequeño de bacterias L. intracellularis. Estas
bacterias se purificaron adicionalmente usando un gradiente de
Percoll. La identidad de las bacterias purificadas se evaluó por PCR
(Jones et al., J. Clin. Microbiol. 31:
2611-2615 (1993)) mientras que la pureza de las
bacterias aisladas (>95%) se evaluó por microscopía con
contraste de fase para revelar cualquier bacteria contaminante o
desecho intestinal presente.
Las proteínas de la membrana externa (OMP) de
L. intracellularis se purificaron esencialmente como se ha
descrito por Barenkamp et al., J, Inf. Dis. 148: 1127
(1983)). En resumen, se alteraron por ultrasonidos las bacterias
purificadas en gradiente de Percoll. Los fragmentos de membrana se
recogieron por centrifugación diferencial, se trataron con Sarkosyl
y se sedimentaron las OMP insolubles en Sarkosyl por
ultracentrifugación. El sedimento se redisolvió en TRIS/HCl 50 mM
(pH 7,5). Las OMP se separaron en un gel de poliacrilamida NuPAGE
SDS (NOVEX) BIS/TRIS al 4-12% de acuerdo con la
descripción del fabricante (Fig. 1; panel A). En el carril adyacente
se cargó la proteína celular total de L. intracellularis por
razones de comparación. Las proteínas se tiñeron usando Azul
Brillante de Coomassie R250. En la preparación de membrana externa
podía verse un potenciamiento claramente visible de las bandas de
las proteínas a 50, 37, 19/21 kD en comparación con la preparación
de células completas, indicando que estas proteínas son OMP.
Se provocaron antisueros contra células
completas de L. intracellularis y OMP purificadas en conejos.
Se inyectó por vía intramuscular a los conejos una preparación de
células completas (R291) u OMP (R279) en n-GNE
(agua:aceite = 45:55). Se recogieron muestras sanguíneas de la vena
de la oreja antes de la inmunización. También se obtuvo suero de un
cerdo que se había estimulado experimentalmente por vía oral con
bacterias purificadas en gradiente de Percoll y había desarrollado
signos clínicos y lesiones post-mortem
típicas para infección por L. intracellularis
(BIG304T4).
(BIG304T4).
Para investigar la antigenicidad de las OMP de
L. intracellularis, se cargó la preparación de OMP en un gel
nuPAGE SDS-PAGE (NOVEX) BIS/TRIS al
4-12%. Después de la separación, las proteínas se
transfirieron a una membrana Immobilon-P PVDF
(Millipore) en TRIS 0,025 M/glicina 0,192 M/metanol al 20%
básicamente de acuerdo con Towbin et al. (Natl. Proc. Acad.
Sci., 76: 4350-4354 (1979)). Las membranas se
bloquearon con leche desnatada en polvo al 1% en PBS 0,04 M que
contenía Tween 20 al 0,05% (PBST) y después se incubaron con
antisuero R279 de conejo (Fig. 1; panel B) y antisuero R291 de
conejo (Fig. 1; panel C) durante 1 hora seguido por dos lavados con
PBST. Los sueros de conejo se usaron a una dilución de 500 en leche
desnatada al 1%/PBST. Se aplicaron inmunoglobulinas de cabra
anti-conejo conjugadas con HRP, diluidas 1:2000,
para detectar los anticuerpos de conejo. Los productos
serorreactivos se detectaron por Quimioluminiscencia Potenciada
(ECL, Amersham) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ambos antisueros (R279 y R291) reconocieron las
proteínas descritas anteriormente. Las señales al 50 y 37 kDa
aumentaron principalmente comparando la proteína de célula completa
con la preparación de OMP otra vez indicando que estas dos
proteínas eran OMP.
Para propósitos de secuenciación, se cargó la
suspensión de OMP en un gel preparativo SDS-PAGE al
10% usando el sistema BioRad Protean II de acuerdo con el manual.
Se cortaron del gel cuatro bandas de proteínas (19/21, 37 y 50 kD)
y se enviaron a Eurosequence (Groningen, Países bajos) a 4ºC. Las
secuencias proteicas del extremo N-terminal y de
los péptidos aislados obtenidos después de la digestión tríptica de
la proteína completa se determinaron por degradación de Edman
automatizada en un secuenciador Applied Biosystems 120A PTH. Las
secuencias proteicas obtenidas (Tabla 1) se usaron para la
generación de cebadores de PCR para la amplificación de los genes
codificantes. A partir de las secuencias proteicas se concluyó que
las proteínas de 19 kD y 21 kD representaban básicamente la misma
proteína. La diferencia en el tamaño se debe probablemente a la
modificación o modificaciones post-
traduccionales.
traduccionales.
Para amplificar los genes de la OMP, se aisló el
ADN genómico de L. intracellularis de las bacterias
purificadas en gradiente de Percoll usando QIAGEN Genomic Tip 100
como se describe por el fabricante. Este ADN se usó en PCR usando
cebadores degenerados basados en secuencias proteicas obtenidas. El
ADN que codifica la proteína de 50 kD se amplificó usando los
cebadores 911 (ggl gtl tgg gaY ttY aa) y 912 (tcc cal gcR taR tcY
tt). El ADN que codifica la proteína de 37 kD se amplificó usando
los cebadores 990 (tcR aal gcR aaR ttlacl cc) y 1021 (gcl gaR gtl
acl gcl ag) usando el sistema EXPAND (Boehringer Mannheim) con
MgCl_{2} 2,5 mM. Después, se tomó 1 \mul de la mezcla de PCR y
se usó en una PCR anidada usando los mismos cebadores. Esto dio
bandas de 1260 pb y 656 pb para las proteínas de 50 kD y 37 kD
respectivamente. Los productos de PCR se cortaron del gel de
agarosa y se purificaron usando el kit QIAGEN spinprep y se clonaron
en pCR-TOPO-blunt II (Novagen). La
mezcla de clonación se transformó en E. coli TOP10F. Los
supuestos transformantes se exploraron para los insertos por PCR de
colonias, usando los cebadores M13 directo y M13 inverso. A partir
de los supuestos clones que contenían un plásmido con inserto, se
aisló el ADN plasmídico usando el kit QIAGEN miniprep.
Posteriormente, se secuenciaron los insertos usando el kit PRISM
Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Sequencing (Applied Biosystems)
de acuerdo con el protocolo del fabricante usando los cebadores M13
directo e inverso.
La parte C-terminal de la región
codificante de la proteína de 50 kD se amplificó usando una PCR de
colas-c usando el cebador 923 (tat agc tgt tga tgg
tgc tt) en la primera PCR y 936 (ggt gat aat atg ctt tac t) y un
cebador poli-G (ata tgg ggg ggg ggg ggg g) en la PCR
anidada. Esto dio una banda de 840 pb, que se clonó y secuenció
como anteriormente.
| Proteína | Péptido | Secuencia |
| 19 kD | Interno | AAYEYLVMLGVN |
| Interno | PFYVMVW | |
| Interno | GTQEYNLALGER | |
| 21 kD | Interno | AAYEYLVMLGVN |
| Interno | PFYVMVW | |
| Interno | GTQEYNLALGER | |
| 37 kD | N-terminal | AEVTASCTKRVG |
| Interno | SDLEIFGR | |
| Interno | GVNFAFDSFALDDTAK | |
| 50 kD | N-terminal | IDFKAKGVWDFN |
| Interno | KDYAWEVDFDT |
Fig. 1. Electroforesis en gel
SDS-PAGE e inmunotransferencias de células completas
de L. intracellularis y la preparación de la membrana
externa de L. intracellularis sondeada con antisueros de
conejo. Carriles: 1, marcadores de precisión preteñidos (BioRad);
2, extracto celular total de L. intracellularis; 3,
preparación de la membrana externa de L. intracellularis.
Paneles: A: visualización de las proteínas con Azul Brillante de
Coomassie, B: transferencia sondeada con suero surgido contra
proteínas de la membrana externa purificadas (R279); C,
transferencia sondeada con suero surgido contra células completas
(R291). Las proteínas de 19/21 kD, 37 kD y 50 kD se indican con
P1/P2, P4 y P5 respectivamente.
<110> AZKO Nobel N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna contra Lawsonia
intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Vacuna contra Lawsonia
intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Tyr Glu Tyr Leu Val Met Leu Gly Val
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Gln Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Glu
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Phe Tyr Val Met Val Trp Thr Pro Arg
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatagctgtt gatggtgctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgataata tgctttact
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatgggggg ggggggggg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattccat atgtattgat tttaaggcaa a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg cgatccttga taatcaagg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattccat atgaaaatga aaaagagcac tctggc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctcgagg aattgatact tcatatttaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Glu Val Thr Ala Ser Cys Thr Lys Arg Val
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Asn Phe Ala Phe Asp Ser Phe Ala Leu
Asp Asp Thr Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Phe Lys Ala Lys Gly Val Trp Asp Phe
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Tyr Ala Trp Glu Val Asp Phe Asp
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Tyr Glu Tyr Leu Val Met Leu Gly Val
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Gln Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Glu
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Proteína de la Membrana Externa de
Lawsonia intracellularis que tiene un peso molecular de 19/21
kD, pudiendo obtenerse dicha Proteína de la Membrana Externa por un
proceso que comprende las etapas de
a) someter una preparación de la membrana
externa a SDS-PAGE
b) escindir la banda de 19 ó 21 kD del gel
donde dicha proteína tiene una secuencia de
aminoácidos N-terminal que es al menos el 70%
homóloga a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID
Nº: 1, una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70% homóloga
de la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2, o
una secuencia de aminoácidos interna que es al menos el 70%
homóloga a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº:
3.
2. Proteína de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene
una homología de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente el
90%, más preferiblemente el 95% de homología con la secuencia de
aminoácidos representada en las SEC ID Nº: 1, 2 ó 3.
3. Proteína de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para su
uso en un vacuna.
4. Uso de una proteína de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la
fabricación de una vacuna para combatir infecciones por Lawsonia
intracellularis.
5. Vacuna para combatir infecciones por
Lawsonia intracellularis, caracterizada porque
comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. Vacuna de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizada porque comprende un
adyuvante.
7. Vacuna de acuerdo con la
reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque comprende un
antígeno adicional obtenido de un virus o microorganismo patogénico
para los cerdos o información genética que codifica dicho
antígeno.
8. Vacuna de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizada porque dicho virus o
microorganismo patogénico para los cerdos se selecciona entre el
grupo de virus de la pseudorrabia, virus de la influenza porcina,
parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible,
rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella
bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis,
Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma
hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
9. Vacuna para combatir infecciones por
Lawsonia intracellularis, caracterizada porque
comprende anticuerpos contra una proteína de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2.
10. Método para la preparación de una
vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 5-8,
comprendiendo dicho método mezclar una proteína de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Método para la preparación de una
vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, comprendiendo dicho
método mezclar anticuerpos contra una proteína de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Ensayo de diagnóstico para la detección
in vitro de anticuerpos contra Lawsonia
intracellularis, caracterizado porque dicho ensayo
comprende una proteína o un fragmento de la misma como se define en
la reivindicación 1 ó 2.
13. Ensayo de diagnóstico para la detección
in vitro de material antigénico de Lawsonia
intracellularis, caracterizado porque dicho ensayo
comprende anticuerpos contra una proteína o un fragmento de la misma
como se define en la reivindicación 1 ó 2.
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|---|---|---|---|
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Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05104073T Expired - Lifetime ES2360225T3 (es) | 2000-12-20 | 2001-12-14 | Vacuna contra lawsonia intracellularis. |
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