DE69533102T2

DE69533102T2 - Analog von haemophilus hin47 mit verminderter protease aktivität

Info

Publication number: DE69533102T2
Application number: DE69533102T
Authority: DE
Inventors: M. Sheena LOOSMORE; Yan-Ping Yang; Pele Chong; P. Raymond OOMEN; H. Michel KLEIN
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2015-07-22
Also published as: CA2171611C; NZ291750A; BR9506272B8; EP0729513A1; EP0729513B1; WO1996003506A2; AU3337695A; WO1996003506A3; DE69533102D1; CA2171611A1; BR9506272A; US6114125A; US6020183A; BR9506272B1; MX9601065A; AU687619B2; US6025342A; ATE268384T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie und beschäftigt sich insbesondere mit Immunogenen und Antigenen aus der Spezies Haemophilus.
Hintergrund der Erfindung
Haemophilus influenzae ist der Organismus, der für eine Vielzahl von ernsten Krankheiten des Menschen verantwortlich ist, wie Meningitis, Epiglotitis, Pneumonie und Mittelohrentzündung. Haemophilus influenzae-Typ b (Hib) ist eine Hauptursache von bakterieller Meningitis bei Kindern mit einem Alter von unter fünf Jahren. Schützende Antikörper gegen die Krankheit werden durch das Kapsel-Polysaccharid des Organismus induziert, und es sind Impfstoffe entwickelt worden, welche das gereinigte Polyribosyl-Ribitol-Phosphat (PRP) als das Antigen verwenden. Dieser Impfstoff sieht einen 90%igen Schutz bei Erwachsnen und bei Kindern mit einem Alter über 24 Monate vor, war aber unwirksam in Kindern unter 24 Monaten (Zangwill et al., 1993). (Die Literatur-Bezugsstellen sind in einer Liste der Bezugsstellen am Ende der Beschreibung angegeben). Wie andere Polysaccharid-Antigene induziert PRP nicht die Proliferation von T-Helferzellen, und eine erneute Immunisierung versagt darin, entweder eine Booster-Antwort oder einen Zuwachs an Gedächtniszellen hervorzurufen. Die Konjugation des PRP-Polysaccharids mit Proteinträgern vermittelt dem Impfstoff T-Zell-abhängige Kennzeichen und verstärkt die immunologische Antwort auf das PRP-Antigen wesentlich. Derzeit sind vier PRP-Träger-Konjugatimpfstoffe verfügbar. Diese Impfstoffe basierten auf H.influenzae-Typ-b-Kapselpolysaccharid, konjugiert an Diphtherie-Toxoid, Tetanus-Toxoid oder Außenmembranprotein von Neisseria meningitidis (übersichtsmäßig zusammengefasst in Zangwill et al., 1993) Diese H.influenzae-b-Konjugatimpfstoffe haben das Auftreten von bakterieller Meningitis drastisch vermindert (Schoendorf et al., 1994).
Es gibt sechs Serotypen von H. influenzae, bezeichnet als a bis f welche durch ihre Kapselpolysaccharide definiert werden. Die derzeitigen Haemophilus-Konjugatimpfstoffe schützen nicht gegen andere invasive typisierbare Stämme (Typen a und c) und schützen, be deutenderweise, nicht gegen nicht-typisierbare (NTHi) Stämme, welche eine häufige Urssache von nachgeburtlicher und Neugeborenen-Sepsis, -Pneumonie und Mittelohrentzündung sind. Otitis media bzw. Mittelohrentzündung ist die häufigste Erkrankung in der frühen Kindheit, wobei ungefähr 70 % aller Kinder mindestens einen Anfall von Mittelohrentzündung vor dem Alter von 7 erleiden. Chronische Mittelohrentzündung kann zur Beeinträchtigung des Hörens, Sprechens und der Wahrnehmung bei Kindern führen. Sie wird durch eine bakterielle Infektion mit Streptococcus pneumoniae (ungefähr 50 %), nicht-typisierbarem H. influenzae (ungefähr 30 %) und Moraxella (Branhamella) catarrhalis (ungefähr 20 %) verursacht. Allein in den Vereinigten Staaten kostet die Behandlung von Mittelohrentzündung zwischen 1 und 2 Milliarden Dollar pro Jahr für Antibiotika und chirurgische Eingriffe, wie Tonsillektomien, Adenoidektomien und Insertion von Tympanostomie-Schläuchen. Um einen universellen Schutz gegen mit H. influenzae zusammenhängenden Krankheiten zu erzielen, insbesondere in der Altersgruppe von 2 bis 6 Monaten und bestimmten Hochrisiko-Gruppen, ist die Bereitstellung von konservierten, kreuzreaktiven nicht-kapsulären H. influenzae-Immunogenen wünschenswert. Nicht-typisierbare Stämme von H. influenzae sind ebenfalls bedeutende Pathogene, welche für Pneumonie in älteren und anderen Personen verantwortlich sind, welche besonders anfällig für Atemwegsinfektionen sind. Somit besteht ein Bedarf nach Antigenen aus H. influenzae, welche nützlich als Komponenten in immunogenen Präparationen sind, welche einen Schutz gegen die vielen Serotypen von H. influenzae gewähren. Die PCT-Anmeldung WO 92/10936, veröffentlicht am 9. Juli 1992, beschreibt ein Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 47 000, welches aus H. influenzae erhalten wurde, das berichtetermaßen ein Adhesin ist und Hin47 genannt wurde, welches immunologisch zwischen nichttypisierbaren, Typ-b- und nicht-typisierten klinischen Isolaten von H. influenzae konserviert ist. Die Aminosäuresequenz von Hin47 und die Nukleotidsequenz des Hin47 codierenden Gens wurden auf der "American Society of Microbiology" (ASM)-Konferenz vorgestellt, welche vom 26–30. Mai 1992 in New Orleans abgehalten wurde. Diese Sequenzen sind ebenfalls in der PCT-Anmeldung WO 94/00149 veröffentlicht worden, welche am 6. Januar 1994 veröffentlicht worden ist.
Da Hin47 unter den Stämmen von Haemophilus influenzae konserviert ist und berichteterweise ein Adhesin ist, besitzt das Protein Verwendbarkeit in der Diagnose von und Impfung gegen Krankheit, verursacht von H. influenzae oder anderen bakteriellen Pathogenen, welche Hin47 oder ein Protein herstellen, welches fähig zur Erzeugung von Antikörpern ist, die spezifisch mit Hin47 reaktionsfähig sind.
Ein Nachteil von Hin47 zur Verwendung als ein Antigen in der Diagnose, für die Erzeugung von bei der Diagnose nützlichen Anti-Hin47-Antikörpern und als Immunogen in einer Impfung besteht in der unerwarteten Feststellung durch die Anmelder der vorliegenden Erfindung, dass Hin47 eine Protease-Aktivität besitzt, welche zum Selbstverdau von Hin47 und zum proteolytischen Abbau anderer damit vermischter Antigene führt.
Es wäre vorteilhaft, Analoga von Hin47-Protein (hierin manchmal bezeichnet als Mutanten oder Derivate), welche eine substanziell verringerte proteolytische Aktivität aufweisen, zur Verwendung als Antigene, immunogene Präparationen einschließlich Impfstoffen, Träger für andere Immunogene und die Erzeugung von diagnostischen Reagenzien bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Bereitstellung von Analoga von Haemophilus-Hin47-Protein mit verminderter Protease-Aktivität.
Gemäß eines Aspekts der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Analogon von Haemophilus influenzae-Hin47-Protein mit einer verminderten Protease-Aktivität, welche geringer als etwa 10% des natürlichen Hin47-Proteins ist, vorgesehen. Ein solches Hin47-Analogon besitzt vorzugsweise im Wesentlichen die gleichen immunogenen Eigenschaften wie das natürliche Hin47-Protein. Das Analogon der vorliegenden Erfindung kann durch chemische, biochemische oder genetische Modifikation von natürlichem Hin47 hergestellt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann, wenn das Analogon durch genetische Modifikation hergestellt wird, mindestens eine Aminosäure des natürlichen Hin47, welche zur Protease-Aktivität beiträgt, deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, um die verminderte Protease-Aktivität zu erzeugen. Alternativ dazu kann die verminderte Protease-Aktivität durch Insertion mindestens einer Aminosäure in das natürliche Hin47-Protein erzielt werden. Die mindestens eine deletierte oder ersetzte Aminosäure kann aus den Aminosäuren 195 bis 201 von Hin47 gewählt werden, und kann spezifisch Serin-197 sein, welches deletiert oder durch Alanin, Cystein oder Threonin ersetzt werden kann. Darüber hinaus kann die mindestens eine deletierte oder ersetzte Aminosäure His-91 sein und kann deletiert oder durch Alanin, Lysin oder Arginin ersetzt werden. Ferner kann die mindestens eine deletierte oder ersetzte Aminosäure Asp-121 sein und kann deletiert oder durch Alanin ersetzt werden.
Darüber hinaus können mehrere Aminosäuren in dem Hin47-Molekül deletiert oder ersetzt werden. Derartige mehrere Aminosäuren können His-91 und Serin-197 einschließen und können deletiert oder ersetzt werden durch Ala-91 und Ala-197, um ein Hin47-Analogon H91A/S197A herzustellen. Darüber hinaus können die mehreren Aminosäuren His-91, Asp-121 und Ser-197 einschließen, und können deletiert oder ersetzt werden mit Ala-91, Ala-121 bzw. Ala-197, um ein Hin-47-Analogon H91 A/D 121 A/S 197A herzustellen. Eine Zusammenfassung von manchen der Eigenschaften einiger Hin47-Analoge, wie hierin vorgesehen, wird in der Tabelle 3 gezeigt. Es wurde nur von einer Hin47-Mutante, D121E, festgestellt, eine substanzielle Protease-Aktivität beizubehalten.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül vor, umfassend ein mutantes Haemophilus influenzae-hin47-Gen, codierend ein Analogon des Haemophilus influenzae-Hin47-Proteins mit einer verminderten Protease-Aktivität, welche weniger als etwa 10 % von der des natürlichen Hin47-Proteins beträgt. Das mutante hin47-Gen kann jedwedes der obenstehend erörterten Hin47-Analoga codieren. Das mutante Gen wird vorzugsweise durch ortsgerichtete Mutagenese eines Wildtyp-hin47-Gens gebildet. Das Nukleinsäuremolekül kann in einem rekombinanten Plasmid enthalten sein, angepasst für Transformation eines Wirts und kann das Plasmid DS-1011-1-1 sein (hinterlegt am 27. Juli 1994 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A., unter der Zugangs-Nr. 75845). Die Erfindung schließt ebenfalls eine transformierte Zelle ein, welche ein solches rekombinantes Plasmid enthält.
In einem anderen Aspekt schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Analogons von Haemophilus influenzae-Hin47-Protein mit einer verminderten Protease-Aktivität, welche niedriger als etwa 10 % wie beim natürlichen Hin47-Protein ist, ein, welches das Identifizieren von wenigstens einem Aminosäurerest des Hin47-Proteins, der zur Protease-Aktivität davon beiträgt, das Durchführen einer ortsgerichteten Mutagenese des hin47-Gens, um eine Nukleotidsequenz, welche diese wenigstens eine Aminosäure codiert, zu entfernen oder zu ersetzen, und um ein mutiertes hin47-Gen zu produzieren, das Einführen des mutierten hin47-Gens in eine Zelle, um eine transformierte Zelle zu produzieren, und das Züchten der transformierten Zelle, um das Hin47-Analogon zu produzieren, umfasst. Die wenigstens eine Aminosäure, welche ausgewählt wird, kann eine beliebige von denjenigen sein, welche obenstehend in Bezug auf das Hin47-Analogon angegeben wurden.
Das Einführen des mutierten hin47-Gens erzeugt vorzugsweise eine transformierte Zelle, in welcher das mutierte hin47-Gen unter der Steuerung des T7-Promotors steht, und das Züchten der transformierten Zelle und die Expression des Hin47-Analogons durch den T7-Promotor wird dann vorzugsweise durch Kultivierung in einer induzierenden Konzentration von Lactose durchgeführt. Vorzugsweise wird die Einführung des mutierten hin47 durch Transformieren der Zelle mit dem rekombinanten Plasmid DS-1011-1-1, welches anderweitig manchmal als Plasmid pT7/Hin47* bezeichnet wird, durchgeführt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zur Bereitstellung von isoliertem und gereinigtem Hin47-Analogon vor, welches das Durchführen der oben stehend beschriebenen Vorgehensweise für die Herstellung des Hin47-Analogons, um gezüchtete transformierte Zellen herzustellen, welche Einschlusskörper beinhalten, welche das Hin47-Analogon enthalten, das Zerstören der gezüchteten transformierten Zellen, um einen Überstand und die Einschlusskörper zu produzieren, das Solubilisieren der Einschlusskörper, um eine Lösung zu produzieren, die das Hin47-Analogon enthält, das chromatographische Reinigen des Hin47-Analogons aus der Lösung ohne Zelldebris und das Isolieren des gereinigten Hin47-Analogons umfasst.
Die hierin vorgesehenen Analoga von Hin47 mit ihrer verminderten proteolytischen Aktivität sind nützlich als Antigene in einer immunogenen Zubereitung, Träger für andere Immunogene, diagnostische Mittel und bei der Erzeugung von diagnostischen Mitteln. Die Nukleinsäuremoleküle sind ebenfalls als Sonden für die diagnostische Anwendung und auch in immunogenen Zubereitungen nützlich.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine immunogene Zubereitung, umfassend eine immunwirksame Menge des Hin47-Analogons oder des Nukleinsäuremoleküls, welches das Gen, codierend für das Hin47-Analogon, einschließt, bereitgestellt. Die immunogene Zubereitung kann als ein Impfstoff für die in vivo-Verabreichung an einen Wirt, einschließlich eines Menschen, formuliert sein, um Schutz gegen Erkrankungen zu verleihen, die durch ein bakterielles Pathogen verursacht werden, das Hin47 oder ein Protein, welches fähig ist, in dem Wirt Antikörper zu induzieren, die mit dem Hin47-Protein spezifisch reagieren, produziert. Das bakterielle Pathogen kann eine Haemophilus-Spezies, wie Haemophilus influenzae sein. Die immunogenen Zubereitungen der Erfindung können ferner mindestens ein weiteres immunogenes oder immunstimulierendes Material, wie ein Adjuvans, umfassen. In einer zusätzlichen Ausführungsform kann das Nukleinsäuremolekül, umfassend ein für das Hin47-Analogon codierendes Gen, innerhalb eines Lebendvektors, wie einem Pockenvirus, Salmonella, Poliovirus, Adenovirus, Vaccinia oder BCG, enthalten sein.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Wirt, einschließlich eines Menschen, umfassend das Verabreichen an diesen von einer immunwirksamen Menge der hierin vorgesehenen immunogenen Zubereitungen.
Wie obenstehend erwähnt, ist das hierin bereitgestellte Hin47-Analogon nützlich in diagnostischen Anwendungen. Folglich wird, in einem weiteren Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Antikörpern, die spezifisch mit Hin47 reagieren, in einer Probe vorgesehen, umfassend die folgenden Schritte:

(a) In Kontaktbringen der Probe mit dem Hin47-Analogon, welches im Wesentlichen dieselben immunogenen Eigenschaften wie das natürliche Hin47-Protein besitzt, wie hierin bereitgestellt, zur Herstellung von Komplexen, die das Hin47-Analogon und jedwede derartigen, in der Probe vorhandenen Antikörper, die spezifisch damit reagieren, umfassen; und
(b) Bestimmen der Bildung der Komplexe.

Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Hin47 in einer Probe vor, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Immunisieren eines Subjekts mit einer wie hierin bereitgestellten immunogenen Zubereitung, um für das Hin47-Protein spezifische Antikörper herzustellen;
(b) In Kontaktbringen der Probe mit den Antikörpern, um Komplexe herzustellen, die jedwedes Hin47, das in der Probe vorliegt, und die Hin47-spezifischen Antikörper umfassen; und
(c) Bestimmen der Bildung der Komplexe.

Die Erfindung erstreckt sich des weiteren auf ein diagnostisches Kit zum Bestimmen des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch mit Hin47 reagieren, umfassend:

(a) das Hin47-Analogon mit im Wesentlichen denselben immunogenen Eigenschaften wie das natürliche Hin47-Protein, wie hierin vorgesehen;
(b) Mittel zum in Kontaktbringen des Analogons mit der Probe, um einen Komplex herzustellen, der das Analogon und jedwede derartigen, in der Probe vorliegenden, Antikörper umfasst; und
(c) Mittel zum Bestimmen der Bildung des Komplexes.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide JB-1031-1-14 und JB-1068-2-2 und die Konstruktion der Plasmide für die Sequenzanalyse;
Die 2 zeigt die vollständige Nukleotid- (SEQ ID Nr. 1) und abgeleitete Aminosäure-Sequenz (SEQ ID Nr. 2) von Hin47 aus dem H. influenzae-Stamm SB 33 sowie eine partielle Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine partielle abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4) davon, wobei letztere spezifisch von einem Erfinder hierin aus Materialien kopiert wurde, welche in der ASM-Konferenz, wie oben stehend beschrieben, vorgestellt wurden;
Die 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von H. influenzae-Hin47 (SEQ ID Nr. 2), E. coli-htrA (SEQ ID Nr. 5) und Salmonella ryphimurium-htrA (SEQ ID NR. 6);
Die 4 zeigt eine Parallel-Übereinanderstellung von den Aminosäureresten 57 bis 256 von Hin47 mit gewissen bekannten Proteasen (SEQ ID Nr. 7 bis 16). Die Codes sind die Folgenden: TON, Ratten-Tonin; PKAAB, Kallikrein; PTN, Trypsin; CHAA, Chymotrypsin; EST, Elastase; RP2A, Ratten-Mastzellen-Protease; SGT, Streptomyces griseus-Trypsin; SGBE, S.griseus-Proteinase A; SGA, S. griseus-Proteinase B; ALP, L.enzymogenes-alphalytische Protease; hin47, Reste 57–256 von Hin47. Die Asterisken (*) kennzeichnen strukturell konservierte Regionen. Die katalytischen Triaden-Reste werden durch ein Gitterkreuz (#) angegeben. "con" bezieht sich auf Regionen eines strukturellen Konsensus unter den Säuger-Proteasen;
Die 5 zeigt die Restriktionskarten für die Plasmide DS-1011-1-1 und DS-1048-2, welche ein Hin47-Analogon aus E. coli exprimieren, und ein Konstruktionsschema für das Plasmid DS-1011-1-1 (Plasmid pT7/Hin47*);
Die 6 zeigt ein Verfahren zur Reinigung des Hin47-Analogons aus E. coli gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und die Gel-Analyse des gereinigten Produkts;
Die 7 zeigt die Protease-Aktivitäten von natürlichem Hin47 und Hin47-Analogon gegenüber β-Casein.
Die 8 zeigt die Stabilität von natürlichem Hin47 und des Hin47-Analogons bei unterschiedlichen Temperaturen;
Die 9 zeigt den enzymatischen Abbau eines rekombinanten H. influenzae-Proteins durch natürliches Hin47 und das Hin47-Analogon; und
die 10 zeigt die vergleichende Immunogenität von natürlichem Hin47 und des Hin47-Analogons in Mäusen;
die 11 zeigt den Aminosäurevergleich von Hin47-Protein, das aus den H. influenzae-Stämmen SB33 und SB12 isoliert wurde; und
die 12 zeigt die Reinigung des Hin47- Analogons H91A aus E. coli.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Jedwede Haemophilus-Stämme, welche Hin47-Gene aufweisen, können zweckmäßigerweise verwendet werden, um die gereinigten und isolierten Nukleinsäuremoleküle vorzusehen (welche in der Form von DNA-Molekülen vorliegen können), die wenigstens einen Teil umfassen, der für Hin47 codiert, wie von den Ausführungsformen von der vorliegenden Er findung typisiert. Solche Stämme sind im Allgemeinen aus klinischen Quellen und aus Bakterienkultur-Sammlungen, wie der American Type Culture Collection, erhältlich. Derartige Stämme schließen H. influenzae-Stämme und andere Bakterien ein, welche ein Protein herstellen, das fähig zur Erzeugung von Antikörpern ist, die Hin47, ein Fragment oder ein Analog davon, spezifisch erkennen. Passende Stämme von Haemophilus können folgende einschließen:

H. influenzae-Typ b Stamm MinnA;
H. influenzae-Typ b Stamm Eagan;
Nicht-typisierbarer H. influenzae-Stamm SB33;
Nicht-typisierbarer H. influenzae-Stamm SB 12; oder
Nicht-typisierbarer H. influenzae-Stamm PAK 12085.

Unter Bezugnahme auf die 1 werden Restriktionskarten der Plasmide JB-1031-1-14 und JB-1068-2-2 veranschaulicht, welche einen Abschnitt enthalten, codierend für das Hin47-Protein aus nicht-typisierbarem H. influenzae SB33. Die Nukleotidsequenz des Hin47-Gens wurde bestimmt und wird in der 2 zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Hin47-Proteins gezeigt. Unter Bezugnahme auf die 3 wird eine Aminosäuresequenz-Parallelübereinanderstellung von H.influenzae-Hin47 und den Serin-Proteasen htrA aus Escherichia coli und htrA aus Salmonella typhimurium gezeigt. Diese Übereinanderstellung enthüllt erstmalig die unerwartete Feststellung der Anmelder der vorliegenden Erfindung, dass Hin47 mit bakteriellen Serin-Proteasen verwandt ist, und dass Hin47 Protease-Aktivität besitzt. Früher wurde über Hin47 berichtet, ein Adhesin zu sein. Die festgestellte Protease-Aktivität davon limitiert die Nützlichkeit von natürlichem Hin47 als Immunogen für eine Impfung und als Antigen in diagnostischen Anwendungen in großem Maße. Die Sequenz-Übereinanderstellung, welche in der 3 gezeigt ist, enthüllte, dass die htrA-Proteine und Hin47 eine Sequenz GNSGGAL (SEQ ID Nr. 17) zwischen den Resten 195 und 201 des reifen Proteins enthalten. Die Konsensus-Sequenz der aktiven Stelle von Serinproteasen ist GDSGGPK (SEQ ID Nr. 18) (Brenner 1988), und der aktive Rest ist Serin. Somit wurde Serin-197 in Hin47 mutiert, um ein Analogon von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität, gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, zu produzieren. In einer besonderen Ausführungsform wurde Serin-197 durch Alanin ersetzt. Die Aminosäurereste 57 bis 256 von Hin47 wurden fernerhin mit bekannten Proteasen parallel-übereinander gestellt, und die Reste der aktiven Stelle aus den lokalen Homologien identifiziert, welche die Reste der katalytischen Triade umgeben (4). Es gibt ein Standard-Numerierungssystem für Serin-Proteasen, in welchem die Reste der katalytischen Triade als His-57, Asp-102 und Ser-195 numeriert sind. Diese entsprechen den Resten His-91, Asp-121 und Ser-197 in dem sequenziellen Numerierungssystem. Somit wird, unter Bezugnahme auf die 4, eine Struktur-basierende Über einanderstellung von 10 strukturell bestimmten Serinproteasen (SEQ ID Nr. 7 – 16) gezeigt, in welchen homologe Reste hauptsächlich auf Grundlage ähnlicher Lokalisierungen im dreidimensionalen Raum aligniert bzw. parallel-ausgerichtet werden. Die Lage von vielen der Reste im hydrophoben Kern von Hin47, sowie von Resten rings um die aktive Stelle herum, kann ziemlich gut aligniert werden, um funktionelle Aminosäuren der Hin47-Protease zu identifizieren. Somit schließen andere Aminosäurereste in Hin47, welche zur Protease-Aktivität des Proteins beitragen, His-91 und Asp-121 ein. In besonderen Ausführungsformen kann His-91 durch Alanin, Lysin oder Arginin ersetzt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann Asp-121 durch Alanin oder Glutaminsäure ersetzt werden. In einer zusätzlichen Ausführungsform kann Serin-197 durch Alanin, Serin oder Treonin ersetzt werden. Obwohl die Bereitstellung eines Analogons von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität hierin durch eine besondere Aminosäuresubstitution innerhalb des Hin47-Proteins beispielhaft veranschaulicht worden ist, gestatten die Feststellung der Protease-Aktivität und die Verfahren der Hin47-Expression, -Reinigung und -Analyse, welche hierin vorgesehen sind, die Herstellung von anderen Analoga, bei welchen wenigstens eine andere Aminosäure deletiert oder ersetzt wird oder bei welchen wenigstens eine zusätzliche Aminosäure in das Hin47-Protein eingefügt wird. In besonderen Anwendungen und Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, gleichzeitig mehrere Aminosäuren des Hin47-Proteins zu verändern, um insbesondere die Protease-Aktivität von Hin47 zu vermindern. Die mehreren Aminosäuren können His-91 und Ser-197 sein, und können deletiert oder mit Alanin ersetzt werden. In einer alternativen Ausführungsform können die mehreren Aminosäuren His-91, Asp-121 und Ser-197 und können deletiert oder durch Alanin ersetzt sein. Folglich sieht die vorliegende Erfindung Analoga von Hin47-Protein mit einer verminderten Protease-Aktivität aufgrund einzelner oder mehrerer Aminosäure-Deletionen, -Austauschungen oder -Additionen innerhalb des Hin47-Proteins vor.
Wie obenstehend erörtert, zeigt Hin47 Homologie mit E. coli-htrA oder S. typhimurium-htrA, welche beide Stressantwort-Proteine mit Serinprotease-Aktivität sind. E. coli-htrA ist durch Wachstum bei 43,5°C (Ref. 13) induzierbar. Wir haben gezeigt, dass das E. coli-htrA-Protein ebenfalls durch Wachstum in 6 % Ethanol induzierbar ist. Hin47 kann auch durch 6 % Ethanol und zu einem geringeren Ausmaß durch Temperaturreduktion bei 43,5°C induziert werden, wie ausführlich untenstehend beschrieben wird. Diese Analyse der Expression von Hin47 liefert einen weiteren Beweis der Verwandtschaft zwischen diesem Protein und LtrA.
Das hin47-Gen wurde auch aus dem nicht-typisierbaren H. influenzae-Stamm SB12 durch PCR-Amplifikation kloniert. Unter Bezugnahme auf die 11 wird ein Aminosäu revergleich zwischen den Hin47-Proteinen der H. influenzae-Stämme SB12 und SB33 gezeigt. Dies zeigt, dass die Proteine hinsichtlich der Aminosäuresequenz fast identisch sind.
Unter Bezugnahme auf die 5, werden die Plasmide DS-1011-1-1 und DS-1048-2 veranschaulicht, welche ein Hin47-Analogon Serin-197-iAlanin in E. coli exprimieren. Die 6 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens für die Reinigung des Hin47-Analogons aus E. coli-Einschlusskörpern.
Die 7 zeigt die verminderte Protease-Aktivität des Hin47 Serin-197 → Alanin-Analogons auf das Substrat β-Casein und demonstriert, dass das Analogon weniger als etwa 10 % der Protease-Aktivität von natürlichem Hin47-Protein besitzt. Somit wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein Analogon von Hin47 mit einer Protease-Aktivität von weniger als etwa 10 % der Protease-Aktivität von natürlichem Hin47 vorgesehen, und bei einem solchen Analogon kann die Aminosäure Serin-197 spezifisch durch Alanin ersetzt sein.
Unter Bezugnahme auf die 8 wird eine Analyse der erhöhten Stabilität eines Analogons von Hin47, wie hierin vorgesehen, veranschaulicht. Somit wird, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ein Analogon von Hin47-Protein mit erhöhter thermischer Stabilität vorgesehen, und bei einem derartigen Analogon kann die Aminosäure Serin-197 spezifisch durch Alanin ersetzt sein.
Unter Bezugnahme auf die 9 wird der proteolytische Abbau eines Nicht-Hin47-Haemophilus-Antigens durch Hin47 und ein Hin47-Analogon, wie hierin vorgesehen, veranschaulicht. So wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Analogon von Hin47 vorgesehen, kompatibel mit einem zweiten Nicht-Hin47-Protein, und bei einem derartigen Analogon kann die Aminosäure Serin-197 spezifisch durch Alanin ersetzt sein.
Unter Bezugnahme auf die 10 und die Tabelle 1 wird die vergleichende Immunogenität von unmodifiziertem Hin47 und einem Hin47-Analogon mit verminderter Protease-Aktivität in Mäusen veranschaulicht. Das Hin47-Protein und die Hin47-Analoga S197A und H91A hatten eine vergleichbare Immunogenität. Somit wird in einer besonderen Ausführungsform ein Analogon von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität und mit im Wesentlichen den gleichen immunogenen Eigenschaften wie natürliches Hin47-Protein vorgesehen. Bei einem derartigen Analogon kann spezifisch die Aminosäure Serin-197 durch Alanin ersetzt sein.
Unter Bezugnahme auf die Tabellen 2 und 3 werden die Immunschutz-verleihenden Eigenschaften der Analoga von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität gegen Hib im Jungratten-Modell von Bakterämie und im Aktivimpfungs-Chinchilla-Modell für Mittelohrentzündung gemäß besonderen Ausführungsformen der Erfindung gezeigt, wobei bei einem derartigen Analog spezifisch die Aminosäure His-91 deletiert oder durch Alanin, Lysin oder Arginin ersetzt werden kann; Asp-121 deletiert oder durch Alanin oder Glutaninsäure ersetzt werden kann; Serien-197 durch Alanin, Cystein oder Threonin ersetzt sein kann; oder eine Kombination hiervon der Fall ist.
Gemäß eines anderen Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff gegen Haemophilus oder andere bakterielle Pathogene vorgesehen, welche Hin47 oder ein Protein produzieren, das in der Lage zum Induzieren von Antikörpern ist, welche Hin47 spezifisch erkennen, umfassend eine immunogenisch wirksame Menge eines immunprotektiven Analogons von Hin47, wie hierin vorgesehen, oder ein Nukleinsäuremolekül mit einer ein Hin47-Analogon codierenden Sequenz, wie hierin vorgesehen, und einem physiologisch annehmbaren Träger hierfür. Die bereitgestellten Analoga können auch als ein Trägerprotein für Hapten, Polysaccharide oder Peptide verwendet werden, um einen Konjugatimpfstoff gegen nicht mit Hin47 verwandte antigene Determinanten herzustellen.
Wie aus der folgenden Beschreibung offensichtlich sein wird, sieht die vorliegende Erfindung ferner Plasmide und neue Stämme von Bakterien für die Herstellung von Hin47-Analogen, wie hierin vorgesehen, vor.
Die gereinigten und isolierten DNA-Moleküle, umfassend mindestens einen Abschnitt, codierend für ein Analogon von Haemophilus influenzae-Hin47-Protein mit verminderter Protease-Aktivität im Vergleich zu natürlichem Hin47, typisiert durch die hierin beschriebenen Ausführungsformen, sind vorteilhaft als Nukleinsäuresonden für die spezifische Identifikation von Haemophilus-Stämmen in vitro oder in vivo. Die von den hierin vorgesehenen DNA-Molekülen codierten Hin47-Analoga sind nützlich als diagnostische Reagenzien, als Antigene oder für die Erzeugung von Anti-Hin47-Antikörpern, Antigene für die Impfung gegen die Erkrankungen, welche von Spezies von Haemophilus oder anderen bakteriellen Pathogenen verursacht werden, die ein Protein herstellen, das fähig zur Erzeugung von Antikörpern ist, welche Hin47 spezifisch erkennen, oder zum Nachweisen einer Infektion durch Haemophilus und andere derartige Bakterien.
In zusätzlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Hin47-Analoga mit verminderter Protease-Aktivität, wie hierin vorgesehen, als Trägermoleküle zur Herstellung von chimären Molekülen und Konjugatimpfstoffen (einschließlich Glycokonjugaten) gegen pathogene Bakterien, einschließlich eingekapselten Bakterien, verwendet werden. So können beispielsweise Glycokonjugate der vorliegenden Erfindung bei Impfungen angewandt werden, um Schutz gegen Krankheit und Infektion zu verleihen, welche von jedweden Bakterien verursacht werden, die Polysaccharid-Antigene einschließlich Lipooligosacchariden (LOS) und PRP aufweisen. Bakterielle Pathogene können beispielsweise Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella, Staphylococcus aureus und Pseudomonas seruginosa einschließen. Besondere Antigene, welche an Analoge von Hin47 konjugiert sein können, und Verfahren zur Durchführung solcher Konjugationen werden in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 94/12641 der Anmelder beschrieben, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Trägerfunktion von Hin47-Analogen zum Beispiel verwendet werden, um Immunität gegen abnormale Polysaccharide von Tumorzellen zu induzieren, oder um Anti-Tumor-Antikörper herzustellen, welche an chemotherapeutische oder bioaktive Mittel konjugiert werden können.
Folglich sieht die vorliegende Erfindung die Primärsequenz und die Herstellung von Analogen von Hin47 von H. influenzae vor, welche in der Prävention und Diagnose von Krankheiten, die durch H. influenzae verursacht werden, verwendet werden können. Insbesondere haben die Erfinder festgestellt, dass die Hin47-Analoga schützende Immunantworten gegen eine bakterielle Herausforderung mit lebendem H. influenzae-Typ b hervorrufen können. Somit besitzt die vorliegende Erfindung Nützlichkeit bei Impfstoffen. Die Erfindung beschreibt auch die Nukleotidsequenzen der Gene, welche die Hin47-Analoga codieren. Diese DNA-Segmente können verwendet werden, um ein Immunogen, welches im wesentlichen frei von anderen H. influenzae-Antigenen ist, wie PRP und Lipooligosacchariden (LOS), durch Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie vorzusehen. Das Hin47-Analogon-Protein kann in einem geeigneten Expressionssystem, wie E. coli, Haemophilus, Bacillus, Bordetella, Pilzen, Hefe, Baculovirus, Pockenvirus, Vaccinia oder Säuger-Expressionssystemen, produziert werden. Die vorliegende Beschreibung sieht ferner neue Techniken vor, welche zur Herstellung von im wesentlichen reinen Hin47-Analogen angewandt werden können.
Für den Fachmann auf dem Gebiet ist es deutlich offensichtlich, dass die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung viele Anwendungen auf den Gebieten der Impfung, Diagnose, Behandlung beispielsweise von Haemophilus-Infektionen und Infektionen mit anderen bakteriellen Pathogenen, welche Proteine produzieren, die in der Lage zur Erzeugung von Antikörpern sind, die Hin47 spezifisch erkennen, und der Erzeugung von immunologischen Reagenzien aufweisen. Eine weitere, nicht-einschränkende Erörterung derartiger Anwendungen wird ferner nachstehend präsentiert.
1. Impfstoff-Herstellung und -Anwendung
Immunogene Zubereitungen, welche zur Verwendung als Impfstoffe geeignet sind, können aus Hin47-Analogen, wie hierin beschrieben, hergestellt werden. Der Impfstoff ruft eine Immunantwort in einem Subjekt hervor, welches Antikörper produziert, einschließlich Anti-Hin47-Antikörpern und Antikörpern, welche opsonisierend bzw. Phagozytose-herbeiführend oder bakterizid sind. Sollte das geimpfte Subjekt durch Haemophilus oder andere Bakterien herausgefordert werden, welche Proteine herstellen, fähig zur Erzeugung von Antikörpern, welche Hin47 spezifisch erkennen, binden die Antikörper an das Bakterium und inaktivieren dieses. Darüber hinaus können opsonisierende oder bakterizide Anti-Hin47-Antikörper ebenfalls Schutz durch alternative Mechanismen verleihen.
Immunogene Zubereitungen, einschließlich Impfstoffen, können als injizierbare Formen, als flüssige Lösungen oder Emulsionen hergestellt werden. Die Hin47-Analoge können mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten gemischt werden, welche mit dem Hin47-Analog kompatibel sind. Solche Exzipienten können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombination hiervon einschließen. Die immunogenen Zubereitungen und Impfstoffe können ferner Hilfssubstanzen enthalten, wie benetzende oder emulgierende Mittel, pH-Puffermittel oder Adjuvantien, um deren Wirksamkeit zu steigern. Verfahren zur Erzielung eines Adjuvanz-Effektes schließen die Verwendung von Mitteln, wie Aluminiumhydroxid oder -phosphat (Alum) ein, welches üblicherweise als 0,05- bis 0,1-prozentige Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verwendet wird. Immunogene Zubereitungen und Impfstoffe können parenteral, durch Injektion, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Alternativ dazu können die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten immunogenen Zubereitungen in einer Weise formuliert und abgegeben werden, dass eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorgerufen wird. So kann die immunogene Zubereitung an Schleimhautoberflächen beispielsweise auf dem nasalen oder oralen (intragastrischen) Weg verabreicht werden. Alternativ dazu können andere Arten der Verabreichung, einschließlich Suppositorien und oralen Formulierungen, wünschenswert sein. Für Suppositorien können Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkalenglycole oder Triglyceride einschließen. Orale Formulierungen können normalerweise verwendete Inzipienten einschließen, wie beispielsweise pharmazeutische Güteklassen von Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat. Diese Zubereitungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kap seln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern einnehmen und enthalten etwa 1 bis 95 % an den Hin47-Analogen. Die immunogenen Präparationen und Impfstoffe werden auf eine Weise verabreicht, welche mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam, schützend und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt vom zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich zum Beispiel der Fähigkeit des Immunsystems der Person, Antikörper zu synthetisieren, und, falls notwendig, eine Zell-vermittelte Immunantwort hervorzubringen. Die genauen Mengen an Wirkstoff, welche zur Verabreichung erforderlich sind, hängen von der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Allerdings sind geeignete Dosierungsbereiche vom Fachmann auf dem Gebiet leicht bestimmbar, und können in der Größenordnung von Mikrogramm der Hin47-Analoge liegen. Geeignete Zeitpläne für die anfängliche Verabreichung und Booster-Dosierungen sind ebenfalls variabel, können aber eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von anschließenden Verabreichungen, einschließen. Die Dosierung kann auch vom Weg der Verabreichung abhängen und wird gemäß der Größe des Wirtes variieren.
Die Antigenkonzentration in einer immunogenen Zubereitung gemäß der Erfindung beläuft sich im allgemeinen auf etwa 1 bis 95 %. Ein Impfstoff, welcher antigenes Material von lediglich einem Pathogen enthält, ist ein monovalenter Impfstoff. Impfstoffe, welche antigenes Material von mehreren Pathogenen enthalten, sind kombinierte Impfstoffe und gehören ebenfalls der vorliegenden Erfindung an. Derartige kombinierte Impfstoffe können zum Beispiel Material aus verschiedenen Pathogenen oder aus verschiedenen Stämmen desselben Pathogens oder aus Kombinationen verschiedener Pathogene enthalten.
Die Nukleinsäuremoleküle, codierend das Hin47-Analog der vorliegenden Erfindung, können auch direkt für eine Immunisierung durch direkte Verabreichung der DNA beispielsweise durch Injektion für eine genetische Immunisierung oder durch Konstruieren eines Lebendvektors, wie Salmonella, BCG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia oder Poliovirus, verwendet werden. Eine Erörterung von einigen Lebendvektoren, welche verwendet worden sind, um heterologe Antigene in das Immunsystem einzutragen, wird zum Beispiel in O'Hagan (1992) diskutiert. Verfahren für die direkte Injektion von DNA in Testsubjekte für eine genetische Immunisierung werden beispielsweise in Ulmer et al., 1993, beschrieben.
2. Immunoassays
Die Hin47-Analoga der vorliegenden Erfindung sind nützlich als Immunogene für die Erzeugung von Anti-Hin47-Antikörpern, als Antigene in Immunassays, einschließlich Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA), RIAs und anderen nicht-Enzym-verknüpften Antikörperbindungsassays oder Vorgehensweisen, welche im Fachgebiet für die Detektion von antibakteriellen Haemophilus- und Anti-Hin47-Antikörpern bekannt sind. In ELISA-Assays werden die Hin47-Analoge auf einer gewählten Oberfläche, beispielsweise einer Oberfläche, fähig zur Bindung von Proteinen, wie den Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte, immobilisiert. Nach Waschen zur Entfernung von unvollständig adsorbierten Hin47-Analogen kann ein nicht-spezifisches Protein, wie eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA), welches bekanntermaßen hinsichtlich der Testprobe antigenisch neutral ist, an die gewählte Oberfläche gebunden werden. Dies gestattet die Blockierung von nicht-spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und vermindert somit den Hintergrund, der durch nicht spezifische Bindungen von Antiseren an die Oberfläche verursacht wird.
Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer Probe, wie klinischen oder biologischen Materialien, welche zu testen ist, auf eine Weise kontaktiert, welche der Bildung von Immunkomplex (Antigen/Antikörper) förderlich ist. Dies kann das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln, wie Lösungen von BSA, Rindergammaglobulin (BGG) und/oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)/Tween, einschließen. Die Probe wird dann 2 bis 4 Stunden lang bei Temperaturen wie von der Größenordnung von etwa 25°C bis 37°C inkubieren gelassen. Im Anschluß an die Inkubation wird die Proben-kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht-immunkomplexiertes Material zu entfernen. Das Waschvorgehen kann das Waschen mit einer Lösung, wie PBS/Tween oder einem Boratpuffer, einschließen. Im Anschluß an die Bildung spezifischer Immunkomplexe zwischen der Testprobe und den gebundenen Hin47-Analogen, und einem anschließenden Waschen, kann das Auftreten und sogar die Menge der Immunkomplex-Bildung bestimmt werden, indem der Immunkomplex einem zweiten Antikörper mit Spezifität für den ersten Antikörper unterzogen wird. Wenn die Testprobe von menschlichem Ursprung ist, ist der zweite Antikörper ein Antikörper mit Spezifität für humane Immunglobuline und im allgemeinen IgG. Um nachweisende Mittel vorzusehen, kann der zweite Antikörper eine assoziierte Aktivität, wie eine enzymatische Aktivität aufweisen, welche zum Beispiel eine Farbentwicklung nach Inkubieren mit einem passenden chromogenen Substrat erzeugen wird. Die Quantifizierung kann dann durch Messen des Grads der Farberzeugung beispielsweise unter Verwendung eines Spektrophotometers für sichtbare Spektren erreicht werden.
3. Verwendung von Sequenzen als Hybridisierungssonden
Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, welche die Sequenz des hin47-Analogon-Gens aufweisen, gestatten die Identifizierung und Klonierung der Hin47-Gene aus jeder Spezies von Haemophilus und anderen Bakterien, welche Proteine produzieren, die fähig zur Erzeugung von Antikörpern sind, welche Hin47 spezifisch erkennen.
Die Nukleinsäuremoleküle, welche die Sequenz aufweisen, codierend für das Hin47-Analogon der vorliegenden Erfindung, sind wegen ihrer Fähigkeit nützlich, selektiv Duplex-Moleküle mit komplementären Abschnitten von anderen hin47-Genen zu bilden. Abhängig von der Anwendung kann eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen angewandt werden, um variierende Grade an Selektivität der Sonde zu den anderen hin47-Genen zu erzielen. Für einen hohen Grad an Selektivität werden relativ stringente Bedingungen verwendet, um die Duplizes bzw. Doppelstränge zu bilden, wie Niedrigsalz- und/oder Hochtemperatur-Bedingungen, wie vorgesehen durch 0,02 M bis 0,15 M NaCl bei Temperaturen zwischen etwa 50°C bis 70°C. Für einige Anwendungen sind weniger stringente Hybridisierungsbedingungen erfordert, wie 0,15 M bis 0,9 M Salz, bei Temperaturen im Bereich zwischen etwa 20°C bis 55°C. Die Hybridisierungsbedingungen können auch durch Zugabe von zunehmenden Mengen an Formamid stringenter gemacht werden, um den Hybrid-Duplex zu destabilisieren. Somit können jeweilige Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden und werden im allgemeinen ein Verfahren nach Wahl, abhängig von den gewünschten Ergebnissen, sein.
In einer klinischen diagnostischen Ausführungsform können die Nukleinsäuremoleküle, welche die hin47-Gene der vorliegenden Erfindung codieren, in Kombination mit einem passenden Mittel, wie einer Markierung, zum Bestimmen der Hybridisierung verwendet werden. Eine große Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Fachgebiet bekannt, einschließlich radioaktiven, enzymatischen oder anderen Liganden, wie Avidin/Biotin, welche in der Lage zur Bereitstellung eines nachweisbaren Signals sind. In einigen diagnostischen Ausführungsformen kann ein Enzym-Tag bzw. -Marker, wie Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle eines radioaktiven Tag's verwendet werden. Im Falle von Enzym-Tags sind colorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, welche eingesetzt werden können, um ein Mittel bereitzustellen, welches für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um eine spezifische Hybridisierung mit Proben, welche hin47-Gensequenzen enthalten, zu identifizieren.
Die Nukleinsäuremoleküle, welche hin47-Gene der vorliegenden Erfindung umfassen, sind nützlich als Hybridisierungssonden in Lösungs-Hybridisierungen und in Ausführungsformen, welche Festphasen-Vorgehensweisen anwenden. In Ausführungsformen, welche Festphasen-Vorgehensweisen anwenden, wird die Test-DNA (oder RNA) aus Proben, wie klinischen Proben, einschließlich Exsudaten, Körperfluiden (z. B. Serum, Amnionflüssigkeit, Mittelohr-Erguß, Sputum, Bronchoalveolar-Waschfluid) oder sogar Geweben, auf eine gewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder anderweitig angeheftet. Die fixierte einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden, umfassend die Nukleinsäuresequenzen der hin47-Gene der vorliegenden Erfindung, unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die gewählten Bedingungen werden von den jeweiligen Umständen abhängen, basierend auf den jeweiligen Kriterien, welche in Abhängigkeit von beispielsweise dem G+C-Gehalt, dem Typ der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde etc. erforderlich sind. Im Anschluß an das Waschen der Hybridisierungsoberfläche, so dass nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle entfernt werden, wird eine spezifische Hybridisierung mittels der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert.
4. Expression der Gene, welche Analoge von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität codieren
Vektoren, welche vielleicht Replicon- und Steuerungssequenzen enthalten, die aus mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies abgeleitet sind, können für die Expression der Hin47-Analogon-Gene, wie hierin vorgesehen, in Expressionssystemen verwendet werden. Der Vektor trägt gewöhnlicherweise eine Replikations-Stelle sowie markierende Sequenzen, welche in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen vorzusehen. Zum Beispiel kann E. coli unter Verwendung von pBR322 transformiert werden, welcher Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält und somit ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereitstellt. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder Phage, muß ebenfalls Promotoren enthalten, oder modifiziert sein, um selbige zu enthalten, welche von der Wirttzelle für die Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können.
Darüber hinaus können Phagenvektoren, enthaltend Replicon- und Steuerungssequenzen, welche mit dem Wirt kompatibel sind, als ein transformierender Vektor im Zusammenhang mit diesen Wirten verwendet werden. Beispielsweise kann der Phage in Lambda GEM^TM-11 verwendet werden bei der Herstellung rekombinanter Phagenvektoren, welche verwendet werden können, um Wirtszellen, wie E. coli LE392, zu transformieren.
Promotoren, welche üblicherweise bei der rekombinanten DNA-Konstruktion verwendet werden, schließen die β-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1979; Goeddel et al., 1980) und andere mikrobielle Promotoren, wie das T7-Promotorsystem (U.S.-Patent 4 952 496), ein. Details, welche die Nukleotidsequenzen von Promotoren betreffen, sind bekannt, was einen geschulten Fachmann in die Lage versetzt, diese funktionstüchtig mit Plasmidvektoren zu ligieren. Der jeweilige verwendete Promotor wird im allgemeinen eine wahlfreie Angelegenheit sein, abhängig von den gewünschten Ergebnissen. Wirte, welche für eine Expression der Hin47-Analoga geeignet sind, schließen E. coli, Bacillus-Spezies, Haemophilus, Bordetella, Pilze, Hefe, Säugerzellen ein, oder das Baculovirus-Expressionssystem kann eingesetzt werden.
Somit kann es, in Übereinstimmung mit der Erfindung, bevorzugt sein, das Hin47-Analogon-Protein durch rekombinante Verfahren herzustellen. Besonders erwünschte Wirte für die Expression schließen in dieser Hinsicht grampositive Bakterien ein, welche kein LPS besitzen und deswegen Endotoxin-frei sind. Derartige Wirte schließen Spezies von Bacillus ein und können besonders nützlich für die Produktion von nicht-pyrogenem Hin47-Analog sein.
Biologische Hinterlegungen
Das Plasmid DS-1011-1-1 (pT7/Hin47*), welches einen Abschnitt enthält, codierend für ein Hin47-Analog, welches hierin beschrieben und angegeben ist, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), befindlich in Rockville, Maryland, USA, unter Befolgung des Budapester Vertrages am 27. Juli 1994 unter der Zugangs-Nr. 75845 hinterlegt worden. Proben des hinterlegten Plasmids werden der Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patentes, basierend auf dieser US-Patentanmeldung, zugänglich werden. Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung ist in ihrem Umfang nicht durch das hinterlegte Plasmid eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform lediglich als eine Veranschaulichung der Erfindung beabsichtigt ist. Jedwede äquivalenten oder ähnlichen Plasmide, welche ähnliche oder äquivalente Antigene codieren, wie beschrieben in dieser Anmeldung, liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Beispiele
Die obenstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele sind lediglich aus Zwecken der Veranschaulichung beschrieben, und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Änderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten werden in Betracht gezogen, wie es die Umstände nahelegen oder zweckdienlich scheinen lassen können. Obwohl spezifische Ausdrücke hierin benutzt worden sind, sind derartige Ausdrücke in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken von Einschränkungen beabsichtigt.
Verfahren der Molekulargenetik, Proteinbiochemie und Immunologie, welche in dieser Beschreibung und diesen Beispielen angewandt aber nicht explizit beschrieben werden, sind in der wissenschaftlichen Literatur in breitem Maße berichtet und liegen durchaus innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns auf dem Gebiet.
Beispiel 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Klonierung des hin47-Gens aus nicht-typisierbarem N. influenzae-Stamm SB33.
Chromosomale DNA wurde aus dem H. influenzae-Stamm SB33 hergestellt, und eine EMBL3-Bibliothek wurde hergestellt und mit einer markierten Oligonukleotidsonde, spezifisch für das 5'-Ende von hin47, gescreent. Nicht-typisierbarer H, influenzae-Stamm SB33 wurde auf Mueller-Hinton-Agar oder in Hirn-Herz-Infusionsnährmedium gezüchtet, wie beschrieben von Harkness et al., 1992. Chromosomale DNA wurde wie folgend hergestellt: Zellen aus 50 ml Kultur wurden durch 15 bis 20 Minuten lange Zentrifugation bei 5000 U/min bei 4°C in einer Sorvall RC-3B-Zentrifuge pelletiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert, und Pronase wurde zu 500 μg ml^–1 und SDS zu 1 % zugesetzt. Die Probe wurde bei 37°C inkubiert, bis ein klares Lysat erhalten wurde. Das Lysat wurde vorsichtig einmal mit Tris-gesättigtem Phenol (pH 7,4), einmal mit Trisgesättigtem Phenol/Chloroform (1:1) und einmal mit Chloroform extrahiert. Die letztendliche wäßrige Phase wurde 24 Stunden lang bei 4°C gegen 1 M NaCl, gefolgt von 24 Stunden gegen TE, dialysiert.
Eine EMBL3-Bibliothek wurde durch partiellen Verdau der chromosomalen SB33-DNA mit Sau3A I, gefolgt von Größenfraktionierung entweder auf einem 10 bis 30%igen Saccharosegradienten in TNE (20 mM Tris/HCl, 5 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) oder von präparativer Gelelektrophorese, hergestellt. Fraktionen, welche DNA-Fragmente mit einer größeren Länge als 5 kb enthielten, wurden vereinigt, gefällt und mit BamH I-Armen von EMBL3 (Promega) ligiert. Die Ligationsmischung wurde unter Verwendung eines Gigapack II-Verpackungskits verpackt und auf E. coli LE392-Zellen plattiert. Die Bibliotheken wurden amplifiziert und bei 4°C in Gegenwart von 0,3 % Chloroform aufbewahrt.
Plaques wurden auf Nitrozellulosefilter für die Hybridisierung mit einer 32P-markierten Oligonukleotidsonde (3026.SL) abgezogen. Die Oligonukleotidsequenz war AT-GAAAAAAACACGTTTTGTATTAAATAGTATTGCACTTGG (SEQ ID Nr.: 3), entspre chend der N-terminalen Aminosäuresequenz MKKTRFVLNSIALG (SEQ ID Nr.: 19). Phagen-DNA wurde aus den vermeintlichen Plaques präpariert, und die Insert-DNA wurde durch Sal I-Verdau herausgeschnitten und in pUC8-BgXb, welcher mit Sal I verdaut war, kloniert. Die Plasmide JB-1031-1-14 und JB-1068-2-2 (1) wurden für eine weitere Analyse ausgewählt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Charakterisierung und Sequenzanalyse des hin47-Gens und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Hin47-Proteins aus dem NTHi-Stamm SB33.
Eine Restriktionskartierung und Southern-Blot-Analyse der Klone JB-1031-1-14 und JB-1068-2-2 lokalisierte das hin47-Gen auf einem 4,7 kb großen BamH I/BamH I- oder einem 2,7 kb großen BamH I/Pst I-DNA-Fragment. Das 4,7 kb große BamH I/BamH I-Fragment aus JB-1068-2-2 wurde in pUC8/BgXb subkloniert, wodurch das Plasmid DS-755-1 erzeugt wurde. Das 3,1 kb große BamH I- bis Xba I-Fragment von DS-755-1 wurde in pUC18 subkloniert, wodurch das Plasmid JB-1165-1 erzeugt wurde, welches Restriktionsstellen besitzt, die für das "Erase-a-base"(Promega)-Vorgehen geeignet sind (1). Diese Technik erzeugt sukzessive Klone mit zunehmenden Trunkierungen von Insert-DNA, wobei die Deletionen vom gleichen Ende her stattfinden. Der resultierende "nested" bzw. geschachtelte Satz an Klonen kann rasch unter Verwendung eines universellen Primers sequenziert werden.
DNA aus dem Plasmid JB-1165-1 wurde mit BamH I und Sac I verdaut und einem exoIII-Verdau unter Verwendung eines Erase-a-base-Kits unterzogen. Der resultierende Satz von trunkierten Plasmiden wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, und repräsentative Plasmide wurden für die Sequenzanalyse ausgewählt.
Plasmid-DNA für die Sequenzierung wurde durch eine Modifikation der Vorgehensweise von Holmes und Quigley, 1981, hergestellt. Kurz gesagt, wurde das Zellpellet aus 50 ml Kultur in 10 ml STET (8 % Saccharose, 5 % Triton X-100, 50 mM EDTA und 50 mM Tris/HCl, pH 8,0) resuspendiert, Lysozym (2,5 mg) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 2 Minuten lang gekocht. Die Probe wurde in einer Sorval RC 5B 20 Minuten lang bei 14000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde mit einem gleichen Volumen von Isopropanol präzipitiert, mit 70 % Ethanol und danach absolutem Ethanol gewaschen und dann luftgetrocknet. Das Pellet wurde in 0,9 ml TE resuspendiert, wonach 20 μl von 5 mg ml^–1 RNAse A zugegeben wurden, und die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von 500 μl 1,5 M NaCl/30% PEG wurde die Mischung 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, und die DNA wurde durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Mikrofuge während 10 Minuten pelletiert. Das Pellet wurde in 400 μl TE resuspendiert und zweimal mit Trisgesättigtem Phenol (pH 7,4), zweimal mit Tris-gesättigtem Phenol/Chloroform (1:1) und zweimal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wurde durch Zusetzen von 40 μl 3 M Ammoniumacetat und 1 ml Ethanol präzipitiert, mit 70 % Ethanol gewaschen und in destilliertem Wasser resuspendiert.
DNA-Proben wurden unter Verwendung des ABI-Modell 370A-DNA-Sequenzierers und der Farbstoff-Terminator-Chemie sequenziert. Der universelle Rückwärts-Primer wurde mit dem geschachtelten Satz an Klonen verwendet, um die Sequenz des hin47-codierenden Stranges zu bestimmen. Oligonukleotid-Primer von ungefähr 25 Basen Länge wurden verwendet, um die Sequenz des nicht-codierenden Strangs zu bestätigen. Die Nukleotidsequenz des SB33-hin47-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Hin47-Proteins sind in der 2 gezeigt. Die Nukleotid- und N-terminalen Aminosäuresequenzen von Hin47, vorgestellt auf dem ASM-Meeting, New Orleans, 26. bis 30. Mai 1992, sind in Kleinbuchstaben in der 2 angegeben. Die aminoterminalen Sequenzen des SB33-Hin47 und diese präsentierte Sequenz sind identisch, was die Identität des klonierten Gens als hin47 begründet.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Ermittlung von Serinprotease-Aktivität des Hin47-Proteins.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Hin47-Protein, bestimmt in obenstehendem Beispiel 2, wurde mit allen anderen bekannten Proteinen in der Genbank-Datenbank verglichen. Wie obenstehend beschrieben, wird von dem Hin47-Protein in veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 94/00149, WO 92/11367 und WO 92/10936 berichtet, ein Adhesin-Molekül von Haemophilus zu sein. Es war deshalb eine überraschende und unerwartete Feststellung der vorliegenden Erfindung, dass Hin47-Protein eine signifikante Aminosäurehomologie (55 %) mit den Serinproteasen E. coli htrA und S. typhimurium htrA und anderen Proteasen besitzt. Diese Aminosäurehomologien sind in den 3 und 4 gezeigt. Darüber hinaus wurde von Hin47-Protein festgestellt, sich selbst zu verdauen, es sei denn es wurde in Gegenwart eines Serinprotease-Inhibitors, wie Pefablock, aufbewahrt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Erzeugung des mutanten hin47-Gens durch ortsgerichtete Mutagenese.
Wie obenstehend erklärt, sind H. influenzae Hin 47, E.coli htrA und S. typhimurium htrA alle Serinproteasen. Die Konsensussequenz der aktiven Stelle von Serinproteasen ist GDSGGPK (SEQ ID Nr.: 18) [Brenner, 1988], wobei Serin der aktive Rest ist. Die htrA-Proteine besitzen beide eine GNSGGAL (SEQ ID Nr.: 17)-Sequenz, und in H. influenzae Hin 47 gibt es die identische Sequenz zwischen den Resten 195 und 201 des reifen Proteins. Somit wurde der Serinrest an Position 197 für eine ortsgerichtete Mutagenese ausgewählt, um ein Analogon von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität zu produzieren.
Ein Oligonukleotid CGCTCCACCAGCATTACCGCGG (SEQ ID Nr.: 20) wurde synthetisiert, welches den Serinrest bei 197 zu einem Alanin ändern wird. Das hin47-Gen wurde in M13mp18 kloniert, wodurch der Klon DS-981-3 erzeugt wurde, und eine Mutagenese wurde unter Verwendung des "in Vitro Site-Directed Mutagenesis"-Kit von Amersham durchgeführt. Bei dem Klon DS-991-8 wurde durch Sequenzanalyse bestätigt, dass er die Mutation Serin-197 zu Alanin enthält. Dieses mutante hin47-Gen wird als hin47* bezeichnet. Unter Verwendung passender Oligonukleotide wurde der Serinrest bei 197 zu einem Cystein (Mutante S 197C) und einem Threonin (Mutante S197T) verändert.
Zusätzlich dazu enthüllte ein Vergleich der Aminosäuresequenz von Hin47 mit anderen Proteasen (wie gezeigt in der 4), dass die Aminosäuren His-91 und Asp-121 passende Stellen für eine Mutagenese sind, um ein Analogon von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität herzustellen. Durch Mutageneseverfahren, welche analog zu den obenstehend beschriebenen waren, wurden His-91 und/oder Asp-121 deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt. Derartige Aminosäure-Austausche schlossen His-91 zu Alanin (Mutante H91 A) und Arginin (Mutante H91 R) und Asp-121 zu Alanin (Mutante D 121 A) und Glutaminsäure (Mutante D121E) ein. Die Oligonukleotide zur Bewirkung einer derartigen Mutagenese schlossen folgende ein:
Entsprechende Oligonukleotide wurden angewandt, um die anderen Mutationen zu bewirken. Mehrfach-Mutationen wurden ebenfalls bewirkt, bei welchen His-91 und Serin-197 beide durch Alanin ersetzt wurden (Mutante H91A/S197A), und His-91, Asp-121 und Ser-197 alle durch Alanin ersetzt wurden (Mutante H91A/D121A/S197A).
Diese weiteren Mutanten wurden hergestellt, extrahiert, gereinigt und hinsichtlich Protease-Aktivität getestet, wie beschrieben für das Hin47*-Material in den anschließenden Beispielen.
Viele Serinproteasen werden in einer inaktiven ("Zymogen")-Form sezerniert und erfordern ein Schneiden, um ihre akitven Stellen freizusetzen. Eine N-terminale Sequenzanalyse von reifem natürlichen Hin47-Protein legte nahe, dass die Spaltung des Präproteins bei KFFFG DRFAEQ (SEQ ID Nr: 23) stattfindet. Modifikationen von Aminosäuren, welche die Spaltung des Moleküls zur Herstellung des aktiven Protease-Moleküls verhindern, können ein Analogon von Hin47 mit verminderter Protease-Aktivität erzeugen.
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion von Plasmiden, welche das Hin47-Ser-197→Alanin-Analog aus E. coli exprimieren.
Das mutierte hin47*-Gen aus dem Plasmid DS-991-8 wurde in den pT7-7-Expressionsvektor kloniert, wodurch das Plasmid DS-1011-1-1 (5) erzeugt wurde. Der E. coli-Stamm BL21/DE3 wurde transformiert, um den E. coli-Stamm DS-1018-3-1 zu erzeugen, welcher das Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon nach Induktion exprimiert.
Um die Tetracyclin-Selektion zu verwenden, wurde das hin47*-Gen in pBR328 kloniert. Das Bgl II/Cla I-T7/hin47*-Genfragment aus DS-1011-1-1 wurde in pEVvrfl (Young und Davis, 1985) kloniert, um ein Bgl II/BamH I-Fragment zu erzeugen, welches in pUC-4K (Pharmacia) kloniert werden konnte, der mit BamH I verdaut war. Der resultierende Klon DS-1034-3 wurde mit EcoR I verdaut, und das T7/hin47*-Genfragment in pBR328 (Boehringer Mannheim Corporation) kloniert, um die Plasmide DS-1048-2 und DS-1067-2 zu erzeugen. Eine Elektroporation von Plasmid-DNA in den E. coli-Stamm BL21/DE3 führte zu den Stämmen DS-1071-1-1 und DS-1071-3-1, welche das Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon exprimieren.
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die Expression von Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon aus E. coli.
Eine Übernachtkultur der Stämme DS-1018-3-1, DS-1071-1-1 oder DS-1071-3-1 wurde über Nacht in NZCYM-Medium + 3 % Dextrose + Antibiotika (Ampicillin bei 25 μg ml^–1 oder Tetracyclin bei 10 μg ml^–1) bei 37°C unter Schütteln gezüchtet. Eine 1:40-Verdünnung der Übernachtkultur wurde in das gleiche Medium inokuliert und bei 37°C unter Schütteln herangezogen, bis die Extiaktion A57g ungefähr 0,3 war. Ein zehntel Volumen an 10%iger Lactose wurde dann zugegeben, um die Expression vom T7-Promotor aus zu induzieren. Zellproben wurden etwa 4 Stunden nach der Induktion durch Zentrifugieren von Kulturproben bei 5000 U/min während 10 Minuten in einer Sorval RC-3B bei 4°C geerntet.
Beispiel 7
Dieses Beispiel veranschaulicht die Extraktion und Reinigung von Hin47.
Hin47 wurde als lösliches Protein in E. coli exprimiert. Das Zellpellet aus einer 250-ml-Kultur, hergestellt wird beschrieben in Beispiel 6, wurde in 40 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, resuspendiert und durch Schallbehandlung bzw. Sonifikation (3 × 10 min, 70 % Leistungs-Zyklus) zerstört. Der Extrakt wurde bei 20 000 × g zentrifugiert, und der resultierende Überstand, welcher > 95 % des löslichen Hin47-Proteins enthielt, wurde beibehalten. Diese Fraktion wurde "Hin47-Extrakt" genannt.
Dieser Hin47-Extrakt wurde weiter auf einer DEAE-Sephacel-Säule gereinigt. Vierzig ml des Hin47-Extraktes wurden auf eine 20-ml-DEAE-Sephacel-Säule, äquilibriert in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, aufgetragen. Hin47 zeigte unter diesen Bedingungen eine Bindung an die Säule. Die Säule wurde mit 100 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, gewaschen und dann mit 100 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 20 mM NaCl, gewaschen. Hin47 wurde dann mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 40 mM NaCl, eluiert. Die Menge an Hin47 in den Fraktionen wurde durch den BCA-Protein-Assay bestimmt. Die Reinheit von Hin47 wurde durch SDS-PAGE-Analyse überprüft. Die Fraktionen, welche Hin47 enthielten, wurden vereinigt und bei –20°C aufbewahrt.
Nur die H91A-Mutante war so löslich wie das Wildtyp-Hin47-Protein, wobei die meisten der anderen Mutanten als Einschlusskörper produziert wurden.
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht die Extraktion und Reinigung von Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon.
Das Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon wurde in Einschlusskörpern in E. coli exprimiert. Das Zellpellet aus einer 250-ml-Kultur, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 6, wurde in 40 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung (3 × 10 min, 70 % Leistungs-Zyklus) zerstört. Der Extrakt wurde bei 20 000 × g zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde aufbewahrt. Das Pellet wurde erneut mit 40 ml 50 mM Tris-HCl, 0,5 % Triton X-100, 10 mM EDTA, pH 8,0, extrahiert. Die Suspension wurde 10 Minuten lang bei 70 % Leistungs-Zyklus schallbehandelt. Der Extrakt wurde 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde erneut bei 20 000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde aufbewahrt. Das Pellet wurde in 50 mM Tris-HCl, 0,5 % Triton X-100, 10 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert. Die Suspension wurde dann mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 8 M Harnstoff, gemischt. Die letztendliche Harnstoffkonzentration in der Mischung wurde mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, auf 2 M eingestellt. Das Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon wurde unter diesen Bedingungen vollständig solubilisiert. Das Endvolumen der Lösung belief sich auf 20 ml. Diese Fraktion wird "Hin47-Analogon-Extrakt" bezeichnet. Der Hin47-Analogon-Extrakt wurde ferner auf einer DEAE-Sephacel-Säule gereinigt. Zwanzig ml Hin47-Analogon-Extrakt wurden auf eine 10 ml-DEAE-Sephacel-Säule aufgetragen, welche in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, äquilibriert war. Das Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon zeigte unter diesen Bedingungen eine Bindung an die Säule. Die Säule wurde mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, gewaschen, und das Hin47-Analogon wurde mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, enthaltend 30 mM NaCl, eluiert. Die Menge an Hin47-Analogon in den Fraktionen wurde durch den BCA-Protein-Assay bestimmt. Die Reinheit des Hin47-Analogons wurde durch SDS-PAGE-Analyse überprüft (6). Die Fraktionen, welche Hin47-Analogon enthielten, wurde vereinigt und bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die Proteaseaktivität von Hin47 und Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon.
Die enzymatische Aktivität von Hin47 und von Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon wurde unter Verwendung von β-Casein als Substrat analysiert (7). Die Reaktionsmi schungen enthielten 5 μg β-Casein und entweder Hin47 oder Hin47-Analogon. Die Reaktion wurde zwei Stunden lang bei 37°C ausgeführt und dann durch Zugeben des SDS-Probenpuffers und unverzügliches Erhitzen der Probe während 5 Minuten bei 100°C gestoppt. Die Aliquots wurden durch SDS-PAGE analysiert. Wie in der 7 gezeigt, war der Verdau von β-Casein durch Hin47 nach zwei Stunden offensichtlicher (Tafel A, Spur 1) im Vergleich zu den Fraktionen, welche Hin47-Analogon enthielten (Tafel A, Spur 2) oder keinerlei exogene Proteine aufwiesen (Tafel A, Spur 3). Das Vorliegen von Hin47 oder Hin47-Analogon in diesen Mischungen wurde durch Immuno-Blotting unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Hin47 bestätigt (7, Tafel C, Spuren 1 und 2).
Die Protease-Aktivitäten von Hin47 und Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon wurden auch durch Analysieren des Selbstverdaus von Hin47 oder Hin47-Analogon bei 4°C und – 20°C verglichen. Das gereinigte Hin47 oder Analogon wurden entweder bei 4°C oder –20°C bis zu 20 Tage lang aufbewahrt. Aliquots wurden an den Tagen 0,10 und 20 entnommen, und die Stabilität von Hin47 oder Analogon wurde durch Immuno-Blotting unter Verwendung eines monoklonalen Hin47-Antikörpers analysiert (8). Das Analogon war bis zu 20 Tage viel stabiler als Hin47 bei Aufbewahrung entweder bei 4°C oder –20°C.
Um die Protease-Aktivität des Hin47-Ser-197→Alanin-Analogons weiter zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von Hin47 oder des Analogons, ein 80-kDa großes rekombinantes H.influenzae-Antigen abzubauen, untersucht. Somit wurde eine gemischte Antigen-Untersuchung durchgeführt, um den proteolytischen Effekt von Hin47 oder Hin47-Analogon auf ein anderes Antigen zu bestimmen. Es wurde ein 80 kDa großes rekombinantes H. influenzae-Protein (TBP1) für diese Untersuchung ausgewählt, um es von dem Hin47- oder Analogon-Protein (47 kDa) zu unterscheiden. Fünf Mischungen wurden wie folgend formuliert: 80-kDa-Protein allein; 80-kDa-Protein + Hin47; 80-kDa-Protein + Analogon; Hin47 allein; und Analogon allein. Die Menge an jedem Protein in der Mischung belief sich auf 5 μg. Die Mischungen wurden bei 4°C bis zu vier Wochen lang aufbewahrt. Aliquots wurden an den Tagen 0, 7, 14 und 28 für eine Analyse durch SDS-PAGE entnommen (9). Sowohl das 80-kDa-Protein als auch Hin47 waren nach einer Woche in großem Maße abgebaut (Spuren 2 und 4). Im Gegensatz dazu blieb das 80-kDa-Protein in Kombination mit Hin47-Analogon nach einer Woche unversehrt und zeigte sogar nach 4 Wochen lediglich einen geringfügigen Abbau (Spur 3).
Die restliche Protease-Aktivität von anderen Hin47-Analogen wurde unter Anwendung des Verdaus von β-Casein, wie beschrieben von Lipinska et al. (Ref. 13) untersucht, und die Ergebnisse hieraus sind in der Tabelle 3 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass nur eine Mutante (D121E) Serin-Protease-Aktivität beibehält.
Beispiel 10
Dieses Beispiel veranschaulicht die vergleichende Immunogenität von Hin47 und Hin47-Analogon in Mäusen.
Die Ergebnisse einer Untersuchung zur Bestimmung der vergleichenden Immunogenität von Hin47 und des Hin47-Ser-197→Alanin-Analogons sind in der 10 gezeigt. So erhielten Gruppen von fünf Ba1b/c-Mäusen dreimal (wie durch die Pfeile angezeigt) subkutan an den Tagen 1, 29 und 43 eine Injektion mit einer 1-μg-Dosis von entweder Hin47 oder Hin47-Analogon in Gegenwart von AlPO₄ (1,5 mg je Dosis). Blutproben wurden an den Tagen 14, 28, 42 und 56 (wie angegeben durch die Blutproben 1, 2, 3 bzw. 4) zum Analysieren der Anti-Hin47-Antikörper-Titer durch EIAs entnommen. Die Bestimmung von Anti-Hin47-Antikörpern in Maus-Seren wurde durchgeführt, wie beschrieben von Panezutti et al. (1993). Mikrotitervertiefungen wurden mit 1 μg entweder an Hin47 oder Hin47-Analogon 16 Stunden lang bei Raumtemperatur beschichtet. Danach wurden die Platten mit 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin in PBS blockiert. Die Maus-Seren wurden einer Verdünnungsreihe unterzogen, in die Vertiefungen gegeben und dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Affinitäts-gereinigte F(ab')₂-Fragmente von Ziege-Anti-Maus-IgG(Fc-spezifisch)-Antikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, wurden als der Zweitantikörper verwendet. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von Tetramethylbenzidin (TMB/H₂O₂) entwickelt, und Extinktionen wurden bei 450 nm (unter Verwendung von 540 nm als Bezugswellenlänge) in einem "Flow-Multiskan MCC"-Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Der reaktive Titer eines Antiserums wurde als der Kehrwert der Verdünnung definiert, welcher konsistent einen zweifachen Anstieg der Extinktion gegenüber derjenigen aufzeigte, welche mit der Serumprobe der Vorab-Blutentnahme erhalten wurde. Wie aus der 10 ersehen werden kann, riefen sowohl Hin47 als auch das Hin47-Analogon vergleichbare IgG-Titer in Mäusen hervor, ungeachtet dessen, ob Hin47 oder die Mutante als Antigen in EIAs verwendet wurde.
Immunogenitäts-Untersuchungen wurden auch unter Verwendung des H91A-Hin47-Analogons durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass dieses Analogon eine Immunantwort hervorbringt, äquivalent zu jener des S197A-Hin47-Analogons.
Um die Immunantwort gegen Hin47 oder das Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon weiter zu untersuchen, wurden die Unterklassen von Anti-Hin47-IgG in Maus-Seren bestimmt.
Mikrotiter-Vertiefungen wurden mit 1 μg gereinigtem Hin47 oder Analogon beschichtet. Die letzte Blutentnahme von Maus-Serumproben aus der vergleichenden Immunogenitätsuntersuchung (wie obenstehend beschrieben) wurden vereinigt und in EIAs getestet. Ratte-Anti-Maus-IgG₁-, IgG₂-, IgG₂b-Antikörper, welche an Meerrettich-Peroxidase konjugiert waren, und Kaninchen-Anti-Maus-IgG₃, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, wurden als Reagenzien in EIAs verwendet. Die Arbeitsverdünnung jedes Konjugats wurde unter Verwendung von gereinigten Antikörper-Unterklassen bestimmt, um eine Kreuzreaktivität zu vermeiden. Die reaktiven Titer wurden bestimmt, wie obenstehend beschrieben. Wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt, war das IgG-Unterklassenprofil, welches in Mäusen entweder durch Hin47 oder Hin47-Analogon induziert wurde, identisch, ungeachtet dessen, ob Hin47 oder das Analogon als ein Feststoff-Antigen in den EIAs verwendet wurde. Die vorherrschende IgG-Antwort in beiden Gruppen von Maus-Seren war vom IgG₁-Isotyp. Somit zeigte das Hin47-Analogon im Wesentlichen die gleichen immunogenen Eigenschaften wie das natürliche Protein.
Beispiel 11
Dieses Beispiel veranschaulicht die immunprotektiven Eigenschaften von Hin47 und Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon.
Die immunprotektiven Eigenschaften von Hin47 und Hin47-Ser-197→Alanin-Analogon wurden durch das Vermögen von Hin47-spezifischen Antiseren, junge Ratten gegen den H. influenzae-Typ b-Stamm MinnA in einem Bakterämie-Modell zu schützen, analysiert. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. Gruppen von neun 6-Tage alten Wistar-Jungratten wurden subkutan (s. c.) auf dem Rücken nahe am Hals mit 0,1 ml von entweder einem Kaninchen-Anti-Hin47-Analogon-Antiserum oder dem entsprechenden Vorab-Blutentnahme-Serum inokuliert. 24 Stunden später wurden die Tiere intraperitoneal (i. p.) mit 700 cfu bzw. koloniebildenden Einheiten des frisch gezüchteten Hib-Stammes MinnA herausgefordert. Blutproben wurden 20 Stunden nach der Herausforderung abgenommen, und auf Schokolade-Agar-Platten ausplattiert. Die Bakerienkolonien wurden nach 24 Stunden gezählt. Wie in der Tabelle 2 gezeigt, zeigten drei von neun Tieren in der Gruppe, welche mit Anti-Hin47-Analogon-Antiserum inokuliert worden war, keinerlei Bakterämie in ihrem Blut. Lediglich eine Maus in der Gruppe, welche mit Anti-Hin47-Analogon-Antiserum inokuliert worden war (11 %), besaß eine höhere Bakterienzurückgewinnung aus der Blutprobe im Vergleich zu Mäusen, welche mit einem Serum der Vorab-Blutentnahme inokuliert worden waren. Im Gegensatz dazu wurden Bakterien aus allen neun Mäusen zurückgewonnen, welche mit Serum der Vorab-Blutentnahme inokuliert worden waren. Vier von neun Tieren (44 %) in der Gruppe, welche mit Serum der Vorab-Blutentnahme inokuliert worden war, zeigten hohe Spiegel (500 bis 1000) an Bakterien, welche in den Blutproben zurückgewonnen wurden.
Das Jungratten-Modell der Bakterämie wurde angewandt, um den Schutz zu untersuchen, welcher von Anti-Hin47- oder Anti-Hin47-Mutante-Antiseren gegen Bakterämie, welche durch Infektion mit H. influenzae-Typ b verursacht wurde, verleihen wurde. 6/10 Jungratten wurden durch Antiseren geschützt, welche jeweils gegen Wildtyp-Hin47, H91A-Hin47- und S 197A-Hin47-Analoga herangezogen worden waren.
Beispiel 12
Dieses Beispiel veranschaulicht die Induktion von Hin47 unter Stressbedingungen.
Der H. influenzae-Stamm Eagan wurde bei 37 °C zu einer A₅₉₀ ≈ 0,3 in Gehirn-Herz-Infusions-Nährmedium (BHI), enthaltend Hämin (2 μg ml^–1) und NAD (2 μg ml^–1) herangezogen. Die Probe wurde aliquotiert und bei 37 °C, 42 °C, 43,5 °C oder in Gegenwart von 6 % Ethanol, 0,2 M NaCl oder 0,3 M NaCl herangezogen. Der E. coli-Stamm JM 109 wurde bei 37°C zu einer A₅₉₀ von ≈ 0,3 in YT-Medium herangezogen und wie beschrieben aliquotiert. Die Proben wurden bei 0 min, 20 min, 40 min, 60 min und 90 min genommen und durch OD und SDS-PGE/Western-Blot analysiert. Meerschweinchen-Antiseren, welche sowohl H. influenzae-Hin47 als auch E. coli-htrA erkannten, wurden für die Western-Blot-Analyse verwendet. Das E. coli-htrA-Protein wurde in großen Mengen hergestellt, wenn der Organismus bei 43,5°C gezüchtet wurde, und eine kleine Menge des H. influenzae-Hin47-Proteins kann beobachtet werden. Beim Wachstum in Medien, enthaltend 6 % Ethanol, werden sowohl das E. coli-htrA- als auch das H. influenzae-Hin47-Protein induziert. Die Hochsalzbedingungen waren nicht ausreichend, um eines der beiden Proteine zu induzieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hin47 ein Stress-Antwortprotein in H. influenzae ist, welches unter ähnlichen Bedingungen zu dem E, coli-htrA-Protein induzierbar ist.
Beispiel 13
Dieses Beispiel veranschaulicht die Reinigung des H91A-Hin47-Proteins.
Die lösliche H91A-Mutante wurde im Wesentlichen so gereinigt, wie beschrieben für das Wildtyp-Hin47 in Beispiel 7, unter Hinzufügung einer Hydroxylapatit (HAP)-Säule. Die HAP-Säule wurde in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) äquilibriert, und der Durchlauf aus der DEAE-Säule wurde aufgetragen. Das H91A-Hin47 zeigte eine Bindung an die HAP-Säule, und kontaminierende Proteine wurden durch Waschen der Säule mit 175 mM Natriumphosphat-Puffer entfernt. Das H91A-Hin47-Protein wurde mit 300 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 8,0) eluiert und bei –20 °C aufbewahrt.
Beispiel 14
Dieses Beispiel veranschaulicht die Schutz-Untersuchungen mit Hin47 und Hin47-Mutanten im Chinchilla-Modell der Mittelohrentzündung.
Das Chinchilla-Modell der Mittelohrentzündung (Ref. 14) wurde angewandt, um den Schutz zu untersuchen, welcher durch eine aktive Immunisierung mit Wildtyp-Hin47, H91A-Hin47 oder S197A-Hin47 induziert wurde.
Chinchillas (~ 500 g Gewicht) wurden i. m. dreimal mit 30 μg/Dosis an Hin47 oder Hin47-Mutante (H91A oder S197A), vorgelegt in dem Adjuvans AlPO₄, an den Tagen 1, 28 und 42 immunisiert. Die Tiere wurden am Tag 56, durch die Bulla, mit 50 – 1000 cfu virulenten NTHi-Stamm-SB 12-Organismen herausgefordert. Die Tiere wurden durch Tympanometrie und otoskopische Untersuchung überwacht und 4 Tage nach der Herausforderung wurden Mittelohr-Fluida abgesaugt und auf Schokoladen-Agar ausplattiert. Bakterienkolonien wurden nach 24 Stunden gezählt. Die Wildtyp-Hin47- und H91A-Hin47-Proteine gewährten einen Schutz für ~50 % der Tiere, aber das S 197A-Hin47 war in diesem Modell nichtprotektiv (Tabelle 3).
Zusammenfassung der Beschreibung
Als Zusammenfassung dieser Beschreibung sieht die vorliegende Erfindung neue Analoga des Haemophilus influenzae-Hin47-Proteins, welche eine verminderte Protease-Aktivität von weniger als etwa 10 % von jener des natürlichen Hin47-Proteins aufweisen, sowie isolierte und gereinigte DNA-Moleküle, welche für selbige codieren, vor.
Tabelle 1
Tabelle 2
Gruppen von neun 6 Tage alten Jungratten wurden s. c. entweder mit einem Kaninchen-Anti-Hin47-Mutanten-Antiserum oder dem entsprechenden Vorab-Blutproben-Serum immunisiert. Die Tiere wurden i. p. mit 700 cfu H. influenzae-Stamm MinnA nach 24 Stunden herausgefordert. Die Blutproben wurden 20 Stunden nach der Herausforderung abgenommen.
Anti-Hin47*-Antikörper: Kaninchen-Immunserum, welches gegen gereinigte Hin47-Mutante in CFA/IFA bzw. vollständigem/unvollständigem Freund'schen Adjuvans herangezogen worden war.
Durchschnittliche Bakterienzurückgewinnung aus der immunisierten Gruppe: 100 cfu pro 2,5 μl Blut; aus Kontrollgruppe: 290 cfu pro 2,5 μl Blut.
Tabelle 3 Charakterisierung von Hin47-Mutanten
Liste der Literatur-Bezugsstellen

1. Zangwill et al., 1993 MMWR 42:1–15.
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Claims

Ein isoliertes und gereinigtes Analogon von Haemophi/us inf/uenzae Hin47-Protein mit einer verminderten Protease-Aktivität, die weniger als 10 % von jener von Wildtyp Hin47-Protein beträgt.
Das Analogon gemäß Anspruch 1, das die gleichen immunogenen Eigenschaften wie natürliches Hin47-Protein aufweist.
Das Analogon gemäß Anspruch 1 oder 2, worin wenigstens eine Aminosäure des natürlichen Hin47-Proteins, die zur Protease-Aktivität beiträgt, deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt worden ist, oder worin wenigstens eine Aminosäure in das natürliche Hin47-Protein insertiert worden ist, um die verminderte Protease-Aktivität bereitzustellen.
Das Analogon gemäß Anspruch 3, worin die wenigstens eine deletierte oder ersetzte Aminosäure aus den Aminosäuren 195 bis 201, Histidin-91 oder Asp-121 des natürlichen Hin47-Proteins ausgewählt ist, wobei die Aminosäuresequenz des natürlichen Proteins beginnend von Thr (27) in der Sequenz Thr-Leu-Pro, die in der in 2 dargestellten Sequenz von Hin47 auftritt, nummeriert wird.
Das Analogon gemäß Anspruch 4, worin die wenigstens eine Aminosäure Serin-197 ist.
Das Analogon gemäß Anspruch 5, worin Serin-197 durch Alanin, Cystein oder Threonin ersetzt wird.
Das Analogon gemäß Anspruch 4, worin die wenigstens eine Aminosäure Histidin-91 darstellt, die durch Alanin, Lysin oder Arginin ersetzt wird.
Das Analogon gemäß Anspruch 4, worin die wenigstens eine Aminosäure Asp-121 ist, die durch Alanin ersetzt wird.
Das Analogon gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8, worin mehrere Aminosäuren deletiert oder ersetzt werden.
Das Analogon gemäß Anspruch 9, worin die mehreren Aminosäuren His-91 und Ser-197 oder His-91, Asp-121 und Ser-197 sind und jede deletiert oder durch Alanin ersetzt ist.
Ein chimäres Molekül, umfassend ein Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, das an ein Polypeptid, ein Protein oder ein Polysaccharid gebunden ist.
Ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein mutiertes Haemophi/us influenzae hin47-Gen, das ein Analogon von Haemophi/us influenzae Hin47-Protein gemäß einem der Ansprüche 1–10 codiert.
Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12, worin wenigstens ein Codon eines Wildtyp hin47-Gens, der eine Aminosäure codiert, die zur Protease-Aktivität beiträgt, deletiert oder ersetzt worden ist, oder worin wenigstens ein Codon in das Wildtyp hin47-Gen insertiert worden ist, um das mutierte hin47-Gen zu bilden.
Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12 oder 13, worin das mutierte Gen durch ortsgerichtete Mutagenese eines Wildtyp hin47-Gens gebildet wird.
Ein rekombinantes Plasmid, geeignet für eine Transformation eines Wirts, umfassend einen Plasmidvektor, in den ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14 insertiert worden ist.
Das rekombinante Plasmid gemäß Anspruch 15, das das Plasmid DS-1011-1-1 (pT7/Hin47*), hinterlegt unter der ATCC Bezugsnr. 75845, darstellt.
Eine transformierte Zelle, die das rekombinante Plasmid gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16 enthält.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Analogons von Haemophi/us influenzae Hin47-Protein mit einer verminderten Protease-Aktivität, die weniger als 10 % des natürlichen Hin47-Proteins beträgt, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, das folgendes umfasst: Identifizieren von wenigstens einem Aminosäurerest des Hin47-Proteins, der zur Protease-Aktivität davon beiträgt; Durchführen einer ortsgerichteten Mutagenese des hin47-Gens, um eine Nukleotidsequenz, die diese wenigstens eine Aminosäure codiert, zu entfernen oder zu ersetzen, und um ein mutiertes hin47-Gen zu produzieren; Einführen des mutierten hin47-Gens in eine Zelle, um eine transformierte Zelle zu produzieren; und Züchten der transformierten Zelle, um das Hin47-Analogon zu produzieren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 18, worin die Einführung des mutierten hin47-Gens eine transformierte Zelle produziert, in der das mutierte hin47-Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors steht, und worin das Züchten der transformierten Zelle und die Expression des Hin47-Analogons durch den T7-Promotor durch Kultivieren in einer induzierenden Konzentration von Lactose durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 19, worin die Einführung des mutierten hin47-Gens durch Transformieren der Zelle mit dem rekombinanten Plasmid DS-1011-1-1 (pT7/Hin47*), hinterlegt unter der ATCC Bezugsnr. 75845, durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, worin der Züchtungsschritt gezüchtete transformierte Zellen produziert, die Einschlusskörper enthalten, die das Hin47-Analogon enthalten, und ferner umfassend: Zerstören der gezüchteten transformierten Zellen, um einen Überstand und die Einschlusskörper zu produzieren; Solubilisieren der Einschlusskörper, um eine Lösung zu produzieren, die das Hin47-Analogon enthält; chromatographisches Reinigen des Hin47-Analogons aus der Lösung ohne Zelldebris; und Isolieren des gereinigten Hin47-Analogons.
Eine immunogene Zubereitung, umfassend eine immunwirksame Menge eines Analogons von Hin47 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14.
Die immunogene Zubereitung gemäß Anspruch 22, formuliert als ein Impfstoff zur in vivo Verabreichung an einen Wirt, um Schutz gegen Erkrankungen zu verleihen, die durch ein bakterielles Pathogen verursacht werden, das das Hin47-Protein oder ein Protein, das fähig ist, in dem Wirt Antikörper zu induzieren, die mit dem Hin47-Protein spezifisch reagieren, produziert.
Die immunogene Zubereitung gemäß Anspruch 23, worin das bakterielle Pathogen eine Haemophi/us Spezies darstellt.
Die immunogene Zubereitung gemäß Anspruch 24, worin die Haemophilus Spezies Haemophilus infiuenzae ist.
Die immunogene Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, die zusätzlich wenigstens ein weiteres immunogenes oder immunstimulierendes Material umfasst.
Ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch mit dem Hin47-Protein reagieren, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen der Probe mit dem Hin47-Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von Komplexen, die das Hin47-Analogon und die Antikörper in der Probe, die spezifisch damit reagieren, umfassen; und (b) Bestimmen der Bildung der Komplexe.
Ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Hin47-Protein in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen der Probe mit den Antikörpern, die für das Hin47-Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 spezifisch sind, um Komplexe herzustellen, die Hin47-Protein, das in der Probe vorliegt, und die Antikörper, die für das Hin47-Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 spezifisch sind, umfassen; und (b) Bestimmen der Bildung der Komplexe.
Ein diagnostisches Kit zum Bestimmen des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe, die spezifisch mit dem Hin47-Protein reagieren, umfassend: (a) das Hin47-Analogon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10; (b) Mittel zum Inkontaktbringen des Analogons mit der Probe, um Komplexe herzustellen, die das Analogon und diese Antikörper, die in der Probe vorliegen, umfassen; und (c) Mittel zum Bestimmen der Bildung der Komplexe.