CN101824424B - 基于b7-2-pe40外毒素融合基因的dna疫苗及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ IDNO：1)。本发明还涉及包含与真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ ID NO：1)的重组表达载体。本发明还涉及所述重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎的DNA疫苗的用途，以及包含本发明所述重组核酸构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。本发明进一步的还涉及治疗类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述DNA疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ IDNO：1)。本发明还涉及含有与真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ ID NO：1)组成的重组表达载体。本发明还涉及所述重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎的DNA疫苗的用途，以及包含本发明所述重组核酸构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。本发明进一步的还涉及治疗类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述DNA疫苗。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种抗原驱动由CD4+CD28+Th1细胞介导的慢性全身性自身免疫性疾病，主要累及各关节，以滑膜及邻近组织的炎性病变为主要特征。该疾病的预后较差，80％的病人20年后关节变形残疾，丧失劳动力。
DNA疫苗是将携带抗原编码基因的质粒直接注人动物体内，通过在动物细胞中表达抗原蛋白以诱导动物产生免疫保护作用。与传统疫苗相比，DNA疫苗具有如下优点：1、不必提取靶蛋白，不必在体外原核或真核表达，也不必对表达产物进行纯化、加工；2、易操作性和稳定性；3、外源基因在体内存在时间长，不断表达外源蛋白，可以持续给免疫系统提供刺激；4、能用各种投递疫苗的方法；5、具有热稳定性；6、可规模化生产；7、不仅能防病，还能有效治病。1993年Ulmer等[Ulmer JB，et al.Science，1993，259(5102)：1745-1749]首次报道了肌肉注射质粒DNA可保护小鼠抵抗流感和疟疾，标志着DNA疫苗的诞生。它的出现代表了新的、具有潜力的疫苗发展途径和研究方向，被誉为继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗。在随后的十多年里，DNA疫苗被不断的完善和发展，由最初给动物注射重组质粒DNA能引起外源蛋白在机体的表达，到所表达的外源蛋白能同时引起机体的体液免疫反应和细胞免疫反应，再到该免疫反应能保护机体免受相应病源的致命性打击。DNA疫苗在各种小动物疾病模型中取得的成功大大推动了其在临床上的研究及应用。
尽管现有技术对类风湿性关节炎以及基因治疗和DNA疫苗等有了较详尽的公开，但是，有关类风湿性关节炎的DNA疫苗尤其是否可以通过诱导免疫耐受或/和免疫调节性细胞的策略采用基因治疗性疫苗直接有效的治疗，哪些类型的DNA疫苗可能有效预防或治疗类风湿性关节炎，带有B7-2-PE40外毒素融合基因的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40重组核酸构建体是否能够在动物体内有效表达、所表达的产物是否具有生物学功能、以及该重组核酸构建体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40是否可以直接作为有效预防或治疗类风湿性关节炎的疫苗，这些问题在现有技术中尚无任何教导。
因此，提供一种可有效预防或治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗仍是本领域技术人员急需解决的。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQID NO：1)。本发明的又一方面，涉及包含本发明所述重组核酸构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。
本发明人在研究中令人意外地发现，转染入真核细胞的重组核酸构建体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40经转录、翻译和翻译后修饰被分泌到胞外，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40可在真核细胞中高效表达并且表达产物具有很好的靶向免疫抑制活性；发明人还发现，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗可以有效地预防和治疗大鼠类风湿性关节炎，本发明基于这些发现而得以完成。
因此，本发明提供的各个方面和特征概述如下：
本发明的一个方面涉及一种重组核酸构建体，其含有与表达调控序列有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ ID NO：1)。在本发明中，所述表达调控序列用于在真核宿主细胞中实现B7-2-PE40外毒素融合基因的有效表达。
本发明中，所述表达调控序列选自CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I。
本发明的又一方面涉及一种重组表达载体，其含有与选自pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ ID NO：1)。
在本发明的一个具体实施方案中，所述重组表达载体含有与真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因。
本发明的另一方面，涉及所述重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎的DNA疫苗的用途。
本发明的再一方面，涉及一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗，其包含与表达调控序列有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因。在本发明中，所述表达调控序列用于在真核宿主细胞中实现B7-2-PE40外毒素融合基因的有效表达。
本发明的又一方面，涉及一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗，其包含一种重组表达载体，其含有与选自pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因。
在本发明的一个具体实施方案中，所述DNA疫苗中所包含的重组表达载体，其含有与真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因。
在本发明中，所述的DNA疫苗还可以包含医药学上可接受的免疫佐剂。
在本发明的一个实施方案中，所述DNA疫苗用于以注射、粘膜、基因枪导入等方式实施免疫；优选的，其用于以至少一种选自静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔内注射的方式实施免疫。
在本发明的又一实施方案中，所述DNA疫苗为可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。
本发明的又一方面，提供一种制备DNA疫苗的方法，其包括将包含SEQ ID NO：1所示DNA序列的B7-2-PE40外毒素融合基因与pcDNA3.1/Zeo(+)载体共同构建的步骤。
根据本发明所述制备DNA疫苗的方法，其包括以下步骤：
1)分别设计含有信号肽及KpnI酶切位点的上游引物P1，及含有确XbaI酶切位点的下游引物P2，其中所述引物的序列如下：
上游引物P1：5’-CGGGGTACCTGTT
(SEQ ID NO：2)
[其中，加单下划线的为KpnI酶切位点；加双下划线的为起始密码子及信号肽编码序列]
下游引物P 2：5’-GCTCTAGATTACTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTG-3’(SEQ IDNO：3)
[其中，加单下划线的为Xba I酶切位点]；
2)以原核表达载体pRSETA-B7-2-PE40KDEL质粒为模板，采用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增；
3)将PCR扩增产物回收，并用KpnI+XbaI双酶切上述回收产物及pcDNA3.1/Zeo(+)载体，电泳后回收酶切产物；
4)回收酶切产物；
5)将双酶切后的PCR产物与pcDNA3.1/Zeo(+)载体连接；
6)挑取具有Amp抗性的阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定，菌株冻存；和
7)培养菌株，提取并纯化DNA疫苗治疗用质粒，以及任选地，
8)将所获得的质粒与医药学上可接受的免疫佐剂混合。
本发明的又一方面，提供一种在有需要的哺乳动物中预防和/或治疗自身免疫性疾病特别是类风湿性关节炎的方法，其包括向所述哺乳动物施用预防和/或治疗有效量的本发明所述DNA疫苗，所述的DNA疫苗包含一种重组核酸构建体，其包含与表达调控序列有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQ ID NO：1)的；或者含有重组表达载体，其与选自pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-2-PE40外毒素融合基因。
B7-2-PE40测定序列及开放阅读框架(SEQ ID NO：1)分析如下：
1 gctagcgtttaacttaagcttggtacctgtt KpnI酶切位点
32 atggatggactgagtaacattctctttgtgatggccttcctgctc
起始密码子和信号肽
M
77 tctggtgctgctcctctgaagattcaagcttatttcaatgagact
122 gcaggcctgccgtgccaatttgcaaactctcaaaaccaaagcctg
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K P P R E D L K *
终止密码子和XbaI酶切位点
下面进一步详细地描述本发明。
用于本文的术语“哺乳动物”是指可能罹患、即将罹患、或已经罹患本发明所述自身免疫性疾病的受试者，其包括但不限于猪、狗、猫、牛、羊等家畜和人类。优选地，所述的哺乳动物是人类。
用于本文的术语“预防”是指所述哺乳动物处于可能发生、即将发生所述自身免疫性疾病的情况下使用本发明的DNA疫苗预防该自身免疫性疾病的发生。
用于本文的术语“治疗”是指所述哺乳动物已经罹患或已经发生所述自身免疫性疾病的情况下使用本发明的DNA疫苗，使该自身免疫性疾病减轻、缓解、延缓、阻止、消除或治愈等。
本发明的DNA疫苗可以是可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。优选的，所述的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂是通过本领域公知的无菌操作工艺制备的；并且还优选的，它们在贮藏、运输、使用过程中均呈无菌状态。
根据本发明，所述的药物组合物可以是本领域公知的任何可用于给药的药物形式，包括药物组合物、药物制剂、药盒等。虽然本发明所述用途中涉及的DNA疫苗可以经注射、粘膜等途径施用，并且这些施用方式也是本发明的一部分。但是，本领域技术人员清楚，适合于本发明所述用途的最优选施用途径是胃肠外途径或经注射方式施用。对于本发明的实施而言，所述的药物组合物优选是用于胃肠外给药的制剂，包括但不限于局部注射用制剂和全身注射用制剂，具体剂型包括但不限于注射用溶液剂和注射用粉针剂。更优选的，所述的药物是无菌的注射用含水溶液剂，或者是无菌的用于临床使用前用注射用水复溶配制的粉针剂，特别是冷冻干燥粉针剂。在制成冷冻干燥粉针剂时，其中还可以含有医药学上可接受的赋形剂，例如甘露醇。
本发明的DNA疫苗可以通过本领域公知的方法导入生物体内。所述的导入方法包括，但不限于，肌肉注射、基因枪导入法、③黏膜免疫、静脉注射法、腹腔注射法等，更详细的可以参考Alpar HO，et al.Expert Opin Drug Deliv，2005，2：829-842所公开的，该文献以其整体内容通过引用并入本文。
另外，根据下文中提供的研究结果，本领域技术人员可以容易地确定在其它哺乳动物中使用时有效剂量，特别是用于人时的有效剂量。可以将一天的剂量在一天中一次性全部给与受试者，也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔施用。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应量。当然，也可以以一定的时间周期施用，例如一天施用一次、两天施用一次、一周施用一次、一月施用一次、二月施用一次、三月施用一次、六月施用一次、一年施用一次、两年施用一次等。
本发明所述的DNA疫苗或药物组合物在用于具体的临床案例时，它们的具体使用量可因多种因素而可能需要作相应的变化，这些因素包括但不限于：受试者病况的严重程度，受试者的年龄、性别、体重，施用途径，药物剂型等等。
本文提及的参考文献、专利说明书、专利申请说明书等，均可以作为本申请的参考，并且以其整体内容通过引用并入本文。
根据本发明，可有效地将含有pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗用于预防或治疗自身免疫性疾病特别是类风湿性关节炎。
词语解释：
本发明涉及的部分缩略词及其中英文对照如下：
| 英文缩写 | 英文全称 | 中文译名 |
| CIA | collagen induced arthritis | 胶原诱导的关节炎 |
| CII | type II collagen | II型胶原 |
| CCII | chicken alpha 1 type IIcollagen | 鸡II型胶原 |
| CD | cluster of differentiation | 白细胞分化抗原 |
| CFA | complete freund’s adjuvant | 完全弗氏佐剂 |
| DC | dendritic cell | 树突状细胞 |
| DMEM | Dulbecco’s modified eagle media | DMEM培养基 |
| DMARD | disease modifying anti-rheumatic drug | 改变病情抗风湿药 |
| ELISA | enzyme linked immunosorbent assay | 酶联免疫吸附法 |
| ECL | enhanced chemiluminescence | 增强化学发光 |
| IFA | incomplete freund’s adjuvant | 不完全弗氏佐剂 |
| Ig | Immunoglobulin | 免疫球蛋白 |
| IFNγ | Interferonγ | 干扰素γ |
| IL | Interleukin | 白细胞介素 |
| MTX | Methotrexate | 甲氨蝶呤 |
| MTT | methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide | 甲基噻唑基四氮唑盐 |
| PAGE | polyacrylamide gel electrophoresis | 聚丙稀酰胺凝胶电泳 |
| PCR | polymerase chain reaction | 聚合酶链反应 |
| PBS | phosphate buffered saline | 磷酸缓冲液 |
| PEA | Pseudomonas aeruginosa exotoxin A | 绿脓杆菌外毒素A |
| PMA | phorbol myristate acetate | 佛波脂 |
| RA | rheumatoid arthritis | 类风湿关节炎 |
| Treg | regular T cell | 调节性T细胞 |
| Ts | suppressor T cell | 抑制性T细胞 |
| TGFβ | transformation growth factorβ | 转化生长因子-β |
| TMB | tetramethyl benzidine | 四甲基联苯胺 |
附图说明
图1是真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40构建示意图，其中S为信号肽序列，图1A是pcDNA3.1/Zeo(+)真核表达载体图谱。
图2是琼脂糖电泳分析经PCR扩增B7-2-PE40的结果。其中1为DNA标志物，2为B7-2-PE40 PCR扩增产物。
图3是琼脂糖电泳分析KpnI+XbaI双酶切重组质粒pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40结果。其中1为DNA标志物，2为KpnI+XbaI双酶切重组质粒pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40。
图4是转染CHO-K1-RPE.40细胞后RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。其中A：B7-2-PE40 PCR扩增结果；B：β-actin PCR扩增结果。其中：1是DNA标志物，2是转染pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDEL的CHO-K1-RPE.40细胞；3是转染pcDNA3.1/Zeo(+)空载体的CHO-K1-RPE.40细胞；4为中国仓鼠卵巢细胞抗绿脓杆菌外毒素细胞株。
图5是Western Blot检测B7-2-PE40融合蛋白在真核细胞中的分泌表达的结果。
图6是经Zeo筛选后获得稳定转染CHO-K1-RPE.40细胞株的RT-PCR验证结果。其中8、10、12、13、14、15、16、20、21、22、28为阳性克隆，阳性率37％
图7是真核表达产物B7-2-PE40的选择性细胞抑制活性比较结果。
图8是琼脂糖电泳分析pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒肌肉注射后体内表达结果。
图9显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗肌肉注射后体内CD28+T细胞清除状况。
图10显示预防性给予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗对CIA大鼠四肢关节肿胀程度的影响。
图11显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对CIA大鼠四肢关节肿胀程度的影响。
图12显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对CIA大鼠外周血CD4+CD25+Treg细胞的影响。
图13是采用流式细胞仪分析外周血CD4+CD25+Treg细胞比例的部分代表图。
图14显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对CIA大鼠外周血CD8+CD28-Ts细胞的影响。
图15是采用流式细胞仪分析外周血CD8+CD28-Ts细胞比例的部分代表图。
图16显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对CIA大鼠外周血CD28+T细胞的影响。
图17是采用流式细胞仪分析外周血CD28+T细胞比例的部分代表图。
图18显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对Th1/Th2细胞比例的影响。
图19显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对Th1/Th2比值的影响。
图20显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对CD4/CD8比值的影响。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
实施例1：pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA
疫苗真核表达载体的构建与鉴定。
1.材料与方法
1.1.质粒、细胞及主要试剂
pRSETA-B7-2-PE40KDEL/BL21 pLysE原核表达载体由本室构建。表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)、ZeocinTM、Trizol及LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。Jurkat和Raji细胞系购自美国ATCC(美国标准生物品收藏中心)。CHO-K1-RPE.40细胞系(中国仓鼠卵巢细胞抗绿脓杆菌外毒素细胞株)亦购自美国ATCC；PEA多抗、CD86单抗及TMB底物显色液购自Sigma公司。PVDF膜与Amicon Ultra-4购自Millipore公司。ECL购自Pierce公司。MTS(CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)及PureYieildTM plasmid midiprep system购自Promega公司。KpnI酶、XbaI酶及T4连接酶购自TaKaRa公司。2×Pfu PCR MasterMix购自TIANGEN公司。QIAquick Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司。
1.2.主要仪器
9700 PCR仪(PerkinElmer)，
紫外检测仪(Beckman)，MiniII型蛋白电泳仪及蛋白半干电转仪(Bio-Rad)，Gel-Pro3.1凝胶成像系统(Media Cybemetic)。
1.3.真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40的构建
分别设计含有信号肽及KpnI酶切位点的上游引物P1，及含有XbaI酶切位点的下游引物P2。引物序列如下：
上游引物P1：5’-CGGGGTACCTGTT
[其中，加单下划线的为Kpn I酶切位点；加双下划线的为起始密码子及信号肽编码序列]
下游引物P2：5’-GCTCTAGATTACTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTG-3’(SEQ IDNO：3)
[其中，加单下划线的为XbaI酶切位点]
以原核表达载体pRSETA-B7-2-PE40KDEL质粒为模板，采用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增体系如下：
PCR反应条件如下：96℃预变性5min，96℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将PCR扩增产物回收，并用KpnI+XbaI双酶切上述回收产物及pcDNA3.1/Zeo(+)载体，电泳后回收酶切产物。酶切体系如下：
混匀后37℃水浴3h。
将酶切产物按如下步骤回收：
1)用干净刀片将目的条带从琼脂糖凝胶上切下放入1.5ml Ep管中。
2)称量凝胶的重量，按100mg的凝胶加300μl的缓冲剂QG加入相应体积的溶胶液。
3)50℃水浴孵育10min直至胶完全溶解，其间每2-3min上下颠倒以彻底混匀。胶完全溶解后，颜色应变为黄色。
4)加入1倍体积的异丙醇，充分混匀。
5)将样品加入QIAquick柱，离心1min。弃掉废液，加0.5ml缓冲剂QG，离心1min。
6)弃掉废液。加0.75ml的缓冲剂PE，放置2min-5min，离心1min。
7)弃掉废液，离心1min。后将柱放于1.5ml的干净Ep管中。
8)将30μl注射用水加入柱膜中央，放置1min后离心1min收集洗脱液。
将双酶切后的PCR产物与pcDNA3.1/Zeo(+)载体连接，体系如下：
将连接管至于4℃冰水混合物中连接过夜。
将连接产物按如下方法转化入TOP10感受态菌中。具体操作如下：
1)将连接产物10μl、试剂A 20μl用无菌水稀释至100μl，冰上备用。
2)冰上融化入TOP10感受态菌(5min)，加入上述稀释备用质粒。
3)冰上放置15min，后37℃放置1min。铺板，37℃过夜。
挑取具有Amp抗性的阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定(条件同前)，阳性者送TaKaRa公司测序确认。
将鉴定序列正确的菌株冻存并大量培养，采用PureYieildTM质粒中提试剂盒大规模提取并纯化DNA疫苗治疗用质粒。提纯的质粒溶解于生理盐水中，260/280≥1.80.浓度＞1.0μg/μl。
1.4.重组质粒pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40在CHO-K1-RPE.40
细胞中的瞬时表达
采用脂质体介导方法，将0.5×105-2×105CHO-K1-RPE.40细胞传入24孔板(培养基为DMEM/F12，7.5％FBS，1×非必需氨基酸)，培养基0.5ml。0.8μg质粒和2.0μl LipofectamineTM2000分别用50μlOPTI-MEM I培养基稀释，两者混合孵育20min，缓慢加入24孔板中。37℃、5％CO2孵育6h后，更换为完全DMEM培养基。48h后收集培养细胞及上清，采用RT-PCR及Western印迹进行检测。
1.5.RT-PCR检测转染细胞中B7-2-PE40外毒素融合蛋白的
mRNA
转染48h后，将生长的CHO-K1-RPE.40细胞用PBS清洗两次，参照说明书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后逆转录合成cDNA，分别用上述引物P1、P2进行PCR扩增，并采用β-actin作为参比对照。
反转录体系如下：
反应条件为42℃30min，99℃5min，5℃5min。
PCR反应体系如下：
反应条件如下：96℃预变性5min，96℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
人β-actin引物序列为：
上游引物P5：5’AGA AAA TCT GGC ACC ACA CC 3’(SEQ ID NO：4)
下游引物P6：5’AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG 3’(SEQ ID NO：5)
1.6.Western印迹检测转染细胞B7-2-PE40外毒素融合蛋白的
表达
1)蛋白电泳：转染CHO-K1-RPE.40细胞48h后，收集培养上清并利用Amicon Ultra-4将其浓缩。取15μl样品与15μl×SDS Loading缓冲剂混匀，煮沸5min，行SDS-PAGE蛋白电泳，80V电压电泳至蛋白泳出积层胶，后行160V电泳至分离胶底部，断开电源。
2)转膜：电转至PVDF膜。PVDF膜选用Immobilon-P。在甲醇浸泡15s，水中泡2min，电转液中泡20min，同时将滤纸及胶泡电转液15min，按+(白色)/三层滤纸/膜/胶/三层滤纸/黑色。转膜条件：60mA40min。
3)使用封闭液室温封闭2h；
4)加入以适当比例用封闭液稀释的一抗，PEA多抗或CD86单抗4℃过液；
5)TBST洗涤3次，每次5min；
6)加入以适当比例用封闭液稀释的HRP-抗兔或小鼠IgG二抗，室温孵育1h；
7)TBST洗涤3次，每次10min；
8)采用ECL方法曝光显影、定影。
以上步骤1)的蛋白电泳配方如下：
1.7.重组质粒pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40稳定转染CHO-K1-
RPE.40细胞
采用脂质体介导方法，具体操作同1.4。转染24h后，1∶10稀释转染细胞，按700μg/ml浓度加入ZeocinTM，每隔3d换液一次，待抗性克隆逐渐增大后将其转至24孔板，长满后传至6孔板中继续培养，并扩增多瓶。用RT-PCR方法进行鉴定，将阳性产物冻存备用。
1.8.ELISA检测稳定转染细胞B7-2-PE40外毒素融合蛋白表达
量
1)收集稳定转染细胞的24h培养上清并浓缩，浓缩方法同前。
2)取10μl浓缩液按1∶10稀释后包被96孔板过夜，每孔100μl，每组样品设3个平行孔。
3)封闭液封闭1h。
4)加入抗PEA多抗37℃孵育1h。
5)用PBST洗板3次。
6)加HRP-抗兔IgG 37℃孵育1h。
7)PBST洗板3次。
8)加入显色液TMB，15min后用2mol/L的H2SO4中止，测450nm吸光度值并计算相应浓度。
以未转染质粒的正常细胞培养液作为空白对照。采用PEA作为标准品绘制标准曲线[参考何婕等，生物工程学报，2006，22(3)：378-383]。
1.9.真核表达产物B7-2-PE40外毒素融合蛋白的选择性细胞毒
作用检测
将高表达CD28的人淋巴瘤细胞系Jurkat、鉴定阳性的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40稳定转染CHO-K1-RPE.40细胞以2×105/ml浓度共培养于96孔培养板中，于37℃、5％CO2培养条件下孵育48h，加入20μl MTS，1h后测定490nm吸光度值计算细胞毒活性。以低表达CD28的人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji作为阴性对照。细胞死亡率按如下公式计算：
细胞死亡率＝(1-稳定转染的CHO-K1-RPE.40细胞与靶细胞共培养孔中的存活细胞/未转染的CHO-K1-RPE.40细胞与靶细胞共培养孔中的存活细胞)×100％
2.结果
2.1.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表达载体的构建
为使B7-2-PE40外毒素融合基因可在真核细胞中表达，一个含有B7-2-PE40以及Zeo抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40按图1所示构建(其中真核表达载体图见图1A)。用所设计的PCR引物扩增人B7-2-PE40，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见预期大小为1919bp的特异性条带(见图2)。将双酶切回收后产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnI和XbaI酶切位点，构建成pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40重组质粒，经质粒提取、双酶切后电泳(见图3)，得到阳性克隆。测序显示信号肽之后的碱基序列没有发生点突变和移码突变，与原核表达质粒pRSETA-B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致，与人B7-2以及PE40蛋白一、二级结构比对结果见表1。
表1、B7-2-PE40外毒素融合蛋白与B7-2及PE40蛋白一、二级结构的比较
2.2.B7-2-PE40外毒素融合蛋白在真核细胞中的表达检测
将测序鉴定正确的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表达载体瞬时转染CHO-K1-RPE.40细胞，分别采用以下方法检测了B7-2-PE40外毒素融合蛋白的表达：首先用RT-PCR检测转染细胞中B7-2-PE40mRNA的合成，结果显示转染pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40的CHO-K1-RPE.40细胞在1919bp处可见特异性条带，而转染空载体的CHO-K1-RPE.40细胞未出现此条带。而两种细胞中均有看家基因β-actin的PCR扩增产物(图4)。采用Western印迹方法检测细胞培养上清B7-2-PE40外毒素融合蛋白的抗原性及分泌表达情况。结果表明无论采用PEA多克隆抗体还是采用CD86单克隆抗体，均在相对分子质量约90×103处有阳性条带，而空载体转染细胞上清无任何条带显示，结果见图5
2.3.稳定转染细胞的筛选及B7-2-PE40外毒素融合蛋白的表达
检测
在所筛选获得的29个克隆中，经RT-PCR验证，11个为阳性，扩大培养后冻存(见图6)。为检测稳定转染细胞B7-2-PE40表达分泌量，取数个阳性克隆的上清，或已知浓度的PEA作为标准品，采用ELISA方法，绘制标准直线(见表2)。将待测上清的OD值与标准曲线比较获得各稳定转染克隆的分泌量，具体结果见表3。其余稳定转染细胞株未检测。结果表明1×106个稳定转染细胞24h约表达0.23μg/L的B7-2-PE40外毒素融合蛋白。
表2、不同浓度PEA标准品的ELISA检测值
以PEA浓度为横坐标，OD450为纵坐标，发现PEA浓度在0.1-5μg/L时，PEA的浓度的对数与OD450呈直线关系，其直线方程式为：Y＝1.52+1.334X，其中X为PEA标准品不同浓度的对数值，Y为OD450吸光度值。
表3、B7-2-PE40外毒素融合蛋白表达水平检测
2.4.B7-2-PE40真核表达产物的选择性细胞毒性作用
利用高表达CD28的人淋巴瘤细胞系Jurkat检测真核表达产物B7-2-PE40的细胞毒抑制活性，并以低表达CD28的人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji作为阴性对照。MTT检测结果显示：稳定转染的细胞与Jurkat细胞共孵育48h后测得的OD值为1.013，未转染组为1.318；稳定转染的细胞与Raji细胞共孵育后测得的OD值为1.671，未转染组为1.633。根据公式计算获得稳定转染细胞对Jurkat细胞的杀伤率为92.87％，抑制率显著高于对Raji细胞的19.14％，证实真核表达产物B7-2-PE40对CD28阳性细胞具有很好的选择性抑制效应(见图7)。
实施例2：pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA
疫苗防治大鼠类风湿性关节炎疗效观察。
1.材料与方法
1.1.质粒、细胞、主要试剂
pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表达载体由本研究室构建。天然鸡II型胶原(CCII)、完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)及PEA多克隆抗体购自Sigma公司。FITC-anti-rat CD3、PE-anti-ratCD28和PharmlyseTM购自BD公司。注射用氨甲喋呤购自江苏恒瑞医药股份有限公司。
1.2.主要仪器
WJ2002活体基因导入仪(Scientz Biotechnology)，550全自动酶标仪(Bio-Rad公司)。
1.3.II型胶原蛋白诱导的大鼠关节炎模型(CIA)的建立
实验动物为4-6周龄Wistar雌性大鼠。参照文献[Rosloniec EF，etal.Collagen-induced arthritis.In：Coco R，Shevach E，editors，Current protocols in immunology，New York：Wiley&Sons，1997，1-24]的方法，将天然鸡II型胶原(CCII，Sigma公司)用0.1mol/L的冰醋酸溶解后，配成5mg/ml的溶液，加等体积完全弗氏佐剂CFA(Sigma公司)，使其终浓度为2.5mg/ml。以1.0ml/只在右后足跖皮内、尾根部及背部多点注射，一周后腹腔注射0.5ml/只加强免疫一次，诱导CIA。
1.4.CIA的治疗方案
大鼠于初次免疫后在第9天发病，于第12日开始治疗。实验分为六组，分别为：(1)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒150μg/只治疗组；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒200μg/只治疗组；(3)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒300μg/只治疗组。(4)MTX治疗组；(5)空载体注射组；(6)CIA对照组。空载体和治疗载体均溶解在生理盐水中，采取肌肉注射结合电脉冲刺激(200V/cm，20ms，2Hz，8脉冲)的方法[Mir LM，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：4262-4267]。MTX的给药方式为0.75mg/kg，每周肌肉注射一次，连续给予4周。
1.5.CIA的预防方案
在用鸡II型胶原诱导免疫的同时预防性地给予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒及MTX，治疗剂量及途径同上，共五组：(1)空载体注射组；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒200μg/只治疗组；(3)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒300μg/只治疗组。(4)MTX治疗组。(5)CIA对照组。
1.6.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
在体内的表达检测
采用肌肉注射的方法，将150μg的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40纯化质粒注射入Wistar大鼠右后肢股二头肌内，后给予电脉冲刺激(200V/cm，20ms，2Hz，8脉冲)。在注射后第2d、4d、7d、14d、21d、28d及56d分取对侧肌肉组织，利用Trizol提取RNA，利用RT-PCR方法检测B7-2-PE40外毒素融合基因在体内表达情况，以β-actin作为内部参照。
RNA的提取：从液氮中取出保存组织，转移至匀浆器，加入1mlTrizol，研磨使其充分裂解。室温放置5min，在每ml Trizol中加入200μl氯仿，振荡混匀，放置分层后4℃12000g离心15min。吸取上层水相至另一管中，加入500μl异丙醇，混匀室温放置10min后，4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底，用75％乙醇清洗，4℃8000g离心5min，弃去上清，待管中乙醇完全挥发后，用适量DEPC水溶解RNA，紫外分光光度仪定量。
逆转录条件如下：
反应条件为42℃30min，99℃5min，5℃5min。
大鼠β-actin引物序列为：
上游引物P7：5’AGG CAT CCT GAC CCT GAA GTA C 3’(SEQ ID NO：6)
下游引物P8：5’TCT TCA TGA GGT AGT CTG TCA G 3’(SEQ ID NO：7)
PCR反应体系如下：
反应条件如下：96℃预变性5min，96℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.7.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
体内活性检测
在150μg pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40纯化质粒注射后第2d、4d、7d、14d、21d、28d以及56d，将大鼠麻醉，心脏穿刺采血并用肝素抗凝。取100μl抗凝血，加入FITC-anti-rat CD3及PE-anti-rat CD28各1μg，室温避光孵育30min。加2mlPharmlyseTM红细胞裂解液，室温避光孵育15min。1500rpm离心5min，弃掉上清，用PBS重悬，1500rpm离心5min。弃掉上清，加入0.5ml 2％多聚甲醛PBS，上机检测。
1.8.关节炎指数(AI)
CIA大鼠四肢关节肿胀程度按0-4级评分：0分：无红肿；1分：个别足趾轻度红肿；2分：大部分足趾关节及足趾红肿；3分：踝关节以下足爪严重红肿；4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿。每一只大鼠的关节分数为四肢关节炎分数之和，最大可能为16分，AI＞5分为造模成功。
1.9.组织病理学检查
鸡II型胶原免疫诱导第35d后，按规定处死实验大鼠，取左后足炎性踝及趾关节作标本，以10％甲醛溶液固定、脱钙、脱水、切片、HE染色，观察炎性关节组织的病理改变。
1.10.血清中抗CII型胶原抗体的检测
参考文献[姚中强，等.中华微生物和免疫学杂志，2006，29(9)：846-849]方法进行。鸡II型胶原注射4周后，从眶静脉取血，离心分离血清后-20℃储存备用。本实验采用ELISA方法，具体操作如下：将CII(25mg/L)溶于0.2mol/L的PBS，按每孔100μl包被，4℃过夜。待测血清1∶500稀释后100μl/孔37℃孵育2h，PBST洗三次，HRP酶标兔抗大鼠IgG 1∶50000稀释100μl/孔37℃孵育1h，PBST洗六次后100μl/孔TMB显色液37℃避光孵育15min，100μl/孔2M H2SO4终止，450nm处测定吸光度值，并与已知CIA大鼠血清的稀释度绘制的标准曲线相比较，获得相应的浓度。
1.11.血清中抗PEA抗体的检测
参考文献[何婕，等.生物工程学报，2006，22(3)：378-383]方法进行。鸡II型胶原免疫8周后，从眶静脉取血，离心分离血清后-20℃储存备用。检测采用ELISA方法：将PEA(1mg/L)溶于包被液，按每孔100μl包被，4℃过夜。待测血清1∶100稀释后100μl/孔37℃孵育2h，PBST洗三次，HRP酶标兔抗大鼠IgG 1∶50000稀释100μl/孔37℃孵育1h，PBST洗六次后100μl/孔TMB显色液37℃孵育15min，100μl/孔2M H2SO4终止，450nm处测定吸光度值。以兔抗PEA多克隆抗体作为阳性对照，以CIA对照组大鼠血清为阴性对照。
1.12.统计学处理
结果数据以
表示，应用SPSS11.0软件进行分析，方差齐性时组间比较采用ANOVA分析，Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有显著性；方差不齐时采用非参数统计。
2.结果
2.1.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
在体内的表达检测
RT-PCR分析结果见如图8，其中显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B72-PE40质粒在注射后2d、4d、7d、14d、21d及28d均可检测出B7-2-PE40的mRNA，56天时基本检测不到。与内参β-actin相比，B7-2-PE40的表达在注射后14天最高，此后逐渐减弱。
2.2.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
在体内的活性检测
结果见图9，显示T细胞清除状况与B7-2-PE40在体内的表达变化一致。在pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒肌肉注射第2天，CD28+T细胞已被明显杀伤，其比值低于正常及CIA对照大鼠。治疗第4天时，CD28+T细胞下降至最低，达34％。此后有短暂恢复。随着B7-2-PE40在14天表达高峰的到来，在21天时再一次下降至低谷。后由于B7-2-PE40表达的降低，CD28+T细胞所占比例逐渐增加，并于第56天时恢复至正常水平。
2.3.CIA大鼠血清中抗PEA抗体水平检测
采用ELISA方法检测PEA抗体水平，结果详见表4和5。pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40治疗及预防组CIA大鼠血清中的抗PEA抗体水平随着质粒剂量的增加而增高，但明显低于阳性对照组(p＜0.05)，与阴性对照即空载体治疗组的抗PEA水平无统计学差异。
表4、pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗八周后CIA大鼠血清中PEA抗体水平
注：＊表示与阳性对照相比，P＜0.05
表5、pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗预防八周后CIA大鼠血清中PEA抗体水平
注：＊表示与阳性对照相比，P＜0.05
2.4.CIA大鼠诱导情况
免疫后第7天造模组部分大鼠足趾表面发红；第12天开始相继出现足爪红肿，至第18天出现关节红肿及软组织肿胀，后足为著。前足关节炎发生率明显低于后足，且出现时间比后足晚2-3天；第18-25天红肿达高峰，随之渐消退，关节屈曲，活动受限。其中治疗组50只，40只符合造模成功的标准，成功率为80％。
2.5.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
能有效预防CIA疾病的发生
在胶原免疫当天预防性给予不同剂量pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒后，观察了大鼠前后脚掌、脚踝及关节的变化(结果未附图示)，并根据平均关节炎指数绘制了临床积分变化图，结果见图10。研究发现在胶原免疫的第一周中，各组均会出现微弱的关节炎症表现。随着pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒的表达，预防各组的关节炎症状会逐渐消失。但在胶原免疫24天后，200μg及300μg预防组呈现了不同的预防效果。200μg预防组仍可很好的抑制关节炎的发生，减轻关节炎的严重程度，直至10周实验结束后。但300μg预防组仅部分抑制了关节炎症的发生，从第三周起，关节炎症逐渐明显。研究发现200μg预防效果与MTX组接近，远胜于300μg预防组。空载体预防组无任何预防效果，其临床积分类似于CIA对照组。
2.6.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
治疗对CIA大鼠四肢关节肿胀程度的影响
当胶原免疫第12天出现足爪红肿时，给予不同剂量的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表达质粒，观察pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40 DNA疫苗治疗对CIA大鼠四肢关节肿胀程度的影响，临床评分结果见图11。研究结果显示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40DNA疫苗在给予5天后即开始发挥作用，一直延续到第10周实验结束后。200μg治疗组及300μg治疗组与MTX治疗组的疗效接近，均可明显减轻四肢关节肿胀程度，降低疾病发生率；而150μg治疗组的关节炎症指数略高于上述三组，但明显低于空载体治疗组及CIA对照组。与CIA对照组相比，空载体组对CIA大鼠四肢关节肿胀程度无任何治疗作用，两组的临床评分基本接近。在300μg治疗组大鼠胶原注射处可见溃疡形成，且经久不愈。
2.7.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
对CIA大鼠后足组织病理学影响
组织病理结果(未附图)显示CIA对照组滑膜细胞大量增生，炎性细胞广泛浸润，滑膜下层有纤维增生和新生血管形成，局部有坏死及肉芽肿形成，软骨和骨的完整性遭到破坏。pcDNA3.1/Zeo(+)空载体对照组的结果类似。而经pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40预防及治疗后的各组均有一定程度的改善：滑膜增生减弱，炎性细胞浸润明显减少，少见纤维样物质沉积，基本看不到骨及软骨的破坏。在治疗各组中，MTX治疗组病理改变最少，其次为200μg治疗组；而预防各组中，200μg预防组病理表现优于MTX预防组。300μg预防组病理表现类似于CIA对照组，可见炎性细胞浸润，纤维增生，局部有坏死及肉芽肿形成。
2.8.CIA大鼠血清中抗CII抗体水平检测
ELISA检测结果见表6、7。空载体治疗组与CIA对照组的CII抗体水平基本接近，明显高于正常对照。而经pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40基因治疗后的各组抗CII抗体水平均有一定程度的降低，尤以200μg治疗组下降最多，但其浓度仍低于MTX治疗组，统计学分析显示除MTX治疗组外，其他各组的差异无统计学意义。
在预防各组中，200μg预防组的抗CII抗体水平明显低于其它各组(P＜0.05)，而MTX预防组和300μg预防组的抗CII抗体滴度略高于空载体预防组及CIA对照组，但差异无统计学意义。
表6、胶原免疫四周后CIA大鼠血清中抗CII抗体的浓度
＊表示与CIA对照组相比，P＜0.05《请将表中英文译成中文》
表7、胶原免疫四周后CIA大鼠血清中抗CII抗体的浓度
＊表示与CIA对照组相比，P＜0.05
实施例3：pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA
疫苗治疗大鼠类风湿性关节炎的试验
1.材料和方法
1.1.实验动物
Wistar雌性大鼠，4-6周龄，平均体重(180±15)g，由军事医学科学院动物中心提供，饲养条件为SPF级。
1.2.药品与试剂
pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表达载体由本研究构建保存。天然鸡II型胶原(CCII)、完全弗氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)购自Sigma公司。注射用甲氨喋呤购自江苏恒瑞医药股份有限公司。FITC-anti-rat CD3、PE-anti-rat CD28、PerCP-anti-rat CD8、PE-anti-rat CD4、FITC-anti-rat CD25、PE-anti-rat IL-4、FITC-anti-rat IFN-γ、PE-Cy5-anti-rat CD4和Cytofix/CytopermTMPlus(with GolgistopTM)kit均购自BD公司。IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α和TGF-βELISA试剂盒均购自R&D公司。IL-10 ELISA试剂盒购自Biosource公司。
1.3.II型胶原蛋白诱导的大鼠关节炎模型的建立
参照文献[Myers LK，et al.Life Sci，1997，61：1861]的方法，将天然鸡II型胶原用0.1mol/L的冰醋酸溶解后，配成5mg/ml的溶液，加等体积完全弗氏佐剂CFA，使其终浓度为2.5mg/ml。以1.0ml/只在右后足跖皮内、尾根部及背部多点注射，一周后腹腔注射0.5ml/只加强免疫一次，诱导CIA。注射100μl生理盐水/只大鼠作为正常对照组。
1.4.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
防治方案
pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗方案：大鼠于初次诱导免疫后9天发病，于第12日开始进行DNA疫苗治疗。实验每组五只，分为六组，分别为：(1)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒150μg/只治疗组；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒200μg/只治疗组；(3)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒300μg/只治疗组。(4)MTX治疗组；(5)CIA对照组；(6)正常对照组。空载体和治疗载体均溶解在生理盐水中，采取肌肉注射结合电脉冲刺激(200V/cm，20ms，2Hz，8脉冲)的方法。MTX具有很好的疗效及安全性，并得到国际风湿界的公认。作为治疗RA的金标准，MTX的给药方式为0.75mg/kg，每周肌肉注射一次，连续给予四周。
pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40的基因预防方案：在胶原免疫的前一天预防性地给予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒及MTX，治疗剂量及途径同上，共五组：(1)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒200μg/只预防组；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40质粒300μg/只预防组；(3)MTX预防组；(4)CIA对照组；(5)正常对照组。
1.5.CIA大鼠血清中细胞因子的检测
胶原初次免疫4周后，从尾静脉取血，离心分离血清后采用双抗夹心ELISA试剂盒分别检测CIA大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α及TGF-β的水平，每份标本进行双复孔检测。由于缺乏大鼠TGF-βELISA试剂盒，因人与大鼠TGFβ同源性较高，故使用人TGF-βELISA试剂盒代替。
A、大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ及TGF-β的检测方法如下：
1)从平衡至室温的密封袋中取出所需板条。
2)除空白孔外，分别将标本(1∶1稀释)或不同浓度的标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。
3)洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60min。
4)洗板4次。除空白孔外，加入酶结合工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30min。
5)洗板4次。加入显色剂100μl/孔，避光37℃孵箱孵育10-15min。
6)加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5分钟内)。
B、大鼠血清IL-10的检测方法如下：
1)从平衡至室温的密封袋中取出所需板条。
2)除空白孔外，分别将标本(1∶1稀释)或不同浓度的标准品(100μl/孔)加入相应孔中；加入生物素化抗体工作液(50μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120min。充分混匀对反应结果尤为重要，要使用微量振荡器(最低频率700rpm)。
3)洗板4次。除空白孔外，加入酶结合工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育30min。使用微量振荡器(最低频率700rpm)。
4)洗板4次。加入显色剂100μl/孔，避光3，室温孵育10-15min。
5)加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5分钟内)。
C、结果判断：
1)每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。
2)手工绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
3)若标本OD值高于标准曲线的上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
1.6.CIA大鼠外周血T细胞亚群分析
胶原初次免疫后28d，抽取CIA及各组大鼠外周血并用肝素钠抗凝，分别加入FITC-anti-rat CD3、PerCP-anti-rat CD8、PE-anti-ratCD28，PE-anti-rat CD4、FITC-anti-rat CD25单克隆抗体，用流式细胞仪检测外周血CD3+CD28+T细胞、CD3+CD8+C28-抑制性T细胞亚群(Ts细胞)、CD4+CD25+调节性T细胞亚群(Treg细胞)的变化。检测方法如下：取100μl抗凝血，加入相应荧光标记抗体各1μg，室温避光孵育30min。加2mlPharmlyseTM红细胞裂解液，室温避光孵育15min。1500rpm离心5min，弃掉上清，用PBS重悬，1500rpm离心5min。弃掉上清，加入0.5ml 2％多聚甲醛PBS，上机检测。
1.7.CIA大鼠外周血Th1和Th2细胞亚群的检测
用IMDM培养基以1∶1比例稀释抗凝血500μl，后加入150ng/mlPMA和1μg/ml离子霉素、0.7μl GolgistopTM刺激5h。按200μl/管加入2mlBD PharmLyse，室温孵育10min，离心500g 5min。用1×Staining缓冲剂清洗一次，加入PE-Cy5-anti-rat CD4室温避光放置20min。加入500μl BD Cytofix/cytoperm solution，固定和穿透细胞，室温避光孵育20min，离心500g 5min。加2ml Perm/wash solution洗涤2次，加入PE-anti-rat IL-4、FITC-anti-rat IFNγ、室温下避光孵育30min。最后以500μl PBS洗涤液重悬细胞。采用Cellquest软件分析获取的细胞，以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门选取Th细胞(CD4+)，以IFN-γ和IL-4的散点图显示Th1细胞和Th2细胞。
1.8.统计学方法
结果数据以
表示，应用SPSS11.0软件进行分析，方差齐性时组间比较采用ANOVA分析，Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有显著性；方差不齐时采用非参数统计。
2.结果
2.1.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
治疗后大鼠血清中细胞因子的变化
胶原免疫后四周后采用ELISA方法检测了实验各组大鼠血清，检测结果详见表8、9。CIA大鼠中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平明显高于正常对照组(P＜0.05)，而二者的TGF-β和IL-10无统计学差异。由于检测方法的灵敏度，IL-4基本检测不到。
经不同剂量的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗后大鼠血清中参与促进炎症的细胞因子如TNF-α及IFN-γ均有显著下降(P＜0.05)，IL-2的变化不大；参与抑制炎症的细胞因子IL-10在200μg治疗组有显著提高(P＜0.05)，而150μg及300μg治疗组中虽有一定程度地提高，但与CIA对照组之间无统计学差异。TGF-β的变化与IL-10的后两组情况类似。MTX治疗组的TNF-α、IFN-γ及IL-10水平较CIA对照组有显著性变化(P＜0.05)。
pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗和MTX预防组均可明显降低TNF-α和IFN-γ的水平(P＜0.05)，MTX预防组的IL-10和IL-2较CIA对照组亦有明显改变(P＜0.05)。此外，300μg预防组中IL-10的水平也有显著提高(P＜0.05)。其余各组虽可一定程度的提高TGF-β以及IL-10的水平、降低IL-2的水平，但与CIA对照组之间无显著性差异。
表8、经pcDNA3.1/Zeo(+)-B-7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗或MTX治疗后大鼠血清中细胞因子的变化(n＝5，
pg/ml)
注：＊表示与CIA对照组相比，P＜0.05；
表示与正常对照相比，P＜0.05
表9、预防性给予pcDNA3.1/Zeo(+)-B-7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗或MTX后大鼠血清中细胞因子的变化(n＝5，pg/ml)
注：＊表示与CIA对照组相比，P＜0.05；表示与正常对照相比，P＜0.05
2.2.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
治疗后大鼠外周血T细胞亚群的变化
胶原免疫四周后采用流式细胞仪检测了三种T细胞亚群，其结果及代表性流式图谱详见图12-17。与正常大鼠相比，CIA大鼠外周血中CD3+CD28+T细胞、Ts及Treg细胞亚群所比例均有显著下降(P＜0.05)。在pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗及MTX治疗各组中，Treg细胞显著提高(P＜0.05)；Ts细胞亦有一定程度地提高，尤其在300μg治疗组达11.26％±3.23％，明显高于CIA对照组(P＜0.05)。除200μg治疗组外，CIA大鼠中CD3+CD28+T细胞亚群下降的情况均得到改善，但无统计学意义。当预防性给予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗或MTX后，CIA大鼠CD28+T细胞亚群、Ts细胞亚群及Treg细胞亚群的变化与上述治疗组结果一致。经统计学分析部分结果有统计学意义。
2.3.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗
治疗后大鼠外周血Th1/Th2、CD4/CD8细胞比例的变化
采用流式细胞仪在胶原免疫四周后检测了外周血IFN-γ分泌型Th1细胞、IL-4分泌型Th2细胞、CD4+和CD8+T细胞亚群的变化，评价pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗对Th1/Th2及CD4/CD8比例的影响，具体结果见表10及图19～21。
表10、pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗对大鼠外周血Th1/Th2、CD4+/CD8+比值的影响(n＝5，
％)
注：＊表示与CIA对照组相比，P＜0.05；表示与正常对照相比，P＜0.05
图18、19结果显示CIA大鼠的IFN-γ分泌型Th1细胞、IL-4分泌型Th2细胞比例均低于正常对照，但IL-4分泌型Th2下降更为明显，使得Th1/Th2比例偏高，发生向Th1的偏移。150和200μgpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治疗可明显抑制Th1细胞的比例，Th2细胞比例则可恢复至正常，阻止了CIA大鼠向Th1的偏移，抑制了疾病的进展。尽管300μg治疗组的Th1/Th2比值较CIA有所下降，但Th1细胞比例却明显高于正常对照。当预防性给予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗后，Th1细胞比例明显下降，阻止了向Th1的偏移。研究同时发现MTX治疗对Th1细胞比例影响不大，但可诱导IL-4分泌型Th2细胞增加，下调了Th1/Th2比值。CD4/CD8比值的变化见图20。研究结果显示CIA大鼠CD4/CD8的比值高于正常对照。当给予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗后，CD4/CD8的比值得以逆转，尤其在300μg治疗组，下降更为明显，可能与CD28分子多表达于CD4+T细胞有关。MTX也可逆转CD4/CD8比例，使其更接近正常水平。
根据本发明提供新型pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗经证实其可有效地预防和/或治疗类风湿关节炎。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军军事医学科学院附属医院
<120>基于B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途
<130>IDC080062
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>B7-2-PE40 fusion gene
<400>1
gctagcgttt aacttaagct tggtacctgt tatggatgga ctgagtaaca ttctctttgt 60
gatggccttc ctgctctctg gtgctgctcc tctgaagatt caagcttatt tcaatgagac 120
tgcaggcctg ccgtgccaat ttgcaaactc tcaaaaccaa agcctgagtg agctagtagt 180
attttggcag gaccaggaaa acttggttct gaatgaggta tacttaggca aagagaaatt 240
tgacagtgtt cattccaagt atatgggccg cacaagtttt gattcggaca gttggaccct 300
gagacttcac aatcttcaga tcaaggacaa gggcttgtat caatgtatca tccatcacaa 360
aaagcccaca ggaatgattc gcatccacca gatgaattct gaactgtcag tgcttgctaa 420
cttcagtcaa cctgaaatag taccaatttc taatataaca gaaaatgtgt acataaattt 480
gacctgctca tctatacgcg gttacccaga acctaagaag atgagtgttt tgctaagaac 540
caagaattca actatcgagt atgatggtat tatgcagaaa tctcaagata atgtcacaga 600
actgtacgac gtttccatca gcttgtctgt ttcattccct gatgttgcga gcaatatgac 660
catcttctgt attctggaaa ctgacaagac gcggctttta tcttcacctt tctctataga 720
gcttgaggac cctcagcctc ccccagacca gattcctggt ggcggcggat ctggaggcgg 780
tggaagcggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggc ggcagcctgg ccgcgctgac 840
cgcgcaccag gcttgccacc tgccgctgga gacttccacc cgtcatcgcc agccgcgcgg 900
ctgggaacaa ctggagcagt gcggctatcc ggtgcagcgg ctggtcgccc tctacctggc 960
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cagcggcggc gacctgggcg aagcgatccg cgagcagccg gagcaggccc gtcttgccct 1080
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ggccgagcgc accgtggtga ttccctcggc gatccccacc gacccgcgca acgtcggcgg 1800
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Claims (9)
1.一种重组表达载体，其含有与载体pcDNA3.1/Zeo(+)有效连接的如SEQ ID NO：1所示的B7-2-PE40外毒素融合基因。
2.权利要求1所述的重组表达载体，其由B7-2-PE40基因与pcDNA3.1/Zeo(+)载体组成。
3.一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗，其包含权利要求1或2所述的重组表达载体。
4.权利要求3所述的DNA疫苗，其中还包含医药学上可接受的免疫佐剂。
5.根据权利要求4的DNA疫苗，其用于以注射、粘膜或基因枪导入方式实施免疫。
6.根据权利要求4的DNA疫苗，其用于以至少一种选自静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔内注射的方式实施免疫。
7.根据权利要求4的DNA疫苗，其为可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。
8.权利要求1或2所述的重组表达载体用于制备治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗的用途。
9.权利要求3-7任一项所述的DNA疫苗用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物的用途。
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