CN105367662A - 一种hbv相关的融合蛋白、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种hbv相关的融合蛋白、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种HBV相关的融合蛋白、其制备方法及其应用,具体地本发明利用基因工程技术,构建了HbcAg相关的原核表达载体并进行了表达,获得的融合蛋白在体内外能够显著诱导HBV特异性的CTL反应。

Description

一种HBV相关的融合蛋白、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及一种HBV相关的融合蛋白、其制备方法及其应用。
背景技术
人乙型肝炎病毒(humanhepatitisBvirus,HBV)感染是全球性的公共卫生问题,根据世界卫生组织((WorldHealthOrganization,WHO)的统计,全球范围内有超过20亿人曾感染过HBV,其中,3.5亿正遭受慢性HBV感染之苦(WHO,2000)。我国为乙型肝炎的高发区。2006年全国病毒性肝炎血清流行病学调查数据显示,在全部人群中乙肝表面抗原(HBsAg)的阳性率为7.18%。据此估计我国约有9300万人为HBV携带者,其中,3000万例为慢性乙型肝炎患者。研究还显示,慢性的HBV感染与肝硬化和肝癌的发病率和死亡率密切相关。
机体清除HBV的关键在于诱导活化出有效的特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞,并通过MHC-I类分子递呈途径诱导感染病毒的细胞自溶。目前本领域中,仍然缺乏有效的诱导机体清除体内HBV的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够诱导HBV特异性的CTL反应的HBV相关的融合蛋白、其制备方法及其应用。
本发明的第一方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白具有式Ia、式Ib或式Ic所述结构:
T-U-H-C(Ia),
T-C-U-H(Ib),
T-H-U-C(Ic),或
其中,
T为任选的标签序列和/或信号肽序列;
C为包括CTP的多肽元件;
U为包括Ub的多肽元件;
H为包括HBcAg的多肽元件;
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
在另一优选例中,所述多肽元件C选自下组:
(A)具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽;
(B)具有与SEQIDNO:2中任一所示氨基酸序列≥80%同源性(优选地,≥90%的同源性;等优选地≥95%的同源性;最优选地,≥97%的同源性)的多肽;
(C)将SEQIDNO:2或4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
在另一优选例中,所述多肽元件C的长度为11个氨基酸。
在另一优选例中,所述多肽元件U选自下组:
(A)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽;
(B)具有与SEQIDNO:4中任一所示氨基酸序列≥80%同源性(优选地,≥90%的同源性;等优选地≥95%的同源性;最优选地,≥97%的同源性)的多肽;
(C)将SEQIDNO:4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
在另一优选例中,所述多肽元件U的长度为76个氨基酸。
在另一优选例中,所述多肽元件H选自下组:
(A)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽;
(B)具有与SEQIDNO:6中任一所示氨基酸序列≥80%同源性(优选地,≥90%的同源性;等优选地≥95%的同源性;最优选地,≥97%的同源性)的多肽;
(C)将SEQIDNO:6中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
在另一优选例中,所述多肽元件H的长度为160-200个氨基酸。
在另一优选例中,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:8或10所示。
在另一优选例中,所述融合蛋白具有以下特性:
a)具有穿透细胞膜的能力;
b)刺激T淋巴细胞增殖;
c)诱导T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子;
d)诱导HBV特异性的CTL反应。
在另一优选例中,所述标签序列为MBP标签序列。
本发明的第二方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中,所述多核苷酸选自下组:
(a)编码如SEQIDNO.:8或10所示多肽的多核苷酸;
(b)序列如SEQIDNO.:7或9所示的多核苷酸;
(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)的多核苷酸;
(d)如(b)所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30,更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸;
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的多核苷酸序列如SEQIDNO:7或9所示。
本发明的第三方面,提供了一种载体,所述载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述载体以pcDNA3.1(-)-Ub-HbcAg质粒为骨架。
本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞表达本发明第一方面所述的融合蛋白;和/或
所述宿主细胞基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸;和/或
所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体。
在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如酵母细胞)。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、果蝇S2细胞、CHO细胞、DC细胞等。
在另一优选例中,所述宿主细胞为大肠杆菌细胞,优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五方面,提供了一种制备融合蛋白的方法,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养本发明第四方面所述的宿主细胞,从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白;和
分离所述融合蛋白。
在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选地,所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。更优选地,所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,所述组合物包含:本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体,以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中,所述药物组合物包括疫苗组合物。
本发明的第七方面,提供了一种疫苗组合物,所述组合物包含:本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体,以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中,所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中,所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12和CpG)。
本发明的第八方面,提供了本发明第一方面所述的融合蛋白的用途,用于制备药剂或试剂,所述药剂或试剂用于:
(1)治疗HBV感染;和/或
(2)诱导HBV特异性的CTL反应;和/或
(3)诱导T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子;和/或
(4)刺激T淋巴细胞增殖。
本发明的第九方面,提供了一种治疗HBV感染或HBV感染相关疾病的方法,包括步骤:给需要的对象施用本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中,所述的融合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。
在另一优选例中,所述的对象是人。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳图谱。
图2显示了免疫荧光检测结果。
图3显示了Westernblot检测结果。
图4显示了体外活性检测中流式细胞术检测结果。
图5显示了体外活性检测中ELISA法检测的结果。
图6显示了体内活性检测中流式细胞术(FCM)检测T淋巴细胞内的细胞因子。
图7显示了体内活性检测中酶联免疫吸附法(ELISA)检测T淋巴细胞分泌细胞因子。
图8显示了体内活性检测中细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖活性。
图9显示了HBV转基因小鼠体内活性检测中流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平。
图10显示了体内活性检测中肝脏组织的检测结果,其中图A显示了HBV转基因小鼠常规HE染色,图B显示了HBsAg免疫组织化学染色,图C显示了HBcAg免疫组织化学染色。
图11显示了荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清中HBVDNA水平。
图12显示了微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平。
图13显示了体内活性检测中ALT水平的检测结果。
图14显示了体内活性检测中特异性CTL的表达水平的检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得一种HBV相关的融合蛋白,实验结果表明,所述融合蛋白能够穿过细胞膜并诱导HBV特异性的CTL反应。本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法及其用途。
CTP
胞浆转导肽(Cytoplasmictransductionpeptide,CTP)是一种可携带生物活性大分子(蛋白、多肽、核酸等)转运到细胞质的转到肽。
在本发明的一个优选例中,所述的CTP氨基酸序列如下所示:
GGRRARRRRRR(SEQIDNO.:2)
在本发明的一个优选例中,所述的CTP的编码多核苷酸序列如下所示:
GGCGGCCGTCGTGCGCGTCGTCGTCGTCGTCGT(SEQIDNO.:1)。
Ub
泛素(Ubiquitin,Ub)是一种高度保守的小蛋白(76个氨基酸),普遍存在于从单细胞酵母到人类的所有真核细胞内,并且表达水平很高。泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基,被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解,泛素的这种标记作用是非底物特异性的,在蛋白质降解过程中泛素的枢纽作用越来越得到研究者的重视。
在本发明的一个优选例中,所述的Ub氨基酸序列如下所示:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGA(SEQIDNO.:4)
在本发明的一个优选例中,所述的Ub的编码多核苷酸序列如下所示:
ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGCAAGACCATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAACGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAAGAGGGCATCCCCCCTGACCAGCAGAGGCTGATCTTTGCCGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACCCTCTCTGATTACAACATCCAGAAGGAGTCAACCCTGCACCTGGTCCTTCGCCTGAGAGGTGCT(SEQIDNO.:3)
HBcAg
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒,完整的HBV颗粒又称Dane颗粒,球形,直径约42um。HBV核心抗原(HepatitisBCoreAntigen,HBcAg)存在于Dane颗粒的核心,是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白,主要存在于受感染的肝细胞核内,其反映血清中Dane颗粒的存在及肝内HBV的复制。存在于乙型肝炎患者血液和肝组织内的HBcAg具有重要的生物学特性和临床病理意义。
HBcAg具有高度免疫原性,在T细胞和B细胞水平上,HBcAg的抗原性较HBeAg强100倍,几乎所有HBV感染者都产生抗-HBc,同时有T细胞免疫应答。对HBcAg的免疫应答在病毒清除中可能有重要作用,这对HBV疫苗研究有重要的意义。
在本发明的一个优选例中,所述的HBcAg氨基酸序列如下所示:
RDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(SEQIDNO.:6)
在本发明的一个优选例中,所述的HBcAg的编码多核苷酸序列如下所示:
AGAGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGCTCACCTCACCATACCGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGT(SEQIDNO.:5)
活性多肽
如本文所用,术语“本发明的融合蛋白”和“本发明的多肽”具有相同的含义,均具有式Ia或式Ib或式Ic所述结构:
T-U-H-C(Ia),
T-C-U-H(Ib),或
T-H-U-C(Ic),
其中,
T为任选的标签序列和/或信号肽序列;
C为包括CTP的多肽元件;
U为包括Ub的多肽元件;
H为包括HBcAg的多肽元件;
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
在本发明的一个实施方式中,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:8所示。
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLE DGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGARDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQCGGRR ARRRRRR(UHC)(SEQIDNO.:8);
在本发明的一个实施方式中,所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQIDNO.:7所示。
ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGCAAGACCATCACCCTGGA GGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAACGTGAAGGCCAAGATCCAGGAT AAAGAGGGCATCCCCCCTGACCAGCAGAGGCTGATCTTTGCCGGCAAGC AGCTGGAAGATGGCCGCACCCTCTCTGATTACAACATCCAGAAGGAGTCA ACCCTGCACCTGGTCCTTCGCCTGAGAGGTGCTAGAGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGCTCACCTCACCATACCGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTGGCGGCCGTCGTGCGCGTCGTC GTCGTCGTCGT(SEQIDNO.:7)。
在本发明的一个实施方式中,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:10所示。
GGRRARRRRRRMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGARDIDPYKEFGASVELL SFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLA TWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVS FGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRR SQSRESQC(CUH)(SEQIDNO.:10);
在本发明的一个实施方式中,所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQIDNO.:9所示。
GGCGGCCGTCGTGCGCGTCGTCGTCGTCGTCGTATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGCAAGACCATCACCCTGGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAACGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAAGAGGGCATCCCCCCTGACCAGCAGAGGCTGATCTTTGCCGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACCCTCTCTGATTACAACATCCAGAAGGAGTCAACCCTGCACCTGGTCCTTCGCCTGAGAGGTGCTAGAGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCT TCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAG ATCTCCTCGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCG GAACATTGCTCACCTCACCATACCGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTG GGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACC CAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTA AAAATCAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGA GAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCT CCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAAC TACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC CTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGG GAATCTCAATGT(SEQIDNO.:.9)。
本发明的所述融合蛋白具有以下活性:
a)具有穿透细胞膜的能力;
b)有效刺激T淋巴细胞增殖;
c)有效诱导T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子;
d)和能够诱导HBV特异性的CTL反应。
在另一优选例中,所述标签序列为MBP标签序列或6His标签序列。
如本文所用,术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQIDNO:8序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):1-3个(通常为1-2个,更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内,较佳地为2个以内,更佳地为1个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外,所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式Ia或式Ib的氨基酸序列相比,有至多3个,较佳地至多2个,更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQIDNO:8所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽(融合蛋白)还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐:氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括:与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐,以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
编码序列
本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQIDNO:8所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:8所示的多肽,但相应编码区序列有差别的核酸序列。
在本发明较佳的实施方式中,所述多核苷酸的的序列如SEQIDNO.:7所示。
本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码本发明酶的功能。
如本文所用,术语“引物”指的是在与模板配对,在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸,但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如,在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列,这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合,非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物,从而进行扩增。
本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述酶的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产本发明融合蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化融合蛋白。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,枯草芽胞杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
制备方法
本发明的融合蛋白(多肽)可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的,或重组的。相应地,本发明多肽可用常规方法人工合成,也可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术,如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品,可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如,Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂,Wang树脂结构为聚苯乙烯,与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇;用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟,以除去Fmoc保护基团,并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后,用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基,可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后,用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时,优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂,PAM树脂结构为聚苯乙烯,与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺;在Boc合成系统中,在去保护、中和、偶联的循环中,用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后,用含对甲苯酚(5-10%)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时,将肽链从树脂上切下,同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽,溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化,然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基,例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC),羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽,其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一实施方式中,本发明的融合蛋白,按其序列,采用固相合成的方法制备,行高效液相色谱纯化,获得高纯度目的肽冻干粉,-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的融合蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的融合蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短,因此可以考虑将多个多肽串联在一起,重组表达后获得多聚体形式的表达产物,然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
药物组合物和施用方法
本发明融合蛋白可作为免疫原在体内诱导产生抗HBV或HBV阳性细胞的抗体及淋巴T细胞活性,从而实现治疗效果。此外,本发明抗原肽具有优异的特异性和免疫活性,故可用于制备免疫治疗或预防的疫苗。
另一方面,本发明还提供了一种药物(包括疫苗)组合物,它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐(或其编码序列);以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂,较佳地为100-1000微克/剂。
为了本发明的目的,有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克,较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外,本发明的多肽可以单用,也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体,且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常,可将治疗性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物,可将其通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物;尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时,可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为注射剂。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制,并且偶尔添加合适的药物添加剂,如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂,而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如,本发明融合蛋白或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中,然后将该药丸或微囊通过手术植入人的组织。作为缓释聚合物的例子,可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等,较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时,作为活性成分的本发明融合蛋白或其药学上可接受的盐的剂量,可根据待预防或治疗的每个对象(病人)的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组蛋白),并且通常与“药学上可接受的载体”组合,这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外,这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外,抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于:(1)铝盐(alum),如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等;(2)水包油型乳剂配方,例如,(a)MF59(参见WO90/14837),(b)SAF,和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,MT),(3)皂素佐剂;(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA);(5)细胞因子,如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等;(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体;以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如,可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂),通常含有稀释剂,如水,盐水,甘油,乙醇等。另外,辅助性物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地,包括免疫原性组合物在内的疫苗,包含免疫学有效量的免疫原性多肽,以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内,可通过常规实验来确定。
通常,可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中,以增强佐剂效果。
此外,本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
本发明的主要优点在于:
(1)本发明的抗原太UHC免疫BALB/c小鼠后,能有效刺激T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及增加CTLs的表达,能提高T淋巴细胞增殖活性及CTL活性。;
(2)融合蛋白Ub-HBcAg-CTP免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量及ALT、AST表达水平,降低血清中HBsAg及HBVDNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg、HBcAg的表达。
下面结合具体实施例,进一步陈述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
材料和方法
实施例1CTP-Ub-HbcAg(CUH)和Ub-HbcAg-CTP(UHC)原核表达载体的构建及其表达
1、基因合成
1.1全基因合成CTP-Ub-HBcAg、Ub-HBcAg-CTP、Ub-HBcAg和CTP-HbcAg序列后进行PCR扩增。
根据CTP-Ub-HBcAg、Ub-HBcAg-CTP、Ub-HBcAg和CTP-HBcAg序列,设计全基因合成引物,合成得到的片段分别命名为CUH、UHC、UH和CH。引物合成公司为苏州金唯智生物科技有限公司,引物序列如下。设计引物时考虑到构建重组质粒,在引物两端引入BamHI与XhoI酶切位点。
附引物序列如下表所示:
1.2基因合成
PCR扩增进行基因合成
CTP-Ub-HBcAg(CUH)的合成:1-22号引物、25-27号引物;
Ub-HBcAg-CTP(UHC)的合成:1-24号引物;
Ub-HBcAg(UH)的合成:UHC为模板、23FBamHI/26RXhoI扩增;
CTP-HBcAg(CH)的合成UHC为模板、27FBamHI/28F/26RXhoI扩增;
基因合成委托上海锐劲生物技术有限公司完成。
1.3酶切
将4个PCR扩增的目的基因用BamHI/HindIII(Fermentas公司)双酶切,37℃水浴反应2h。
1.4酶切产物回收
应用AxygenPCR清洁试剂盒回收酶切产物。
1.5连接
4个基因片段分别连接到同样酶切的pMAL载体(购自NewEnglandBiolabs公司)中,16℃水浴反应2h。
1.6转化
4个连接产物(pMAL-CUH、pMAL-UHC、pMAL-UH、pMAL1-CH)转化Top10感受态细胞(购自Novagen公司)。
1.7阳性克隆鉴定
4个菌板上各挑3个单克隆进行菌落PCR验证,并各送阳性克隆测序。经测序,4个目标序列与预期相符。
2、阳性表达菌株构建
2.1质粒抽提
测序正确的阳性克隆,应用Axygen质粒小提试剂盒进行质粒抽提。
2.2转化表达菌株
4个质粒pMAL-CUH、pMAL-UHC、pMAL-UH、pMAL1-CH分别转化BL21感受态细胞(购自Novagen公司)。
3、诱导表达与验证
3.1挑取阳性转化子
每个转化板各挑1个单克隆摇菌,加700ulLB培养基,摇至对数生长期,按照1:100比例转接到2mLLB培养基中摇菌过夜。
3.2诱导表达
过夜培养物按照1:100比例转接到2mlLB培养基中摇至对数生长期,加20ul0.1M的IPTG(终浓度1mM)诱导表达,28℃,诱导5h。
3.3SDS-PAGE电泳
取200ul诱导表达菌液,13000rpm室温离心2min,收集菌体,加入15ul2×Loadingbuffer充分重悬菌体,置于沸水中,煮10min。13000rpm室温离心5min,取上清8ul上样,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果如图1所示。
从图中可以看出,经诱导后表达的蛋白分子量与预期一致,说明本实施例成功的制备了融合蛋白CUH、UHC、UH、CH。
4、蛋白纯化
4.1纯化步骤
4.1.1确认4个蛋白(CUH、UHC、UH、CH)表达后,重新表达400ml,经超声破碎后离心留上清;
4.1.2初步估计蛋白表达含量以及根据MBP柱载量取适当体积的MBP柱装柱;
4.1.3平衡:MBP柱用lysisbuffer(20mMTris,1mMEDTA,200mMNaCl,1mMDTT)平衡5-10个柱体积;
4.1.4上样:将离心后的破菌液上清以1ml/min通过MBP柱,收集流穿液4℃保存;
4.1.5洗杂:用lysisbuffer洗4-5个柱体积,收集洗杂液,4℃保存;
4.1.6洗脱:用洗脱buffer(20mMTris,1mMEDTA,200mMNaCl,1mMDTT,10mM麦芽糖)洗4-5个柱体积,收集洗脱液4℃保存。
4.2SDS-PAGE电泳
取10ul样本+5ulloadingbuffer混匀100℃水浴煮沸10min,离心,跑SDS-PAGE胶,根据电泳图分析结果,所得蛋白纯度符合进一步实验的要求。
实施例2体外活性检测
方法:
1、体外分离培养近交系Balb/c小鼠髓源性DC,加入rGM-CSF和rIL-4培养5天,再加入LPS诱导DC成熟。
不同组融合蛋白加入细胞培养介质中,激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光在细胞内的分布及定位,并对荧光强度进行定量分析。
进一步以Westernblot观察不同组细胞中HBcAg表达的差异来检测Ub-HBcAg-CTP的转导效率。Westernblot中使用的抗体分别为抗HBcAg抗体(一抗)、羊抗鼠二抗(购自武汉博士德公司)。
流式细胞术测定DC表面分子表达,使用FITC标记小鼠单克隆抗体CD11c,CD80,CD83,CD86,MHCI抗体(购自eBioscience公司)进行荧光标记。
ELISA法测定DC培养上清中的IL-12p70的水平,使用IL-12p70ELISA试剂盒(晶美生物公司)。
CCK-8试剂盒(购自同仁化学研究所公司)检测T淋巴细胞增殖反应。
2、不同组融合蛋白刺激DC成熟后与T淋巴细胞共培养,ELISA法检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的分泌水平(具体方法可参考文献:唐余燕等,胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin诱导C57BL/6小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及特异性CTL的表达;细胞与分子免疫学杂志,2013,29(3))。
流式细胞仪检测胞内细胞因子CD8α和IFN-γ的水平。
乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测特异性CTL活性。
结果:
体外成功诱导培养并鉴定小鼠骨髓源性DC,免疫荧光检测结果如图2所示,从图中可以看出(含有CTP序列的蛋白Ub-HBcAg-CTP(UHC)和CTP-HBcAg能够穿透DC膜进入细胞质,而不能进入细胞核,而蛋白UH只见于细胞膜上,但是Ub-HBcAg-CTP(UHC)转染的DC细胞质中的荧光强度低于CTP-HBcAg,说明HBcAg被部分降解,说明与Ub相连的HBcAg通过CTP被带进细胞后被泛素蛋白酶体系统降解为蛋白片段,并最终导致抗原递呈作用增强。
Westernblot检测结果如图3所示,从图中可以看出Ub-HBcAg-CTP和CTP-HBcAg转染DC后加入蛋白酶抑制剂MG-132后可以明显抑制HBcAg蛋白的降解。此结果证实蛋白在细胞质中是被泛素蛋白酶体系统降解掉的,而不是被其他系统降解。
流式细胞术检测结果如图4所示,从图中可以看出Ub-HBcAg-CTP能明显上调DC表面分子CD80、CD83、CD86及MHC-Ⅰ分子的表达量,显著高于对照组(P<0.05)。
ELISA法检测的结果如图5所示,从图5可以看出经UHC处理的细胞分泌的IL-12p70水平显著高于对照组和空白组,高于HC处理组23.3%,高于UH处理组29.1%。
上述实验结果表明,UHC诱导DC刺激T淋巴细胞增值能力明显高于对照组和空白组。UHC融合蛋白可以明显上调细胞因子IL-2和IFN-γ的水平,Ub-HBcAg-CTP融合蛋白刺激后的淋巴细胞中Tc1的数量明显高于其他组,其诱导的CTL比其他组有明显的特异性杀伤作用。
实施例3体内活性检测
方法:
1、BALB/c小鼠体内活性实验
BALB/c小鼠随机分为实验组Ub-HBcAg-CTP(20μg),对照组CTP-HBcAg(20μg)、HBcAg-Ub(20μg)、HBcAg(20μg)及空白组(生理盐水),经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次,最后1次免疫7天后,进行如下检测:
流式细胞术(FCM)检测T淋巴细胞内的细胞因子
酶联免疫吸附法(ELISA)检测T淋巴细胞分泌细胞因子;
细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖活性。
2、HBV转基因小鼠体内活性实验
HBV转基因小鼠(购自中国人民解放军第458医院全军肝病中心,该鼠基因组内整合有HBV基因,可持续表达抗原和进行病毒复制的特性)随机分为实验组Ub-HBcAg-CTP(50μg)、对照组CTP-HBcAg(50μg)、HBcAg-Ub(50μg)、HBcAg(50μg)、IFN-α(20000IU)及空白组(生理盐水)经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次;第3次免疫后7天,进行如下检测:
流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平;
肝脏组织HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg、HBcAg表达;
荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清中HBVDNA水平;
微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平;
ALT水平及特异性CTL的表达水平。
结果:
1、BALB/c小鼠体内活性实验
流式细胞术(FCM)检测T淋巴细胞内的细胞因子的结果如图6所示,从图中可以看出实验组蛋白能明显诱导CTL水平升高。
酶联免疫吸附法(ELISA)检测T淋巴细胞分泌细胞因子的实验结果如图7所示,从图中可以看出实验组蛋白能有效刺激小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子。
细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖活性的实验结果如图8所示,从图中可以看出融合蛋白诱导的T淋巴细胞增殖活性明显高于其他组。
上述实验证明Ub-HBcAg-CTP融合蛋白能有效刺激小鼠T细胞分泌Th1型细胞因子;FCM检测融合蛋白诱导的CTL水平明显高于其他组;且融合蛋白诱导的T淋巴细胞增殖活性和CTL活性明显高于对照组及空白组(p值均<0.05)。
2、HBV转基因小鼠体内活性实验
流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平的实验结果如图9所示,从图中看出融合蛋白可以明显诱导特异性CTL反应。
肝脏组织HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg、HBcAg表达的检测结果如图10所示,其中图A显示了HBV转基因小鼠常规HE染色,图B显示了HBsAg免疫组织化学染色,图C显示了HBcAg免疫组织化学染色,从图中可以看出空白组肝组织呈正常肝细胞形态,并且小叶结构完整清晰,汇管区及中央静脉周围可见少量炎性浸润;各组融合蛋白免疫小鼠后出现中央静脉及汇管区周围炎性细胞浸润逐渐增多,汇管区内出现了大量炎性细胞。
荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清中HBVDNA水平的检测结果如图11所示,图中HBVDNA抑制率%=(1-实验组/空白组)X100,从图中可以看出经UHC免疫的小鼠体内HBVDNA抑制率显著提高,与HC免疫组相比提高了15%,与UH免疫组相比提高了约30%。
微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平的检测结果如图12所示,HbsAg抑制率=(1-实验组/空白组)X100(请给出计算方法),从图中可以看出经UHC免疫的小鼠体内HbsAg抑制率显著提高,与HC免疫组相比提高了约20%,是UH免疫组的3.5倍。
ALT水平的检测结果如图13所示,从图中可以看出经UHC免疫的小鼠体内ALT水平明显提升,与HC组相比提高了约20%,与UH组相比提高了约55%。
特异性CTL的表达水平检测结果如图14所示,从图中可以看出,在20:1条件下,经UHC免疫的小鼠体内特异性CTL水平与HC组相比提高了约20%,与UH组相比提高了约24%。
结论:本发明的抗原太UHC免疫BALB/c小鼠后,能有效刺激T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及增加CTLs的表达,能提高T淋巴细胞增殖活性及CTL活性。融合蛋白Ub-HBcAg-CTP免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量及ALT、AST表达水平,降低血清中HBsAg及HBVDNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg、HBcAg的表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白具有式Ia、式Ib或式Ic所述结构:
T-U-H-C(Ia),
T-C-U-H(Ib),或
T-H-U-C(Ic),
其中,
T为任选的标签序列和/或信号肽序列;
C为包括CTP的多肽元件;
U为包括Ub的多肽元件;
H为包括HBcAg的多肽元件;
“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头;优选地,
所述多肽元件C选自下组:
(A)具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽;
(B)具有与SEQIDNO:2中任一所示氨基酸序列≥80%同源性(优选地,≥90%的同源性;等优选地≥95%的同源性;最优选地,≥97%的同源性)的多肽;
(C)将SEQIDNO:2或4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽;和/或
所述多肽元件U选自下组:
(A)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽;
(B)具有与SEQIDNO:4中任一所示氨基酸序列≥80%同源性(优选地,≥90%的同源性;等优选地≥95%的同源性;最优选地,≥97%的同源性)的多肽;
(C)将SEQIDNO:4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽;和/或
所述多肽元件H选自下组:
(A)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽;
(B)具有与SEQIDNO:6中任一所示氨基酸序列≥80%同源性(优选地,≥90%的同源性;等优选地≥95%的同源性;最优选地,≥97%的同源性)的多肽;
(C)将SEQIDNO:6中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:8或10所示。
3.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
4.一种载体,其特征在于,所述载体包括权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白;和/或
所述宿主细胞基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸;和/或
所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体。
6.一种制备融合蛋白的方法,其特征在于,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养权利要求5所述的宿主细胞,从而表达出权利要求1所述的融合蛋白;和
分离所述融合蛋白。
7.一种药物组合物,其特征在于,所述组合物包含:权利要求1所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述载体,以及药学上可接受的载体或赋形剂。
8.一种疫苗组合物,其特征在于,所述组合物包含:权利要求1所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述载体,以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
9.权利要求1所述的融合蛋白的用途,其特征在于,用于制备药剂或试剂,所述药剂或试剂用于:
(1)治疗HBV感染;和/或
(2)诱导HBV特异性的CTL反应;和/或
(3)诱导T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子;和/或
(4)刺激T淋巴细胞增殖。
10.一种治疗HBV感染或HBV感染相关疾病的方法,其特征在于,包括步骤:给需要的对象施用权利要求1所述的融合蛋白。
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