EA005821B1

EA005821B1 - Иммуномодулирующие пептиды, полученные из белков теплового шока, и их применение

Info

Publication number: EA005821B1
Application number: EA200300438A
Authority: EA
Inventors: Альберто Мартини; Сальваторе Альбани; Деннис Карсон; Берент Дж. Праккен
Original assignee: Дзе Реджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния; Альберто Мартини
Priority date: 2000-11-01
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2005-06-30
Also published as: BR0115246A; CN1481390B; WO2002036611A2; IL155610A0; MXPA03003901A; WO2002036611A3; CA2427572A1; EA200300438A1; ATE548376T1; JP2004537496A; US20080187550A1; US7301005B2; EP1355923B1; KR20030055295A; JP4264257B2; EP1355923A2; CN1481390A; US20030031679A1; AU2002220038A1

Abstract

Описан способ модуляции иммунного ответа у индивидуума. Изобретение основано на открытии того, что эффективная терапевтическая стратегия в уменьшении интенсивности связанных с воспалением симптомов опосредованного иммунитетом заболевания, такого как артрит, может быть осуществлена путём модуляции самого лежащего в основе иммунного ответа, а не нацеливанием только на являющееся конечным результатом воспаление. Эта стратегия может быть использована для регуляции воспалительной реакции и применима ко многим ситуациям, в которых требуется иммунная модуляция, к таким как стимуляция толерантности в слизистой оболочке, ДНК-вакцинация, индуцирование анергии, активная иммунизация и модуляция ex vivo антигенспецифических Т-клеток. В одном из вариантов осуществления способ включает введение индивидууму пептида бактериального dnaJ, или его человеческого гомолога, или его негомологичной человеческой изоформы.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится вообще к способам и составам для модуляции иммунного ответа у индивидуума, а более конкретно - к композициям, содержащим бактериальный пептид йпа1 или его человеческий гомолог, или его негомологичную человеческую изоформу, и к способам применения таких композиций для стимулирования иммунного ответа или для создания толерантности к иммуногену. По существу, настоящее изобретение предусматривает различные способы регулирования воспалительной реакции, в том числе способы повышения толерантности слизистой оболочки, ДНК-вакцинации, индуцирования анергии (отсутствия реакции на раздражители) и активной иммунизации.

Предшествующий уровень техники

Стратегии лечения многих заболеваний направлены скорее на смягчение симптомов заболевания, чем на удаление причины составляющих проблему симптомов. Например, в случае воспалительных заболеваний основные способы лечения направлены на ослабление воспаления, в основном с помощью стероидных или нестероидных противовоспалительных агентов.

Воспаление часто является следствием иммунного ответа. Хотя иммунный ответ (иммунная реакция) и последующая воспалительная реакция, как правило, полезны для индивидуума, например, если это реакция на бактериальную инфекцию, но в некоторых случаях иммунный ответ и воспалительная реакция приводят к пагубным последствиям. В частности, пациенты с аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, системная красная волчанка и подобные им, часто страдают острым и в некоторых случаях системным поражением тканей. Хотя введение, например, стероидного лекарства может снизить у таких пациентов остроту иммунной реакции, длительное применение таких лекарств может привести к побочным эффектам, в том числе снизить качество жизни пациента. Более того, применение таких лекарств, вообще говоря, снижает способность индивидуума формировать иммунный ответ, в результате чего индивидуум подвержен кратковременным инфекциям, которые могут иметь серьёзные последствия. Таким образом, существует потребность в композициях и способах, которые применимы для специфической модуляции иммунного ответа и связанной с ним воспалительной реакции. Настоящее изобретение удовлетворяет этой потребности и обеспечивает дополнительные преимущества.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным пептидам, происходящим из белка теплового шока (БТШ, англоязычное сокращение - йзр) йпаТ и способам применения таких пептидов в качестве способа модуляции иммунного ответа у индивидуума. Как описано в настоящей заявке, иммуногенные пептиды настоящего изобретения, действующие через опосредованный Т-клетками иммунный ответ, включают «провоспалительные пептиды» (стимулирующие воспаление), результатом действия которых является усиление экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как интерферон-гамма, и «антивоспалительные пептиды» (подавляющие воспаление), результатом действия которых является усиление экспрессии антивоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-10. Пептиды в общем случае могут быть охарактеризованы так же, как «гомологичные пептиды», имеющие аминокислотную последовательность, которая относительно консервативна для БТШ йпа1 различных видов, и «негомологичные пептиды», имеющие аминокислотную последовательность, которая не является существенно консервативной.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у индивидуума. Способ настоящего изобретения может быть осуществлён, например, путём введения индивидууму иммуногенной пептидной части БТШ йпа1 и модуляции таким путём иммунного ответа у индивидуума. БТШ йпа1 может быть прокариотным или эукариотным БТШ йпаТ в том числе, например, бактериальным БТШ йпа1, таким как БТШ йпа1 Е. сой; БТШ йпа1 беспозвоночных, таким как БТШ йпа1 дрожжей; или БТШ йпа1 позвоночных, таким как БТШ йпа1 млекопитающих, в том числе БТШ йпа1 человека, такой как человеческий белок Н8Л, НЭП или ΗΌ12.

Иммуногенным пептидом может быть любая иммуногенная часть БТШ йпа1, в том числе гликозилированная форма такого пептида, и в общем виде это пептид, который может связываться с рецептором молекул II класса главной системы тканевой совместимости (ГСТС, англоязычное сокращение - МНС) или с рецептором Т-клеток и который представляет собой эпитоп, который является существенно специфичным для полипептида йпа! Например, пептид может быть иммуногенной пептидной частью БТШ йпа1 Е. сой, таким как пептид, имеющий аминокислотную последовательность ООУУЕ1БСУ8КТАЕЕ (8 ЕС) ГО N0: 1), РКАУКРЕАУКУНРЕР (8ЕС) ГО N0: 2), СКРААУЕОУСНААРЕС) (НЕС) ГО N0: 3), (Х.₁ЕРАУ()()ТСР11С()С, (8 ЕС) ГО N0: 4), 8КТЕ8УК1РСАУПТС (8 ЕС) ГО N0: 5), СЕЕУУСАПУКС)! 1Р1Е (8Е() ГО N0: 6), УСЕУРЮТАМААЬСС (8Е() ГО N0: 7) или Р1ХРАМААЕССЕ1ЕУ (8Е() ГО N0: 8); или иммуногенной пептидной частью БТШ йпа1 человека Н8Л, НОЛ ΗΌ12, такой как пептид с аминокислотной последовательностью А8УУЕ1ЕЛУРЕ8А8А (8Е0 ГО N0: 9), КЕУУ0ТЕСЕАРСА8Е (8Е0 ГО N0: 10), ТТУУЭУЕСУКРХАТО (8 ЕС) ГО N0: 11), ККАУРРКАЕСАНРЕК (8 ЕС) ГО N0: 12), КРАУРРОАБРУНРЕК (8 ЕС) ГО N0: 13), ККАУРКЕ АРКУНРЕК (8 ЕС) ГО N0: 14),

РР8У81'8ТГЕУОСРР (8ЕС) ГО N0: 15), 1УА1УС)С)1С)8УС\1ЕСС) (8Е() ГО N0: 16) СРРП'ТШИМЕХСЮЕ (8Е0 ГО N0: 17), или пептидом с аминокислотной последовательностью 0АУЕУЕ8ОАККРЕЕУО (8Е0 ГО N0: 18), ЕАУЕУЬ8ПКНКРЕ1УВ (8 ЕС) ГО N0: 19), 8СРЕЕТЕ888ЕРСН8 (8 ЕС) ГО N0: 20),

- 1 005821

ΌΟΡΕΚδνΤΙΝΟνΡΌΌ (ΜΓ) ΙΌ N0: 21), 1Ш0ЕА\1А¥ММЛ1ЕЛ (ΜΓ) ΙΌ N0: 22), Е1)ЕЕ\1С\11)ЮЕУЕЛЬ (МГ) ΙΌ N0: 23), Ε(Γι1Γ)ΚΡΙΜ'ΕΙ)ΝΊΜ (МГ) ΙΌ N0: 24), 1ΜΙ\ΊΤ81 ΙΡΟΟΙνΚΙΙ (МГ) ΙΌ N0: 25) или С1^IIЕΕΚVNΕΡЕNС (МГ) ΙΌ N0: 26).

Способ по настоящему изобретению может модулировать иммунный ответ путём усиления или ослабления воспалительной реакции, связанной с иммунным ответом. Так, в одном из вариантов осуществления способ по настоящему изобретению предусматривает путь усиления или индуцирования у индивидуума воспалительной реакции. В одном из аспектов способ усиления или индуцирования у индивидуума воспалительной реакции осуществляется введением индивидууму пептида, имеющего провоспалительную активность, т.е. провоспалительного пептида, в условиях иммунизации. В другом аспекте способ осуществляется введением индивидууму антивоспалительного пептида в условиях стимуляции толерантности. Еще в одном аспекте способа вводят комбинацию иммуногенных пептидов, например, в условиях иммунизации вводят два или более провоспалительных пептида или в условиях стимуляции толерантности вводят два или более антивоспалительных пептида, или по меньшей мере один провоспалительный пептид в условиях иммунизации и по меньшей мере один антивоспалительный пептид в условиях стимуляции толерантности. Результатом действия такого способа усиления или индуцирования воспалительной реакции является повышение у индивидуума уровня провоспалительного цитокина, такого как интерферон-гамма (№N7, ИФНу), фактор-α некроза опухолей (ФНОа, ТМа), интерлейкин-1 (ТС-1), Ш-6, ΙΕ-12 или ΙΕ-23, или снижение у индивидуума уровня антивоспалительного цитокина, такого как ΙΕ-4, Ш-10, или фактора-β трансформации роста (ΤΟΕβ), или же их комбинаций.

В другом варианте осуществления способ по настоящему изобретению предусматривает пути ослабления или подавления у индивидуума воспалительной реакции. В одном из аспектов способ ослабления или подавления у индивидуума воспалительной реакции осуществляется введением индивидууму в условиях иммунизации пептида, имеющего антивоспалительную активность. В другом аспекте способ осуществляется введением индивидууму в условиях стимуляции толерантности провоспалительного пептида. Еще в одном аспекте способа вводят комбинацию иммуногенных пептидов, например, в условиях стимуляции толерантности вводят два или более провоспалительных пептида или в условиях иммунизации вводят два или более антивоспалительных пептида, или же по меньшей мере один провоспалительный пептид в условиях стимуляции толерантности и по меньшей мере один антивоспалительный пептид в условиях иммунизации. Результатом действия такого способа ослабления или подавления воспалительной реакции является повышение у индивидуума уровня антивоспалительного цитокина, такого как ΙΕ-4, ТС-10 или ΤΟΕβ, или понижение у индивидуума уровня провоспалительного цитокина, такого как ΙΕΜγ. ЮТа, ΙΕ-1, Ш-6, Ш-12 или Ш-23, или же их комбинаций.

Как раскрыто в настоящем описании, можно ввести одну иммуногенную пептидную часть БТШ биа1 или их комбинацию, в том числе, например, любой из иммуногенных пептидов, примеры которых представлены МО ΙΌ N0: 1 - 8Е0 ΙΌ N0: 26, или любую их комбинацию. Как будет видно из представленного описания, пептид по настоящему изобретению вводят индивидууму в условиях иммунизации или в условиях стимуляции толерантности, в зависимости от того, является ли пептид провоспалительным пептидом или антивоспалительным пептидом, и в зависимости от того, вводится ли пептид для усиления или индуцирования воспалительной реакции, или же для ослабления или подавления воспалительной реакции. Пептид может вводиться в условиях иммунизации путём введения иммуногенного количества пептида, например, внутрикожно, подкожно или внутримышечно, и, при необходимости, в составе композиции, в состав которой входит иммуноадъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда. Пептид может вводиться в условиях стимуляции толерантности путём введения вызывающего толерантность количества пептида, например, в слизистую оболочку или же внутрикожно, подкожно или внутримышечно.

Способ по настоящему изобретению может применяться на практике по отношению к индивидууму, имеющему или предрасположенному, или восприимчивому к любому состоянию, в котором необходимо модулировать иммунный ответ, включая индивидуума, имеющего иммунологическое расстройство или восприимчивому или предрасположенному к иммунологическому расстройству. В общем случае индивидуум представляет собой позвоночное существо, в частности млекопитающее, в том числе домашнее животное, такое как кошка, собака или лошадь; сельскохозяйственное животное, такое как овца, корова или свинья; а также это может быть человек. Иммунологическое расстройство может представлять собой расстройство иммунной системы, такое как аутоиммунное заболевание (например, артрит, такой как олигоартикулярный (развивающийся в малом числе суставов) юношеский идиопатический артрит), или сопровождающееся иммунодефицитом заболевание, такое как заболевание с приобретённым иммунодефицитом (СПИД). Дополнительные болезненные состояния, при которых может быть необходимо модулировать иммунный ответ, включают состояния, при которых у индивидуума не развивается нормальная иммунная реакция, например, в ответ на инфекционное заболевание или рак, или состояние, при котором иммунный ответ индивидуума слишком силён, например у индивидуума, страдающего воспалительным заболеванием кишечника, отличающимся от аутоиммунного заболевания, или у индивидуума с бактериальным сепсисом.

- 2 005821

Настоящее изобретение относится также к способу модуляции реакционной способности (реактивности) иммуноэффекторных клеток. Такой способ может быть осуществлён, например, приведением иммуноэффекторных клеток индивидуума в контакт с пептидной частью БТШ бпаТ БТШ биа1, из которого получен пептид, может быть любым БТШ биаб, как они раскрыты здесь, или известным иначе в данной области, включая прокариотный или эукариотный БТШ бпаТ Пептид может быть включён, но не обязательно, в состав композиции, которая может также содержать, при необходимости, иммуноадъювант или иной иммуномодулирующий агент, например один или несколько цитокинов. Иммуноэффекторные клетки, которые могут быть любыми клетками, участвующими в опосредованном Т-клетками иммунном ответе, в частности Т-клетками, могут быть приведены в контакт с пептидом ίη νίνο путём введения пептида индивидууму или могут быть приведены в контакт ίη νίίτο.

В том случае, когда иммуноэффекторные клетки приведены в контакт ίη νίίτο (или ех νίνο), способ может дополнительно включать введение контактирующих иммуноэффекторных клеток индивидууму, что обеспечивает способ модуляции у индивидуума иммунного ответа. Сами по себе иммуноэффекторные клетки могут быть аутологичными (собственными) по отношению к индивидууму, т.е. клетки, извлечённые из пациента, приводились в контакт с пептидом ех νίνο, затем вводились индивидууму, при необходимости, после роста клеток в культуре. Иммуноэффекторные клетки могут также быть аллогенными по отношению к индивидууму, например, это клетки, которые по отношению к индивидууму могут быть хотя бы частично гаплотипными. Поэтому такой способ обеспечивает путь модуляции иммунного ответа путём усиления или индуцирования у индивидуума воспалительной реакции или путём ослабления или подавления у субъекта воспалительной реакции.

Настоящее изобретение относится также к иммуногенной пептидной части БТШ бпа1, имеющей провоспалительную или антивоспалительную активность. Примерами таких иммуногенных пептидов настоящего изобретения являются пептиды, приведённые далее как последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 1 8 ЕС ΙΌ N0: 26. Кроме того, настоящее изобретение относится к химерному полипептиду, который содержит пептид настоящего изобретения, функционально («оперативно») связанный по меньшей мере с одним гетерологичным полипептидом. Композицию, содержащую по меньшей мере один пептид настоящего изобретения, предусматривает, например, композиция, содержащая любой из пептидов, представленных среди последовательностей 8ЕС ΙΌ N0: 1 - 8ЕС ΙΌ N0: 26, и композиция, содержащая любую комбинацию таких пептидов, в частности, композиция, содержащая комбинацию провоспалительных пептидов, и композиция, содержащая комбинацию антивоспалительных пептидов. Композиция по настоящему изобретению обычно входит в состав физиологически приемлемого раствора и при необходимости может дополнительно содержать один или несколько иммуноадъювантов, например, один или несколько цитокинов, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, квасцы или подобное им. Вообще, если композиция содержит один или несколько цитокинов, цитокины имеют воспалительную активность, такую же, как воспалительная активность пептидов настоящего изобретения, или дополняющую ее (комплементирующую).

Далее настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему иммуногенный пептид настоящего изобретения. Полинуклеотид может быть однонитевым или двунитевым, и он может быть молекулой рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их гибридом. Предлагается также рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид настоящего изобретения, оперативно связанный по меньшей мере с одной гетерологичной нуклеотидной последовательностью. Гетерологичной нуклеотидной последовательностью может быть любая нуклеотидная последовательность, которая обыкновенно обнаруживается в природе в непосредственном соединении с полинуклеотидом настоящего изобретения. Например, гетерологичной нуклеотидной последовательностью может быть последовательность контроля экспрессии, такая как регуляторный элемент транскрипции или регуляторный элемент трансляции или их комбинация; или эта последовательность может кодировать полипептид, такой как цитокин или иной иммуномодулирующий агент, пептидную метку («1ад») экспрессированной последовательности, домен клеточной локализации, или подобный им. Предлагается также вектор, содержащий полинуклеотид настоящего изобретения, например, экспрессирующий вектор, и клетка, содержащая полинуклеотид или вектор настоящего изобретения.

Способ модуляции иммунного ответа по настоящему изобретению основан на том открытии, что эффективная терапевтическая стратегия ослабления связанных с воспалением симптомов опосредованного иммунитетом заболевания (такого как артрит) может быть достигнута преимущественно модуляцией лежащего в основе иммунного ответа, а не просто воздействием на являющееся результатом воспаление. Эта стратегия может быть использована для регуляции воспалительной реакции и применима во многих ситуациях, при которых необходима иммуномодуляция, в том числе, например, повышение толерантности слизистых оболочек, ДНК-вакцинация, индуцирование анергии, активная иммунизация и модуляция ех νίνο антигенспецифических Т-клеток.

В различных примерах осуществления модуляция может включать повышение у индивидуума уровней провоспалительных цитокинов, таких как ИФНу или фактор некроза опухолей ТБЕа; стимуляцию пролиферации одноядерных клеток; или повышение у индивидуума уровней антивоспалительных

- 3 005821 цитокинов, таких как ЕЛ-10, 1Ь-4 или ΤΟΕβ. В других вариантах осуществления модуляция может включать снижение или подавление уровней цитокинов у индивидуума. Как таковые, композиция или способ по настоящему изобретению предусматривает путь усиления провоспалительной реакции или толерогенной реакции в соответствии с особенностями подлежащего лечению индивидуума.

Способ настоящего изобретения полезен для лечения индивидуума, страдающего заболеванием, которое включает или опосредовано иммунным ответом, например аутоиммунным заболеванием, инфекционным заболеванием или онкологическим заболеванием. Примеры аутоиммунного заболевания, которое можно лечить в соответствии со способом настоящего изобретения, включают артрит, в частности олигоартикулярный юношеский идиопатический артрит (оЮИА), диабет и рассеянный склероз. Композиция или способ по настоящему изобретению могут быть также полезны как часть схемы лечения с помощью комбинированного воздействия, например, как вспомогательное средство в противораковой терапии или в терапии, направленной против инфекционного агента.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1А-1С.

Фиг. 1А показывает пролиферативные реакции одноядерных клеток периферической крови (ОКПК) и одноядерных клеток синовиальной жидкости (ОКСЖ) здоровых индивидуумов («контроль») и пациентов с олигоартикулярным юношеским идиопатическим артритом («оЮИА»), стимулированных в течение 96 ч рекомбинантным БТШ бпа1 Е. сой. Результаты, выраженные значениями индекса стимуляции (ИС), представлены как средние значения + стандартное отклонение.

Фиг. 1В даёт оценку типов Т-клеток С.П69+ от здоровых индивидуумов («Контроль») и пациентов с оЮИА после инкубации в течение 72 ч с рекомбинантным БТШ биаЧ Е. сой. Результаты, выраженные в виде процентного содержания клеток ί.Ό3+ί.Ό69+, представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

Фиг. 1С даёт результаты определения отношения индексов стимуляции (ИС) в парных образцах клеток ОКПК-ОКСЖ от пациентов с оЮИА, стимулированных в течение 96 ч рекомбинантным БТШ биа1 Е. сой.

Фиг. 2 показывает продуцирование цитокинов (ИФНу, ΤΝΡα, 1Ь-10 и 1Ь-4, как указано) в надосадочных жидкостях культур ОКПК или ОКСЖ здоровых индивидуумов («контроль») или пациентов с оЮИА, стимулированных в течение 72 ч рекомбинантным БТШ биаЧ Е. сой. Результаты, выраженные значениями с размерностью пг/мл, представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

Фиг. ЗА и 3В показывают пролиферативные реакции ОКСЖ пациентов с оЮИА (фиг. 3А) и пациентов с антигеном лейкоцитов человека (АЛЧ) В27+ (фиг. ЗА), инкубированных в течение 72 ч с пептидами рекомбинантного БТШ биаЧ Е. сой и повторно стимулированных с аутологичными облучёнными подпитывающими (Гссбсг) клетками в присутствии или в отсутствие постороннего контрольного пептида (ОУА) или полученных из БТШ Е. сой пептидов, как указано. Результаты, выраженные значениями индекса стимуляции (ИС), представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

На фиг. 4 показано продуцирование 1Й-10 в надосадочных жидкостях культур ОКСЖ пациентов с оЮИА, стимулированных в течение 72 ч пептидами БТШ биаЧ Е. сой и повторно стимулированных с аутологичными облучёнными подпитывающими клетками, предъявляющими человеческий пептид, гомологичный или не гомологичный бактериальным пептидам. Результаты, выраженные значениями с размерностью пг/мл, представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

Фиг. 5 показывает продуцирование 1Й-10 в надосадочных жидкостях культур ОКСЖ пациентов с оЮИА, стимулированных в течение 72 ч БТШ биаЧ Е. сой и повторно стимулированных с аутологичными облучёнными подпитывающими клетками, предъявляющими гомологичные или негомологичные человеческие пептиды (как указано). Результаты, выраженные значениями с размерностью пг/мл, представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

Фиг. 6 показывает значения ИС для негомологичных пептидов человека 50, 51, 134, 197, 254, 256, 270, 283 и 318 (соответственно последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 18-8ЕО ΙΌ N0: 26).

На фиг. с 7 по 9 показаны уровни соответственно ИФНу, ΤΝΕ и 1Б-10 в ответ на действие пептидов, представленных на фиг. 6.

Фиг. 10 показывает значения ИС в ответ на действие бактериального БТШ биаЧ (4) (8Е0 ΙΌ N0: 1) и его человеческих гомологов: (2) (Н8Л, 8ЕО ΙΌ N0: 9), (3) (ΗΌΠ, 8ЕО ΙΌ N0: 10) и (5) (ΗΌ12, 8ЕО ΙΌ N0: 11).

На фиг. с 11 по 13 показаны уровни соответственно ИФНу, ΤNΕα и ΙΠ-10 в ответ на действие пептидов, представленных на фиг. 10.

Фиг. 14 показывает значения ИС в ответ на действие бактериальных пептидов биа1 4, 22, 61, 174, 209, 242, 264 и 268 (соответственно последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 - 8Е0 ΙΌ N0: 8).

Фиг. с 15 по 18 показывают соответственно ИС и уровни ΤNΕα, ИФНу, и ΙΠ-10 в ответ на действие бактериального биаЧ 174 (8Е0 ΙΌ N0: 4) и его человеческих гомологов 164 (8Е0 ΙΌ N0: 15, Н8П), 167 (8ЕО ΙΌ N0: 16, ΗΌ12) и 176 (8ЕО ΙΌ N0: 17,Н8П).

Фиг. с 19 по 22 показывают соответственно ИС и уровни Τ№α, ИФНу, и ГЬ-Ю в ответ на действие

- 4 005821 бактериального биа1 22 и его человеческих гомологов 20 (Н8Л), 21 (НЛЛ) и 23 (ΗΌ12).

Фиг. 23 показывает пролиферативные реакции клеток на различные пептиды у пациентов с оЮИА («олиго») в сравнении с пациентами с иными, чем оЮИА, формами ЮИА («сист / поли»). Результаты представлены как значения ИС («усы» показывают стандартное отклонение). Контрольными пептидами являются раибг и биа1ру.

Фиг. 24А показывает процентное содержание СТБА4/СО25 позитивных клеток в ответ на стимуляцию пептидами 174 и 134. «ТС» обозначает нестимулированную культуру ткани. «Усы» показывают стандартное отклонение.

Фиг. 24В показывает выраженное в пг/мл продуцирование 1Ь-10 клетками ОКСЖ пациентов с оЮИА, стимулированными пептидами 174 и 134.

Фиг. с 25А по 25С показывают пролиферативную реакцию (ИС, фиг. 25А) и продуцирование ИФНу (фиг. 25В) или 1Ь-10 (фиг. 25С) клетками ОКСЖ пациентов с оЮИА, стимулированными различными пептидами, согласно обозначениям.

Фиг. с 26А по 26Е показывают результаты индуцированной обработкой модуляции реакций Тклеток на бпаТРТ На фиг. 26А показаны пролиферативные реакции Т-клеток в ОКПК, стимулированных в течение 5 дней 10 мкг/мл пептида бпаЛЛ (8ЕО Ю N0: 3). Определения производили с месячными интервалами. В контролях использовали фитогемагглютинин (ФГА) как общий митоген и бпа1ру (8Е0 Ю N0: 28). Методом БАС8 с месячными интервалами проводили определения внутриклеточного продуцирования цитокина (провоспалительного - фиг. 26В, С и Ό; толерогенного - фиг. 26 Е) клетками ОКПК тех пациентов, которые при предварительном обследовании (скрининге) давали позитивную реакцию. Результаты выражены процентным отношением содержания клеток СО3+ в стимулированных бпаГР1 и нестимулированных культурах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способ модуляции иммунного ответа у индивидуума. Как здесь описано, эффективная терапевтическая стратегия ослабления симптомов, связанных с воспалением, опосредованного иммунитетом заболевания (такого как артрит) может быть достигнута преимущественно модуляцией лежащего в основе иммунного ответа, а не просто воздействием на являющееся результатом воспаление. Эта стратегия может быть использована для регуляции воспалительной реакции и применима во многих ситуациях, при которых необходима иммуномодуляция, в том числе, например, повышение толерантности слизистых оболочек, ДНК-вакцинация, индуцирование анергии, активная иммунизация и модуляция ех νίνο антигенспецифических Т-клеток.

Настоящее изобретение предусматривает пептиды для применения в модуляции иммунного ответа. Пептиды настоящего изобретения являются иммуногенными пептидами, выбранными по их способности связываться с наиболее общими аллелями человеческого АЧЛ II класса. Как здесь описано, иммуногенным пептидом может быть любая иммуногенная часть БТШ бпа1, и обычно это пептид, который может связываться с рецептором II класса молекул главной системы тканевой совместимости (ГСТС, англоязычное сокращение - МНС) или с рецептором Т-клетки и который обеспечивает эпитоп, существенно специфичный для полипептида бпа!

Иммуногенные пептиды, приведённые здесь в качестве примеров, происходили из белков теплового шока (БТШ, англоязычное сокращение - йкр) микробов и млекопитающих, в том числе БТШ бпа1 Е. сой (см. СепВапк, № доступа ΝΡ_308042), и гомологи белка бпа1 человека, такие как Н8Л (СепВапк, № доступа ХР_010863), НЭИ (СепВапк, № доступа Р25685) и ΗΌ12 (СепВапк, № доступа Р31689). Однако необходимо учитывать, что белки, гомологичные бпа1 Е. сой, или гомологи бпа1 человека также могут быть использованы в качестве источника для получения из них иммуногенного пептида, пригодного для применения в способе по настоящему изобретению. Такие гомологи бпа1 хорошо известны в данной области и включают, например, гомологи, кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты, которые клонированы из различных прокариотных и эукариотных организмов, таких как УегДша рекйк (СепВапк, № доступа САС89325), 8ассйаготусе§ сеге\'№ае (СепВапк, № доступа ΝΡ_013884), полосатый данио (Вгасйубашо гегю) (СепВапк, № доступа В1846679), курица (СепВапк, № доступа В1391025), мышь (СепВапк, № доступа ΝΡ_064662). Понятно, что и в других организмах могут быть идентифицированы дополнительные БТШ бпак они могут быть получены поиском молекулы нуклеиновой кислоты или белковой последовательности в нуклеотидных или белковых банках данных, таких как банк данных Национального Центра Биотехнологической Информации США (№1Еопа1 Сеп1ег Гог Вю1есйпо1оду [пГоппайоп. NСВI), с помощью таких обозначений, как бпаТ¹, Н8Л или подобных им, и способа поиска и параметров поиска, раскрытых здесь.

Как здесь описано, пептидные части белка бактериального БТШ биа1 и человеческих БТШ Н8Л, НОЛ и НО12, в том числе пептиды, гомологичные пептидным последовательностям бактериального БТШ бпа.1 («гомологичные человеческие пептиды»), и пептиды, негомологичные пептидным последовательностям бактериального БТШ бпа.1 («негомологичные человеческие пептиды»), могут модулировать иммунный ответ индивидуума. Типичные пептиды бактериального БТШ бпа.1 и гомологичные и негомологичные человеческие пептиды включают пептиды бактериального бпа1

- 5 005821

йпаб 4	ΟΟΥΥΕΙΚ3ν3ΚΤΑΕΕ	(ЗЕО Ю ΝΟ: 1)
Спаб 22	ΡΚΑΥΚΡΙ.ΑΜΚΥΗΡΟΕ	(ЗЕО Ю ΝΟ: 2)
йпаб 61	ΟΚΡΑΑΥΟΟΥΘΗΑΑΡΕΟ	(ЗЕО Ю ΝΟ: 3)
с1паб 174	ОСЕЕАУСЮТСРНСОО	(ЗЕО Ю ΝΟ: 4)
бпаб 209	εκτίδνκίΡΟΑνοτβ	(ЗЕО Ю ΝΟ: 5)
Йпаб 242	οοίγνονονκοΗΡίρ	(ЗЕО Ю ΝΟ: 6)
4паб 264	ΥΟΕνΡΙΝΡΑΜΑΑίΘΟ	(ЗЕО 10 ΝΟ: 7)
йпаб 268	ΡΙΝΕΑΜΑΑΙ_(3<3ΕΙΕν	(ЗЕО Ю ΝΟ: 8)

гомологичные человеческие пептиды (Η861) ΑδΥΥΡΙΡΙΑΤΗδΑδΑ (гомолог пептида 4 бактериального йпаб; δΕΟ ГО N0: 9) (ΗΌ61) ΚΙΙΥΥΟΤΕΟΕΑΡΟΑδΙ) (гомолог пептида 4 бактериального йпаб; δΕΟ ГО N0: 10) (ΗΌ62) ΤΤΥΥυνΕΕινΚΡΥΛΤΌ (гомолог пептида 4 бактериального йпаб; δΕΟ ГО N0: 11) (Η861) ΚΚΑΥΡΡΚΑΡΟΑΗΡΟΚ (гомолог пептида 22 бактериального йпаб; δΕΟ ГО N0: 12) (ΗΌ61) ΚΡΑΥΡΡΟΑΡΡΥΗΡΟΚ (гомолог пептида 22 бактериального йпаб; δΕΟ ГО N0: 13) (ΗΌ62) ΚΚΑΥΡΚΕΑΡΚΥΗΡΟΚ (гомолог пептида 22 бактериального йпаб; δΕΟ ГО N0: 14)

164 (Ηδ61) ΕΡδνδΤ'δΤ'Τ'ΡνΟΟΡΡ (гомолог пептида 174 бактериального йпаб; δΕΟ ΙΌ N0: 15)

167(ΗΌ62) 1ΑΑΐν(Χ)Ι6)δν(Α1Ρ(Ό (гомолог пептида 174 бактериального йпаб; δΕΟ ΙΌ N0: 16)

176(Ηδ61) ΟΡΡΓΤΤ'ΡΡΙΜΕΧΟΟΕ (гомолог пептида 174 бактериального йпаб; δΕΟ ΙΌ N0: 17) негомологичные человеческие пептиды (Ηϋ62) ΟΑΥΕνίδϋΑΚΚΡΕίΥΟ (НЗЛ) ΕΑΥΕνί80ΚΗΚΚΕΙΥ0 134 (НЗЛ) 56ЕЕЕТЕЗЗЗЕРСН5

197 (НЗЛ) ΟΘΟίΚδνΤΙΝΟνΡΟΟ

254 (Н8Л) ΟίΟΙ-ΑΜΑΥδίδΕΜΕΑ

256 (Н0Э2) Е01.РМСМ0101УЕА1.

270 (Η0ΰ2) Ι_Ο<3ΕΟΚΡΙ8ΤΙ_ΟΝΕ{Τ

283 (Н0Э2) ΗΤΜΤδΗΡΟΟίνΚΗ

318 (Η062) 0ΚΙ_ΙΙΕΕΚνΝΕΡΕΝ6 (δΕΟ ΟΝΟ: 18) (ЗЕО Ю ΝΟ: 19) (ЗЕО Ю ΝΟ: 20) (8Ε0 Ю N0: 21) (ЗЕО Ю N0: 22) (8Ε0 Ю N0:23) (8Ε0 Ю ΝΟ: 24) (8ΕΟ Ю N0: 25) (8Ε0 Ю ΝΟ: 26)

Иммуногенные пептиды настоящего изобретения включают «провоспалительные пептиды», результатом действия которых является повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов, таких как интерферон-гамма, и «антивоспалительные пептиды», результатом действия которых является повышенная экспрессия антивоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-10. Определение того, имеет ли пептид настоящего изобретения провоспалительную активность или антивоспалительную активность, удобно проводить с помощью анализов ίη νίΐΓΟ, как раскрывается здесь (см. примеры 1 и 2), или можно проводить с помощью любого метода, обычно используемого в данной области для определения, например, идентичности и количества цитокинов, экспрессируемых вследствие контакта пептида с иммуноэффекторными клетками. В том смысле, как он использован здесь, термин «иммуноэффекторные клетки» относится к клеткам, непосредственно вовлечённым в создание или действие иммунного ответа. Такие клетки хорошо известны в данной области и включают В-лимфоциты (В-клетки); предъявляющие антиген клетки, такие как дендритные клетки, одноядерные фагоцитные клетки, макрофаги, в том числе клетки Лангерганса, и (у человека) клетки эндотелия венул (и В-клетки); и в особенности Т-клетки, например Т-хелперные клетки, Т-супрессорные клетки и цитотоксичные Т-клетки.

По характеристикам иммуногенные пептиды настоящего изобретения можно разделить на две основные категории, а именно пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, относительно сохраняемую (консервативную) для БТШ йпаб различных видов («гомологичные пептиды»), и пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, существенно не сохраняемую среди БТШ йпаб («негомологичные пептиды). Термин «гомология», как он использован здесь, относится к аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, которая имеет степень идентичности последо

- 6 005821 вательности с референтной последовательностью не менее 50%, если располагается и сопоставляется для максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области и если эта степень идентичности измеряется с помощью любого числа алгоритмов сопоставления или путём выравнивания последовательностей вручную и их визуального обследования. Для целей определения степени идентичности последовательностей считают идентичными консервативные аминокислотные замещения, такие как взаимные замещения аминокислот, имеющих алифатическую гидрофобную боковую цепь (например, аланин, лейцин, изолейцин, валин), или аминокислот, имеющих кислотную боковую цепь (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), или аминокислот, имеющих основную боковую цепь (аргинин, лизин), или подобные замещения. Кроме того, определение гомологии может допускать одну или несколько вставок или делеций, предпочтительно одну или две вставки или делеции, при условии, что такие вставки или делеции учитываются для целей сравнения как аминокислоты, не являющиеся идентичными. Как таковые, гомологичные пептиды могут различаться по длине на одну, две или несколько аминокислот, при условии, что сохраняется минимальная степень идентичности последовательностей.

Как раскрывается в данном описании, гомологичные пептиды или полинуклеотиды настоящего изобретения имеют степень идентичности последовательностей не менее чем приблизительно 50%; как правило, они имеют степень идентичности последовательностей не менее чем приблизительно 60%, и степень идентичности их последовательностей с последовательностью референтного пептида или полинуклеотида может быть соответственно по меньшей мере не менее чем приблизительно 70% или не менее чем приблизительно 80%. Например, пептид 4 бактериального бпа1 (8ЕО ΙΌ N0: 1), содержащий 15 аминокислот, гомологичен пептиду 2 человеческого Η8Η (8Е0 ΙΌ N0: 9), содержащему 15 аминокислот и по отношению к 8Е0 ΙΌ N0: 1 имеющему 7 идентичных аминокислот и 2 консервативных замещения (9/15, 60%); он гомологичен пептиду 3 человеческого ΗΌΗ (8Е0 ΙΌ N0: 10), содержащему 15 аминокислот, причём по отношению к 8Е0 ΙΌ N0: 1 шесть аминокислот идентичны и имеются 3 консервативных замещения (9/15, 60%); и он гомологичен также пептиду 5 человеческого ΗΌ12 (8Е0 ΙΌ N0: 11), имеющему в сравнении с 8Е0 ΙΌ N0: 1 восемь идентичных аминокислот (8/15, 53,3%). Негомологичные пептиды настоящего изобретения включают такие пептиды, которые не являются гомологичными пептидами, но тем не менее имеют характеристики иммуногенного пептида настоящего изобретения.

Определить, достаточно ли гомологичен для целей нестоящего изобретения пептид или полинуклеотид, можно путём визуального сопоставления двух или нескольких последовательностей или с помощью компьютерного метода, который может быть также полезен для идентификации гомологичных последовательностей среди множества последовательностей, имеющихся в банках данных для молекул белков или нуклеиновых кислот. Например, степень гомологии или идентичности может быть измерена с помощью компьютерной программы анализа последовательностей, такой как 8ес.|иепсе Апа1ук1к 8оГ1\уагс Раскаде оГ 1йе Сепебск Сотри1ег Огоир (Ишуегайу оГ ХУйсощш Вю1ес1то1оду СсШсг. 1710 ищуегкйу Ауепие, Маб1коп, XVI 53705, И8А). Такая программа подбирает похожие последовательности, приписывая степени гомологии различным делециям, замещениям и другим модификациям. При использовании алгоритма сопоставления последовательностей испытуемую и референтную последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты последовательности и устанавливают параметры программы алгоритма сопоставления последовательностей. Могут быть использованы программные параметры определения неполного соответствия (значение беГаи11 - по умолчанию) или могут быть заданы альтернативные параметры. Затем алгоритм сопоставления последовательностей на основании программных параметров рассчитывает для испытуемой последовательности процент идентичности последовательности по отношению к референтной последовательности.

Термин «окно сравнения» используется здесь в широком смысле, чтобы ввести обозначение сегмента из любого числа соседствующих позиций, например, приблизительно от 9 до 50 аминокислотных позиций или приблизительно от 20 до 200 нуклеотидных позиций, в котором может быть произведено сравнение последовательности с референтной последовательностью из такого же числа соседствующих позиций, после того как обе последовательности оптимальным образом расположены параллельно (аНдпеб). Методы параллельного расположения сравниваемых последовательностей хорошо известны и включают, например, алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана (8ιηί11ι аиб Vаΐе^таη//Абν. Арр1. Ма111. 1981. т. 2. с. 482), алгоритм выровненного расположения по гомологиям (№еб1етап апб νπ^^/Τ Мо1. Вю1. 1970. т. 48. с. 443), метод поиска подобия (Регкоп апб Ыртап//Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А. 1988. т. 85. с. 2444), каждый из которых включён сюда ссылкой. Сопоставление последовательностей может быть произведено путём компьютеризованного введения этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТТТТ, ЕА8ТА и ТРА8ТА в V^ксоик^и СепеЕск 8оП\саге Раскаде, Сепебск Сотри1ег Сгоир, 575 8с1епсе Όγ., Маб1коп, ν1, И8А) или путём выровненного расположения этих последовательностей вручную и визуального сопоставления. Кроме программы ВБА8Т (Вакю Ьоса1 АНдптеЩ Зеагсй Тоо1, №Шопа1 Сеп1ег Гог Вю1од1са1 [пГогтаЕоп) могут быть использованы другие алгоритмы для определения степени гомологии или идентичности, включающие, например, АЬЮН АМА8 (Апа1ук1к оГ Ми1бр1у АНдпеб Зес-Щепсек), АМР8 (Рго1ет Ми1бр1е 8ес.|иепсе А1^дптеиΐ), А88ЕТ (АНдпеб 8едтеп1 81абкбса1 Еуа1иа1юп Тоо1), ВАИОЗ, ВЕ8Т8С0К, ВI08САN (Вю1одюа1 Зедиепсе Сотрагабуе Апа1ук1к №бе), ВЫМР8 (В1оскк IМР^оνеб

- 7 005821

Зеагсйег), ЕАЗТА, ΙηίβΓναίδ & Ροίηίδ, ВМВ, СЬиСТЛЬ V, СЕЕ'ЗТАЕ V, СОХ8ЕХ8Б8. ЕСОХ8ЕХ8Е8. \νί.ΌΝ8ΕΝ8υ8. алгоритм 8тН11-\Уа1егтап. ΌΛΚ^ΙΝ, алгоритм Баз Vеда8, ΕΝΆΤ (Еогсеб Хис1еоЕбе АНдптегИ Тоо1), Егатеайдп, Егатезеагсй, ΟΥΝΑΜΙΟ Е1БТЕК. Е8ЛР (ЕгМепзку 8ес.|иепсе Апа1у818 Раскаде), САР (С1оЬа1 АНдптегИ Ргодгат), 6ΕΝΑΕ, С1ВВЗ, СепОпезЕ 188С (ЗепщБе 8ес.|иепсе Сотрапзоп), ΓΑΜΟΝ (Боса1 8ес.|иепсе А11дптеп1), ЬСР (Ьоса1 Соп1еп1 Ргодгат), ΜΑСΑV (Ми1Рр1е АНдптегИ СопзйисРоп & АпаЕ'Ж \Vο^кЬеηс11). МАР (Ми1Рр1е АНдптегП Ргодгат), МВБКР, МВИ-КН Р1МА (Райегп1пбисеб Ми1Р-8ес.|иепсе А11дптеп1), 8АСА (8ес.|иепсе АНдптегП Ьу СепеРс А1доп1Ьт) и VНЛΤ-IЕ. Такие программы выровненного расположения могут также использоваться для первичного просмотра (скрининга) геномных банков данных, чтобы идентифицировать полинуклеотидные последовательности, имеющие в основном идентичные последовательности.

Примерами полезных алгоритмов являются алгоритмы ВБА8Т и ВБА8Т 2.0, описанные соответственно в работах А118сЬи1 и др.СМ-юБю АсИб Вез. 1977. Т. 25. С. 3389-3402 и А11зсЬи1 и др.//Б Мо1. Вю1. 1990. т. 215. с. 403-410, каждая из которых включена сюда ссылкой. Программа для осуществления анализов с помощью ВБА8Т открыто предоставляется №1юпа1 Сеп1ег Гог Вю1есРпо1оду 1пГогтаРоп (ИКБ в Интернете \\л\л\\псЬНп1т.т11.до\'). Этот алгоритм вначале проводит идентификацию пар нуклеотидов с высокой степенью регистрируемости (ЫдР зсоппд зецпепсе ра1гз, Н8Р) по идентификации в исследуемой последовательности коротких слов длиной ν, которые либо полностью соответствуют слову той же длины в последовательности из банка данных, либо удовлетворяют некоторому, имеющему положительную величину, пороговому значению отсчёта Т. Величину Т называют порогом прочтения соседствующего слова (А11зсйи1 и др., 1977, 1990, см. выше). Эти исходные попадания на соседствующие слова служат отправными центрами для инициирования перебора с поиском содержащих их более длинных Н8Р. Найденные слова удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, пока не достигается увеличение значения кумулятивного параллельного подобия (сити1а1^νе аНдптеп! зсоге). Кумулятивные значения вычисляются с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М («премиальное» значение за пару соответствующих друг другу нуклеотидов всегда > 0). Для аминокислотных последовательностей для расчёта величины кумуляции используется счётная матрица. Удлинение слов в каждом из направлений прекращается, если кумулятивный отсчёт параллельного соответствия падает на величину X ниже максимального достигнутого значения; кумулятивный отсчёт падает до нуля и ниже вследствие появления одного или нескольких нуклеотидных сопоставлений, дающих отрицательный отсчёт; или же достигнут конец каждой последовательности. Параметры алгоритма ВБА8Т V, Т и X определяют чувствительность и скорость параллельного выравнивания. Программа В^Л8ΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) использует как предел несовпадения длину слова (ν), равную 11, ожидание (Е), равное 10, М = 5, Ν = 4 и сопоставление обеих нитей. Для аминокислотных последовательностей программа ВБА8ТР использует как пределы несовпадения длину слова 3 и ожидание (Е) 10, а для счётной матрицы ВБО8ИМ62 (см. НешкоГГ апб Неп|коГГ//Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А. 1989. т. 89. с. 10915) используют масштаб выравнивания (В), равный 50, ожидание (Е), равное 10, М = 5, Ν = 4 и сопоставление обеих нитей.

Алгоритм ВБА8Т производит также статистический анализ подобия между двумя последовательностями (см., например, работу Каг1т апб А11зсйи1//Ргос. №11. Асаб. ИЗА, 1993. т. 90. с. 5873, включённую сюда ссылкой). Одной из мер подобия, даваемой алгоритмом ВБА8Т, является наименьшая суммарная вероятность (Р(№)), которая указывает вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может являться случайным. Например, нуклеиновая кислота считается подобной по последовательности референтной последовательности, если при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с референтной нуклеиновой кислотой наименьшая суммарная вероятность ниже чем приблизительно 0,2, более предпочтительно ниже чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно ниже чем приблизительно 0,001.

В одном из вариантов осуществления изобретения степень гомологии последовательностей белка и нуклеиновой кислоты оценивают с помощью программы Вазю Ьоса1 А11дптеп1 8еагс11 Тоо1 (ВБА8Т). В частности, для решения следующих задач используют пять специфических программ ВБА8Т:

(1) ВБА8ТР и ВБА8Т3 сопоставляют исследуемую аминокислотную последовательность с банком банных для белковых последовательностей;

(2) В^Л8ΤΝ сопоставляет исследуемую нуклеотидную последовательность с банком банных для нуклеотидных последовательностей;

(3) ВБА8ТХ сопоставляет рассчитанные продукты шестикодонной (δίχ-Ггате) трансляции исследуемой нуклеотидной последовательности (обе нити) с банком банных для белковых последовательностей;

(4) ΤВ^Л8ΤΝ сопоставляет исследуемую белковую последовательность с взятыми из банка данных нуклеотидными последовательностями, транслируемыми по всем шести рамкам считывания (обе нити); и (5) ТВБА8ТХ сопоставляет продукты шестикодонной трансляции исследуемой нуклеотидной последовательности с продуктами шестикодонной трансляции нуклеотидных последовательностей из банка данных для нуклеотидных последовательностей.

- 8 005821

Программы ВБА8Т идентифицируют гомологичные последовательности путём идентификации похожих сегментов, которые здесь обозначены как «пары сегментов с высокой регистрируемостью», при сопоставлении исследуемой аминокислотной или нуклеотидной последовательности с референтной последовательностью, предпочтительно получаемой из банка банных для аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Пары сегментов с высокой регистрируемостью предпочтительно идентифицируют (то есть располагают параллельно) с помощью счётной матрицы, многие из которых известны в данной области. Предпочтительно в качестве счётной матрицы используют матрицу ВЬО8иМ62 (см. работы Сопле! и др.//8с1епсе/1992. т. 256. с. 1443-1445; НешкокТ апб НешкоП7/Рго!еш5. 1993. т. 7. с. 49-61, каждая из которых включена сюда ссылкой). Менее предпочтительно могут быть также использованы матрицы РАМ и РАМ250 (Ма!псе5 ког Пе!ес!шд Ό 151апсе РекФогМирз: А!1а5 ок Рто!еш 8ес.|иепсе апб 8!гис!иге. Под ред. 8ск\\'аг!х и ОаукоГГ. №1бопа1 Вютебка1 Кезеатск Роипбабоп. \Уа51ипд1оп. 1978). Программы ВЬА8Т предоставляются, например, и.8. №1бопа1 ЫЬтату ок Мебюше на \теЬ-сайте с ИКЬ \\л\л\\псЬкп1т.шк.доу. Параметры, используемые в указанных выше алгоритмах, могут быть адаптированы в зависимости от исследуемой длины последовательности и степени гомологии. В некоторых вариантах осуществления при отсутствии инструкций разработчика в качестве параметров алгоритмов могут быть использованы параметры пределов несовпадения (бекаи1! рагате!ег5). Такие методы поиска могут также быть использованы для идентификации белков теплового шока бпаЧ в банках данных.

Пептид настоящего изобретения может быть приготовлен с помощью методов химического синтеза пептидов, может быть экспрессирован с кодирующего полинуклеотида или выделен после расщепления БТШ бпа1. Методы очистки, синтеза или получения пептидов в рекомбинантной форме удобны и хорошо известны в данной области, они пригодны для получения иммуногенных пептидов достаточной степени чистоты для применения в способе настоящего изобретения. В этом отношении термин «выделенный» или «существенно чистый» обозначает пептид или полинуклеотид, который существенно освобождён от других компонентов, с которыми он в естественном состоянии может быть ассоциирован ш у1уо. В контексте способа настоящего изобретения термин «существенно чистый» относится к существенно гомогенным пептидам или полинуклеотидам, где степень гомогенности определяется по отношению к известным в данной области стандартам чистоты. Так, это может быть степень чистоты, достаточная для получения Ν-концевой аминокислотной последовательности белка. Предпочтительно степень очистки пептида или полинуклеотида должна быть настолько достаточной, чтобы этот пептид или полинуклеотид мог быть использован для введения индивидууму. Как таковой, выделенный пептид или полинуклеотид обычно составляет не менее чем примерно 50% образца, содержащего пептид, обычно не менее чем приблизительно 75%, в частности, не менее чем приблизительно 90% и предпочтительно приблизительно от 95 до 99% и более. Необходимо осознавать, что такая мера чистоты относится к самому пептиду или как к исходному материалу, например, для рецептур в составе композиции, в случае чего выделенный пептид настоящего изобретения может представлять собой компонент композиции, которая может кроме него содержать дополнительные компоненты, как здесь описано, в том числе добавочные выделенные пептиды настоящего изобретения.

Существенно чистые белки и пептиды могут быть получены из интактных микроорганизмов, конкретно бактерий, при экспрессии в микробах путём химического или биологического синтеза, или используя обычные методы очистки, известные в данной области, включая, например, аффинную хроматографию. Такой метод может быть использован для получения иммуногенных пептидных фрагментов БТШ бпаЧ. Например, белки или пептиды, пригодные для приготовления вакцинной композиции настоящего изобретения, могут быть получены путём химического синтеза методом, включающим защиту альфа-аминогрупп группами !ВОС (трет-бутилоксикарбонил) или РМОС. Оба метода включают ступенчатый синтез, где на каждом этапе добавляется одна аминокислота, начиная с С-конца пептида (см., например, СоНдап и др.//Сиггеп! Рго!осок ίπ 1ттипо1оду, υπί! 9. \УПеу Iπ!е^5с^еπсе. 1991). Пептиды настоящего изобретения могут быть также синтезированы одним из различных хорошо известных методов твердофазного синтеза пептидов (см., например, Метк1е1б//1. Ат. Скет. 8ос. 1962. т. 85. с. 2149; 8!е\\ш! апб Уоипд//8о1|б Рказе Реркбез 8уп!ке515. Ргеетап. 8ап Ргапсщсо, 1969. с. 27-62) с использованием, например, сополимера стирола с дивинилбензолом, содержащего приблизительно 0,1-1,0 ммоль аминов на 1 г полимера. По завершении химического синтеза защита может быть снята, а пептиды отщеплены от смолы обработкой жидким НР с 10% анизолом при 0°С в течение приблизительно от 15 мин до 1 ч.

После выпаривания реагентов пептиды экстрагируют из полимера 1% раствором уксусной кислоты, экстракт затем подвергают лиофильной сушке, получая неочищенный материал, который может быть очищен с помощью такого метода, как гель-фильтрационная хроматография, например, на аффинной колонке с модифицированным сефадексом 8ЕРНАЭЕХ.ВТМ С-15 или модифицированной сефарозой 8ЕРНАКО8Е.КТМ, с использованием в качестве растворителя 5% уксусной кислоты. Лиофилизация подходящих фракций из элюата с колонки даёт существенно гомогенные пептид или производные пептида, которые могут быть охарактеризованы с помощью стандартных методик, таких как аминокислотный анализ, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, спектроскопия поглощения в УФ области, измерение молярного вращения или растворимости, а также может быть произведено их секвенирование, например, методом твердофазной деструкции по Эдману.

- 9 005821

При необходимости иммуногенный пептид настоящего изобретения может быть модифицирован, например, для повышения способности пептида действовать как иммуноген или толераген, для повышения стабильности пептида в организме индивидуума или в другой среде, или для любой другой необходимой цели. Например, пептид может быть модифицирован путём гликозилирования, что может быть осуществлено пришивкой углеводной части молекулы к реакционноспособной боковой цепи аминокислоты пептида или введением одной или нескольких дополнительных аминокислот на Ν-конце или Сконце пептида и пришивкой углеводной части молекулы к дополнительной аминокислоте. Образуемая связь может быть любой связью, обнаруживаемой в гликопротеине, например пришивка углевода Νконцом или О-концом соответственно к остатку аспарагина или остатку серина, или же это может быть любая другая связь, которую удобно осуществить.

Иммуногенный пептид настоящего изобретения может быть также модифицирован, будучи функционально («оперативно») связан с одним или более других пептидов или полипептидов. По существу настоящее изобретение предусматривает также химерный полипептид, который включает пептид настоящего изобретения, оперативно связанный по меньшей мере с одним гетерологичным полипептидом. В том смысле, как он использован здесь, термин «оперативно связанный» означает, что два или более пептидов (или два или более полинуклеотида) соединены вместе так, что функции связанных пептидов (или полинуклеотидов) сохраняются, и так, что химерный полипептид (или молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты) проявляет функции каждого пептидного (или полинуклеотидного) компонента. Например, химерный полипептид настоящего изобретения может включать пептид настоящего изобретения, оперативно связанный с пептидной меткой (1ад), такой как полигистидиновая метка, так, что пептид может быть идентифицирован в образце или выделен из смеси с помощью реагента, хелатно связывающегося с никелем. Пептид настоящего изобретения может быть также связан, например, с доменом клеточной компартментализации, который может обеспечивать локализацию пептида в определённом секторе клетки, например, пептида, экспрессированного после введения индивидууму молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный полипептид. Домен клеточной компартментализации может обеспечить локализацию пептида в цитозоле, ядре, плазматической мембране, эндоплазматическом ретикулуме, срединных полостях в аппарате Гольджи, или в лизосоме или эндосоме; или это может быть переносящий через мембрану пептид, который может обеспечить транспорт иммуногенного пептида сквозь клеточную мембрану; или это секреторный пептид, который может обеспечить секрецию пептида из клетки (см., например, работы Напсоск и др.//ЕМВО 1. 1991. т. 10. с. 4033-4039; Ви88 и др.//Мо1. Се11. Вю1. 1988. т. 8. с. 3960-3963; патент США № 5776689, каждая из которых включена сюда ссылкой).

Настоящее изобретение предусматривает также полинуклеотид, кодирующий иммуногенный пептид настоящего изобретения. Полинуклеотид может быть однонитевым или двунитевым и может быть молекулой рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их гибридом. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид настоящего изобретения, оперативно связанный по меньшей мере с одной гетерологичной нуклеотидной последовательностью. Гетерологичная нуклеотидная последовательность может быть любой нуклеотидной последовательностью, которая в норме обнаруживается в природе в близлежащей связи с полинуклеотидом настоящего изобретения. Например, гетерологичной нуклеотидной последовательностью может быть последовательность контроля экспрессии, такая как элемент регуляции транскрипции или элемент регуляции трансляции, или их комбинация; или она может кодировать полипептид, такой как цитокин или иной иммуномодулирующий агент, пептидная метка (1ад), домен клеточной локализации и т.п. Если рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует пептид настоящего изобретения и второй (или более) функциональный пептид, такой как один или несколько добавочных пептидов настоящего изобретения, или один или несколько цитокинов или подобных им, тогда молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты может дополнительно кодировать сайт распознавания протеазой, расположенный между всеми кодируемыми пептидами, так что после экспрессии каждый из кодируемых пептидов высвобождается в форме, свободной от других кодируемых пептидов или полипептидов.

Настоящее изобретение предлагает также вектор, содержащий полинуклеотид настоящего изобретения, и дополнительно предлагает клетку, которая содержит полинуклеотид или вектор настоящего изобретения. Вектором может быть клонирующий вектор, который может быть пригоден для получения больших количеств содержащихся в нём полинуклеотида или молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, или им может быть экспрессирующий вектор, который может быть пригоден, если полинуклеотид должен быть введён в клетку или индивидууму с целью экспрессии кодируемого пептида. Такие векторы хорошо известны в данной области и включают, например, плазмидные векторы и вирусные векторы, в том числе векторы, полученные из ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса коровьей оспы или подобных им.

Обычно используемым плазмидным вектором, который функционально кодирует вставки чужеродного структурного гена, является плазмида рВК.322. Плазмида рВК.322 содержит в качестве маркера ген для придания устойчивости к ампициллину; однако, для использования у людей такой устойчивости к

- 10 005821 ампициллину следует избегать. Модифицированные векторы, которые пригодны для процедур генной иммунизации, но не придают устойчивости к ампициллину, описаны, например, в заявке на патент США № 08/593554, поданной 30 января 1996 г., которая включена сюда ссылкой.

В настоящем изобретении могут быть использованы различные вирусные векторы, включая аденовирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы или РНК-содержащий вирус, такой как ретровирус. Предпочтительно ретровирусный вектор является производным мышиного или птичьего ретровируса. Примеры ретровирусных векторов, в которые может быть вставлен один чужеродный ген, включают (но не ограничиваются ими) вирус мышиной саркомы Молони (Мо1опеу) (МоМиБУ), вирус мышиной саркомы Нагуеу (НаМи8-У), вирус опухоли молочных желез мыши (МиМТУ) и вирус саркомы Рауса (Л8У). В большое количество дополнительных ретровирусных векторов можно ввести несколько генов. Все эти векторы могут переносить или содержать ген селектирующего маркера, так что можно идентифицировать и создавать трансдуцированные (преобразованные) клетки.

Поскольку рекомбинантные вирусы дефектны, для продуцирования инфекционных векторных частиц им необходима помощь. Такую помощь можно обеспечить, например, путём использования линий клеток-помощников (хелперов), которые содержат плазмиды, кодирующие все структурные гены ретровируса под контролем регуляторных последовательностей внутри длинного концевого повтора (БТЛ). Эти плазмиды не содержат нуклеотидных последовательностей, обеспечивающих механизм упаковки путём распознавания РНК-транскрипта для инкапсулирования. Линии клеток-помощников, имеющих делеции сигнала упаковки, включают, например (но не ограничиваются ими), ψ2, РА317 и РА12. Эти линии клеток продуцируют пустые вирионы, поскольку геном не упаковывается. Если в такие клеткипомощники вводится ретровирусный вектор, в котором сигнал упаковки интактен, но структурные гены заменены другими целевыми генами, вектор может упаковываться, и может продуцироваться векторный вирион.

Определённые преимущества могут быть получены при введении в виде «вакцины» полинуклеотида, кодирующего пептид настоящего изобретения, вместо введения пептида в качестве традиционной вакцины. Эти преимущества включают, например, то, что существенно исключается риск потенциальной токсичности (типа анафилактического шока), присущей белковой вакцине. При контакте с клеткой или введении индивидууму полинуклеотид или молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, или вектор, содержащий полинуклеотид, могут вводиться как «голая» ДНК или могут входить в состав носителя для доставки, такого как липосомы или коллоидные частицы, которые могут усиливать захват полинуклеотида и могут снижать склонность полинуклеотида к разрушению до захвата клеткой.

Настоящее изобретение предусматривает также композицию, которая содержит по меньшей мере один пептид настоящего изобретения и может содержать несколько различных иммуногенных пептидов настоящего изобретения. Например, это может быть композиция, содержащая любой из пептидов, перечисленных далее как последовательности 8ЕО Ш N0: 1 - 8Е0 Ш N0: 26, или композиция, содержащая любую комбинацию таких пептидов, в частности композиция, содержащая комбинацию провоспалительных пептидов, и композиция, содержащая комбинацию антивоспапительных пептидов. Композиция по настоящему изобретению, как правило, составляется в физиологически приемлемом растворе, и при необходимости может дополнительно содержать один или несколько иммуноадъювантов, например, один или несколько цитокинов, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, квасцы или подобное им. Вообще, если композиция содержит один или несколько цитокинов, цитокины имеют активность по отношению к воспалению такую же, как активность пептидов настоящего изобретения, или дополняющую ее (комплементирующую). Композиция может также содержать любой иммуноадъювант, в том числе иммуностимулятор или, если необходимо, иммуноподавитель, который может модулировать иммунный ответ организма индивидуума. Подходящие вещества, имеющие такую активность, хорошо известны в данной области и включают 1Ь-6, который может стимулировать супрессорные или цитотоксичные Т-клетки, и циклоспорин А и антитела к СЭ4. которые могут подавлять иммунный ответ. Такие вещества могут вводиться отдельно или в виде смеси с вакциной настоящего изобретения.

Термин «цитокин» используется здесь широко для обозначения растворимых гликопротеинов, высвобождаемых клетками иммунной системы и действующих не по ферментному типу через специфические рецепторы, регулируя иммунные ответы. Как таковой, термин «цитокин», как он использован здесь, включает хемокины, интерлейкины, лимфокины, монокины, интерфероны, стимулирующие образование колоний факторы, активирующие тромбоциты факторы, фактор-α некроза опухолей и связанные с рецепторами белки, а также их функциональные фрагменты. Термин «функциональный фрагмент», как он использован здесь, относится к пептидной или полипептидной части белка, которая обладает биологической функцией или активностью, характерной для нативного белка. Например, функциональный фрагмент 1Б-10 или 1Ь-4 имеет, например, существенно такую же антивоспалительную активность, как существующий в природе или полученный путём рекомбинации соответственно 1Б-10 или 1Ь-4, тогда как функциональный фрагмент ИФНу или ΤΝΕα имеет, например, существенно такую же антивоспалительную активность, как существующий в природе или полученный путём рекомбинации соответственно

- 11 005821

ИФНу или ΤΝΕα.

Цитокины хорошо известны в данной области и включают, например, активирующий моноциты эндотелия полипептид II (ЕМАР-ΙΙ), стимулирующий образование колоний гранулоцитов-макрофагов фактор (СМ-С8Е), стимулирующий образование колоний гранулоцитов фактор (С-С8Е), стимулирующий образование колоний макрофагов фактор (М-С8Е), 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10, 1Б-12, 1Ь13 и т.д., интерфероны, в том числе ИФНа, ИФНв и ИФНу, и ΤΝΕα, каждый из которых связан с конкретным биологическим, морфологическим или фенотипическим изменением клетки или клеточного механизма. Дополнительными примерами цитокинов являются члены подсемейства хемокина СХС (или а), которые имеют вставленную аминокислоту между двумя сохраняемыми цистеинами; члены подсемейства СС (или β), которые не содержат такой вставки аминокислоты; и хемокины С (или у), у которых отсутствуют первый и третий остатки цистеина. Вообще члены подсемейства цитокинов а активны по отношению к нейтрофилам и Т-лимфоцитам (Т-клеткам), а хемокины подсемейства β активны по отношению к моноцитам, макрофагам и Т-клеткам. Некоторые члены подсемейств цитокинов а и β активны также по отношению к дендритным клеткам, представляющим собой мифирующие клетки, которые проявляют выраженные антиген-предъявляющие свойства и, как считают, участвуют в патофизиологии многих воспалительных заболеваний (Хи и др.//Е Ьеик. ΒίοΙ. 1996. т. 60. с. 365-371; и 8οζζαηί и др.//Е 1шшиηοΐ. 1997. Т. 159. С. 1993-2000). Был также описан четвёртый хемокин человека типа СХЗС, фракталкин (Βαζαη и др.//№Щ.1ге. 1997. т. 385. с. 640-644; 1ша1 и др.//Се11. 1997. т. 91. с. 521-530; Маскау//Сшт.Вю1. 1997. т. 7. с. К.384-К.386). В отличие от других хемокинов, фракталкин существует в мембранной и растворимой формах. Растворимая форма является активным хемоаттрактантом для моноцитов и Т-клеток. Рецептор на поверхности клеток для этого хемокина обозначается СХ3СК1.

Примерами α-хемокинов (известных также как 1Б-8) являются хемотактный для гранулоцитов белок-2 (ССР-2); связанные с ростом онкогены: онкоген-α (СКО-а), СКО-β и СКО-у; активирующий нейтрофилы пептид-78 из клеток эпителия (ΕΝΑ-78); основной белок тромбоцитов (РВР); активирующий соединительную ткань пептид III (СТАР III); активирующий нейтрофилы пептид-2 (ΝΑΡ-2); фактор-4 тромбоцитов с низким сродством (ЬАРЕ-4); индуцированный ИФНу монокин (МЮ); фактор 4 тромбоцитов (РЕ4); индуцируемый интерфероном белок 10 (ГР-10); полученные из клеток стромы факторы 8ΌΕ1а, 8ЭЕ-1 β и 8ЭЕ-2. Примерами хемокинов β являются хемотактные для моноцитов белки МСР-1, МСР2, МСР-3, МСР-4 и МСР-5; ингибирующие макрофаги белки МЕР-1а, ΜΦ-1β, МХР-1у, МШ-2, МШ-2а, ΜΦ-2β, МШ-3а, МШ^, МШ-4 и МШ-5; хемокин из макрофагов (МОС); хемокин 1 человека (НСС-1); БО78Р, ΡΑΝΤΕ8; эотаксин 1; эотаксин 2; ТАКС; 8СУА17 и ^309; хемокин-1 дендритных клеток (ЭССК-1). Примером хемокинов у является лимфотактин.

Композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена для введения индивидууму путём комбинирования иммуногенного пептида или иммуногенных пептидов с физиологически приемлемыми носителями. Такие носители должны быть нетоксичными для реципиентов при применяемых дозах и концентрациях. Обычно при приготовлении таких композиций объединяют конкретный вакцинный антиген с физиологическим раствором, буферами, антиоксидантами, такими как аскорбиновая кислота, низкомолекулярными (менее 10 аминокислотных остатков) полипептидами, белками, аминокислотами, углеводами, включая глюкозу или декстраны, или хелатными агентами, такими как ΕΌΤΑ (этилендиаминтетраацетат), глютатионом и другими стабилизаторами и наполнителями. Такие композиции могут быть в виде суспензии, эмульсии или в лиофилизованной форме и составляются при таких условиях, чтобы они были соответствующим образом приготовлены и готовы для использования при требуемом применении.

Физиологически приемлемым носителем может быть любой материал, который при комбинировании с иммуногенным пептидом или полинуклеотидом настоящего изобретения обеспечивает сохранение биологической активности ингредиента и не нарушает нежелательным образом его реакцию с иммунной системой индивидуума. Примеры включают (но не ограничиваются ими) любые стандартные физиологически приемлемые носители, такие как забуференный фосфатом солевой физиологический раствор, вода, эмульсии (такие как эмульсия масло/вода) и различного типа увлажняющие агенты. Предпочтительными разбавителями для аэрозольного или парентерального введения являются забуференный фосфатом солевой физиологический раствор или нормальный (0,9%) солевой физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, составляют хорошо известными общепринятыми методами (см., например, КешшЦогМ Рйагшасеийса1 8с1епсе§, часть 43, 14-е издание. Маск РиЬШЫпд Со., ЕаЧоп РА 18042, Ц8А).

Как правило, для введения индивидууму пептид или кодирующий полинуклеотид включают в состав композиции. Поэтому настоящее изобретение предлагает композицию, которая обычно кроме пептида или полинуклеотида настоящего изобретения содержит носитель, в который удобно внедрить пептид или полинуклеотид для введения индивидууму. Например, носителем может быть водный раствор, такой как забуференный физиологический солевой раствор, или другой растворитель или носитель, как гликоль, глицерин, масло (такое как оливковое масло) или пригодные для инъекции органические эфиры. Носитель может включать также физиологически приемлемое соединение, которое действует, например,

- 12 005821 таким образом, что стабилизирует пептид или кодирующий полинуклеотид или усиливает его адсорбцию. Физиологически приемлемые соединения включают, например, углеводы (такие как глюкоза, сахароза или декстраны), антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота или глутатион), хелатные агенты, низкомолекулярные белки и другие стабилизаторы или наполнители. Подобным же образом клетка, которая претерпела в культуре обработку в целях практического применения способов настоящего изобретения (например, одноядерные клетки синовиальной жидкости, дендритные клетки или подобные им), также может быть введена в состав композиции, если клетки надлежит вводить индивидууму.

Специалистам в клинической работе понятно, что выбор носителя, в том числе физиологически приемлемого соединения, зависит, например, от способа, которым следует ввести пептид или кодирующий полинуклеотид, а также от пути введения композиции. Если композиция вводится в условиях иммунизации, то есть как вакцина, её обычно вводят внутримышечно, внутрикожно или подкожно, но её можно вводить также парентерально, например внутривенно, и она может быть введена путём инъекции, интубации или иным подобным методом, известным в данной области. Если желательной модификацией иммунной системы является создание толерантности, композицию предпочтительно вводят орально или же её можно ввести так, как указано выше.

Композиция настоящего изобретения может также содержать второй реагент, такой как диагностический реагент, питательное вещество, токсин или терапевтический агент (например, агент для противораковой терапии). Предпочтительно второй реагент представляет собой иммуномодулирующий агент, например иммуностимулирующий агент (такой как цитокин или молекула В7). Кроме того, если необходимо стимулировать иммунный ответ, композиция может содержать адъювант, например, квасцы, адъювант ΌΕΤΘΧ (К1Ы 1шшипосйеш1 Кекеагсй, 1пс.; НатШоп, МТ, Л8А); или полный или неполный адъювант Фрейнда. Добавление адъюванта может усиливать иммуногенность пептида настоящего изобретения, снижая таким путём количество антигена, необходимого для стимуляции иммунного ответа. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ, продлевая персистенцию антигена, усиливая совместно стимулирующие сигналы, индуцируя образование гранулёмы, неспецифически стимулируя пролиферацию лимфоцитов или улучшая контакт между Т-клетками и антиген-предъявляющими клетками (АПК).

Композиция, содержащая пептид или полинуклеотид настоящего изобретения, может быть также включена внутрь инкапсулирующего материала, например в эмульсию масла в воде, микроэмульсию, мицеллы, смешанные мицеллы, липосомы, микросферы или в иной полимерный матрикс (см., например, работы Сгедог1аб15//Ыро5оше Тесйпо1оду, т. 1. СКС Ртекк. Воса РаЮп. РЬ, 1984; Ега1еу и др.//Тгепбк Βίοсйеш. 8сг 1981. т. 7. с. 77, каждая из которых включена сюда ссылкой). Липосомы, например, состоящие из фосфолипидов или других липидов, - это нетоксичные, физиологически переносимые и подвергающиеся метаболизму носители, которые сравнительно легко готовить и вводить. Примером такого инкапсулирующего материала являются так называемые «скрытные» (51еайй) липосомы (см., например, патенты США №№ 5882679, 5395619 и 5225212, каждый из которых включён сюда ссылкой). Катионные липосомы, например, могут быть также модифицированы специфическими рецепторами или лигандами (работа Мойкййа и др.//Т Сйп. 1пуек1. 1993. т. 91, с. 2580-2585, которая включена сюда ссылкой). Кроме того, полинуклеотидный агент может быть введён в клетку с помощью, например, комплексов ДНК аденовируса с полилизином (см., например, работу Мюйае1 и др.//Т Вю1. Спет. 1993, т. 268, с. 6866-6869, которая включена сюда ссылкой).

В соответствии с этим настоящее изобретение предлагает способ модуляции иммунного ответа у индивидуума путём введения индивидууму иммуногенной пептидной части БТШ бпа1 или полинуклеотида, кодирующего такой пептид. Как раскрывается здесь, БТШ бпа1 может быть прокариотным или эукариотным БТШ бпа1, в том числе, например, бактериальным БТШ бпа1, таким как БТШ бпа1 Ε. сой; БТШ бпа1 беспозвоночных, таким как БТШ бпа1 дрожжей; или БТШ бпа1 позвоночных, таким как БТШ бпа1 млекопитающих, в том числе БТШ бпа1 человека, таким как человеческий Н8Л, НОЛ или НЭ12. Как таковой, пептид настоящего изобретения, который может представлять собой компонент композиции по настоящему изобретению, может быть полезен как лекарственное средство, в том числе лекарственное средство для лечения человеческого индивидуума и лекарственное средство для ветеринарных целей.

Способ по настоящему изобретению может модулировать иммунный ответ путём усиления воспалительной реакции, связанной с иммунным ответом, или путём ослабления воспалительной реакции, связанной с иммунным ответом. Так, в одном из вариантов осуществления способ по настоящему изобретению предусматривает путь усиления или индуцирования у индивидуума воспалительной реакции. Такой способ может быть осуществлён путём введения индивидууму в условиях иммунизации пептида, имеющего провоспалительную активность, т.е. провоспалительного пептида; путём введения индивидууму в условиях стимуляции толерантности антивоспалительного пептида; или путём введения комбинации таких пептидов, например, в условиях иммунизации вводят два или более провоспалительных пептида или в условиях стимуляции толерантности вводят два или более антивоспалительных пептида, или же по меньшей мере один провоспалительный пептид в условиях иммунизации и по меньшей мере один антивоспалительный пептид в условиях стимуляции толерантности. Результатом действия такого способа усиления или индуцирования воспалительной реакции может являться повышение у индиви

- 13 005821 дуума уровня провоспалительного цитокина, такого как ИФНу, ΤΝΡα. 1Ь-1, 1Ь-6, 1Й-12 или 1Й-23, или снижение у индивидуума уровня антивоспалительного цитокина, такого как 1Ь-4, 1Ь-10 или ΤΟΡβ, или их комбинаций.

Способ по настоящему изобретению предусматривает также пути ослабления или подавления у индивидуума воспалительной реакции путём введения индивидууму в условиях иммунизации пептида, имеющего антивоспалительную активность; или путём введения индивидууму в условиях стимуляции толерантности провоспалительного пептида; или путём введения комбинации таких пептидов, например, в условиях стимуляции толерантности вводят два или более провоспалительных пептида или в условиях иммунизации вводят два или более антивоспалительных пептида, или же по меньшей мере один провоспалительный пептид в условиях стимуляции толерантности и по меньшей мере один антивоспалительный пептид в условиях иммунизации. Результатом действия такого способа может быть повышение у индивидуума уровня антивоспалительного цитокина, такого как 1Ь-4, Ю-10 или ΤΟΡβ, или понижение у индивидуума уровня провоспалительного цитокина, такого как ИФНу, ΤΝΡα, 1Ь-1, 1Ь-6, 1Й-12 или 1Ь23 или же их комбинаций.

Как раскрыто в данной заявке, может быть введена одна иммуногенная пептидная часть БТШ йиа1 или их комбинация, в том числе, например, любой один из иммуногенных пептидов или любая комбинация иммуногенных пептидов, примеры которых представлены последовательностями 8ЕО ГО N0: 1 8Е0 ГО N0: 26. Опытным клиницистам в свете данного описания понятно, что пептид настоящего изобретения вводят индивидууму в условиях иммунизации или в условиях стимуляции толерантности, в зависимости от того, является ли пептид провоспалительным пептидом или антивоспалительным пептидом, и от того, вводится ли пептид для усиления или индуцирования воспалительной реакции, или для снижения или подавления воспалительной реакции.

Термин «в условиях иммунизации», как он использован здесь, означает, что пептид настоящего изобретения приводится в контакт с клеткой или вводится субъекту таким образом, что он может проявлять свою иммуногенную активность. Сам по себе пептид, который является иммуногенным для Тклеток, вводят в иммуногенном количестве, обычно вначале в дозе для первоначальной затравки (рпшшд), за которой через некоторое время следует введение одной или нескольких бустерных доз. Пептид вводится внутрикожно, подкожно или внутримышечно и при необходимости включается в состав композиции, которая содержит иммуноадъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда. Термин «в условиях стимуляции толерантности», как он использован здесь, означает, что пептид настоящего изобретения приводится в контакт с клеткой или вводится субъекту таким образом, что он может индуцировать образование состояния толерантности к проявляющейся в иных условиях иммуногенной активности. В результате индивидуум, например, становится толерантным к пептиду, так что последний распознаётся индивидуумом как «свой» и не может воздействовать на иммунный ответ. Пептид может вводиться в условиях стимуляции толерантности путём введения вызывающего толерантность количества пептида, обычно малого количества, в течение некоторого периода времени, внутрикожно, подкожно или внутримышечно или, что предпочтительно, в слизистую оболочку, например, он распыляется в нос или съедается.

Способ настоящего изобретения может применяться на практике по отношению к индивидууму, имеющему или предрасположенному, или восприимчивому к любому состоянию, в котором необходимо модулировать иммунный ответ, включая индивидуума, имеющего иммунологическое расстройство, или восприимчивого или предрасположенного к иммунологическому расстройству. В общем виде индивидуум представляет собой позвоночное существо, в частности млекопитающее, в том числе домашнее животное, такое как кошка, собака или лошадь; сельскохозяйственное животное, такое как овца, корова или свинья; а также это может быть человек. Иммунологическое расстройство может представлять собой расстройство иммунной системы, такое как аутоиммунное заболевание (например, артрит, такой как олигоартикулярный юношеский идиопатический артрит) или сопровождающееся иммунодефицитом заболевание, такое как заболевание с приобретённым иммунодефицитом (СПИД). Дополнительные болезненные состояния, при которых может быть необходимо модулировать иммунный ответ, включают состояния, при которых у индивидуума не развивается нормальная иммунная реакция, например, в ответ на инфекционное заболевание или рак, или состояние, при котором иммунный ответ индивидуума слишком силён, например, у индивидуума, страдающего воспалительным заболеванием кишечника, отличающимся от аутоиммунного заболевания, или у индивидуума с бактериальным сепсисом.

Общее количество композиции, которая должна вводиться при практическом применении способа настоящего изобретения, может быть введено индивидууму в виде единичной дозы, либо как импульсное введение (в форме пилюли), либо вливанием в течение относительно короткого периода времени, и за этим может следовать введение одной или нескольких бустерных доз в течение некоторого периода времени. Количество композиции, необходимой для стимуляции иммунного ответа у индивидуума, зависит от различных факторов, среди которых возраст и общее состояние здоровья индивидуума, а также путь введения и число лечебных воздействий, которые необходимо произвести. В свете этих факторов опытный клиницист сумеет установить необходимую конкретную дозировку. Как правило, рецептуру компо

- 14 005821 зиции и пути и частоту введения определяют первоначально с помощью клинических испытаний фазы Ι (см. пример 8) и фазы II.

Иммуногенный пептид настоящего изобретения предпочтительно вводят в соответствии с процедурой, достаточной для селективной стимуляции продуцирования 1дЛ в желудочно-кишечном тракте индивидуума и для индуцирования оральной толерантности. Методы индуцирования оральной толерантности скармливанием антигена индивидууму - человеку или животному - хорошо известны (см., например, работу НикЬу и др.//к Iттиηο1. 1994. т. 152. с. 4663-4670, которая включена в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, если необходима стимуляция толерантности, пептиды настоящего изобретения можно вводить совместно с иммуностимулятором 1дЛ, индуцирующим переключение с 1дМ на 1дА; это, например, ΤΟΕβ, который может также в организме подавлять активность хелперных Тклеток. Предпочтительно вводить иммуногенный пептид и, если он присутствует, стимулятор образования 1дА в тонкий кишечник, чтобы локализовать эффект вакцины в желудочно-кишечном тракте. Однако пептиды настоящего изобретения можно вводить любым другим способом, принятым в иммунотерапии, например, внутрисосудистым, внутрикожным, подкожным, внутримышечным или внутрибрюшинным.

Полинуклеотид можно вводить любым путём, обычно используемым для иммунологической процедуры, в частности внутрикожно (см., например, заявку на патент США, регистрационный № 08/446691, поданную 7 июня 1995 г., включённую в настоящее описание ссылкой; см. также заявку № 08/593554). Согласно приведённым в них описаниям рекомбинантные векторы генной экспрессии вводят путём инъекции, абсорбции или черезкожного переноса в кожу или слизистую хозяина.

Условия введения пептида или полинуклеотида настоящего изобретения варьируют в зависимости от их состава, а также от возраста, веса и состояния здоровья пациента. Однако предпочтительный протокол введения пептида включает ежедневное оральное (или в тонкий кишечник) введение иммунологически эффективных доз вакцины, в сочетании с другими формами или без других форм терапии, как описано выше, или в сочетании с обычными противовоспалительными лекарствами (например, использование стероидных или нестероидных противовоспалительных лекарств и/или анальгетиков). В зависимости от частоты дозировок, иммунологически эффективная доза каждой пептидной вакцины настоящего изобретения составляет от приблизительно 10 мкг до 100 мг, в общем случае приблизительно от 100 мкг до 100 мг, обычно приблизительно от 1 мг до 50 мг и, в частности, приблизительно 25 мг антигенного белка или пептида. Суточная дозировка антигенного пептида обычно вводится в количестве приблизительно 1 мг в день.

Дозировка полинуклеотида, подлежащего введению согласно способу настоящего изобретения, варьируется в зависимости от необходимой реакции хозяина и уровней генной экспрессии, достижимой с используемым вектором. Обычно для введения «голого» полинуклеотида внутрикожным путём можно вводить в единичной дозе количество полинуклеотида, достигающее приблизительно от 100 до 200 мкг, хотя для индуцирования длительного иммунного ответа достаточно введения через кожу или слизистую всего лишь приблизительно 0,3 мкг полинуклеотида. Для целей настоящего изобретения достаточно, однако, чтобы «голые» векторы генной экспрессии были введены в достаточной дозировке, чтобы обеспечить экспрессию кодируемого иммуногенного пептида. Эти дозировки можно менять для достижения различных уровней экспрессии, обеспечивая таким образом иммунизирующее количество или обеспечивающее толерантность количество. Способы проверки наличия и количества экспрессированных пептидов хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, иммунологические анализы, такие как твердофазные иммуносорбентные анализы с участием фермента (епхуте-Кпкеб ίιηιηιιηοκοΓЬеп1 аккау, ЕЫ8А), методы с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуногистологические анализы. Дозировки вводимого полинуклеотида могут быть установлены таким образом, чтобы достигнуть необходимого уровня экспрессии на основании результатов этих методов детектирования и количественного определения, а также по клиническим признакам ίη νίνο, известным имеющим опыт специалистам в клинической практике.

В композицию вместе с пептидом или полинуклеотидом настоящего изобретения могут быть включены традиционные дозировки иммуностимулятора или иммуносупрессора или они могут быть введены отдельно до, одновременно или после введения пептида. Это может быть, например, 1Ь-6 в дозировке от 1 до 100 мкг/кг. Такие дозировки будут основаны на информации, известной в данной области, или они легко могут быть установлены с помощью обычно используемых на практике методов. Лечение пациентов, начатое на ранней стадии болезни, может быть проведено до суррогатной конечной точки, может быть проведено через неё или продолжено за неё.

Введение пептида или полинуклеотида настоящего изобретения индивидууму, предрасположенному к болезни, но ещё не болевшему, может быть осуществлено кратковременным введением одной или нескольких дозировок композиции, достаточных для того, чтобы вызвать заметное повышение количества, например, 1дА к пептиду бнаб в жидкости желудочно-кишечного тракта или кровотоке в периферических сосудах пациента. Обычно вакцины настоящего изобретения предпочтительно используются у пациентов с заболеванием на ранней его стадии.

Эффективность терапевтического способа настоящего изобретения на протяжении времени может быть идентифицирована по отсутствию симптомов или клинических признаков иммунологического рас

- 15 005821 стройства у индивидуума, предрасположенного к данному расстройству, но ещё не имевшего признаков или симптомов расстройства к моменту начала терапии. У пациентов, имевших по диагнозу иммунологическое расстройство или иное болезненное состояние, при котором требуется модулировать иммунный ответ, эффективность способа настоящего изобретения может быть оценена путём измерения снижения у индивидуума остроты признаков или симптомов или по достижению суррогатной конечной точки заболевания.

Что касается иммунологического расстройства (такого как аутоиммунный артрит), обычные параметры клинических признаков и симптомов артрита, а также суррогатных точек окончания заболевания, хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, проведение измерений «показателя Ритчи» для болезненности суставов (КйсЫе и др.//Оиаг1.1. Мей. 1968. т. 37, с. 393-406), измерение числа распухших суставов, суточную длительность утренней тугоподвижности суставов, силу внезапной резкой боли или интенсивность боли по визуальной аналоговой шкале (Ни8к188оп//Ьапсе!. 1974, т, 2. с. 1127-1131) и измерение пациентом относительных уровней полезности антивоспалительного агента или анальгетика. Дополнительные удобные клинические параметры, за которыми можно следить, включают, например, длительность заболевания, скорость осаждения эритроцитов (РОЭ), уровень С-реактивного белка (СКР), число активных суставов (ΝΑΑ), величину (остроту) суставного индекса (С8А), интервал ремиссии, данные анкетирования СЫ1йгеп'8 Неа1111 Аккеккшеп! Оие51юппайе (СНАО) и реакцию на лечение пептидом йпай (отношение числа восприимчивых к лечению к числу невосприимчивых).

На основании результатов клинических испытаний с двойной шифровкой экстракта Е. со11 (Вгаскег(5 и др.//й. КЪеит. 1989, т. 16, с. 19-23) было сделано заключение, что следует ожидать, что введение композиции настоящего изобретения может вызвать минимальные побочные эффекты или же вообще их не вызвать. Например, может возникать раздражение желудочно-кишечного тракта, но можно ожидать, что оно будет слабым. Токсичность этих композиций можно отслеживать обычными способами, такими как периодическое лабораторное обследование путём анализа таких переменных, как гематокрит, уровни гемоглобина, тромбоцитов и ревматоидного фактора, а также химия крови. Для других иммунологических нарушений или других болезненных состояний, при которых необходимо модулировать иммунный ответ индивидуума, следует отслеживать характерные для этого заболевания признаки и симптомы.

Настоящее изобретение предлагает также способ модуляции способности к реагированию (реактивности) иммуноэффекторных клеток. Такой способ может быть осуществлён, например, приведением иммуноэффекторных клеток в контакт с пептидной частью БТШ йиай или с полинуклеотидом, кодирующим такой пептид. БТШ йпай, из которого получен пептид, может быть любым БТШ йпай, как раскрывается здесь или известно из данной области, и может (но не обязательно) быть включён в состав композиции, которая может содержать также при необходимости иммуноадъювант или иной иммуномодулирующий агент, например один или несколько цитокинов. Иммуноэффекторные клетки, которыми могут быть любые клетки, участвующие в опосредованном Т-клетками иммунном ответе, в том числе антигенпредъявляющие клетки, такие как дендритные клетки, и, в особенности, Т-клетки, могут быть приведены в контакт с пептидом ш у1уо введением пептида индивидууму или же могут быть приведены в контакт ш уйго.

В том случае, когда иммуноэффекторные клетки приведены в контакт ш уйго (или ех У1уо), способ может дополнительно включать введение контактированных иммуноэффекторных клеток индивидууму, что обеспечивает способ модуляции у индивидуума иммунного ответа. Иммуноэффекторные клетки могут быть аутологичными (собственными) клетками, которые были извлечены из пациента, приведены в контакт с пептидом ех у1уо, а затем введены обратно индивидууму. Такой способ имеет то преимущество, что можно при необходимости предоставить возможность иммуноэффекторным клеткам пролиферировать ш У11го. а затем размноженные клетки могут быть введены индивидууму. Иммуноэффекторные клетки могут также быть аллогенными по отношению к индивидууму, например, это могут быть клетки, отобранные у индивидуума, родственного данному индивидууму и имеющего с ним общие гаплотипы, или клетки, отобранные из популяции клеточных линий, для которых гаплотипы известны и которые по отношению к индивидууму могут быть хотя бы частично гаплотипными. Такие клетки при введении индивидууму могут модулировать иммунный ответ у индивидуума путём усиления или индуцирования у индивидуума воспалительной реакции, или путём ослабления или подавления у индивидуума воспалительной реакции.

Следующие далее примеры предназначены для иллюстрации изобретения, но не ограничивают его.

Описание примеров осуществления изобретения

Пример 1. Клеточный иммунный ответ на рекомбинантный йпай Е. Сой.

Пролиферативные реакции одноядерных клеток периферической крови (ОКПК) от 10 здоровых индивидуумов («контроль») и 21 пациента с олигоартикулярным юношеским идиопатическим артритом (оЮИА) на рекомбинантный БТШ йпай Е. сой (йпай) не были достоверно различными (фиг. 1А). Чтобы определить, повышается ли содержание специфических к йпай Т-клеток в синовиальных центрах воспаления, одноядерные клетки синовиальной жидкости (ОКСЖ) всех пациентов с оЮИА стимулировали белком йпай в течение 96 ч. Средний индекс стимуляции (ИС) ОКСЖ был достоверно выше, чем ИС соответствующих ОКПК (р = 0,01; фиг. 1А). Кроме того, после стимуляции йпай процент активированных

- 16 005821

Т-клеток, идентифицированных как клетки СЭ3+СЭ69+ был в ОКСЖ достоверно выше (р = 0,0002), чем в ОКПК (фиг. 1В).

Чтобы подтвердить, что повышенная реакция ОКСЖ на йпа1 не является вторичным эффектом неспецифического повышения реактивности ОКСЖ, определяли пролиферативные реакции клеток обоих подразделений на посторонний для данного процесса анатоксин столбняка (ТТ). Пролиферативная реакция на ТТ имела тенденцию быть выше в ОКСЖ (средний ИС = 6,0) по сравнению с ОКПК (средний ИС = 12,3). Чтобы сравнить различия в реакциях ОКПК и ОКСЖ на йпа1 и ТТ, рассчитывали соотношение значений индекса стимуляции, полученных в двух подразделениях для каждого из двух антигенов. Как показано на фиг. 1С, отношение ИС ОКСЖ/ИС ОКПК было существенно (р = 0,038) выше после стимуляции йпай, чем после стимуляции ТТ.

Продуцирование провоспалительных цитокинов интерферона-гамма (ИФНу) и фактора-альфа некроза опухолей (ΤΝΕα), а также антивоспалительных цитокинов интерлейкина-4 (1Ь-4) и ГБ-10 оценивали в надосадочных жидкостях культур ОКПК от здоровых контрольных индивидуумов и в спаренных образцах ОКПК-ОКСЖ от пациентов с оЮИА, инкубированных в течение 72 ч с и без йпаТ Как показано на фиг. 2, не было разницы в продуцировании цитокинов в ОКПК пациентов и контрольных индивидуумов. Анализ парных образцов ОКПК-ОКСЖ на продуцирование цитокинов показал, что стимуляция йпа1 индуцировала значительно более высокое продуцирование (р <0,01) ИФНу в ОКСЖ, чем в ОКПК от пациентов с оЮИА; продуцирование ИФНу имело достоверную обратную корреляцию с длительностью заболевания (К = -0,40, р = 0,034). Продуцирование ΤΝΕα и 1Б-10 было сопоставимо в обоих подразделениях. Уровни 1Б-4 были ниже предела обнаружения в надосадочных жидкостях ОКПК и ОКСЖ как у контрольных индивидуумов, так и у пациентов.

В табл. 1 представлены результаты измерения продуцирования провоспалительных и антивоспалительных цитокинов в надосадочной жидкости культур ОКСЖ от пациентов с оЮИА, инкубированных в течение 72 ч в присутствии рекомбинантного белка йпа1 Е сой, затем повторно стимулированных с аутологичными облучёнными подпитывающими клетками в присутствии или в отсутствие не имеющего отношения к данному процессу контрольного пептида - овальбумина ОУА, или в присутствии полученных из БТШ йпа1 Е. сой пептидов в течение 72 ч. Результаты приведены с размерностью пг/мл как средние значения ± стандартное отклонение.

Таблица 1

Продуцирование провоспалительных и антивоспалительных цитокинов

Пептид	ИФНу	ΤΝΕα	ΙΕ-6	1Б-10	1Б-4
4	38,5 ± 47,7	9,8 ±21,2	49,8 ±54,0	5,4 ±6,9	<0,39
22	27 ± 38,0	14,1 ±26,8	45,7 ±57,7	4,4 ±2,7	<0,39
61	31 ± 45,7	22,6 ± 35,3	47,6 ± 70,5	<3,9	<0,39
174	29,8 ±44,6	16,1 ±31,5	47,3 ±61,2	4,2 ±1,9	<0,39
209	41,3 ±46,9	15,3 ±29,2	56.6 ±65,9	6,2 ±5,8	<0,39
242	41,2 ± 48,8	14,2 ± 29,2	34,1 ±41,7	5,3 ± 6,6	<0,39
264	44,9 ±55,8	14,0 ±29,3	47,4 ±61,2	<3,9	<0,39
268	34,7 ±51,2	17,2 ±30,1	45 ±58,4	<3,9	<0,39

Эти результаты показывают, что пролиферативная реакция и продуцирование ИФНу в ответ на действие йпа1 выше в синовиальном подразделении, чем в периферической крови пациентов с оЮИА, и указывают на то, что БТШ йпа1 Е. сой, или гомологичный белок, или его пептидная часть могут играть роль в воспалительном процессе в суставах.

Пример 2. Клеточный иммунный ответ на синтетические пептиды, полученные из рекомбинантного белка йпа1 Е. сой.

Чтобы идентифицировать возможные имеющие отношение к делу эпитопы на бактериальном белке йпаф ОКПК и ОКСЖ пациентов с оЮИА инкубировали в течение 72 ч с йпа1 и повторно стимулировали в течение 96 ч с аутологичными подпитывающими клетками в присутствии или в отсутствие полученных из йпа1 Е. сой пептидами, связывающимися с молекулами II класса главной системы тканевой совместимости (ГСТС). Всего были испытаны 8 пептидов, в том числе три пептида (рер4, рер22, рер174), полученные из Ν-концевой области йпа1 Е. сой и имеющих гомологии аминокислотной последовательности с каждой из трёх изоформ человеческого йпа1 (НОЛ, НО12, Н8Л; гомологичные пептиды), и пять пептидов, полученных из С-концевой области йпа1 Е. сой и не имеющих никакой гомологии с человеческими двойниками (рер61, рер209, рер242, рер264, рер268; негомологичные пептиды).

Результатом стимуляции ОКПК полученными из йпа1 Е. сой пептидами явились очень слабые пролиферативные реакции (ИС <1) и практическое отсутствие продуцирования провоспалительных и антивоспалительных цитокинов. Наоборот, ОКСЖ давали пролиферацию в ответ на все пептиды, хотя и в

- 17 005821 различной степени, со средним ИС > 6 в присутствии пептидов 22, 61, 174 или 268 (фиг. 3). Чтобы оценить специфичность реакций, ОКСЖ инкубировали с йиа1, затем повторно стимулировали в присутствии не относящегося к данному процессу пептида ОУА. ОКСЖ от пациентов АЧЛ В27+ (п = 4), не имевших оЮИА, имели среднее значение ИС < 3 в ответ на каждый из бактериальных пептидов. Результаты позволяют предположить, что сильный пролиферативный ответ на пептиды, полученные из йиа1 Е. сой, являются специфичными по отношению к заболеванию. Продуцирование цитокинов в ответ на те же пептиды было определено в надосадочных жидкостях культур ОКСЖ от пациентов с оЮИА. Как показано в табл. 1, продуцирование провоспалительных цитокинов было заметным после контакта с полученными из йиа1 Е. сой пептидами. ОКСЖ только у одного из 21 пациента с оЮИА продуцировали заметные количества антивоспалительного цитокина 1Ь-10, и ни одна из культур не продуцировала заметных количеств 1Ь-4.

Из всех испытанных провоспалительных цитокинов продуцирование ИФНу достоверно коррелировалось с пролиферативными реакциями на все бактериальные пептиды, кроме пептидов 4 и 264 (табл. 2). Корреляция была сильнее для пептидов 22, 61, 174 и 268, которые индуцировали ИС >6, что указывает на то, что эти пептиды могут доставлять нужные мишенные эпитопы в центры воспаления. Кроме того, продуцирование ИФНу в ответ на стимуляцию пептидами 209, 242 или 264 достоверно коррелировалось с величинами СВР и РОЭ. Табл. 2 показывает корреляцию между уровнями продуцирования ИФНу в надосадочных жидкостях культур ОКСЖ пациентов с оЮИА, стимулированных рекомбинантным йиа1 Е. сой, затем повторно стимулированных с облучёнными аутологичными подпитывающими клетками в присутствии или в отсутствие полученных из БТШ йиа1 Е. сой, и индексом стимуляции (ИС) после стимуляции ОКСЖ теми же пептидами и величинами РОЭ и СВР.

Таблица 2

Корреляции (по тесту Спирмана)

Бактериальные пептиды	Корреляция между продуцированием ИФНу и ИС	Корреляция между продуцированием ИФНу и РОЭ	Корреляция между продуцированием ИФНу и СВР
4*	нд	НД	НД
22*	К = 0,55; р < 0,01	нд	нд
61	В = 0,67; р < 0,0008	нд	нд
174*	К = 0,77; р < 0,00001	нд	НД
209	К = 0,50; р < 0,02	В = 0,72; р = 0,01	В = 0,65; р = 0,02
242	К = 0,50; р < 0,02	В = 0,64; р = 0,032	В = 0,63; р < 0,03
264	НД	В = 0,60; р < 0,05	В = 0,59; р < 0,04
268	В = 0,71; р < 0,001	НД	НД

* обозначает бактериальные пептиды, имеющие гомологию последовательности с пептидами, полеченными из трёх человеческих изоформ БТШ е1па.Т Е. сой;

НД - нет достоверной корреляции

Пример 3. Клеточные иммунные реакции на пептиды человека Н8Л, НЭП или ΗΌ12, гомологичные или негомологичные БТШ йпа1 Е. сой.

Чтобы оценить, могут ли человеческие гомологичные пептиды быть мишенью для перекрёстного распознавания, ведущего к способности реагировать на свои белки, были изучены человеческие пептиды, полученные из участков Н8Л, НОЛ или ΗΌ12, имеющих гомологию последовательности с йиа1 Е. сой. ОКСЖ 14 пациентов с оЮИА, дающие ИС более 3 при стимуляции рекомбинантным БТШ йиа1 Е. сой, повторно стимулировали в течение 96 ч с аутологичными клетками в присутствии или в отсутствие человеческих пептидов 2, 3 или 5 - гомологов бактериального пептида 4; человеческих пептидов 20, 21 или 23 - гомологов бактериального пептида 22; или человеческих пептидов 164, 167 или 176 - гомологов бактериального пептида 174. Пролиферативные реакции ОКСЖ, продуцирование провоспалительных цитокинов и уровни антивоспалительного 1Ь-4 были полностью подобны для пептидов, полученных из человеческих белков йпаТ и гомологичных бактериальных пептидов.

Табл. 3 показывает пролиферативные реакции и продуцирование цитокинов в ОКСЖ пациентов с оЮИА, инкубированных в течение 72 ч с рекомбинантным БТШ йиа1 Е. сой и затем повторно стимулированных с аутологичными подпитывающими клетками в присутствии или в отсутствие полученных из йиа1 Е. сой пептидов или гомологичных пептидов, полученных из изоформ человеческого йпа1 (Н8Л, НОЛ или НЛ12). Результаты представлены как ИС или величинами с размерностью пг/мл (средние значения ± стандартное отклонение).

- 18 005821

Таблица 3

Пролиферативные реакции и продуцирование цитокинов

	ИС	ИФНу	ΤΝΡα	Ιί-6
Е. соН рер 4	4,1 ±3,3	30,8 ±52,4	6.0 ±4,5	60,2 ±60,3
НЗЛ рер 2	5,9 ±5,7	51,3 ±72,4	23,2 ±26,8	41,7±43,8
НОЛ рер 3	8,0 ± 7,5	57,5 ±85,7	10,3 ±9,9	114,01126
Ηϋ62 рер 5	8,2 ± 7,3*	69,5±105,2@	18,9 ± 16,9	60,0167,2
Е. соН рер 22	4,7 ±4,0	20,1 ±33,5	10,5 ±23,1	54,3169,0
НЗЛ рер 20	4,7 ±4,7	25,3 ±47,4	11,8111,2	33,0 134,0
НОЛ рер 21	4,6 ±4,2	30,8 ± 56,4	26,6 ±39,3	33,5 1 43,8
Ηϋΰ2 рер 23	4,7 ±4,0	38,2 ± 75	7,7 ±7,6	33,3 1 32,7
Е. соН рер 174	5,9 ± 7,5	31,4 ±53,1	16,1 ±30,9	56,4 ± 70
НЗЛ рер 164	4,2 ±4,0	52,4 ±85,2	13,5 ± 18,9	27,3131,3
НОЛ рер 167	3,9 ±3,1	38,3 ±61,2	7,3 ± 7,3	23,0122,3
Ηϋϋ2 рер 176	4,3 ±2,7	45,6 ±68,3	8,9 ± 10,3	21,2125,2

* р <0,03 по отношению к Е. сой рер 4;

@ р <0,05 по отношению к Е. сой рер 4

Единственное отличие наблюдалось для пептида 5, который индуцировал пролиферативную реакцию и продуцирование ИФНу, значительно большие (соответственно р <0,03 и р <0,05), чем были обнаружены в ответ на действие его бактериальных гомологов. Похожие результаты наблюдались, когда оценивали реактивность 9 человеческих пептидов, полученных из областей белков Н8Л, НЭП или НЛ12, которые не имеют гомологий с БТШ биа1 Е. сой. В противоположность результатам, полученным с бактериальными пептидами, продуцирование ΙΠ-10 было заметным, хотя и в разной степени, в надосадочных жидкостях культур ОКСЖ, стимулированных человеческими пептидами, в том числе пептидами, гомологичными или негомологичными бактериальному пептиду. Среднее продуцирование ΙΠ-10 после стимуляции негомологичными человеческими пептидами было выше (27,1±10,3 пг/мл), чем гомологичными человеческими пептидами (7,7±7,0 пг/мл, фиг. 4), и было особенно очевидно для гомологичных человеческих пептидов 20, 21 и 23, которые подобно их бактериальному гомологу (пептид 22) не индуцировали заметных уровней ΙΠ-10 (фиг. 4). Эти опыты с картированием эпитопов показывают, что с различными пептидами получаются различные биологические эффекты, и что эффекты специфичны для заболевания.

Эти результаты показывают, что иммунные реакции на пептиды из различных изоформ человеческих белков бна1, индуцированные в сравнении с биаЧ Е. сой, могут играть регуляторную роль, опосредованную продуцированием антивоспалительного ΙΠ-10, тогда как провоспалительная реакция на БТШ биа1 Е. сой может быть осуществлена бактериальными пептидами и гомологичными, имеющими отношение к этому процессу эпитопами на пептидах из их человеческих аналогов. Этот результат был подтверждён при исследовании продуцирования ΙΠ-10 у трёх пациентов, имевших в момент отбора образцов развитый олигоартрит, причём в надосадочных жидкостях культур, стимулированных бактериальными или человеческими пептидами, обнаруживалось сниженное продуцирвоание ΙΠ-10, в особенности в ответ на человеческие пептиды 50, 254, 256 и 283, которые не гомологичны пептидам, полученным из БТШ биа1 Е. сой.

Пример 4. Пролиферация и продуцирование цитокинов в ответ на человеческие негомологичные пептиды.

Дополнительные пептиды, в том числе набор человеческих пептидов из негомологичных областей изоформ для пептидов бактериального биа1, были испытаны как описано выше. На фиг. 6 показаны ИС для негомологичных пептидов 50, 51, 134, 197, 254, 256, 270, 283 и 318. Уровни образования ИФНу, ΤΉΡα и ΙΠ-10 в ответ на эти пептиды показаны соответственно на фиг. с 7 по 9.

Пример 5. Пролиферация и продуцирование цитокинов в ответ на бактериальные пептиды и их человеческие гомологи.

Исследовали пролиферацию и продуцирование цитокинов в ответ на стимуляцию различными бактериальными пептидами и сравнивали это с реакцией на стимуляцию человеческими гомологами этих бактериальных пептидов. Фиг. 10 показывает ИС в ответ на бактериальный биа1 4 и человеческие гомологичные пептиды 2 (Н8Л), 3 (НЛЛ) и 5 (НЛ12). На фиг. с 11 по 13 показаны соответственно уровни Τ№α, ИФНу и ΙΠ-10 в ответ на эти пептиды. Для сравнения на фиг. 14 представлен ИС в ответ на бактериальные пептиды биаЧ 4, 22, 61, 174, 209, 242, 264 и 268. На фиг. с 15 по 18 представлены соответственно ИС и уровни Τ^α, ИФНу и !й-10 в ответ на бактериальный биаЧ 174 и на гомологичные человече

- 19 005821 ские пептиды 164 (Н8Л), 167 (НЛ12) и 176 (Н8Л). На фиг. с 19 по 22 представлены соответственно ИС и уровни ΤΝΕα, ИФНу и ГЙ-10 в ответ на бактериальный бпа1 22 и на гомологичные человеческие пептиды 20 (Н8Л), 21 (НЛЛ) и 23(НЛ12).

Пример 6. Корреляция между анализами ш νίΙΐΌ и клиническими последствиями.

Результаты определения пролиферации и индуцирования цитокинов, приведённые выше, были сопоставлены с клиническими параметрами у тех же пациентов, в том числе с длительностью заболевания, скоростью осаждения эритроцитов (РОЭ), уровнями С-реактивного белка (С-геасНуе рго1еш, СКР), числом активных суставов (ΝΑΑ), величиной суставного индекса (С8А), длительностью периода ремиссии, данными анкетирования Сййбгеп'к НеаНй А^екктеШ ^ие8ΐ^οиа^^е (СНАО) и реакцией на лечение пептидом бпа1 (соотношение восприимчивых к лечению и невосприимчивых). Как показано в табл. с 4 по 10, у пациентов с артритом, у которых был эффект лечения пептидом бпа1, были также получены хорошие результаты при определении пролиферации ш ν 11 го и индуцирования цитокинов с использованием их собственных одноядерных клеток со стимуляцией пептидами, которые находятся только в человеческих изоформах (т. е. негомологичными человеческими пептидами). В согласии с этими наблюдениями обследование пациентов, которых лечили пептидами бпа1 и артрит у которых развился до большей степени, чем наличие небольшого числа болезненных суставов («развитый Райа»), показало, что пациенты с развитым Раис1 не давали хорошего ответа на негомологичные человеческие пептиды (табл. 11).

Таблица 4 Суммарные данные и корреляция с клиническими параметрами у пациентов (п = 21)

Сопоставляемые пары	Критерии Спирмана
К	Р
Длительность болезни	Общее количество С1Э69	-0,52	0,02
Длительность болезни	ΤΝΕ после введ. рер (120	0,68	0,01
РОЭ	И-10 после введ. рер Ь23	0,77	0,005

Таблица 5

С-реактивный белок (СКР) в начале заболевания

Сопоставляемые пары	Критерии Спирмана
К	Р
СКР в начале болезни	ИС для рер 4	-0,67	0,004
СКР в начале болезни	Продуцирование ΤΝΡ для рер 4	-0,59	0,02
СКР в начале болезни	ИС для рер 200	-0,52	0,037
СКР в начале болезни	ИС для рер 264	-0,51	0,043
СКР в начале болезни	Продуцирование 1Ы0 для рер Ь23	0,72	0,008
СКР в начале болезни	1Ы0 для рер ЬЗ, гомолог, рер 4	0,73	0,022
СКР в начале болезни	И-10 для рер Ь5, гомолог, рер 4	0,79	0,011

Таблица 6

Число активных суставов ^АА)

Сопоставляемые пары	Критерии Спирмана
К	Р
ΝΑΑ	Продуцирование ΙΙ--10 для рер М64	0,62	0,022

Таблица 7

Величина суставного индекса (С8А)

Сопоставляемые пары	Критерии Спирмана
К	Р
С8А	ИС для бпаб	0,51	0,02
СЗА	ИС для Γί50 негомолог.	0,75	0,018
С5А	Продуцирование ΤΝΕ для рер 242	0,48	0,03

- 20 005821

Таблица 8

Соотношение числа восприимчивых и числа невосприимчивых к лечению 6пя1 пациентов (критерий Мапи-ХУШи-теу)

Сопоставляемые пары	критерий Малп-У/бЛпеу
Восприимч. к 6 мес. сроку	ИС для рер 268	0,049 > восприимч.
Восприимч, кб мес. сроку	ИС для 6167 гомолог. 174	0,037 > восприимч.
Восприимч. к 6 мес. сроку	Продуцирование ИФН для 174	0,012 > восприимч.
Восприимч. к 6 мес. сроку	ИС для 620, гомолог. 22	> восприимч.
Восприимч. к 6 мес. сроку	Продуцирование ИФН для 22	> восприимч.
Восприимч. к 6 мес. сроку	ИС для 6270, негомолог.	0,034 > восприимч.
Восприимч. к 6 мес. сроку	Продуцирование ИФН для 4	0,034 > восприимч.
Восприимч. к 6 мес. сроку	Продуцирование 1Ы0 для ΰηβΰ	0,024 > невосприимч.

Таблица 9

Период ремиссии

Сопоставляемые пары	Критерии Спирмана
Р	Р
Период ремиссии	ИС для άτοΰ	0,53	0,049
Период ремиссии	ИС для 174	0,6	0,021
Период ремиссии	ИС для 209	0.61	0,02
Период ремиссии	ИС для 208	0,56	0,038
Период ремиссии	Продуцирование ИФН для 174	0,68	0,019
Период ремиссии	Продуцирование ИФН для 22	0,71	0,009

Таблица 10

СЫ16гсп Неайй Аккекктек 0ικ5ΐίοηη;·ιίΐΐ (СНАС)

Сопоставляемые пары	Критерии Спирмана
К	Р
СНАО	ИС для 6паЗ	-0,49	0,037
СНАО	ИС для 174	-0,63	0,005
СНАО	ИС для 268	-0,56	0,015
СНАО	ИС для 209	-0,5	0,032
СНАО	ИС для 620	-0,54	0,043
СНАО	Продуцирование ИФН для άηθΰ	-0,56	0,017
СНАО	Продуцирование ИФН для 174	-0,61	0,006
СНАО	Продуцирование ИФН для 268	-0,59	0,009
СНАО	Продуцирование ИФН для 22	-0,6	0,0076
СНАО	Продуцирование ИФН для 61	-0,56	0,015
СНАО	Продуцирование ИФН для 6167 (гомолог. 174)	-0,59	0,04
СНАО	Продуцирование ΤΝΕ для 174	-0,57	0,011
СНАО	Продуцирование ΤΝΕ для 22	-0,57	0,011
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог. 50	-0,49	0,036
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог. 51	-0,5	0,034
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог. 134	-0,49	0,036
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог. 197	-0,6	0,01
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог 254	-0,49	0,036
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог. 256	-0,49	0,036
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог. 270	-0,49	0,036
СНАО	Продуцирование ИФНу для челов. негомолог. 283	-0,49	0,036
СНАО	Продуцирование ИФН для челов. негомолог. 318	-0,5	0,034

- 21 005821

Таблица 11

Сопоставление пациентов с Раис1 (п = 14) и пациентов с развитым Раис1 (п = 7)

Определяемый параметр	критерий Мапп-У7№пеу
Продуцирование ИФНу для 22	0,033
Продуцирование ИФНу для 174	0,427
Продуцирование ИФНу для (1164, гомолог. 174	0,037
Продуцирование ИФНу для М67, гомолог. 174	0,037
Продуцирование ИФНу для (1176, гомолог. 174	0,037
Продуцирование ИФНу для 22	0,032
Продуцирование ИФНу для 268	0,044

Пример 7. Иммунные реакции на эпитопы бактериального БТШ бпа1 в одноядерных клетках синовиальной жидкости пациентов с оЮИА.

Реакции Т-клеток на полный белок теплового шока бпа1 Ε. сой были преимущественно типа ТН-1 (ТН - Т-хелперные клетки) и были ограничены ареалом синовиальной жидкости. Пролиферация Т-клеток (ИС) и продуцирование ИФН были существенно выше для ОКСЖ пациентов с оЮИА по сравнению с ОКПК того же происхождения. Реакции в ОКСЖ пациентов с оЮИА были существенно выше, чем в контрольных культурах ОКСЖ от пациентов с другими заболеваниями, в том числе 14 пациентов с системным и полиартикулярным (многосуставным) ЮИА, для 4 из 8 полученных из бактериального бпа1 пептидов, связывающихся с подтипами ЛК антигена человеческих лейкоцитов (АЧЛ) (йишап 1еикосу1е аниден, НЬА), испытанных в качестве антигенов для Т-клеток (фиг. 23). Эти реакции имели также провоспалительную природу, что подчёркивалось продуцированием ИФН и практическим отсутствием продуцирования регуляторных цитокинов в ответ на действие индивидуальных пептидов ΐπ νίΙΐΌ. Такая реактивность была специфичной по отношению к ареалу, антигену и заболеванию, поскольку в ОКПК и ОКСЖ 14 пациентов с другими типами ЮИА, а также контрольной группы здоровых индивидуумов того же возраста реакции были ничтожными.

В том случае, когда способность к реакции на испытуемые антигены сравнивали с действием контрольных посторонних пептидов, в том числе связывающегося с подтипами ЛК. антигена человеческих лейкоцитов модельного пептида (рапбг) и полученного из Ε. сой изменённого пептидного лиганда (бпа1ру; см. фиг. 23), были обнаружены достоверные различия. Повышенная реакция ОКСЖ на рекомбинантный бпа1 не была вторичной реакцией на неспецифическое повышение реактивности ОКСЖ. У 7 пациентов с оЮИА испытывали также пролиферативные реакции клеток из обоих ареалов на столбнячный анатоксин (ТТ, посторонний антиген памяти). Чтобы сравнить различия в реакциях ОКПК и ОКСЖ на рекомбинантный бпа1 и ТТ, рассчитывали отношение индексов стимуляции, полученных для двух ареалов в ответ на каждый из двух антигенов. Отношение ИС ОКСЖ к ИС ОКПК было достоверно выше (р <0,02) после стимуляции рекомбинантным бпаТ чем после стимуляции ТТ.

Эти результаты показывают заметную реактивность на эпитопы бпа1 Е. сой в синовиальном ареале пациентов с оЮИА, что указывает на то, что эта реакция может играть роль в месте воспаления. Такая роль может быть связана с модуляцией аутоиммунного воспаления и может быть основана на взаимодействии между различными эпитопами на бактериальном белке и его человеческих эквивалентах, которые могут быть сверхэкспрессированы в синовии. По существу, была испытана идентичность таких предполагаемых эпитопов.

Поскольку 2 из 4 иммуногенных бактериальных пептидов (22 и 174) были получены из участков БТШ бпа1 Ε. сой, имеющих гомологию последовательности с человеческими белками бпа1 (Н8Л, НИЛ или НЛ12), была оценена возможность перекрёстного распознавания, приводящего к реакции на свои белки. Испытывали гомологичные человеческие пептиды 20, 21 и 23 (гомологи бактериального пептида 22), пептиды 164, 167-181 и 176 (гомологи бактериального пептида 174) и негомологичные человеческие пептиды. Эти пептиды выявили реактивность Т-клеток с пролиферацией и продуцированием ИФНу, сопоставимыми с таковыми, полученными после стимуляции соответствующими гомологичными бактериальными пептидами. Была обнаружена высокая степень корреляции между ИС и продуцированием ИФНу в ответ на эти человеческие пептиды и ИС и продуцированием ИФНу в ответ на бактериальные гомологи. Эти результаты указывают на то, что корреляция между реакциями Т-клеток на бактериальные пептиды и их человеческие гомологи основываются на перекрёстном распознавании. В противоположность результатам, полученным с бактериальными пептидами, в надосадочных жидкостях культур ОКСЖ, стимулированных полученными из человеческого бпа1 пептидами, были обнаружены заметные уровни 1Б-10; 1Ь-4 не обнаруживался. Результаты дополнительно демонстрируют, что собственные антигены могут запускать качественно иную реакцию Т-клеток.

Для оценки процентного количества СТБА+/СЛ25/СЛ4 позитивных клеток после стимуляции типичных ОКСЖ от пациентов с персистирующим оЮИА негомологичным человеческим пептидом 134 был использован анализ методом РАС8. Процентное содержание СТБА+/СЛ25/СЛ4 позитивных клеток,

- 22 005821 которые, как полагают, имеют регуляторную функцию, было выше в обработанных пептидом клетках, чем в контрольных клетках (фиг. 24А). Повышение доли регуляторных клеток в ответ на действие пептида 134 хорошо коррелировало с продуцированием 16-10 при тех же самых условиях культивирования (фиг. 24В). Эти результаты показывают, что распознавание пептида 134 человеческого бпаЧ приводит к развитию регуляторных клеток и продуцированию ΣΠ-10.

Чтобы проверить наличие корреляции между клиническими проявлениями и развитием индуцированной пептидами иммуномодуляции, пациенты с оЮИА были в зависимости от хода заболевания разделены на группы, содержащие пациентов с персистентным заболеванием (п = 16) и с развитым заболеванием (п= 15) (фиг. 25). Пролиферативные реакции на пептид 134 были достоверно ниже (р = 0,05) в образцах от пациентов с развитым заболеванием, чем в образцах от пациентов с персистентным оЮИА (фиг. 25А и 25В). Что касается продуцирования ИФН, то степень достоверности различий была минимальной (р = 0,076). Если же рассматривалось продуцирование ΣΠ-10, то степень достоверности различий была высокой (р = 0,0012; см. фиг. 25С).

Чтобы дополнительно проанализировать возможные связи с более мягкой степенью заболевания, в качестве меры степени воспалительной активности в индивидуальных суставах была выбрана длительность клинической ремиссии исследуемого сустава после внутрисуставного введения пригодного к инъекции стероида ТХА. Была обнаружена высокая степень корреляции между продуцированием ΣΠ-10 в ответ на негомологичный человеческий пептид 134 и длительностью клинической ремиссии индивидуального сустава (Я = 0,537, р = 0,026). Эти результаты показывают, что с временным ослаблением заболевания связано распознавание иммуномодулирующих собственных эпитопов.

Пример 8. Пептид бпа1Р1 обеспечивает наличие провоспалительного эпитопа у пациентов с ревматоидным артритом.

Был идентифицирован пептид из белка теплового шока бпаЧ, действующий как агент (триггер), приводящий в действие пролиферацию Т-клеток и продуцирование провоспалительных цитокинов клетками периферической крови и синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (РА). Этот пептид бпаЧР1 (РКЕААУЭРУСНААЕЕ; 8 Ер ΣΌ NО: 27) имеет гомологию последовательности с «общим эпитопом», который является общим участком из 5 аминокислот среди аллелей АЧЛ, связанных с РА (работа А1Ьаш и др.//№!. Меб. 1995, т. 1, с. 448-452, включённая в настоящее описание посредством ссылки). Было предпринято изучение того, действительно ли взаимодействие между АЧЛ и полученными из бпаЧ пептидами при РА поддерживает и стимулирует Т-клетки, участвующие в аутоиммунном воспалении. Такая популяция Т-клеток была объектом исследования в 1-й фазе клинического изучения стимуляции иммунной толерантности.

В 1-й фазе клинического изучения 15 пациентов с РА получали три различных дозы бпаГР1 (4 раза в день перорально) в течение 6 месяцев. Исходные критерии требовали наличия клинически активной стадии болезни и провоспалительной реакции Т-клеток на пептид ш уйго. Как показано на фиг. 26, формирование в слизистой оболочке толерантности к бпаДН индуцировало резкий иммунный сдвиг от провоспалительных цитокинов к цитокинам регуляторного типа. Иммунные изменения индуцировались введением препарата и были специфичными к введению препарата.

Хотя описание настоящего изобретения основывается на приведённых выше примерах, понятно, что возможные модификации и изменения охватываются идеей и объемом изобретения. Соответственно, объем изобретения определяется следующей формулой изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Композиция, включающая физиологически приемлемый носитель и по меньшей мере один вид существенно очищенного пептида, включающего аминокислотную последовательность, выбранную из любой из последовательностей с 8ЕР ΣΌ NО: 1 по 8ЕР ΣΌ NО: 26.
2. Химерный полипептид, включающий пептид, как он определен в п.1, связанный по меньшей мере с одним гетерологичным полипептидом.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно включает иммуноадъювант.
4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что иммуноадъювант представляет собой цитокин.
5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что вид существенно очищенного пептида имеет аминокислотную последовательность, по существу состоящую из РКЕААУЭРУСНААЕЕР (8ЕР ΣΌ NО: 3).
6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что применяется для модуляции иммунного ответа.
7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что модуляция иммунного ответа включает усиление или индуцирование воспалительной реакции у индивидуума.
8. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что модуляция иммунного ответа включает ослабление или подавление воспалительной реакции у индивидуума.
9. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что иммунный ответ вызывают у индивидуума, имеющего иммунологическое расстройство.
10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что иммунологическое расстройство представляет собой аутоиммунное заболевание.

- 23 005821
11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что аутоиммунное заболевание является заболеванием, выбранным из группы, включающей артрит, диабет, воспалительное заболевание кишечника и рассеянный склероз.
12. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что иммунный ответ вызывают у индивидуума, имеющего инфекционное заболевание.
13. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что иммунный ответ вызывают у индивидуума, имеющего рак.
14. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что пептид кодирован полинуклеотидом.
15. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что применяется для модуляции реактивности иммуноэффекторных клеток у индивидуума.
16. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что иммуноэффекторные клетки являются аутологичными для индивидуума.
17. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что иммуноэффекторные клетки являются аллогенными для индивидуума.
18. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что иммуноэффекторные клетки выбраны из группы, включающей В-лимфоциты (В-клетки), дендритные клетки, одноядерные фагоцитные клетки, макрофаги, клетки Лангерганса, клетки эндотелия венул, Т-хелперные клетки, Т-супрессорные клетки и цитотоксичные Т-клетки.
19. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что иммуноэффекторные клетки представляют собой Т-клетки.
20. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что она дополнительно включает иммуноадъювант.

р=0.0002