CN101801402B - 炎性疾病和自身免疫疾病的治疗和预防 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及热休克蛋白的片段在治疗和/或预防自身免疫疾病如关节炎或炎性疾病如炎性肠病中的用途。优选使用属于HSP70家族的细菌和/或哺乳动物的热休克蛋白。
Description
发明领域
本发明涉及治疗和/或预防炎性疾病，尤其是炎性肠病(IBD)，包括克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎和乳糜泻，以及其它炎性疾病，例如过敏性疾病或状况，例如特应性皮炎、食物过敏、药物过敏和哮喘。本发明还涉及治疗和/或预防关节炎病(特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎)和其它自身免疫疾病，例如动脉粥样硬化、多发性硬化、或重症肌无力。特别是提供了热休克蛋白70家族成员的人II类MHC洗脱片段以及它们的延伸序列(例如更长的片段和/或一系列肽)在制备治疗或预防IBD和关节炎以及其它自身免疫或炎性疾病的组合物中的用途，以及治疗性和/或预防性治疗IBD、关节炎和其它自身免疫或炎性疾病的方法。此外，本文还提供了特定的HSP-70蛋白衍生肽。另外，还提供了鉴定和选择适合于治疗和/或预防炎性或自身免疫疾病的热休克蛋白70(HSP70)家族成员的肽的方法。
发明背景
热休克蛋白(HSP)被证实对于防御1型糖尿病和类风湿性关节炎是关键性的，这两种疾病为普遍的慢性退行性自身免疫疾病。
该关键性基于以下的发现：
1.HSP的肽可用作治疗剂来预防或阻止实验性自身免疫关节炎和实验性自身免疫糖尿病两者中的炎性损伤。这类肽治疗(首例临床试验)以特异的自身免疫T细胞的细胞因子谱(profiles)从促炎Th-1反应向抗炎Th-2反应的转变为特征。
2.HSP的表位被免疫系统的适应性部分(arm)(T细胞和B细胞的抗原受体)所识别。
3.HSP的表位在两种疾病中都为调节性T细胞的靶。
在I型糖尿病和关节炎模型中，已观察到以HSP免疫可预防和遏制疾病。这里可能的机制为微生物(共生的)HSP反应性T细胞的扩增，其通过黏膜耐受机制而在肠内耐受。HSP反应性T细胞的这种扩增通过口服和胃肠外途径的HSP给药是可能的。所扩增的T细胞与在发炎(应激)组织中过表达的同源自身HSP有交叉反应。耐受T细胞的这种交叉反应性导致炎症部位的调节性细胞因子生成。对于I型糖尿病和关节炎，人类中的首例临床试验证实了源于HSP60和HSP40的HSP衍生肽将疾病相关T细胞特异性的细胞因子模式转变为更多调节性细胞因子生成的可能性。
WO95/25744描述了具有哺乳动物序列相似性的分枝杆菌热休克蛋白(HSP65)的部分在预防或治疗炎性疾病中的用途，所述疾病包括自身免疫疾病，例如糖尿病、关节炎病、动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力、或肿瘤或移植排斥导致的炎性反应。该文献仅显示了针对HSP65衍生表位(HSP60家族成员)的数据。
US 6,007,821描述了全长人热休克蛋白HSP90和HSP70在治疗自身免疫疾病中的用途。仅提供了使用gp96(HSP90成员)治疗胰岛素依赖糖尿病(IDDM)的数据。仅在IDDM发作后看到效果，并且据说该自身免疫反应(即针对自身抗原的异常免疫反应)被使用全长人gp96的治疗所逆转。用在US 6,007,821中的治疗性治疗中的热休克蛋白优选从待治疗患者、即已出现了该自身免疫疾病的患者获得(即它们为自体蛋白)。没有使用非全长HSP70或HSP90蛋白的暗示，并且仅在与全长HSP70蛋白复合的肽情形下提及HSP70肽。该文献中不包括预防性治疗。溃疡性结肠炎被错误地作为自身免疫疾病而提到。
Kingston等人(1996，Clin.Exp.Immunology 103：77)描述了全长重组分枝杆菌HSP70蛋白可用于减少佐剂性关节炎的出现。
Tanaka等人(1999，J.Immunology 163，5560-5565)描述了分枝杆菌HSP70的肽234-252抑制佐剂性关节炎的出现并诱导IL-10生成。表位特异T细胞系也具有保护作用。另一肽(氨基酸84-103)是无效的，不抑制佐剂性关节炎的出现。Tanaka等人认为，分枝杆菌肽234-252的大鼠同源物也可能适合于预防关节炎，因为在初步实验中特异于分枝杆菌肽的T细胞系对保守的大鼠肽(与19个氨基酸长的细菌肽在8个氨基酸有差异)有反应。
Van Eden(2000，Cell Stress and Chaperones 5：452-457)提供了关于自身热休克蛋白在关节炎免疫方面的保护潜力的综述。
Wendling等人(2000，J.Immunology 164：2711-2717)测试了一系列合成的重叠的分枝杆菌HSP70的15聚体肽诱导(全长)重组分枝杆菌HSP70特异T细胞系增殖的能力。采用这种方式，鉴定出4种肽(氨基酸111-125、131-145、397-411和490-504)。这四种肽中，肽111-125诱导与肽111-125的大鼠同源物(由此与自体HSP70)有交叉反应的T细胞，但是以这种分枝杆菌肽胃肠外预免疫不预防关节炎出现。另一方面，鼻内给药缺导致关节炎显著减少。
Dengjel，Schoor等人(2005，PNAS USA 102：7922-2927)描述了这样的实验，其显示当人B细胞在营养缺乏条件下培养时HSP70家族成员的片段被负载进II类主要组织相容性复合物分子(II类MHC分子)中，并且这主要是针对细胞内胞质蛋白而发生，不针对细胞外蛋白。这篇文章未提及使用这种HSP片段来诱导疾病抑制性免疫调节。
Crotzer和Blum(2005，PNAS USA 102：7779-7780)描述了HSP70上载(upload)II类MHC的分子和细胞生物学基础，并概述了细胞应激导致自我吞噬机制以及特别是HSP70家族成员片段通过伴侣介导自我吞噬(CMA)被负载进II类MHC分子的证据。没有提及可能诱导疾病抑制性免疫调节。
Paludan等人(2005，Science 307：593-595)描述了自我吞噬后的溶酶体加工促进了长寿命内源抗原的II类MHC限制性监视。在增加的补充材料(补充表1)中，描述了HSC70和HSP70为三种最常见的细胞质/核II类MHC天然配体源之中的两种。
Mizushima，Yamamoto等人(2004，Mol.Biol.Cell 15：1101-1111)描述，在胸腺上皮网状细胞中，自我吞噬是组成型活跃的，其发生无需营养缺乏或其它细胞应激诱导事件，并且这种胸腺自我吞噬在新生儿中更活跃。由此，可推断自我吞噬有助于T细胞库的产生。
Hutszti，Bene et al.(2004，Inflamm.Res.53：551-555)描述了旨在支持这样的观察结果的实验，即低水平的针对分枝杆菌hsp65的抗体存在于患有IBD的患者中。
Elsaghier et al.(1992，Clin.Exp.Immunology 89：305-309)描述了测量患有克罗恩病、溃疡性结肠炎和肺的非肺结核分枝杆菌疾病的患者中针对分枝杆菌和人热休克蛋白的抗体水平。他们认为这些数据不足以暗示分枝杆菌在IBD患者中的致敏作用。因此，其它的细菌蛋白可能参与了致敏作用。
WO 03/072598描述了HSP70肽在诊断和治疗自身免疫疾病、尤其是1型糖尿病中的用途。在测试的糖尿病患者中，大多数显示了对人HSP70的二十肽1-20(p1)、391-410(p27)和511-530(p35)的增殖反应。没有公开适合于用在免疫介入中的肽。
WO 2007/054658公开了某些CD40L和分枝杆菌hsp70序列用于控制免疫反应的用途。这些hsp70序列为二十肽407-426、457-476和477-496。
仍需要其它的适合于治疗和/或预防IBD和关节炎和/或其它自身免疫疾病的肽和组合物。还需要可用于鉴定或选择肽的方法，当所述肽以适合量给予人体时可治疗或预防关节炎和/或其它自身免疫疾病或其症状。
炎性肠病(IBD)的起因已知依赖于肠道菌群的存在，并认为是对共生生物体的不当的高反应性(Bouma and Strober 2003，Nature Rev.Immunol.3：521-533)。在手术切除回肠的克罗恩病患者(无粪流)中，病变似乎消失了。注入肠内容物后诱导了复发的克罗恩病(D’Haens et al.1998，Gastroenterology 114：262-267)。此外，在无菌条件下，不能诱导实验性IBD疾病，除非重建肠菌群(Chandran et al.2003，Surgeon 1：125-136，Strober et al.2002，Ann.Rev.Immunol.20：495-549)。因此，据信细菌抗原为导致疾病引发的触发者。在诸如克罗恩病的IBD中，没有病因相关的自体抗原已知存在，这与自身免疫疾病不同。因此，IBD不被认为是自身免疫疾病，如类风湿性关节炎。
IBD模型已产生了厌氧细菌(梭菌，类杆菌属)在诱导该疾病中的主要作用的证据(参见Verdu et al.2000，Clin.Exp.Immunol.120(1)：46-50)。在DSS诱导的结肠炎中口服给予厌氧细菌、需氧革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的粗超声降解物，只有厌氧细菌的超声降解物被发现减弱实验性结肠炎的严重程度。
发明概述
本发明人发现，一种或多种HSP70衍生肽可用于治疗和/或预防关节炎和/或其它自身免疫疾病以及炎性肠病和其它炎性疾病。因此，本发明涉及所述肽及其混合物，涉及包含这些的一种或多种的组合物，以及涉及鉴定能够激活HSP70特异调节性T细胞的保护性HSP70肽的方法。还提供了HSP70肽特异的T细胞系和杂交瘤，其可在体外或体内用作HSP70肽特异的调节性T细胞的来源，用于研究目的以及在治疗和疗法中使用这类特异的调节性T细胞。
在以全长分枝杆菌HSP70蛋白免疫小鼠和表位作图分析(测试分枝杆菌HSP70衍生肽(在123种重叠的HSP70肽筛选中，参见Wendling etal.2000，J.Immunol.164：2711-2717)存在下T细胞增殖反应)后，鉴定了13种分枝杆菌15聚体肽，它们被分枝杆菌HSP70启动的(primed)T细胞识别，并由此认为是参与激活HSP特异的调节T性细胞的候选物。在免疫小鼠中采用13种肽(基于它们与小鼠同源HSP70肽的同源性分为肽池)的混合策略(pooling strategy)，他们发现两种保守的细菌肽(命名“B1”和“C1”)诱导与小鼠同源物HSP70肽(分别为“mB1”和“mC1a”，“mC1b”)有交叉反应的T细胞，即细菌肽启动的T细胞与小鼠的同源的“自身”HSP70肽(即小鼠同源肽)有交叉反应。
在随后的实验中，在小鼠中诱导关节炎之前，给予全长分枝杆菌HSP70蛋白或分枝杆菌和/或小鼠HSP70肽(例如，具有氨基酸VLRIVNEPTAAALAY(SEQ ID NO：3)并命名“C1”的分枝杆菌肽和具有氨基酸序列VLRVINEPTAAALAY(SEQ ID NO：4)并命名“mC1a”的小鼠同源HSP70肽的混合物或给予这些肽的任一种本身；或给予具有氨基酸序列DEVVAVGAALQAGVL(SEQ ID NO：1)并命名肽“B1”的分枝杆菌肽本身)，以细菌和哺乳动物同源HSP70肽的混合物鼻内预处理或以这些肽的任一种分别处理，或以分枝杆菌肽B1处理，能够显著减弱关节炎进展和症状严重度，表明保守的HSP70肽可用于治疗和/或预防关节炎。
因此，细菌HSP70衍生肽能够诱导特异保护性T细胞的增殖和扩展，这些T细胞可与“自身”HSP70表位(自身HSP肽)交叉反应，例如关节炎关节或关节炎发炎区域局部诱导的HSP70蛋白衍生的那些。除了抗原特异的T细胞增殖，IFN-γ和IL10的生成显著地被所述肽和肽混合物刺激，表明IFN-γ和/或IL10的生成可能在保护效应方面起作用。
另外，在小鼠中诱导结肠炎之前，给予全长分枝杆菌HSP70蛋白或分枝杆菌和/或小鼠HSP70肽(C1和mC1a)，导致结肠炎进展和症状严重度的显著减轻，表明全长HSP70蛋白和/或保守的HSP70肽可用于治疗和/或预防炎性肠病，例如结肠炎。因此，细菌HSP70蛋白和/肽能够诱导特异保护性T细胞的增殖和扩展，这些T细胞可与“自身”HSP70表位(自身HSP肽)交叉反应，例如IBD局部诱导的HSP70蛋白衍生的那些。
发现以下的肽和/或其混合物(以及包含这些或由这些组成的组合物)诱导HSP70特异的T细胞反应，可用在治疗和/或预防关节炎(尤其是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎)和/或其它自身免疫疾病(例如但不限于1型糖尿病、动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力)或任意这些疾病的症状的方法中，以及用在治疗和/或预防炎性疾病(特别是IBD，例如克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎和乳糜泻)的方法中：
1)SEQ ID NO：1-命名“B1”并具有氨基酸序列DEVVAVGAALQAGVL的分枝杆菌HSP70肽；及其变体(包含例如至少70％的与该肽的序列一致性)和包含该肽或变体的更长的肽。SEQ ID NO：1的一变体例如描述在SEQ ID NO：2和SEQ ID No：83-93的相关部分中，其中SEQ ID NO：2显示了命名“mB1”并具有氨基酸序列DEAVAIGAAIQGGVL的小鼠HSP70同源肽。
2)SEQ ID NO：3-命名“C1”并具有氨基酸序列VLRIVNEPTAAALAY的分枝杆菌HSP70肽；及其变体(包含例如至少70％的与该肽的序列一致性)和包含该肽或变体的更长的肽。SEQ ID NO：3的变体例如描述在以下的两序列中：SEQ ID NO：4，描述命名“mC1a”并具有氨基酸序列VLRVINEPTAAALAY的小鼠HSP70同源肽；以及SEQ ID NO：5，描述命名“mC1b”并具有氨基酸序列VLRIINEPTAAAIAY的小鼠HSP70同源肽，以及在SEQ ID No：57-71的相关部分中。
出乎意料地，发明人在表位作图实验(见实施例)中鉴定的具有与肽mC1b相同氨基酸序列的肽已在文献中描述为从保持在应激(营养缺乏)条件以增强自我吞噬的人B细胞系的人II类MHC分子洗脱(Dengjel et al.2005，PNAS 102：7922-7927，参见表1，人肽VLRIINEPTAAAIAY)，并且重叠肽也已由其它描述为存在于人II类MH中(参见实施例)。不被任何理论所束缚，本发明人认为，其它的从II类MHC分子洗脱的HSP70衍生肽(和/或它们的细菌同源物)也适合于治疗和/或预防关节炎(特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎)和/或其它自身免疫疾病，例如但不限于动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力，或任意这些疾病的症状，以及一种或多种IBD，例如克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎和/或乳糜泻。因此，提供了可用于本发明的其它组的肽：
3)HSP70蛋白衍生肽，其结合待治疗个体的细胞上的II类MHC并且诱导与该个体的同源“自身”HSP70肽可交叉反应的T细胞。
从文献筛选存在于(结合)II类MHC分子上(即容纳在II类MHC裂隙中且可从中洗脱)的HSP70衍生肽，鉴定了约30种肽(参见实施例和SEQ ID NO：17-47)，它们都作为适合于治疗或预防自身免疫疾病和IBD而包括在本文中。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了包含一种或多种HSP70衍生肽的组合物(以及包含这些或由这些组成的组合物)(其能够结合哺乳动物、尤其是人II类MHC分子)，用于激活HSP70特异的调节性T细胞，并由此用于治疗和/或预防关节炎，特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎，和/或其它自身免疫疾病，例如但不限于动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力或任意这些疾病的症状，以及IBD。
另外，还提供了使用HSP70家族成员的一种或多种II类MHC洗脱肽来(制备药物来)治疗或预防关节炎和/或其它自身免疫疾病(例如但不限于动脉粥样硬化，多发性硬化、重症肌无力或任意这些疾病的症状)的方法。此外，本文提供了使用一种或多种更长的包含这些洗脱肽的HSP70肽的方法。在另一实施方案中，本文排除使用全长HSP70蛋白或复合的HSP70衍生肽(例如US 6,007,821中描述的HSP70肽复合物)。因此，本文使用的肽优选自由的、非复合肽，它们不结合至其它蛋白或肽。所述肽的使用具有优点，因为它们可合成制备，这是廉价的并且避免了例如从天然或重组来源纯化的蛋白的污染。特异性、稳定性和均一性也高。类似地，提供了包含一种或多种HSP70肽的药物、营养或食品增补组合物，其可用于免疫或预免疫哺乳动物、特别是人来预防关节炎和/或其它自身免疫疾病，和/或在症状出现后治疗关节炎和/或其它自身免疫疾病。
另外，还提供了使用HSP70家族成员的一种或多种II类MHC洗脱肽来治疗或预防一种或多种IBD的方法。在另一实施方案中，本文提供了使用全长HSP70蛋白来(制备药物来)治疗或预防一种或多种炎性肠病(IBD)的方法。类似地，上文提及的药物、营养或食品增补组合物可用于免疫或预免疫哺乳动物、特别是人来防御IBD，和/或在症状出现后治疗IBD。
在另一实施方案中，提供了鉴定适合于治疗和/或预防关节炎和/或其它自身免疫疾病的HSP70衍生肽的方法，包括
(a)提供优选来自细菌或哺乳动物HSP70蛋白的一种或多种HSP70衍生肽；以及
(b)任选地确定HSP70衍生肽是否能够结合II类MHC分子，即结合II类MHC裂隙，或者可从II类MHC分子洗脱；
(c)任选地在交叉反应测定法中测试所述肽诱导与哺乳动物(尤其是人或动物模型或细胞系)的同源自身肽可交叉反应的肽特异T细胞的能力，并选择显示交叉反应性的那些肽；以及
(d)向关节炎动物模型(例如佐剂性关节炎、蛋白聚糖诱导关节炎)和/或其它自身免疫疾病动物模型或炎性疾病动物模型给予包含一种或多种所述肽或由其组成的组合物以确定体内保护活性，并且比较治疗和对照动物之间的发病和/或症状，由此确认所述一种或多种肽适合于治疗和/或预防疾病；以及
(e)采用所述一种或多种肽来制备用于治疗和/或预防人或动物的关节炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD的药物，以及在治疗和/或预防个体的关节炎和/或其它自身免疫疾病和/或炎性疾病的方法中使用所述一种或多种肽，其中所述个体特别是人或驯养动物，例如家畜或宠物(例如狗)。
因此，在一个实施方案中，所述肽源于HSP70蛋白且包含T细胞表位，其在动物模型如小鼠中预防实验性诱导的关节炎和/或其它自身免疫疾病(见步骤d)。在另一实施方案中，所述肽包含全长HSP70蛋白的一部分，或全长HSP70蛋白的一系列肽，或两种或多种HSP70衍生肽的混合物，或者由其组成，且在给予小鼠时预防实验性关节炎和/或其它自身免疫疾病和/或炎性疾病(见步骤d)。
还提供了治疗或预防人或动物个体的关节炎和/或一种或多种其它自身免疫疾病和/或一种或多种炎性疾病的方法，包括向有需要的个体给予治疗或预防有效量的一种或多种HSP70衍生肽(或其变体，或包含该较短肽的更长肽)(步骤(e))。
一般性定义
“关节炎”在本文中指选自类风湿性关节炎、银屑病关节炎和幼年型慢性关节炎的炎性自身免疫疾病。
“自身免疫疾病”指诸如关节炎、胰岛素依赖糖尿病(1型糖尿病)、动脉粥样硬化、重症肌无力、实验性自身免疫脑脊髓炎、多发性硬化等的疾病，其中主要的疾病开始和维持性免疫反应是针对个体的自体抗原(自身抗原；即正常细胞组分的抗原)。产生了特异于这类自体抗原的自体抗体和T细胞。特别地，根据本发明，待治疗或预防的自身免疫疾病为炎性T细胞即II类MHC限制性CD4T细胞引起的那些疾病。这些疾病包括动脉粥样硬化、关节炎、重症肌无力、多发性硬化等。这些疾病可被认为不用于细胞毒性T淋巴细胞(I类MHC限制性CD8T细胞)引起的自身免疫疾病，如糖尿病。
“非自身免疫疾病”在本文指这样的疾病，其中主要的疾病开始和维持性免疫反应不是针对个体的自体抗原(自身抗原)，而是针对非自身抗原(外来抗原)。例如，IBD(炎性肠病)为非自身免疫疾病。在这种/后一情形下，自身免疫反应不是开始和/或维持炎症的原因。对于克罗恩病，该疾病的非自身免疫性质在手术构建的盲袢中得到证实，其中除去粪便内含物导致疾病消退，而重新注入粪便内容物导致疾病复发(Rutgeerts et al.1991，Lancet 338：771-774)。
“炎性疾病”指任何这样的疾病，其中组织或细胞损伤或细胞功能障碍是通过血浆体液介导物或淋巴(白血)细胞形式的免疫系统活性引起。这包括炎性肠病(IBD)和其它炎性疾病。这类其它炎性疾病包括过敏性疾病或状况，例如特应性皮炎、食物过敏、药物过敏和哮喘。
“IBD”在本文指炎性肠病，一种胃肠道慢性炎症，包括以下疾病或由其组成：克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎和乳糜泻。
“个体”在本文为哺乳动物，特别是人和/或驯养动物，特别是家畜(牛、马、猪等)或宠物(狗、猫、兔等)。术语“模型动物”在本文中通常指非人动物，特别是非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔等。
术语“抗原”(或免疫原)包括提及能够引起适应性免疫反应的物质，即能够诱导产生对该抗原有特异免疫反应性的抗原识别分子(特别是抗原特异或交叉反应T细胞)的物质。抗原内的特异免疫反应位点称为“表位”(或抗原决定族)。本文提供了由一种或多种细菌和/或哺乳动物HSP蛋白的表位组成或包含它们的蛋白片段(肽)，所述表位能够预防和/或治疗关节炎和/或一种或多种其它自身免疫疾病。这些表位也称为“保护性表位”。
“T细胞表位”指由T细胞受体识别的表位。结合表位后，个体中免疫反应被固定。
“肠的”在本文中指直接输送进个体的胃肠道(例如，口服或通过软管、导管或人造口)。“鼻的”指通过鼻给药。
“百分比”或“均值”一般指重均百分比，除非另有说明或除非明确指另一基准。
“序列一致性”和“序列相似性”可通过采用整体或局部比对算法比对两氨基酸序列或两核苷酸序列来确定。然后，当它们(当通过例如采用默认参数的程序GAP或BESTFIT最佳比对时)共有至少某种最低百分比的序列一致性时，序列可归为“基本上一致的”或“实质上相似的”，或“变体”(如以下所定义的)。GAP采用Needleman和Wunsch整体比对算法在总长度上来比对两序列，最大化匹配数量并最小化空位数量。其最适合比对类似长度的序列。一般地，采用GAP默认参数，空位生成罚分高于延伸罚分(例如，空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5)。对于核苷酸，所使用的默认计分矩阵为nwsgapdna，对于蛋白，默认计分矩阵为Blosum62(Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。可以采用计算机程序，例如GCG Wisconsin软件包，版本10.3，来确定序列比对和序列一致性百分比计分，该软件包可从Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752USA获得。另外，可使用EmbossWin版本2.10.0，采用程序“needle”(其对应GAP)，参数与以上GAP所用的相同。对于不同长度的序列，优选使用局部比对算法如Smith Waterman算法，例如通过例如EmbossWin版本2.10.0的程序“water”所提供的，采用默认参数(空位开放罚分10.0和空位延伸罚分0.5)，或采用诸如BLAST或FASTA的程序。
术语“蛋白”或“多肽”或“肽”可互换使用，指由氨基酸链组成的分子，不考虑特异作用方式、大小、三维结构或来源。蛋白的“片段”或“部分”或包含天然蛋白的片段的肽因此仍可称为“蛋白”或“肽”。“分离的蛋白”用来指不再处于其天然环境中的蛋白，例如在体外或在重组细菌宿主细胞中。
根据上下文，术语“同源物”或“同源的”指从共同祖先序列传下来的序列。如果需要，该术语可通过直系同源(ortholog)和旁系同源(paralog)来说明；参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/Orthology.html)。直系同源一般在不同物种中保留了相同功能。与此相反，旁系同源进化出不同(可能相关)的功能。HSP70家族的细菌热休克蛋白和哺乳动物热休克蛋白因此在本文中认为是同源物，不同种类细菌的HSP70蛋白或不同种类的哺乳动物的HSP70蛋白(例如小鼠和人HSP70蛋白)也是如此。因此，采用局部比对算法(例如SmithWaterman)成对比对时，细菌HSP70衍生肽的“哺乳动物同源物”在氨基酸序列上与该细菌肽有至少70％、优选至少80％、90％或更高的一致性。
术语“同源的”和“异源的”也可以用于指核酸或氨基酸序列与其宿主细胞或生物体的关系，尤其在转基因细胞/生物体情况下。同源序列因此在宿主物种中天然存在，而异源序列不天然存在于宿主细胞中。
“严紧杂交条件”可用于鉴定核苷酸序列，其基本上与给定的核苷酸序列相同。严紧条件是序列依赖的，不同情况下可以不同。通常，对特异序列而言，在确定的离子强度和pH下严紧条件选择为低于热力学熔点(Tm)约5℃。Tm为50％的靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度(确定的离子强度和pH值下)。典型地，可以选择这样的严紧条件，其中盐浓度约0.02摩尔，pH7，且温度至少60℃。降低盐浓度和/或升高温度增强严紧性。用于RNA-DNA杂交(采用例如100nt探针的Northern印迹)的严紧条件例如包括至少一次在0.2X SSC中于63℃洗涤20min，或等同条件。用于DNA-DNA杂交(采用例如100nt探针的Southern印迹)的严紧条件例如包括至少一次(一般两次)在0.2X SSC中于至少50℃(一般约55℃)洗涤20min，或等同条件。还参见Sambrook等人(1989，Molecular Cloning：a laboratory manual(分子克隆：实验室手册).第二版.N.Y.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.1659p.ISBN 0-87969-309-6)以及Sambrook和Russell(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)。
在本文及其权利要求书中，动词“包含”及其词形变化以其非限制性意义使用，指该词语之后的项目包括在内，但是并不排除未明确提及的项目。另外，通过不定冠词“a”或“an”指出的元素不排除存在一个以上该元素的可能性，除非上下文明确要求该元素中的一个并仅有一个。因此不定冠词“a”或“an”一般指“至少一个”，例如“a cell”也指细胞培养物、组织、整个生物体等形式的多个细胞。还应理解的是，当本文提及“序列”时，一般指具有某种亚单元(例如氨基酸)序列的实际物理分子。
详细说明
本发明涉及一种或多种从II类MHC分子洗脱和/或能够与其结合的热休克蛋白70(HSP70)衍生肽在治疗和/或预防关节炎、特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎和/或其它自身免疫疾病、例如但不限于动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力或任意这些疾病的症状中的用途。本发明还涉及包含一种或多种这类肽或由其组成的组合物。本发明还涉及HSP70衍生肽和/或一种或多种全长HSP70蛋白在治疗和/或预防炎性疾病、特别是IBD、尤其是各种形式的结肠炎、例如选自克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎和乳糜泻的那些疾病中的用途。
用于本发明的肽和蛋白
热休克蛋白为普遍的蛋白，其在原核和真核细胞中发挥重要的看家功能。它们作为伴侣蛋白在蛋白折叠和从应激条件拯救细胞方面起重要作用。基于它们的单体分子量将它们分为不同的家族。因此，家族HSP70的蛋白具有约70kDa的分子量。主要家族为HSP 10、40、60、70、90和100。很多哺乳动物HSP家族成员具有高度保守的微生物同源物。
本发明人发现，分枝杆菌HSP70和哺乳动物HSP70蛋白的肽片段可用于治疗哺乳动物中的炎性疾病和/或自身免疫疾病。他们发现所鉴定的小鼠肽之一(命名mC1b)的人同源物由于在II类MHC分子上被呈递而已在Dengjel等人的文章(PNAS 2005，上文)有描述。该文章中显示并认为，特别在细胞应激条件下，胞质蛋白通过自我吞噬而进入抗原呈递的II类MHC途径中。在自我吞噬中，三种不同的机制起作用，其中伴侣蛋白介导的自我吞噬(CMA)是一种机制。在CMA中，HSC70为转运分子，其协助有功能的Lamp-2将胞质蛋白转移进溶酶体，用于II类MHC呈递。由于CMA的这种机制，HSC70(HSP70家族蛋白)片段优先与II类MHC负载区室相交叉，并被捕获在II类MHC结合裂隙中。在Dengjel等人的文章中，发现HSP70肽主导从II类MHC获取的胞质肽库并在增强自我吞噬的条件下上调(营养缺乏)。这篇文章中没有地方有对这对于HSP特异CD4+T细胞识别可能意味着什么的解释，而是已发现类似的肽(本文命名mC1a和C1)适合于治疗和/或预防自身免疫疾病，例如关节炎或IBD，本发明人断定能够结合II类MHC分子并诱导与同源的“自身”HSP70肽可交叉反应的CD4+T细胞的HSP70衍生肽可用于治疗和/或预防哺乳动物(特别是人)中的关节炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD。术语“治疗”在本文中指，在给予适合量的一种或多种HSP70衍生肽后，疾病症状和/或进展的任何减弱或缓解，由此在诊断出关节炎或IBD后进行一次或多次给药。该术语因此包括经治疗个体中疾病症状和/或进展的减弱，以及该个体的痊愈。术语“预防”指向个体预防性给予本发明的化合物或组合物，该个体还未被诊断有关节炎或IBD，但是其例如可能有发病的风险。
本发明人还得到Mizushima等人的文章(Molecular Biology of the Cell，2004，Vol.15：1101-1111)的指导，其显示自我吞噬以高基础水平在胸腺的胸腺上皮细胞中发生。年幼哺乳动物和晚期胚胎在胸腺中显示甚至更高的自我吞噬活性(同上，相同文章)。本发明人认为，胸腺上皮细胞参与了T细胞库的阳性选择。这使得HSP70有可能在组织T细胞库的阳性选择的位置和时间上载进II类MHC。换言之，由此本发明人推断，胸腺选择的HSP70衍生肽将可能导致对HSP70肽有特异性的调节性T细胞的T细胞库的形成。
本发明人将这些零碎的信息与他们自己的实验数据(见实施例)组合，得出结论：增强的自我吞噬条件(例如应激和营养缺乏)下的细胞系的II类MHC分子结合裂隙中的HSP70家族成员衍生肽有诱导调节性T细胞反应的性质，并适合于治疗和/或预防关节炎(特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎)和/或其它自身免疫疾病，例如但不限于1型糖尿病、动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力或任何这些疾病的症状或IBD。
本发明人在蛋白聚糖诱导的关节炎的Balb/c小鼠模型中测试了命名C1(SEQ ID NO：3)的分枝杆菌HSP70衍生肽和其交叉反应性哺乳动物(小鼠)同源物(命名mC1a的HSP70同源肽，SEQ ID NO：4)诱导调节性T细胞反应(针对同源的小鼠HSP70肽)的能力(将它们分别测试或混合在一起测试)。这些实验显示，在诱导疾病之前给药，两种肽单独(或作为二者的混合物)的鼻内给药抑制了关节炎(见实施例)。对于肽“B1”也发现了类似的结果。
他们还在TNBS诱导的Balb/c小鼠结肠炎模型中测试了C1诱导调节性T细胞反应(针对同源的小鼠HSP70肽)的能力。该实验显示，当在TNBS皮肤致敏之后且在通过直肠TNBS给药诱导疾病之前给药时，这种肽(肽混合物)的鼻内给药抑制了TNBS诱导的结肠炎病(参见实施例)。
本发明人还在实验性IBD模型中测试了完整分枝杆菌HSP70分子。这种情况下测试了SEQ ID NO：55的分枝杆菌HSP70。为此，使用了TNBS诱导的IBD模型和DSS诱导的IBD模型。在两种模型中，当口服和/或鼻内给药时，全长分枝杆菌HSP70都抑制了发病。
因此，本发明人发现HSP70衍生肽和/或完整HSP70蛋白的鼻内给药和/或口服给药在啮齿类的TNBS和DSS结肠炎模型中为高度抑制疾病的(参见实施例)。观察到预防效果和治疗效果。
肽(鼻内给药)预防关节炎的效果可与全长分枝杆菌HSP70蛋白(SEQID NO：55)的保护效果相较。因此，本发明人发现啮齿类关节炎模型中HSP70衍生肽的鼻内给药高度抑制疾病的(参见实施例)。
因此，在一个实施方案中，提供了保护性表位或由保护性表位组成或包含保护性表位的蛋白片段(肽)，以及包含它们的一种或多种的组合物。特别是在一个实施方案中，提供了用于制备治疗和/或预防关节炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD的组合物(例如药物或疫苗)的一种或多种HSP70肽或包含这种肽的更长的多肽。还提供了一系列HSP70肽，其中一系列包括重叠肽，它们合起来覆盖全长HSP70蛋白。这一系列的子部分(subpart)或全部也可以用于制备本发明的组合物。
术语“HSP70蛋白”在本文指全长蛋白，例如人、动物(例如哺乳动物)、细菌、酵母、植物或其它来源的且分类为属于HSP70家族蛋白的全长HSP70蛋白。该术语该包括这些蛋白的“变体”，例如相对于天然蛋白有一个或多个氨基酸缺失、替换或插入的蛋白。当优选采用整体比对算法全长比对时，变体可以包括与天然蛋白(即生物体中天然发现的HSP70蛋白)至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更高的氨基酸一致性。HSP70蛋白的实例包括SEQ ID NO：55中描述的分枝杆菌HSP70蛋白及其变体，SEQ ID NO：48-54中描述的人HSP70蛋白及其变体，例如包括与SEQ ID NO：55和/或48-54的至少以上百分比的氨基酸序列一致性的蛋白。其它来源的HSP70蛋白在本领域中是已知的，它们的氨基酸序列可容易地获得，例如通过http://www.expasy.org。实例包括(带UniProtKB/Swiss-Prot条目)：牛HSP70蛋白8(P19120；HSP7C_BOVIN)；鼠HSP蛋白5(P20029；GRP78_MOUSE)；大鼠HSP蛋白9(P48721；GRP75_RAT)；鸡(P08106；HSP70_CHICK)；果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))(HSP72_DROME)；拟南芥(Arabidopsis_thaliana)(P22953，HSP71_ARATH；P22954，HSP72_ARATH；O95719，HSP73_ARATH；Q39043，BIP2_ARATH)；普通烟草(Nicotiana_tabacum)(Q40511_TOBAC；Q67BD0_TOBAC；Q67BD1_TOBAC；Q67BD2_TOBAC；Q03685，BIP5_TOBAC)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SSQ1(Q05931，HSP7Q_YEAST)，SSB2(P40150，HSP76_YEAST)，SSA3(P09435，HSP73_YEAST)和SSA4(P22202，HSP74_YEAST)；嗜酸性乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)(Q84BU4，DNAK_LACAC)；丝状霉浆菌(Mycoplasma mycoides)(Q6MT06；DNAK_MYCMS)；以及麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)(DNAK_MYCLE，P19993)，禽结核分枝杆菌(M.avium)(A0QLZ6，DNAK_MYCA1)，副结核分枝杆菌(M.paratuberculasis)(Q00488，DNAK_MYCPA)，和浅黄分枝杆菌(M.gilvum)(DNAK_MYCGI，A4T112)；等等。
术语“HSP70衍生肽”或“HSP70肽”或“HSP70片段”在本文指以上描述的HSP70蛋白和/或蛋白变体的片段，例如包含上述HSP70蛋白或变体的至少5、6、7、8、9、10、优选至少11、12、13、14、15、任选地至少16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70或更多连续氨基酸的或由其组成的片段。因此，当采用局部比对算法与全长HSP70蛋白或变体(如上所定义)比对时，所述肽的至少5、6、7、8、9、10、11等连续氨基酸100％匹配该全长蛋白或变体。HSP70衍生肽还可以例如在一端或两端包含其它的氨基酸，或在氨基酸之间插入其它的氨基酸。这些另外的氨基酸不必与天然HSP70氨基酸序列互补。长度变化反映了这样的事实，即不同的长度变体可结合II类MHC分子。本发明HSP70衍生肽的非限制性实例由SEQ ID NO：1-5或其变体组成或包含SEQ ID NO：1-5或其变体，例如这样的肽，其相对于SEQ ID NO：1-5包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10氨基酸插入或添加、置换或删除并在体内仍为保护性的。其它优选的肽由SEQ ID NO：17-47或其变体组成或包含SEQ ID NO：17-47或其变体，例如这样的肽，其相对于SEQID NO：17-47包含1、2、3、4、5、或更多氨基酸插入或添加、置换或删除并在体内仍为保护性的。特别优选的肽为SEQ ID NO：56-132的那些，即其相同部分或与该部分有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％氨基酸一致性的等同物。显然，本发明的HSP70肽在治疗和/或预防关节炎方面在体内是有功能的，并且如下文所阐述的，可测试或确定功能。在一个实施方案中，所述肽包含HSP70蛋白或变体的不超过30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个连续氨基酸或由其组成。优选地，用在本发明中的肽具有至少10、11、12、13或14氨基酸，多至19、18、17或16连续氨基酸。最优选地，所述肽具有至少11至30氨基酸，更优选至少12氨基酸，多至少于25氨基酸，最优选15至少于19氨基酸。
“一系列”HSP70肽指至少两种、三种、四种、五种等，多至至少50、100、120、130、150、200、300或更多种肽的集合，这些肽重叠一个或多个氨基酸(优选至少3、5、8、9、10、11氨基酸或更多)，这样整个HSP70蛋白被该集合所覆盖，即重叠区域的排列可重构成整个HSP70蛋白或蛋白变体。例如，重叠10氨基酸的一系列15聚体肽产生123种肽的系列。该系列肽可以在不同的肽长度和/或重叠方面更小或更大。子系列可覆盖少于整个HSP70蛋白，例如至多80％、60％、50％、30％、20％或更少。
原则上，可以使用任何HSP70蛋白，例如任何微生物(例如细菌，例如来自分枝杆菌属的，等等)或哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、人等)来源的HSP70蛋白片段。各种各样生物体的HSP70蛋白都已被克隆和测序，如以上所描述的，因此蛋白和/或肽可通过例如重组DNA技术、化学合成而产生，或采用本领域熟知的方法从天然来源纯化。HSP70衍生肽可以为任何来源的HSP70蛋白的片段，例如细菌的、酵母的、植物的、合成的、人工的、哺乳动物(大鼠、小鼠、牛等)或人的。当采用全长HSP70蛋白(或一系列肽，例如覆盖全长蛋白)时，一个实施方案是该全长蛋白不是人源的，特别是当其用于治疗和/或预防溃疡性结肠炎时。因此，该实施方案包括使用全长非人HSP70蛋白来治疗或预防溃疡性结肠炎。
优选地，该HSP70蛋白系列和/或HSP70肽包含在体内有功能的表位或由其组成，即当它们以适合浓度和通过适合途径(例如鼻内)给药时，预防或治疗关节炎和/或其它自身免疫疾病。这类肽优选能够a)结合个体(例如人)的II类MHC分子，和任选地(b)它们能够激活与该个体(例如人或动物)或哺乳动物模型动物如小鼠的同源“自身”HSP70肽有交叉反应的调节性T细胞(CD4+细胞)，以及(c)当给予动物或人个体时，该肽能够治疗和/或预防关节炎和/或一种或多种其它自身免疫疾病，或症状严重性和/或任何这些疾病的发病(进展)。如本文其它地方所详细描述的，可对肽的上述能力进行测试，但基本上，能力a)可通过从科学文献(其被描述具有这种能力)鉴定肽和/或通过体外或体内的II类MHC结合测定来确定；能力b)可通过体外启动测试，能力c)可通过使用例如动物模型和/或人体试验来测试。在动物模型中也可使用人源化MHC转基因动物。
因此，在一个实施方案中，具有特定氨基酸序列的肽就此使用，例如组合物包含SEQ ID NO：1-5和10、或SEQ ID NO：17-47和/或56-132、或其它的各HSP70衍生肽之一的多个分子，或由其组成。
在另一实施方案中，提供了两种或多种不同HSP70衍生肽的混合物。这些不同的肽可以来自相同HSP70蛋白(例如源自细菌HSP70，例如源自分枝杆菌HSP70，例如SEQ ID NO：55)或来自不同HSP70蛋白，例如来自不同物种的同源物，例如一种肽来自小鼠或人HSP70，一种肽来自细菌HSP70。“不同”意味着肽的氨基酸序列有至少一个氨基酸差异(相对于其它肽通过添加、置换或删除)。
还可以使用一种或多种HSP70肽和/或HSP70系列的混合物。在优选的实施方案中，用于治疗和/或预防关节炎和/或其它自身免疫疾病的组合物包含至少一种微生物和至少一种哺乳动物HSP70肽或由其组成，其中细菌和哺乳动物肽优选彼此为同源物，即它们在氨基酸序列上非常相似(它们为如上所述的“变体”)且可交叉反应。例如，优选的组合物包含SEQ ID NO：3的肽(细菌“C1”)和一种或多种小鼠同源物(SEQ IDNO：4和/或5或其其它变体，例如来自其它物种的，参见SEQ ID NO：47-54和56-132)。
当提及“热休克蛋白”时，可理解的是该蛋白天然存在于细菌、酵母、植物或哺乳动物细胞中，但是可以通过各种手段生成或分离。例如，其可以通过重组DNA技术产生，由此编码蛋白(或蛋白片段)的核苷酸序列被用于转化或转染宿主细胞，然后其产生蛋白或蛋白片段。编码HSP的核酸序列(cDNA、RNA和基因组DNA)在本领域中是已知的，可以通过化学合成制备，并且用于重组产生蛋白或蛋白片段(肽)的方法是常规的。类似地，核酸杂交技术(例如采用严紧杂交条件)可用于分离编码HSP的基因。或者，蛋白或蛋白片段可以从天然来源(例如哺乳动物细胞、细菌或植物)纯化或部分纯化，或者可以化学合成。例如，肽可通过公知的Merrifield固相合成方法来合成，其中氨基酸顺序地添加至生长链。参见Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156；和Atherton et al.，“Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，”IRL Press，London，(1989)。自动肽合成仪可从许多供应商获得，例如AppliedBiosystems，Foster City，California。
在最广义上，提供了具有结合个体II类MHC分子的能力的任何HSP70肽序列。这种能力可采用本领域已知的各种方法测试。例如，可在II类MHC结合测定法中测试覆盖整个HSP70蛋白的例如15聚体肽的整个重叠组，参见Peptide electrophoretic mobility shift assay(肽电泳迁移率测定法)，Mittelman A.et al.，Degenerate binding of tyrosinase peptidesto MHC II Ad/Ed molecules(酪氨酸酶肽与MHC II Ad/Ed分子的简并结合).J.Exp.Ther.Oncol.(2007)6：231-9。还参见Joosten，I.等人(1994)描述的基于竞争的结合测定法，Direct binding of autoimmune disease related Tcell epitopes to purified Lewis rat MHC class II molecules(自身免疫疾病相关T细胞表位与纯化的Lewis大鼠II类MHC分子的直接结合).Int.Immunol.6：751。还参见US2004/224009。优选地，这类方法可用于测试一种或多种肽是否能够结合II类MHC分子。
“片段”在本文指包含任何HSP70蛋白的至少6或7、更优选至少8或9、更优选10、11、12、13、14、15、任选地16、17、18或更多连续(邻近)氨基酸的肽。如已经提到的，这是适当的，特别是因为II类MHC结合肽具有可变长度且多种长度的变体可结合类似的II类MHC分子。在一个实施方案中，片段不超过40、30，优选25、20、19、18、17、16或15氨基酸长。
本发明的HSP70片段(和混合物)优选是“有功能的”，即它们由一种或多种肽序列组成或包含一种或多种肽序列，当体内给药时，这些肽序列有治疗和/或预防关节炎和/或一种或多种其它自身免疫疾病和或IBD的能力。因此，最后，如实施例中所描述以及本领域已知的，将关节炎和/或其它自身免疫疾病的体内动物模型应该用于测试功能性。
所述肽优选能够结合个体的II类MHC分子(见上文)。尽管不是所有能够结合II类MHC分子的HSP70衍生肽都能诱导保护性T细胞反应，但是可通过选择发现存在于II类MHC分子裂隙中的HSP70序列来预选择潜在有功能的HSP70衍生肽(T细胞表位)，已知大约50％的MHC结合序列将通过免疫库(immune repertoire)而用作T细胞表位。在这种基于II类MHC结合能力的预选择之后，可通过测试肽诱导T细胞的能力来进一步测试功能性(类似采用体外人T细胞致敏测定法，例如参见：第3239页RH栏“Cellular Assay(细胞测定法)”和第3243页LH栏，Halder T，et al.，Isolation of novel HLA-DR restricted potential tumor-associated antigens from the melanoma cell line FM3(从黑素瘤细胞系FM3分离新的HLA-DR限制性的潜在肿瘤相关抗原).，Cancer Res.，1997，57：3238-44)，并且通过在体外致敏测定法中分析它们和/或在动物模型中测试体内功能，其可与同源“自身”肽交叉反应，由此以潜在的保护性肽对测试动物给药并选择那些显著降低或预防(与适合的对照相比)动物中自身免疫疾病的肽。
为了测试交叉反应性，即所选择的肽诱导与同源自身蛋白交叉反应的T细胞的能力，可使用以下方法(还参见实施例)：在体外以确定的(例如微生物)HSP70表位激活的T细胞接着可用同源的自身肽(在小鼠模型中小鼠HSP)再次激活，该自身肽或者为重组蛋白或从应激细胞或组织纯化，或作为应激的抗原呈递细胞上升高水平的MHC-肽复合物，或者是合成制备的。任何激活迹象(见上文)都可认为是测试(例如微生物)表位与自身蛋白/肽的交叉反应性的指示。最初的测试可基于自身蛋白/肽的序列以合成肽进行，但是最终证实与该蛋白/肽自身(分离形式或细胞上表达的)的交叉反应性优选以(过)表达并呈递该自身HSP肽的(应激的)抗原呈递细胞在T细胞激活试验中获得，以便排除隐蔽表位(crypticepitope)。
一种简单的确定最适合片段的方式是生成全长细菌HSP蛋白或哺乳动物/人HSP蛋白的重叠肽(例如重叠五聚体、六聚体、七聚体或十聚体；即短的连续氨基酸)并从它们的保护效果方面筛选这些重叠肽。例如，通过在自身免疫疾病如关节炎的啮齿类模型中给药，如实施例中所描述的。
在一个实施方案中，使用如上所述的覆盖完整HSP70蛋白的一系列肽，或子系列。例如，分枝杆菌HSP70(SEQ ID NO：55)在长度上由625氨基酸组成。可使用其片段或其变体的片段。在另一优选的实施方案中，使用包含SEQ ID NO：55或其变体的至少约6、7、8或更多连续氨基酸的或由其组成的片段。另外，可以使用完整的、优选非人HSP70，例如用于预防或治疗溃疡性结肠炎。
在本发明的另一实施方案中，用于本发明的HSP蛋白的片段(或系列)包含衍生自如下蛋白的所有功能片段，所述如下蛋白与SEQ ID NO：55或48-54(也称为SEQ ID NO：55的变体，或48-54)的任一种有至少35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高(100％)的氨基酸序列一致性(就蛋白的全长而言)，不考虑蛋白的来源且不考虑其是否天然存在。
在这些实施方案中，不要求该蛋白在细菌或哺乳动物(如人)中天然存在，由于在本文中使用了天然产生的HSP蛋白的变体。这类变体当然也可以天然存在于细菌或哺乳动物中。这些变体(及其片段)可以通过本领域已知的方法来产生，例如定向诱变，从头开始的化学合成，包含一个或多个核苷酸缺失、置换或添加的核酸序列的重组表达，基因混排技术，等等。例如，上文所述的DNA序列的小修饰可常规地完成，即通过PCR介导的诱变(Ho et al.，1989，Gene 77，51-59.，White et al.，1989，Trends in Genet.5，185-189)。对DNA序列的更深刻的修饰可通过采用可获得的技术进行的对所需编码区域的从头开始DNA合成来常规完成。细菌HSP70(如SEQ ID NO：55中所描述的)的优选片段由以下氨基组成或包含以下氨基酸：
-SEQ ID NO：55的氨基酸141-155(其也描述为SEQ ID NO：3)及其变体；
-SEQ ID NO：55的氨基酸342-356(其也描述为SEQ ID NO：1)及其变体；
-SEQ ID NO：17-47(哺乳动物HSP70片段)的细菌同源物，或其变体；这些细菌序列的实例在SEQ ID NO：56-132中给出；
-SEQ ID NO：55或其变体的任何其它的至少6、7、8、9、10、优选至少11、12、13、14、15、任选地至少16、17、18、20、30、40、50或更多连续氨基酸的片段。最优选的为在HSP70蛋白之间高度保守的片段；
“变体”包括具有至少70或至少80％序列同源性的同源物；变体还包括具有SEQ ID NO：3或1的序列的肽，其中一个或多个、优选多至五个或更优选一、二或三个氨基酸分别与SEQ ID NO：56-71或SEQ IDNO：83-93的对应氨基酸交换。
例如小鼠、大鼠、兔、牛、人等来源的哺乳动物同源HSP70蛋白(例如SEQ ID NO：48-54中为人HSP70蛋白所描述的)的优选片段由以下氨基酸组成或包含以下氨基酸：
-SEQ ID NO：1的哺乳动物同源物，例如SEQ ID NO：2(小鼠同源物)；或SEQ ID NO：48(人同源物hspa1a)的氨基酸366-380，或SEQ IDNO：49(人同源物hspa11)的氨基酸368-382；SEQ ID NO：50(人同源物hspa2)的氨基酸369-383；SEQ ID NO：51(人同源物hspa5)的氨基酸391-405；SEQ ID NO：52(人同源物hspa6)的氨基酸368-382；SEQ ID NO：53(人同源物hspa8)的氨基酸366-380；SEQ ID NO：54(人同源物hspa9)的氨基酸414-428，或其它哺乳动物HSP70蛋白的同源物或变体，例如与SEQ ID NO：1有至少70％氨基酸一致性或更高(如上所定义)的序列。
-SEQ ID NO：3的哺乳动物同源物，例如SEQ ID NO：4或5(小鼠同源物)；或SEQ ID NO：48(人同源物hspa1a)的氨基酸168-183，或SEQID NO：49(人同源物hspa11)的氨基酸171-185；SEQ ID NO：50(人同源物hspa2)的氨基酸170-184；SEQ ID NO：51(人同源物hspa5)的氨基酸195-209；SEQ ID NO：52(人同源物hspa6)的氨基酸171-185；SEQ IDNO：53(人同源物hspa8)的氨基酸169-183；SEQ ID NO：54(人同源物hspa9)的氨基酸216-230，或其它哺乳动物HSP70蛋白的同源物或变体，例如与SEQ ID NO：3有至少70％氨基酸一致性或更高(如上所定义)的序列。
-SEQ ID NO：48-54或其变体(例如来自其它哺乳动物的同源物)的任一种的氨基酸或任何其它的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、30、40、50或更多连续氨基酸的片段。最优选的为在HSP70蛋白之间高度保守的片段。
-SEQ ID NO：17-47和56-132，或其变体，例如来自其它哺乳动物物种的其同源物或其它哺乳动物HSP70蛋白
“变体”包括具有至少70或至少80％序列同源性的同源物；变体还包括具有SEQ ID NO：4或5；或2的序列的肽，其中一个或多个、优选多至五个或更优选一、二或三个氨基酸分别与SEQ ID NO：56-72或SEQ ID NO：83-93的对应氨基酸交换。
在一个实施方案中，优选仅使用一种蛋白片段，而在另一实施方案中，可以使用不同氨基酸序列的蛋白片段混合物。另外，全部HSP70系列或子系列可以与一种或多种HSP70蛋白的片段混合或组合。或者，可以混合不同HSP70蛋白的片段。例如，来自细菌的HSP70肽可以与一种或多种具体的哺乳动物HSP70衍生肽混合/组合或共给药。因此，也可以混合细菌和哺乳动物的其功能性片段。同样地，可以混合相同或不同HSP70蛋白的HSP70衍生肽的混合物。混合物包括包含两种或更多种蛋白和/或肽的单一组合物，或者共给药(一起，或一种紧接另一种)的分开组合物(称为试剂盒)，这样仅在给药后两种或多种蛋白和/或片段在一个个体的体内组合。
该混合物或试剂盒也可以包含一系列的HSP70肽，或这种系列的一部分(子系列)。例如，每种长度例如10、12、15、16或更多氨基酸的至少3、4、5或更多种重叠肽(它们合起来可重建HSP70蛋白的至少一部分或甚至全长)可在一种组合物内一起使用，或者共给药，这样它们在体内组合。对于该系列仅包含HSP70蛋白的一部分的情形，优选重叠肽构成全长HSP70蛋白的至少10％、20％、25％、优选至少30％、40％或50％。此外，优选地，这些肽优选重叠以仅形成一个或两个重叠群(contig)。因此，它们可以来自全长蛋白的两个区域，例如来自包括SEQID NO：55的氨基酸150和包括SEQ ID NO：55的氨基酸350的区域。这些肽优选重叠至少一个氨基酸，更优选重叠至少2、3、4或5氨基酸。
在本发明的另一实施方案中，提供了保护性表位或由保护性表位组成或包含保护性表位的蛋白片段，由此哺乳动物如小鼠或人HSP70衍生肽被用于制备治疗和/或预防人或动物(如家畜或宠物)中关节炎和/或其它自身免疫疾病的组合物(或药物)。“人热休克70蛋白”指智人(Homosapiens)的天然存在的蛋白，例如SEQ ID NO 48-54中描述的。非人、哺乳动物热休克70蛋白为人热休克70蛋白的变体，包括与人蛋白的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更高的一致性(参见本文其它地方的定义)。在整个说明书中，为细菌HSP70衍生片段描述的实施方案可同样应用到哺乳动物、特别是小鼠和人HSP70衍生片段，反之亦然。
因此，在一个实施方案中，全长人HSP70蛋白(或其变体或肽系列)也可以用于治疗人(或动物)个体，尤其是治疗或预防一种或多种选自克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎和乳糜泻的IBD。在另一实施方案中，全长人HSP70优选不用于人个体中治疗或预防IBD溃疡性结肠炎，由于对此目的非人HSP70蛋白是优选的。在不同的实施方案中，优选全长、非人HSP70(或变体或肽系列)可以被用于治疗人或动物个体，例如非人哺乳动物HSP70蛋白(例如小鼠、大鼠、牛、等)。
在另一实施方案中，仅使用细菌HSP70衍生肽，即在方法和组合物中不使用哺乳动物肽。在另一实施方案中，仅使用哺乳动物HSP70衍生肽，即在方法和组合物中不使用细菌肽。
在另一实施方案中，所述方法和组合物涉及治疗或预防一种或多种IBD的用途，其中该IBD为非自身免疫疾病；在一个实施方案中，该IBD不是溃疡性结肠炎。
如所提到的，所用的片段优选“有功能的”，即它们由一种或多种保护性表位组成或包含一种或多种保护性表位并且当给药至个体时能够诱导产生交叉反应的T细胞，并且尤其是减弱或预防关节炎或一种或多种与关节炎相关的症状。因此，为了试验片段的功能，可以如上所述或如实施例中测量交叉反应T细胞的激活，和/或体内功能可以在自身免疫疾病动物模型中评估，如所描述的，例如在关节炎或另一自身免疫疾病模型中评估。
应理解，本发明还考虑了肽类似物或包含肽类似物的蛋白片段，其展示出上述肽的免疫学性能，但是其含有一个或多个化学修饰。这类肽类似物，也称为肽模拟物，可例如由对应于上述肽的氨基酸残基的单元组成，其中基本上相同的侧基是存在的，但是骨架含有修饰，例如另一诸如CH＝CH、CO-O、CO-CH2或CH2-CH2的基团替换酰胺基团(C0-NH)。也可想像其它的修饰，例如通过类似的天然或非天然氨基酸替换氨基酸。在这方面，“类似的”指具有大致相同的大小、电荷和极性；因此脂肪族氨基酸丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸可认为是相似的；同样地，出于本目的，碱性至中性极性氨基酸如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺是类似的；这同样适合于酸性至中性极性氨基酸，例如天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸、高丝氨酸和苏氨酸。
上述肽可以就此使用，或者可以连接至增强它们的抗原性或免疫原性的序列。这种序列可以包括类毒素类或免疫球蛋白类的部分。所述肽也可以用作与MHC分子的复合物和/或被纳入溶酶体中。所述肽也可以共价连接至作为免疫刺激载体的其它分子或整个细胞。所述肽可以为单体、二聚体或多聚体的形式。
本发明还提供了自体T细胞或其它表达来自这类T细胞的T细胞受体或其部分的细胞，采用上述蛋白或肽通过免疫刺激将它们激活。
本发明还考虑了抗体，尤其是针对上述肽的单克隆抗体。这些抗体可采用已知方法来产生，例如通过杂交瘤技术。这些抗体可以用作被动疫苗或用作诊断工具。
鉴定HSP70表位和肽的方法
在另一实施方案中，提供了鉴定适合于治疗和/或预防关节炎(特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎)和/或其它自身免疫疾病(例如但不限于动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力)或任意这些疾病中的任一种的症状的方法，包括：
提供优选来自细菌和/或哺乳动物HSP70蛋白的一种或多种HSP70衍生肽(“试验”肽)；并且
a)任选地确定该HSP70衍生肽是否能够结合II类MHC分子，即结合II类MHC裂隙，或者可从II类MHC分子洗脱；
b)任选地在交叉反应测定法中测试该“试验”肽诱导与哺乳动物(尤其是人或动物模型或细胞系)的同源自身肽可交叉反应的肽特异T细胞的能力，并选择显示交叉反应性的那些肽；以及
c)任选地向自身免疫疾病或IBD动物模型给予包含一种或多种“试验”肽或由其组成的组合物以确定体内保护活性，并且比较治疗和对照动物之间的发病和/或症状，由此确认所述一种或多种肽适合于治疗和/或预防自身免疫疾病或IBD(和/或其症状)，以及
d)采用所述一种或多种“试验”肽来制备用于治疗和/或预防人或动物自身免疫疾病或IBD的药物，以及在治疗和/或预防个体(特别是人或动物个体，例如家畜或宠物)自身免疫疾病的方法中使用所述一种或多种“试验”肽。
在步骤(a)中，可以使用细菌或哺乳动物HSP70蛋白(包括人HSP70蛋白)的任何片段。可获得很多HSP70氨基酸序列，并且可采用标准肽合成方法合成由片段组成或包含片段的肽。优选地，将例如不同细菌和/或哺乳动物来源的HSP70蛋白进行比对，并选择保守氨基酸。所述肽在下文中称为“试验”肽。
在步骤(b)中，优选确定“试验”肽是否可结合人II类MHC分子。结合能力可采用各种方法分析，例如采用II类MHC-肽结合测定法。
步骤(a)和(b)也可互换，这样最初的测试肽例如通过文献分析鉴定为结合II类MHC分子，然后合成试验肽来进一步用于步骤(c)、(d)和(e)。由于步骤(b)是任选的，其也可被删除。
任选的步骤(c)涉及分析试验肽是否能够激活与同源自身肽或包含同源自身氨基酸的蛋白可交叉反应的调节性T细胞。这可以通过以下方式来完成：提供同源自身肽或蛋白(例如，通过比对步骤(a)的“试验”肽和生物体或细胞系的天然HSP70蛋白)，然后测试“自身”肽或蛋白向经“试验”肽启动的T细胞的给药是否导致T细胞激活反应，例如增殖，呈递激活标志物和产生细胞因子。这可例如在体内(动物模型)以及在体外(采用体外T细胞致敏测定法，参见Halder T. et al，Isolation ofnovel HLA-DR restricted potential tumor-associated antigens from themelanoma cell line FM3(从黑素瘤细胞系FM3分离新的HLA-DR限制性的潜在肿瘤相关抗原).，Cancer Res.，1997，57：3238-44)进行。选择显示交叉反应的试验肽来进一步使用，而摒弃不显示交叉反应的肽。
在步骤(d)中，与适当的对照一起，使用自身免疫疾病(例如关节炎模型)或IBD(例如TNBS诱导的结肠炎)的动物模型来确定一或多量的肽在一个或多个时间点(疾病诱导之前或疾病诱导之后)的给药是否对疾病严重性或发病有影响。这类各种自身免疫疾病的动物模型在本领域是可获得的，参见例如，实施例中描述的蛋白聚糖诱导的关节炎模型。其它关节炎模型例如包括II型胶原诱导的关节炎、蛋白聚糖诱导的关节炎、姥鲛烷诱导的关节炎和链球菌细胞壁诱导的关节炎(参见：PH Wooley，Animal models of rheumatoid arthritis(类风湿性关节炎的动物模型)，Curr.Opin.Rheumatol.1991Nr.3(3)：407-20.)。其它IBD模型包括例如化学诱导、免疫学、遗传学和自发模型(参见Pizarro T.T.，et al.，Mouse modelsfor the study of Crohn′s disease(用于克罗恩病研究的小鼠模型).TrendsMol.Med.20039(5)：218-22.综述)。动物模型也可用于确定有效浓度和最佳给药方式以及给药方案。
也可能通过采用转基因啮齿动物如小鼠来试验一种或多种HSP70衍生肽的功能和/或有效量，该转基因啮齿动物经人II类MHC基因转化，参见例如Koehm S.et al.，HLA-DRB1 alleles control allergic broncho-pulmonary aspergillosis-like pulmonary responses in humanized transgenicmice(人源化转基因小鼠中HLA-DRB1等位基因控制过敏性支气管肺曲霉病样肺反应)，J.Allergy Clin.Immunol.2007，June 8th印刷之前的电子出版物；Chen Z.，et al..，Humanized transgenic mice expressing HLA DR4-DQ3 haplotype：reconstitution of phenotype and HLA-restricted T-cellresponses(表达HLA DR4-DQ3单元型的人源化转基因小鼠：重建表型和HLA限制性T细胞反应)，Tissue Antigens 2006No.68(3)：210-9；Brintnell W.et al.，The influence of MHC class II molecules containing therheumatoid arthritis shared epitope on the immune response to aggrecan G1and its peptides(含有类风湿性关节炎共有表位的II类MHC分子对针对聚集蛋白聚糖G1及其肽的免疫反应的影响)，Scand.J.Immunol.2007Nr.65(5)：444-52；以及Mangalam A.et al.，Role of MHC class II expressingCD4+T cells in proteolipid protein(91-110)-induced EAE in HLA-DR3transgenic mice(HLA-DR3转基因小鼠内表达II类MHC的CD4+T细胞在蛋白脂质蛋白(91-110)诱导的EAE中的作用)，Eur.J.Immunol.2006Nr.36(12)：3356-70。
在步骤(e)中，步骤(d)中在治疗和/或预防疾病症状或进展方面显示出积极效果的那些肽或肽混合物被用于制备用于临床或动物试验以及用于商业用途的组合物。
该方法也可以用于覆盖全长HSP70蛋白的一序列肽或子系列，或肽混合物。在以上的方法中，步骤(c)也可以任选地用全长HSP70蛋白进行，这样在体外致敏测定后接着测量与纯化的人hsp70或应激的抗原呈递细胞或与人hsp70衍生肽的交叉反应。其也可在动物模型中进行。然后针对交叉反应性T细胞反应分析调节活性的诱导(例如细胞因子如IL-10的产生，在共培养测定法中的hsp特异T细胞的抑制活性)。
本发明的组合物和用途
本发明的蛋白和/或肽用于制备包含它们的药物组合物，由此该药物组合物可用于向哺乳动物(尤其是人和/或动物，特别是家畜和宠物)给药，来治疗和/或预防关节炎，特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎，和/或其它自身免疫疾病，例如但不限于动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力，或任意这些疾病中的任何的一种或多种(优选全部)症状，或者来治疗和/或预防IBD(特别是克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎和/或乳糜泻)，或其一个或多个(优选全部)症状，或者来治疗或预防其它炎性疾病，尤其是特应性皮炎、食物过敏、药物过敏和哮喘或其一个或多个症状。
所用的蛋白或肽的量可以变化，这取决于该组合物是用于治疗还是用于预防，以及取决于剂型和给药频率。适合的制剂可在Remington′sPharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，18th ed.(1990)或Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Remington：药物科学与实践)，2005，Lippincott Williams &Wilkins，US；21st Rev Ed edition中找到。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性肽(或包含它们的组合物)为预防性地给药(预防)或给予已经患有自身免疫疾病或炎性疾病的个体(治疗)。该组合物以足以引起有效免疫反应的量给予个体(例如患者)。足以实现该目的的量定义为“治疗有效量”或“免疫有效量”。对此用途有效的量将取决于例如肽组合物、给药方式、治疗的疾病的阶段和严重性、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的判断，但是一般在每个个体约0.1μg至约150μg每千克(kg)体重、或约1μg至约200μg每kg体重的范围，更通常是每剂约1μg至约50μg每kg体重。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。
组合物可以制备成各种剂量单元，例如包含例如7μg、7.5μg、8μg、9μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、100μg、200μg、1000μg、2500μg、5000μg或更多的每一HSP70衍生肽(以及任选地还有HSP70系列或子系列)的剂量。
任选地，药物组合物为黏膜给药，最优选口服或鼻内给药。但是，在另一实施方案中，包括了其它的给药形式，例如经皮给药、吸入和胃肠外给药。由其优选的为口服和鼻内制剂。
本发明的蛋白和/或肽可以例如溶解或悬浮在可接受的载体中，优选水性载体。可以使用多种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的、公知的灭菌技术灭菌，或者可以无菌过滤。所得到的水溶液可以就此包装使用，或者冻干，该冻干制剂在给药前与无菌溶液组合。
如接近生理条件所需，该组合物可以含有药物可接受的辅助物质，例如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨糖醇月桂酸酯和油酸三乙醇胺。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过将任何常用的赋形剂如之前列出的那些载体以及约0.1％至5％或10％、更优选0.1-2％的(优选每种)活性成分并入而形成药学上可接受的无毒组合物。如上所述，组合物旨在诱导对肽的免疫反应。因此，适合于最大化免疫反应的组合物和给药方法是优选的。例如，肽可以被引入宿主，包括人，其连接至载体或作为活性肽单元的均聚物或杂聚物。或者，可使用肽的“鸡尾酒(cocktail)”。一种以上肽的混合物具有增加免疫反应的优点。
该组合物，特别是口服剂型，还可以包含一种或多种蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂分为四类：丝氨酸蛋白酶抑制剂(包括胰蛋白酶抑制剂)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。适合的蛋白酶抑制剂在本领域中是可获得的(例如从Sigma-Aldrich)。优选的抑制剂为胰蛋白酶抑制剂，例如植物来源的胰蛋白酶抑制剂(大豆胰蛋白酶抑制剂、利马豆胰蛋白酶抑制剂、谷物胰蛋白酶抑制剂等)或动物来源的胰蛋白酶抑制剂(来自鸡或火鸡蛋清、来自牛胰腺等的胰蛋白酶抑制剂)。
该组合物还可以包含佐剂。很多佐剂在本领域都是公知的。适合的佐剂包括不完全弗氏佐剂、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′，2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)，以及RIBI，其在2％的角鲨烯/吐温80乳液中含有三种从细菌提取的组分：单磷酰脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
本发明免疫原性肽在药物制剂中的浓度可以广泛变化，即从少于约0.1％(例如，0.01％wt/vol)到约2％或更高重量比，并且将根据所选的特定给药模式主要通过液体体积、粘度等进行选择。
适合于各种给药类型的制剂的进一步指导可在Remington′sPharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，Mace Publishing Company，Philadelphia，PA，18th ed.(1990，上文)中找到。对于药物递送的方法的概述，参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。这些参考文献都通过引用其整体并入本文。
经皮递送系统包括贴剂、凝胶、胶带和软膏，并且可含有赋形剂如增溶剂、渗透增强剂(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、亲水聚合物(例如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷以及粘合剂和增粘剂(例如聚异丁烯、基于硅酮的粘合剂、丙烯酸酯和聚丁烯)。经黏膜递送系统包括贴剂、片剂、栓剂、阴道栓剂、凝胶和软膏，并且可含有赋形剂，例如增溶剂和增强剂(例如丙二醇、胆汁盐和氨基酸)，以及其它载体(例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及亲水聚合物如羟丙甲基纤维素和透明质酸)。可注射递送系统包括溶液、混悬液、凝胶、微球和聚合物可注射剂，并且可包含赋形剂如溶解性改变剂(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚癸酰基内酯和PLGA′s)。可植入系统包括帮状物和盘状物，并且可包含赋形剂如PLGA和聚癸酰基内酯。
其它的可用于本发明药物组合物给药的递送系统包括鼻内递送系统如喷雾剂和粉末剂、舌下递送系统和通过吸入递送的系统。对于通过吸入给药，本发明的药物组合物方便地以气溶胶喷雾剂包装的形式从压缩包或雾化器递送，其使用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、一氧化碳或其它适合的气体。对于压缩的气溶胶的情况，剂量单元可以通过提供阀递送计量的量来确定。用在吸入器或吹药器中的例如明胶胶囊和药盒可以配制为容纳有本发明肽的粉末混合物和适合的粉末基料如乳糖或淀粉。本发明的药物组合物还可以配制为通过例如美国专利6,358,530中描述的吸入剂给药。也可以使用其它的疫苗或给药方法，例如颗粒轰击(微弹轰击)，由此编码表位即本发明的肽和/或蛋白的DNA或RNA被包被在金颗粒上，这些金颗粒被用于轰击个体组织，参见例如van Drunen et al.Methods Mol Med.2006；127：91-105；Gaffal et al.Eur.J.Cell.Biol.2006，Available online 22August 2006)，或脂质体递送。因此，在一个实施方案中，提供了编码本发明蛋白和/或肽的DNA或RNA(例如，包含所述DNA或RNA的质粒)，以及包含它们的组合物。
在另一方面，本发明涉及产生包含本发明的肽或蛋白的药物组合物的方法。该方法至少包括将本发明的肽或蛋白与药物可接受的载体和其它如上文描述的组分如佐剂混合的步骤。还提供了被本发明的一种或多种肽和/或蛋白包被的金颗粒，其用于微弹轰击应用。
还提供了治疗或预防关节炎(特别是类风湿性关节炎和/或银屑病关节炎和/或幼年型关节炎)和/或其它自身免疫疾病如动脉粥样硬化、多发性硬化、重症肌无力或人个体中任意这些疾病的一种或多种(优选全部)症状或炎性肠病(IBD)的方法，包括给予有需要的人治疗或预防有效量的一种或多种上述肽。在优选的实施方案中，该给药为定期黏膜给药，优选口服和/或鼻内给药。
应注意到，本文描述的治疗和预防性(保护性)治疗不限于完全消除或完全防止疾病，而是在一实施方案中还指，相对于对照组，显著降低治疗个体组中一种或多种关节炎症状和/或一种或多种其它自身免疫疾病的症状的严重性，如关节炎的实施例所描述的。例如，一种或多种与关节炎和/或其它自身免疫疾病和/或IBD相关的症状，例如体重减轻(临床状态)、结肠缩短和/或组织形态学变化等，在治疗组中可以显著降低。显著降低应该是统计学上显著的，技术人员可容易地确定是否如此。例如，与对照组相比，一种或多种症状降低至少约1％、2％、5％、10％、20％或更多可以是显著的。
关节炎症状包括例如动物爪子的发红和肿胀或体重减轻。在人，可以评估普遍接受的疾病活性标准/接受的反应标准，例如HealthTechnology Assessment 2002，Vol.6，No.21，p83中描述的关节炎反应标准，其包括例如“疼痛关节数”、“肿胀关节数”、“疼痛的患者评估”以及其它用于评估疾病症状和严重性的标准。对于其它自身免疫疾病，类似的用于评估症状和疾病严重性的标准在本领域是已知的。
应注意到，本文描述的治疗和预防性(保护性)治疗不限于完全消除或完全防止疾病，而是在一实施方案中还指，相对于对照组，显著降低治疗个体组中一种或多种IBD症状的严重性，如实施例中所描述的。例如，一种或多种与IBD相关的症状，例如体重减轻(临床状态)、结肠缩短和/或组织形态学变化等，在治疗组中可以显著降低。显著降低应该是统计学上显著的，技术人员可容易地确定是否如此。例如，与对照组相比，一种或多种症状降低至少约1％、2％、5％、10％、20％或更多可以是显著的。
以下的表1显示了II类MHC结合/洗脱的哺乳动物HSP70衍生肽的文献研究结果。这些肽可用于治疗或预防人或其它动物的关节炎或IBD。根据本发明使用的肽优选与表的序列具有至少70％的氨基酸一致性。另外，可有利地使用来自其它物种、尤其是细菌物种的同源肽。
表1：从II类MHC分子洗脱的衍生自哺乳动物HSP70家族成员的肽
| 序列和SEQ ID | II类MHC类型 | MHC来源 | 潜在肽来源 | 蛋白来源($) | 参考文献 |
| IIANDQGNRTTPSY(SEQ ID NO：17) | I-Ak | 小鼠 | hspa8(28-41)hspa2(29-42)hspa11(30-43)hspa1a(28-41)hspa1b(28-41) | mmmmm | Nelson et al.，(1992)，PNAS，89：7380-83 |
| ITPSYVAFTPEGERL(SEQ IDNO：18) | I-Ab | 小鼠 | hspa5(62-76) | m | Dongre et al.(2001)，Eur.J.Immunol.，31：1485-1494 |
| TPSYVAFTDTERLIG(SEQ ID NO：19) | HLA-DR7 | 人 | hspa8(38-52)hspa2(39-53)hspa11(40-54)Hspa1a(38-52) | hhhh | Chicz et al.(1993)，J.Exp.Me d.，178：27-47 |
| TPSYVAFTDTERLIGDA(SEQ ID NO：20) | HLA-DR7 | 人 | 同上 | h | Chicz et al.(1993)，J.Exp.Med.，178：27-47 |
| DAAKNQLTSNPEN(SEQ ID NO：21) | I-Ag7 | 小鼠 | hspa5(79-91) | m | Suri et al.，(2005)，J.Clin.Invest.，115：2268-2276(supl) |
| NPTNTVFDAKRLIGRRFD(SEQ ID NO：22) | HLA-DRB1*1104 | 人 | hspa8(62-79) | h | Verreck et al.(1996)Immunogenetics，43：392-397 |
| QDIKFLPFKVVEKKTKPY(SEQ ID NO：23) | BoLA-DRB3*1201(小鼠种系中) | 牛 | hspa5(111-128) | m | Sharif et al.(2003)Anim.Genet.，34：116-123 |
| LNVLRIINEPTAAAIAYG(SEQ ID NO：24) | HLA-DRB*0401(大鼠种系中) | 人 | hspa8(167-184) | r | Muntasell et al.(2004)J.Immunol.，173：1085-1093 |
| (NVLRIINEPTAAAIAYG)(SEQ ID NO：25) | hspa1a(167-184)hspa11(169-186)hspa2(168-185) | rrr | |||
| NVLRIINEPTAAAIAYG(SEQ ID NO：26) | HLA-DRB1*0401/DRB4*0101 | 人 | hspa8(168-184)hspa1a(168-184)hspa11(170-186)hspa2(169-185)hspa6(170-186) | hhhhh | Dengjel et al.，(2005)，PNAS，102：7922-7927.表1 |
| NVLRIINEPTAAAIA(SEQ ID NO：27) | 多种HLA混合物 | 人 | hspa8(168-184)hspa1a(168-184)hspa11(170-186)hspa2(169-185)hspa6(170-186) | hhhhh | Halder et al.(1997)Cancer Res.，57：3238-3244 |
| NVMRIINEPTAAAIAYG(SEQ ID NO：28) | 多种HLA混合物 | 人 | hspa5(194-210) | h | Halder et al.(1997)Cancer Res.，57：3238-3244 |
| VMRIINEPTAAAIAYG(SEQ ID NO：29) | HLA-DRB1*0401/DRB4*0101 | 人 | hspa5(195-210) | h | Dengjel et al.，(2005)，PNAS，102：7922-7927(supl.tbl 3) |
| IINEPTAAAIAYGLD(SEQ ID NO：30) | HLA-DQ6(B*602) | 人 | hspa8(172-186)hspa2(173-187)hspa11(174-188)hspa1a(172-186)hspa5(198-212) | hhhhh | Sanjeevi et al.(2002)，Ann.N.Y.Acad.Sci.，958：317-320 |
| NRMVNHFIAEFKRK(SEQ ID NO：31) | I-Ek | 小鼠 | hspa8(236-249) | m | Marrack et al.(1993)J.Exp.Med.，178：2173-2183 |
| RMVNHFIAEFKRKH(SEQ ID NO：32) | I-Ek | 小鼠 | hspa8(236-249) | m | Freed et al.(2000)，J.Immunol.，164：4697-4705 |
| VNHFIAEFKRKHKKD(SEQ ID NO：33) | HLA-DR11/w52 | 人 | hspa8(238-252) | h | Newcomb andCresswell(1993)，J.Imm.，150：499-507 |
| XDFYTSITRAXFEE(SEQ ID NO：34) | HLA-DR11/w52 | 人 | hspa8(291-304)hspa1a(291-304)hspa11(293-306)hspa2(294-307)hspa6(294-306) | hhhhh | Newcomb andCresswell(1993)，J.Imm.，150：499-507 |
| EGEDFSETLTRAKFEEL(SEQ ID NO：35) | BoLA-DRB3*1201(小鼠种系中) | 牛 | hspa5(315-331) | m | Sharif et al.(2003)Anim.Genet.，34：116-123 |
| ADLFRGTLDPVEK(SEQ ID NO：36) | HLA-DQ6(B*0604) | 人 | hspa8(307-319) | h | Sanjeevi et al.(2002)，Ann.N.Y.Acad.Sci.，958：317-320 |
| TIPTKQTQTFTTYSDNQP(SEQ ID NO：37) | RT1.Bl | 大鼠 | hspa8(419-436)hspa1a(419-436) | rr | Reisiz et al.(1996)Intern.Immunol.，8：1825-1832 |
| VPTKKSQIFSTASDNQPTVT(SEQ ID NO：38) | HLA-DRB1*0401/DRB4*0101 | 人 | hspa5(443-462) | h | Dengjel et al.，(2005)，PNAS，102：7922-7927(supl.tbl 3) |
| GERAMTKDNNLLG(SEQ ID NO：39) | HLA-DR4Dw4 | 人 | hspa8(445-457)hspa1a(445-457)hspa11(447-459)hspa2(448-460)hspa6(447-459) | hhhhh | Friede et al.(1996)，BBA，1316：85-101 |
| GERAMTKDNNLLGKFE(SEQ ID NO：40) | HLA-DRB1*0401/DRB4*0101 | 人 | hspa8(445-460)hspa1a(445-460) | hh | Dengjel et al.，(2005)，PNAS，102：7922-7927tbl 1 |
| GERAMTKDNNLLGRFE(SEQ ID NO：41) | HLA-DRB1*0401/DRB4*0101 | 人 | hspa6(447-462) | h | Dengjel et al.，(2005)，PNAS，102：7922-7927(supl.tbl 3) |
| ANGILNVSAVDKSTGKE(SEQ ID NO：42) | HLA-DRB*0401 | 人 | hspa8(482-499) | h | Lippolis et al.(2002)，J.Imm.，169：5089-97 |
| GILNVSAVDKSTGK(SEQ ID NO：43) | HLA-DRB*0401 | 人 | hspa8(484-497) | h | Lippolis et al.(2002)，J.Imm.，169：5089-97 |
| GILNVSAVDKSTGKE(SEQ ID NO：44) | HLA-DRB1*0401/DRB4*0101 | 人 | hspa8(484-498) | h | Dengjel et al.，(2005)，PNAS，102：7922-7927tbl 1 |
| CNEIINWLDKNQ(SEQ ID NO：45) | HLA-DR4Dw10 | 人 | hspa8(574-585) | h | Friede et al.(1996)，BBA，1316：85-101 |
| ISWLDKNQTAEKEEFE(SEQ ID NO：46) | HLA-DQ8(NOD中转基因！) | 人 | hspa8(578-593) | m | Suri et al.，(2005)，J.Clin.Invest.，115：2268-2276(suppl) |
| YGSGGPPPTGEEDTSEKDEL(SEQ ID NO：47) | I-Ag7 | 小鼠 | hspa5(636-655) | m | Suri et al.，(2005)，J.Clin.Invest.，115：2268-2276(suppl) |
$：HSP70蛋白的来源物种：m＝小鼠；h＝人；r＝大鼠
用于选择本发明肽的适合HSP70序列列在表2中。这些序列基于表1中具有中或高度保守性的肽。指出了来源物种：“mamm”指哺乳动物，包括人，“酵母”指酿酒酵母(SSA3和SSB2蛋白)，“Mycob”指分枝杆菌属，包括结核分枝杆菌(在对应的区域内麻风分枝杆菌(leprae)和浅黄分枝杆菌(gilvum)是相同的)。来自其它物种和其它HSP70蛋白的对应序列可通过与这些其它物种或蛋白的可获得序列进行比较来容易地鉴定。优选的肽具有至少12、更优选至少13、最优选至少14或甚至15氨基酸、多至至多19、更优选至多18、最优选至多17或甚至16个的来自表2的序列的氨基酸。除了表2的特定序列，本发明还包括这样的肽，其中1、2、3或多至4氨基酸被高度保守的氨基酸替换，或被来自相同组56-72、73-82、83-94、95-105、106-119或120-132的肽的对应氨基酸替换。例如，也包括这样的基于SEQ ID NO：72的肽，其中第二亮氨酸被甲硫氨酸(SEQ 57)、丙氨酸(来自SEQ 62)、谷氨酸(来自SEQ66、69或71)、或赖氨酸(来自SEQ 80)替换，或者第三亮氨酸被异亮氨酸(来自例如SEQ 56)替换。高度保守的氨基组为例如V、L、I和M；R和K；D和E；N和Q；D和N；E和Q；S和T；G和A；F、W和Y；等等。最优选的肽为表2的序列丧失最先的两个氨基酸和/或最后的两个或三个氨基酸的那些。特别优选的为分枝杆菌肽，其具有至多三个、更优选两个或一个如上所述高度保守的置换或替换，或者具有相同(部分的)序列。在基于C1的分枝杆菌肽中，优选至少位置145(V-145)的V和L-153之一是保留的；类似地，对于B1，至少V-344、G-354和V-355之一是保留的；以及对于B2，至少E-31、T-35和V-39(或I或T)是保留的。
表2：基于从II类MHC分子洗脱的HSP70家族成员的保守肽。
序列
SEQ ID NO 1：分枝杆菌HSP70肽“B1”
SEQ ID NO 2：小鼠HSP70同源肽“mB1”
SEQ ID NO 3：分枝杆菌HSP70肽“C1”
SEQ ID NO 4和5：小鼠HSP70同源肽“mC1a”和“mC1b”
SEQ ID NO 6-16：用在实施例中的分枝杆菌HSP70肽
SEQ ID NO 17-47：II类MHC呈递的哺乳动物HSP70肽的列表
SEQ ID NO 48-54：人HSP70蛋白
SEQ ID NO 55：分枝杆菌HSP70蛋白
SEQ ID NO 56-132：保守HSP70区域的优选序列
图例
图1-实施例1的T细胞增殖(HSP70表位作图)
图2-实施例1的细胞因子生成(HSP70表位作图)
图3-a)和b)鼠DSS结肠炎实验时间表
图4至图7-全长分枝杆菌HSP70蛋白对DSS结肠炎的抑制作用(实施例3)；图4(结肠长度-口服组)，图5(重量变化-口服组)，图6(临床状态-口服组)，图7(组织学等级-口服组)。
图8至图11-全长分枝杆菌HSP70蛋白对DSS结肠炎的抑制作用(实施例4)；图8(结肠长度-口服组)，图9(重量变化-口服组)，图10(临床状态-口服组)，图11(组织学等级-口服组)。
图12-鼠科动物DSS结肠炎实验时间表
图13-实施例5的疾病发作
图14-实施例5的最大体重减轻
图15-实施例5的结肠长度数据
图16-实施例5的末端结肠样品的IL10释放
图17-鼠科动物TNBS结肠炎实验时间表
图18-实施例6中对体重的影响
图19-对引流淋巴结细胞(CLN)IL10生成的影响(CD3/CD28再刺激)。
图20-A)、B)和C)实验时间表(3A：全长分枝杆菌HSP70的给药时间表)(3B：肽或肽混合物的给药时间表)(3C：肽混合物的给药时间表)
图21-全长分枝杆菌HSP70蛋白给药后的关节炎评分；*p＜0.05(Mann-Whitney U检验)。
图22-肽C1和mC1a的混合物(称为“C1 mix”)给药后的关节炎评分
图23-肽“B1”给药后的关节炎评分
图24-抗原特异的T细胞增殖测定结果。处死小鼠后，分离脾细胞并在体外用抗原再刺激72小时，随后与3H孵育18小时。计算刺激指数(CPM抗原/CPM培养基刺激细胞)，并按每个体内治疗组描述。CPM＝每分钟的放射性氚记数。
图25-抗原特异的IFN-γ生成
除了抗原特异增殖之外，通过ELISA测量IFN-γ生成。培养72小时后获取体外再刺激的脾细胞的上清液。
图26-抗原特异的IL-10生成
除了抗原特异增殖之外，通过ELISA测量IL-10生成。培养72小时后获取体外再刺激的脾细胞的上清液。
图27-肽C1和mC1a的混合物(称为“C1 mix”)给药后的关节炎评分
图28-实验时间表
图29-肽C1或mC1a治疗后的关节炎评分；
*p＜0.05(Mann-Whitney U检验)
**p＜0.01(Mann-Whitney U检验)
图30-人细胞中的肽特异反应(实施例12)
(A)通过在96小时孵育后测量[3H]掺入而确定分离自健康供者血液的PBMC的肽特异增殖。mC1b诱导了增加的PBMC增殖。结果表示为平均刺激指数(CPM抗原/CPM背景)
(B)在一个JIA患者中，通过细胞内染色和FACS分析来处理肽存在下培养8天后SFMC中IL-10、TNFα和IFNγ的肽特异生成，如材料和方法中描述的。在最后的6小时，添加新鲜培养基、肽和APC。数据表示为来自CD3+CD4+群的阳性细胞百分比。
以下的非限定性实施例描述本发明的抗原性蛋白和肽的保护性和治疗性用途。除非实施例中另有说明，所有的分子技术都根据标准方法进行，如Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition(分子克隆：实验室手册，第三版)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，Ausubel et al.(1994)Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学当前实验方案)的卷1和2，Current Protocols，USA以及Brown(1998)Molecular Biology LabFax，Second Edition的卷I和II，Academic Press(UK)中所述。
实施例
实施例1-包括可与自身HSP70交叉反应的T细胞在内的HSP70特异T
细胞可识别的细菌HSP70肽的作图
来自HSP免疫小鼠的HSP70特异调节性T细胞为调节性T细胞(Treg)的有限来源。除此之外，HSP特异性依赖于免疫并且是可变的。为了得到替代来源以及更精确定义的Hsp特异调节性T细胞群，我们开始HSP70表位作图。
根据之前描述的方法(Wendling et al.(2000)J.Immunol.164：2711-2717)分析经完整分枝杆菌HSP70免疫的Balb/c小鼠的脾细胞(SEQ IDNO：55(腹膜内和皮下给予共100μg，于含有作为佐剂的10mg/ml二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)的200μl PBS中)的T细胞反应，所述T细胞反应针对覆盖整个蛋白的123种重叠15聚体肽的完整组。
以此方式，我们鉴定了13种Hsp70肽，它们或多或少可被Hsp70特异T细胞识别，并且可能参与了Hsp特异的调节性T细胞的激活。
为了更精确地定义表位，基于细菌和同源小鼠Hsp70之间的序列一致性程度，我们将这13种肽分成3个肽池(肽池A：非保守肽，肽池B：与小鼠同源物有至少约80％氨基酸一致性的保守肽，以及肽池C：包括与小鼠同源物＞86％氨基酸一致性的高度保守肽，见下文)，并且用这些肽池以2周的间隔期免疫10-12周龄Balb/c小鼠两次(腹膜内和皮下给药)。在第二次免疫后10天，在体外用所有13种单独肽再刺激启动的脾和引流淋巴结细胞，之后我们测量了T细胞增殖(氚掺入)、IFNγ、IL10、IL4和IL5产生(细胞因子产生)。
我们(在十三种中)鉴定了三种诱导明显反应的肽(参见图1)：三种肽诱导了增加的增殖性T细胞反应和IFNγ(肽A1、B1、C1)，两种肽诱导了增强的IL-10生成(肽A1，C1)。没有肽诱导了可检测的IL4或IL5。
以相应的小鼠同源肽确定交叉反应性。肽B1和C1被发现诱导了针对它们对应的小鼠同源肽的交叉反应性T细胞反应(就增殖和细胞因子生成而言，参见对小鼠同源肽mB1、mC1a、mC1b的反应)。
含有T细胞表位的肽被用于产生肽特异的T细胞系和杂交瘤。这些T细胞系在体外和体内用作Hsp特异调节性T细胞的来源。另外，细胞系和杂交瘤的激活被用于研究抗原呈递细胞的Hsp加工对Hsp肽特异的T细胞激活的影响。肽C1和mC1a用在TNBS结肠炎研究中。
结果显示在图1和图2中，并总结如下：
表3：总结Hsp70表位作图
| 肽 | T细胞增殖反应 | IFN-γ | IL-10 | 细菌启动的T细胞与小鼠同源肽的交叉反应性 |
| A1(SEQ ID NO：6) | + | + | + | 否 |
| B1(SEQ ID NO：1) | + | + | - | 是 |
| C1(SEQ ID NO：3) | ++ | ++ | ++ | 是 |
分枝杆菌肽：
A1＝分枝杆菌hsp70肽(KPFQSVIADTGISVS)-SEQ ID NO：6
B1＝分枝杆菌hsp70肽(DEVVAVGAALQAGVL)-SEQ ID NO：1
C1＝分枝杆菌hsp70(VLRIVNEPTAAALAY)-SEQ ID NO：3
小鼠同源物：
mB1＝小鼠Grp75肽(hspa9a)(DEAVAIGAAIQGGVL)-SEQ ID NO：2
mC1a＝小鼠Grp75(hspa9a)肽(VLRVINEPTAAALAY)-SEQ ID NO：4
mC1b＝小鼠hsp70(hspa1a/hspa8)肽(VLRIINEPTAAAIAY)-SEQ ID NO：5
结论
以上结果显示，保守的HSP70肽，例如B1和C1以及它们的哺乳动物同源物，诱导T细胞反应，并且细菌肽启动的T细胞与哺乳动物(小鼠)中的自身HSP70肽/蛋白交叉反应。还通过对应的小鼠同源肽也诱导了细胞因子生成(IFNγ和IL-10生成)。
实施例2-结肠炎的DSS模型和TNBS模型
结肠炎的DSS模型
至少部分地涉及上皮细胞屏障功能变化的结肠炎模型为通过物理因子硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的结肠炎。该模型经常用于研究潜在治疗剂的效果，因为其容易通过在饮用水中给予DSS而诱导以及因为DSS诱导具有明确起始的持续水平的结肠炎。这种形式结肠炎中的炎症机制至少开始时是激活诸如巨噬细胞的非淋巴细胞并释放促炎细胞因子。上皮屏障功能的变化可在早期(明显炎症之前几天)发现，由此可以为巨噬细胞激活创造条件。
在DSS结肠炎的急性阶段，T细胞反应由极化的Th1反应组成，但是在随后和炎症的更慢性阶段，发生混合的Th1/Th2反应。在后一情况下，DSS引起大量的TNF-α和IL-6的分泌，这是造成疾病中组织破坏的主要原因。所使用的方法改编自Verdu EF et al，Clin.Exp.Immunol.2000，120：46-50。
结肠炎的TNBS模型
可以多种方式实现结肠炎的TNBS模型。用于研究IBD中适应性免疫反应的作用的最佳和最有代表性的变体之一为这里所使用的，其为皮肤致敏，接着以TNBS结肠内灌注的方法(Te Velde AA.et al.，Inflamm.Bowel Dis.2006，12：995-999。我们的方法为对Arita M等人描述的方法(Proc Natl.Acad.Sci.USA.2005，102：7671-6)的修改。
实施例3-全长分枝杆菌HSP70蛋白给药对BALB/c小鼠DSS结肠炎的 抑制作用(Prague研究-第一部分)
这是一个实验的第一部分。由于动物数量限制，该实验分为两个部分。每一部分中每组五只小鼠。
方案
15只常规的雌性Balb/c雌性小鼠(7至9周龄)随机分为4组(每组5只)。为了评估口服治疗的效果，将抗原(全长分枝杆菌HSP70蛋白)与溶解在50μl 0.15M碳酸氢钠中的1mg大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI，Sigma)一起给药，以一周的间隔期填喂4次。一周后，小鼠在它们的饮用水中接受3％硫酸葡聚糖钠(DSS)，持续多达7天。在35天时，通过临床活动性评分、结肠长度和组织学评分评估结肠炎。
关于实验时间表，参见图3(时间表A)。
组A1(PBS+DSS)：
治疗方式：100μl的无菌PBS/SBTI，胃内给药(对照组)
组B1(HSP60+DSS)：
治疗方式：100μl无菌PBS/SBTI(1∶1)中HSP6030μg/小鼠，胃内给药
组C1(HSP70+DSS)：
治疗方式：100μl无菌PBS/SBTI(1∶1)中HSP7030μg/小鼠，胃内给药
结果
结果显示在下表和图4(结肠长度)、图5(重量变化)、图6(临床状态)和图7(组织学级别)中。
结肠长度：
统计学总结
| 数目 | 均值 | 方差 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 范围 | |
| PBS | 5 | 6.16 | 0.113 | 0.336155 | 5,6 | 6,5 | 0,9 |
| HSP60 | 5 | 6.82 | 0.092 | 0.303315 | 6,4 | 6,6 | 0,6 |
| HSP70 | 5 | 6.36 | 0.083 | 0.288097 | 6,0 | 7,1 | 0,7 |
| 总计 | 15 | 6.45 | 0.164 | 0.405087 | 5,6 | 7,1 | 1,5 |
多重范围检验
| 对比 | 差异 | P值 | CI 95％ |
| PBS-HSP70 | -0,2 | 0.3420 | -0.656567至0.256567 |
| PBS-HSP60 | *-0,66 | 0.0115 | -1.12693至-0.193069 |
| HSP70-HSP60 | *-0,46 | 0.0394 | -0.891415至-0.0285851 |
*表示统计学显著差异。(p＜0,05)
重量变化
统计学总结
| 数目 | 均值 | 方差 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 范围 | |
| PBS | 5 | -8.56 | 8.308 | 2.88236 | -12.5 | -5.5 | 7.0 |
| HSP60 | 5 | -6.38 | 5.302 | 2.30261 | -8.6 | -2.7 | 5.9 |
| HSP70 | 5 | -2.04 | 6.743 | 2.59673 | -5.8 | 1.1 | 6.9 |
| 总计 | 15 | -5.66 | 13.684 | 3.69919 | -12.5 | 1.1 | 13.6 |
多重范围检验
| 对比 | 差异 | P值 | CI 95％ |
| PBS-HSP70 | *-6.52 | 0.0056 | -10.5209至-2.51909 |
| PBS-HSP60 | -2.18 | 0.2229 | -5.98457至1.62457 |
| HSP70-HSP60 | *4.34 | 0.0233 | 0.760853至7.91915 |
*表示统计学显著差异。(p＜0,05)
临床状态：
总评分通过每一参数的评分相加后除以3来计算。
*Cooper et al.：Clinicopathologic study of dextran sulfate sodiumexperimental murine colitis(硫酸葡聚糖钠实验性鼠结肠炎的临床病理性研究).Lab Invest 69：238-249，1993，和Hermann et al.：Specific Type IVPhosphodiesterase Inhibitor Rolipram Mitigates Experimental Colitis in Mice(特异的IV型磷酸二酯酶抑制剂Rolipram缓解小鼠中实验性结肠炎)JPET292：22-30，2000
统计学总结
| 数目 | 均值 | 方差 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 范围 | |
| PBS | 5 | 3.4666 | 0.0334668 | 0.182939 | 3.333 | 3.667 | 0.334 |
| HSP60 | 5 | 1.8666 | 0.977422 | 0.988647 | 0.667 | 3.333 | 2.666 |
| HSP70 | 5 | 2.1334 | 1.19987 | 1.09538 | 0.667 | 3.333 | 2.666 |
| 总计 | 15 | 2.4889 | 1.15648 | 1.0754 | 0.667 | 3.667 | 3.0 |
多重范围检验
| 对比 | 差异 | P值 | CI 95％ |
| PBS-HSP70 | *1.3332 | 0.0277 | 0.187908至2.47849 |
| PBS-HSP60 | *1.6 | 0.0074 | 0.563121至2.63688 |
| HSP70-HSP60 | 0.4 | 0.6966 | -1.78852至1.25492 |
*表示统计学显著差异。(p＜0.05)
组织学级别
统计学总结
| 数目 | 均值 | 方差 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 范围 | |
| PBS | 5 | 2.15 | 0.167187 | 0.408886 | 1.75 | 2.75 | 1.0 |
| HSP60 | 5 | 1.4 | 0.128125 | 0.357946 | 1.0 | 1.875 | 0.875 |
| HSP70 | 5 | 1.4 | 0.245312 | 0.49529 | 1.0 | 2.0 | 1.0 |
| 总计 | 20 | 1.65 | 0.288393 | 0.537022 | 1.0 | 2.75 | 1.75 |
多重范围检验
| 对比 | 差异 | P值 | CI 95％ |
| PBS-HSP70 | *0.75 | 0.0150 | 0.189576至1.31042 |
| PBS-HSP60 | *0.75 | 0.0311 | 0.0876491至1.41235 |
| HSP70-HSP60 | 0.0 | 1.0000 | -0.63021至0.63021 |
*表示统计学显著差异。(p＜0,05)
结论
以上结果显示，当预防性地(疾病诱导之前)口服给药时，全长HSP70蛋白对结肠炎具有抑制作用。
实施例4-全长分枝杆菌HSP70对BALB/c小鼠DSS结肠炎的抑制作用 (Prague研究-第二部分)
这些结果仅涉及实验的第二部分(第一部分参见实施例3)。这部分每组有5只小鼠。
方案
15只常规的雌性Balb/c雌性小鼠(7至9周龄)随机分为4组(每组5只)。为了评估口服治疗的效果，将抗原(全长分枝杆菌HSP70蛋白)与溶解在50μl 0.15M碳酸氢钠中的1mg大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI，Sigma)一起给药，以一周的间隔期填喂4次。一周后，小鼠在它们的饮用水中接受3％硫酸葡聚糖钠(DSS)，持续多达8天。在36天时通过临床活动性评分、结肠长度和组织学评分评估结肠炎。
对于实验时间表，参见图3，时间表B。
组
组A2(PBS+DSS)：
治疗方式：100μl的无菌PBS/SBTI，胃内给药(对照)
组B2(HSP60+DSS)：
治疗方式：100μl无菌PBS/SBTI(1∶1)中HSP6030μg/小鼠，胃内给药
组C1(HSP70+DSS)：
治疗方式：100μl无菌PBS/SBTI(1∶1)中HSP7030μg/小鼠，胃内给药
结果
结果显示如下，以及显示在图8(结肠长度)、图9(重量变化)、图10(临床状态)和图11(组织学级别)中。
结肠长度：
与PBS相比，当口服给药时HSP70防止了结肠缩短。
统计总结
| 数目 | 均值 | 方差 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 范围 | |
| PBS | 5 | 6.28 | 0.267 | 0.51672 | 5.6 | 7.0 | 1.4 |
| HSP70 | 5 | 7.3 | 0.105 | 0.324037 | 6.9 | 7.6 | 0.7 |
| HSP60 | 5 | 7.16 | 0.183 | 0.427785 | 6.5 | 7.6 | 1.1 |
| 总计 | 15 | 6.91 | 0.377 | 0.613964 | 5.6 | 7.6 | 2.0 |
多重范围实验
| 对比 | 差异 | P值 | CI 95％ |
| PBS-HSP70 | *-1.02 | 0.00570944 | -1.649至-0.391004 |
| PBS-HSP60 | *-0.88 | 0.0189015 | -1.5718至-0.188197 |
| HSP70-HSP60 | 0.14 | 0.57574 | -0.693442至0.413442 |
*表示统计学显著差异。(p＜0,05)
重量变化：
统计总结
| 数目 | 均值 | 方差 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 范围 | |
| PBS | 5 | -4.88 | 13.427 | 3.66429 | -9.9 | 0.0 | 9.9 |
| HSP60 | 5 | -0.26 | 4.058 | 2.01445 | -2.8 | 1.8 | 4.6 |
| HSP70 | 5 | -0.44 | 14.473 | 3.80434 | -6.4 | 3.9 | 10.3 |
| 总计 | 15 | -1.86 | 14.0226 | 3.74467 | -9.9 | 3.9 | 13.8 |
多重范围试验
| 对比 | 差异 | P值 | CI 95％ |
| PBS-HSP70 | *-4.62 | 0.0386771 | -8.9323至-0.3077 |
| PBS-HSP60 | -4.44 | 0.0969649 | -9.88726至1.00726 |
| HSP70-HSP60 | 0.18 | 0.927806 | -4.61941至4.25941 |
*表示统计学显著差异。(p＜0.05)
组织学级别：
统计总结
| 数目 | 均值 | 方差 | 标准差 | 最小值 | 最大值 | 范围 | |
| PBS | 5 | 1.575 | 0.325 | 0.570088 | 1.0 | 2.25 | 1.25 |
| HSP60 | 5 | 1.225 | 0.316 | 0.561805 | 0.5 | 2.0 | 1.5 |
| HSP70 | 5 | 1.225 | 0.316 | 0.561805 | 0.5 | 2.0 | 1.5 |
| 总计 | 15 | 1.342 | 0.302 | 0.549892 | 0.5 | 2.25 | 1.75 |
多重范围试验
| 对比 | 差异 | P值 | CI 95％ |
| PBS-HSP70 | 0.35 | 0.356811 | -0.475426至1.17543 |
| PBS-HSP60 | 0.35 | 0.356811 | -0.475426至1.17543 |
| HSP70-HSP60 | 0.0 | 1.0 | -0.819364至0.819364 |
结论
与PBS相比，分枝杆菌HSP70蛋白的给药显著减轻结肠炎的症状(对于结肠长度、重量减轻和临床状态分别为p＝0.0057、0.0387和0.0831)。结果类似于在实验的第一部分期间获得的结果(见实施例3)。
实施例3和4合起来
在口服治疗的BALB/c小鼠中评估急性硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的结肠炎。值表示为均值±标准差。
a大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)，1mg/每剂，溶解在50μl的0.15摩尔/升碳酸氢钠缓冲液中(pH 8.0)。
*与对照组的值有显著差异(P＜0.05)，通过Student’s t检验计算。
**与对照组的值有显著差异(P＜0.01)，通过Student’s t检验计算。
实施例5全长分枝杆菌HSP70蛋白对在BALB/c小鼠中诱导DSS结
肠炎的抑制作用(Utrecht研究)
图12显示了研究设计。载体指PBS。
治疗：
组A：100μl PBS(对照)
组B：100μl PBS中的30μg分枝杆菌HSP70蛋白[SEQ ID NO：55]
实验开始时，以7周龄的雌性BALB/c小鼠进行这项研究。小鼠组(n＝10)以100μl PBS中的30μg HSP70(Mt hsp70；批号031205；2.1内毒素单位/mg)或载体(100μl PBS)处理4次(第7、9、11、14天)，通过口腔饲喂给药。饲喂前10分钟，动物接受含有2mg大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)的0.15M碳酸氢钠，pH 8.0。通过在7天内给予补加了3％DSS的饮用水来诱导结肠炎。
通过确定体重和粪便粘稠度来跟踪疾病发作，得到如下表中阐释的临床状态。
解剖时记录结肠长度
纵向切割结肠，分为几个部分来确定：
-福尔马林固定的石蜡切片上的组织学
-匀浆液中的MPO活性(指示中性白细胞渗入)
-来自末端结肠样品的离体细胞因子释放(TNFα，IL10)。
通过将每个参数的评分相加后除以3来计算总评分。
图13显示了疾病进展。以HSP70蛋白预处理导致降低的疾病严重性。疾病发作基于按上文描述计算的临床评分。
临床评分的确定
图14显示了体重减轻。HSP70处理导致结肠炎诱导造成的体重减轻显著减小。最大体重减轻在36天时确定。
图15显示结肠长度。在以HSP70蛋白预处理时结肠长度较少减小。结肠炎症通常导致减小的结肠长度。
图16显示HSP70处理增加了(白介素10)IL10的释放。将远端结肠样品孵育24小时，并采用特异ELISA测量上清液中的IL10含量。健康BALB/c小鼠中从远端结肠样品释放的IL10为450±328pg/g结肠。
结果总结
统计学：非参数Kruskal Wallis检验，接着是Mann-Whitney事后检验(单尾)。
实施例6-全长分枝杆菌HSP70蛋白、或分枝杆菌和小鼠HSP70肽同源
物在BALB/c小鼠TNBS结肠炎中的抑制作用
目的：研究HSP70蛋白或肽预处理是否导致减弱的TNBS诱导结肠炎。
研究概述：
在疾病诱导之前，以全长HSP70[SEQ ID NO：55]或HSP70肽(显示在SEQ ID NO：3中的分枝杆菌HSP70衍生肽“C1”和SEQ ID NO：4的小鼠同源肽“mC1a”)胃内或鼻内给药治疗雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver-Germany)(实验开始时10-12周龄)。在4周期间，小鼠接受4×30μg HSP70胃内给药。通过在口服HSP70给药前10分钟给予大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)来中和胃内容物。
鼻内治疗以4×30μg HSP70或4×(与33μg肽mC1a(＝小鼠Grp75(hspa9)肽216-230，VLRVINEPTAAALAY)混合的67μg肽C1(结核分枝杆菌HSP70肽141-155，VLRIVNEPTAAALAY))在一周内进行。
然后，通过以下方式致敏小鼠：以含有1mg TNBS的100μl 50％乙醇涂抹去毛的腹部连续两天，在6天后以含有1mg TNBS的100μl 40％乙醇直肠攻毒(challenge)。3天后解剖小鼠，基于结肠长度、重量和形态学确定直肠炎症。另外，还确定直肠和引流的尾部淋巴结(CLN)的细胞因子生成。
治疗组(n＝10)：
A.口服PBS，致敏TNBS，攻毒TNBS(对照组)
B.口服(全长)HSP70，致敏TNBS，攻毒TNBS(口服组)
C.鼻内(全长)HSP70，致敏TNBS，攻毒TNBS(鼻内组)
D.鼻内肽，致敏TNBS，攻毒TNBS(肽组，C1和mC1a)
实验设计显示在图17中。
结果
体重的结果显示在图18中，IL10生成显示在图19中。
结论
以上结果显示，全长HSP70蛋白(无论是口服还是鼻内给予)以及HSP70肽的组合(鼻内给予)均对TNBS诱导的结肠炎有预防性地(疾病诱导之前)抑制作用。口服给予全长HSP70的抑制作用与尾部淋巴结内升高的IL-10反应相关。
实施例7-蛋白聚糖诱导的关节炎模型
蛋白聚糖诱导的关节炎模型(PGIA)为类风湿性关节炎的鼠科动物模型，并描述为T细胞依赖的和抗体介导的模型。在该模型中，通过两次注射位于合成的佐剂二甲基二十八烷基铵(DDA)中的人蛋白聚糖(hPG)而诱导关节炎，参见Hanyecz A.et al.，Achievement of a synergistic adjuvanteffect on arthritis induction by activation of innate immunity and forcing theimmune response toward the Th1 phenotype(通过激活先天免疫并迫使免疫反应朝向Th1表型而实现对关节炎诱导的协同佐剂效应).ArthritisRheum.200450(5)：1665-76。
因为是通过合成的佐剂而不是完全弗氏佐剂(CFA)进行免疫来诱导关节炎，所以可排除存在于CFA中的微生物Hsp诱导的干扰免疫反应的影响。由于人和小鼠(自身)PG之间的交叉反应，出现了慢性和复发的关节炎。发病后，关节炎严重性通过临床评估关节的粗细、发红和变形来评分，每只爪1-4分。
实施例8-分枝杆菌全长HSP70蛋白对蛋白聚糖诱导的关节炎的抑制作
用
方案
将10只雌性Balb/c小鼠(从Charles River获得的退出种鼠(retiredbreeder))随机分为两组。为了评估分枝杆菌HSP70(SEQ ID NO：55)鼻内治疗对PGIA的影响，在疾病诱导之前的第-7、-5和-3天时，给予含有30μg Hsp70的10μl PBS。通过两次i.p.注射含有400μg hPG和2mgDDA的200μl PBS来诱导PGIA。通过如实施例7中所述的临床评估来评价随后出现的关节炎的评分。
实验时间表显示在图20A中。
组A：(PBS)：
以10μl PBS鼻内治疗(3×)
组B(Hsp70)：
以含有30μg Hsp70的10μl PBS鼻内治疗(3×)
结果显示在图21中。
结果证实了之前的研究，显示全长HSP70可抑制关节炎发病。
实施例9-HSP70衍生肽对蛋白聚糖诱导的关节炎的抑制作用(第一实验)
方案
将15只雌性Balb/c小鼠(从Charles River获得的退出种鼠)随机分为3组(每组5只小鼠)。为了评估以Hsp70衍生肽“B1”(SEQ ID NO：1)和C1(SEQ ID NO：3)与mC1a(SEQ ID NO：4)的混合物(本文称为“C1mix”)进行的鼻内治疗对PGIA的影响，在疾病诱导之前的第-7、-5和-3天时，给予含有100μg肽的10μl PBS。将卵清蛋白肽323-339(pOva)用作对照肽。通过两次i.p.注射含有400μg hPG和2mg DDA的200μl PBS来诱导PGIA。通过临床评估来评价随后出现的关节炎的评分。
实验时间表显示在图20B中。
组A：(pOva)：
以含有100μg pOva的10μl PBS鼻内治疗(3×)
组B(B1)：
以含有100μg B1的10μl PBS鼻内治疗(3×)
组C(C1)：
以含有100μg的C1mix混合物的10μl PBS鼻内治疗(3×)
关节炎评分结果显示在图22，图23中。
处死小鼠后，分离出脾细胞，在体外用抗原再刺激72小时，接着与3H一起孵育18小时。计算刺激指数(CPM抗原/CPM培养基刺激细胞)，并按每一体内治疗组描述(参见图24)。
除了抗原特异增殖，IFN-γ和IL10生成通过ELISA测量。培养72小时后获取体外再刺激的脾细胞的上清液(参见图25和图26)。
结果显示，C1mix和B1肽的治疗都导致疾病严重性的降低。肽的鼻内给药也诱导了针对这些肽的特异和交叉反应性T细胞反应(增殖、IFN-γ和IL10生成)。
实施例10-HSP70衍生肽对蛋白聚糖诱导的关节炎的抑制作用(第二实验)
将12只雌性Balb/c小鼠(从Charles River获得的退出种鼠)随机分为2组(每组6只小鼠)。为了评估以Hsp70衍生的mC1a进行的鼻内治疗对PGIA的影响，在疾病诱导之前的第-14、-11、-7和-4天时，给予含有100μg肽的10μl PBS。将卵清蛋白肽(pOva)用作对照肽。通过两次i.p.注射含有400μg hPG和2mg DDA的200μl PBS来诱导PGIA。通过临床评估来评价随后出现的关节炎的评分。
实验时间表显示在图20C中。
组A：(pOva)：
以含有100μg pOva的10μl PBS鼻内治疗(4×)
组B(mC1a)：
以含有100μg mC1a的10μl PBS鼻内治疗(4×)
结果显示在图27。
结果显示，肽mC1a的给药抑制了疾病活性。
实施例11-HSP70衍生肽对蛋白聚糖诱导的关节炎(PGIA)的抑制作用
将18只雌性Balb/c小鼠(从Charles River获得的退出种鼠)随机分为3组(每组6只小鼠)。为了评估以Hsp70衍生肽C1和其小鼠同源物mC1a进行的鼻内(i.n.)治疗对PGIA的影响，在疾病诱导前的第-7、-5和-3天时，给予含有100μg肽的10μl PBS(见图28)。将卵清蛋白肽(pOva)用作对照肽。通过两次i.p.注射含有300μg hPG和2mg DDA的200μl PBS来诱导PGIA。通过临床评估来评价随后出现的关节炎的评分。
组A：(pOva)：以含有100μg pOva的10μl PBS鼻内治疗
组B(C1)：以含有100μg C1的10μl PBS鼻内治疗
组C(mC1a)：以含有100μg mC1的10μl PBS鼻内治疗
结果显示在图29中。结果显示单独的肽C1和mC1a的鼻内给药导致疾病活性的显著降低。
实施例12-人PBMC和SFMC中的肽特异反应。
在从健康对照的血液或JIA和RA患者的滑液获得的单核细胞中研究肽特异反应。患者在乌得勒支大学医学中心的风湿病学和临床免疫学以及儿科学的门诊部(Utrecht，The Netherlands)就诊。RA患者满足美国风湿病学协会RA标准的诊断标准(参考文献)。通过肝素化血液或滑液的ficoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)密度梯度离心分离细胞，并在圆底96孔板的补加了2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和链霉素(GibcoBRL，Gaithersburg，MD USA)以及10％AB阳性热灭活人血清(SanquinBlood Bank，Utrecht，the Netherlands)的RPMI 1640中培养，每孔200μl，含2*105细胞。以20μg/ml的肽在37℃、5％CO2和100％相对湿度下刺激培养物96小时，一式三份。为了确定PBMC的肽特异增殖，在最后16小时，向每孔添加1μC1(37kBq)[3H]-胸苷，并测量掺入。数据表示为刺激指数，通过与肽一起培养的细胞的平均CPM除以没有肽时培养的细胞的平均CPM来计算。
SFMC的肽特异反应通过细胞内染色和FACS分析来测量。因此，如同为PBMC所描述的，细胞在肽存在下培养。96小时后，100μl的培养基以新鲜培养基替换，并加入40IU/ml IL-2。第8天时，离心沉淀细胞，吸取培养基，并添加含有相同供体的新近经射线处理的APC(7.5*105，以3500rad射线处理)的200μl新培养基。在存在或不存在肽并添加共刺激mAb CD28和CD49(各0.5μg/ml)情况下于37℃培养细胞6小时。在最后4小时，添加Golgistop(BD Biosciences)。洗涤收集的细胞，按以前的描述(参考文献)，以抗CD3-多甲藻叶绿素蛋白复合物(PerCP)、抗CD4-别藻蓝蛋白(APC)和抗CD69-异硫氰酸荧光素(FITC)对其表面染色并随后在Cytofix/cytoperm溶液(BD Biosciences)中固定，接着以针对IL-10、IFNγ或TNFα的藻红蛋白(PE)偶联mAb细胞内染色。所有抗体都从Becton Dickinson获得。数据表示为CD3+CD4+群的阳性细胞百分比。
结果人PBMC和SFMC中(m)C1肽特异反应
人体内，HSP特异T细胞反应被报道与恶性疾病形式相关。另外，识别Hsp60的CD4+T细胞出现在发炎的关节内。Hsp特异T细胞向炎症部位的迁移很可能对于它们恰当发挥功能是重要的。在C1区域，mC1a和mC1b肽基本上与人肽相同。出于这个原因，研究了人体内的(m)C1特异T细胞反应。首先，从健康对照分离PBMC，并通过[3H]胸苷掺入来测量肽特异增殖。与A5对照肽相比，以mC1b肽刺激显著增加增殖，证实该肽存在于人HLA上且可被人T细胞识别。其次，为了测试(m)C1肽是否可在炎性条件下在关节内被局部识别，分离了滑液单核细胞(SFMC)并如材料和方法中所述，用肽刺激。第8天时，添加含有肽和新近射线处理的APC的培养基再刺激6小时，接着通过细胞内染色和FACS分析来分析肽诱导的IL-10、IFNγ和TNFα生成。与在健康对照中获得的增殖数据一致，mC1b刺激增加了IL-10、IFNγ和TNFα的生成以及CD69在CD3+CD4+群中的表面表达。另外，C1肽刺激增加了CD69和细胞因子表达。与此相反，如所预料的，对照A5不诱导肽特异反应。总体而言，这证实C1且特别是mC1b肽在健康对照和在发炎关节内都可被人T细胞所识别，由此支持了在人体内使用所述肽的可能性。
结果显示在图30中。
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<213>结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400>1
Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>2
Asp Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Leu
1 5 10 15
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>3
Val Leu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr
1 5 10 15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>4
Val Leu Arg Val Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr
1 5 10 15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>5
Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr
1 5 10 15
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>6
Lys Pro Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val Ser
1 5 10 15
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>7
Tyr Thr Ala Pro Glu Ile Ser Ala Arg Ile Leu Met Lys Leu Lys
1 5 10 15
<210>8
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>8
Ala Glu Gly Gly Ser Lys Val Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val
1 5 10 15
<210>9
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>9
Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr Gly Ala Ala His Pro Gly Gly
1 5 10 15
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>10
Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn
1 5 10 15
<210>11
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>11
Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu Leu
1 5 10 15
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>12
Gly Gly Lys Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val
1 5 10 15
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>13
Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly
1 5 10 15
<210>14
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>14
Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu
1 5 10 15
<210>15
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>15
Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn
1 5 10 15
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>16
Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His
1 5 10 15
<210>17
<211>14
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>17
Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr
1 5 10
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>18
Ile Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu
1 5 10 15
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu Arg Leu Ile Gly
1 5 10 15
<210>20
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp
1 5 10 15
Ala
<210>21
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>21
Asp Ala Ala Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn
1 5 10
<210>22
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Asn Pro Thr Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg
1 5 10 15
Phe Asp
<210>23
<211>18
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>23
Gln Asp Ile Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys
1 5 10 15
Pro Tyr
<210>24
<211>18
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>24
Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
1 5 10 15
Tyr Gly
<210>25
<211>17
<212>PRT
<213>褐家鼠
<400>25
Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr
1 5 10 15
Gly
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr
1 5 10 15
Gly
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>27
Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
1 5 10 15
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr
1 5 10 15
Gly
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly
1 5 10 15
<210>30
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>30
Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp
1 5 10 15
<210>31
<211>14
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>31
Asn Arg Met Val Asn His Phe Ile Ala Glu Phe Lys Arg Lys
1 5 10
<210>32
<211>14
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>32
Arg Met Val Asn His Phe Ile Ala Glu Phe Lys Arg Lys His
1 5 10
<210>33
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Val Asn His Phe Ile Ala Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp
1 5 10 15
<210>34
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>34
Xaa Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Xaa Phe Glu Glu
1 5 10
<210>35
<211>17
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>35
Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu
1 5 10 15
Leu
<210>36
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>36
Ala Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Asp Pro Val Glu Lys
1 5 10
<210>37
<211>18
<212>PRT
<213>黒鼠(Rattus rattus)
<400>37
Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro
<210>38
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln
1 5 10 15
Pro Thr Val Thr
20
<210>39
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Gly Glu Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly
1 5 10
<210>40
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Gly Glu Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu
1 5 10 15
<210>41
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>41
Gly Glu Arg Ala MetThr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu
1 5 10 15
<210>42
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys
1 5 10 15
Glu
<210>43
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys
1 5 10
<210>44
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>44
Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Glu
1 5 10 15
<210>45
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>45
Cys Asn Glu Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Asn Gln
1 5 10
<210>46
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>46
Ile Ser Trp Leu Asp Lys Asn Gln Thr Ala Glu Lys Glu Glu Phe Glu
1 5 10 15
<210>47
<211>20
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>47
Tyr Gly Ser Gly Gly Pro Pro Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ser Glu
1 5 10 15
Lys Asp Glu Leu
20
<210>48
<211>641
<212>PRT
<213>智人
<400>48
Met Ala Lys Ala Ala Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser
1 5 10 15
Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp
20 25 30
Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu
35 40 45
Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Leu Asn Pro Gln
50 55 60
Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Gly Asp
65 70 75 80
Pro Val Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Gln Val Ile Asn
85 90 95
Asp Gly Asp Lys Pro Lys Val Gln Val Ser Tyr Lys Gly Glu Thr Lys
100 105 110
Ala Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys
115 120 125
Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Tyr Pro Val Thr Asn Ala Val Ile
130 135 140
Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp
145 150 155 160
Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro
165 170 175
Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Arg Thr Gly Lys Gly Glu
180 185 190
Arg Asn Val LeuIle Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser
195 200 205
Ile Leu Thr Ile Asp Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly
210 215 220
Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn His
225 230 235 240
Phe Val Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser Gln Asn
245 250 255
Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp Ser Leu Phe
275 280 285
Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu
290 295 300
Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Glu Pro Val Glu Lys Ala
305 310 315 320
Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ala Gln Ile His Asp Leu Val Leu
325 330 335
Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Leu Gln Asp
340 345 350
Phe Phe Asn Gly Arg Asp Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala
355 360 365
Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Met Gly Asp Lys
370 375 380
Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro Leu Ser
385 390 395 400
Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Ala Leu Ile Lys Arg
405 410 415
Asn Ser Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Ile Phe Thr Thr Tyr Ser
420 425 430
Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala
435 440 445
Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Ser Gly Ile
450 455 460
Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile
465 470 475 480
Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Thr Asp Lys Ser Thr Gly
485 490 495
Lys Ala Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys
500 505 510
Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Ala Glu
515 520 525
Asp Glu Val Gln Arg Glu Arg Val Ser Ala Lys Asn Ala Leu Glu Ser
530 535 540
Tyr Ala Phe Asn Met Lys Ser Ala Val Glu Asp Glu Gly Leu Lys Gly
545 550 555 560
Lys Ile Ser Glu Ala Asp Lys Lys Lys Val Leu Asp Lys Cys Gln Glu
565 570 575
Val Ile Ser Trp Leu Asp Ala Asn Thr Leu Ala Glu Lys Asp Glu Phe
580 585 590
Glu His Lys Arg Lys Glu Leu Glu Gln Val Cys Asn Pro Ile Ile Ser
595 600 605
Gly Leu Tyr Gln Gly Ala Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Phe Gly Ala
610 615 620
Gln Gly Pro Lys Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val
625 630 635 640
Asp
<210>49
<211>641
<212>PRT
<213>智人
<400>49
Met Ala Thr Ala Lys GlyIle Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr
1 5 10 15
Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala
20 25 30
Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp
35 40 45
Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Met Asn
50 55 60
Pro Gln Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe
65 70 75 80
Asn Asp Pro Val Val Gln Ala Asp Met Lys Leu Trp Pro Phe Gln Val
85 90 95
Ile Asn Glu Gly Gly Lys Pro Lys Val Leu Val Ser Tyr Lys Gly Glu
100 105 110
Asn Lys Ala Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys
115 120 125
Leu Lys Glu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Gly His Pro Val Thr Asn Ala
130 135 140
Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr
145 150 155 160
Lys Asp Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn
165 170 175
Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Gly Gln
180 185 190
Gly Glu Arg His Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp
195 200 205
Val Ser Ile Leu Thr Ile Asp Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr
210 215 220
Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val
225 230 235 240
Ser His Phe Val Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser
245 250 255
Gln Asn Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala
260 265 270
Lys Arg Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Asn Leu Glu Ile Asp Ser
275 280 285
Leu Tyr Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe
290 295 300
Glu Glu Leu Cys Ala Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Glu Pro Val Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Arg Asp Ala Lys Met Asp Lys Ala Lys Ile His Asp Ile
325 330 335
Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Arg Leu Leu
340 345 350
Gln Asp Tyr Phe Asn Gly Arg Asp Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp
355 360 365
Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Met Gly
370 375 380
Asp Lys Ser Glu Lys Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro
385 390 395 400
Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Ala Leu Ile
405 410 415
Lys Arg Asn Ser Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Ile Phe Thr Thr
420 425 430
Tyr Ser Asp Asn Gln Pro Gly Val LeuI le Gln Val Tyr Glu Gly Glu
435 440 445
Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Asp Leu Thr
450 455 460
Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe
465 470 475 480
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Thr Asp Lys Ser
485 490 495
Thr Gly Lys Val Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu
500 505 510
Ser Lys Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Leu Asp Ala Glu Lys Tyr Lys
515 520 525
Ala Glu Asp Glu Val Gln Arg Glu Lys Ile Ala Ala Lys Asn Ala Leu
530 535 540
Glu Ser Tyr Ala Phe Asn Met Lys Ser Val Val Ser Asp Glu Gly Leu
545 550 555 560
Lys Gly Lys Ile Ser Glu Ser Asp Lys Asn Lys Ile Leu Asp Lys Cys
565 570 575
Asn Glu Leu Leu Ser Trp Leu Glu Val Asn Gln Leu Ala Glu Lys Asp
580 585 590
Glu Phe Asp His Lys Arg Lys Glu Leu Glu Gln Met Cys Asn Pro Ile
595 600 605
Ile Thr Lys Leu Tyr Gln Gly Gly Cys Thr Gly Pro Ala Cys Gly Thr
610 615 620
Gly Tyr Val Pro Gly Arg Pro Ala Thr Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val
625 630 635 640
Asp
<210>50
<211>639
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Met Ser Ala Arg Gly Pro Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr
1 5 10 15
Ser Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn
20 25 30
Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr
35 40 45
Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Met Asn Pro
50 55 60
Thr Asn Thr Ile Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Glu
65 70 75 80
Asp Ala Thr Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Arg Val Val
85 90 95
Ser Glu Gly Gly Lys Pro Lys Val Gln Val Glu Tyr Lys Gly Glu Thr
100 105 110
Lys Thr Phe Phe Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met
115 120 125
Lys Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Gly Lys Val His Ser Ala Val
130 135 140
Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys
145 150 155 160
Asp Ala Gly Thr Ile Thr Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu
165 170 175
Pro Thr Ala Ala Al aIle Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Lys Gly Cys Ala
180 185 190
Gly Gly Glu Lys Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe
195 200 205
Asp Val Ser Ile Leu Thr Ile Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ser
210 215 220
Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Met
225 230 235 240
Val Ser His Leu Ala Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile
245 250 255
Gly Pro Asn Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg
260 265 270
Ala Lys Arg Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Ile Glu Ile Asp
275 280 285
Ser Leu Tyr Glu Gly Val Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg
290 295 300
Phe Glu Glu Leu Asn Ala Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Glu Pro Val
305 310 315 320
Glu Lys Ala Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Gly Gln Ile Gln Glu
325 330 335
Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Lys Leu
340 345 350
Leu Gln Asp Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro
355 360 365
Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Ile
370 375 380
Gly Asp Lys Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Thr
385 390 395 400
Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Pro Leu
405 410 415
Ile Lys Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr
420 425 430
Thr Tyr Ser Asp Asn Gln Ser Ser Val Leu Val Gln Val Tyr Glu Gly
435 440 445
Glu Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Asp Leu
450 455 460
Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr
465 470 475 480
Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Ala Asp Lys
485 490 495
Ser Thr Gly Lys Glu Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg
500 505 510
Leu Ser Lys Asp Asp Ile Asp Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Arg Tyr
515 520 525
Lys Ser Glu Asp Glu Ala Asn Arg Asp Arg Val Ala Ala Lys Asn Ala
530 535 540
Leu Glu Ser Tyr Thr Tyr Asn Ile Lys Gln Thr Val Glu Asp Glu Lys
545 550 555 560
Leu Arg Gly Lys Ile Ser Glu Gln Asp Lys Asn Lys Ile Leu Asp Lys
565 570 575
Cys Gln Glu Val Ile Asn Trp Leu Asp Arg Asn Gln Met Ala Glu Lys
580 585 590
Asp Glu Tyr Glu His Lys Gln Lys Glu Leu Glu Arg Val Cys Asn Pro
595 600 605
Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gln Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly
610 615 620
Gly Gly Ser Gly Ala Ser Gly Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val Asp
625 630 635
<210>51
<211>654
<212>PRT
<213>智人
<400>51
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala
1 5 10 15
Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly
20 25 30
Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly
35 40 45
Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser
50 55 60
Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala
65 70 75 80
Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys
85 90 95
Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile
100 105 110
Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile
115 120 125
Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu
130 135 140
Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr
145 150 155 160
Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe
165 170 175
Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly
180 185 190
Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
195 200 205
Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp
210 215 220
Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly
225 230 235 240
Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu
245 250 255
Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys
260 265 270
Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu
275 280 285
Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln
290 295 300
Ala Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu
305 310 315 320
Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg
325 330 335
Ser Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys
340 345 350
Lys Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile
355 360 365
Pro Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro
370 375 380
Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val
385 390 395 400
Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu
405 410 415
Leu Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val
420 425 430
Met Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser
435 440 445
Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys
450 455 460
Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly
465 470 475 480
Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln
485 490 495
Ile Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr
500 505 510
Ala Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn
515 520 525
Asp Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp
530 535 540
Ala Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp
545 550 555 560
Thr Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile
565 570 575
Gly Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu
580 585 590
Thr Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His
595 600 605
Gln Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu
610 615 620
Glu Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro
625 630 635 640
Pro Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu
645 650
<210>52
<211>643
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Met Gln Ala Pro Arg Glu Leu Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr
1 5 10 15
Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Gln Gln Gly Arg Val Glu Ile Leu Ala
20 25 30
Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp
35 40 45
Thr Glu Arg Leu Val Gly Asp Ala Ala Lys Ser Gln Ala Ala Leu Asn
50 55 60
Pro His Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe
65 70 75 80
Ala Asp Thr Thr Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Arg Val
85 90 95
Val Ser Glu Gly Gly Lys Pro Lys Val Arg Val Cys Tyr Arg Gly Glu
100 105 110
Asp Lys Thr Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Ser Lys
115 120 125
Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Gln Pro Val Lys His Ala
130 135 140
Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr
145 150 155 160
Lys Asp Ala Gly Ala Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn
165 170 175
Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Arg Arg Gly Ala
180 185 190
Gly Glu Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp
195 200 205
Val Ser Val Leu Ser Ile Asp Ala Gly Val Phe Glu Val Lys Ala Thr
210 215 220
Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val
225 230 235 240
Asn His Phe Met Glu Glu Phe Arg Arg Lys His Gly Lys Asp Leu Ser
245 250 255
Gly Asn Lys Arg Ala Leu Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala
260 265 270
Lys Arg Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Thr Leu Glu Ile Asp Ser
275 280 285
Leu Phe Glu Gly Val Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe
290 295 300
Glu Glu Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Glu Pro Val Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ala Gln Ile His Asp Val
325 330 335
Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Leu
340 345 350
Gln Asp Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp
355 360 365
Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Val Leu Met Gly
370 375 380
Asp Lys Cys Glu Lys Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro
385 390 395 400
Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile
405 410 415
Gln Arg Asn Ala ThrIle Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr
420 425 430
Tyr Ser Asp Asn Gln Pro Gly Val Phe Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu
435 440 445
Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Ser
450 455 460
GlyIle Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe
465 470 475 480
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Ser Val Thr Ala Thr Asp Arg Ser
485 490 495
Thr Gly Lys Ala Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu
500 505 510
Ser Lys Glu Glu Val Glu Arg Met Val His Glu Ala Glu Gln Tyr Lys
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Arg Asp Lys Ile Pro Glu Glu Asp Arg Arg Lys Met Gln Asp Lys Cys
565 570 575
Arg Glu Val Leu Ala Trp Leu Glu His Asn Gln Leu Ala Glu Lys Glu
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Glu Tyr Glu His Gln Lys Arg Glu Leu Glu Gln Ile Cys Arg Pro Ile
595 600 605
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610 615 620
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Glu Val Asp
<210>53
<211>646
<212>PRT
<213>智人
<400>53
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1 5 10 15
Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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Asp Ala Gly Arg Pro Lys Val Gln Val Glu Tyr Lys Gly Glu Thr Lys
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115 120 125
Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Val Thr Asn Ala Val Val
130 135 140
Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp
145 150 155 160
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165 170 175
Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Lys Val Gly Ala Glu
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Phe Ile Ala Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser Glu Asn
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Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Ile Glu Ile Asp Ser Leu Tyr
275 280 285
Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu
290 295 300
Leu Asn Ala Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Asp Pro Val Glu Lys Ala
305 310 315 320
Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ser Gln Ile His Asp Ile Val Leu
325 330 335
Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Lys Leu Leu Gln Asp
340 345 350
Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala
355 360 365
Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Ser Gly Asp Lys
370 375 380
Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser
385 390 395 400
Leu Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Val Leu Ile Lys Arg
405 410 415
Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser
420 425 430
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435 440 445
Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu Thr Gly Ile
450 455 460
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Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser Thr Gly
485 490 495
Lys Glu Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys
500 505 510
Glu Asp Ile Glu Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Ala Glu
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Asp Glu Lys Gln Arg Asp Lys Val Ser Ser Lys Asn Ser Leu Glu Ser
530 535 540
Tyr Ala Phe Asn Met Lys Ala Thr Val Glu Asp Glu Lys Leu Gln Gly
545 550 555 560
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Thr Ile Glu Glu Val Asp
645
<210>54
<211>679
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Met Ile Ser Ala Ser Arg Ala Ala Ala Ala Arg Leu Val Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ser Arg Gly Pro Thr Ala Ala Arg His Gln Asp Ser Trp Asn Gly
20 25 30
Leu Ser His Glu Ala Phe Arg Leu Val Ser Arg Arg Asp Tyr Ala Ser
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Val Arg Ala Ser Asn Gly Asp Ala Trp Val Glu Ala His Gly Lys Leu
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Tyr Ser Pro Ser Gln Ile Gly Ala Phe Val Leu Met Lys Met Lys Glu
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Thr Ala Glu Asn Tyr Leu Gly His Thr Ala Lys Asn Ala Val Ile Thr
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Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Ser Glu Asp Lys Val Ile
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Ala Val Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Leu Glu
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Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Gln Ala Leu Leu Arg His Ile Val Lys
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Glu Phe Lys Arg Glu Thr Gly Val Asp Leu Thr Lys Asp Asn Met Ala
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Leu Gln Arg Val Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Cys Glu Leu Ser
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Ser Ser Val Gln Thr Asp Ile Asn Leu Pro Tyr Leu Thr Met Asp Ser
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Gly Ile Val Thr Asp Leu Ile Arg Arg Thr Ile Ala Pro Cys Gln Lys
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Leu Val Gly Gly Met Thr Arg Met Pro Lys Val Gln Gln Thr Val Gln
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Val Ala Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val Leu Ala Gly Asp Val
420 425 430
Thr Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu
435 440 445
Thr Leu Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asn Arg Asn Thr Thr Ile
450 455 460
Pro Thr Lys Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala Asp Gly Gln Thr
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Gln Val Glu Ile Lys Val Cys Gln Gly Glu Arg Glu Met Ala Gly Asp
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<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>55
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Ser Val Leu Glu Gly Gly Asp Pro Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val
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50 55 60
Thr Val Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Ser Asp Trp Ser Ile Glu
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Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val
195 200 205
Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu
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Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys
225 230 235 240
Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro
245 250 255
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260 265 270
Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg
275 280 285
Thr Arg Lys Pro Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val
290 295 300
Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro
305 310 315 320
Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn
325 330 335
Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln
340 345 350
Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val
355 360 365
Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg
370 375 380
Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe
385 390 395 400
Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu
420 425 430
Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val
435 440 445
Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp
450 455 460
Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly
465 470 475 480
Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His
485 490 495
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595 600 605
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<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>56
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<400>57
Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
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20
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<213>智人
<400>58
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1 5 10 15
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20
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<211>20
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<213>智人
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Leu Lys Val Leu Pro Ile Ile Asn Glu Ala Thr Ala Ala Ala Ile Ala
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20
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<211>20
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<213>智人
<400>60
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1 5 10 15
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20
<210>61
<211>20
<212>PRT
<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400>61
Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
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20
<210>62
<211>20
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>62
Leu Asn Val Ala Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala
1 5 10 15
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20
<210>63
<211>20
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<213>酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)
<400>63
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1 5 10 15
Tyr Gly Leu Asp
20
<210>64
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>64
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1 5 10 15
Tyr Gly Leu Gly
20
<210>65
<211>20
<212>PRT
<213>白色念珠菌(Candida albicans)
<400>65
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1 5 10 15
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20
<210>66
<211>20
<212>PRT
<213>乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)
<400>66
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1 5 10 15
Tyr Gly Leu Asp
20
<210>67
<211>20
<212>PRT
<213>德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)
<400>67
Leu Asn Val Gln Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ser Ala Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Asp
20
<210>68
<211>20
<212>PRT
<213>瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)
<400>68
Leu Asn Val Gln Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ser Ala Leu Ala
1 5 10 15
Phe Gly Leu Asn
20
<210>69
<211>20
<212>PRT
<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)
<400>69
Leu Glu Val Glu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Asp
20
<210>70
<211>20
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>70
Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Asp
20
<210>71
<211>20
<212>PRT
<213>丝状霉浆菌(Mycoplasma mycoides)
<400>71
Leu Gln Val Glu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Asp
20
<210>72
<211>20
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>72
Leu Asn Val Leu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Asp
20
<210>73
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala
1 5 10 15
Phe Thr Asp Thr
20
<210>74
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>74
Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser Tyr Val Ala
1 5 10 15
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20
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<212>PRT
<213>拟南芥
<400>75
Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala
1 5 10 15
Phe Thr Asp Ser
20
<210>76
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>76
Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala
1 5 10 15
Phe Thr Asp Thr
20
<210>77
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>77
Ile Ile Ala Asn Glu Gln Gly Asn Arg Val Thr Pro Ser Phe Val Ala
1 5 10 15
Phe Thr Pro Gln
20
<210>78
<211>20
<212>PRT
<213>嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)
<400>78
Val Ile Pro Asn Pro Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala
1 5 10 15
Phe Lys Asp Gly
20
<210>79
<211>20
<212>PRT
<213>枯草杆菌
<400>79
Val Ile Ala Asn Ala Glu Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala
1 5 10 15
Phe Lys Asn Gly
20
<210>80
<211>20
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>80
Val Val Ala Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala
1 5 10 15
Phe Ala Arg Asn
20
<210>81
<211>20
<212>PRT
<213>麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)
<400>81
Val Val Ala Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Thr Val Ala
1 5 10 15
Phe Ala Arg Asn
20
<210>82
<211>20
<212>PRT
<213>浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)
<400>82
Val Val Ala Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala
1 5 10 15
Phe Ala Arg Asn
20
<210>83
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>83
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile
1 5 10 15
Leu Met Gly Asp
20
<210>84
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>84
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile
1 5 10 15
Leu Ile Gly Asp
20
<210>85
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>85
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Ser Gly Asp
20
<210>86
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>86
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Val
1 5 10 15
Leu Met Gly Asp
20
<210>87
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>87
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile
1 5 10 15
Leu Ser Gly Asp
20
<210>88
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>88
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Ile Gln Gly Gly Val
1 5 10 15
Leu Ala Gly Asp
20
<210>89
<211>20
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>89
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Gly Ala Ile
1 5 10 15
Leu Ser Gly Glu
20
<210>90
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>90
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile
1 5 10 15
Leu Thr Gly Asp
20
<210>91
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>91
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Gly AlaIle
1 5 10 15
Leu Thr Gly Gln
20
<210>92
<211>20
<212>PRT
<213>嗜碱芽孢杆菌
<400>92
Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Leu Gly Ala Ala Val Gln Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Thr Gly Asp
20
<210>93
<211>20
<212>PRT
<213>丝状霉浆菌
<400>93
Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Val Gln Gly Gly Val
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu
20
<210>94
<211>20
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>94
Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Lys Gly Glu
20
<210>95
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>95
Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Ile Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Gly Val
20
<210>96
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>96
Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Asn
1 5 10 15
Gln Ser Ser Val
20
<210>97
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>97
Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Thr Val
20
<210>98
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>98
Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Gly Val
20
<210>99
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>99
Thr Ile Pro Thr Lys Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala Asp Gly
1 5 10 15
Gln Thr Gln Val
20
<210>100
<211>20
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>100
Thr Ile Pro Thr Lys Lys Glu Gln Val Phe Ser Thr Tyr Ser Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Gly Val
20
<210>101
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>101
Thr Ile Pro Thr Lys Lys Ser Glu Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Gly Val
20
<210>102
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>102
Thr Val Pro Thr Ile Lys Arg Arg Thr Phe Thr Thr Val Ser Asp Asn
1 5 10 15
Gln Thr Thr Val
20
<210>103
<211>20
<212>PRT
<213>嗜碱芽孢杆菌
<400>103
Thr Ile Pro Thr Ser Lys Ser Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ala Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Ser Val
20
<210>104
<211>20
<212>PRT
<213>丝状霉浆菌
<400>104
Thr Ile Pro Ala Lys Arg Thr Gln Ile Phe Ser Thr Ala Thr Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Ala Val
20
<210>105
<211>20
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>105
Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp Asn
1 5 10 15
Gln Pro Ser Val
20
<210>106
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>106
Glu Gly Glu Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe
1 5 10 15
Glu Leu Ser Gly
20
<210>107
<211>20
<212>PRT
<213>欧洲牛(Bos taurus)
<400>107
Glu Gly Glu Arg Ala Met Thr Arg Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe
1 5 10 15
Glu Leu Ser Gly
20
<210>108
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>108
Glu Gly Glu Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe
1 5 10 15
Asp Leu Thr Gly
20
<210>109
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>109
Glu Gly Glu Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe
1 5 10 15
Asp Leu Thr Gly
20
<210>110
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>110
Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr Phe
1 5 10 15
Asp Leu Thr Gly
20
<210>111
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>111
Glu Gly Glu Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe
1 5 10 15
Glu Leu Thr Gly
20
<210>112
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>112
Gln Gly Glu Arg Glu Met Ala Gly Asp Asn Lys Leu Leu Gly Gln Phe
1 5 10 15
Thr Leu Ile Gly
20
<210>113
<211>20
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>113
Glu Gly Glu Arg Ala Arg Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe
1 5 10 15
Glu Leu Ser Gly
20
<210>114
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>114
Glu Gly Glu Arg Thr Arg Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe
1 5 10 15
Glu Leu Ser Gly
20
<210>115
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>115
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1 5 10 15
Asp Leu Lys Asn
20
<210>116
<211>20
<212>PRT
<213>嗜碱芽孢杆菌
<400>116
Gln Gly Glu Arg Glu Met Ala Ala Asp Asn Lys Thr Leu Gly Arg Phe
1 5 10 15
Gln Leu Thr Asp
20
<210>117
<211>20
<212>PRT
<213>丝状霉浆菌
<400>117
Gln Gly Glu Arg Ala Met Ala Ala Asp Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe
1 5 10 15
Gln Leu Thr Gly
20
<210>118
<211>20
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>118
Gln Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe
1 5 10 15
Glu Leu Thr Gly
20
<210>119
<211>20
<212>PRT
<213>麻风分枝杆菌
<400>119
Gln Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ser His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe
1 5 10 15
Glu Leu Thr Gly
20
<210>120
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>120
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Thr Asp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Lys Ala
20
<210>121
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>121
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Thr Asp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Lys Val
20
<210>122
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>122
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Ala Asp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Lys Glu
20
<210>123
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>123
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1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys
20
<210>124
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>124
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Ser Val Thr Ala Thr Asp Arg Ser
1 5 10 15
Thr Gly Lys Ala
20
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<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>125
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Lys Glu
20
<210>126
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>126
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Ser Ala Lys Asp Lys Gly
1 5 10 15
Thr Gly Arg Glu
20
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<211>20
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<213>拟南芥
<400>127
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Glu Asp Lys Thr
1 5 10 15
Thr Gly Gln Lys
20
<210>128
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>128
Asp Ile Asp A1a Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Leu Glu Lys Gly
1 5 10 15
Thr Gly Lys Ser
20
<210>129
<211>20
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>129
Glu Val Asp Ala Asn Gly Ile Leu Lys Val Thr Ala Val Glu Lys Ser
1 5 10 15
Thr Gly Lys Ser
20
<210>130
<211>20
<212>PRT
<213>嗜碱芽孢杆菌
<400>130
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val Asn Val Lys Ala Lys Asp Leu Gly
1 5 10 15
Thr Asn Lys Glu
20
<210>131
<211>20
<212>PRT
<213>丝状霉浆菌
<400>131
Glu Ile Asp Ala Asn GlyIle Val Ser Val Ser Ala Lys Asp Lys Asn
1 5 10 15
Thr Asn Glu Glu
20
<210>132
<211>20
<212>PRT
<213>结核分支杆菌
<400>132
Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp Lys Gly
1 5 10 15
Thr Gly Lys Glu
20
Claims (7)
1.衍生自热休克家族70蛋白的肽在制备用于治疗和/或预防炎性肠病或关节炎的药物中的用途，所述肽由SEQ ID No.3或4的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述热休克家族70蛋白为分枝杆菌热休克家族70蛋白。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述炎性肠病选自克罗恩病、肉芽肿性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、胶原性结肠炎、溃疡性结肠炎和乳糜泻。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述关节炎选自类风湿性关节炎、铝屑病关节炎和幼年型关节炎。
5.由SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的氨基酸序列组成的肽。
6.包含如权利要求5所述的肽的药物组合物。
7.包含由SEQ ID No.3的氨基酸序列组成的肽和由SEQ ID No.4的氨基酸序列组成的肽的组合物。
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