KR20030055295A - 열 충격 단백질에서 유래한 면역조절 펩티드 및 그의 용도 - Google Patents
열 충격 단백질에서 유래한 면역조절 펩티드 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대상체에서 면역반응을 조절하는 방법을 개시하였다. 본 발명은 관절염과 같은 면역 매개 질환의 염증 관련 증상을 개선하기 위한 효과적인 치료 전략의 발견에 기초하며, 단지 생성된 염증을 치료하는 것 보다는 근본적인 면역반응을 조절함으로써 달성할 수 있다. 이런 전략은 염증반응을 조절하기 위해 이용할 수 있고, 점막 관용화, DNA 백신접종, 아네르기 유도, 능동 면역법 및 항원 특이성 T 세포의 생체외 조절과 같이 면역 조절이 바람직한 여러 상태에 적용할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 박테리아 dnaJ 펩티드, 또는 이들의 인간 상동체 또는 비-상동성 인간 이성체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
Description
다수의 질환에서 치료 전략은 문제가 있는 증상의 원인을 해결하기 보다는 질환의 증상을 경감시키는 것이다. 염증 질환의 경우에, 예를 들면, 대부분의 치료는 일반적으로 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 소염제를 사용하여 염증을 경감시키는 것이다.
염증은 흔히 면역반응의 결과로서 발생한다. 예를 들면 반응이 박테리아 감염에 대한 것일 때는 면역반응 및 후속적인 염증반응이 일반적으로 개체에게 이점을 제공하지만, 일부 경우에는 면역반응 및 염증반응이 해로운 결과를 야기한다. 특히, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 등과 같은 자가면역 질환에 걸린환자는 심한 고통을 겪고 일부 경우에 조직 손상이 발생된다. 예를 들면 스테로이드성 약물의 투여는 상기 환자에서 면역반응의 심각성을을 감소시킬 수 있지만, 그러한 약물을 장기간 사용하면 환자의 삶의 질을 떨어뜨리는 것을 비롯한 유해 효과를 발생시킬 수 있다. 또한, 그러한 약물의 사용은 일반적으로 면역반응을 일으키는 개체의 능력을 감소시켜, 개체가 단기간 감염에 약해져서 심각한 결과가 야기될 수 있다. 따라서, 특이적으로 면역반응 및 관련 염증반응을 조절하는데 유용한 조성물 및 방법이 요구된다. 본 발명은 상기 요구를 충족시키고 추가의 이점을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 dnaJ 열 충격 단백질(hsp)로부터 유래된 면역원성 펩티드 및, 상기 펩티드를 사용하여 대상체에서 면역반응을 조절하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, T 세포 매개의 면역반응을 통해 작용하는 본 발명의 면역원성 펩티드에는 인터페론-감마와 같은 전염증성 (pro-inflammatory) 사이토카인의 발현을 증가시키는 "전염증성 펩티드" 및 인터루킨-10과 같은 항염증성 사이토카인의 발현을 증가시키는 "항염증성 펩티드"가 포함된다. 펩티드는 또한 일반적으로 다양한 종의 dnaJ hsp에서 비교적 보존된 아미노산 서열을 갖는 "상동성 펩티드" 및 실질적으로 보존되지 않은 아미노산 서열을 갖는 "비-상동성 펩티드"서 특성화될 수 있다.
따라서, 본 발명은 대상체에서 면역반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 부분을 대상체에게 투여하여 대상체의 면역반응을 조절함으로써 수행할 수 있다. dnaJ hsp는 원핵생물 또는 진핵생물 dnaJ hsp, 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ hsp와 같은 박테리아 dnaJ hsp, 효모 dnaJ hsp와 같은 무척추동물 dnaJ hsp, 또는 인간 HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2와 같은 인간 dnaJ hsp를 비롯한 포유동물 dnaJ hsp와 같은 척추동물 dnaJ hsp일 수 있다.
면역원성 펩티드는 dnaJ hsp 펩티드의 글리코실화 형태를 비롯한 dnaJ hsp의 임의 면역성 부분일 수 있고, 일반적으로 MHC 클래스 II 수용체 또는 T 세포 수용체와 결합할 수 있는 펩티드이며, dnaJ 폴리펩티드에 대해 실질적으로 특이적인 에피토프 (epitope)를 제공하는 펩티드이다. 예를 들면, 상기 펩티드는 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 부분, 예를 들면 아미노산 서열 QDYYEILGVSKTAEE (서열 1), RKAYKRLAMKYHPDR (서열 2), QKRAAYDQYGHAAFEQ (서열 3), QGFFAVQQTCPHCQG (서열 4), SKTLSVKIPGAVDTG (서열 5), GDLYVQVQVKQHPIF (서열 6), YCEVPINFAMAALGG (서열 7) 또는 PINFAMAALGGEIEV (서열 8)을 갖는 펩티드일 수 있거나, 인간 HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2 dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 부분, 예를 들면 아미노산 서열 ASYYEILDVPRSASA (서열 9), KDYYQTLGLARGASD (서열 10), TTYYDVLGVKPNATQ (서열 11), KKAYRRKALQWIIPDK (서열 12), KRAYRRQALRYHPDK (서열 13), KKAYRKLALKYHPDK (서열 14), FRSVSTSTTFVQGRR (서열 15), PGMVQQIQSVCMECQ (서열 16) 또는 GRRITTRRIMENGQE (서열 17)을 갖는 펩티드, 또는 아미노산 서열 QAYEVLSDAKKRELYD (서열 18), EAYEVLSDKHKREIYD (서열 19), SGPFFTFSSSFPGHS (서열 20), DGQLKSVTINGVPDD (서열 21), DLQLAMAYSLSEMEA (서열 22), EDLFMCMDIQLVEAL (서열 23), LCGFQKPISTLDNRT (서열 24), RTIVITSHPGQIVKH (서열 25) 또는 GRLIIEFKVNFPENG (서열 26)을 갖는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 방법은 면역반응과 관련된 염증반응을 증가시키거나 감소시켜 면역반응을 조절할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 염증반응을 증대시키거나 유도하기 위한 수단을 제공한다. 한 측면에서, 대상체의 염증반응을 증대시키거나 유도하기 위한 방법은 전염증성 활성을 갖는 펩티드, 즉 전염증성 펩티드를 면역화 조건하에서 대상체에게 투여함으로써 수행한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 항염증성 펩티드를 관용화 조건하에서 대상체에게 투여함으로써 수행한다. 상기 방법의 또 다른 측면에서는, 면역원성 펩티드의 조합물을 투여하는데, 예를 들면 면역화 조건하에서 2종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하거나, 또는 관용화 조건하에서 2종 이상의 항염증성 펩티드를 투여하거나, 또는 면역화 조건하에서 1종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하고 관용화 조건하에서 1종 이상의 항염증성 펩티드를 투여한다. 염증반응을 증대시키거나 유도하는 상기 방법은 대상체에서 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 인터루킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12 또는 IL-23과 같은 전염증성 사이토카인의 농도를 증가시키거나, 또는 대상체에서 IL-4, IL-10 또는 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β)와 같은 항염증성 사이토카인의 농도를 감소시키거나, 또는 이들의 조합을 초래한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에서 염증반응을 감소시키거나 억제하는 수단을 제공한다. 한 측면에서, 염증반응을 감소시키거나 억제하는 방법은 면역화 조건하에서 대상체에게 항염증성 활성을 갖는 펩티드를 투여함으로써 수행한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 관용화 조건하에서 대상체에게 전염증성 펩티드를 투여함으로써 수행한다. 또 다른 측면에서, 면역원성 펩티드의 조합물을 투여하는데, 예를 들면 관용화 조건하에서 2종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하거나, 또는 면역화 조건하에서 2종 이상의 항염증성 펩티드를 투여하거나, 또는 관용화 조건하에서 1종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하고 면역화 조건하에서 1종 이상의 항염증성 펩티드를 투여한다. 염증반응을 감소시키거나 억제하는 상기 방법은 대상체에서 IL-4, IL-10 또는 TGF-β와 같은 항염증성 사이토카인의 농도를 증가시키거나, 또는 대상체에서 IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 또는 IL-23과 같은 전염증성 사이토카인의 농도를 감소시키거나, 또는 이들의 조합을 초래한다.
본원에 기재된 바와 같이, 1종의 dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 부분 또는 이들의 조합물, 예를 들면 서열 1 내지 26에 예시된 임의 1종의 면역원성 펩티드 또는 임의의 조합물을 투여할 수 있다. 본원의 개시내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 펩티드가 전염증성 펩티드인지 또는 항염증성 펩티드인지, 그리고 펩티드가 염증반응을 증대 또는 유도하기 위해 투여되는지 아니면 염증반응을 감소 또는 억제하기 위해 투여되는지에 따라, 면역화 조건 또는 관용화 조건하에서 본 발명의 펩티드를 대상체에게 투여한다. 면역화 유효량의 펩티드를 피부내, 피하, 또는 근육내로 투여함으로써 면역화 조건하에서 펩티드를 투여할 수 있고, 필요한 경우 면역보조제, 예를 들면 프로인트 (Freund)의 완전 또는 불완전 보조제를 포함하는 조성물로서 투여할 수 있다. 관용화 유효량의 펩티드를 점막으로, 또는 피부내, 피하 또는 근육내로 투여함으로써 관용화 조건하에서 펩티드를 투여할 수 있다.
본 발명의 방법은 면역반응을 조절하는 것이 바람직한 임의의 증상을 가지고 있거나, 소인성이거나 감수성인 대상체, 예를 들면 면역 장애를 가지고 있거나 면역 장애에 대해 감수성 또는 소인성인 대상체에 대해 수행할 수 있다. 대상체는 일반적으로 척추동물 대상체, 특히 고양이, 개 또는 말과 같은 길들여진 동물; 양, 소 또는 돼지와 같은 농장 동물; 또는 인간을 비롯한 포유동물이다. 면역 장애는 자가면역 질환, 예를 들면 관절염 (예를 들면, 관절결핍성 (oligoarticular) 유년형 특발성 관절염) 또는 면역결핍 질환 (예를 들면, 후천성 면역결핍증, AIDS)과 같은 면역계의 장애일 수 있다. 면역반응을 조절하는 것이 바람직할 수 있는 추가의 증상에는 면역반응 (예를 들면, 감염 질환 또는 암에 대한 반응)이 충분하게 나타나지 않는 대상체의 증상, 또는 면역반응이 너무 과도하게 나타나는 대상체, 예를 들면, 자가면역 질환이외의 염증성 장 질환에 걸린 대상체 또는 박테리아성 패혈증에 걸린 대상체의 증상이 포함된다.
본 발명은 또한 면역작용 (immunoeffector) 세포의 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 예를 들면 면역작용 세포를 dnaJ hsp의 소정 펩티드 부분과 접촉시켜 수행할 수 있다. 상기 펩티드가 유래된 dnaJ hsp는 원핵생물 또는 진핵생물 dnaJ hsp를 비롯하여, 본원에 개시되거나 또는 당업자에게 알려진 임의의 dnaJ hsp일 수 있다. 펩티드는 필요한 경우, 면역보조제 또는 다른 면역조절제, 예를 들면, 1종 이상의 사이토카인을 또한 함유할 수 있는 조성물로 제제화될 수 있지만, 이것이 필수적인 것은 아니다. T 세포 매개의 면역반응과 관련된 임의세포 (특히, T 세포)일 수 있는 면역작용 세포는 대상체에게 펩티드를 투여함으로써 생체내에서 펩티드와 접촉시킬 수 있거나, 또는 시험관내에서 접촉시킬 수 있다.
면역작용 세포를 생체내에서 (또는 생체외에서) 접촉시킨 경우, 상기 방법은 또한 접촉시킨 면역작용 세포를 대상체에게 투여하여 대상체의 면역반응을 조절하는 수단을 제공하는 것을 더 포함할 수 있다. 이와 같이, 면역작용 세포는 대상체에 대해 자기유래의 것, 즉 환자로부터 얻은 세포를 생체외에서 펩티드와 접촉시킨 후에 필요에 따라 배양하여 세포를 증식시킨 후 대상체에게 투여한 세포일 수 있다. 상기 면역작용 세포는 또한 대상체에 대해 동종이형의 것, 예를 들면 일배체형 (haplotype)이 대상체와 적어도 부분적으로 일치하는 세포일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 대상체의 염증반응을 증대 또는 유도하거나, 또는 대상체의 염증반응을 감소 또는 억제함으로써 면역반응을 조절하는 수단을 제공한다.
본 발명은 또한 전염증성 또는 항염증성 활성을 가진 dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 부분에 관한 것이다. 본 발명의 상기 면역원성 펩티드는 서열 1 내지 26으로 나타낸 펩티드로 예시된다. 또한, 본 발명은 1종 이상의 이종 폴리펩티드와 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 1종 이상의 펩티드를 함유하는 조성물, 예를 들면 서열 1 내지 26으로 나타낸 펩티드 중 어느 하나를 함유하는 조성물 및 상기 펩티드들의 임의 조합물을 함유하는 조성물, 특히 전염증성 펩티드의 조합물을 함유하는 조성물 및 항염증성 펩티드의 조합물을 함유하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 생리학적으로 허용 가능한 용액 중에 제제화되고, 필요한 경우 추가로 1종 이상의 면역보조제, 예를 들면 1종 이상의 사이토카인, 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, 알룸 (alum) 등을 함유할 수 있다. 일반적으로, 조성물이 1종 이상의 사이토카인을 함유하는 경우, 사이토카인은 본 발명 펩티드의 염증성 활성과 동일한 염증성 활성을 갖거나 이를 보충하는 염증성 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 리보핵산 분자 (RNA), 데옥시리보핵산 분자 (DNA), 또는 이들의 하이브리드 (hybrid)일 수 있다. 또한 1종 이상의 이종 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자가 제공된다. 이종 뉴클레오티드 서열은 자연 상태에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 인접한 계통에서 정상적으로 발견되지 않는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들면, 이종 뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열, 예를 들면 전사 조절 요소 또는 번역 조절 요소 또는 이들의 조합물일 수 있거나, 또는 폴리펩티드, 예를 들면 사이토카인 또는 다른 면역조절제, 펩티드 태그 (tag), 세포내 위치결정 (localization) 도메인 등을 코딩하는 것일 수 있다. 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터 (예를 들면, 발현 벡터) 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 포함된 세포가 제공된다.
본 발명에 따른 대상체에서 면역반응을 조절하는 방법은, 관절염과 같은 면역 매개 질환의 염증 관련 증상을 개선하기 위한 효과적인 치료 전략이 단지 생성된 염증의 치료에 의해서가 아니라 근본적인 면역반응을 조절함으로써 달성할 수 있다는 발견에 기초한다. 이런 전략을 이용하여 염증반응을 조절할 수 있고, 면역 조절이 바람직한 여러 상태, 예를 들면 점막 관용화, DNA 백신접종, 아네르기 유도, 능동 면역법 및 항원 특이성 T 세포의 생체외 조절에 상기 전략을 적용할 수 있다.
여러 실시양태에서, 상기 조절에는 대상체에서 IFN-γ 또는 TNF-α의 농도와 같은 전염증성 사이토카인의 농도 증가, 단핵 세포의 증식 자극, 또는 대상체에서 IL-10, IL-4 또는 TGF-β의 농도와 같은 항염증성 사이토카인의 농도 증가가 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 조절에는 대상체에서의 사이토카인 농도 감소 또는 억제가 포함될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 조성물 또는 방법은 치료되는 대상체의 환경에 적합하도록 전염증성 반응 또는 관용화 반응을 증가시키기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 방법은 면역반응과 관련된 또는 면역반응에 의해 매개되는 질환, 예를 들면 자가면역 질환, 감염 질환 또는 암에 걸린 대상체의 치료에 유용하다. 본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 자가면역 질환의 예로는 관절염, 특히 관절결핍성 유년형 특발성 관절염 (oJIA), 당뇨병 및 다발성 경화증이 있다. 본 발명의 조성물 또는 방법은 또한 병용 치료법의 일부로서, 예를 들면, 암 치료법에 대한 보조제 또는 감염원에서 유도된 치료법에 대한 보조제로서 유용할 수 있다.
본 발명은 일반적으로 대상체에서 면역반응을 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이며, 더 구체적으로는 박테리아의 dnaJ 펩티드, 또는 이것의 인간 상동체 또는 인간 비-상동 이성체를 함유하는 조성물과, 이 조성물을 사용하여 면역반응을 자극하거나 면역원에 대한 관용을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 이와 같이, 본 발명은 점막 관용화, DNA 백신접종, 아네르기(anergy) 유도 및 능동 면역법을 비롯하여 염증반응을 조절하기 위한 다양한 수단을 제공한다.
도 1A 내지 1C. 도 1A는 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ로 96 시간동안 자극한 건강한 대상체 ("CTRL") 및 관절결핍성 유년형 특발성 관절염 ("oJIA")에 걸린 환자로부터의 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 활액 단핵 세포 (SFMC)의 증식반응을 나타낸다. 자극 인덱스 (SI)로 표시된 결과를 평균값＋표준편차로서 나타낸다. 도 1B는 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ로 72 시간 동안 인큐베이션시킨 후 건강한 대상체 (CTRL) 및 oJIA에 걸린 환자의 CD69+ T 세포의 평가를 제공한다. CD3+CD69+ 세포의 백분율로 표시된 결과를 평균값＋표준편차로서 나타낸다. 도 1C는 파상풍 독소 (TT) 또는 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ (dnaJ)로 96 시간 동안 자극한 oJIA에 걸린 환자로부터 채취한 PBMC-SFMC 쌍 시료의 자극 인덱스 (SI) 비율을 평가한 것이다.
도 2는 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ (dnaJ)로 96 시간 동안 자극한 건강한 대상체 (CTRL) 또는 oJIA에 걸린 환자의 PBMC 또는 SFMC 배양 상층액에서 사이토카인 생성 (제시한 바와 같은 IFN-γ, TNF-α, IL-10 및 IL-4)을 나타낸다. pg/㎖로 표시된 결과를 평균값＋표준편차로서 나타낸다.
도 3A 및 3B는 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ 펩티드로 72 시간 동안 인큐베이션시키고 관계없는 대조 펩티드 (OVA) 또는 이. 콜라이 (E. coli) hsp에서 유래된 펩티드 (도면에 제시됨)의 존재 또는 부재하에 자기유래의 조사된 공급세포 (autologous irradiated feeder cell)로 재자극한, oJIA에 걸린 환자 (도 3A) 또는 HLA B27+ 환자 (도 3B)로부터 채취한 SFMC의 증식 반응을 나타낸다. 자극 인덱스 (SI)로 표시된 결과를 평균값＋표준편차로서 나타낸다.
도 4는 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ 펩티드로 72 시간 동안 자극하고 박테리아 펩티드에 대한 인간 펩티드 상동체 또는 비-상동체가 존재하는 자기유래의 조사된 공급세포로 재자극한, oJIA 환자의 SFMC의 배양 상층액에서 IL-10 생성을 나타낸다. pg/㎖로 표시된 결과를 평균값＋표준편차로서 나타낸다.
도 5는 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ로 72 시간 동안 자극하고 상동성 또는 비-상동성 인간 펩티드 (도면에 제시됨)가 존재하는 자기유래의 조사된 공급세포로 재자극한, oJIA 환자의 SFMC의 배양 상층액에서 IL-10 생성을 나타낸다. pg/㎖로 표시된 결과를 평균값＋표준편차로서 나타낸다.
도 6은 비-상동성 인간 펩티드 50, 51, 134, 197, 254, 256, 270, 283 및 318 (각각 서열 18 내지 26)에 대한 SI를 나타낸다.
도 7 내지 9는 도 6에서와 같은 펩티드로 인한 IFN-γ, TNF-α 및 IL-10의 농도를 각각 나타낸다.
도 10은 박테리아 dnaJ 4 (서열 1) 및 그의 인간 상동체 2 (서열 9; HSJ1), 3 (서열 10; HDJ1) 및 5 (서열 11; HDJ2)에 대한 SI를 나타낸다.
도 11 내지 13은 도 10에서와 같은 펩티드로 인한 TNF-α, IFN-γ 및 IL-10의 농도를 각각 나타낸다.
도 14는 박테리아 펩티드 dnaJ, 4, 22, 61, 174, 209, 242, 264 및 268 (각각 서열 1 내지 8)에 대한 SI를 나타낸다.
도 15 내지 18은 박테리아 dnaJ 174 (서열 4) 및 그의 인간 상동체 164 (서열 15; HSJ1), 167 (서열 16; HDJ2) 및 176 (서열 17; HSJ1)에 반응한 SI, TNF-α, IFN-γ 및 IL-10의 농도를 각각 나타낸다.
도 19 내지 22는 박테리아 dnaJ 22 및 그의 인간 상동체 20 (HSJ1), 21 (HDJ2) 및 23 (HSJ1)에 반응한 SI, TNF-α, IFN-γ 및 IL-10의 농도를 각각 나타낸다.
도 23은 oJIA가 아닌 형태의 JIA ("syst/poly")에 걸린 환자와 비교하여 oJIA ("oligo") 환자의 각종 펩티드에 대한 증식 반응을 나타낸다. 결과를 SI (바(bar)는 SD를 나타냄)로 표시한다. pandr 및 dnaJpv는 대조군 펩티드이다.
도 24a는 펩티드 174 및 134를 사용한 자극에 반응한 CTLA4/CD25 포지티브 (positive) 세포의 백분율을 나타낸다. "TC"는 자극되지 않은 조직 배양물을 지시한다. 바는 SD를 나타낸다.
도 24b는 펩티드 174 및 134로 자극한 oJIA 환자의 SFMC에 의한 IL-10 생성 (pg/㎖로 표시함)을 나타낸다.
도 25a 내지 25c는 도면에 제시된 여러 펩티드로 자극한 oJIA 환자의 SFMC에 의한 증식 반응 (SI; 도 25a) 및 IFN-γ의 생성 (도 25b) 또는 IL-10의 생성 (도 25c)을 나타낸다.
도 26a 내지 26e는 dnaJP1에 대한 T 세포 반응의 처리-유도된 조절의 결과를 나타낸다. 도 26a는 10 ㎍/㎖의 dnaJP1 펩티드 (서열 3)로 5 일 동안 자극한 PBMC의 T 세포 증식 반응을 나타낸다. 한 달 간격으로 평가를 수행하였다. 조절에는 일반적인 유사분열 촉진 인자로서의 PHA 및 dnaJpv (서열 28)가 포함되었다. 스크리닝시 반응성을 나타낸 환자의 PBMC에 의한 세포내 사이토카인 생성 (전염증성 - 도 26b, c 및 d; 관용성 - 도 26e)을 FACS에 의해 한달 간격으로 평가하였다.dnaJP1로 자극된/자극되지 않은 배양물에서 ％CD3+ 세포로 결과를 표시한다.
본 발명은 대상체에서 면역반응을 조절하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, 관절염과 같은 면역 매개 질환의 염증 관련 증상을 개선하기 위한 효과적인 치료 전략은, 단지 생성된 염증을 치료하는 것 보다는 근본적인 면역반응을 조절함으로써 달성할 수 있다. 이런 전략은 염증반응을 조절하기 위해 이용할 수 있고, 점막 관용화, DNA 백신접종, 아네르기 유도, 능동 면역법 및 항원 특이성 T 세포의 생체외 조절과 같이 면역 조절이 바람직한 여러 상태에 적용할 수 있다.
본 발명은 면역반응의 조절에 사용하기 위한 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 가장 일반적인 인간 HLA 클래스 II 대립형질에 대한 결합 능력으로 선택된 면역원성 펩티드이다. 본원에 개시된 바와 같이, 면역원성 펩티드는 dnaJ hsp의 임의 면역원성 부분일 수 있고, 일반적으로 MHC 클래스 II 수용체 또는 T 세포 수용체와 결합할 수 있으며 dnaJ 폴리펩티드에 대해 실질적으로 특이적인 에피토프를 제공하는 펩티드이다.
본원에 예시된 면역원성 펩티드는 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ (GenBank Acc. No. NP_308042 참조) 및 인간 dnaJ 단백질 상동체, 예를 들면 HSJ1 (GenBank Acc. No. XP_010863), HDJ1 (GenBank Acc. No. P25685) 및 HDJ2 (GenBank Acc. No. P31689)를 비롯한 미생물 및 포유동물 열 충격 단백질 (hsp)로부터 유래되었다. 그러나, 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ에 대한 단백질 상동체 또는 인간 dnaJ 상동체를 또한 본 발명의 방법에 유용한 면역원성 펩티드를 유도하기 위한 공급원으로 사용할 수 있다는 것을 알게될 것이다. 이런 dnaJ 상동체는 당업계에 잘 알려져 있으며 다양한 원핵 및 진핵 유기체, 예를 들면 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis, GenBank Acc. No. CAC89325), 사카로마이시스 세레비재 (Saccharomyces cerevisiae, GenBank Acc. No. NP_013884), 제브라피시 (GenBank Acc. No. B1846679), 닭 (GenBank Acc. No. B1391025), 마우스 (GenBank Acc. No. NP_064662)로부터 클로닝된 핵산 분자에 의해 코팅된 상동체가 포함된다. 다른 유기체로부터 추가의 dnaJ hsp를, 예를 들면 "dnaJ", "HSJ1" 등의 용어 및 본원에 개시된 검색 방법 및 검색 매개변수를 사용하여 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 또는 단백질 데이터베이스를 검색함으로써 확인하고 수득한다는 것을 알게될 것이다.
본원에 개시된 바와 같이, 박테리아 hsp dnaJ 단백질의 펩티드 부분, 및 박테리아 hsp dnaJ 펩티드 서열에 대해 상동성이 있는 펩티드 ("상동성 인간 펩티드") 및 박테리아 hsp dnaJ 펩티드 서열에 대해 상동성이 없는 펩티드 ("비-상동성 인간 펩티드")를 포함하는, 인간 HSJ1, HDJ1 및 HDJ2 hsp의 펩티드 부분이 대상체의 면역반응을 조절할 수 있다. 대표적인 박테리아 hsp dnaJ 펩티드 및 상동성 인간 펩티드와 비-상동성 인간 펩티드에는 하기 펩티드가 포함된다:
박테리아 dnaJ 펩티드
dnaJ 4QDYYEILGVSKTAEE (서열 1)
dnaJ 22RKAYKRLAMKYHPDR (서열 2)
dnaJ 61QKRAAYDQYGHAAFEQ (서열 3)
dnaJ 174QGFFAVQQTCPHCQG (서열 4)
dnaJ 209SKTLSVKIPGAVDTG (서열 5)
dnaJ 242GDLYVQVQVKQHPIF (서열 6)
dnaJ 264YCEVPINFAMAALGG (서열 7)
dnaJ 268PINFAMAALGGEIEV (서열 8)
상동성 인간 펩티드
2 (HSJ1)ASYYEILDVPRSASA (박테리아 dnaJ 펩티드 4의 상동체; 서열 9)
3 (HDJ1)KDYYQTLGLARGASD (박테리아 dnaJ 펩티드 4의 상동체; 서열 10)
5 (HDJ2)TTYYDVLGVKPNATQ (박테리아 dnaJ 펩티드 4의 상동체; 서열 11)
20 (HSJ1)KKAYRRKALQWHPDK (박테리아 dnaJ 펩티드 22의 상동체; 서열 12)
21 (HDJ1)KRAYRRQALRYHPDK (박테리아 dnaJ 펩티드 22의 상동체; 서열 13)
23 (HDJ2)KKAYRKLALKYHPDK (박테리아 dnaJ 펩티드 22의 상동체; 서열 14)
164 (HSJ1)FRSVSTSTTFVQGRR (박테리아 dnaJ 펩티드 174의 상동체; 서열 15)
167 (HDJ2)PGMVQQIQSVCMECQ (박테리아 dnaJ 펩티드 174의 상동체; 서열 16)
176 (HSJ1)GRRITTRRIMENGQE (박테리아 dnaJ 펩티드 174의 상동체; 서열 17)
비-상동성 인간 펩티드
50 (HDJ2)QAYEVLSDAKKRELYD (서열 18)
51 (HSJ1)EAYEVLSDKHKREIYD (서열 19)
134 (HSJ1)SGPFFTFSSSFPGHS (서열 20)
197 (HSJ1)DGQLKSVTINGVPDD (서열 21)
254 (HSJ1)DLQLAMAYSLSEMEA (서열 22)
256 (HDJ2)EDLFMCMDIQLVEAL (서열 23)
270 (HDJ2)LCGFQKPISTLDNRT (서열 24)
283 (HDJ2)RTIVITSHPGQIVKH (서열 25)
318 (HDJ2)GRLIIEFKVNFPENG (서열 26)
본 발명의 면역원성 펩티드에는 인터페론-감마와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 증가시키는 "전염증성 펩티드" 및 인터루킨-10과 같은 항염증성 사이토카인의 발현을 증가시키는 "항염증성 펩티드"가 포함된다. 본 발명의 펩티드가 전염증성 활성을 갖는지 또는 항염증성 활성을 갖는지에 대한 측정은 본원 (실시예 1 및 2 참조)에 개시된 바와 같이 시험관내 분석을 이용하여 용이하게 수행할 수 있거나, 또는 면역작용 세포와 펩티드의 접촉에 의해 발현된 사이토카인의 종류 및 양을 측정하기 위해 당업계에서 일반적으로 사용하는 임의의 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 본원에서 사용한 용어 "면역작용 세포"는 면역반응의 발생 또는 작용과 직접적으로 관련된 세포를 말한다. 이런 세포는 당업계에 잘 알려져 있으며, B 림프구 (B 세포); 수상세포 (dendritic cell), 단핵 식세포 (mononuclear phagocytic cell), 대식세포 (macrophage) (랑게르한스 세포 (Langerhans cell) 포함) 및 인간의 소정맥 내피 세포 (및 B 세포)와 같은 항원 제시 세포 (antigenpresenting cell); 및 특히 T 세포, 예를 들면 T 헬퍼 세포, T 억제 세포 및 세포독성 T 세포가 포함된다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 여러 종의 dnaJ hsp 중에서 비교적 보존된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 ("상동성 펩티드") 및 실질적으로 보존되지 않은 아미노산 서열을 갖는 펩티드 ("비-상동성 펩티드")를 비롯한 2종의 일반적인 카테고리로 특성화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "상동성"은, 임의의 수의 서열 비교 연산법을 사용하거나 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정시 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대로 상응하도록 비교하고 정렬하는 경우에, 기준 서열과 약 50 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 사용된다. 서열 동일성을 측정하기 위한 목적으로, 지방족 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린), 또는 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들면, 아르기닌, 리신) 등으로의 치환과 같은 보존적 아미노산 치환은 동일한 것으로 간주된다. 또한, 상동성의 측정에서는 1개 또는 몇개의 삽입 또는 결실, 바람직하게는 1개 또는 2개의 삽입 또는 결실을 허용할 수 있으나, 상기 삽입 또는 결실은 비교의 목적에서는 동일하지 않은 아미노산으로 간주한다. 이와 같이, 상동성 펩티드는 1개, 2개 또는 몇개의 아미노산에 의해 길이가 다를 수 있으나, 서열 동일성의 최소량은 유지된다.
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 상동성 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 각각 기준 펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 비교하여 약 50 ％ 이상의 서열 동일성, 일반적으로 약 60 ％ 이상의 서열 동일성을 갖고, 약 70 ％ 이상의 서열 동일성, 또는 80 ％ 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들면, 15개 아미노산을 함유한 박테리아 dnaJ 펩티드 4 (서열 1)는, 서열 1에 대해 7개의 동일한 아미노산 및 2개의 보존적 치환을 포함하는 15개 아미노산을 함유한 인간 HSJ1 펩티드 2 (서열 9)에 상동성 (9/15; 60 ％)이 있고; 서열 1에 대해 6개의 동일한 아미노산 및 3개의 보존적 치환을 포함하는 15개 아미노산을 함유한 인간 HDJ1 펩티드 3 (서열 10)에 상동성 (9/15; 60 ％)이 있으며; 서열 1에 대해 8개의 동일한 아미노산을 함유한 인간 HDJ2 펩티드 5 (서열 11)와 상동성 (8/15; 53.3 ％)이 있다. 본 발명의 비-상동성 펩티드에는 상동성 펩티드가 아닌 펩티드들이 포함되나, 이들은 본 발명의 면역원성 펩티드의 특성을 갖는다.
본 발명의 목적에서 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 상동성이 있는 지는 2개 또는 몇개의 서열을 시각적으로 비교하여 결정할 수 있거나, 단백질 또는 핵산 분자 데이터베이스에 함유될 수 있는 다수의 서열 중에서 상동성이 있는 서열을 확인하는데 유용한 컴퓨터 보조 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 상동성 또는 동일성은 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)의 서열 분석 소프트웨어 팩키지와 같은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다. 상기 소프트웨어는 여러 결실, 치환 및 다른 변형에 대해 상동성 정도를 정하여 유사 서열을 매치시킨다. 서열 비교 연산법을 사용하는 경우, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 부서열 좌표 (subsequence coordinates)를 지정하고, 필요한 경우, 서열 연산 프로그램의 매개변수를 지정한다. 프로그램의 기본 매개변수를 사용하거나, 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 이 후, 서열 비교 연산법은 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
용어 "비교 윈도우"는 인접한 위치의 번호 중 임의의 하나, 예를 들면 약 9 내지 50개 아미노산 위치 또는 약 20 내지 200개 뉴클레오티드 위치의 부분서열 (segment)에 대한 기준을 포함하는 것으로 본원에서 광범위하게 사용되는데, 이 때 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후 서열을 인접한 위치의 번호가 동일한 기준 서열에 대해 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들면 본원에 참고로 인용된 스미스 (Smith) 및 워터만 (Waterman)(Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981)의 국소 상동성 연산법, 니들맨 (Needleman) 및 분쉬 (Wunsch)(J. Mol. Biol. 48: 443, 1970)의 상동성 정렬 연산법, 퍼슨 (Person) 및 리프맨 (Lipman)(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444, 1988)의 유사성 검색법이 있고, 이들 연산을 컴퓨터로 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA 이용, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)하거나 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 수행하는 것을 포함한다. 상동성 또는 동일성을 측정하는 다른 연산법에는, 예를 들면 BLAST 프로그램 (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information) 이외에도, ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned SegmentStatistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMProved Searcher), FASTA, 인터벌즈 앤드 포인츠(Intervals ＆ Points), BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 연산법, DARWIN, 라스 베가스 (Las Vegas) 연산법, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), 프레임얼라인 (Framealign), 프레임서치 (Framesearch), DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction ＆ Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) 및 WHAT-IF가 포함된다. 상기 정렬 프로그램을 또한 게놈 데이터베이스를 스크리닝하는데 사용하여 실질적으로 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다.
유용한 연산법의 한 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 연산법이 있는데, 이들은 알츠출 (Altschul) 등의 문헌 ([Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1977] 및 [J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990], 각각은 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용됨)에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터 를 통해 공개적으로 입수 가능하다 (인터넷 URL: www.ncbi.nln.nih.gov에서 입수 가능함). 상기 연산법은 먼저 검색을 원하는 서열 (query sequence)에서 짧은 길이의 워드 (word) W를 확인하여 스코어가 높은 서열 쌍 (high scoring sequence pairs)을 찾아내는데, 이는 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드와 정렬하는 경우에 매치되거나 일부 (＋) 값의 역치 스코어 T를 충족한다. T는 인접 워드 스코어 역치라 부른다 (Altschul et al., 상기 문헌, 1977, 1990). 상기 초기 인접 워드 히트 (hit)가 검색을 개시하기 위한 입력값 (seed)으로 작용하여, 이들을 포함하는 스코어가 높은 더 긴 길이의 서열 쌍을 찾는다. 상기 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있을때까지 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 확장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열의 경우에 매개변수 M + (매치되는 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 0 초과임)를 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어 산정 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값에서 양 (quantity) X로 감소된 경우, 누적 스코어가 하나 이상의 (－) 스코어를 갖는 잔기 정렬의 누적에 의해 0 이하로 내려간 경우, 또는 서열의 양쪽 말단에 도달한 경우에 각 방향에서 워드 히트의 확장이 중지된다. BLAST 연산법의 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열의 경우) BLASTN 프로그램은 기본 매개변수로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=4 및 2개 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 기본 매개변수로서 워드길이 3 및 기대값(E) 10을 사용하고, BLOSUM62 스코어 산정 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 10915, 1989] 참조)는 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 2개 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 연산법은 또한 2개 서열 사이에 유사성의 통계적 분석을 수행한다 (예를 들면, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90: 5873, 1993] 참조). BLAST 연산법에 의해 제공된 유사성 측정법은, 2종의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생함으로써 확률을 나타내는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
한 실시양태에 있어서, 기초 국소 정렬 검색 도구 ("BLAST")를 이용하여 단백질 및 핵산 서열의 상동성을 평가하였다. 특히, 하기 과제를 수행하기 위해 5개의 특별한 BLAST 프로그램을 이용하였다.
(1) 검색을 원하는 아미노산 서열을 단백질 서열 데이터베이스와 비교하는 BLASTP 및 BLAST3;
(2) 검색을 원하는 뉴클레오티드 서열을 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 비교하는 BLASTN;
(3) 검색을 원하는 뉴클레오티드 서열 (양쪽 가닥)의 6개 프레임 가상 번역 산물을 단백질 서열 데이터베이스와 비교하는 BLASTX;
(4) 검색을 원하는 단백질 서열을, 모든 6개 리딩 프레임 (양쪽 가닥)에서 번역된 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 비교하는 TBLASTN;
(5) 검색을 원하는 뉴클레오티드 서열의 6개 프레임 번역체를 뉴클레오티드서열 데이터베이스의 6개 프레임 번역체와 비교하는 TBLASTX.
BLAST 프로그램은 검색을 원하는 아미노산 또는 핵산 서열과, 바람직하게는 단백질 또는 핵산 서열 데이터베이스에서 얻어진 시험 서열간의 유사 부분서열 (본원에서 "스코어가 높은 부분서열 쌍 (high-scoring segment pairs)"으로 언급됨)을 찾아냄으로써 상동성 찾는다. 스코어가 높은 부분서열 쌍은, 바람직하게는 당업계에 공지된 많은 스코어 산정 매트릭스에 의해 확인 (즉, 정렬)된다. 바람직하게는, 스코어 산정 매트릭스로서 BLOSUM62 매트릭스 (Gonnet et al., Science 256: 1443-1445, 1992; Henikoff and Henikoff, Proteins 17: 49-61, 1993, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용됨)가 이용된다. 이보다 덜 바람직하게는 PAM 또는 PAM250 매트릭스도 이용될 수 있다 (Schwartz and Dayhoff, eds., "Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure" (Washington, National Biomedical Research Foundation 1978)). BLAST 프로그램은 미국 국립 의학 도서관 (예를 들면, 인터넷 URL: www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 이용 가능하다. 상기 연산법에 사용된 매개변수는 서열 길이와 밝혀진 상동성 정도에 따라 조정될 수 있다. 몇몇 실시양태에 있어서, 상기 매개변수는 사용자의 특정한 지정없이 연산법의 기본 매개변수를 사용할 수 있다. 이러한 검색 방법은 데이터베이스에서 dnaJ hsp의 상동성 서열을 확인하는 경우에도 이용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 화학적인 펩티드 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 코딩 폴리뉴클레오티드로부터 발현되거나, 또는 dnaJ hsp의 절단 후 단리될 수 있다. 재조합체 형태의 펩티드를 정제, 합성 또는 제조하는 기술은 간편하고 당업계에 잘 알려져 있으며, 이것은 본 발명의 방법에 이용되기에 충분한 순도를 갖는 면역원성 펩티드를 제조하는데 적합하다. 상기 관점에서, 용어 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한"은 생체내에서 일반적으로 결합해 있는 다른 화학물질들을 실질적으로 갖고 있지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 본 발명의 방법에 있어서, 용어 "실질적으로 순수한"은 실질적으로 균일한 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말하며, 여기에서 균일성은 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 얻을 수 있기에 충분한 순도와 같이 당업계에 공지된 순도 기준을 참고로 하여 결정된다. 바람직하게는, 상기 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 대상체 투여용으로 이용될 수 있을 정도로 충분히 단리된다. 이러한 것으로서, 단리된 펩티드 또는 폴리펩티드는 일반적으로 이러한 펩티드를 포함한 시료에 약 50 ％ 이상 포함되어 있고, 일반적으로 약 75 ％ 이상, 특히 약 90 ％ 이상, 바람직하게는 약 95 ％ 내지 99 ％ 또는 그 이상 포함되어 있다. 이러한 순도 측정은 상기 펩티드 단독, 또는 예를 들면 조성물 제조를 위한 출발 물질로서의 펩티드에 관련된 것이며, 상기 경우에 있어서 본 발명의 단리된 펩티드는 조성물의 성분을 포함할 수 있고, 본 발명의 단리된 추가의 펩티드를 비롯하여 본원에 개시된 추가 성분을 더 포함할 수 있음을 주지하여야 한다.
실질적으로 순수한 dnaJ 단백질 및 펩티드는 살아있는 미생물 (특히, 박테리아)에서 미생물 발현을 통해, 화학적 또는 생물학적 합성에 의해, 또는 예를 들면 친화 크로마토그래피를 비롯하여 당업계에 공지된 일반적 정제 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 이러한 기술은 dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 단편을 얻기 위해 이용될수 있다. 예를 들면, 본 발명의 백신 조성물 제조에 유용한 단백질 또는 펩티드는 알파-아미노기를 t-BOC 또는 FMOC로 보호하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 상기 두 방법 모두, 각각의 단계에서 단일 아미노산이 펩티드의 C-말단에서부터 첨가되는 단계적 합성을 포함한다 (예를 들면, 문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9] 참조). 본 발명의 펩티드는, 예를 들면 중합체 1 g 당 약 0.1 내지 1.0 mmol의 아민을 포함하는 공중합(스티렌-디비닐벤젠)을 이용하여, 다양한 공지의 고체상 펩티드 합성 방법으로도 합성될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, 1962; Stewart and Young, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pages 27-62] 참조). 화학적 합성 완료 후, 상기 펩티드는 0 ℃에서 약 15 분 내지 1 시간 동안 액상의 HF-10 ％ 아니솔을 처리하여 탈보호되고 중합체에서 분리될 수 있다.
시약을 증발시킨 후, 상기 펩티드를 1 ％ 아세트산 용액을 사용하여 중합체로부터 추출하고 이 후 동결건조시켜 조생성물을 수득하고, 예를 들면 5 ％ 아세트산을 용매로 사용한 세파덱스 (SEPHADEX).RTM G-15 친화 칼럼 또는 세파로스 (SEPHAROSE).RTM 친화 칼럼 상에서 겔 여과 크로마토그래피와 같은 방법을 이용하여 정제할 수 있다. 상기 칼럼의 적절한 분획을 동결건조시켜 실질적으로 균일한 펩티드 또는 펩티드 유도체를 수득하고, 이것을 아미노산 분석, 박막 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 자외선 흡수 분광법, 몰 광회전 또는 용해도와 같은 표준 기술에 의해 특성화할 수 있으며, 예를 들면 고체상 에드만 (Edman) 분해 방법에 의해 서열을 분석할 수 있다.
필요한 경우, 본 발명의 면역원성 펩티드는 예를 들면 펩티드가 면역원 또는 톨러라겐 (toleragen)으로서 작용하는 능력이 증가되도록, 대상체 또는 다른 매체에서 펩티드의 안정성이 증가되도록, 또는 원하는 임의의 다른 목적을 위해 변형될 수 있다. 예를 들면 상기 펩티드는 글리코실화 반응에 의해 변형될 수 있으며, 이것은 상기 펩티드에 있는 아미노산의 반응 측쇄에 탄수화물 부분을 연결시키거나, 또는 상기 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 1개 또는 소수의 추가 아미노산을 부착시키고, 이 추가 아미노산에 탄수화물 부분을 연결시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 연결은 예를 들면, 아스파라긴 잔기 또는 세린 잔기에 각각 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물과 같이 당단백질에서 흔히 발견되는 임의의 연결일 수도, 또는 쉽게 수행될 수 있는 임의의 다른 연결일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역원성 펩티드를 1종 이상의 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 작동 가능하게 연결하여 변형시킬 수 있다. 이러한 것으로서, 본 발명은 또한 키메라 폴리펩티드를 제공하며, 이것은 1종 이상의 이종 펩티드에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 펩티드 (또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드)가 서로 연결된 상태에서, 연결된 펩티드들 (또는 폴리뉴클레오티드들)의 기능이 유지되고, 키메라 폴리펩티드 (또는 재조합 핵산 분자)가 각각의 구성 펩티드 (또는 폴리뉴클레오티드)의 기능을 나타내는 것을 의미한다. 예를 들면 본 발명의 키메라 폴리펩티드는, 본 발명의 펩티드가 폴리히스티딘 태그와 같은 펩티드 태그에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 펩티드를 포함할 수 있으며, 이러한 펩티드는 니켈 킬레이트제를 이용하여 시료내에서 동정되거나 또는 혼합물로부터 단리될 수 있다. 또한 본 발명의 펩티드는, 예를 들면 세포내에서 펩티드의 위치결정을 용이하게 하는 세포 구획화 (compartmentalization) 도메인과 결합될 수 있으며, 그 예로는 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 대상체에 도입한 후 발현되는 펩티드가 있다. 세포 구획화 도메인은 펩티드가 세포질기질, 핵, 원형질막, 소포체, 중앙의 트랜스-골지 시스터나 (cisternae), 또는 리소솜 또는 엔도솜으로 위치하는 것을 용이하게 하거나; 또는 면역원성 펩티드가 세포막을 통해 이동하는 것을 용이하게 하는 막 전이 펩티드이거나; 또는 상기 펩티드가 세포 외부로 분비되는 것을 용이하게 하는 분비 펩티드일 수 있다 (예를 들면, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Hancock et al., EMBO J. 10: 4033-4039, 1991], [Buss et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3960-3963,1988] 및 미국 특허 제5,776,689호 참조).
본 발명은 또한, 본 발명의 면역원성 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 리보핵산 분자 (RNA), 데옥시리보핵산 분자 (DNA) 또는 이들의 하이브리드일 수 있다. 또한 본 발명은, 1종 이상의 이종 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 자연상태에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 인접한 계통에서 정상적으로 발견되지 않는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들면, 이러한 이종 뉴클레오티드 서열은 전사 조절 요소, 번역 조절 요소 또는 이들의 조합물과 같은 발현 조절 서열일 수 있거나, 또는 사이토카인 또는 그외 다른 면역조절제, 펩티드 태그, 세포내 위치결정 도메인 등과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 것일 수 있다. 상기 재조합 핵산 분자가 본 발명의 펩티드, 및 본 발명의 1종 이상의 추가 펩티드 또는 1종 이상의 사이토카인 등과 같은 제2의 (또는 그 이상의) 기능적 폴리펩티드를 코딩하는 경우에 있어서, 상기 재조합 핵산 분자는 또한, 코딩된 각 펩티드 사이에 단백질 분해효소 인식 부위를 추가로 코딩하여, 발현시 코딩된 각 펩티드가 코딩된 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하지 않는 형태로 방출되도록 할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하며, 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 벡터는, 벡터내에 포함되어 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 핵산 분자를 대량 제조하는데 유용한 클로닝 벡터일 수도, 또는 코딩된 펩티드를 발현시킬 목적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 대상체에 도입하는 경우 유용할 수 있는 발현 벡터일 수도 있다. 이러한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 플라스미드 벡터 및 바이러스성 벡터 (레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아 바이러스 등에서 유래한 벡터 포함)를 포함한다.
외래 구조 유전자 삽입체를 작동 가능하게 코딩하는 플라스미드 벡터로서 pBR322 플라스미드가 일반적으로 사용된다. pBR322에는 앰피실린 내성을 부여하는 유전자가 마커 (marker)로서 포함되어 있으나, 인간에게 사용할 때에는 이러한 앰피실린 내성을 피해야 한다. 예를 들면, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 출원 제08/593,554호 (1996년 1월 30일 출원)에는, 앰피실린 내성을 부여하지 않으면서도 유전자 면역법에 유용한 변형된 벡터가 기재되어 있다.
아데노바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아, 또는 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스를 비롯한 다양한 바이러스성 벡터가 본 발명에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 레트로바이러스성 벡터는 쥐과 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스성 벡터의 예로서는, 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (Moloney Murine Leukemia Virus, MoMuLV), 하베이 쥐과 육종 바이러스 (Harvey Murine Sarcoma Virus, HaMuS-V), 쥐과 유방 종양 바이러스 (Murine Mammary Tumor Virus, MuMTV) 및 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus, RSV)가 포함되지만 이것에만 제한되는 것은 아니다. 그 외 다수의 레트로바이러스성 벡터는 여러 개의 유전자를 혼입시킬 수 있다. 상기 모든 벡터는 선별가능 마커로서의 유전자를 전이시키거나 또는 혼입시킬 수 있어서, 형질전환된 세포를 동정하거나 발생시킬 수 있다.
재조합 레트로바이러스는 불완전하기 때문에, 감염성 벡터 입자로 만들기 위한 도움이 필요하다. 이러한 도움은 예를 들면, LTR내 조절 서열의 통제 하에서 레트로바이러스의 모든 구조 유전자를 코딩하는 플라스미드를 지닌 헬퍼 세포주를 이용함으로써 제공될 수 있다. 상기 플라스미드는, RNA 전사체를 인식하여 캡시드를 형성 (encapsidation)하는 패키징 메커니즘을 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열이 결여되어 있다. 이러한 패키징 신호 (packaging signal)가 제거된 헬퍼 세포주로는, 예를 들면 Ψ2, PA317 및 PA12가 포함되지만 이것에만 제한되는 것은 아니다. 이러한 세포주들은 게놈이 패키징되지 않기 때문에 비어있는 비리온 (virion)을 생성한다. 만약 레트로바이러스성 벡터가, 패키징 신호는 그대로 있지만 구조 유전자가 다른 목적 유전자로 교체된 헬퍼 세포내로 도입된 경우에는, 상기 벡터가 패키징될 수 있고 벡터 비리온이 생성될 수 있다.
본 발명의 펩티드를 전통적인 백신으로서 투여하는 대신에, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 백신으로서 투여함으로써, 예를 들면 단백질성 백신과 관련된 과민성 쇼크 같은 잠재 독성의 위험을 실질적으로 피하는 것을 비롯한 몇몇 이점을 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 핵산 분자, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 벡터를 세포와 접촉시키거나 또는 대상체에 투여할 경우, 이것은 "있는 그대로의 (naked)" DNA 상태로 투여될 수도, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 용이한 도입과 세포로의 도입 이전의 분해 가능성을 줄일 수 있는 리포좀 또는 콜로이드성 입자와 같은 전달 매체내로 제제화될 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 펩티드를 1종 이상 포함하고 본 발명의 서로 다른 다수의 면역원성 펩티드를 제공할 수 있는 조성물을 제공하며, 그 예로는 서열 1 내지 26에 기재한 임의 펩티드를 포함하는 조성물, 또는 이러한 펩티드의 임의 조합물을 포함하는 조성물, 특히 전염증성 펩티드의 임의 조합물을 포함하는 조성물, 및 항염증성 펩티드의 조합물을 포함하는 조성물이 있다. 일반적으로 본 발명의 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 용액내로 제제화되며, 필요한 경우 1종 이상의 면역보조제 (예를 들면, 1종 이상의 사이토카인, 프로인트 완전 면역보조제,프로인트 불완전 면역보조제, 알룸 (alum) 등)가 더 포함될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물이 1종 이상의 사이토카인를 포함하고 있는 경우, 상기 사이토카인은 본 발명의 펩티드의 염증성 활성과 동일한 활성을 갖거나 또는 상기 펩티드의 염증성 활성을 보충한다. 상기 조성물은 또한, 면역자극제 또는 필요한 경우 면역억제제를 비롯한 임의의 면역보조제를 포함할 수 있으며, 이것은 개체의 전신성 면역반응을 조절할 수 있다. 이러한 활성을 갖는 적합한 물질들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 여기에는 억제 또는 세포독성 T 세포를 자극할 수 있는 IL-6, 및 면역반응을 억제할 수 있는 시클로스포린 A 및 항-CD4 항체가 포함된다. 이러한 화합물들은 개별적으로 또는 본 발명의 백신과 혼합하여 투여될 수 있다.
용어 "사이토카인"은 본원에서 광범위하게 사용되는 것으로, 세포의 면역계에 의해 방출되고, 면역반응을 조절하기 위해 특정 수용체를 통해 비-효소적으로 작용하는 가용성 당단백질을 말한다. 이러한 것으로서, 본원에 사용된 용어 "사이토카인"에는 케모카인, 인터루킨, 림포카인, 모노카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 혈소판 활성화 인자, 종양 괴사 인자-알파 및 수용체 결합 단백질뿐만 아니라 이들의 기능적 단편이 포함된다. 본원에 사용된 용어 "기능적 단편"은, 생물학적 기능 또는 고유 단백질의 특징적 활성을 갖고 있는 단백질의 소정 펩티드 또는 소정 폴리펩티드 부분을 말한다. 예를 들면 IL-10 또는 IL-4의 기능적 단편은, 예를 들면 자연적으로 발생한 또는 재조합으로 생산된 IL-10 또는 IL-4과 각각 실질적으로 동일한 항염증성 활성을 갖는 반면, IFN-γ또는 TNF-α의 기능적 단편은 예를 들면 자연적으로 발생한 또는 재조합으로 생산된 IFN-γ 또는 TNF-α와 각각 실질적으로 동일한 전염증성 활성을 갖는다.
사이토카인은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 내피 단핵세포 활성화 폴리펩티드 II (EMAP-II), 과립백혈구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 과립백혈구-CSF (G-CSF), 대식세포-CSF (M-CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13 등, IFN-α, IFN-β및 IFN-γ를 비롯한 인터페론, 및 TNF-α를 포함하며, 이들 각각은 세포 또는 세포 메커니즘에서의 특정한 생물학적 변화, 형태학적 변화 또는 표현형 변화와 관련되어 있다. 케모카인은, 첫번째 두개의 보존된 시스테인 사이에 삽입된 아미노산을 갖는 CXC 케모카인 (또는 α) 아과 (subfamily)의 구성원 ; 상기 삽입된 아미노산 잔기를 포함하지 않는 CC (또는 β) 아과의 구성원; 및 첫번째 및 세번째 시스테인 잔기가 결여된 C (또는 γ) 케모카인에 의해 더 예시될 수 있다. 일반적으로, α케모카인 구성원은 중성백혈구 및 T-림프구 (T 세포)에 작용하고, β케모카인은 단핵세포, 대식세포 및 T 세포에 작용한다. 또한 α 및 β케모카인 아과의 몇몇 구성원은, 강력한 항원-제시 성질을 나타내는 유주세포 (migratory cell)이고, 많은 염증성 질병의 이상병리학에 관여하는 것으로 생각되는 수상세포에도 작용한다 (Xu et al., J. Leuk. Biol., 60: 365-71, 1996; Sozzani et al., J. Immunol., 159: 1993-2000, 1997). 이외에도 제4의 인간 CX3C-형 케모카인인 프렉탈카인 (fractalkine)도 기재되었다 (Bazan et al., Nature, 385: 640-4, 1997; Imai et al., Cell, 91: 521-30, 1997; Mackay, Curr. Biol. 7: R384-6, 1997). 다른 케모카인과는 달리, 프렉탈카인은 가용성 형태로 막에 존재한다. 이러한 가용성 형태는 단핵세포 및 T 세포에 대한 강력한 화학유인물질이다. 상기 케모카인에 대한 세포 표면 수용체는 CX3CR1이다.
상기 α케모카인 (IL-8로도 알려짐)의 예로는, 과립백혈구 화학주성 단백질-2 (GCP-2); 성장-관련 종양유전자-α (GRO-α), GRO-β 및 GRO-γ; 외피 세포-유래 중성백혈구 활성화 펩티드-78 (ENA-78); 혈소판 염기성 단백질 (PBP); 연결조직 활성화 펩티드 III (CTAP III); 중성백혈구 활성화 펩티드-2 (NAP-2); 저친화성 혈소판 인자-4 (LAPF-4); IFN-γ에 의해 유도된 모노카인 (MIG); 혈소판 인자 4 (PF4); 인터페론 유도가능 단백질 10 (IP-10); 기질세포 유래 인자 SDF-1α, SDF-1β 및 SDF-2가 있다. 상기 β케모카인의 예로는, 단핵세포 화학주성 단백질 MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 MCP-5; 대식세포 억제성 단백질 MIP-1α, MIP-1β, MIP-1γ, MIP-2, MIP-2α, MIP-2β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4 및 MIP-5; 대식세포-유래 케모카인 (MDC); 인간 케모카인 1 (HCC-1); LD78β; RANTES; 에오탁신 (eotaxin) 1; 에오탁신 2; TARC; SCYA17 및 I-309; 수상세포 케모카인-1 (DC-CK-1)이 있다. 상기 γ케모카인의 예로는 림포탁틴 (lymphotactin)이 있다.
본 발명의 조성물은 1종 이상의 면역원성 펩티드(들)을 생리학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함으로써 대상체 투여용으로 제조될 수 있다. 이러한 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 독성을 나타내지 않을 것이다. 보통은, 상기 조성물 제조시, 특정 백신 항원을 염수, 완충액, 아스코르브산과 같은 산화방지제, 저분자량 (약 10개 잔기 미만)의 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 포도당 또는 덱스트란을 비롯한 탄수화물, 또는 EDTA, 글루타티온과 같은 킬레이트제 및 다른 안정화제 및 부형제와 혼합하는 것이 요구된다. 이러한 조성물은 현탁액, 유상액또는 동결건조된 형태일 수 있으며, 조성물이 적합하게 제조되고 원하는 용도에 사용 승인을 받을 수 있도록 하는 조건하에서 제제화된다.
생리학적으로 허용 가능한 담체는, 본 발명의 면역원성 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼합될 때, 성분의 생물학적 활성이 유지되고, 대상체의 면역계와의 반응을 방해하지 않는 임의의 물질일 수 있다. 예를 들면, 인산 완충 염수 용액, 물, 수중유 유상액과 같은 유상액 및 다양한 형태의 습윤제와 같은 생리학적으로 허용 가능한 임의 표준 담체가 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다. 바람직한 에어로졸용 또는 비경구 투여용 희석제로는 인산 완충 염수 또는 보통 (0.9 ％)의 염수가 있다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상의 방법에 의해 제제화된다 (예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Chapter 43, 14th Ed., Mack Publishing Co., Easton PA 18042, USA] 참조).
대상체에 투여하기 위해, 펩티드 또는 이것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 조성물로서 제제화된다. 따라서 본 발명은, 일반적으로 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 함께 상기 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 투여용으로 쉽게 제제화될 수 있는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들면, 상기 담체는 생리학적 완충 염수 또는 다른 용매와 같은 수용액, 또는 글리콜, 글리세롤, 올리브오일과 같은 오일 또는 주사 가능한 유기 에스테르와 같은 비히클 (vehicle)일 수 있다. 또한 담체는, 예를 들면 펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 안정화시키거나 또는 이것의 흡수를 증가시키는, 생리학적으로 허용 가능한 화합물을 포함할 수 있다. 생리학적으로 허용 가능한 화합물로는, 예를 들면 포도당, 자당 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 또는 글루타티온과 같은 산화방지제, 킬레이트제, 저분자량 단백질, 또는 다른 안정화제 또는 부형제가 포함된다. 이와 유사하게, 본 발명의 방법을 수행하기 위해 배양액 중에서 처리된 세포 (예를 들면, 활액 단핵세포 (synovial fluid mononuclear cell), 수상세포 등)는 상기 세포를 대상체에게 투여할 때 조성물내로 제제화될 수도 있다.
숙련된 임상학자는 생리학적으로 허용 가능한 화합물을 비롯한 담체 선택이, 예를 들면 상기 펩티드 또는 이것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여 방법뿐만 아니라 상기 조성물의 투여경로에 의존함을 알 것이다. 상기 조성물이 면역화 조건하에서 (즉, 백신으로서) 투여될 경우, 일반적으로 근육내, 피부내 또는 피하 투여되지만 또한 정맥내 주사와 같이 비경구 투여될 수도 있으며, 주사, 삽관 (intubation) 또는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 면역계의 조절이 관용화 (tolerization)인 경우, 상기 조성물은 바람직하게는 경구 투여되거나, 또는 상기 방법으로 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 진단시약, 영양 물질, 독소 또는 치료제 (예를 들면, 암 화학치료제)와 같은 제2의 시약을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2의 시약은 면역조절제 (예를 들면 사이토카인 또는 B7 분자와 같은 면역자극제)이다. 또한 면역반응의 자극이 필요한 경우, 상기 조성물은 예를 들면 알룸, DETOX 면역보조제 (Ribi Immunochem Research, Inc.; Hamilton MT), 또는 프로인트 완전 또는 불완전 면역보조제와 같은 면역보조제를 포함할 수 있다. 면역보조제를 첨가하는 것은 본 발명의 펩티드의 면역성을 강화시킬 수 있으며, 따라서 면역반응을 자극하기 위한 항원의 양을 감소시킨다. 면역보조제는 항원의 존속을 연장시키거나, 동시-자극성 신호를 강화시키거나, 육아종 (granuloma) 형성을 유도하거나, 림프구의 비특이적 증식을 자극하거나, 또는 T 세포가 APC와 병치하는 것을 향상시킴으로써 면역반응을 증대시킬 수 있다.
또한 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은, 수중유 유상액, 미세유상액, 미셀 (micelle), 혼합된 미셀, 리포좀, 미세구 (microsphere) 또는 다른 중합체 매트릭스와 같은 캡슐화 물질내에 혼입될 수 있다 (예를 들면, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, FL 1984)] 및 문헌 [Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981] 참조). 예를 들면 인지질 또는 다른 지질로 구성된 리포솜은 비독성이고, 생리학적으로 허용 가능하며, 제조 및 투여가 상대적으로 간단한 대사가능 담체이다. "스텔스 (stealth)" 리포솜 (예를 들면, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,882,679호, 제5,395,619호 및 제5,225,212호 참조)은 상기 캡슐화 물질의 예이다. 양이온성 리포솜은 예를 들면, 특정 수용체 또는 리간드를 사용하여 변형될 수도 있다 (이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Morishita et al., J. Clin. Invest., 91: 2580-2585, 1993] 참조). 또한 폴리뉴클레오티드제는, 예를 들면 아데노바이러스-폴리리신 DNA 복합체 (이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Michael et al., J. Biol. Chem. 268: 6866-6869, 1993] 참조)를 이용하여 세포내로 도입될 수 있다.
따라서, 본 발명은 dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 부분 또는 이러한 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에 투여함으로써, 대상체의 면역반응을 조절하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, dnaJ hsp는 원핵생물 또는 진핵생물 dnaJ hsp, 예를 들면 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ hsp와 같은 박테리아 dnaJ hsp; 효모 dnaJ hsp와 같은 무척추동물 dnaJ hsp; 또는 HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2와 같은 인간 dnaJ hsp를 비롯한 포유동물 dnaJ hsp와 같은 척추동물 dnaJ hsp일 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 조성물 성분을 포함할 수 있는 본 발명의 펩티드는 인간 대상체 처치용 및 수의학용을 비롯한 의약으로서 유용할 수 있다.
본 발명의 방법은 면역반응과 관련된 염증반응을 증가시키거나 또는 면역반응과 관련된 염증반응을 감소시킴으로써 면역반응을 조절할 수 있다. 따라서 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에서의 염증반응을 증대시키거나 또는 유도하는 수단을 제공한다. 이러한 방법은 전염증성 활성을 갖는 펩티드, 즉 전염증성 펩티드를 면역화 조건하에서 대상체에 투여하거나; 관용화 조건하에서 항염증성 펩티드를 대상체에게 투여하거나; 또는 예를 들면 면역화 조건하에서 2종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하거나, 또는 관용화 조건하에서 2종 이상의 항염증성 펩티드를 투여하거나, 또는 면역화 조건하에서 1종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하고 관용화 조건하에서 1종 이상의 항염증성 펩티드를 투여하는 것과 같이 상기 펩티드의 조합물를 투여함으로써 수행될 수 있다. 염증반응을 증대시키거나 유도하는 방법은 대상체에서 IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 또는 IL-23과 같은 전염증성 사이토카인의 수준을 증가시키거나, 대상체에서 IL-4, IL-10 또는 TGF-β와 같은항염증성 사이토카인의 수준을 감소시키거나, 또는 이들의 조합을 초래한다.
또한 본 발명의 방법은, 면역화 조건하에서 대상체에게 항염증성 활성을 갖는 펩티드를 투여하거나; 관용화 조건하에서 대상체에게 전염증성 펩티드를 투여하거나; 또는 예를 들면 관용화 조건하에서 2종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하거나, 면역화 조건하에서 2종 이상의 항염증성 펩티드를 투여하거나, 또는 관용화 조건하에서 1종 이상의 전염증성 펩티드를 투여하고 면역화 조건하에서 1종 이상의 항염증성 펩티드를 투여하는 것과 같이 상기 펩티드의 조합물을 투여함으로써 대상체에서의 염증반응을 감소 또는 억제하는 수단을 제공한다. 이러한 방법은 대상체에서 IL-4, IL-10 또는 TGF-β와 같은 항염증성 사이토카인의 수준을 증가시키거나, 또는 IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 또는 IL-23과 같은 전염증성 사이토카인의 수준을 감소시키거나, 또는 이들의 조합을 초래한다.
본원에 기재된 바와 같이, 1종의 dnaJ hsp의 면역원성 펩티드 부분 또는 이들의 조합물, 예를 들면 서열 1 내지 26에 예시된 임의 1종의 면역원성 펩티드 또는 이들의 임의 조합물을 투여할 수 있다. 본 발명의 관점에서 숙련된 임상학자는, 펩티드가 전염증성 펩티드인지 또는 항염증성 펩티드인지, 그리고 펩티드가 염증반응을 증대 또는 유도하는지 아니면 염증반응을 감소 또는 억제하는지에 따라 면역화 조건 또는 관용화 조건하에서 본 발명의 펩티드를 대상체에게 투여된다는 것을 알 수 있을 것이다.
본원에 사용된 용어 "면역화 조건하에서"는 본 발명의 펩티드가 세포와 접촉하거나 또는 대상체에게 투여되어 면역 활성을 나타낼 수 있음을 말한다. 이와 같이, T 세포 면역원인 상기 펩티드는 일반적으로 면역화 유효량, 전형적으로 초회량 이후 몇시간 뒤 1회 이상의 추가 투여량으로 피부내, 피하 또는 근육내에 투여될 것이며, 필요한 경우 프로인트 완전 또는 불완전 면역보조제와 같은 면역보조제를 포함하는 조성물로 제제화될 것이다. 본원에 사용된 용어 "관용화 조건하에서"는 본 발명의 펩티드가 세포와 접촉하거나 또는 대상체에게 투여되어 다른 면역 활성에 대해 관용을 유도하는 것을 말한다. 그 결과 대상체는, 예를 들면 대상체가 상기 펩티드를 "자기 (self)"로 인식하고 면역반응이 발생하지 않는, 상기 펩티드에 대한 관용성을 갖게 된다. 관용화 유효량의 펩티드, 일반적으로 소량을 일정 시간 동안 피부내, 피하, 근육내, 또는 바람직하게는 점막 (예를 들면, 비강 흡입 또는 경구)에 투여함으로써 관용화 조건하에서 펩티드를 투여할 수 있다.
본 발명의 방법은 면역반응을 조절하는 것이 바람직한 임의의 증상을 가지고 있거나, 소인성이거나 감수성인 대상체, 예를 들면 면역 장애를 가지고 있거나 면역 장애에 대해 감수성 또는 소인성인 대상체에 대해 수행할 수 있다. 대상체는 일반적으로 척추동물 대상체, 특히 고양이, 개 또는 말과 같은 길들여진 동물; 양, 소 또는 돼지와 같은 농장 동물; 또는 인간을 비롯한 포유동물이다. 면역 장애는 자가면역 질환, 예를 들면 관절염 (예를 들면, 관절결핍성 유년형 특발성 관절염, oJIA) 또는 면역결핍 질환 (예를 들면, 후천성 면역결핍증, AIDS)과 같은 면역계의 장애일 수 있다. 면역반응을 조절하는 것이 바람직할 수 있는 추가의 증상에는 면역반응 (예를 들면, 감염 질환 또는 암에 대한 반응)이 충분하게 나타나지 않는 대상체의 증상, 또는 면역반응이 너무 과도하게 나타나는 대상체, 예를 들면, 자가면역 질환 이외의 염증성 장 질환에 걸린 대상체 또는 박테리아성 패혈증에 걸린 대상체의 증상이 포함된다.
본 발명의 방법 수행에 있어서 조성물의 총 투여량은 상대적으로 짧은 시간에 걸쳐 볼루스 (bolus)로서 또는 주입에 의해 대상체에게 단일 투여 형태로 투여될 수 있으며, 이후 소정의 시간에 걸쳐 1회 이상의 추가 투여량으로 더 투여될 수 있다. 대상체에서의 면역반응을 자극하기 위한 조성물 양은, 투여 경로 및 투여 횟수뿐만 아니라 대상체의 연령 및 건강 상태를 비롯한 다양한 인자에 의존한다. 숙련된 임상학자는 이러한 인자를 고려하여 특정 투여량이 필요에 따라 조정되는 것을 알 것이다. 일반적으로 상기 조성물의 제제화, 및 투여 경로 및 빈도는 임상시험 I상 (실시예 8 참조) 및 II상을 이용하여 1차적으로 결정된다.
바람직하게는, 본 발명의 면역원성 펩티드가 대상체의 위장관에서의 IgA 생성을 선택적으로 자극하고 경구 관용 (oral tolerance)을 유도하기에 충분한 방식으로 투여된다. 인간 또는 동물 대상체에게 항원을 투여하여 경구 관용을 유도하는 방법은 잘 알려져 있다 (예를 들면, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Husby et al., J. Immunol. 152: 4663-4670 (1994)] 참조). 따라서 관용이 요구되는 경우에 본 발명의 펩티드는, IgM을 IgA로 전환시키는 IgA 면역자극제 (예를 들면, 전신성 헬퍼 T 세포 활성도 억제할 수 있는 TGF-β)와 함께 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역원성 펩티드 및 (존재할 경우) IgA 면역자극제를 장에 투여하여 백신의 효과를 위장관에 집중시킨다. 그러나 본 발명의 펩티드는, 예를 들면 혈관내, 피부내, 피하, 근육내 또는 복막내 투여와 같이, 면역치료 분야에 허용된 임의의 다른 방식으로 투여될 수도 있다.
폴리뉴크레오티드는 면역학적 방법에서 흔히 사용되는 임의 방법으로, 특히 피부내로 투여될 수 있다 (예를 들면, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 출원 제08/446,691호 (1995년 6월 7일 출원), 또는 미국 특허 제08/593,554호 참조). 상기 개시된 문헌에 의하면, 재조합 유전자 발현 벡터는 주사, 흡수, 또는 숙주의 피부 또는 점막을 가로지르는 경피 전달에 의해 투여된다.
본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 방법은 환자의 연령, 체중 및 조건뿐만 아니라 이들의 조성에 따라 달라질 것이다. 그러나, 바람직한 펩티드 투여 방법으로는, 상기한 바와 같은 다른 치료형태의 존재여부와 무관하게, 면역학적 유효량의 백신을 일일 경구 (장내) 투여하거나, 또는 통상의 소염성 치료 (예, 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 소염제 및(또는) 진통제를 사용함)가 포함된다. 투여 빈도에 따라서, 본 발명의 각 펩티드 백신의 면역학적 유효량은, 항원성 단백질 또는 펩티드 약 10 ㎍ 내지 100 ㎎, 일반적으로 약 100 ㎍ 내지 100 ㎎, 통상적으로 약 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 및 특히 약 25 ㎎이다. 항원성 펩티드의 일일 투여량은 일반적으로 1일 당 1㎎의 양으로 투여된다.
본 발명의 방법에 따라 투여되는 폴리뉴클레오티드의 투여량은, 숙주가 원하는 반응 및 사용된 벡터에 의해 달성할 수 있는 유전자 발현 수준에 따라 달라진다. 피부 또는 점막을 통해 투여된 약 0.3 ㎍ 정도의 소량의 폴리뉴클레오티드가 장기간 동안 지속적인 면역반응을 유도할 수는 있지만, 피부내 경로에 의한 있는그대로의 (naked) 폴리뉴클레오티드 투여시 일반적으로 100 ㎍ 내지 200 ㎍의 폴리뉴클레오티드가 단일 투여량으로 투여될 수 있다. 그러나 본 발명에서는, 상기 있는 그대로의 유전자 발현 벡터가 코딩된 면역원성 펩티드를 발현시키기에 충분한 양으로 공급되면 충분하다. 이러한 투여량은 서로 다른 발현 수준을 달성하기 위해 변형될 수 있으며, 그 결과 면역화 유효량 또는 관용화 유효량을 제공한다. 발현된 펩티드의 존재 및 양을 확인하기 위한 수단은 당업계에 잘 알려져 있으며, 여기에는 효소-결합 면역흡착 분석법, PCR 기술 및 면역조직학적 분석과 같은 면역분석법이 포함된다. 폴리뉴클레오티드의 투여량은 상기 검출 및 정량 수단뿐만 아니라, 임상 업계 종사자들에게 알려진 생체내 임상학적 신호에 의해 제공된 정보에 근거하여 원하는 발현 수준을 달성하도록 조정될 수 있다.
통상적 투여량의 면역자극제 또는 면역억제제는 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 함께 조성물에 포함될 수 있거나, 또는 상기 펩티드의 투여 시점이나 그 이전 또는 이후에 별도로 투여될 수 있다 (예를 들면, 약 1 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg의 IL-6). 이러한 투여량은 당업계에 알려진 정보에 기초하거나, 또는 일반적으로 수행되는 방법을 이용하여 쉽게 확인할 수 있다. 초기단계 환자의 치료는 대리자료 종료점 (surrogate end-point)을 관찰할 때까지, 관찰 시점까지 또는 관찰 시점을 지나서까지 계속될 수 있다.
질병에 대해 소인성이지만 아직 질병이 발달하지 않은 대상체에 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것은, 예를 들면 위장관의 체액 또는 환자의 말초혈관 순환 체액에서 항-dnaJ 펩티드 IgA를 검출할 수 있을 정도로 충분히증가시키는 조성물을 1회 이상의 투여량으로 단기간 투여함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 백신은 질병의 초기단계에 환자에게 사용하는 것이 바람직하다.
시간에 따른 본 발명 치료 방법의 효능은, 면역 장애에 대해 소인성이지만 치료 개시 시점에서 아직 상기 장애의 신호 또는 징후가 나타나지 않은 대상체에서 상기 면역 장애의 징후 또는 임상학적 신호가 없는 것에 의해 확인 될 수 있다. 면역 장애, 또는 면역반응을 조절하는 것이 바람직한 다른 증상을 갖고 있는 것으로 진단된 환자의 경우, 본 발명의 방법에 대한 효능은 대상체에서의 신호 또는 징후의 심각성이 감소되는 것에 의해, 또는 상기 장애에 대한 대리자료 종료점이 발생하는 것에 의해 평가할 수 있다.
자가면역 관절염과 같은 면역 장애에 관해서는, 관절염의 임상학적 신호 및 징후, 및 상기 질병의 대리자료 종료점에 대한 통상의 매개변수가 당업계에 잘 알려져 있으며, 여기에는 관절 유연성에 대한 "리치 인덱스 (Ritchie Index)" 측정 수행 (Ritchie et al., Quart. J. Med., 37: 393-406 (1968)), 부어오른 관절의 수 측정, 조조 관절 경직의 매일 지속기간 측정, 그립 (grip) 강도 측정 또는 시각적 연속변화 척도 (visual analogue scale)상의 통증 강도 측정 (Huskisson, Lancet 2: 1127-1131 (1974)), 및 환자에 사용한 소염제 또는 진통제의 상대적인 양 측정이 포함된다. 예를 들면 질병 지속기간, 적혈구 침강 속도 (ESR), C-반응성 단백질 (CRP)의 양, 활성 관절의 수 (NAA), 관절 인덱스의 심각성 (CSA), 완화 간격, 유아 건강 평가 질문서 (CHAQ) 및 dnaJ 펩티드 처리에 대한 반응 (반응자 대 비반응자로 특징을 나타냄)을 비롯한, 추가의 통상적인 임상학적 매개변수도 이후 이용될 수 있다.
이. 콜라이 (E. coli) 추출물에 대한 임상학적 이중맹검법 (Brackertz et al., J. Rheum. 16: 19-23, 1989) 결과에 근거하여, 본 발명의 조성물 투여로 인한 대상체에서의 불리한 부작용이 거의 나타나지 않을 것으로 기대된다. 예를 들면, 위장 자극이 발생할 수 있으나, 약할 것으로 기대된다. 상기 조성물의 독성은, 적혈구용적률 (hematocrit), 헤모글로빈, 혈소판 및 류머티스성 인자 수준과 같은 변수들의 분석뿐만 아니라 혈액 화학의 분석을 통한 주기적 실험 평가와 같은 통상의 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명은 또한 면역작용 세포의 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 예를 들면 면역작용 세포를 dnaJ hsp의 소정 펩티드 부분 또는 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시켜 수행할 수 있다. 상기 펩티드가 유래된 dnaJ hsp는 원핵생물 또는 진핵생물 dnaJ hsp를 비롯하여, 본원에 개시되거나 또는 당업자에게 알려진 임의의 dnaJ hsp일 수 있으며, 필요한 경우, 면역보조제 또는 다른 면역조절제, 예를 들면, 1종 이상의 사이토카인을 또한 함유할 수 있는 조성물로 제제화될 수 있지만, 이것이 필수적인 것은 아니다. 수상세포 및 특히 T 세포와 같은 항원 제시 세포를 비롯하여, T 세포 매개의 면역반응과 관련된 임의의 세포일 수 있는 면역작용 세포는 대상체에게 펩티드를 투여함으로써 생체내에서 펩티드와 접촉시킬 수 있거나, 또는 시험관내에서 접촉시킬 수 있다.
면역작용 세포를 생체내에서 (또는 생체외에서) 접촉시킨 경우, 상기 방법은접촉시킨 면역작용 세포를 대상체에게 투여하여 대상체의 면역반응을 조절하는 수단을 제공하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 면역작용 세포는, 환자로부터 얻은 세포를 생체외에서 펩티드와 접촉시킨 후 대상체에게 다시 투여하는, 대상체에 대해 자기유래의 세포일 수 있다. 이러한 방법은 면역작용 세포를 시험관내에서 증식시킬 수 있고, 이후 필요한 경우에, 증식된 세포군집을 대상체에게 투여할 수 있다는 이점을 제공한다. 상기 면역작용 세포는 또한 대상체에 대해 동종이형의 세포, 예를 들면 대상체와 관련된 개체에서 선택되고, 대상체와 공통적인 일배체형을 공유하는 세포, 또는 일배체형이 알려져 있고 일배체형이 대상체와 적어도 부분적으로 일치하는 세포주의 군집에서 선택된 세포일 수 있다. 상기 세포는, 대상체에 투여시 대상체에서의 염증반응을 증대 또는 유도하거나, 또는 대상체에서의 염증반응을 감소 또는 억제하여 대상체의 면역반응을 조절할 수 있다.
하기 실시예는 설명을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ에 대한 세포성 면역반응
재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ (dnaJ)에 대한, 10명의 건강한 대상체 ("대조군")와 21명의 관절결핍성 유년형 특발성 관절염 ("oJIA") 환자에서의 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)의 증식 반응은 유의하게 다르지 않았다 (도 1A). 염증 활액 부위에서 dnaJ-특이적 T 세포가 증가하였는지를 측정하기 위해, 모든 oJIA 환자에서의 활액 단핵 세포 (SFMC)를 dnaJ로 96 시간 동안 자극시켰다. SFMC의 평균 자극 인덱스 (SI)는, 이에 상응하는 PBMC의 SI보다 유의하게 높았다 (p=0.01; 도1A). 또한 dnaJ로 자극시킨 이후, 활성화된 T 세포 (CD3+CD69+ 세포로 밝혀짐)의 백분율은 PBMC 경우 보다 SFMC에서 유의하게 높았다 (p=0.0002; 도 1B).
dnaJ에 대한 상기 SFMC의 반응 증가는 SFMC 활성의 비-특이적 증가로 인한 부수적인 것이 아님을 확인하기 위해, 관계없는 기억 항원 (memory antigen)으로서의 파상풍 독소 (tetanus toxoid, TT)에 대한 상기 2개 군에서의 세포 증식 반응을 측정하였다. TT에 대한 증식 반응은 PBMC (평균 SI=12.3)와 비교하여 SFMC (평균 SI=6.0)에서 더 높았다. dnaJ 및 TT에 대한, PBMC 및 SFMC의 반응상 차이점을 비교하기 위해, 상기 2개 항원 각각에 대한 상기 2개 군에서의 자극 인덱스 비율을 계산하였다. 도 1C에 나타난 바와 같이, SI SFMC/SI PBMC 비율은 TT로 자극시켰을 때보다 dnaJ로 자극시켰을 때 유의하게 높았다 (p=0.038).
건강한 대조군에서의 PBMC 시료, 및 oJIA 환자군에서의 PBMC-SFMC 쌍의 시료에 dnaJ를 처리하거나 처리하지 않고 72 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 배양 상층액에서 전염증성 사이토카인 (인터페론-감마 (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-알파 (TNF- α))과 항염증성 사이토카인 (인터루킨-4 (IL-4) 및 IL-10)의 생성을 측정하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 환자군 및 대조군의 PBMC로부터 생성된 사이토카인의 양은 서로 차이가 없었다. 사이토카인 생성에 대해 상기 PBMC-SFMC 쌍의 시료를 분석한 결과, oJIA 환자군에서의 이러한 dnaJ 자극은 PBMC보다 SFMC에서 유의하게 더 많은 IFN-γ 생성을 유도 (p<0.01)한다는 것이 밝혀졌고, IFN-γ 생성은 질병 지속기간에 유의하게 반비례하였다 (R=-0.40, p=0.034). TNF-α 및 IL-10 생성은 상기 2개 군에서 거의 유사하였다. PBMC 및 SFMC의 상층액에서의 IL-4 수준은 대조군 및 환자군에서 모두 검출한계 미만이었다.
재조합 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ 단백질을 oJIA 환자의 SFMC에 72 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 관계없는 대조 펩티드, 즉 난알부민 (ovalbumin, OVA), 또는 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ 유래 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서, 자기유래의 조사된 공급세포 (autologous irradiated feeder cell)를 이용하여 72 시간 동안 재자극시켜, 상기 SFMC의 전염증성 및 항염증성 사이토카인 생산을 배양 상층액으로부터 측정한 결과를 표 1에 나타내었다. 결과를 pg/㎖ (평균값+표준편차)로 나타내었다..
상기 결과는 dnaJ에 대한 증식 반응 및 IFN-γ 생성이 oJIA 환자의 말초혈액에서보다 활액 구획에서 더 높다는 것을 나타내며, 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ또는 상동성 단백질 또는 그의 펩티드 부분이 관절 염증과정에서 소정의 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2:재조합 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ에서 유래한 합성 펩티드에 대한 세포성 면역반응
박테리아 dnaJ 단백질의 가능한 관련-에피토프 (epitope)를 밝혀내기 위해, oJIA 환자군의 PBMC 및 SFMC를 dnaJ와 72 시간 동안 인큐베이션시키고, 선택된 이. 콜라이 (E. coli)-유래 MHC 클래스 II 결합 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 자기유래의 공급세포를 이용하여 96 시간 동안 재자극시켰다. 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ의 N-말단 영역에서 유래하였고, 각각 3종의 인간 dnaJ 이성체 (HDJ1, HDJ2, HSJ1: 상동성 펩티드)와 서열 상동성을 나타내는 3종의 펩티드 (pep4, pep22, pep174), 및 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ의 C-말단 영역에서 유래하였고, 인간 이성체와 전혀 상동성을 나타내지 않는 5종의 펩티드 (pep61, pep209, pep242, pep264, pep268; 비-상동성 펩티드)를 비롯하여 총 8종의 펩티드를 시험하였다.
PBMC를 이. 콜라이 (E. coli) 유래 펩티드로 자극하였을 경우, 증식 반응이 매우 낮았고 (SI<1), 전염증성 또는 항염증성 사이토카인이 거의 생성되지 않았다. 이와는 반대로, 상기 모든 펩티드에 대해 반응하여 증식된 SFMC는, 정도의 차이는 있지만, 펩티드 22, 61, 174 또는 268이 존재하는 경우 평균 SI가 6 이상이었다 (도 3). 상기 반응에 대한 특이성을 측정하기 위해, SFMC를 dnaJ와 인큐베이션시키고 그 후 관계없는 OVA 펩티드의 존재하에서 재자극시켰다. oJIA를 갖지 않은 HLAB27＋ 환자 (n=4)의 SFMC는 각각의 박테리아 펩티드와 반응하여 3 미만의 평균 SI를 나타내었다. 상기 결과는 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ 유래 펩티드에 대한 높은 증식 반응이 질병에 특이적임을 시사한다. oJIA 환자의 SMFC 배양 상층액에서, 동일 펩티드에 대한 사이토카인 생성을 시험하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 각각의 이. 콜라이 (E. coli) 유래 펩티드와 접촉시킨 후 전염증성 사이토카인의 생성이 검출가능하였다. oJIA 환자 21명 중 단지 1명의 SFMC만이 검출가능한 수준의 항염증성 사이토카인 IL-10을 생성하였으며, 검출 가능한 수준의 IL-4는 모두에게서 생성되지 않았다.
시험된 전염증성 사이토카인 중, IFN-γ의 생성은 펩티드 4 및 264를 제외한 모든 박테리아 펩티드에 대한 증식반응과 유의하게 높은 상관성을 나타내었다 (표 2). 이러한 상관성은 SI를 6 이상으로 유도하는 펩티드 22, 61, 174 및 268에서 강하게 나타났고, 이것은 상기 펩티드가 염증부위에서의 관련 표적 에피토프일 수 있음을 의미한다. 또한, 펩티드 209, 242 또는 264를 사용한 자극에 반응하여 생성된 IFN-γ는 CRP및 ESR 값에 유의하게 높은 상관성을 나타내었다. 표 2는 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ로 자극한 후, 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ 유래 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 자기유래의 조사된 공급세포를 이용하여 재자극시킨 oJIA 환자의 SFMC 배양 상층액에서의 IFN-γ생성 수준과, 동일한 펩티드로 SFMC를 자극하여 유도된 자극 인덱스 (SI), ESR 또는 CRP 값 사이의 상관성을 나타낸다.
실시예 3: 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ와 상동성 또는 비-상동성인 인간 HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2 펩티드에 대한 세포성 면역반응
인간 상동성 펩티드가 자가 반응성을 유도하는 교차-인식의 표적이 될 수 있는지를 평가하기 위해, 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ와 서열 상동성을 갖는 HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2 영역에서 유래한 인간 펩티드에 대해 연구하였다. 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ에 대해 3을 초과하는 SI를 나타내는 oJIA 환자 14명의 SFMC를, 박테리아 펩티드 4의 상동체인 인간 펩티드 2, 3 또는 5; 박테리아 펩티드 22의 상동체인 인간 펩티드 20, 21 또는 23; 또는 박테리아 펩티드 174의 상동체인 인간 펩티드 164, 167 또는 176이 존재하거나 존재하지 않은 상태에서 자기유래의 세포를 이용하여 96 시간 동안 재자극시켰다. 인간 dnaJ 단백질에서 유래한 펩티드 및 상동성 박테리아 펩티드간의 SFMC 증식 반응, 전염증성 사이토카인 생성 및 항염증성 IL-4 수준은 전반적으로 유사하였다.
표 3은 재조합 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ와 72 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ 유래 펩티드 또는 인간 dnaJ 이성체 (HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2)에서 유래한 상동성 펩티드가 존재하거나 존재하지 않은 상태에서 자기유래의 조사된 공급세포을 이용하여 재자극시킨 oJIA 환자의 SFMC에서의 증식 반응 및 사이토카인 생성을 나타낸다. 결과를 SI 또는 pg/㎖ (평균값+표준편차)로 나타내었다.
단지 인간 펩티드 5만이 이것의 박테리아 상동성 펩티드에 대한 반응에서보다 유의하게 더 높은 증식 반응 및 IFN-γ 생성 (각각 p<0.03 및 p<0.05)을 유도하여, 유일한 차이점이 관찰되었다. 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ와 서열 상동성을 갖지 않는, HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2 단백질 영역에서 유래한 인간 펩티드 9종의반응성을 측정했을 때에도 이와 유사한 결과가 관찰되었다. 박테리아 펩티드에서 얻은 결과와 대조적으로, 박테리아 펩티드와 상동성인 펩티드 또는 비-상동성인 펩티드를 비롯한 인간 펩티드로 자극시킨 SFMC의 배양 상층액에서의 IL-10 생성은, 정도의 차이는 있지만 검출가능하였다. IL-10의 평균 생성은 상동성 인간 펩티드로 자극시켰을 때 (7.7±7.0 pg/㎖)보다 비-상동성 인간 펩티드로 자극시켰을 때 (27.1±10.3 pg/㎖) 더 높았고 (도 4), 상동성 인간 펩티드 20, 21 및 23에서 특히 분명하였으며, 박테리아 상동체 (펩티드 22)의 경우와 유사하게, IL-10의 생성을 검출 가능한 수준으로 유도하지 않았다 (도 4). 이러한 에피토프 매핑 (mapping) 실험은, 서로 다른 펩티드를 사용하면 서로 다른 생물학적 효과가 발생한다는 것과, 이러한 효과가 질병 특이적임을 보여준다.
상기 결과는, 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ와 접촉하여 유도된 인간 dnaJ 단백질의 서로 다른 이성체 펩티드에 대한 면역반응이 항염증성 IL-10 생성을 통해 조절 역할을 할 수 있고, 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ에 대한 전염증성 반응은 박테리아 펩티드 및 이것의 인간 대응물에서 유래한 펩티드의 상동성 관련-에피토프에 의해 영구지속될 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 시료채취 시점에 확장된 결핍성관절염 (extended oligoarthritis)을 나타내는 3명의 환자에서의 IL-10 생성을 검사함으로써 확인하였고, 여기에서 박테리아 또는 인간 펩티드는 IL-10의 생성이 감소된 것으로 나타났고, 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ 유래 펩티드에 대해 비-상동성인 인간 펩티드 50, 254, 256 및 283로 자극된 경우에 특히 그러하였다.
실시예 4: 인간 비-상동성 펩티드로 인한 증식 및 사이토카인 생성
박테리아 dnaJ 펩티드 이성체의 비-상동성 영역에서 유래한 일련의 인간 펩티드를 비롯한, 추가의 펩티드를 상기한 바와 같이 시험하였다. 도 6은 비-상동성 펩티드 50, 51, 134, 197, 254, 256, 270, 283 및 318에 대한 SI를 나타낸다. 이들 펩티드로 인한 IFN-γ, TNF-α 및 IL-10의 수준을 도 7 내지 도 9에 각각 나타내었다.
실시예 5: 박테리아 펩티드 및 그의 인간 상동체에 반응한 증식 및 사이토카인 생성
다양한 박테리아 펩티드의 자극에 반응한 증식 및 사이토카인 생성을 측정하고, 이 박테리아 펩티드의 인간 상동체의 자극에 의한 반응과 비교하였다. 박테리아 dnaJ, 및 인간 상동성 펩티드 2 (HSJ1), 3 (HDJ1) 및 5 (HDJ2)에 반응한 SI를 도 10에 나타내었다. 상기 펩티드로 인한 TNF-α, IFN-γ 및 IL-10 수준을 도 11 내지 도 13에 각각 나타내었다. 비교용으로, 박테리아 펩티드 dnaJ, 4, 22, 61, 174, 209, 242, 264 및 268에 반응한 SI를 도 14에 나타내었다. 박테리아 dnaJ 174 및 상동성 인간 펩티드 164 (HSJ1), 167 (HDJ2) 및 176 (HSJ1)에 반응한 TNF-α, IFN-γ 및 IL-10 수준을 도 15 내지 도 18에 각각 나타내었다. 박테리아 dnaJ 22 및 상동성 인간 펩티드 20 (HSJ1), 21 (HDJ2) 및 23 (HSJ1)에 반응한 SI, TNF-α, IFN-γ 및 IL-10 수준을 각각 도 19 내지 도 22에 나타내었다.
실시예 6: 시험관내 분석과 임상학적 결과간의 상관성
증식 및 사이토카인 분석에 대한 상기 결과를, 동일한 환자에서의 질병 지속기간, 적혈구 침강 속도 (ESR), C-반응성 단백질 (CRP)의 양, 활성 관절의 수(NAA), 관절 인덱스의 심각성 (CSA), 완화 간격, 유아 건강 평가 질문서 (CHAQ) 및 dnaJ 펩티드 처리에 대한 반응 ("반응자 대 비반응자")을 비롯한, 임상학적 매개변수와 비교하였다. 표 4 내지 10에 나타낸 바와 같이, dnaJ 펩티드 치료에 반응성을 나타낸 관절염 환자는 이들의 단핵 세포와, 단지 인간 이성체에만 있는 펩티드 (즉, 비-상동성 인간 펩티드)에 의한 자극을 이용한 시험관내 증식 및 사이토카인 분석으로 결정된 바와 같이 양호한 결과를 나타내었다. 상기 관찰 결과와 동일하게, dnaJ 펩티드가 처리되었고 소수 관절보다 더 확장된 관절염 ("확장된 파우시 (extended Pauci)")을 갖는 환자를 평가한 결과, 확장된 파우시 환자는 상기 비-상동성 인간 펩티드에 대해 잘 반응하지 않았다 (표 11).
| 환자 (n=21) | R | P |
| 스피어만 (Spearman) 질병 지속기간 대 CD69 총량 | -0.52 | 0.02 |
| 스피어만 질병 지속기간 대 TNF pep h20 | 0.68 | 0.01 |
| 스피어만 ESR 대 IL-10 pep h23 | 0.77 | 0.005 |
| 스피어만 | R | P |
| 초기 CRP 대 SI pep 4 | -0.67 | 0.004 |
| 초기 CRP 대 TNF pep 4 | -0.59 | 0.02 |
| 초기 CRP 대 SI pep 209 | -0.52 | 0.037 |
| 초기 CRP 대 SI pep 264 | -0.51 | 0.043 |
| 초기 CRP 대 IL-10 pep h23 | 0.72 | 0.008 |
| 초기 CRP 대 IL-10 pep h3 homol.pep 4 | 0.73 | 0.022 |
| 초기 CRP 대 IL-10 pep h5 homol.pep 4 | 0.79 | 0.011 |
| 스피어만 | R | P |
| NAA 대 IL-10 pep h164 | 0.62 | 0.022 |
| 스피어만 | R | P |
| CSA 대 SI dnaJ | 0.51 | 0.02 |
| CSA 대 SI h50 nonhomol. | 0.75 | 0.018 |
| CSA 대 TNF pep 242 | 0.48 | 0.03 |
| 만-휘트니 (Mann-Whitney) | |
| 반응자 (6개월) 대 SI pep 268 | 0.049 |
| 반응자 (6개월) 대 SI h167 homol.174 | 0.037>반응자 |
| 반응자 (6개월) 대 IFN 174 | 0.012>반응자 |
| 반응자 (6개월) 대 SI h20 homol.22 | >반응자 |
| 반응자 (6개월) 대 IFN 22 | >반응자 |
| 반응자 (6개월) 대 SI h270 nonhomol. | 0.034>반응자 |
| 반응자 (6개월) 대 IFN 4 | 0.034>반응자 |
| 반응자 (6개월) 대 IL-10 dnaJ | 0.024>비-반응자 |
| 스피어만 | R | P |
| Rem int. 대 SI dnaJ | 0.53 | 0.049 |
| Rem int. 대 SI 174 | 0.6 | 0.021 |
| Rem int. 대 SI 209 | 0.61 | 0.02 |
| Rem int. 대 SI 268 | 0.56 | 0.038 |
| Rem int. 대 IFN 174 | 0.68 | 0.019 |
| Rem int. 대 IFN 22 | 0.71 | 0.009 |
| R | P | |
| CHAQ 대 SI dnaJ | -0.49 | 0.037 |
| CHAQ 대 SI 174 | -0.63 | 0.005 |
| CHAQ 대 ST 268 | -0.56 | 0.015 |
| CHAQ 대 ST 209 | -0.5 | 0.032 |
| CHAQ 대 SI h20 | -0.54 | 0.043 |
| CHAQ 대 IFN dnaJ | -0.56 | 0.017 |
| CHAQ 대 IFN 174 | -0.61 | 0.006 |
| CHAQ 대 IFN 268 | -0.59 | 0.009 |
| CHAQ 대 IFN 22 | -0.6 | 0.0076 |
| CHAQ 대 IFN 61 | -0.56 | 0.015 |
| CHAQ 대 IFN h167(homol.174) | -0.59 | 0.04 |
| CHAQ 대 TNF 174 | -0.57 | 0.011 |
| CHAQ 대 TNF 22 | -0.57 | 0.011 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.50 | -0.49 | 0.036 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.51 | -0.5 | 0.034 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.134 | -0.49 | 0.036 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.197 | -0.6 | 0.01 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.254 | -0.49 | 0.036 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.256 | -0.49 | 0.036 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.270 | -0.49 | 0.036 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.283 | -0.49 | 0.036 |
| CHAQ 대 IFN-γHu.nonhomol.318 | -0.5 | 0.034 |
| 만 휘트니 | |
| IFN-γ 22 | 0.033 |
| IFN-γ 174 | 0.427 |
| IFN-γ h164 homol.174 | 0.037 |
| IFN-γ h167 homol.174 | 0.037 |
| IFN-γ h176 homol.174 | 0.037 |
| IFN-γ 22 | 0.032 |
| IFN-γ 268 | 0.044 |
| 파우시 (n=14) 대 확장된 파우시 (n=7) |
실시예 7: oJIA 환자의 활액 단핵 세포내의 박테리아 HSP dnaJ 에피토프에 대한면역반응
이. 콜라이 (E. coli) dnaJ 열 충격 단백질 전체에 대한 T 세포 반응은 우세적으로 TH-1 형이었고, 활액 구획에 한정되었다. oJIA 환자에서의 SFMC 반응을 동일 환자에서의 PBMC 반응과 비교했을 때, T 세포 증식 (SI) 및 IFN 생성이 유의하게 증가하였다. T 세포 항원으로서 시험된 박테리아 dnaJ 기원의 팬 (pan)-DR 결합 펩티드 8종 중에서 4종에 대한 oJIA 환자의 SFMC에서의 반응은 전신성 및 과다성관절염 (polyarticular) JIA 환자 14명이 포함된 질병 대조군에서의 SFMC 경우보다 유의하게 증가하였다 (도 23). 이러한 반응은 또한, 시험관내에서의 각 펩티드로 인한 IFN 생성 및 조절성 사이토카인의 검출 불가능한 수준에 의해 알 수 있는 바와 같이 전염증성 성질의 것이다. 이러한 반응성은 서로 다른 JIA 형을 갖고 있는 14 명의 환자뿐만 아니라, 단지 무시할만한 반응을 나타낸 동일 연령의 건강한 대조군의 PBMC 및 SFMC와 같이 구획, 항원 및 질병에 특이적이다.
최초 항원에 대한 반응성을, 팬 DR 결합 디자이너 펩티드 (pan DR binder designer peptide, pandr)를 비롯한 무관한 대조군 펩티드 및 이. 콜라이 (E. coli) 유래의 변경된 펩티드 리간드 (dnaJpv)의 반응성과 서로 비교하였을 때 유의한 차이점을 발견하였다 (도 23 참조). 재조합 dnaJ에 대한 SFMC의 증가된 반응은 SFMC 반응성의 비특이적 증가로 인한 부수적인 것이 아니었다. oJIA 환자 7명에서, 관계없는 기억 항원으로서의 파상풍 독소 (TT)에 대해 양쪽 구획에서의 세포가 나타내는 증식 반응을 시험하였다. 재조합 dnaJ 및 TT에 대한 PBMC 및 SFMC의 반응 차이를 비교하기 위해, 상기 2종의 항원 각각에 대해 양쪽 구획에서 얻어진 자극 인덱스 비율을 계산하였다. SI SFMC/SI PBMC 비율은 TT로 자극시킨 경우보다 재조합 dnaJ로 자극시킨 경우에서 유의하게 높았다 (p<0.02).
상기 결과는, o-JIA 환자의 활액 구획에서의 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ 에피토프에 대한 현저한 반응성을 나타내며, 이 반응이 염증 부위에서 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 이러한 역할은 자가면역 염증의 조절과 관련될 수 있고, 활액 부위에서 과다발현될 수 있는, 박테리아 단백질 및 이것의 인간 등가물 상의 서로 다른 에피토프간의 상호작용에 근거할 수 있다. 이와 같이, 이러한 추정의 에피토프의 본질을 조사하였다.
면역성의 박테리아 펩티드 4종 중 2종 (22 및 174)은 인간 dnaJ 단백질 (HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2)과 서열 상동성을 갖는 이. 콜라이 (E. coli) hsp dnaJ 영역에서 유래하였기 때문에, 교차 인식으로 인한 자가 반응성의 가능성을 평가하였다. 상동성 인간 펩티드 20, 21 및 23 (박테리아 펩티드 22의 상동체) 및 펩티드 164, 167 내지 181, 및 176 (박테리아 펩티드 174의 상동체), 및 비-상동성 인간 펩티드를 조사하였다. 상기 펩티드는 T 세포 반응성을 유도하였으며, 증식 및 INF-γ 생성은 이에 상응하는 상동성 박테리아 펩티드로 자극한 후에 얻은 것과 필적하였다. 상기 인간 펩티드에 대한 SI 및 IFN-γ 반응은, 박테리아 상동체의 존재하에서 얻어지는 SI 및 IFN-γ 반응과의 높은 관련성을 나타내었다. 상기 결과는 교차-인식을 통한, 박테리아 펩티드에 대한 T 세포 반응과 인간 상동성 펩티드에 대한 T 세포 반응간의 상관성을 나타낸다. 박테리아 펩티드를 사용하여 얻은 결과와 대조적으로, 인간 dnaJ 펩티드에서 유래한 펩티드로 자극시킨 SFMC 배양 상층액에서 IL-10이 검출 가능한 수준으로 검출되었고, IL-4는 검출되지 않았다. 상기 결과는 자가 항원이 정성적으로 다른 T 세포 반응을 일으킬 수 있음을 추가로 입증한 것이다.
지속적인 (persistent) oJIA 환자에서의 대표적인 SFMC를 비-상동성 인간 펩티드 134로 자극시킨 후, FACS 분석을 이용하여 CTLA+/CD25/CD4 포지티브 (positive) 세포의 백분율을 측정하였다. 조절 기능을 갖고 있는 것으로 알려진 CTLA+/CD25/CD4 포지티브 세포의 ％는 대조군 조건하에서 유지시킨 세포와 비교했을 때 펩티드를 처리한 세포에서 더 높았다 (도 24a). 펩티드 134에 의한 조절 세포의 확장은 동일한 배양 조건에서의 IL-10 생성과 높은 상관성을 나타내었다 (도 24b). 상기 결과는 인간 dnaJ 134 펩티드의 인식으로 조절 세포의 확장 및 IL-10 생성이 유도된다는 것을 입증한 것이다.
임상학적 특징과 펩티드-유도 면역 조절 전개간의 가능한 상관성을 확인하기 위해, oJIA 환자를 질병 단계에 따라 o-JIA의 지속적인 질병 환자군 (n=16), 및 확장된 질병 환자군 (n=15)이 포함된 군으로 분류하였다 (도 25). 펩티드 134에 의한 확장된 질병 환자군 시료의 증식 반응은 지속적인 o-JIA 환자군보다 유의하게 더 낮았다 (p=0.05, 도 25a 및 도 25b). 또한, IFN 생성에 대해 통계학적 유의성의 경계선 수준 (p=0.076)이 관찰되었다. IL-10 생성을 고려하였을 때 매우 유의한 차이가 발견되었다 (p=0.0012, 도 25c 참조).
양성 (benign) 질병과의 가능한 관련성을 추가 분석하기 위해, 주사 가능한 스테로이드 TXA를 관절내부에 투여한 후 시험 관절의 임상학적 완화 지속기간을 각관절에서의 염증 활성 정도의 척도로 사용하였다. 비-상동성 인간 펩티드 134에 반응한 IL-10 생성은 각 관절의 임상학적 완화 지속기간과 높은 상관성을 나타내었다 (R=0.537, p=0.026). 상기 결과는 면역조절성 자가 에피토프의 인식이 질병 완화와 연관되어 있음을 나타낸다.
실시예 8: dnaJP1 펩티드는 류마티스성 관절염 환자에서 전염증성 에피토프를 제공한다.
류마티스성 관절염 (RA) 환자의 말초 혈액 및 활액 세포에서 T 세포 증식 및 전염증성 사이토카인의 생성을 촉발시키는 hsp dnaJ 단백질로부터의 펩티드를 동정하였다. 상기 펩티드, 즉 dnaJ P1 (QKRAAYDQYGHAAFE; 서열 27)은 RA 관련 HLA 대립유전자 중에 공통적인 아미노산 5개의 스트레치 (stretch)인 "공유 에피토프"와 서열 상동성을 공유한다 (이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Albani et al., Nat. Med. 1: 448-52, 1995] 참조). RA에 있어서, HLA와 dnaJ 유래 펩티드간의 상호작용이 T 세포를 유지시키고 자극시키며, 이것이 자가면역 염증에 관여하는지를 결정하기 위한 시험을 수행하였다. 이러한 T 세포군은 I상 면역 관용도 (Phase I Immune Tolerization) 연구에 표적으로 이용되어 왔다.
임상시험 I상에서는, dnaJP1을 15명의 RA 환자에게 3종의 서로 다른 투여량 (1일 4회, 경구투여)으로 6개월간 투여하였다. 허가 기준은 임상학적으로 활동중인 질병 및 시험관내에서의 상기 펩티드에 대한 전염증성 T 세포의 반응성을 요구하였다. 도 26에 나타난 바와 같이, dnaJP1에 대한 점막 관용화는 전염증성 사이토카인에서 조절형 사이토카인까지의 극적인 면역 편차를 유도하였다. 상기 면역변화는 처리에 특이적이고 처리에 의해 유도된 것이었다.
비록 상기 실시예를 참고로 하여 본 발명을 기재하였지만, 이들의 변경 및 변화는 본 발명의 정신 및 범위내에 있음을 이해할 것이다. 따라서 본 발명은 단지 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.
Claims (73)
- dnaJ 열 충격 단백질 (hsp)의 면역원성 펩티드 부분을 대상체에게 투여하여 대상체의 면역반응을 조절하는 것을 포함하는, 대상체의 면역반응을 조절하는 방법.
- 제1항에 있어서, dnaJ hsp가 박테리아 dnaJ hsp인 방법.
- 제2항에 있어서, 박테리아 dnaJ hsp가 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ hsp인 방법.
- 제3항에 있어서, 펩티드가QDYYEILGVSKTAEE (서열 1),RKAYKRLAMKYHPDR (서열 2),QKRAAYDQYGHAAFEQ (서열 3),QGFFAVQQTCPHCQG (서열 4),SKTLSVKIPGAVDTG (서열 5),GDLYVQVQVKQHPIF (서열 6),YCEVPINFAMAALGG (서열 7),PINFAMAALGGEIEV (서열 8), 또는이들의 임의 조합물인 방법.
- 제1항에 있어서, dnaJ hsp가 진핵생물 dnaJ hsp인 방법.
- 제5항에 있어서, 진핵생물 dnaJ hsp가 효모 dnaJ hsp 또는 척추동물 dnaJ hsp인 방법.
- 제6항에 있어서, 척추동물 dnaJ hsp가 인간 dnaJ hsp인 방법.
- 제7항에 있어서, 인간 dnaJ hsp가 HSJ1, HDJ1 또는 HDJ2인 방법.
- 제8항에 있어서, 펩티드가 박테리아 dnaJ hsp의 소정 펩티드 부분에 대해 상동성이 있는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 펩티드가ASYYEILDVPRSASA (서열 9),KDYYQTLGLARGASD (서열 10),TTYYDVLGVKPNATQ (서열 11),KKAYRRKALQWHPDK (서열 12),KRAYRRQALRYHPDK (서열 13),KKAYRKLALKYHPDK (서열 14),FRSVSTSTTFVQGRR (서열 15),PGMVQQIQSVCMECQ (서열 16),GRRITTRRIMENGQE (서열 17), 또는이들의 임의 조합물인 방법.
- 제8항에 있어서, 펩티드가 박테리아 dnaJ hsp의 소정 펩티드 부분에 대해 상동성이 없는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 펩티드가QAYEVLSDAKKRELYD (서열 18),EAYEVLSDKHKREIYD (서열 19),SGPFFTFSSSFPGHS (서열 20),DGQLKSVTINGVPDD (서열 21),DLQLAMAYSLSEMEA (서열 22),EDLFMCMDIQLVEAL (서열 23),LCGFQKPISTLDNRT (서열 24),RTIVITSHPGQIVKH (서열 25),GRLIIEFKVNFPENG (서열 26), 또는이들의 임의 조합물인 방법.
- 제1항에 있어서, 면역반응의 조절이 대상체에서 염증반응의 증대 또는 유도를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 펩티드가 전염증성 (pro-inflammatory) 활성을 갖는 펩티드이고, 염증반응의 증대 또는 유도가 면역화 조건하에서 상기 펩티드의 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 펩티드가 항염증성 활성을 갖는 펩티드이고, 염증반응의 증대 또는 유도가 관용화 조건하에서 상기 펩티드의 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 염증반응의 증대 또는 유도가 대상체에서 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 또는 둘 다의 농도 증가를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 염증반응의 증대 또는 유도가 대상체에서 인터루킨-1 (IL-1), IL-6, IL-12, IL-23 또는 이들의 조합물의 농도 증가를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 염증반응의 증대 또는 유도가 대상체에서 IL-4, IL-10, 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β) 또는 이들의 조합물의 농도 감소를 포함하는 것인방법.
- 제1항에 있어서, 면역반응의 조절이 대상체에서 염증반응의 감소 또는 억제를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 펩티드가 항염증성 활성을 갖는 펩티드이고, 염증반응의 감소 또는 억제가 면역화 조건하에서 상기 펩티드의 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 펩티드가 전염증성 활성을 갖는 펩티드이고, 염증반응의 감소 또는 억제가 관용화 조건하에서 상기 펩티드의 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 염증반응의 감소 또는 억제가 대상체에서 IL-10, IL-4, TGF-β또는 이들의 조합물의 농도 증가를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 염증반응의 감소 또는 억제가 대상체에서 IFN-γ, TNF-α 또는 둘 다의 농도 감소를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 염증반응의 증대 또는 유도가 대상체에서 IL-1, IL-6, IL-12, IL-23 또는 이들의 조합물의 농도 감소를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 펩티드의 투여가 면역화 조건하에서의 펩티드 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 면역화 조건하에서의 펩티드 투여가 피부내, 피하 또는 근육내로의 펩티드 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 펩티드가 면역보조제를 추가로 포함하는 조성물로 제제화되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 펩티드의 투여가 관용화 조건하에서의 펩티드 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 관용화 조건하에서의 펩티드 투여가 점막으로의 펩티드 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 관용화 조건하에서의 펩티드 투여가 피부내, 피하 또는 근육내로의 펩티드 투여를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 대상체가 면역 장애를 가진 대상체인 방법.
- 제31항에 있어서, 면역 장애가 자가면역 질환인 방법.
- 제32항에 있어서, 자가면역 질환이 관절염인 방법.
- 제33항에 있어서, 관절염이 관절성 유년형 특발성 관절염인 방법.
- 제1항에 있어서, 대상체가 감염성 질환, 염증성 장 질환 또는 암에 걸린 대상체인 방법.
- 면역작용 세포 (immunoeffector cell)를 dnaJ 열 충격 단백질 (hsp)의 소정 펩티드 부분과 접촉시키는 것을 포함하는 면역작용 세포 반응의 조절 방법.
- 제36항에 있어서, dnaJ hsp가 박테리아 dnaJ hsp인 방법.
- 제37항에 있어서, 박테리아 dnaJ hsp가QDYYEILGVSKTAEE (서열 1),RKAYKRLAMKYHPDR (서열 2),QKRAAYDQYGHAAFEQ (서열 3),QGFFAVQQTCPHCQG (서열 4),SKTLSVKIPGAVDTG (서열 5),GDLYVQVQVKQHPIF (서열 6),YCEVPINFAMAALGG (서열 7),PINFAMAALGGEIEV (서열 8), 또는이들의 임의 조합물 중에서 선택된 이. 콜라이 (E. coli) dnaJ hsp인 방법.
- 제36항에 있어서, dnaJ hsp가 진핵생물 dnaJ hsp인 방법.
- 제39항에 있어서, 진핵생물 dnaJ hsp가 인간 dnaJ hsp인 방법.
- 제40항에 있어서, 펩티드가 박테리아 dnaJ hsp의 소정 펩티드 부분에 대해 상동성이 있는 것인 방법.
- 제41항에 있어서, 펩티드가ASYYEILDVPRSASA (서열 9),KDYYQTLGLARGASD (서열 10),TTYYDVLGVKPNATQ (서열 11),KKAYRRKALQWHPDK (서열 12),KRAYRRQALRYHPDK (서열 13),KKAYRKLALKYHPDK (서열 14),FRSVSTSTTFVQGRR (서열 15),PGMVQQIQSVCMECQ (서열 16),GRRITTRRIMENGQE (서열 17), 또는이들의 임의 조합물인 방법.
- 제42항에 있어서, 펩티드가 박테리아 dnaJ hsp의 소정 펩티드 부분에 대해 상동성이 없는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 펩티드가QAYEVLSDAKKRELYD (서열 18),EAYEVLSDKHKREIYD (서열 19),SGPFFTFSSSFPGHS (서열 20),DGQLKSVTINGVPDD (서열 21),DLQLAMAYSLSEMEA (서열 22),EDLFMCMDIQLVEAL (서열 23),LCGFQKPISTLDNRT (서열 24),RTIVITSHPGQIVKH (서열 25),GRLIIEFKVNFPENG (서열 26), 또는이들의 임의 조합물인 방법.
- 제36항에 있어서, 면역작용 세포의 접촉이 대상체에게 펩티드를 투여하는 것을 포함하고, 상기 접촉이 생체내에서 발생하는 방법.
- 제36항에 있어서, 면역작용 세포의 접촉이 시험관내에서 수행되는 방법.
- 제46항에 있어서, 대상체에게 면역작용 세포를 투여하여 대상체의 면역반응을 조절하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제47항에 있어서, 면역작용 세포가 대상체에 대해 자기유래의 것인 방법.
- 제47항에 있어서, 면역작용 세포가 대상체에 대해 동종이형의 것인 방법.
- 제47항에 있어서, 면역반응의 조절이 대상체에서 염증반응의 증대 또는 유도를 포함하는 것인 방법.
- 제47항에 있어서, 면역반응의 조절이 대상체에서 염증반응의 감소 또는 억제를 포함하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 면역작용 세포가 T 세포인 방법.
- 제36항에 있어서, 면역작용 세포를 면역보조제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제53항에 있어서, 면역보조제가 사이토카인인 방법.
- 제54항에 있어서, 사이토카인이 전염증성 사이토카인인 방법.
- 제55항에 있어서, 사이토카인이 항염증성 사이토카인인 방법.
- 서열 1 내지 26 중 어느 하나로부터 선택된 펩티드.
- 1종 이상의 이종 폴리펩티드와 작동가능하게 연결된 제57항의 펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드.
- 제57항의 펩티드 1종 이상을 포함하는 조성물.
- 제59항에 있어서, 상기 펩티드를 다수 포함하는 조성물.
- 제60항에 있어서, 생리학적으로 허용 가능한 용액을 추가로 포함하는 조성물.
- 제57항에 있어서, 면역보조제를 추가로 포함하는 조성물.
- 제62항에 있어서, 면역보조제가 사이토카인인 조성물.
- 제63항에 있어서, 사이토카인이 전염증성 활성을 갖는 것인 조성물.
- 제63항에 있어서, 사이토카인이 항염증성 활성을 갖는 것인 조성물.
- 제62항에 있어서, 면역보조제가 프로인트(Freund) 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제 또는 알룸 (alum)을 포함하는 것인 조성물.
- 제57항의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제67항에 있어서, 이중 가닥 데옥시리보핵산 분자인 폴리뉴클레오티드.
- 1종 이상의 이종 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 제67항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제69항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 전사 조절 요소, 번역 조절 요소 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 재조합 핵산 분자.
- 제69항에 있어서, 이종 뉴클레오티드 서열이 소정의 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 핵산 분자.
- 제67항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
- 제67항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포.
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