CN116507360A

CN116507360A - 用于通过改变肿瘤微环境来治疗胃肠腺癌的组合物

Info

Publication number: CN116507360A
Application number: CN202180050842.6A
Authority: CN
Inventors: 拉尔斯·奥托·乌滕塔尔; 托尔斯滕·比约恩
Original assignee: Nordic Science Group Co ltd
Current assignee: Nordic Science Group Co ltd
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-07-28
Also published as: WO2022038035A1; CA3191866A1; JP2023538591A; US20240033342A1; EP4196157A1

Abstract

本发明提供了包含针对SARS‑CoV‑2病毒的疫苗的组合物，用于通过将所述组合物直接注射到肿瘤中，从而在先前已由于感染或疫苗接种而暴露于所述病毒的具有可及的腺癌肿瘤的对象中促进抗肿瘤免疫应答。

Description

用于通过改变肿瘤微环境来治疗胃肠腺癌的组合物

技术领域

本发明提供了这样的组合物，其被设计成改变胃肠肿瘤特别是结直肠腺癌的微环境，来以这样的方式通过局部免疫机制促进对肿瘤细胞的杀伤以及抑制促进肿瘤生长和侵袭的其他过程，例如胶原蛋白沉积、新血管生成和微转移的形成。本发明的目的是在进行任何可被认为是必要的手术切除或消融或针对肿瘤的其他经皮或内窥镜干预之前，促进肿瘤的衰退或降低其尺寸和侵袭活性。因此，本发明与肿瘤学、胃肠病学和胃肠外科领域相关。

背景技术

肿瘤微环境是指肿瘤细胞周围的整个生物环境，并且因此其可以是指肿瘤的直接周围环境和实体瘤自身内在状况二者。这种与肿瘤生长相关的环境组分包括细胞元件(例如免疫细胞和成纤维细胞)、脉管系统、细胞外基质和信号传导分子(例如由组成型细胞产生的细胞因子、趋化因子和生长因子)，它们对其周围环境发挥作用。近数十年来，这些因素作为用于旨在减少肿瘤生长或诱导肿瘤消退以及降低从肿瘤转移扩散的治疗方法和药剂的靶标越来越受到关注。

关注的主要焦点一直是紧邻肿瘤周围和肿瘤内部的免疫细胞。具有重要意义的是肿瘤相关巨噬细胞。这些肿瘤相关巨噬细胞可以以不同比例来自不同肿瘤中的循环单核细胞或组织驻留巨噬细胞，但在大多数情况下，它们显示出与M2巨噬细胞表型接近的功能性特征，发挥整体抗炎作用并抑制抗肿瘤T细胞活性。它们的作用不仅通过使抗肿瘤免疫防御弱化，还通过直接促进实体瘤内部和周围的新血管生成来支持肿瘤生长。这提供了肿瘤生长所需的血液供应，但也产生了脆弱的、缺乏周细胞的血管，这些血管具有高渗透性并允许肿瘤细胞逃逸以形成远端转移。这种血管生成的一个重要因素是由巨噬细胞分泌生长因子，包括血管内皮生长因子VEGF-A和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα)，以及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)和肾上腺髓质素(adrenomedullin)。肿瘤巨噬细胞的白介素IL-4、IL-6、IL-10和IL-13的分泌以及程序性细胞死亡蛋白1配体(PD-1配体1；PD-L1)的表面表达有助于抑制肿瘤浸润性淋巴细胞的抗肿瘤活性。

在能够以可抑制肿瘤生长和转移并导致肿瘤消退的方向改变肿瘤微环境之情况和治疗的大量研究中，最近观察到将灭活流感疫苗注射到结直肠腺癌中可活化肿瘤免疫细胞环境，其主要特征是抑制性调节性T细胞和B细胞亚型以及髓样来源的抑制细胞，刺激介导抗肿瘤免疫的全身性CD8+T细胞的招募和使抗性肿瘤对检查点阻断敏感(Newman et al2020)。尚未阐明常规使用的灭活流感疫苗以及活性流感感染(其也被发现具有抗肿瘤作用)为何会导致这种抗肿瘤免疫应答的根本原因。在此假设为了发生这种类型的响应，需要疫苗中存在的重要病毒蛋白和病毒对肿瘤细胞显示出强烈的结合亲和力，并且宿主应该先前已经暴露于病毒或已经针对该病毒用疫苗进行了疫苗接种以确保宿主具有可通过再次暴露于病毒蛋白而活化的T和B记忆细胞。这适用于灭活流感疫苗的抗肿瘤用途，因为流感是绝大多数(如果不是全部的话)患有结直肠腺癌的患者都曾遭受过的流行性疾病，通常在他们的一生期间发生数次。

发明内容

因此，本发明试图通过利用最近出现并引起主要大流行的SARS-CoV-2β冠状病毒的特性来实现该策略的极其有效的抗肿瘤作用。这种新病毒显示出对胃肠上皮细胞(由其产生腺癌)的高度亲和力。用于引发该响应的重要病毒蛋白被称为所述病毒的S蛋白或刺突蛋白或表面糖蛋白，其经由其S1亚基的受体结合结构域与宿主细胞表面上表达的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合。因此，ACE2充当病毒的受体并介导病毒进入细胞。由S蛋白(目前已知其具有许多次要变体)介导的SARS-CoV-2病毒的一般感染性可比普遍发生的流感病毒的一般感染性高数百倍至数千倍。本发明的方法可在身体不同部位(包括肺)的可及肿瘤上进行，并且其用途不一定局限于治疗结直肠腺癌，尽管后者构成其应用的主要靶标。

因此，本发明包括用于在患有腺癌的对象中促进抗肿瘤免疫应答的组合物和方法，如在以下条目中所述：

1.包含针对SARS-CoV-2病毒的疫苗的组合物，其用于通过将一定剂量的所述组合物直接注射到肿瘤中来在注射可及部位患有腺癌肿瘤的对象中促进抗肿瘤免疫应答，并且其中所述对象先前已由于感染或疫苗接种而暴露于所述病毒。

2.根据条目1所述应用的组合物，其中所述疫苗含有灭活的全SARS-CoV-2病毒或由其重组产生的蛋白质或蛋白质片段。

3.根据条目1所述应用的组合物，其中所述疫苗含有编码所述病毒之蛋白质或蛋白质片段的核糖核酸或脱氧核糖核酸序列，并且其中所述核糖核酸或脱氧核糖核酸在进入肿瘤细胞之后能够诱导所述蛋白质或蛋白质片段的表达。

4.根据条目2所述应用的组合物，其中所述疫苗含有重组产生的来自所述SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段，其包括所述病毒的S蛋白的受体结合结构域。

5.根据条目1所述应用的组合物，其中所述疫苗注射到所述肿瘤中的剂量为所述疫苗的免疫剂量。

6.根据条目4所述应用的组合物，其中重组产生的来自所述SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段直接注射到所述腺癌肿瘤中的剂量为1至50微克。

7.根据前述条目中任一个所述应用的组合物，其中所述肿瘤是结肠或直肠的腺癌，或者是胰腺导管腺癌。

8.根据前述条目中任一个所述应用的组合物，其中所述肿瘤先前已进行过电穿孔。

9.根据前述条目中任一个所述应用的组合物，其中在将所述组合物注射到所述肿瘤中之前持续多至数周的时期和/或者将所述组合物注射到所述肿瘤中之后持续多至数周或数月的时期中，向所述对象给予每日经口剂量的乙酰水杨酸150mg，例如75至300mg，和/或氯沙坦100mg，例如50至150mg，和/或雷尼替丁150mg，例如75至300mg，所述乙酰水杨酸，和/或氯沙坦，和/或雷尼替丁可在组合片剂中给予。

作为治疗方法，这些条目可如下所述：

10.用于在注射可及部位患有腺癌肿瘤的对象中促进抗肿瘤免疫应答的方法，所述对象先前已由于感染或疫苗接种而暴露于SARS-CoV-2病毒，所述方法包括向所述肿瘤注射包含针对所述病毒之疫苗的组合物的剂量直接进入到所述肿瘤中。

11.根据条目10所述的方法，其中所述疫苗含有灭活的全SARS-CoV-2病毒或由其重组产生的蛋白质或蛋白质片段。

12.根据条目10所述的方法，其中所述疫苗含有编码所述病毒之蛋白质或蛋白质片段的核糖核酸或脱氧核糖核酸序列。

13.根据条目11所述的方法，其中所述疫苗含有重组产生的来自所述SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段，其包括所述病毒的S蛋白的受体结合结构域。

14.根据条目10所述的方法，其中所述疫苗注射到所述肿瘤中的剂量为所述疫苗的免疫剂量。

15.根据条目13所述的方法，其中重组产生的来自所述SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段直接注射到所述腺癌肿瘤中的剂量为1至50微克。

16.根据条目10至15中任一个所述的方法，其中所述肿瘤是结肠或直肠的腺癌，或者是胰腺导管腺癌。

17.根据条目10至16中任一个所述的方法，其中所述肿瘤先前已进行过电穿孔。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中在将所述组合物注射到所述肿瘤中之前持续多至数周的时期和/或者将所述组合物注射到所述肿瘤中之后持续多至数周或数月的时期中，向所述对象给予每日经口剂量的乙酰水杨酸150mg，例如75至300mg，和/或氯沙坦100mg，例如50至150mg，和/或雷尼替丁150mg，例如75至300mg，所述乙酰水杨酸，和/或氯沙坦，和/或雷尼替丁可在组合片剂中给予。

在实施本发明时，可能有必要确定对象实际上已经暴露于SARS-CoV-2病毒。鉴于以上条目4和13，这可以通过测试对象针对SARS-CoV-2抗原，优选包含S蛋白或其受体结合结构域的抗原的抗体来完成。如果未检测到所述抗体，则在根据本发明的方法和组合物进行治疗之前，对象应接种经批准用于人使用的满足以上条目2至4和11至13中所述的一个或更多个特征的抗SARS-CoV-2疫苗，并在至少2周的时期之后重新测试所述抗体的出现。

本发明的实施可与其他抗肿瘤治疗相结合，特别是与在肿瘤内注射疫苗之前将肿瘤电穿孔相结合。电穿孔可在导致肿瘤细胞因坏死而快速死亡的高电压下进行。电穿孔也可在较低的电压下进行，这在其被称为电化学疗法时使肿瘤细胞透性化至诸如细胞毒性药物的分子，以及透性化至核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)分子，所述核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)分子编码蛋白质或蛋白质片段并且能够在进入肿瘤细胞后诱导所述蛋白质或蛋白质片段的表达。在以上条目3和12中设想使用基于编码病毒的蛋白质或蛋白质片段的RNA或DNA的抗SARS-CoV-2疫苗时，目的是肿瘤细胞应存活足够长的时间表达并且作为少量相应的蛋白质序列的抗原存在，以促进针对其的免疫应答，在实施本发明方面优选的是后一种类型的电穿孔。该过程由Hansen等(2020)进行描述。

如果用于给对象接种的抗SARS-CoV-2疫苗是特别地不编码病毒的S蛋白的受体结合结构域的RNA或DNA疫苗，则注射到肿瘤中的疫苗是与用于对对象免疫接种的疫苗相同的疫苗。

本发明的实施还可以与促进抗肿瘤微环境的药物手段相结合，例如使用对血管生成具有抑制作用的经口乙酰水杨酸、经口血管紧张素II型受体1拮抗剂如氯沙坦(其影响肿瘤胶原合成并促进CD8+T细胞浸润到肿瘤组织中)以及经口H₂受体拮抗剂如雷尼替丁或法莫替丁(其具有限制肿瘤生长和转移的多种作用，包括促进淋巴细胞浸润肿瘤)。这样的药物辅助抗肿瘤疗法可以在通过本发明治疗之前持续多至数周和/或在通过本发明治疗之后持续多至数周或数月的时期中，每天一次经口服用的包含乙酰水杨酸75mg至300mg、氯沙坦50mg至150mg和雷尼替丁75mg至300mg的组合片剂形式来给予。“数周”意指至少2周至6周的时期，“数月”意指至少2个月至6个月的时期，并不暗示这种限制是治疗的必要方面。在本发明的一个实施方案中，乙酰水杨酸以150mg的剂量施用，氯沙坦的剂量为100mg，以及雷尼替丁的剂量为150mg。

在本发明的以下详细描述中，将给出本发明的范围及其实际性能的详细内容。

具体实施方式

本发明的基本特征是通过直接肿瘤内注射包含抗SARS-CoV-2疫苗的组合物来将所述疫苗用作在患有腺癌的对象中诱导抗肿瘤免疫应答的手段，其中所述对象先前已经由于感染或针对SARS-CoV-2病毒的疫苗接种而暴露于SARS-CoV-2病毒。

通过在取自对象的血清、血浆或全血样本中检测针对SARS-CoV-2抗原，优选包括S蛋白或其受体结合结构域的抗原的抗体，证明对象对于治疗的适应性。如果未检测到这样的抗体，则向对象接种经批准用于人使用的抗SARS-CoV-2疫苗，该疫苗满足以下特征中的一项或更多项：

a)该疫苗含有灭活的全SARS-CoV-2病毒或其重组产生的蛋白质或蛋白质片段。

b)该疫苗含有编码SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段的RNA或DNA序列，并且该RNA或DNA能够在进入肿瘤细胞后诱导所述蛋白质或蛋白质片段的表达。

c)该疫苗含有重组产生的来自SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段，其包括病毒的S蛋白的受体结合结构域。

然后推迟治疗，直到可以检测到上述抗体。

治疗包括将溶解或分散在适当的水性介质中的包含具有以上a)、b)和c)中所述的一项或更多项特征的疫苗的组合物直接注射到肿瘤中。在一些实施方案中，上述c)中提到的并且用于本发明的组合物和方法的蛋白质或蛋白质片段的长度为10至1273个氨基酸并且序列与SEQ ID NO:1的可比区域的序列至少75％，例如至少80％，例如至少90％相同，或者蛋白质片段的长度为10至194个氨基酸，并且与SEQ ID NO:2的可比区域的序列至少75％，例如至少80％，例如至少90％相同。

为了本发明的目的，并不认为任何基于核苷酸的疫苗都必须具有编码并入到作为能够或有限地能够在人体内复制或能够产生另外的病毒蛋白的载体的病毒(例如腺病毒)中的病毒蛋白的序列。事实上，这样的措施可能引入由于因载体病毒引起的感染或对载体病毒蛋白质的反应而产生副作用的机会，或者由于预先存在的针对对象可能具有的载体病毒的抗体而使疫苗失活的机会。本发明的目的并不在于任何SARS-CoV-2抗原都应在远离待治疗的肿瘤的非肿瘤部位表达。

在注射之前可以通过技术人员公知的手段对肿瘤进行电穿孔，然后可以每天经口服用具有包含乙酰水杨酸、血管紧张素II型受体1拮抗剂和H₂受体拮抗剂的药物组合的药物。

本发明组合物的活性成分

本发明组合物的基本活性成分为适合于人使用的抗SARS-CoV-2疫苗。这些包括以下活性成分：

1)灭活的全SARS-CoV-2病毒，例如通过以类似于生产标准灭活季节性流感疫苗的方式用β-丙内酯或甲醛进行处理而灭活。

为了促进抗肿瘤免疫应答的目的，预期通过经由所述方法使整个病毒灭活而产生的活性成分的化学修饰不会破坏其诱导这样的应答的能力。Gao等(2020)已经报道了这种类型的候选疫苗。

2)重组产生的SARS-CoV-2S蛋白(也称为刺突蛋白或表面糖蛋白)或包含该蛋白的S1亚基的受体结合结构域的重组产生的SARS-CoV-2S蛋白片段。

下面更详细地描述了这种活性成分的更简单形式的生产。

3)编码SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段的RNA或DNA序列。

这种类型的活性成分通常将与一种或更多种佐剂和渗透剂一起存在以促进这些相当大的分子渗透到接种宿主的细胞中，使得其编码的蛋白质物质将作为用于激发针对它们并因此针对病毒的免疫应答的抗原表达和存在。这种类型的RNA序列可以并入到能够在免疫对象内复制并感染宿主细胞的病毒例如腺病毒中，使得它们表达编码的病毒蛋白。认为该过程对于本发明的实施不是必需的或有利的，并且可能确实以副作用或疫苗由于预先存在的抗体而灭活的形式具有负面后果，但不排除其在本发明中的使用。

如果用于对对象免疫接种的疫苗中的RNA或DNA序列特别地不编码病毒的S蛋白的受体结合结构域，则注射到肿瘤中的活性成分是与用于对患者免疫接种的疫苗相同的疫苗。

包含受体(ACE2)结合结构域的重组表达的SARS-CoV-2S蛋白或其片段的生产

在本发明的一个实施方案中，存在于用于直接注射到待治疗的腺癌肿瘤中的组合物中的活性成分为重组产生的SARS-CoV-2β冠状病毒的S蛋白[SEQ ID NO:1]、或包含其S1亚基的受体(ACE2)结合结构域[SEQ ID NO:2]的所述蛋白质的任何片段。Wu等(2020)已经报道了蛋白质序列。

蛋白质或蛋白质片段可以通过在宿主细胞如原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中或在无细胞体系中表达而重组产生。

在本发明的一个实施方案中，S蛋白或其片段由宿主细胞重组产生。因此，在本发明的一个方面中，蛋白质或蛋白质片段由这样的宿主细胞产生：其包含与能够指导在所述宿主细胞中的表达的第二核酸序列可操作地缔合的编码蛋白质或蛋白质片段的第一核酸序列。因此，第二核酸序列可包含将指导目的蛋白质在所述细胞中的表达的启动子或甚至由将指导目的蛋白质在所述细胞中表达的启动子组成。技术人员将能够容易地鉴定用于给定宿主细胞的有用的第二核酸序列。

生产重组蛋白质的方法一般包括以下步骤：

-提供宿主细胞；

-制备基因表达构建体，其包含与能够指导所述蛋白质或片段在宿主细胞中的表达的第二核酸序列可操作地连接的编码待表达S蛋白或其片段的第一核酸序列；

-用构建体转化宿主细胞；

-培养宿主细胞，从而获得蛋白质或其片段的表达。

由此产生的重组S蛋白或其片段可以通过技术人员已知的任何常规方法分离，技术人员将能够鉴定用于纯化产物的合适的蛋白质分离步骤。

在本发明的一个实施方案中，重组产生的目的蛋白质或片段由宿主细胞分泌。在这种情况下，生产重组蛋白质或蛋白质片段的方法可包括前述步骤，其中培养转化的宿主细胞引起蛋白质或蛋白质片段的表达以及其向培养基中的分泌，从而获得包含目的产物的培养基。

因此，在本发明的该实施方案中，包含S蛋白或其蛋白质片段的组合物可以为培养基或由培养基制备的组合物。

在本发明的一个实施方案中，S蛋白或其片段在宿主细胞中体外重组产生并从细胞裂解物、细胞提取物中或从组织培养上清液中分离。在一个更优选的实施方案中，S蛋白或其片段由以其表达相关蛋白质或蛋白质片段的方式被修饰的宿主细胞产生。在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，所述宿主细胞被转化以产生和分泌相关的蛋白质或蛋白质片段。

为了本发明的目的，即诱导抗肿瘤免疫应答，认为活性成分不一定必须被糖基化。因此，其可以通过在不使表达的蛋白质糖基化的细胞中例如在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达而以适当的形式产生。

SARS-CoV-2病毒的蛋白质的氨基酸序列并非一成不变，每天都有报道称不同的病毒临床分离物的蛋白质之间的氨基酸序列存在细微差异。这也适用于S蛋白及其S1亚基。因此，该蛋白质及其受体结合结构域可能作为大量变体存在，所述变体与指示蛋白(在中国首次分离并测序的病毒的S蛋白[SEQ ID NO:1])同源，并且所述变体在病毒的传染性和致病性方面共享其作用，但所述变体与指示蛋白的不同之处在于指示蛋白序列中的一个或更多个氨基酸残基被其他氨基酸残基替换。这些替换在氨基酸残基被具有大致相似特性的不同氨基酸残基替换时可被认为是“保守的”，而在氨基酸残基被不同类型的氨基酸残基替换时可被认为是“非保守的”。从广义上讲，在不改变蛋白质生物活性的情况下，较少的非保守取代将是可能的。

为了本发明的目的，指示蛋白或其受体结合结构域的保留指示蛋白或其受体结构域的抗原性的任何这样的变体都适用于实施本发明，无论其是天然存在的或在如上所述表达重组蛋白时通过修饰编码蛋白质的核苷酸序列而有意产生的。

因此，本发明范围内的变体可以为这样的蛋白质：其表现出与SEQ ID NO:1的可比部分至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。

可以使用许多公知的算法并应用许多不同的空位罚分来计算序列同一性。可以使用任何序列比对算法(例如但不限于FASTA、BLAST或GETSEQ)以搜索同源物并计算序列同一性。此外，在适当的时候，任何公知的替换矩阵，例如但不限于PAM、BLOSSUM或PSSM矩阵，都可以与搜索算法一起应用。例如，可以经由PSI-BLAST程序应用PSSM(位置特定评分矩阵)。此外，可以使用空位开放和延伸的一系列罚分来进行序列比对。例如，BLAST算法可以与5至12的空位开放罚分和1至2的空位延伸罚分一起使用。

因此，根据本发明的变体或其片段可在序列的相同变体或其片段内或在序列的不同变体或其片段之间包含至少一个替换，例如彼此独立地引入的多个替换。

从以上概述中清楚的是，相同的变体或其片段可包含多于一个如以上所定义的保守氨基酸替换。

使用本发明组合物的说明

用于将一定剂量的本发明的组合物肿瘤内注射到可及的腺癌中的说明如治疗临床医生的决定。

制剂

本发明的活性成分被配制成用于在水性介质中直接注射到肿瘤中。其可以溶解在药学上可接受的且经批准的等渗盐水溶液例如磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中，直至允许要直接注射到肿瘤中的免疫剂量的活性成分浓度。在本发明的其中活性成分为来自SARS-CoV-2病毒的包括所述病毒的S蛋白的受体结合结构域的重组产生的蛋白质或蛋白质片段的实施方案中，制剂中活性成分的浓度可以为0.05mg/mL至0.2mg/mL，优选0.1mg/mL。蛋白质溶液还可以任选地包含作为增溶剂和稳定剂的浓度高至0.2mg/mL的辛苯昔醇-10(TRITON X-100)和/或浓度高至1mg/mL的聚山梨醇酯80(Tween 80)和作为抗氧化防腐剂的浓度高至0.25mg/mL的α-生育酚氢琥珀酸酯以及批准浓度的经批准的抗菌防腐剂。

施用

选择剂量的组合物的施用是通过以如通过肿瘤的尺寸和状况确定的10微升至0.5mL的体积直接注射到肿瘤物质中。注射通常经由内窥镜进行，以接近和观察肿瘤。

剂量

要直接注射到肿瘤中的抗SARS-CoV-2疫苗的剂量为用于对成人对象免疫接种的标准剂量。在本发明的其中活性成分为重组蛋白质或蛋白质片段的实施方案中，要注射的组合物的体积被选择为使得将1微克至50微克，优选15微克至30微克的活性成分剂量给予到肿瘤中。该剂量不旨在重复，但可以在间隔4周或更长时间之后重复。

与其他抗肿瘤干预措施结合

电穿孔或电化学疗法：如果肿瘤在注射之前已通过标准技术进行电穿孔，则预期通过肿瘤内注射本发明的组合物来激发抗肿瘤免疫应答特别有效。如果该过程与抗癌化学治疗剂(例如博来霉素或顺铂)的施用相结合，则其称为电化学疗法。电穿孔可在导致肿瘤细胞因坏死而快速死亡的高电压下进行。电穿孔也可以在较低的电压下进行，这使肿瘤细胞透性化至诸如细胞毒性药物的分子和RNA或DNA分子中，而不会立即杀死细胞。当在本发明使用基于编码病毒的蛋白质或蛋白质片段的RNA或DNA的抗SARS-CoV-2疫苗时，电穿孔的目的是其应促进RNA或DNA摄取到肿瘤细胞中，所述肿瘤细胞应存活足够长的时间表达并且作为少量相应蛋白质序列的抗原存在，以促进抗肿瘤免疫应答。因此，在实施本发明方面优选的是较低电压类型的电穿孔。该过程由Hansen等(2020)进行描述。用于在这样的电穿孔介导治疗中使用的DNA和RNA分子将具有允许编码的蛋白质在肿瘤细胞中表达的性质。在DNA序列的情况下，这将包括指导相关序列转录的序列。制造这样的DNA构建体在本领域中是公知的。用于在本发明中使用例如用于电穿孔到肿瘤细胞中以及随后编码蛋白质的表达的RNA序列将包括用于介导翻译过程起始的相关序列。用于制造这样的能够在进入细胞后被翻译成蛋白质的RNA序列的方法在本领域中是公知的。

促进抗肿瘤微环境的药物：通过将肿瘤内注射本发明的组合物与促进抗肿瘤微环境的药物手段(例如使用对血管生成具有抑制作用的经口乙酰水杨酸、经口血管紧张素II型受体1拮抗剂如氯沙坦(其影响肿瘤胶原合成并促进CD8+T细胞浸润到肿瘤组织中)以及经口H₂受体拮抗剂如雷尼替丁或法莫替丁(其具有限制肿瘤生长和转移的多种作用，包括促进淋巴细胞浸润肿瘤)相结合，可以巩固通过肿瘤内注射本发明的组合物激发的抗肿瘤免疫应答。这样的药物辅助抗肿瘤疗法可通过单独施用单个药剂来给予，或者也可以为每天一次经口服用的包含乙酰水杨酸75mg至300mg、氯沙坦50mg至150mg和雷尼替丁75mg至300mg的组合片剂的形式。在本发明的一个实施方案中，乙酰水杨酸以150mg的剂量施用，氯沙坦的剂量为100mg，以及雷尼替丁的剂量为150mg。这样的药物辅助治疗的时期可在注射之前多至数周开始，并且可在肿瘤内注射完成之后患者刚能够经口服用药物就立即继续，并且根据临床医生判断可另外持续多至数周或数月的时期。

实施例

SEQ ID NO:1

SARS-CoV-2刺突蛋白或S蛋白或表面糖蛋白

氨基酸序列由国际上接受的单个字母氨基酸代码表示，从残基1到残基1273：

SEQ ID NO:2

SARS-CoV-2刺突蛋白或S蛋白或表面糖蛋白的S1亚基的受体结合结构域

氨基酸序列由国际上接受的单个字母氨基酸代码表示，从刺突蛋白的残基331到残基524：

参考文献：

Gao Q et al(2020)Development of an inactivated vaccine candidate forSARS-CoV-2.

Science 369:77-81.

Hansen HF et al(2020)Electrochemotherapy for colorectal cancer usingendoscopic

electroporation:a phase 1clinical study.Endosc Int Open 08:E124-E132.

Newman JH et al(2020)Intratumoral injection of the seasonal flu shotconverts

immunologically cold tumors to hot and serves as an immunotherapy forcancer.Proc Natl Acad Sci USA 117:1119-1128.

Wu F et al(2020)A new coronavirus associated with human respiratorydisease in

China.Nature 579:265-269.

序列表

<110> Nordic Science Group ApS

<120> 用于通过改变肿瘤微环境来治疗胃肠腺癌的组合物

<130> P82002280DK00

<160> 2

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

1010 1015 1020

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

1025 1030 1035 1040

Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1045 1050 1055

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1060 1065 1070

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1075 1080 1085

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1090 1095 1100

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1105 1110 1115 1120

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

1125 1130 1135

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1140 1145 1150

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

1155 1160 1165

Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

1170 1175 1180

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile

1205 1210 1215

Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile

1220 1225 1230

Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270 1273

<210> 2

<211> 194

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 2

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

1 5 10 15

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

20 25 30

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

35 40 45

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

50 55 60

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

65 70 75 80

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

85 90 95

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

100 105 110

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

115 120 125

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

130 135 140

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

165 170 175

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

180 185 190

Thr Val

194

Claims

1.包含针对SARS-CoV-2病毒的疫苗的组合物，其用于通过将有效剂量的所述组合物直接注射到肿瘤中，以在注射可及部位患有腺癌肿瘤的对象中促进抗肿瘤免疫应答，并且其中所述对象先前已由于感染或疫苗接种而暴露于所述病毒。

2.根据权利要求1所述应用的组合物，其中所述疫苗含有灭活的全SARS-CoV-2病毒或由其重组产生的蛋白质或蛋白质片段。

3.根据权利要求1所述应用的组合物，其中所述疫苗含有编码所述病毒之蛋白质或蛋白质片段的核糖核酸或脱氧核糖核酸序列，并且其中所述核糖核酸或脱氧核糖核酸在进入肿瘤细胞之后能够诱导所述蛋白质或蛋白质片段的表达。

4.根据权利要求2所述应用的组合物，其中所述疫苗含有重组产生的来自所述SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段，其包括所述病毒的S蛋白的受体结合结构域。

5.根据权利要求1所述应用的组合物，其中所述疫苗注射到所述肿瘤中的剂量为所述疫苗的免疫剂量。

6.根据权利要求4所述应用的组合物，其中所述重组产生的来自SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段直接注射到所述腺癌肿瘤中的剂量为1至50微克。

7.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中所述肿瘤是结肠或直肠的腺癌，或者是胰腺导管腺癌。

8.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中所述肿瘤先前已进行过电穿孔。

9.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中在将所述组合物注射到所述肿瘤中之前持续多至数周的时期和/或者将所述组合物注射到所述肿瘤中之后持续多至数周或数月的时期，向所述对象给予有效的每日经口剂量的乙酰水杨酸，和/或氯沙坦，和/或雷尼替丁，所述乙酰水杨酸，和/或氯沙坦，和/或雷尼替丁可在组合片剂中给予。

10.根据权利要求9所述应用的组合物，其中乙酰水杨酸的有效的每日经口剂量为75mg至300mg，氯沙坦的每日经口剂量为50mg至150mg，并且雷尼替丁的每日经口剂量为75mg至300mg。

11.用于在注射可及部位患有腺癌肿瘤的对象中促进抗肿瘤免疫应答的方法，所述对象先前已由于感染或疫苗接种而暴露于SARS-CoV-2病毒，所述方法包括向所述肿瘤将有效剂量的包含针对所述病毒之疫苗的组合物直接注射进入到所述肿瘤中。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述疫苗含有灭活的全SARS-CoV-2病毒或由其重组产生的蛋白质或蛋白质片段。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述疫苗含有编码所述病毒之蛋白质或蛋白质片段的核糖核酸或脱氧核糖核酸序列，并且其中所述核糖核酸或脱氧核糖核酸在进入肿瘤细胞之后能够诱导所述蛋白质或蛋白质片段的表达。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述疫苗含有重组产生的来自所述SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段，其包括所述病毒的S蛋白的受体结合结构域。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述疫苗注射到所述肿瘤中的剂量为所述疫苗的免疫剂量。

16.根据权利要求14所述的方法，其中重组产生的来自所述SARS-CoV-2病毒的蛋白质或蛋白质片段直接注射到所述腺癌肿瘤中的剂量为1至50微克。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是结肠或直肠的腺癌，或者是胰腺导管腺癌。

18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述肿瘤先前已进行过电穿孔。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中在将所述组合物注射到所述肿瘤中之前持续多至数周的时期和/或者将所述组合物注射到所述肿瘤中之后持续多至数周或数月的时期，向所述对象给予有效的每日经口剂量的乙酰水杨酸，和/或氯沙坦，和/或雷尼替丁，所述乙酰水杨酸，和/或氯沙坦，和/或雷尼替丁可在组合片剂中给予。

20.根据权利要求19所述的方法，其中乙酰水杨酸的有效的每日经口剂量为75mg至300mg，和/或氯沙坦的有效的每日经口剂量为50mg至150mg，和/或雷尼替丁的有效的每日经口剂量为75mg至300mg。