CN102998457B - 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 - Google Patents
草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102998457B CN102998457B CN201210312755.6A CN201210312755A CN102998457B CN 102998457 B CN102998457 B CN 102998457B CN 201210312755 A CN201210312755 A CN 201210312755A CN 102998457 B CN102998457 B CN 102998457B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- grass carp
- antigen
- enzyme
- elisa plate
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；洗涤酶标板以及对底物显色；对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。本发明的有益效果是：为检测草鱼中肿瘤坏死因子alpha的蛋白表达水平提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及酶联免疫检测（ELISA）生物技术领域。
背景技术
肿瘤坏死因子alpha（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）是一种重要的细胞因子。早在30多年前，Carswell等人发现了一种存在于血清中，能抑制和杀伤某些肿瘤细胞，并使体内肿瘤发生出血坏死的蛋白物质，被命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)。研究发现，肿瘤坏死因子alpha参与和调控机体的免疫功能和炎症反应，发挥促进细胞生长、分化、凋亡等重要作用。自从牙鲆中克隆出第一个肿瘤坏死因子alpha基因的全长cDNA序列开始,肿瘤坏死因子alpha在鱼类中的研究开始受到重视，研究表明鱼类肿瘤坏死因子alpha表现出极大的功能差异说明其功能具有种属特异性，因此有必要对草鱼肿瘤坏死因子alpha在草鱼中的功能检测和应用进行研究。
草鱼（Ctenopharyngodon idellus）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，英文名：Grasscarp，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等。加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其调节机制十分重要。由于肿瘤坏死因子alpha在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，因此检测肿瘤坏死因子α在草鱼中的功能对草鱼免疫系统的研究以及鱼类疾病的治疗密切相关。同时，由于鱼类肿瘤坏死因子alpha与哺乳动物和两栖动物的肿瘤坏死因子α分子在结构和功能方面存在较大差距，不能用其他种族的肿瘤坏死因子alpha蛋白和抗体代替鱼类肿瘤坏死因子alpha进行研究，加之鱼类肿瘤坏死因子alpha抗体的缺乏使对肿瘤坏死因子alpha功能地位的研究陷入瓶颈。目前尚没有专门检测草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度的酶联免疫反应方法。
发明内容
本发明的目的针对现有检测草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度方法的不足，通过重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白制备多克隆抗体，并成功建立草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，为研究肿瘤坏死因子alpha的功能提供了基础方法。
本发明的技术方案是：草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；
步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤：
步骤21：包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；
步骤22：封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；
步骤23：制备酶标抗体与抗原混合液；
步骤24：将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；
步骤25：洗涤酶标板以及对底物显色；
步骤26：对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值（OD），根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。
本发明的有益效果是：以重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为包被抗原，采用多克隆抗体，建立了草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白检测竞争抑制酶联免疫检测方法，为检测草鱼中肿瘤坏死因子alpha的蛋白表达水平提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。
附图说明
图1是草鱼肿瘤坏死因子alpha ELISA检测的标准曲线。
图2是采用本发明的方法检测草鱼头肾白细胞中肿瘤坏死因子alpha蛋白的分泌结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
一种草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，利用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体（草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体），再用辣根过氧化物酶（HRP）标记该多克隆抗体得到HRP标记草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体（以下简称酶标抗体）。最后再次采用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为包被抗原和酶标抗体从而建立草鱼肿瘤坏死因子alpha（TNFα）的竞争抑制酶联免疫（ELISA）检测方法。
上述重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的获取过程可以利用本申请人之前递交的中国发明专利申请（申请号：201210240601.0，名称：一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法）合成，将草鱼肿瘤坏死因子alpha的基因序列克隆到原核表达载体pET30a(+)（一种商业化的克隆载体）上，构建重组表达质粒pET30a(+)-gcTNFα载体，再将构建得到的重组表达质粒pET30a(+)-gcTNF-α载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)（一种商业化的实验用菌种）中，进行筛选鉴定和测序验证后，将获得的阳性克隆作为工程菌株；将筛选所得的含有工程菌株的菌液，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，将菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用含6×His单克隆抗体或镍离子的亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得高纯度的重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白。
由于本步骤的具体过程已经在专利申请201210240601.0中陈述，因此该步骤不再详细介绍，并且本步骤的目的是获取重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白，本领域的普通技术人员应该意识到，采用其他的能够获取重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的现有方法也是可行的。
上述利用重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白作为免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体的过程是一个公知的现有过程，因此不再详细介绍；本领域的普通技术人员应该意识到，采用其他种类的兔子也是可行的。
上述利用辣根过氧化物酶（HRP）标记草鱼肿瘤坏死因子alpha抗体得到HRP标记多克隆抗体的方法具体采用马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记草鱼肿瘤坏死因子alpha多克隆抗体（马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒购自Thermo Scientific公司）。该方法是一个公知的现有技术，因此不再详细介绍。
在具备上述前提材料后，本发明的具体步骤如下：
步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；
本实施例中，该步骤经过棋盘滴定法确定竞争抑制酶联免疫检测时酶标抗体的最适稀释倍数为1：2000，包被抗原浓度为2μg/ml，每孔滴加100μL。
步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程又包括如下步骤：
步骤21：包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原（即肿瘤坏死因子alpha蛋白）。
本实施例中，该步骤的具体操作过程为用抗原稀释液（pH为9.6的0.05M（mol/L）碳酸盐缓冲液）稀释草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白（2μg/ml/孔）成为包被液，用包被液包被96孔酶标板，每孔加入包被液体积为100μl。4℃条件下包被过夜后甩干，用洗涤液（pH为7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中含0.05%Tween-20，PBST）洗涤三次（每次300μl/孔），每次3分钟。
步骤22：封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位。
本实施例中，用封闭液（pH为7.4的0.1M PBS稀释5%脱脂奶粉、0.3%牛血清白蛋白溶液）室温封闭2小时，每孔加封闭液300μl。
步骤23：制备酶标抗体与抗原混合液。
本实施例中，用抗原/抗体稀释液（PBST）将重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白稀释到如下浓度：0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml以及20ng/ml作为不同浓度标准品，取不同浓度标准品50μl与50μl酶标抗体（PBST溶液中按1：2000比例稀释）混匀后室温孵育2小时。对待测样品的检测：取待测样品50μl与50μl 1:2000稀释的酶标抗体混合，同样室温孵育2小时。
步骤24：将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合。
本实施例中，酶标板中抗原完成封闭后，甩干封闭液，并用300μl PBST洗涤三次，每次至少3分钟，然后加入步骤23中制备完成的酶标抗体与抗原混合液，每孔中加入酶标抗体与抗原混合液100μl，室温孵育至少2小时。
步骤25：洗涤酶标板以及对底物显色。
本实施例中，步骤24结束后，甩干孔内液体，用300μl PBST洗涤五次，每次3分钟，然后每孔加入100μl TMB底物（酶联反应底物，一种商业化试剂），37℃反应20分钟后加入50μl 2M硫酸（H2SO4）终止反应。
步骤26：对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值（OD），根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。
本实施例中，采用酶标仪在吸光度450nm下读取每孔的吸光值（OD）值，根据所得OD值计算标准品抑制率％＝（阴性样品吸光值-标准品吸光值）/阴性样品吸光值×100%；同时计算待测样品抑制率％＝（阴性样品吸光值-待测样品吸光值）/阴性样品吸光值×100%，其中，阴性样品是指不加标准品时的吸光值，标准品吸光值为不同浓度标准品对应的吸光值以及待测样品吸光值为待测样品的吸光值。如图1所示，以标准品抑制率为纵坐标，其对应标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，通过曲线拟合计算可以获得标准曲线对应的趋势线函数，从图中可以看出，本方法能准确检测浓度为0-20ng/ml的草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白。根据待测样品抑制率带入该标准曲线趋势线函数中，可以推导出待测样品中草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白浓度。
为了证明本检测方法的可应用性，我们用该竞争抑制酶联免疫检测方法成功检测了草鱼头肾白细胞中，脂多糖（LPS）对草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白分泌的调控。分离得到草鱼头肾淋巴细胞（HKL），按6×105/孔接种到24孔板中，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液于27℃，5%CO2浓度下培养过夜。草鱼HKL过夜培养后，每孔中加LPS，其终浓度为30μg/ml，同时不加药组为对照组。药物刺激0、3、6、12小时后，收培养液，离心，取上清，用竞争抑制酶联免疫检测方法检测上清中草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白含量。经过步骤2所有步骤，采用酶标仪在吸光度450nm下读取标准品和待测物品的吸光值。按步骤26获得标准样品标准曲线及其对应的趋势线函数。由待测样品的吸光值，计算待测样品抑制率，然后以标准曲线所对应的趋势线函数，可获得测样品中草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的浓度，如图2所示。图2中表示横坐标表示不同时间点LPS处理组和对照组（Ctrl），纵坐标草鱼肿瘤坏死因子浓度。空白方框和黑框分别表示对照组和LPS处理组对应的草鱼肿瘤坏死因子alpha浓度。利用本发明我们不仅证明了在草鱼头肾白细胞中LPS能够上调草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的分泌水平，而且精确地检测出草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的含量（见附图2）。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；
步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤：
步骤21：包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；具体操作过程为用pH为9.6且浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液抗原稀释液稀释每孔浓度为2μg/ml的草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白成为包被液，用包被液包被96孔酶标板，每孔加入包被液体积为100μl；4℃条件下包被过夜后甩干，用pH为7.4、浓度为0.1M且含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液即PBST洗涤液洗涤三次，每次300μl/孔，每次3分钟；
步骤22：封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；具体操作过程为用由pH为7.4且浓度为0.1M的PBS稀释5％脱脂奶粉和0.3％牛血清白蛋白溶液组成的封闭液室温封闭2小时，每孔加封闭液300μl；
步骤23：制备酶标抗体与抗原混合液；具体操作过程为用PBST抗原/抗体稀释液将重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白稀释到如下浓度：0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml以及20ng/ml作为不同浓度标准品，取不同浓度标准品50μl与PBST溶液中按1：2000比例稀释得到的50μl酶标抗体混匀后室温孵育2小时；对待测样品的检测：取待测样品50μl与50μl 1:2000稀释的酶标抗体混合，同样室温孵育2小时；
步骤24：将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；具体操作过程为酶标板中抗原完成封闭后，甩干封闭液，并用300μl PBST洗涤三次，每次至少3分钟，然后加入步骤23中制备完成的酶标抗体与抗原混合液，每孔中加入酶标抗体与抗原混合液100μl，室温孵育至少2小时；
步骤25：洗涤酶标板以及对底物显色；具体操作过程为待步骤24结束后，甩干孔内液体，用300μl PBST洗涤五次，每次3分钟，然后每孔加入100μl TMB底物，37℃反应20分钟后加入50μl 2M硫酸H2SO4终止反应；
步骤26：对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值OD，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。
2.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤1中经过棋盘滴定法确定竞争抑制酶联免疫检测时酶标抗体的最适稀释倍数为1：2000，包被抗原浓度为2μg/ml，每孔滴加100μL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210312755.6A CN102998457B (zh) | 2012-07-12 | 2012-08-29 | 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012102406010 | 2012-07-12 | ||
| CN201210240601 | 2012-07-12 | ||
| CN201210240601.0 | 2012-07-12 | ||
| CN201210312755.6A CN102998457B (zh) | 2012-07-12 | 2012-08-29 | 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102998457A CN102998457A (zh) | 2013-03-27 |
| CN102998457B true CN102998457B (zh) | 2015-08-26 |
Family
ID=47927293
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210312755.6A Expired - Fee Related CN102998457B (zh) | 2012-07-12 | 2012-08-29 | 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 |
| CN201310285117.4A Expired - Fee Related CN103509814B (zh) | 2012-07-12 | 2013-07-09 | 一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310285117.4A Expired - Fee Related CN103509814B (zh) | 2012-07-12 | 2013-07-09 | 一种草鱼肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN102998457B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103575908B (zh) * | 2013-10-30 | 2016-01-13 | 浙江理工大学 | 一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法 |
| CN104237529A (zh) * | 2014-07-10 | 2014-12-24 | 电子科技大学 | 一种草鱼白细胞介素1β酶联免疫检测试剂盒 |
| CN108893474B (zh) * | 2018-02-07 | 2021-11-16 | 电子科技大学 | 草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定 |
| CN111273028B (zh) * | 2020-02-25 | 2023-03-28 | 芜湖天明生物技术有限公司 | rhTSG-6直接竞争ELISA法定量检测试剂盒及其使用方法和应用 |
| CN112851792B (zh) * | 2021-03-19 | 2023-01-20 | 山东省淡水渔业研究院（山东省淡水渔业监测中心） | 一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1740321A (zh) * | 2004-08-27 | 2006-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 黑鲷肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法 |
| CN102439040A (zh) * | 2009-04-16 | 2012-05-02 | 亚培生物医疗股份有限公司 | 抗TNF-α抗体和其用途 |
| CN102495215A (zh) * | 2011-12-06 | 2012-06-13 | 任庆远 | 一种定量检测肿瘤坏死因子α的试剂盒 |
| CN102539778A (zh) * | 2010-12-24 | 2012-07-04 | 北京义翘神州生物技术有限公司 | 一种检测人肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒 |
| CN102608332A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-07-25 | 电子科技大学 | 一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法 |
-
2012
- 2012-08-29 CN CN201210312755.6A patent/CN102998457B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-07-09 CN CN201310285117.4A patent/CN103509814B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1740321A (zh) * | 2004-08-27 | 2006-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 黑鲷肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法 |
| CN102439040A (zh) * | 2009-04-16 | 2012-05-02 | 亚培生物医疗股份有限公司 | 抗TNF-α抗体和其用途 |
| CN102539778A (zh) * | 2010-12-24 | 2012-07-04 | 北京义翘神州生物技术有限公司 | 一种检测人肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒 |
| CN102495215A (zh) * | 2011-12-06 | 2012-06-13 | 任庆远 | 一种定量检测肿瘤坏死因子α的试剂盒 |
| CN102608332A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-07-25 | 电子科技大学 | 一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| Functional characterisation of the recombinant tumor necrosis factors in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss;J. Zou，et al.;《Developmental and Comparative Immunology》;20031031;第27卷(第9期);第813-822页 * |
| Interleukin-10 concentration determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay is unrepresentative of bioactivity in murine blood;L.M.Hillyer, et al.;《American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology》;20031231;第285卷(第6期);第R1515页"Sandwich ELISA of IL-10"节 * |
| New Binding Mode to TNF-Alpha Revealed by Ubiquitin-Based Artificial Binding Protein;Andreas Hoffmann，et al.;《PLoS ONE》;20120229;第7卷(第2期);e31298 * |
| Receptor-Mediated and Lectin-Like Activities of Carp (Cyprinus carpio) TNF-α1,2;Maria Forlenza,et al.;《The Journal of Immunology》;20091015;第183卷(第8期);摘要，说明书第5321页"Western blot"节 * |
| 花鲈肿瘤坏死因子基因cDNA的克隆、分析与表达;邱丽华 等;《中国水产科学》;20031031;第10卷(第5期);第370-375页 * |
| 草鱼胆中毒大鼠致急性肾损伤TNF-α动态水平测定;胡婧;《大理学院学报》;20100630;第9卷(第6期);第48-50页 * |
| 鱼类肿瘤坏死因子基因和受体的研究进展;邱丽华 等;《中国水产科学》;20040930;第11卷(第5期);第482-487页 * |
| 鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肿瘤坏死因子基因的克隆与表达分析;梁卉 等;《生态科学》;20090430;第28卷(第2期);第139-146页 * |
| 黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)肿瘤坏死因子α cDNA的克隆及特征分析;高春萍 等;《海洋与湖沼》;20050731;第36卷(第4期);第326-334页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103509814B (zh) | 2015-11-18 |
| CN102998457A (zh) | 2013-03-27 |
| CN103509814A (zh) | 2014-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102998457B (zh) | 草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法 | |
| Zhao et al. | Identification and measurement of staphylococcal enterotoxin M from Staphylococcus aureus isolate associated with staphylococcal food poisoning | |
| CN108776219B (zh) | 一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条 | |
| CN103575889A (zh) | 一种检测万古霉素的试纸条及方法 | |
| CN102608332B (zh) | 一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法 | |
| CN102216781A (zh) | 全部流感嗜血杆菌的测定方法 | |
| CN104360065B (zh) | 副溶血性弧菌酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN106632643B (zh) | 一种中华鲟vtg蛋白抗原及抗体及制备方法和应用 | |
| CN107884578A (zh) | 用于快速定量检测血清中包虫病抗体检测卡 | |
| CN103575887A (zh) | 一种检测黄曲霉毒素b1的试纸卡及其应用 | |
| CN104237529A (zh) | 一种草鱼白细胞介素1β酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN103777015A (zh) | 一种检测红霉素的胶体金试纸条及方法 | |
| CN103792361A (zh) | 出血性大肠杆菌o157:h7酶联免疫检测试剂盒 | |
| AU2020101140A4 (en) | ELISA kit for quantitative detection of content of insect cadherin and use method thereof | |
| CN103513035A (zh) | 一种检测黄曲霉毒素m1的试纸条及方法 | |
| CN105541977A (zh) | 鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用 | |
| CN105296520B (zh) | 一种人肿瘤抗原3H11Ag的制备方法及其酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN108359642B (zh) | 一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 | |
| CN102109521A (zh) | 检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球及其制备方法 | |
| CN110551220A (zh) | 一种滴滴涕单克隆抗体的制备及其应用 | |
| CN106011144A (zh) | 一种甜菜夜蛾卵黄原蛋白、其特异性肽链、载体、菌株及应用 | |
| CN103823062B (zh) | 猪霍乱沙门氏菌酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN102707054B (zh) | 大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法 | |
| CN103940995A (zh) | 单核细胞增生性李斯特菌酶联免疫检测试剂盒 | |
| CN104360066B (zh) | 检测副溶血性弧菌的方法及其单抗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150826 Termination date: 20160829 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |