CN103575908B - 一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法 - Google Patents

一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法 Download PDF

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Abstract

一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法，其特征在于利用竞争酶联免疫的方法来检测古代文物材料中的蛋白成分，即将AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体固定于固相载体上，加入样品洗脱液形成抗原抗体复合物；用PBS缓冲溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析。本发明所采用的方法成本低、检测简单、响应速度快。

Description

一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法
技术领域
本发明涉及一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法，主要用于古代文物材料中胶原蛋白的检测。
背景技术
文物是一定历史时期人类社会活动的产物，具有重要的科学价值。古代文物材料对于文物的研究起着基础性的作用。胶原蛋白作为一种天然的高分子材料，在古代文物材料中的应用十分广泛。以往鉴别古代文物材料中胶原蛋白的方法也很多，主要有显微镜观察鉴别法、电子显微镜法、气相色谱法、液相色谱法、红外分光光度计法、热失重分析鉴别等。但是这些方法都具有不确定性，尤其是当一种胶原蛋白来源于不同的材料或者一些蛋白分子结构具有相似性时，这些方法根本不能进行高效的鉴别。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对上述现有技术存在的问题提供一种灵敏度高、简单高效的古代文物材料中胶原蛋白的检测方法。
本发明所采用的技术方案是：利用竞争酶联免疫的方法来检测古代文物材料中的蛋白成分，即将样品洗脱液固定于固相载体上，加入AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体形成抗原抗体复合物。用PBS溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析。其采用步骤如下：
a)溶液配制：PBS缓冲溶液的配制：KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8.0g，NaH2PO4·7H2O2.16g,用去离子水溶解并定容1000mL，调节PH至7.4,121℃灭菌处理。洗脱液的配制：5mL1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、1mL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20％十二烷基硫酸钠，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存；
b)将PBS缓冲溶液80-100μL设为空白对照、样品鱼胶粉0.1-0.5mg设为阳性对照。将所述80-100μL的PBS缓冲溶液、所述0.1-0.5mg的样品鱼胶粉和0.1-0.5mg的实验样品文物材料分别溶于80-120μL的洗脱液中，室温下放置2-4天，形成空白对照样品洗脱液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液；
c)取步骤b所述空白对照样品洗脱液、阳性对照样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液各40-60μL分别与0.1mol/L的NaHCO3溶液80-100μL混合并放置10分钟；
d)加60-80μL0.1mol/L的NaHCO3溶液至ELISA板的实验孔内；
e)加10-30μL步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中；
f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4℃冰箱内放置过夜后继续实验；
g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品；
h)用PBS溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μL，洗涤三次，每次三分钟；
i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300μL1％牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温下封闭1h；
j)去除步骤i的封闭液，每孔添加80-120μL一抗即AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体，一抗的浓度稀释到1:3000到1:9000之间。室温下孵育2小时；
k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟；
l)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80-120μL二抗即碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，二抗的浓度可稀释至1：10000到1:12000之间。室温下孵育2小时；
m)去除步骤l的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟；
n)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80-120μL10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液；待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80-120μL0.75mol/L的NaOH溶液终止反应；
o)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值。
p)比较空白对照样品和实验样品文物材料的吸光度数值OD；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验样品文物材料中确实存在胶原蛋白；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在胶原蛋白。
本发明的有益效果是：1、本发明利用竞争酶联免疫的方法进行文物材料胶原蛋白成分的检测，一方面灵敏度高、专一性强、特异性强、成本低、操作简单，可以实现对文物材料成分的高效分析，另一方面，对文物本身的破坏性较小，可以较好的保持文物本身的原貌。2、与现有技术相比，本发明所采用的方法成本低、检测简单，响应速度快。
具体实施方式
本发明是利用竞争酶联免疫的方法来检测古代文物材料中的蛋白成分，即将样品洗脱液固定于固相载体上，加入AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体形成抗原抗体复合物。用PBS溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，可根据呈色的深浅进行定性分析。
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
a)溶液配制：PBS缓冲溶液的配制：KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8.0g，NaH2PO4·7H2O2.16g,用去离子水溶解并定容1000mL，调节PH至7.4,121℃灭菌处理。洗脱液的配制：5mL1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、1mL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20％十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有10g溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存。
b)将PBS缓冲溶液100μL设为空白对照、样品鱼胶粉0.1mg设为阳性对照。将空白样品PBS缓冲溶液100μL、阳性对照样品鱼胶粉0.1mg和实验样品文物材料0.1mg分别溶于100μL洗脱液中，室温下放置2天，形成空白对照样品洗脱液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液。
c)取步骤b所述空白对照样品洗脱液、、阳性对照样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液各50μL，分别与0.1mol/LNaHCO3溶液100μL混合并放置10分钟。
d)加65μL0.1mol/LNaHCO3溶液至ELISA板的实验孔内。
e)加15μL步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中。
f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4℃冰箱内放置过夜后继续实验。
g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品。
h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μL，洗涤三次，每次三分钟。
i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300μL1％牛血清蛋白(BSA)溶液，室温下封闭1h。
j)去除步骤i的封闭液，每孔添加80μL一抗(AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体)，一抗的浓度稀释到1:3000。室温下孵育2小时。
k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
l)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80μL二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L))，二抗的浓度稀释至1：10000。室温下孵育2小时。
m)去除步骤l的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
n)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80μL10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液。待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80μL的0.75mol/L的NaOH溶液终止反应。
o)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD。
p)比较空白对照样品和实验样品文物材料的吸光度数值OD；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验样品文物材料中确实存在胶原蛋白；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在胶原蛋白。
实施例2
一种检测古代文物材料中胶原蛋白的方法，它包括如下步骤:
a)溶液配制：PBS缓冲溶液的配制：KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8.0g，NaH2PO4·7H2O2.16g,用去离子水溶解并定容1000mL，调节PH至7.4,121℃灭菌处理。洗脱液的配制：5mL1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、1mL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20％十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有10g溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存。
b)将PBS缓冲溶液100μL设为空白对照、样品鱼胶粉0.1mg设为阳性对照。将空白样品PBS缓冲溶液100μL、阳性对照样品鱼胶粉0.1mg和实验样品文物材料0.3mg分别溶于100μL洗脱液中，室温下放置3天，形成空白对照样品洗脱液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液。
c)取步骤b所述空白对照样品洗脱液、、阳性对照样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液各50μL，分别与0.1mol/L的NaHCO3溶液100μL混合并放置10分钟。
d)加65μL0.1mol/L的NaHCO3溶液至ELISA板的实验孔内。
e)加15μL步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中。
f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4℃冰箱内放置过夜后继续实验。
g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品。
h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μL，洗涤三次，每次三分钟。
i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300μL1％牛血清蛋白(BSA)溶液，室温下封闭1h。
j)去除步骤i的封闭液，每孔添加80μL一抗(AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体)，一抗的浓度稀释到1:6000。室温下孵育2小时。
k)去除步骤i的抗体溶液，每孔加300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
l)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80μL二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L))，二抗的浓度稀释至1：10000。室温下孵育2小时。
m)去除步骤l的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
n)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80μL10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液。待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80μL0.75mol/L的NaOH溶液终止反应。
o)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD。
p)比较空白对照样品和实验样品文物材料的吸光度数值OD；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验样品文物材料中确实存在胶原蛋白；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在胶原蛋白。
实施例3
一种检测古代文物材料中胶原蛋白的方法，它包括如下步骤:
a)溶液配制：PBS缓冲溶液的配制：KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8.0g，NaH2PO4·7H2O2.16g,用去离子水溶解并定容1000mL，调节PH至7.4,121℃灭菌处理。洗脱液的配制：5mL1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、1mL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20％十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有10g溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存。
b)将PBS缓冲溶液100μL设为空白对照、样品鱼胶粉0.1mg设为阳性对照。将空白样品PBS溶液100μL、阳性对照样品鱼胶粉0.1mg、实验样品文物材料0.5mg分别溶于100μL洗脱液中，室温下放置4天，形成空白对照样品洗脱液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液。
c)取步骤b所述空白对照样品洗脱液、、阳性对照样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液各50μL，分别与0.1mol/L的NaHCO3溶液100μL混合并放置10分钟。
d)加65μL0.1mol/L的NaHCO3溶液至ELISA板的实验孔内。
e)加15μL步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中。
f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4℃冰箱内放置过夜后继续实验。
g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品。
h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μL，洗涤三次，每次三分钟。
i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300μL1％牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温下封闭1h。
j)去除步骤i的封闭液，每孔添加80μL一抗(AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体)，一抗的浓度稀释到1:9000。室温下孵育2小时。
k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
l)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80μL二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L))，二抗的浓度稀释至1：10000。室温下孵育2小时。
m)去除步骤l的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
n)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80μL10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液。待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80μL0.75mol/L的NaOH溶液终止反应。
o)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD。
p)比较空白对照样品和实验样品文物材料的吸光度数值OD；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验样品文物材料中确实存在胶原蛋白；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在胶原蛋白。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法，其特征在于利用间接酶联免疫的方法来检测古代文物材料中的蛋白成分，即将样品洗脱液固定于固相载体上，加入AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体形成抗原抗体复合物；用PBS缓冲溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析；
具体步骤如下：
a)溶液配制：PBS缓冲溶液的配制：KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8.0g，NaH2PO4·7H2O2.16g,用去离子水溶解并定容1000mL，调节PH至7.4,121℃灭菌处理；洗脱液的配制：5mL1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、1mL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20％十二烷基硫酸钠，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存；
b)将PBS缓冲溶液80-100μL设为空白对照，样品鱼胶粉0.1-0.5mg设为阳性对照；将所述80-100μL的PBS缓冲溶液、所述0.1-0.5mg样品鱼胶粉和0.1-0.5mg的实验样品文物材料分别溶于80-120μL的洗脱液中，室温下放置2-4天，形成空白对照样品洗脱液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液；
c)取步骤b所述空白对照样品洗脱液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液各40-60μL，分别与0.1mol/L的NaHCO3溶液80-100μL混合并放置10分钟；
d)加60-80μL0.1mol/LNaHCO3溶液至ELISA板的实验孔内；
e)加10-30μL步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中；
f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4℃冰箱内放置过夜后继续实验；
g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品；
h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μL，洗涤三次，每次三分钟；
i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300μL1％牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温下封闭1h；
j)去除步骤i的封闭液，每孔添加80-120μL一抗即AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体，一抗的浓度稀释到1:3000到1:9000之间，室温下孵育2小时；
k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟；
l)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80-120μL二抗即碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，二抗的浓度稀释至1：10000到1:12000之间，室温下孵育2小时；
m)去除步骤l的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μLPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟；
n)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80-120μL10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液，待阳性对照反应完全,而阴性对照仍呈透明时，每孔加80-120μL0.75mol/L的NaOH溶液终止反应；
o)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD；
p)比较空白对照样品和实验样品文物材料的吸光度数值OD；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验样品文物材料中确实存在胶原蛋白；与空白对照样品检测的OD值相比，如果文物材料洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在胶原蛋白。
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