CN105424943B - 一种区分蚕丝种类的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种区分蚕丝种类的检测方法,利用不同特征多肽制备蚕丝素蛋白特异抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类蚕丝的丝素蛋白成分，即将蚕丝素蛋白洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗丝素蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物。洗涤后加入碱性磷酸酯酶标山羊抗兔IgG(H+L)抗体，形成抗体‑抗原‑抗体复合物，洗涤加入TMB显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅进行定性分析。该方法操作简单，灵敏度高，优于常规检测方法。

Description

一种区分蚕丝种类的检测方法
技术领域
本发明涉及一种区分蚕丝种类的检测方法，主要用于古代丝织品的检测。
背景技术
蚕丝是古代汉族文明产物之一,至今仍是我国的宝贵资源。我国出产的蚕丝有两种，一种是通常所说的桑蚕丝，就是栽桑养家蚕结的茧里抽出的蚕丝，这种蚕丝色泽白里略带黄色，手感细腻、光滑，有一股淡淡的动物纤维特有的气味。另一种蚕丝就是柞蚕丝，它是用柞蚕茧抽丝出来的。柞蚕俗称野蚕，主要生活在北方地区，它由人工放养在野外柞林之中，以柞叶为食。和桑蚕丝相比，柞蚕丝的颜色比较深，纤维较粗，其本色为黑灰色，一般经过漂白后制成成品。在蚕丝起源以及养殖研究领域，迫切需要科学严谨的检测手段。因为桑蚕丝柞蚕丝元素含量相似、仅存在氨基酸组成和结构差异；并且蚕丝作为一种有机高分子材料，长期处于墓葬或遗址环境中，必然会受到多种因素影响而出现蚕丝蛋白质发生降解及大分子链的断裂等问题。所以用常规的检测方法会出现样品前处理困难，耗时长，灵敏度低及其它蛋白质的干扰等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对上述问题提供一种简单快捷、灵敏度高的蚕丝检测方法，利用不同特征多肽制备蚕丝素蛋白特异抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类蚕丝的丝素蛋白成分，即将蚕丝素蛋白洗脱液包被到酶标记板上，然后添加兔抗丝素蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，洗涤后加入碱性磷酸酯酶标山羊抗兔IgG(H+L)抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物，洗涤加入TMB显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅可进行定性分析。
为解决上述技术问题，为此采用如下的技术方案；一种区分蚕丝种类的检测方法，根据桑蚕丝素蛋白和柞蚕丝素蛋白的氨基酸序列区别设计合成序列为“MQRKNKNHGILGKC”的多肽作为桑蚕丝素蛋白特异抗体，设计合成序列为“CSHSHSYEASRISVH”的多肽作为柞蚕丝素蛋白特异抗体。
一种区分蚕丝种类的检测方法，具体包括如下步骤：
a)溶液的配制：PBS7.4缓冲液配制：KCl 0.2g，KH2PO4 0.27g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，用蒸馏水定容至1000mL；碳酸盐缓冲溶液配制：Na2CO3 1.5g，NaHCO32.9g，用蒸馏水定容至1000ml；
封闭液(含质量分数1％BSA)配制：BSA0.1g，加PBS7.4缓冲液定容至10mL；
底物显色液配制：TMB底物溶液与底物缓冲液以1：1体积混合；
终止液(2mol/LH2SO4)配制：蒸馏水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL；
b)将0.01g-0.1g文物样溶解于100-1000mL PH为9.6的碳酸盐缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，取50-120μl上清液加入到酶标记板中，形成实验对照1、2；实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体；取50-120μl PH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2(空白对照与实验对照相对应)用；阴性对照设为不加一抗，其包被液和实验对照设为一样；然后将各阴性对照，空白对照,实验对照各放置于4℃冰箱中过夜；
c)各孔中加入封闭液100-300μl，37℃下封闭1-2h，然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min；
d)分别取用封闭液稀释1000-12000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体50-120μl，加入到酶标记板中，保鲜膜封板，37℃下温育1-2h，然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min；
e)各孔中加入用封闭液稀释3000-10000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体50-120μl，37℃下温育1-2h，然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min；
f)各孔内加底物显色液100μl，置黑暗处使其反应10min；
g)各孔内加终止液50-120μl，终止反应；
h)将酶标记板置于酶标仪中读取吸光度数值；
i)比较实验组测得的OD值；
将空白对照的OD均值+3个SD作为cut-off值；
若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕丝；
若实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕丝。
本发明的有益效果是：可以以一种简单快捷灵敏度高的方式区分蚕丝的种类，并且可以避免其他蛋白质干扰，特异性强。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例1
一种区分蚕丝种类的检测方法，具体实施步骤如下：
a)溶液的配制：PBS7.4缓冲液配制：KCl 0.2g，KH2PO4 0.27g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，用蒸馏水定容至1000mL。碳酸盐缓冲溶液配制：Na2CO3 1.5g，NaHCO32.9g，用蒸馏水定容至1000ml。封闭液(含质量分数1％BSA)配制：BSA0.1g，加PBS7.4缓冲液定容至10mL。底物显色液配制：TMB底物溶液与底物缓冲液以1：1体积混合。终止液(2mol/LH2SO4)配制：蒸馏水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL。
b)将0.01g文物样溶解于100mL PH为9.6的碳酸盐缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，取50μl上清液加入到酶标记板中，形成实验对照1、2(实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体)。取50μl PH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2(空白对照与实验对照相对应)用。阴性对照设为不加一抗，其包被液和实验对照设为一样。然后将各阳性对照，阴性对照，空白对照,实验对照各放置于4℃冰箱中过夜。
c)各孔中加入封闭液100μl。37℃下封闭1h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
d)分别取用封闭液稀释1000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体50μl，加入到酶标记板中，保鲜膜封板，37℃下温育1h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
e)各孔中加入用封闭液稀释3000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体50μl，37℃下温育1-2h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min。
f)各孔内加底物显色液100μl，置黑暗处使其反应10min。
g)各孔内加终止液50μl，终止反应。
h)将酶标记板置于酶标仪中，读取λ＝450nm处的吸光度数值。
i)比较实验组测得的OD值。
将空白对照的OD均值+3个SD作为cut-off值。
若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕丝；
若实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕丝。
实施例2
一种区分蚕丝种类的检测方法，具体实施步骤如下：
a)溶液的配制：PBS7.4缓冲液配制：KCl 0.2g，KH2PO4 0.27g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，用蒸馏水定容至1000mL。碳酸盐缓冲溶液配制：Na2CO3 1.5g，NaHCO32.9g，用蒸馏水定容至1000ml。封闭液(含质量分数1％BSA)配制：BSA 0.1g，加PBS7.4缓冲液定容至10mL。底物显色液配制：TMB底物溶液与底物缓冲液以1：1体积混合。终止液(2mol/LH2SO4)配制：蒸馏水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL。
b)将0.05g文物样溶解于500mL PH为9.6的碳酸盐缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，取70μl上清液加入到酶标记板中，形成实验对照1、2(实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体)。取70μl PH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2(空白对照与实验对照相对应)用。阴性对照设为不加一抗，其包被液和实验对照设为一样。然后将各阳性对照，阴性对照，空白对照,实验对照各放置于4℃冰箱中过夜。
c)各孔中加入封闭液200μl。37℃下封闭1.5h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
d)分别取用封闭液稀释7000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体70μl，加入到酶标记板中，保鲜膜封板，37℃下温育1.5h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
e)各孔中加入用封闭液稀释7000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体70μl，37℃下温育1.5h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min。
f)各孔内加底物显色液100μl，置黑暗处使其反应10min。
g)各孔内加终止液70μl，终止反应。
h)将酶标记板置于酶标仪中，读取λ＝450nm处的吸光度数值。
i)比较实验组测得的OD值。
将空白对照的OD均值+3个SD作为cut-off值。
若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕丝；
若实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕丝。
实施例3
一种区分蚕丝种类的检测方法，具体实施步骤如下：
a)溶液的配制：PBS7.4缓冲液配制：KCl 0.2g，KH2PO4 0.27g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，用蒸馏水定容至1000mL。碳酸盐缓冲溶液配制：Na2CO3 1.5g，NaHCO32.9g，用蒸馏水定容至1000ml。封闭液(含质量分数1％BSA)配制：BSA 0.1g，加PBS7.4缓冲液定容至10mL。底物显色液配制：TMB底物溶液与底物缓冲液以1：1体积混合。终止液(2mol/LH2SO4)配制：蒸馏水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL。
b)将0.1g文物样溶解于1000mL PH为9.6的碳酸盐缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，取100μl上清液加入到酶标记板中，形成实验对照1、2(实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体)。取100μl PH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2(空白对照与实验对照相对应)用。阴性对照设为不加一抗，其包被液和实验对照设为一样。然后将各阳性对照，阴性对照，空白对照,实验对照各放置于4℃冰箱中过夜。
c)各孔中加入封闭液300μl。37℃下封闭2h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
d)分别取用封闭液稀释10000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体100μl，加入到酶标记板中，保鲜膜封板，37℃下温育2h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
e)各孔中加入用封闭液稀释8000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体100μl，37℃下温育2h。然后吸出孔内液体，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min。
f)各孔内加底物显色液100μl，置黑暗处使其反应10min。
g)各孔内加终止液100μl，终止反应。
h)将酶标记板置于酶标仪中，读取λ＝450nm处的吸光度数值。
i)比较实验组测得的OD值。
将空白对照的OD均值+3个SD作为cut-off值。
若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕丝；
若实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为柞蚕丝。

Claims (1)

1.一种区分蚕丝种类的检测方法,其特征在于利用不同特征多肽制备蚕丝素蛋白特异抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类蚕丝的丝素蛋白成分，即将蚕丝素蛋白洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗丝素蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，洗涤后加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG抗体，洗涤加入底物显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅可进行定性分析；
其中，根据桑蚕丝素蛋白和柞蚕丝素蛋白的氨基酸序列区别设计合成序列为“MQRKNKNHGILGKC”的多肽制备桑蚕丝素蛋白特异抗体，设计合成序列为“CSHSHSYEASRISVH”的多肽制备柞蚕丝素蛋白特异抗体；
具体检测步骤如下：
a)溶液的配制：pH为7.4的PBS缓冲液配制：KCl 0.2g，KH2PO4 0.27g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，用蒸馏水定容至1000mL；碳酸盐缓冲溶液配制：Na2CO3 1.5g，NaHCO32.9g，用蒸馏水定容至1000ml；
封闭液配制：BSA0.1g，加pH为7.4的PBS缓冲液定容至10mL；
终止液配制：蒸馏水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL；
b)将0.01g-0.1g样品溶解于100-1000mL pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，取50-120μl上清液加入到酶标板中，形成实验对照1、2；实验对照1在后续步骤添加兔抗桑蚕丝素蛋白抗体，实验对照2在后续步骤添加兔抗柞蚕丝素蛋白抗体；取50-120μlpH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照1、2用，空白对照与实验对照相对应；阴性对照设为不加一抗，其包被液和实验对照设为一样；然后将各阴性对照，空白对照,实验对照各放置于4℃冰箱中过夜；
c)各孔中加入封闭液100-300μl，37℃下封闭1-2h，然后吸出孔内液体，用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min；
d)分别取用封闭液稀释1000-12000倍的兔抗桑蚕和柞蚕丝素蛋白多克隆抗体50-120μl，加入到酶标板中，保鲜膜封板，37℃下温育1-2h，然后吸出孔内液体，用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min；
e)各孔中加入用封闭液稀释3000-10000倍的碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG抗体50-120μl，37℃下温育1-2h，然后吸出孔内液体，用pH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min；
f)各孔内加底物显色液100μl，置黑暗处使其反应10min；
g)各孔内加终止液50-120μl，终止反应；
h)将酶标板置于酶标仪中，读取吸光度数值；
i)比较实验组测得的OD值；
将空白对照的OD均值+3个SD作为cut-off值；
若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为桑蚕丝；
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