CN105738632B - 一种区分羊皮种类的检测方法 - Google Patents

一种区分羊皮种类的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种区分羊皮种类的检测方法，利用不同特征多肽制备山羊皮/绵羊皮I型胶原蛋白抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类羊皮的I型胶原蛋白成分，即将羊皮I型胶原蛋白洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗I型胶原蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，洗涤后加入碱性磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗体，形成抗体‑抗原‑抗体复合物，洗涤加入底物显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅可进行定性分析。本发明方法简单快捷，灵敏度高，并且可以避免其他蛋白质干扰，特异性强。

Description

一种区分羊皮种类的检测方法
技术领域
本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种区分羊皮种类的检测方法。
背景技术
羊皮自古以来广泛应用于北方及西北地区，多做服饰、书写载体等，是我国的宝贵财富。羊皮主要分为两种，一种是绵羊皮，它的特点是皮板轻薄，手感柔软光滑而细腻，毛孔细小，无规则地分布均匀，呈扁圆形，多用于制作高档服饰。另一种山羊皮，结构比绵羊皮结实，所以拉力强度比绵羊皮好。由于皮表层比绵羊皮厚，所以比绵羊皮耐磨，更为粗糙，手感稍差，多用于制作猎具等耐磨制品。
在出土的大量羊皮制品面前，检测遇到较大困难。因为山羊皮、绵羊皮I型胶原含量相似、仅存在氨基酸组成和结构差异；并且羊皮作为一种蛋白质材料，长期处于墓葬或遗址环境中，容易受到多种因素影响而出现蛋白质发生降解及大分子链的断裂等问题。所以用常规的检测方法会出现样品前处理困难，结果准确性不高及耗时长等问题，不利于文物的保护。
申请号为CN98120267.5的中国专利公开了一种皮革鉴别方法，通过利用皮革制品厂废弃的边角料，制成皮革簿。皮革簿内附有人造革、合成革、牛皮、羊皮、鳄鱼皮等小的矩形皮革样品，以及使用皮革簿的说明书、辅助工具。供消费者在购买皮革制品时参照使用，以鉴别皮革真伪及质量档次。
上述方法只能通过皮革的外观、性能来进行区别，但是文物出土后外观、性能发生较大差异，因此并不能适用于文物鉴别，且只能区分不同物种的皮革，对于同一物种的皮革不能使用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种区分羊皮种类的检测方法。本发明方法利用不同特征多肽制备羊皮I型胶原蛋白抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类羊皮的I型胶原蛋白成分。本发明能够以一种简单快捷灵敏度高的方式区分羊皮的种类，并且可以避免其他蛋白质干扰，特异性强。
本发明的具体技术方案为：一种区分羊皮种类的检测方法，包括以下步骤：
A）将羊皮检测样溶解于EB洗脱缓冲液中并搅拌均匀，静置后分别取50-120体积份的上清液加入到酶标板A行孔、B行孔、E行孔和F行孔中；分别将50-120体积份的PBS缓冲液加入到酶标板C行孔和D行孔中，将酶标板的A行孔、B行孔、C行孔、D行孔、E行孔和F行孔分别作为实验对照1、实验对照2、空白对照1、空白对照2、阴性对照1、阴性对照2；将酶标板冷藏保存。
B）向酶标板各行孔中分别加入100-300体积份封闭液，在36-38℃下封闭1-2h后，吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤。
C）分别向酶标板A行孔、C行孔中加入50-120体积份用封闭液稀释后的兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体；分别向酶标板B行孔、D行孔中加入50-120体积份用封闭液稀释后的兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体；用保鲜膜封板，在36-38℃下温育1-2h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤。
D）分别向酶标板各行孔中加入50-120体积份用封闭液稀释后的辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体，在36-38℃下温育1-2h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤。
E）分别向酶标各行板孔中加入95-105体积份底物显色液，于黑暗处反应8-12min。
F）分别向酶标板各行孔中加入50-120体积份终止液，终止反应。
G）将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450nm处的吸光度值。
H）将空白对照1的OD均值+3个SD作为cut-off值，将空白对照2的OD均值+3个SD作为cut-off值；若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为山羊皮；若实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为绵羊皮。
本发明利用不同特征多肽制备羊皮I型胶原蛋白抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类羊皮的I型胶原蛋白成分，即将羊皮I型胶原蛋白洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗羊皮I型胶原蛋白抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物。洗涤后加入碱性辣根过氧化物酶标山羊抗兔IgG（H+L）抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物，洗涤加入TMB显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化的深浅可进行定性分析。
作为优选，所述PBS缓冲液由0.02wt%的KCl，0.027wt%的KH2PO4，0.8wt%的NaCl，0.358wt%的Na2HPO4·12H2O 和余量的蒸馏水组成。
作为优选，所述EB洗脱缓冲液的配制方法如下：将浓度为1 mol/L的Tris-HCl溶液、浓度为0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和浓度为20wt%的十二烷基硫酸钠溶液按体积比5:1:25混合制得混合溶液，按180g/31mL的固液比将尿素溶解于所述混合溶液中，配制成EB洗脱缓冲液。
作为优选，步骤A）中羊皮检测样与EB洗脱缓冲液的用量比为0.01-0.1g:100-1000mL。
作为优选，所述封闭液的配制方法如下：按0.1g/10mL的固液比将牛血清蛋白溶解于PBS缓冲液中。
作为优选，所述底物显色液的配制方法如下：将柠檬酸、NaHPO4·12H2O和蒸馏水按质量比1.02:3.68:100配制成pH为5为底物缓冲液，将所述底物缓冲液与TMB底物溶液、3wt%的双氧水按体积比900:100:1配制成底物显色液。
作为优选，所述终止液为浓度为2mol/mL的硫酸溶液。
作为优选，所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体由氨基酸合成序列如序列表SEQ IDNo.1所示的多肽通过动物免疫制得；所述兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体由氨基酸合成序列如序列表SEQ ID No.2所示的多肽通过动物免疫制得。
本发明根据山羊皮I型胶原蛋白和绵羊皮I型胶原蛋白的氨基酸序列区别设计合成序列为GPSGEPGTAGPPGTPGPQGFLGPPGFLGLPGSR的多肽通过动物免疫制得兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体，设计合成序列为GPSGEPGTAGPPGTPGPQGLLGAPGFLGLPGSR的多肽通过动物免疫制得兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体。
作为优选，所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体和兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体的初始浓度为2-5mg/L，且用封闭液稀释的倍数为1000-12000倍。
作为优选，所述辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体的初始浓度为1mg/L，且用封闭液稀释的倍数为3000-10000倍。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
本发明利用不同特征多肽制备羊皮I型胶原蛋白抗体来在间接酶联免疫的方法中检测不同种类羊皮的I型胶原蛋白成分，方法简单快捷，灵敏度高，并且可以避免其他蛋白质干扰，特异性强。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
原料配制
PBS缓冲液：KCl 0.2 g，KH2PO4 0.27 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，用蒸馏水定容至1000 mL。
EB洗脱缓冲液：180g尿素加入到5 mL浓度为1mol/L Tris-HCl溶液, 1mL浓度为0.5 mol/L乙二胺四乙酸溶液和25 mL 浓度为20wt%的十二烷基硫酸钠溶液中，并稀释到500 mL。
封闭液：按0.1g/10mL的固液比将牛血清蛋白溶解于PBS缓冲液中。
底物显色液：将1.02g柠檬酸、3.68gNaHPO4·12H2O和100mL蒸馏水配制成pH为5为底物缓冲液，将9mL底物缓冲液与1mL的TMB底物溶液、10μL的3wt%的双氧水配制成底物显色液。
终止液：向178.90 mL蒸馏水中逐滴加入98%硫酸21.70 mL配制为浓度为2mol/mL的硫酸溶液。
所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体由氨基酸合成序列如序列表SEQ ID No.1所示的多肽通过动物免疫制得：GPSGEPGTAGPPGTPGPQGFLGPPGFLGLPGSR；所述兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体由氨基酸合成序列如序列表SEQ ID No.2所示的多肽通过动物免疫制得：GPSGEPGTAGPPGTPGPQGLLGAPGFLGLPGSR。均委托杭州华安生物技术有限公司合成。
实施例1
一种区分羊皮种类的检测方法，包括以下步骤：
A）将0.05g羊皮检测样溶解于500mL的EB洗脱缓冲液中并搅拌均匀，静置后分别取85μL的上清液加入到酶标板A行孔、B行孔、E行孔和F行孔中；分别将85μL的PBS缓冲液加入到酶标板C行孔和D行孔中，将酶标板的A行孔、B行孔、C行孔、D行孔、E行孔和F行孔分别作为实验对照1、实验对照2、空白对照1、空白对照2、阴性对照1、阴性对照2；将酶标板4℃冷藏保存。
B）向酶标板各行孔中分别加入200μL封闭液，在37℃下封闭1.5h后，吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。
C）分别向酶标板A行孔、C行孔中加入85μL用封闭液稀释6500倍后的兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体；分别向酶标板B行孔、D行孔中加入85μL用封闭液稀释6500倍后的兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体；用保鲜膜封板，在37℃下温育1.5h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。其中，所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体和兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体的初始浓度为3.5mg/L。
D）分别向酶标板各行孔中加入85μL用封闭液稀释6500倍后的辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体，在37℃下温育1.5h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次，每次3min。所述辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体的初始浓度为1mg/L。
E）分别向酶标各行板孔中加入100μL底物显色液，于黑暗处反应10min。
F）分别向酶标板各行孔中加入85μL终止液，终止反应。
G）将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450nm处的吸光度值。
H）将空白对照1的OD均值+3个SD作为cut-off值，将空白对照2的OD均值+3个SD作为cut-off值；结果实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为山羊皮。
实施例2
A）将0.01g羊皮检测样溶解于1000mL的EB洗脱缓冲液中并搅拌均匀，静置后分别取120μL的上清液加入到酶标板A行孔、B行孔、E行孔和F行孔中；分别将120μL的PBS缓冲液加入到酶标板C行孔和D行孔中，将酶标板的A行孔、B行孔、C行孔、D行孔、E行孔和F行孔分别作为实验对照1、实验对照2、空白对照1、空白对照2、阴性对照1、阴性对照2；将酶标板4℃冷藏保存。
B）向酶标板各行孔中分别加入300μL封闭液，在36℃下封闭2h后，吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。
C）分别向酶标板A行孔、C行孔中加入120μL用封闭液稀释1000倍后的兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体；分别向酶标板B行孔、D行孔中加入120μL用封闭液稀释1000倍后的兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体；用保鲜膜封板，在36℃下温育2h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。其中，所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体和兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体的初始浓度为2mg/L。
D）分别向酶标板各行孔中加入120μL用封闭液稀释3000倍后的辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体，在36℃下温育2h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次，每次3min。所述辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体的初始浓度为1mg/L。
E）分别向酶标各行板孔中加入95μL底物显色液，于黑暗处反应8min。
F）分别向酶标板各行孔中加入120μL终止液，终止反应。
G）将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450nm处的吸光度值。
H）将空白对照1的OD均值+3个SD作为cut-off值，将空白对照2的OD均值+3个SD作为cut-off值；结果实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则证明所检测的样品为绵羊皮。
实施例3
A）将0.1g羊皮检测样溶解于100mL的EB洗脱缓冲液中并搅拌均匀，静置后分别取50μL的上清液加入到酶标板A行孔、B行孔、E行孔和F行孔中；分别将50μL的PBS缓冲液加入到酶标板C行孔和D行孔中，将酶标板的A行孔、B行孔、C行孔、D行孔、E行孔和F行孔分别作为实验对照1、实验对照2、空白对照1、空白对照2、阴性对照1、阴性对照2；将酶标板4℃冷藏保存。
B）向酶标板各行孔中分别加入100μL封闭液，在38℃下封闭1h后，吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。
C）分别向酶标板A行孔、C行孔中加入50μL用封闭液稀释12000倍后的兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体；分别向酶标板B行孔、D行孔中加入50μL用封闭液稀释12000倍后的兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体；用保鲜膜封板，在38℃下温育1h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次3min。其中，所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体和兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体的初始浓度为5mg/L。
D）分别向酶标板各行孔中加入50μL用封闭液稀释10000倍后的辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体，在38℃下温育1h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次，每次3min。所述辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体的初始浓度为1mg/L。
E）分别向酶标各行板孔中加入105μL底物显色液，于黑暗处反应12min。
F）分别向酶标板各行孔中加入50μL终止液，终止反应。
G）将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450nm处的吸光度值。
H）将空白对照1的OD均值+3个SD作为cut-off值，将空白对照2的OD均值+3个SD作为cut-off值；结果实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则证明所检测的样品为山羊皮。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A）将羊皮检测样溶于EB洗脱缓冲液中，静置后分别取50-120体积份上清液加入到酶标板A行孔、B行孔、E行孔和F行孔中；分别将50-120体积份PBS缓冲液加入到酶标板C行孔和D行孔中，将酶标板A行孔、B行孔、C行孔、D行孔、E行孔和F行孔分别作为实验对照1、实验对照2、空白对照1、空白对照2、阴性对照1、阴性对照2；将酶标板冷藏保存；
B）向酶标板各行孔分别加入100-300体积份封闭液，在36-38℃下封闭1-2h，吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤；
C）分别向酶标板A行孔、C行孔加入50-120体积份用封闭液稀释后的兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体；分别向酶标板B行孔、D行孔加入50-120体积份用封闭液稀释后的兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体；封板，在36-38℃下温育1-2h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤；
D）分别向酶标板各行孔加入50-120体积份用封闭液稀释后的辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体，在36-38℃下温育1-2h后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤；
E）分别向酶标各行板孔加入95-105体积份底物显色液，于黑暗处反应8-12min；
F）分别向酶标板各行孔加入50-120体积份终止液，终止反应；
G）将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450nm处吸光度值；
H）将空白对照1的OD均值+3个SD作为cut-off值，将空白对照2的OD均值+3个SD作为cut-off值；若实验对照1的OD均值＞空白对照1的cut-off值，则检测样为山羊皮；若实验对照2的OD均值＞空白对照2的cut-off值，则检测样为绵羊皮。
2.如权利要求1所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液由0.02wt%的KCl，0.027wt%的KH2PO4，0.8wt%的NaCl，0.358wt%的Na2HPO4·12H2O 和余量的蒸馏水组成。
3.如权利要求1所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述EB洗脱缓冲液的配制方法如下：将浓度为1 mol/L的Tris-HCl溶液、浓度为0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和浓度为20wt%的十二烷基硫酸钠溶液按体积比5:1:25混合制得混合溶液，按180g/31mL的固液比将尿素溶解于所述混合溶液中，配制成EB洗脱缓冲液。
4.如权利要求1或3所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，步骤A）中羊皮检测样与EB洗脱缓冲液的用量比为0.01-0.1g:100-1000mL。
5.如权利要求2所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述封闭液的配制方法如下：按0.1g/10mL的固液比将牛血清蛋白溶解于PBS缓冲液中。
6.如权利要求1所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述底物显色液的配制方法如下：将柠檬酸、NaHPO4·12H2O和蒸馏水按质量比1.02:3.68:100配制成pH为5的底物缓冲液，将所述底物缓冲液与TMB底物溶液、3wt%的双氧水按体积比900:100:1配制成底物显色液。
7.如权利要求1所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述终止液为浓度为2mol/mL的硫酸溶液。
8.如权利要求1所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体由氨基酸合成序列如序列表SEQ ID No.1所示的多肽通过动物免疫制得；所述兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体由氨基酸合成序列如序列表SEQ ID No.2所示的多肽通过动物免疫制得。
9.如权利要求1或5所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述兔抗山羊皮I型胶原蛋白抗体和兔抗绵羊皮I型胶原蛋白抗体的初始浓度为2-5mg/L，且用封闭液稀释的倍数为1000-12000倍。
10.如权利要求1或5所述的一种区分羊皮种类的检测方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）抗体的初始浓度为1mg/L，且用封闭液稀释的倍数为3000-10000倍。
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