CN112724260B - 一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112724260B CN112724260B CN202110052253.3A CN202110052253A CN112724260B CN 112724260 B CN112724260 B CN 112724260B CN 202110052253 A CN202110052253 A CN 202110052253A CN 112724260 B CN112724260 B CN 112724260B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant
- growth
- protein
- liposome
- promoting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 65
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000001814 protein method Methods 0.000 title description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 claims description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 claims description 2
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 claims 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 abstract description 16
- 101000824878 Gallus gallus Somatotropin Proteins 0.000 abstract description 15
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 13
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 abstract description 13
- 101000868144 Sus scrofa Somatotropin Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000031891 intestinal absorption Effects 0.000 abstract description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241001417092 Macrouridae Species 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 235000009233 Stachytarpheta cayennensis Nutrition 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008782 xin-kang Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
- A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Birds (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
Abstract
本发明涉及基因重组技术领域，具体公开了一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用，该重组兽用促生长蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，为猪生长激素和鸡生长激素的融合蛋白，可同时对猪和鸡的促生长起作用；该蛋白的分子量较大，可以较好的解决半衰期短的问题；采用脂质体将重组的融合蛋白包封在其中可避免胃肠道蛋白酶的分解，同时脂质体更重要的是具有促进吸收的作用可导引蛋白的穿肠吸收。本发明用重组的方式生产兽用促生长激素，较提取的方法简单且成本低，可以广泛应用于饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明属于基因重组技术领域及药剂领域，具体涉及一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白(Liposome-coated veterinary recombinant growth-promoting protein，L-VRGP)及其制备方法和应用。
背景技术
脂质体又称人工膜泡，是两性分子分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，无毒、无免疫原性，可用于转基因，或制备药物。
原核表达是蛋白重组的一种方法类别，是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。其优点在于能够短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。方法也比较简单，可以表达的蛋白也比较多，适合大规模生产工艺。
促生长蛋白常见的有生长激素和胰岛素生长因子，两者均为蛋白类物质。生长激素，是由垂体前叶分泌的含个氨基酸的单链多肽，几乎对所有组织的生长都有刺激作用。其促进生长的生理生化机制在于调节动物的蛋白质、脂肪和糖代谢。胰岛素生长因子是一种结构上相关的多肽类生长因子，是一种广谱性的促生长因子，是一类多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增殖，个体的生长、发育中具有很重要的促进作用。胰岛素生长因子的特点是，血清中的浓度受生长激素调节。大量研究工作表明，外源生长激素能够提高动物生长速度和饲料转化率，减少体脂、提高饲料转化率，具有明显的经济效益和社会效益。
目前有相关机构研制出了重组猪生长激素、鸡生长激素等，但多不能口服，也有公司研制出了含有转导蛋白的猪生长激素融合蛋白，但这种口服蛋白在胃肠道蛋白酶的作用下很快会被分解而丧失原有的生物学活性。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题，提供脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用，以提供一种可以同时对猪和鸡的促生长起作用，且半衰期较长的新型兽用促生长蛋白。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了重组兽用促生长蛋白，该重组兽用促生长蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，为猪生长激素氨基酸全长序列和鸡生长激素氨基酸全长序列通过柔性linker序列连接后，进行序列优化后获得的一种融合蛋白。
本发明还提供了一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，即采用脂质体将重组的融合蛋白包封在其中，可避免胃肠道蛋白酶的分解，同时脂质体更重要的是具有促进吸收的作用可导引蛋白的穿肠吸收。
作为本发明的进一步优化方案，所述脂质体为由大豆卵磷脂制备获得；利用大豆卵磷脂做脂质体材料，成本较低且安全性高。
本发明还提供了上述脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的制备方法，步骤包括：
步骤S1：人工合成所述重组兽用促生长蛋白的编码基因，并将该基因连接到蛋白表达载体上，获得重组质粒；
步骤S2：将重组质粒导入感受态细胞中，构建含有所述重组兽用促生长蛋白的编码基因的重组工程菌；
步骤S3：利用重组工程菌进行发酵表达，纯化，获得重组兽用促生长蛋白；
步骤S4：利用脂质体包封所述目的蛋白，获得脂质体包封的重组兽用促生长蛋白。
作为本发明的进一步优化方案，所述蛋白表达载体为pET32a质粒，所述感受态细胞为Rosetta(DE3)感受态细胞。
作为本发明的进一步优化方案，所述脂质体包封方法的步骤包括：
步骤S401：将大豆卵磷脂和胆固醇溶于污水乙醇中，冰浴超声溶解，制成膜材溶液；
步骤S402：用磷酸盐缓冲液溶解重组兽用促生长蛋白，获得蛋白溶解液；
步骤S403：将膜材溶液和蛋白溶解液的温度调节一致后混合，蒸发去除乙醇，滤膜过滤，得到脂质体包封的重组兽用促生长蛋白。
本发明还提供了上述脂质体包封的重组兽用促生长蛋白在用于制备畜禽用促生长饲料添加剂中的应用。
作为本发明的进一步优化方案，所述畜禽包括猪或鸡。
作为本发明的进一步优化方案，该脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的饲料添加量为每100kg饲料添加10g。
本发明的有益效果在于：
本发明与现有技术相比有如下特点：
1)本发明为基于猪生长激素和鸡生长激素所制备脂质体封包的融合蛋白，可同时对猪和鸡的生长起促进作用。
2)本发明采用融合蛋白的形式，蛋白分子量较大约为50kD，可以较好的解决半衰期短的问题。
3)本发明用重组的方式生产兽用促生长激素，较提取的方法简单且成本低，可以广泛应用于饲料添加剂。
附图说明
图1为重组兽用促生长蛋白wb验证图；图中，M：蛋白Marker 26616、泳道1：未进行优化的菌株产物使用猪生长激素抗体验证图、泳道2：序列优化后使用猪生长激素抗体验证图、泳道3：序列优化后使用鸡生长激素抗体验证图；
图2为制备的重组促生长蛋白脂质体电镜照片；
图3为大鼠血清重组兽用促生长蛋白浓度随时间变化图。
具体实施方式
下面对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的制备
(1)重组兽用促生长蛋白的基因序列的获取：
参考GENBANK登录号X53325.1，取猪生长激素氨基酸全长序列，参考GENBANK登录号M35609.1，取鸡生长激素氨基酸全长序列，上游添加酶切位点BamHⅠ、猪生长激素序列和鸡生长激素序列之间使用柔性linker以保护目的片段的空间结构，下游添加酶切位点EcoRⅠ，并对序列进行优化，将经序列优化后的目的基因序列送华大基因合成，测序合格，获得如SEQ ID NO:1所示的目标基因序列，其中，柔性linker序列如SEQ ID NO：2所示。
同时，取上述猪生长激素氨基酸全长序列和鸡生长激素氨基酸全长序列，上游添加酶切位点BamHⅠ、猪生长激素序列和鸡生长激素序列之间使用柔性linker以保护目的片段的空间结构，下游添加酶切位点EcoRⅠ，作为对照序列，送华大基因合成。
(2)工程菌构建：
使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种内切酶对两个合成的基因及pET32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并导入Rosetta(DE3)感受态细胞中，涂布于氨苄LB平板上，37℃恒温培养，挑取氨苄LB平板上长出的菌落送华大基因测序鉴定目的基因，测序结果与目的基因一致，表示表达载体构建成功，记为VRGP工程菌。
(3)发酵表达及纯化
取经测序VRGP工程菌于摇床37℃，220r/min培养至OD600为2左右，加入1‰的IPTG，随即将摇床的温度调为32℃，约5小时后收获。7000rpm 4℃离心15min，取上请即为目的蛋白VRGP粗制品。
采用GE Chelating Sepharose Fast Flow Ni2+螯合填料装填GE XK50自装柱，以3倍柱体积纯水清洗Ni2+亲和层析柱，后配制3倍柱体积Binding Buffer A(7.16g/LNa2HPO4·12H2O，29.22g/L NaCl，3.06g/L咪唑，pH 8.0)过柱平衡并实时检测电导率及UV280nm吸收值，待二者皆稳定后开始上样。上样完毕后，继续以Binding Buffer A平衡层析柱直至UV280 nm吸收值稳定为止。配制Elution Buffer A(7.16g/L Na2HPO4·12H2O，29.22g/L NaCl，34g/L咪唑，pH 8.0)过柱进行洗脱，当UV280nm吸收值开始上升时收集洗脱液，直至吸收值下降至稳定水平时停止收集。以5倍柱体积超纯水清洗层析柱，后加入20％乙醇封存。将收集的洗脱液置于20倍柱体积PBS缓冲液中透析12h。使用冰乙酸快速调节pH值至5.0±0.2，12000rpm 15min离心后收集上清。以流速5ml/min超纯水冲洗层析柱至出液端液体pH为中性。配制Binding Buffer B(4.1g/L乙酸钠，pH 5.0±0.2)平衡层析柱，至出液端液体pH与Binding Buffer B一致。以流速3ml/min上样，待UV280nm吸收值开始上升时收样。上样结束后以Binding Buffer B平衡层析柱至UV280nm吸收值下降时停止收样。以2倍柱体积2M NaCl处理层析柱，再以2倍柱体积2M NaCl-1M NaOH处理层析柱并加超纯水冲洗层析柱至pH中性，最后加入10mM NaOH封存。将上样前后平衡层析柱收集的样品进行无菌过滤处理，处理后样品即为纯化的目的蛋白，记为VRGP。
使用biorbyt公司猪生长激素抗体(orb24331)、鸡生长激素抗体(orb176913)为第一抗体，使用biorbyt公司山羊抗鼠IgG(HRP标记)为第二抗体做WB，如图1所示，本发明样本在50kD处有阳性条带，表明表达蛋白为猪生长激素和鸡生长激素的融合蛋白，而未优化的对照样本无条带，说明未优化的序列连接后并没有正常表达。
(4)脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的制备
将纯度为98％的大豆卵磷脂100g和胆固醇60g溶于500mL无水乙醇中，300W冰浴超声10分钟，超声1S间歇1S，超声2次，溶解制成膜材溶液，并置于42℃水浴待用；取重组兽用促生长蛋白1g溶解于100mL pH7.0的磷酸盐缓冲液中，置于37℃水浴。待两者温度达到后将两者混合搅拌10min，旋转蒸发除去乙醇。使用0.45μm滤膜过滤得到脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，呈双层囊膜结构，其粒径约100nm，见图2。记为L-VRGP。
实施例2：脂质体包封的重组兽用促生长蛋白口服后血清浓度检测
选取健康雄性SD大鼠(购自安徽省实验动物中心)5只，体重约200克。禁食不禁水12h后取实施例1所制备的脂质体包封的重组兽用促生长蛋白PBS稀释至1mg/ml，每只大鼠灌胃给予1ml。分别于试验开始前(0h)和灌胃后1、3、5、7、12、18、24h鼠尾取血200μL，4℃放置1h，7000rpm离心15分钟分离血清，立即冻存于-70℃，最后一次采血后也冻存于-70℃2h以上冻实，保证所有血清在进行ELISA检测时均冻融了1次。本重组蛋白为猪生长激素和鸡生长激素的融合蛋白，选择价格便宜的鸡生长激素ELISA测定试剂盒Biorbyt(orb439751)，按说明书操作，测定大鼠血清中鸡生长素的含量，即可表示重组兽用促生长蛋白在大鼠血清中的含量。SD大鼠口服脂质体包封的重组兽用促生长蛋白后1h血清中即可检出，至5小时达到峰值浓度(98ng/mL)，达到峰值后开始缓慢下降，半衰期大约22h，如表1和图1所示，可以看出，本申请的兽用促生长蛋白的半衰期比现有常规产品要长，提示饲喂周期可以1-2天1次。
表1大鼠血清VRGP浓度随时间变化表
| 时间(h) | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 12 | 18 | 24 |
| 浓度(ng/mL) | 0 | 18 | 65 | 98 | 96 | 75 | 62 | 37 |
实施例3：脂质体包封的重组兽用促生长蛋白促生长性能验证
取实施例1制备的脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，按100kg饲料添加10g L-VRGP进行配比搅拌混匀。饲料选用安徽新康饲料厂生产的猪通用型饲料和鸡通用型饲料。分别添加L-VRGP 0.1mg/g的饲料记为饲料A，未添加L-VRGP的普通饲料记为饲料B，添加VRGP0.1mg/g的饲料记为饲料C。
选取21日龄、体重在250±50g的白羽仔鸡30只，雌雄各半，随机分成3组，每组10只，做脚标。选取60日龄、体重在20±0.5kg的健康三元仔猪30头，公母各半，随机分成3组，每组10头，打耳标。A组：10只21日龄白羽鸡、10头60日龄猪，饲喂饲料A；B组：10只21日龄白羽鸡、10头60日龄猪，饲喂饲料B；C组：10只21日龄白羽鸡、10头60日龄猪，饲喂饲料C；于相同条养殖，鸡饲喂养殖14天，猪饲喂养殖30天。
饲喂期内未出现死亡及发病情况，饲喂添加脂质体包封的重组兽用促生长激素饲料的A组：猪平均体重增加1.42kg/只/天，鸡平均体重增加40.4g/只/天；饲喂普通饲料的B组：猪平均体重增加0.74kg/只/天，鸡平均体重增加30.7g/只/天；饲喂添加重组兽用促生长激素饲料的C组：猪平均体重增加0.99kg/只/天，鸡平均体重增加35.9g/只/天。白羽仔鸡组：A组较B组日均增重增长31.6％，A组较C组日均增重增长12.6％。三元仔猪组：A组较B组日均增重增长91.9％，A组较C组日均增重增长43.4％；如下表所示。说明本发明脂质体包封的重组兽用促生长蛋白相比重组兽用促生长蛋白对猪和鸡都有较好的促生长的作用。
表2生长性能统计表(三元仔猪：kg，白羽仔鸡：g)
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽中起生物科技有限公司
<120> 一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用
<141> 2021-01-15
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggatccatgg cggcgggccc gcgcaccagc gcgctgctgg cgtttgcgct gctgtgcctg 60
ccgtggaccc gcgaagtggg cgcgtttccg gcgatgccgc tgagcagcct gtttgcgaac 120
gcggtgctgc gcgcgcagca tctgcatcag ctggcggcgg atacctataa agaatttgaa 180
cgcgcgtata ttccggaagg ccagcgctat agcattcaga acgcgcaggc ggcgttttgc 240
tttagcgaaa ccattccggc gccgaccggc aaagatgaag cgcagcagcg cagcgatgtg 300
gaactgctgc gctttagcct gctgctgatt cagagctggc tgggcccggt gcagtttctg 360
agccgcgtgt ttaccaacag cctggtgttt ggcaccagcg atcgcgtgta tgaaaaactg 420
aaagatctgg aagaaggcat tcaggcgctg atgcgcgaac tggaagatgg cagcccgcgc 480
gcgggccaga ttctgaaaca gacctatgat aaatttgata ccaacctgcg cagcgatgat 540
gcgctgctga aaaactatgg cctgctgagc tgctttaaaa aagatctgca taaagcggaa 600
acctatctgc gcgtgatgaa atgccgccgc tttgtggaaa gcagctgcgc gtttggcggc 660
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagca tggcgccggg cagctggttt 720
agcccgctgc tgattgcggt ggtgaccctg ggcctgccgc aggaagcggc ggcgaccttt 780
ccggcgatgc cgctgagcaa cctgtttgcg aacgcggtgc tgcgcgcgca gcatctgcat 840
ctgctggcgg cggaaaccta taaagaattt gaacgcacct atattccgga agatcagcgc 900
tataccaaca aaaacagcca ggcggcgttt tgctatagcg aaaccattcc ggcgccgacc 960
ggcaaagatg atgcgcagca gaaaagcgat atggaactgc tgcgctttag cctggtgctg 1020
attcagagct ggctgacccc ggtgcagtat ctgagcaaag tgtttaccaa caacctggtg 1080
tttggcacca gcgatcgcgt gtttgaaaaa ctgaaagatc tggaagaagg cattcaggcg 1140
ctgatgcgcg aactggaaga tcgcagcccg cgcggcccgc agctgctgcg cccgacctat 1200
gataaatttg atattcatct gcgcaacgaa gatgcgctgc tgaaaaacta tggcctgctg 1260
agctgcttta aaaaagatct gcataaagtg gaaacctatc tgaaagtgat gaaatgccgc 1320
cgctttggcg aaagcaactg caccatttag gaattc 1356
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcatggc gccgggcagc 60
Claims (8)
1.一种重组兽用促生长蛋白，其特征在于，该重组兽用促生长蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，其特征在于，包括如权利要求1所述的重组兽用促生长蛋白，以及包裹在该蛋白外部的脂质体。
3.根据权利要求2所述的一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，其特征在于，所述脂质体为由大豆卵磷脂制备获得。
4.一种如权利要求2的脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的制备方法，其特征在于，步骤包括：
步骤S1：人工合成所述重组兽用促生长蛋白的编码基因，并将该基因连接到蛋白表达载体上，获得重组质粒；
步骤S2：将重组质粒导入感受态细胞中，构建含有所述重组兽用促生长蛋白的编码基因的重组工程菌；
步骤S3：利用重组工程菌进行发酵表达，纯化，获得重组兽用促生长蛋白；
步骤S4：利用脂质体包封目的蛋白，获得脂质体包封的重组兽用促生长蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白表达载体为pET32a质粒，所述感受态细胞为Rosetta(DE3)感受态细胞。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，脂质体包封的步骤包括：
步骤S401：将大豆卵磷脂和胆固醇溶于污水乙醇中，冰浴超声溶解，制成膜材溶液；
步骤S402：用磷酸盐缓冲液溶解重组兽用促生长蛋白，获得蛋白溶解液；
步骤S403：调节膜材溶液和蛋白溶解液的温度至37-42℃，混合，蒸发去除乙醇，滤膜过滤，得到脂质体包封的重组兽用促生长蛋白。
7.一种如权利要求2所述的脂质体包封的重组兽用促生长蛋白在制备猪或鸡用促生长饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的饲料添加量为每100kg饲料添加10g。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110052253.3A CN112724260B (zh) | 2021-01-15 | 2021-01-15 | 一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110052253.3A CN112724260B (zh) | 2021-01-15 | 2021-01-15 | 一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112724260A CN112724260A (zh) | 2021-04-30 |
| CN112724260B true CN112724260B (zh) | 2021-11-30 |
Family
ID=75593249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110052253.3A Active CN112724260B (zh) | 2021-01-15 | 2021-01-15 | 一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112724260B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1205551A1 (en) * | 2000-11-09 | 2002-05-15 | Pfizer Products Inc. | Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions |
| CN1380097A (zh) * | 2002-04-18 | 2002-11-20 | 江南大学 | 一种猪用生长激素脂质体及其制备方法 |
| CN112175964A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-01-05 | 安徽中起生物科技有限公司 | 一种重组猪生长激素及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1204321B1 (en) * | 1999-07-26 | 2005-11-09 | Baylor College Of Medicine | Super-active porcine growth hormone releasing hormone analog |
-
2021
- 2021-01-15 CN CN202110052253.3A patent/CN112724260B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1205551A1 (en) * | 2000-11-09 | 2002-05-15 | Pfizer Products Inc. | Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions |
| CN1380097A (zh) * | 2002-04-18 | 2002-11-20 | 江南大学 | 一种猪用生长激素脂质体及其制备方法 |
| CN112175964A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-01-05 | 安徽中起生物科技有限公司 | 一种重组猪生长激素及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "A reusable liposome array and its application to assay of growth-hormone-related peptides";Atsushi Shoji等;《Anal Bioanal Chem》;20100320;第397卷(第3期);第1377-1381页 * |
| "重组生长激素对猪生长激素受体和胰岛素样生长因子1 基因表达及血清瘦蛋白水平的影响";青清富等;《中国科学》;20021020;第32卷(第5期);第430-435页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112724260A (zh) | 2021-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101240033B (zh) | 一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN112111474B (zh) | 一种酶活性提高的重组溶菌酶lyz-2及其突变体和应用 | |
| CN113575915B (zh) | 牡蛎酱油的制备方法 | |
| CN102295695B (zh) | 重组人促卵泡激素及其制备 | |
| Li et al. | Expression of common carp growth hormone in the yeast Pichia pastoris and growth stimulation of juvenile tilapia (Oreochromis niloticus) | |
| US12049657B1 (en) | Type III collagen peptide and preparation method thereof | |
| WO2014005466A1 (zh) | 改善缺铁性贫血的产品及其制备方法 | |
| CN104561020A (zh) | 一种重组人生长激素的编码基因及其应用 | |
| CN115960211A (zh) | 一种重组人源ⅵ型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN108976294A (zh) | 大黄鱼神经肽y及其重组表达方法和应用 | |
| Acosta et al. | Tilapia somatotropin polypeptides: potent enhancers of fish growth and innate immunity | |
| CN112724260B (zh) | 一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用 | |
| Deng et al. | Cell factory-based milk protein biomanufacturing: Advances and perspectives | |
| CN103173440A (zh) | 一种高效分泌表达重组人生长激素的操纵子、载体和工程菌及载体和工程菌的制备方法 | |
| CN103936864B (zh) | 一种口服猪生长激素融合蛋白及其应用 | |
| CN103074362B (zh) | 一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用 | |
| CN110607306A (zh) | 一种重组猪表皮生长因子的表达方法 | |
| CN108752459A (zh) | 半滑舌鳎igf-i蛋白及其体外表达制备方法与应用 | |
| TWI414244B (zh) | 具有胰脂肪酶活性的重組型多肽暨其核酸編碼序列以及它們的生成與應用 | |
| CN110317821A (zh) | 一种融合蛋白thg及其应用 | |
| CN111808201A (zh) | 重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法 | |
| Liu et al. | Stable cell-surface expression of Japanese flounder growth hormone in yeast Saccharomyces cerevisiae and growth-promoting effect on juvenile fish by oral administration | |
| RU2451750C2 (ru) | Способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека | |
| CN111202169B (zh) | 一种包含牦牛β-防御素4的非蛋白氮饲料添加剂 | |
| CN109021085A (zh) | 曼氏无针乌贼神经肽y及其重组表达方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |