CN108251346A - 一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明将密码子优化后的水蛭透明质酸酶基因前端添加谷氨酸棒杆菌信号肽后构建重组质粒，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌中获得能高效分泌表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌，发酵液中透明质酸酶的酶活达12000U/ml。本发明利用该重组谷氨酸棒杆菌发酵产生的透明质酸酶可以在温和的条件下将高分子量透明质酸高效酶解成低分子量的透明质酸，从而精确控制所需的分子量，且生产过程没有明显的污染，能耗小，成本低，适于规模化生产小分子量透明质酸，具有重要的工业应用前景。

Description

一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其在生产小分子量透明质酸中的应用。
背景技术
透明质酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键连接而成的高分子多糖类物质，又称玻尿酸。透明质酸广泛地存在于人体的各个部位，具有极其重要的生理作用，如协助水电解质的扩散转运，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等。另外，透明质酸具有极强的保湿作用，被称为理想的天然保湿因子。它是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。透明质酸具有不同的分子量，其分布从几千到几百万道尔顿，因其分子量的不同，其性能及应用也有所不同。小分子量的透明质酸(分子量<10万)能渗入真皮，容易被人体吸收，因此主要作于保健食品，美容食品及药物载体领域；中分子量的透明质酸(10万<分子量<100万)能够紧致肌肤，因此在保湿、面膜、化妆品领域具有广泛应用；大分子的透明质酸(分子量>100万)，可以作为皮肤填充剂，在美容、医药领域具有广泛的应用。目前全球透明质酸的市场已经超过100亿美元。
目前小分子量透明质酸的生产方法主要是通过机械破碎法或者化学法，能耗和污染较大，且透明质酸的分子量难以控制，不适用规模化生产小分子量透明质酸。
发明内容
本发明目的是提供一种能够表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其在生产小分子量透明质酸中的应用。
本发明提供的表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌含有透明质酸酶基因。
所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述透明质酸酶基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，本发明的重组谷氨酸棒杆菌，通过以下步骤构建得到：以SEQ ID NO.2所示的基因为模板，以SEQ ID NO.3-4所示序列为引物进行PCR，扩增获得约1.6kb的hya片段，将该片段酶切后与载体进行连接，获得的重组质粒，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。
在本发明的实施例中，是将得到的hya片段用SalI/EcoRI进行双酶切，并与同样进行SalI/EcoRI双酶切的pEC-H36进行连接，获得的重组质粒命名为pEC-hya，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。
本发明提供了上述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸酶中的应用。
所述应用是将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/L of K2HPO4,1-3g/L KH2PO4,1-5g/L尿素,5-30g/L(NH4)2SO4,0.5-2.5g/L MgSO4,100-500μg/L生物素,1-5mg/L的维生素B1,5-20mg/L的泛酸钙,5-20mg/L的FeSO4,1-5mg/L的MnSO4,1-10mg/L的ZnSO4,100-500μg/L的CuSO4,5-20mg/L的CaCl2,1-10g/L的酵母粉,1-10g/L的酪蛋白水解物，25-20mg/L的卡那霉素。
上述应用的发酵过程温度控制在28-33℃，溶氧控制在30％以上，pH控制在6.0-7.0，发酵过程流加葡萄糖使得发酵罐中葡萄糖浓度维持在5-10g/L，发酵周期36-48h。
本发明提供了一种生产小分子量透明质酸的方法，是在大分子量的透明质酸溶液中加入权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的发酵上清液，通过控制反应时间，制备所需小分子量的透明质酸。
进一步地，大分子量的透明质酸溶液的浓度为20-50g/L，并加入1-5倍体积发酵上清液，30-37℃放置6-24h，制得小分子量的透明质酸。
所述发酵上清液是将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养得到；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/L of K2HPO4,1-3g/L KH2PO4,1-5g/L尿素,5-30g/L(NH4)2SO4,0.5-2.5g/L MgSO4,100-500μg/L生物素,1-5mg/L的维生素B1,5-20mg/L的泛酸钙,5-20mg/L的FeSO4,1-5mg/L的MnSO4,1-10mg/L的ZnSO4,100-500μg/L的CuSO4,5-20mg/L的CaCl2,1-10g/L的酵母粉,1-10g/L的酪蛋白水解物，25-20mg/L的卡那霉素。
本发明的重组谷氨酸棒杆菌能高效分泌表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌，发酵液中透明质酸酶的酶活达12000U/ml。本发明利用该重组谷氨酸棒杆菌发酵产生的透明质酸酶可以在温和的条件下将高分子量透明质酸高效酶解成低分子量的透明质酸，从而精确控制所需的分子量，且生产过程没有明显的污染，能耗小，成本低，适于规模化生产小分子量透明质酸，具有重要的工业应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1构建高效表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌
根据水蛭的透明质酸酶的氨基酸序列，并在其前端添加了谷氨酸棒杆菌的信号肽Cg1514(SEQ ID NO.5)，设计了可在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的透明质酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。根据该氨基酸序列以及谷氨酸棒杆菌的密码子偏好性，设计了优化的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示，委托青兰生物进行基因合成。以该合成的基因为模板，以hya-F(agaggtcgacATCAGGAGCTCTTTATGTTAAACAGAGTCAGTCGTATTG)和hya-R(actggaattcttactttttgcaggcctctaca)为引物进行PCR，扩增获得约1.6kb的hya片段。将该片段用SalI/EcoRI进行双酶切，并与同样进行SalI/EcoRI双酶切的pEC-H36(ScientificReports,2017,7:42246)进行连接，获得的重组质粒命名为pEC-hya。将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌ATCC 13869，获得的重组菌株命名为C.glutamicum-hya。电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。
实施例2利用重组菌发酵生产透明质酸酶
利用实施例1中所述的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-hya发酵生产透明质酸酶，其方法为：C.glutamicum-hya接种于100ml的LB液体培养基中(10g/L的蛋白胨，5g/L的氯化钠，10g/L的酵母粉，25ug/ml的氯霉素)，30℃培养16h。
将100ml的上述种子液接种于1L的发酵液培养基中，在发酵罐中进行流加培养。发酵培养基为：30g/L的葡萄糖，3g/L of K2HPO4,1g/L KH2PO4,2g/L尿素,10g/L(NH4)2SO4,2g/L MgSO4,500μg/L生物素,5mg/L的微生物B1,10mg/L的泛酸钙,10mg/L的FeSO4,1mg/L的MnSO4,1mg/L的ZnSO4,200μg/L的CuSO4,10mg/L的CaCl2,5g/L的酵母粉,7g/L的酪蛋白水解物，25mg/L的卡纳霉素。
发酵过程温度控制在30℃，溶氧控制在30％以上，用氨水控制pH在6.0-7.0，发酵过程流加600g/L的葡萄糖使得发酵罐中葡萄糖浓度维持在5-10g/L，发酵周期48h。
取5ml 48h时的发酵液离心，弃去沉淀，检测上清液中透明质酸酶的活性。检测方法如下：在1ml的体系中包含50mM的KH2PO4(pH5.5)，2g/L的透明质酸，100ul的发酵上清液，37℃反应20min后检测还原糖的当量。结果显示，发酵中透明质酸酶的酶活达到12000U/ml。说明利用本发明构建的重组谷氨酸棒杆菌可以高效分泌表达有活性的透明质酸酶。
实施例3利用透明质酸酶发酵液制备低分子量透明质酸的方法
利用实施例2中包含透明质酸的发酵上清液可以高效制备特定分子量的透明质酸，方法如下：将分子量约为120万的透明质酸用50mM的KH2PO4配制成20g/L的透明质酸溶液(pH5.5)，加入1倍体积的实施例二中的谷氨酸棒杆菌发酵上清液，37℃反应24h小时，每6h取样检测透明质酸的分子量，6h、12h、18h、24h时透明质酸的分子量分别为42万、12万、7万和2万。因此可以通过控制反应的时间，制备所需分子量的透明质酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
<130> KHP171119363.2
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Asn Arg Val Ser Arg Ile Ala Gly Ala Ser Ala Ile Thr Leu
1 5 10 15
Cys Ile Gly Leu Thr Thr Ile Leu Ser Pro Thr Ser Thr Ala Gln Ser
20 25 30
His His His His His His Met Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp
35 40 45
Lys Asn Val Ile Ala Ser Val Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe
50 55 60
Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile
65 70 75 80
Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr
85 90 95
Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp
100 105 110
Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro
115 120 125
Glu Thr Ala Thr Ile Thr Arg Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn
130 135 140
Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser
145 150 155 160
Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr
165 170 175
Glu Ile Gly Lys Lys Met Thr Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu
180 185 190
Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn Ile Asp
195 200 205
Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr
210 215 220
Glu Lys Gln Val Gly Glu Asp Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu
225 230 235 240
Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly
245 250 255
Trp Met Gly Val Ser Tyr Val Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp
260 265 270
His Val Thr Ala Phe Thr Leu His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln
290 295 300
Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys
305 310 315 320
Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly
325 330 335
Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp
340 345 350
Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln
355 360 365
Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu
370 375 380
Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly
385 390 395 400
Asn Thr Val Phe Lys Val Asp Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg
405 410 415
Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg
420 425 430
Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu
435 440 445
Asp Val Thr Leu Lys Ile Asp Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Ile Tyr Ser
450 455 460
Tyr Ile Leu Thr Pro Glu Gly Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu
465 470 475 480
Leu Asn Gly Lys Glu Leu Lys Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu
485 490 495
Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe
500 505 510
Gly Phe Phe Val Val Ser Asp Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys
515 520 525
<210> 2
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttaaaca gagtcagtcg tattgcaggc gcttctgcaa tcacactatg catcggctta 60
accacaatac taagccctac ttccactgca caaagccatc atcatcatca tcacatgaag 120
gagattgcgg tcacgattga tgacaaaaat gtaatcgctt ccgtgtctga gtctttccac 180
ggagtagcat tcgacgcgtc gttgtttagc ccaaaaggac tctggtcgtt tgtcgacatt 240
acctctccca aacttttcaa gctgcttgaa ggcttgagcc caggttattt ccgggttgga 300
ggaacttttg cgaattggct ttttttcgat ctcgatgaga ataacaaatg gaaggattat 360
tgggcgttca aagacaagac ccccgagacg gctaccatta cgcggcggtg gttgttccgt 420
aaacagaata acttgaaaaa ggagacgttc gacgatctcg ttaagctgac gaagggttct 480
aaaatgcgcc tcctgttcga cctgaatgct gaagtgcgga cgggctacga gatcggtaaa 540
aagatgacgt caacctggga ctcctcagag gcagaaaaat tgtttaaata ctgtgtgtca 600
aagggatacg gagacaatat cgactgggag ctcggtaatg aaccagacca tacttccgcg 660
cataacctca cggaaaaaca agtaggagaa gatttcaagg cgttgcacaa agtgttggag 720
aaatatccga ccctcaataa aggctcactg gtaggtccgg atgtgggttg gatgggtgtg 780
tcgtacgtaa agggcctggc agacggtgca ggagaccatg tcacggcctt tactctgcat 840
cagtactact ttgatggaaa tacctcggat gtttcgacgt atttggacgc gacttatttc 900
aagaagcttc aacagctctt tgataaggtc aaagatgttc ttaagaactc cccacataag 960
gacaagccgc tctggttggg agaaacttct tcaggttaca atagcggcac gaaagatgtg 1020
tcggatcggt acgtcagcgg ttttcttact cttgacaaac ttggtctgtc tgctgcaaat 1080
aacgtaaaag tggttatccg gcaaaccatt tataacggat actacggtct cctcgacaaa 1140
aacacgctcg aaccgaatcc tgactactgg ttgatgcacg tacataatag ccttgttggc 1200
aatacggttt ttaaagtgga tgtctccgat cccaccaaca aggcacgtgt ctatgcccaa 1260
tgtacgaaga ccaactctaa gcatactcaa tcccgttatt ataagggatc tttgactatc 1320
tttgcactta acgtcggaga tgaagacgtt actttgaaga ttgatcaata ctcaggtaag 1380
aagatctata gctacatcct tactcccgaa ggcggtcagc tgacctcgca gaaggttctc 1440
ctgaatggta aggaactcaa gcttgtatct gatcaactcc cagaacttaa cgcagatgaa 1500
tctaagacct ccttcacgct ttcccccaag actttcggct ttttcgtggt atcagatgcc 1560
aatgtagagg cctgcaaaaa gtaa 1584
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaggtcgac atcaggagct ctttatgtta aacagagtca gtcgtattg 49
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actggaattc ttactttttg caggcctcta ca 32
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Leu Asn Arg Val Ser Arg Ile Ala Gly Ala Ser Ala Ile Thr Leu
1 5 10 15
Cys Ile Gly Leu Thr Thr Ile Leu Ser Pro Thr Ser Thr Ala Gln Ser
20 25 30

Claims (10)

1.一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，该重组谷氨酸棒杆菌含有透明质酸酶基因。
2.如权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述透明质酸酶基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其通过以下步骤构建得到：以SEQ IDNO.2所示的基因为模板，以SEQ ID NO.3-4所示序列为引物进行PCR，扩增获得约1.6kb的hya片段，将该片段酶切后与载体进行连接，获得的重组质粒，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。
5.权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸酶中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/L of K2HPO4,1-3g/L KH2PO4,1-5g/L尿素,5-30g/L(NH4)2SO4,0.5-2.5g/L MgSO4,100-500μg/L生物素,1-5mg/L的维生素B1,5-20mg/L的泛酸钙,5-20mg/L的FeSO4,1-5mg/L的MnSO4,1-10mg/L的ZnSO4,100-500μg/L的CuSO4,5-20mg/L的CaCl2,1-10g/L的酵母粉,1-10g/L的酪蛋白水解物，25-20mg/L的卡那霉素。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，发酵过程温度控制在28-33℃，溶氧控制在30％以上，pH控制在6.0-7.0，发酵过程流加葡萄糖使得发酵罐中葡萄糖浓度维持在5-10g/L，发酵周期36-48h。
8.一种生产小分子量透明质酸的方法，其特征在于，在大分子量的透明质酸溶液中加入权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的发酵上清液，通过控制反应时间，制备所需小分子量的透明质酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，大分子量的透明质酸溶液的浓度为20-50g/L，并加入1-5倍体积发酵上清液，30-37℃放置6-24h，制得小分子量的透明质酸。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述发酵上清液是将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养得到；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/L of K2HPO4,1-3g/L KH2PO4,1-5g/L尿素,5-30g/L(NH4)2SO4,0.5-2.5g/L MgSO4,100-500μg/L生物素,1-5mg/L的维生素B1，5-20mg/L的泛酸钙,5-20mg/L的FeSO4,1-5mg/L的MnSO4,1-10mg/L的ZnSO4,100-500μg/L的CuSO4,5-20mg/L的CaCl2,1-10g/L的酵母粉,1-10g/L的酪蛋白水解物，25-20mg/L的卡那霉素。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021077580A1 (zh) * 2019-10-24 2021-04-29 华熙生物科技股份有限公司 一种高效合成高纯度透明质酸及其寡聚糖的重组谷氨酸棒状杆菌
CN114350639A (zh) * 2021-03-05 2022-04-15 华熙生物科技股份有限公司 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达
CN114480409A (zh) * 2022-02-25 2022-05-13 江南大学 一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法
CN117887691A (zh) * 2023-12-27 2024-04-16 山东福瑞达医药集团有限公司 一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1810968A (zh) * 2005-04-26 2006-08-02 清华大学 一种调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法
CN103937734A (zh) * 2014-04-23 2014-07-23 清华大学 一种高产透明质酸的基因工程菌及其应用
EP2851421A4 (en) * 2012-07-03 2015-11-25 Genaris Inc USEFUL MICROORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING A DESIRED SUBSTANCE
CN106190939A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 清华大学 高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法与应用
CN106367459A (zh) * 2016-09-30 2017-02-01 江南大学 一种制备不同分子量寡聚透明质酸的方法
WO2017048850A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Advaxis, Inc. Listeria-based immunogenic compositions and methods of use thereof in cancer prevention and treatment
CN107354119A (zh) * 2017-07-19 2017-11-17 清华大学 一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1810968A (zh) * 2005-04-26 2006-08-02 清华大学 一种调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法
EP2851421A4 (en) * 2012-07-03 2015-11-25 Genaris Inc USEFUL MICROORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING A DESIRED SUBSTANCE
CN103937734A (zh) * 2014-04-23 2014-07-23 清华大学 一种高产透明质酸的基因工程菌及其应用
CN103937734B (zh) * 2014-04-23 2016-05-11 清华大学 一种生产透明质酸的基因工程菌及其应用
WO2017048850A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Advaxis, Inc. Listeria-based immunogenic compositions and methods of use thereof in cancer prevention and treatment
CN106190939A (zh) * 2016-07-18 2016-12-07 清华大学 高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法与应用
CN111040980A (zh) * 2016-07-18 2020-04-21 清华大学 高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN106367459A (zh) * 2016-09-30 2017-02-01 江南大学 一种制备不同分子量寡聚透明质酸的方法
CN107354119A (zh) * 2017-07-19 2017-11-17 清华大学 一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENG, FANGYU等: "Enhanced Biosynthesis of Hyaluronic Acid Using Engineered Corynebacterium glutamicum Via Metabolic Pathway Regulation", 《BIOTECHNOLOGY JOURNAL》 *
SUNG SUN YIM等: "Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
原攀红等: "体外酶法水解制备小分子透明质酸", 《食品科学技术学报》 *
李思明: "《FGF21蛋白抗类风湿性关节炎研究》", 30 June 2017, 科学技术文献出版社 *
胡立涛等: "代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成透明质酸", 《食品与发酵工业》 *
金国琴等主编: "《生物化学（第3版）》", 31 August 2017, 上海科学技术出版社 *
阮红等: "《基因工程原理》", 30 September 2007, 浙江大学出版社 *
陈清西编著: "《酶学及其研究技术（第二版）》", 31 May 2015, 厦门大学出版社 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021077580A1 (zh) * 2019-10-24 2021-04-29 华熙生物科技股份有限公司 一种高效合成高纯度透明质酸及其寡聚糖的重组谷氨酸棒状杆菌
US12054760B2 (en) 2019-10-24 2024-08-06 Bloomage Biotechnology Corporation Limited High-efficiency synthesis and high-purity hyaluronic acid, and recombinant Corynebacterium glutamicum for oligosaccharide thereof
CN114350639A (zh) * 2021-03-05 2022-04-15 华熙生物科技股份有限公司 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达
WO2022183541A1 (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 华熙生物科技股份有限公司 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达
CN114350639B (zh) * 2021-03-05 2023-06-02 华熙生物科技股份有限公司 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达
CN114480409A (zh) * 2022-02-25 2022-05-13 江南大学 一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法
CN114480409B (zh) * 2022-02-25 2023-09-12 江南大学 一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法
CN117887691A (zh) * 2023-12-27 2024-04-16 山东福瑞达医药集团有限公司 一种透明质酸酶融合蛋白、酵母工程菌及构建方法与应用

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