CN114480409B

CN114480409B - 一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法

Info

Publication number: CN114480409B
Application number: CN202210178585.0A
Authority: CN
Inventors: 许菲; 张萌; 齐静静
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114480409A

Abstract

本发明公开了一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。本发明提供了编码胶原蛋白的核苷酸序列，并搭建了谷氨酸棒杆菌分泌表达具有三股螺旋结构的重组胶原蛋白的平台，并通过引入6种不同信号肽(CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA)构建重组表达载体，及通过对培养基、起始诱导菌浓、诱导时长、IPTG浓度、溶氧等条件的优化，使胶原蛋白的产量达75mg/L，胶原域产量约30mg/L。本研究为重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的高效分泌表达奠定了基础。

Description

一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法

技术领域

本发明涉及一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，是动物结缔组织和细胞外基质(ECM)的重要组成成分。胶原蛋白典型的三股螺旋结构决定了其具有良好的生物力学性能和生物相容性，在医药组织工程、化妆品、食品等领域应用广泛。胶原蛋白的获取可通过动物提取，但具有潜在的免疫原性，有安全隐患；也可通过转基因动植物表达和化学合成获得，但价格昂贵、产量低；微生物发酵表达重组胶原蛋白由于具有安全性高、成本低、产量高、序列设计灵活等优点，近年来受到人们的关注。

目前重组胶原蛋白常用的表达系统有大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia pastoris)，大肠杆菌具有发酵周期短、表达量高、便于遗传操作等特点，将来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的胶原蛋白Scl2在大肠杆菌中表达，在缺乏脯氨酸羟化酶修饰的情况下，仍能形成稳定的三螺旋结构。但由于大肠杆菌外膜的屏障作用，外源蛋白多为胞内表达，且易形成包涵体。酵母作为真核表达系统，可进行翻译后修饰，并且无致病性，但是分泌的胶原蛋白大多为单链，分泌带有三股螺旋结构的胶原蛋白一直是研究的难点。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是公认的符合食品安全标准的宿主，含有丰富的信号肽序列，并且具有单层膜结构，胞外很少检测到蛋白酶活性，是很有潜力的异源蛋白分泌表达的宿主，目前还未有胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达的相关报道。

发明内容

为了解决上述胶原蛋白常用表达系统存在的问题，本发明通过在谷氨酸棒杆菌中建立胶原蛋白的分泌表达体系，通过发酵条件优化进一步提高胞外分泌产量，使胞外具有三股螺旋结构的胶原蛋白V-B在信号肽PorB的介导下产量由0提高到75mg/L，三股螺旋结构的胶原域B产量约为30mg/L，是发酵条件优化前的3倍。该方法能有效指导具有三股螺旋胶原蛋白的分泌表达，同时也为谷氨酸棒杆菌分泌表达信号肽的选择提供参考。

本发明提供了一种编码胶原蛋白的DNA分子，含有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

本发明还提供携带所述DNA分子的质粒。

在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pXMJ19系列质粒。

本发明还提供了可向胞外分泌具有三股螺旋结构的胶原蛋白的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，所述谷氨酸棒杆菌表达了如所示的序列；其中，非胶原域V-domain的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；胶原域B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；Signal区域含SEQ IDNO.3～8任一所示序列编码的信号肽。

在一种实施方式中，所述非胶原域V-domain和胶原域B之间添加胰蛋白酶识别位点LVPRGSP。

在一种实施方式中，所述非胶原域V-domain的N端添加6×His标签。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌以pXMJ19系列质粒为表达载体。

在一种实施方式中，所述宿主包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。

本发明提供了一种促进谷氨酸棒杆菌向胞外分泌表达带有三股螺旋结构的胶原蛋白的方法，是将信号肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA添加至编码胶原蛋白的序列的上游；所述信号肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～8所示。

在一种实施方式中，所述编码胶原蛋白的序列包括非胶原域V-domain和胶原域；所述非胶原域V-domain的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；胶原域B的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供应用所述谷氨酸棒杆菌生产胶原蛋白的方法。

在一种实施方式中，所述方法是将所述谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中，在27～28.5℃培养24～64h。

在一种实施方式中，所述方法是将所述谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中，在28℃培养24～40h。

在一种实施方式中，所述发酵培养基含有(按g/L计)：(NH4)₂SO₄ 20，玉米浆干粉20，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 0.25，3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐42，葡萄糖20；pH 7.0。

在一种实施方式中，所述方法还在培养至OD₆₀₀为2～14时用IPTG进行诱导。

在一种实施方式中，所述诱导是以终浓度0.2～1.1mmol/L加入IPTG诱导。

在一种实施方式中，所述诱导在27～28.5℃诱导24～64h。

在一种实施方式中，所述方法还包括提高发酵过程的溶氧；所述提高发酵过程的溶氧包括(a)或(b)：

(a)在含挡板的容器中发酵；

(b)控制发酵培养基的装液量为发酵容器容积的10～20％。

在一种实施方式中，所述方法采用容器内部含挡板的摇瓶进行发酵；并控制500mL摇瓶的装液量为50mL～100mL。

在一种实施方式中，所述发酵是将谷氨酸棒杆菌的种子液接种至发酵培养基中发酵；所述种子液经过在BHI平板上划线，于30℃，培养24-32h，然后挑取单菌落至5mL的BHI中，于30℃，200r/min过夜培养制得。

在一种实施方式中，所述发酵方法具体为：将谷氨酸棒杆菌种子液接种至含50～100mL发酵培养基的500mL带挡板的摇瓶中，控制接种后的初始OD₆₀₀为0.1，于28℃，200r/min培养至OD₆₀₀达2～6时添加IPTG至终浓度为0.2～0.5mmol/L诱导至少24h。

在一种实施方式中，所述发酵方法具体为：将谷氨酸棒杆菌种子液接种至含50mL发酵培养基的500mL带挡板的摇瓶中，控制接种后的初始OD₆₀₀为0.1，于28℃，200r/min培养至OD₆₀₀达6时添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L诱导40h。

本发明还提供所述谷氨酸棒杆菌或所述方法在生产胶原蛋白方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是以上述谷氨酸棒杆菌为生产菌株，诱导表达分泌具有三螺旋结构的胶原蛋白。

本发明要求保护所述胶原蛋白、序列设计策略、基因、质粒、宿主细胞、或制备方法在生物、制药、食品、化工等领域制备和在生物医学材料、组织工程和化妆品等领域中的应用。

有益效果：

1、本发明通过以食品安全级菌株谷氨酸棒杆菌为底盘细胞，在胶原蛋白V-B序列前端引入不同种类信号肽，实现了具有三股螺旋结构胶原蛋白V-B从无到有的分泌表达，其中，信号肽PorB介导分泌V-B的产量最高，可达25mg/L。经发酵条件优化，胞外分泌的胶原蛋白V-B的产量可提高至约75mg/L，纯三股螺旋结构的胶原域B的产量约为30mg/L，是发酵条件优化前的3倍。

2、本发明首次实现了在食品安全级菌株谷氨酸棒杆菌中进行具有三股螺旋结构的胶原蛋白的分泌表达，本发明为胶原蛋白的重组表达提供了新的宿主选择，为微生物难以分泌有三股螺旋结构胶原蛋白的困境提供了解决思路和理论依据，同时初步建立了谷氨酸棒杆菌分泌表达胶原蛋白的体系。

附图说明

图1为信号肽对菌体生长和蛋白表达的影响；A为不同重组菌株的生长曲线；B为引入信号肽菌株的发酵上清的SDS-PAGE图；C为对照菌株发酵上清的SDS-PAGE图；其中1-6分别对应引入信号肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052、TorA的菌株。

图2为培养基条件对菌体生长和蛋白表达的影响；A为不同培养基下菌株的生长曲线；B为不同培养基下发酵上清的SDS-PAGE图；其中1-3分别对应发酵培养基1、发酵培养基2、发酵培养基3。

图3为起始诱导OD₆₀₀对菌体生长和蛋白表达的影响；A为未加诱导剂菌株的生长曲线；B为不同起始诱导OD₆₀₀下菌株的生长曲线；C为在不同起始诱导OD₆₀₀下发酵上清的SDS-PAGE图；泳道1-4分别对应起始诱导OD₆₀₀为2、6、10、14。

图4为诱导时长对菌体生长和蛋白表达的影响；A为上述优化基础上菌株的生长曲线；B为不同诱导时长下发酵上清的SDS-PAGE图；泳道1-6分别对应发酵时长24h、32h、40h、48h、56h、64h。

图5为IPTG浓度对菌体生长和蛋白表达的影响；A为不同IPTG浓度下菌株的生长曲线；B为不同IPTG浓度下发酵上清的SDS-PAGE图；1-4分别对应IPTG浓度为0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.1mmol/L。

图6为溶氧对菌体生长和蛋白表达的影响；A为不同溶氧条件下的生长曲线；B为不同溶氧条件下发酵上清的SDS-PAGE图；1-4分别对应装液量50mL/500mL摇瓶、装液量50mL/500mL带挡板摇瓶、装液量100mL/500mL摇瓶、装液量100mL/500mL带挡板摇瓶。

图7为V-B纯化、酶切后的SDS-PAGE图及B的圆二色谱图；A为SDS-PAGE图，其中泳道1为纯化后的V-B，泳道2为酶切后样品B；B为全波长图谱；C为热变曲线。

具体实施方式

培养基：

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取粉5，NaCl 10，pH 7.0；

发酵培养基1(g/L)：(NH4)₂SO₄ 20，玉米浆干粉20，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 1，MgSO₄0.25，3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐42，葡萄糖20，pH 7.0；

发酵培养基2：BHI溶液；

发酵培养基3(g/L)：葡萄糖150，(NH4)₂SO₄ 40，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 0.5，玉米浆15，酵母膏1，蛋白胨0.5，MnSO₄·H₂O 0.01，FeSO₄·7H₂O 0.01，焦磷酸硫铵素0.001，生物素0.001，轻质碳酸钙20，pH 7.2。

蛋白纯化方法：在最优发酵条件下，收集菌液，4℃、12000rpm离心25min，取上清，经0.22μm水系滤膜过滤。然后用His Trap^TM HP 5mL亲和纯化，先用5倍柱体积结合缓冲液A(20mmol/L Na₂HPO₄、20mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、10mmol/L Iminazole、pH 7.4)平衡，再以5mL/min的流速上样。上样结束后，用洗脱缓冲液B(20mmol/L Na₂HPO₄、20mmol/LNaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、500mmol/L Iminazole、pH 7.4)进行梯度洗脱获得目的蛋白，并利用SDS-PAGE分析纯化情况。

胰蛋白酶切：将纯化后的胶原蛋白与胰蛋白酶以摩尔比250：1的比例混合，16℃过夜酶切。

除盐冻干处理方法：用HiTrap Desalting对酶切后的反应物做脱盐处理，以超纯水为流动相，流速为5mL/min，经SDS-PAGE验证后再进行真空冷冻干燥。

样品稳定性鉴定：采用圆二色谱鉴定，具体步骤为：将冻干后的样品用10mmol/L、pH 7.4的PB缓冲液溶解成1mg/mL的溶液，4℃平衡48h后进行圆二色谱鉴定。全波长是在4℃下以1nm为间隔测定190-260nm的CD光谱，平均扫描时间为5s。热变曲线是通过监测225nm处的CD信号，以10℃/h的升温速率从10℃升高到70℃获得的，每个温度下平衡8s，熔融温度(Tm)通过取拟合热变曲线在10℃和70℃所对应的吸光值取中值求得，该数据表示样品的稳定性。

实施例1：胶原蛋白序列的设计及重组质粒的构建

设计如所示的胶原蛋白氨基酸序列；其中，非胶原域V-domain的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，胶原域B的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码信号肽域signal的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～8所示。

在V-domain的N端分别引入信号肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052、TorA，构建含编码所示序列的重组质粒，具体步骤如下：

(1)重组质粒pXMJ19-V-B的构建：将SEQ ID NO.9所示的编码V-domain-B的核苷酸序列连接至载体pXMJ19的HindⅢ和EcoR I位点之间，再转化至E.coli JM109中，然后涂布于含30μg/mL氯霉素的LB平板，挑取转化子于37℃培养，提取质粒，将测序验证正确的重组质粒命名为pXMJ19-V-B。

(2)重组质粒pXMJ19-SPs-V-B的构建：以质粒pXMJ19-V-B为模板，设计引物CspB-F/R、PorB-F/R、Cg1514-F/R、CgR0949-F/R、Cg2052-F/R、TorA-F/R(表1)，通过PCR分别获得带有信号肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA的重组质粒。产物回收后做磷酸化处理，16℃过夜连接，转化至E.coli JM109，然后涂布于含30μg/mL氯霉素的LB平板，培养12-14h挑取单菌落培养送基因测序。测序验证正确后，将质粒命名为pXMJ19-SPs-V-B(其中，Sps表示引入的信号肽)。

表1引物序列

备注：引物中带下划线的碱基为限制性酶切位点，直线为Sal I，曲线为Hind III；Sal I后端的ATGTATACTCCT为RBS序列。

实施例2：含不同信号肽的重组谷氨酸棒杆菌的构建

具体步骤如下：

(1)将实施例1构建的质粒分别电转到谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum ATCC13032中，涂布在含15μg/mL氯霉素的BHI平板上。

(2)将步骤(1)保存重组菌的甘油管在BHI平板上划线，30℃，培养24-32h，然后挑取单菌落至5mL的BHI液体培养基中，30℃，200r/min过夜培养；取一定量的种子液转接至发酵培养基1，使初始OD₆₀₀为0.1，28℃，200r/min培养3h后添加IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导，培养48h。

发酵培养基1：(g/L)：(NH4)₂SO₄ 20，玉米浆干粉20，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 1，MgSO₄0.25，3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐42，葡萄糖20，pH 7.0。

生长曲线测定：在发酵过程中，每隔8h取样静置15min测OD₆₀₀，绘制曲线。

SDS-PAGE分析：诱导结束后，收集发酵液上清，浓缩20倍进行SDS-PAGE分析，比较目的条带的粗细。

结果如图1A所示，引入信号肽的菌株整体生长趋势相近，在诱导期的前24h，均保持较快的生长速度，积累较多菌体；诱导24-48h，菌体生长速度明显变缓，OD₆₀₀维持在25左右；对照菌株V-B在诱导期的前24h生长趋势与其它菌株相似，但诱导24-40h仍保持较高的生长速度，诱导40-48h趋于平稳，OD₆₀₀约为28。诱导结束后，取发酵上清进行SDS-PAGE分析，如图1B、1C所示，与对照菌株相比，所有引入信号肽的菌株发酵液上清中均出现分子量约为23kDa的条带，高于目的蛋白的理论分子量17.82kDa，这可能是由于胶原域含有大量的脯氨酸，导致胶原蛋白在SDS-PAGE中迁移速度较慢，表观分子量约为理论分子量的1.4倍。其中，携带信号肽PorB的重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B表达的目的蛋白条带最粗，取发酵液上清，经蛋白纯化方法处理，再经除盐冻干处理后称重估算V-B产量约为25mg/L，信号肽CspB、Cg1514、CgR0949、Cg2052、TorA介导分泌的产量分别约为15、20、8、8、5mg/L，均低于PorB介导的分泌产量，此外，未插入信号肽的胞外表达量约为0mg/L。

实施例3：C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B在不同发酵培养基中发酵

以实施例2构建的C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B为发酵菌株，在BHI中于30℃、200r/min过夜培养获得种子液，分别将种子液转接至发酵培养基1、发酵培养基2、发酵培养基3中，控制起始OD₆₀₀均为0.1，在28℃、200r/min培养3h，添加IPTG至终浓度为0.8mmol/L继续于28℃诱导表达，诱导结束后取上清浓缩后进行SDS-PAGE分析，以此确定最佳发酵培养基。

发酵培养基2：BHI培养基(g/L)；牛脑浸粉4.0，牛心浸粉4.0，蛋白胨5.0，酪蛋白胨16.0，葡萄糖2.0，NaCl 5.0，磷酸氢二钠2.5，pH 7.4±0.2；

图2为不同发酵培养基对V-B分泌表达影响的结果图，如图2A所示，重组菌在3种发酵培养基中的生长状况有明显差异：在培养基2中，诱导16h菌浓达到最高，直到诱导结束一直维持在10左右，菌体生长受限，积累菌量最少；在发酵培养基1中，菌体前期生长迅速，后期生长趋势变缓，诱导24-48h，OD₆₀₀逐渐增加到25左右；发酵培养基3中菌体前期生长速度虽低于发酵培养基1，但诱导40h内一直维持较高的增长速度，诱导48h时OD₆₀₀与发酵培养基1相当。从图2B的SDS-PAGE图中可看出，发酵培养基1中目的蛋白表达量最高，条带最粗；发酵培养基3次之，发酵培养基2产量最低，几乎看不到条带。发酵培养基1和发酵培养基3虽然诱导结束菌浓相近，但发酵培养基1中的菌体前期生长速度快，积累了较多菌量，在后期较发酵培养基3有足够的时间进行目的基因的翻译和表达。因此，选择发酵培养基1作为重组胶原蛋白V-B分泌表达的发酵培养基。取发酵培养基1中培养的发酵液上清，经蛋白纯化方法处理，再经除盐冻干处理称重估算V-B产量约为25mg/L。

实施例4：C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B在不同OD₆₀₀下诱导表达胶原蛋白

以实施例2构建的C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B为发酵菌株，然后挑取单菌落至5mL的BHI中，30℃，200r/min过夜培养；转接种子液至发酵培养基1中，控制初始OD₆₀₀为0.1，28℃，200r/min培养32h，前16h每隔2h取样测OD₆₀₀，培养16h后，间隔8h取样测OD₆₀₀，并绘制未加诱导剂菌株的生长曲线。如图3A所示，培养前4h，菌种处于延滞期，生长缓慢；4h开始进入对数期，4-14h为菌种的对数生长期；之后生长速度明显变缓。

按照相同的方法培养种子液，再将种子液转接至发酵培养基后，于28℃，200r/min培养至OD₆₀₀分别达到2、6、10、14时，添加IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导，28℃培养48h，每隔8h测定OD₆₀₀并绘制生长曲线。由图3B可知，受起始OD₆₀₀的影响，菌株在诱导表达前8h，OD₆₀₀仍维持较大差距。诱导16h，差距明显缩小，OD₆₀₀达到22左右；诱导24h后，菌体生长速度变缓，OD₆₀₀以较低速度增长，诱导48h，所有条件的最终OD₆₀₀差别不大，都达到28左右。由图3C的SDS-PAGE可知，诱导结束后，起始OD₆₀₀为2和6的菌株对应目的条带较粗，蛋白表达量高；可能是由于起始OD₆₀₀为10和14的菌株诱导剂添加时间较晚，前期培养基中营养物质被大量消耗，影响后期目的蛋白合成。而起始OD₆₀₀为2时，菌体处于延滞期，故宜选取处于对数生长期的OD₆₀₀＝6为起始诱导菌浓。取发酵液上清，按照具体实施方法中的蛋白纯化方法处理，经除盐冻干处理称重估算V-B产量约为27.5mg/L。

实施例5：C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B在不同诱导时间下发酵

以实施例2构建的C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B为发酵菌株，挑取单菌落至5mL的BHI中，30℃，200r/min过夜培养；取一定量的种子液转接至发酵培养基1，使初始OD₆₀₀为0.1，于28℃、200r/min培养至OD₆₀₀达到6时，添加IPTG至终浓度为0.8mmol/L诱导64h，诱导培养24h后，每间隔8h取发酵上清做SDS-PAGE分析。

图4为诱导时长对V-B分泌表达影响的结果图，由图4A可看出，在诱导前16h，菌体保持较快的生长速度，诱导第17-48h，菌体生长速度放缓，诱导第49-64h，OD₆₀₀趋于稳定，维持在28左右。从图4B可观察到，在24-40h，目的蛋白表达量随诱导时间的增加而增加；诱导时间超过40h后，目的蛋白条带没有明显的变化，蛋白未出现降解现象。考虑到培养基营养物质有限以及发酵时间成本，宜选取诱导时长为40h。取发酵液上清，按照具体实施方法中的蛋白纯化方法处理，经除盐冻干处理称重估算V-B产量约为27.5mg/L。

实施例6：IPTG浓度对C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B表达的影响

以实施例2构建的C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B为发酵菌株，挑取单菌落至5mL的BHI中，30℃，200r/min过夜培养；取一定量的种子液转接至发酵培养基1，使初始OD₆₀₀为0.1，于28℃，200r/min培养至OD₆₀₀达到6时添加IPTG至终浓度分别为0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L和1.1mmol/L诱导40h，诱导结束后，取发酵上清做SDS-PAGE分析。

图5为IPTG浓度对V-B分泌表达影响的结果图，从图5A可看出，IPTG浓度对菌体整体生长趋势无太大影响。从图5B的SDS-PAGE中看出，IPTG终浓度为0.5mmol/L时，目的蛋白条带最粗，0.2mmol/L次之。因此，诱导剂IPTG的工作浓度宜选择0.2～0.5mmol/L。取发酵液上清，按照具体实施方法中的蛋白纯化方法处理，经除盐冻干处理称重估算IPTG终浓度为0.5mmol/L时V-B产量约为32.5mg/L。

实施例7：C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B在不同溶氧下发酵

以实施例2构建的C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B为发酵菌株，挑取单菌落至5mL的BHI中，30℃，200r/min过夜培养；取一定量的种子液转接至含发酵培养基1的不同培养体系中，培养体系分别为装液量50mL/500mL摇瓶，50mL/500mL带挡板摇瓶，100mL/500mL摇瓶以及100mL/500mL带挡板摇瓶，控制接种后的初始OD₆₀₀为0.1，于28℃，200r/min培养至OD₆₀₀达到6时添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L诱导40h，诱导结束后，取发酵上清做SDS-PAGE分析。

图6为溶氧对V-B分泌表达影响的结果图，由图6A可看出，在诱导相同时长下，带挡板的摇瓶OD₆₀₀比不带挡板的高，且相同类型摇瓶，装液量低的OD₆₀₀较高，说明溶氧对菌体的生长状况影响较大。诱导0-8h，带挡板摇瓶的菌体生长速度很快，约为相同装液量不带挡板摇瓶的两倍；之后OD₆₀₀无太大变化，进入稳定期；不带挡板摇瓶条件下的菌体OD₆₀₀在诱导0-24h稳定增长，诱导24h后，OD₆₀₀保持平稳，诱导40h后，装液量50mL和100mL的摇瓶OD₆₀₀分别达到40和28。诱导结束取上清进行SDS-PAGE分析，如图6B所示，装液量50mL带挡板的摇瓶目的条带最粗。表明溶氧对菌体生长和蛋白表达有显著影响，高的溶氧条件有利于菌体生长和外源蛋白表达。取发酵液上清，按照具体实施方法中的蛋白纯化方法处理，经除盐冻干处理称重估算V-B产量约为75mg/L，是优化前的3倍。该结果表明，溶氧是影响胶原蛋白产量的关键因素，此结果对进一步放大发酵体系的发酵试验有一定的指导意义。

实施例8：重组胶原蛋白V-B的表征

收集实施例7中在装液量50mL/500mL带挡板摇瓶中的发酵上清，经过蛋白纯化方法进行纯化处理。收集其中一部分纯化蛋白，以胶原蛋白与胰蛋白酶摩尔比250：1的比例加入胰蛋白酶，16℃过夜消化，切除辅助折叠域V-domain，后续进行除盐冻干处理，将冻干的胶原蛋白样品用10mM PB配成终浓度为1mg/mL的溶液，4℃下放置48h。用SDS-PAGE对酶切前后的蛋白样品进行鉴定，并用圆二色谱对酶切后经进一步除盐冻干处理后的蛋白进行相关性质的表征。

图7为分泌的胶原蛋白的性质表征图，重组胶原蛋白V-B包含辅助折叠域V domain和胶原域B，纯化后的V-B经胰蛋白酶酶切，V domain被切成多个小肽段，如果胶原域B是单链，则会被胰蛋白酶消化；如果胶原域B在V domain的辅助下折叠形成刚性的三股螺旋结构，则不会被胰蛋白酶消化。从图7A中看出，酶切前V-B分子量约为23kDa，酶切后可观察到清晰的单一条带，且分子量约为12kDa，是胶原域B分子量的1.4倍，表明分泌表达出的V-B中的胶原域B形成了三股螺旋结构。后续进行除盐冻干称重处理，胶原域B的产量约为30mg/L。为了进一步确定胶原域B的二级结构，对胶原域B进行圆二色谱鉴定，如图7B所示，胶原域B在225nm处有胶原蛋白的特征正峰，表明其正确折叠形成三股螺旋结构。将图7C的热变曲线拟合，显示胶原域B的T_m值为25.82℃。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法

<130> BAA220172A

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 74

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Asp Glu Gln Glu Glu Lys Ala Lys Val Arg Thr Glu Leu Ile Gln

1 5 10 15

Glu Leu Ala Gln Gly Leu Gly Gly Ile Glu Lys Lys Asn Phe Pro Thr

20 25 30

Leu Gly Asp Glu Asp Leu Asp His Thr Tyr Met Thr Lys Leu Leu Thr

35 40 45

Tyr Leu Gln Glu Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ser Trp Arg Lys Arg Leu

50 55 60

Leu Lys Gly Ile Gln Asp His Ala Leu Asp

65 70

<210> 2

<211> 83

<212> PRT

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 2

Pro Gly Pro Arg Gly Glu Gln Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Lys Asp

1 5 10 15

Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Met Gly Pro Ala Gly

20 25 30

Phe Pro Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gln Gly Ala

35 40 45

Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Val Gly Pro Arg Gly Glu Arg

50 55 60

Gly Glu Ala Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Arg Gly Pro Val Gly

65 70 75 80

Pro Ala Gly

<210> 3

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttaacaacc gtatccgcac tgcagctctt gctggtgcaa tcgcaatctc caccgcagct 60

tccggcgttg ctatcccagc attcgctcag gagacc 96

<210> 4

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagctttcac accgcatcgc agcaatggca gcaaccgcag gcatcacagt ggcagcattc 60

gcagcacctg cttccgcatc cgacttc 87

<210> 5

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttaaacagag tcagtcgtat tgcaggcgct tctgcaatca cactatgcat cggcttaacc 60

acaatactaa gccctacttc cactgcacaa agcctcgaac ag 102

<210> 6

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caaataaacc gccgaggctt cttaaaagcc accacaggac ttgccactat cggcgctgcc 60

agcatgttta tgccaaaggc caacgccctt ggagca 96

<210> 7

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttacgaaaaa cagttaccgg tggaattgtt gctcttattg cgactgccac tctcatgaat 60

tctgtctctt ctgctgaaga ggta 84

<210> 8

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacaacaatg atctgttcca ggcatcccgg cgacgttttt tggcgcagct tggtggcctc 60

actgtggctg gcatgctggg accttctcta ctcaccccac gccgcgccac cgcagcccaa 120

gct 123

<210> 9

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catcatcatc atcaccacgc cgatgaacaa gaagagaaag caaaggtgcg caccgaactg 60

attcaagaac tggcacaagg tctgggcggt atcgaaaaga agaacttccc gactttaggt 120

gatgaggatt tagatcacac ctacatgacc aaactgctga cctatttaca agaacgcgaa 180

caagctgaaa atagctggcg caaacgtctg ctgaaaggca tccaagatca tgcactggat 240

ctggttccgc gtggtagccc cggtcctcgc ggtgaacaag gtccgcaagg tctgccgggt 300

aaagatggtg aagccggtgc acaaggtccg gctggtccta tgggcccggc cggctttccg 360

ggcgaacgtg gtgaaaaagg cgaaccgggt acccaaggtg ccaaaggtga tcgtggcgaa 420

accggtccgg ttggccctcg tggcgaacgc ggtgaagctg gtccggctgg caaagacggt 480

gaacgtggtc ccgttggtcc ggccggt 507

Claims

1.可向胞外分泌具有三股螺旋结构的胶原蛋白的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌表达了依次为Signal区域、胶原蛋白的序列；其中，Signal区域为SEQ ID NO.3~5任一所示序列编码的信号肽，所述胶原蛋白的序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以pXMJ19系列质粒为表达载体。

3.一种促进谷氨酸棒杆菌向胞外分泌表达带有三股螺旋结构的胶原蛋白的方法，其特征在于，将信号肽添加至编码胶原蛋白的序列的上游；所述信号肽的核苷酸序列分别如SEQID NO.3~5所示；所述编码胶原蛋白的序列如SEQ ID NO.9所示。

4.应用权利要求1或2所述谷氨酸棒杆菌生产胶原蛋白的方法，其特征在于，将所述谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中，在27~28.5℃培养24~64 h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括（a）~（d）的至少一项操作：

（a）培养至发酵液OD₆₀₀为2~14时用IPTG进行诱导；

（b）以终浓度0.2~1.1 mmol/L加入IPTG诱导；

（c）在27~28.5℃用IPTG诱导24~64 h；

（d）提高发酵过程的溶氧。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高发酵过程的溶氧包括：在含挡板的容器中发酵，和/或控制发酵培养基的装液量为发酵容器容积的10~20%。

7.根据权利要求4~6任一所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基按g/L计含有：(NH4)₂SO₄ 20，玉米浆干粉20，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 0.25，3-（N-吗啉基）丙磺酸钠盐42，葡萄糖20。

8.权利要求1~2任一所述的谷氨酸棒杆菌，或权利要求3~7任一所述的方法在生物、食品或化工领域制备胶原蛋白中的应用。