CN113005071A

CN113005071A - 一种SsgA编码基因SMDS_1018的用途、重组菌株及其构建方法

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Publication number: CN113005071A
Application number: CN202110250694.4A
Authority: CN
Inventors: 白林泉; 王丹; 钱源; 步国建
Original assignee: Jiangsu Donghui Biotechnology Co ltd; Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Jiangsu Donghui Biotechnology Co ltd; Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2041-03-08
Also published as: CN113005071B

Abstract

本发明公开了一种SsgA编码基因SMDS_1018的用途、重组菌株及其构建方法。本发明通过增强SsgA编码基因的转录水平，促进菌丝横隔形成、提高谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌效率，进而提升谷氨酰胺转氨酶产量。通过在茂源链霉菌中，利用人工强启动子kasOp*过量表达内源SsgA编码基因SMDS_1018，得到高产谷氨酰胺转氨酶的重组菌株WD07。增强SsgA编码基因的转录水平使菌丝横隔增多，提高了谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。所得的重组菌株WD07的谷氨酰胺转氨酶发酵终产量在实验室摇瓶水平下较对照菌株提高35％。

Description

一种SsgA编码基因SMDS_1018的用途、重组菌株及其构建方法

技术领域

本研究涉及的是生物工程领域，具体说是一种提高SsgA编码基因的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法。通过在茂源链霉菌IPIO中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源的SsgA编码基因SMDS_1018，可以增加菌丝横隔数量、提高谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌效率，最终可明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TGase)是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TGase是外分泌蛋白，在胞内为pre-pro-MTGase初始形式，穿过细胞膜成为无活性的酶原pro-TGase，经过金属蛋白酶TAMEP切割信号肽成为 FRAP-TGase，再经丝氨酸蛋白酶SM-TAP切割成为成熟的TGase。TGase作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块，提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TGase制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等等。

基于此，期望获得通过增强某一基因的表达水平，从而促进菌丝横隔的形成，提升谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌效率，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种SsgA编码基因 SMDS_1018的用途、重组菌株及其构建方法，本案发明人在研究过程中通过基因组学信息找到了SsgA编码基因SMDS_1018。增强SsgA编码基因的表达可以促进菌丝横隔的形成，提升谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌效率，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。此外，本发明还提供了一种高产TGase的重组菌株以及一种通过增强SsgA 编码基因的转录水平以提高TGase发酵水平的方法。该重组菌株基于过量表达内源 SsgA编码基因SMDS_1018，增加菌丝横隔数量，进而提高TGase酶原的分泌效率，最终提升TGase的产量。

为实现上述目的，本发明通过以下几个方面实现：

第一方面，本发明提出了一种SsgA编码基因SMDS_1018在发酵生产谷氨酰胺转氨酶中的用途，所述SsgA编码基因SMDS_1018如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述应用为构建过表达SsgA编码基因SMDS_1018相关的生物材料，所述生物材料为下述的任意其中之一：

(1)包括所述SsgA编码基因SMDS_1018如SEQ ID NO.1所示的表达盒；

(2)包括所述SsgA编码基因SMDS_1018如SEQ ID NO.1所示的重组载体或含有 (1)所述表达盒的重组载体；

(3)含有(2)所述重组载体的重组菌株。

更为优选地，所述生物材料中含有启动子kasOp*，所述启动子来源于质粒pDR3-K*。第二方面，本发明提出了一种重组菌株，所述重组菌株的SsgA编码基因过量表达，所述SsgA编码基因SMDS_1018如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述菌株来源于大肠杆菌作为宿主菌，受体菌为茂源链霉菌。

更为优选地，大肠杆菌为ET12567(pUZ8002)，受体菌为茂源链霉菌IPIO，其由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为M 2020196，保藏日期为2020年6月10日。

优选地，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的SsgA编码基因SMDS_1018。

第三方面，本发明提出了一种重组载体，所述重组载体包括源于茂源链霉菌的SsgA 编码基因SMDS_1018。

第四方面，本发明提出了一种重组菌株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

步骤S1：设计并构建重组载体，所述重组载体包括源于茂源链霉菌的SsgA编码基因SMDS_1018；

步骤S2：将步骤S1构建得到的重组载体通过接合转移导入作为受体菌的茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组，并通过抗性和PCR验证筛选得到重组菌株。

优选地，所述步骤S1具体包括如下步骤：

步骤S11：以茂源链霉菌基因组DNA为模板，在其两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_1018-F以及smds_1018-R，其中，smds_1018-F如SEQ ID NO.2所示， smds_1018-R如SEQ ID NO.3所示，通过PCR扩增获得片段，即SsgA编码基因 SMDS_1018基因片段；

步骤S12：将步骤S11获得的扩增片段插入到质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI酶切位点，即得到重组载体。

优选地，所述步骤S2具体包括如下步骤：

步骤S21：将构建得到的重组载体转化进入宿主菌内，并将宿主菌接种于含有抗生素的LB培养基内；

步骤S22：将宿主菌与作为受体菌的茂源链霉菌IPIO混合涂布于有10mM镁离子的ISP4MYM固体培养基上培养获得接合子，所述的接合子通过抗性和PCR验证筛选得到重组菌株。

第五方面，本发明提出了一种谷氨酰胺转氨酶的发酵生产方法，所述发酵生产方法通过上述的重组菌株发酵获得谷氨酰胺转氨酶。

优选地，所述重组菌株发酵具体包括如下步骤：

将活化后的重组菌株孢子接种于种子培养基中，于30℃、200-220rpm条件下培养24h；

随后，按10％接种量转接至发酵培养基中，于30℃、200-220rpm的条件下发酵26-28 h，收集发酵液并测酶活。

优选地，所述种子培养基包括以下组分：甘油2-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨2-4w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.4w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.4w/v％；

所述发酵培养基包括以下组分：甘油2-3w/v％，酵母提取物0.4-0.7w/v％，鱼粉蛋白胨2-4w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.4w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3w/v％。。

相较于现有技术，本发明具有如下所述的有益效果：

1、本案发明人发现在TGase发酵过程中，茂源链霉菌会形成大而致密的菌丝球，且菌丝分枝少，而Tat分泌途径通常位于菌丝体顶端，因此茂源链霉菌IPIO的这种菌丝体形态不利于TGase的分泌，是工业上限制TGase产量提高的关键因素，因此，本发明通过增强SsgA编码基因的表达可以促进菌丝横隔的形成，提升谷氨酰胺转氨酶酶原的分泌效率，最终提高谷氨酰胺转氨酶的产量。

2、本发明提供了一种高产TGase的重组菌株，该该重组菌株基于过量表达内源SsgA编码基因SMDS_1018，增加菌丝横隔数量，进而提高TGase酶原的分泌效率，最终提升TGase的产量。

3、本发明在茂源链霉菌IPIO中，利用带人工强启动子kasOp*的整合型载体 pDR3-K*，在染色体上分别插入一个拷贝、来源于茂源链霉菌IPIO的SsgA编码基因SMDS_1018，实验室摇瓶水平下较对照菌株(空白载体整合菌株)酶活提高35％。通过本发明可显著提高TGase的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为SMDS_1018基因过量表达质粒构建示意图；

图2为SsgA编码基因增强表达突变株与对照菌株TGase发酵产量示意图；

图3为SsgA编码基因增强表达突变株与对照菌株菌丝体形态显微镜示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。虽然以下给出了本发明优化的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

以下实施例中，所述茂源链霉菌IPIO由江苏东汇生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为M 2020196，保藏日期为2020.6.10；

所涉及的质粒pDR3-K*已经在SCI数据库文献《Xinjuan Ning,Xinran Wang,Yuanting Wu,Qianjin Kang*and Linquan Bai*:Identification and Engineering ofPost-PKS Modification Bottlenecks for Ansamitocin P-3Titer Improvement inActinosynnema pretiosum subsp.pretiosum ATCC 31280.Biotechnology Journal2017, 12,1700484》中记载。

实施例1

本实施例为制备SsgA编码基因SMDS_1018过量表达的突变株WD07的具体过程。具体包括以下步骤：

第一步：构建质粒pLQ1750：以茂源链霉菌IPIO基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_1018-F/R，通过PCR扩增得到SMDS_1018 基因片段(129bp)。在质粒pDR3-K*中人工强启动子kasOp*下游的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段(即SMDS_1018基因片段，其序列如SEQ ID NO.1所示)，得到质粒pLQ1750。

上述具体构建结构可以参考图1，图1为SMDS_1018基因过量表达质粒构建示意图。

*第一步涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：

NdeI识别位点： EcoRI识别位点：

5'...CA^TATG...3' 5'...G^AATTC...3'

3'...GTAT^AC...5' 3'...CTTAA^G...5'

*第一步所用到的引物序列为：

*第一步中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：

PCR反应体系：DNA模板30ng，引物20pmol，50％DMSO 5μL，dNTP 10nmol，缓冲液25μL，Taq DNA聚合酶1个单位，加纯水补齐至50μL；

PCR条件：95℃ 5min；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 30s；循环30次；72℃ 10min。

第二步：将第一步构建得到的过量表达的质粒载体pLQ1750通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌IPIO中进行位点特异性重组，并通过抗性及PCR验证筛选正确的接合子，从而得到SMDS_1018基因过量表达的突变株。具体包括以下步骤：

将基因过量表达的质粒pLQ1750转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中。将对应ET12567(pUZ8002)接种于含有安普霉素(终浓度50μg/mL)、卡那霉素(终浓度50μg/mL) 以及氯霉素(终浓度25μg/mL)的三种抗生素的LB培养基中，37℃培养20h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时制备的茂源链霉菌IPIO新鲜菌丝体(约24h培养物)，用2×孢子预萌发液漂洗2～3次之后，将其与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1:10)均匀后涂布于含有 10mM镁离子的ISP4MYM固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养。12h后取出平板，分别将安普霉素(终浓度50μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度50μg/mL)两种抗生素加入1 mL无菌水中混匀后覆盖在ISP4MYM固体培养基上，将固体培养基晾干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5天后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含安普霉素(终浓度50μg/mL)和甲氧苄啶(终浓度50μg/mL)两种抗生素的ISP4MYM固体培养基上扩大培养，通过菌丝体PCR验证筛选得到SMDS_1018基因加倍的突变株，命名为突变株WD07。

*第二步中通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：

PCR体系：DNA模板10～100ng，引物10pmol，50％DMSO 2μL，2×Mix缓冲液 10μL，加纯水补齐至20μL；

PCR条件：95℃ 10min；9℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 30s；循环30次；72℃ 10min。

ISP4MYM：甘露醇1g/L,酵母提取物1g/L,麦芽提取物2.5g/L,可溶性淀粉10g/L,MgSO₄·7H₂O 1g/L,(NH₄)₂SO₄ 2g/L,K₂HPO₄ 1g/L,NaCl 1g/L,CaCO₃ 2g/L,FeSO₄· 7H₂O0.001g/L,MnCl·4H₂O 0.001g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.001g/L,琼脂粉20g/mL。

实施例2

本实施例为利用SsgA编码基因过量表达的突变株WD07发酵产生TGase的过程。具体步骤如下：将SsgA过量表达的菌株WD07涂布于固体ISP4MYM培养基上活化， 30℃培养5-7天后，刮取一平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200-220rpm条件下培养24h，按10％的接种量转接至发酵培养基，30℃、200-220rpm条件下发酵26-28h，收集发酵液进行酶活检测。

表1种子培养基及发酵培养基的成分构成

实施例3

本实施例为利用比色法检测TGase的酶活的方法。具体为：取100μL的稀释10-20倍的实施例2获得的发酵液上清于试管中作为试验组，取另一管加入100μL水作为空白对照组；同样，取一管加入100μL的稀释10-20倍的对照菌株的发酵液上清(采用实施例2的方法进行发酵，不同仅在于采用的菌株为对照菌株)。所述对照菌株为IPIO：： pSET152，其通过将空载体pSET152通过接合转移导入IPIO中进行位点特异性重组获得。

各组加入1mL 37℃预热好的A液，37℃反应10min后，加入1mL B液终止反应。用1cm的石英比色皿，在分光光度计525nm处测定发酵液的吸光度。最终将OD₅₂₅带入由标准曲线换算得到的公式，计算出TGase的酶活。

其中，溶液配制方法如下：

A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048g底物Na-CBZ-GLN-GLY(即Z-谷氨酰甘氨酸)于烧杯中，加350mL水，调节pH 为6.0，加水定容至400mL。

B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％FeCl₃溶于0.1mol/L HCl中，将三种溶液等量混合均匀。

图2为SsgA编码基因增强表达突变株与对照菌株TGase相对发酵产量示意图。结果表明，在实验室摇瓶水平下本案的突变株WD07的产量对比野生型菌株提高35％。

图3为SsgA编码基因增强表达突变株与对照菌株在相差显微镜下菌丝体形态示意图。结果表明，本案的突变株WD07的菌丝体较对照菌株有更多数量的菌丝横隔。需要说明的是，本发明的保护范围中现有技术部分并不局限于本申请文件所给出的实施例，所有不与本发明的方案相矛盾的现有技术，包括但不局限于在先专利文献、在先公开出版物，在先公开使用等等，都可纳入本发明的保护范围。

此外，本案中各技术特征的组合方式并不限本案权利要求中所记载的组合方式或是具体实施例所记载的组合方式，本案记载的所有技术特征可以以任何方式进行自由组合或结合，除非相互之间产生矛盾。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110> 上海交通大学

江苏东汇生物科技有限公司

泰兴市东圣生物科技有限公司

<120> 一种SsgA编码基因SMDS_1018的用途、重组菌株及其构建方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 129

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggtgcaga tcgacaccgc cgaactgcgc gggttcctgg cacgctcgta cgcgctggtg 60

ccggtgggcg gcgaggccgg gtgcctcgac gtcgacgggg gtgtcgaggc gctgctgcgt 120

cagctctga 129

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atatcatatg gtgcagatcg acaccgccga 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atatgaattc tcagagctga cgcagcagcg 30

Claims

1.一种SsgA编码基因SMDS_1018在发酵生产谷氨酰胺转氨酶中的用途，其特征在于，所述SsgA编码基因SMDS_1018如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的SsgA编码基因过量表达，所述SsgA编码基因SMDS_1018如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，在茂源链霉菌IPIO中过量表达来源于茂源链霉菌IPIO的SsgA编码基因SMDS_1018。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括源于茂源链霉菌的SsgA编码基因SMDS_1018。

5.一种重组菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括如下步骤：

步骤S11：以茂源链霉菌基因组DNA为模板，在其两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_1018-F以及smds_1018-R，其中，smds_1018-F如SEQ ID NO.2所示，smds_1018-R如SEQID NO.3所示，通过PCR扩增获得片段，即SsgA编码基因SMDS_1018基因片段；

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括如下步骤：

8.一种谷氨酰胺转氨酶的发酵生产方法，其特征在于，所述发酵生产方法通过权利要求2或3所述的重组菌株发酵获得谷氨酰胺转氨酶。

9.根据权利要求8所述的发酵生产方法，其特征在于，所述重组菌株发酵具体包括如下步骤：

随后，按10％接种量转接至发酵培养基中，于30℃、200-220rpm的条件下发酵26-28h，收集发酵液并测酶活。

10.根据权利要求9所述的发酵生产方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下组分：甘油2-3w/v％，酵母提取物0.4-0.8w/v％，鱼粉蛋白胨2-4w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.4w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.4w/v％；

所述发酵培养基包括以下组分：甘油2-3w/v％，酵母提取物0.4-0.7w/v％，鱼粉蛋白胨2-4w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.4w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3w/v％。