CN111040980A - 高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明利用食品安全级的微生物谷氨酸棒杆菌，其本身不会分泌内毒素，简化了后提取过程，通过基因工程技术构建高产透明质酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，其能够产生不同分子量的透明质酸(3000Da～200万Da)，依据分子量不同透明质酸的产量可达7g/L‑20g/L，产品无需复杂的分离就即可满足食品、化妆品及医药品的要求。

Description

高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与 应用
本发明是申请号CN201610566586.7的中国发明专利申请，申请日为2016年7月18日，发明名称为“高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其制备方法与应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
透明质酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键连接而成的高分子多糖类物质，又称玻尿酸。透明质酸广泛地存在于人体的各个部位，具有极其重要的生理作用，如协助水电解质的扩散转运，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等。另外，透明质酸具有极强的保湿作用，被称为理想的天然保湿因子。它是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。透明质酸具有不同的分子量，其分布从几千到几百万道尔顿，因其分子量的不同，其性能及应用也有所不同。小分子量的透明质酸(分子量<10万)能渗入真皮，容易被人体吸收，因此主要用于保健食品，美容食品及药物载体领域；中分子量的透明质酸(10万<分子量<100万)能够紧致肌肤，因此在保湿、面膜、化妆品领域具有广泛应用；大分子量的透明质酸(分子量>100万)，可以作为皮肤填充剂，在美容、医药领域具有广泛的应用。目前全球透明质酸的销售额已超过100亿美元。
透明质酸的生产方法主要包括动物组织提取法和微生物发酵法两种。前者由于来源有限、产率较低等因素，生产成本较高且容易产生免疫反应。因此，目前透明质酸的生产主要是通过发酵法进行。目前，工业上透明质酸的生产菌株主要包括兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等条件致病性菌株。由于这类菌株会分泌内毒素，因此其分离过程要求极高，产品应用受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重组谷氨酸棒杆菌Δzwf，通过基因工程手段使谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf失活，即构建得到重组谷氨酸棒杆菌Δzwf。优选出发菌株为谷氨酸棒杆菌MB001。
例如，通过敲除谷氨酸棒状杆菌中的zwf基因，可以敲除整个基因或者部分基因，或者通过关键位点的突变实现葡萄糖6-磷酸脱氢酶功能的失活都可以达到相同的目的。
本发明还提供一种重组谷氨酸棒杆菌Δzwf的构建方法，包括以下步骤：
S11、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-up-F和zwf-up-R为引物进行PCR，获得葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf上游约1000bp的同源片段zwf-up并进行PCR产物纯化；
S12、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-down-F和zwf-down-R为引物进行PCR，获得zwf下游约1000bp的同源片段zwf-down并进行PCR产物纯化；
S13、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将zwf-up和zwf-down片段一步连接到酶切后的pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-zwf；
S14、将pK18-zwf转化到谷氨酸棒杆菌MB001中，筛选阳性克隆，即得；
其中，葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的序列如SEQ ID NO:1所示。
所用引物序列如下：
zwf-up-F：5’-acagctatgacatgattacgggcgattcctacgacgctca-3’
zwf-up-R：5’-taaattatggcacgatggtagtgtcacgatcc-3’
zwf-down-F：5’-taccatcgtgccataatttaggggcaaaaaatgatctttgaact-3’
zwf-down-R：5’-tgcatgcctgcaggtcgactgtgcgcgtactacatcaaccatag-3’。
优选采用电穿孔仪(伯乐)将pK18-zwf通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌MB001中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上进行重组菌的第一次筛选。挑取阳性重组子进一步在液体LB培养基里过夜培养，然后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选。利用zwf-up-F和zwf-down-R为引物进行菌落PCR，敲除zwf基因的重组子能够扩增出2Kb大小的片段，该重组菌命名为C.glutamicumΔzwf。
为了验证葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的敲除对透明质酸产量的影响，进行如下实验：
基于兽疫链球菌的透明质酸合成酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸合成酶基因hasA(SEQ ID NO:7)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的hasA基因片段为模板，以hasA-F(5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’)和hasA-R(5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’)为引物进行PCR，获得约1400bp的hasA片段，并进行PCR产物纯化。将带有lacY基因(SEQ ID NO:8)的质粒pXYJ-12(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将hasA片段连接到pXYJ-12上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA。将质粒pXYJ-hasA通过电转法(条件同上)分别转化野生型的谷氨酸棒杆菌MB001和重组菌C.glutamicumΔzwf，获得的重组菌分别命名为Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA。
将Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA在摇瓶中发酵，检测其透明质酸的产量。发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量。
透明质酸的检测方法为：取1mL的发酵液，向其中加入等量0.1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，在室温下静置30min，12000rpm条件下将发酵液离心10min，收集上清液，加入2倍体积的无水乙醇，于4℃条件下静置1h，充分沉淀。4℃，12000rpm条件下离心10min，弃去上清液，风干至乙醇完全挥发，用与原发酵液等体积的去离子水重悬沉淀。取300μL经过一次重悬稀释后的透明质酸溶液，向其中加入700μL的乙酸缓冲溶液(浓度为0.2mol/L的乙酸钠和0.15mol/L的NaCl，用乙酸调pH至6.0左右)，然后向其中加入2ml CTAB溶液(2.5g/L的CTAB，用0.5mol/L的NaOH溶液溶解)，反应进行5min后测定OD400值。
发酵结果显示，Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA的透明质酸的产量分别为0.3g/L和2.2g/L，因此敲除葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf对于提高透明质酸的产量具有重要的作用。
本发明进一步提供所述重组谷氨酸棒杆菌Δzwf在构建高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌中的应用。
本发明提供一种高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中过表达内源的UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA(SEQID NO:2)构建得到的。
本发明还提供所述高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：
S21、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法如上所述；
S22、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以udgA-F和udgA-R为引物进行PCR，获得约1200bp的UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA片段，并进行PCR产物纯化；
S23、将质粒pXYJ-hasA用SalI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将udgA片段连接到质粒pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-udgA；
S24、将pXYJ-hasA-udgA转化(电转法条件同上)到所述重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，将获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA。
其中，所用引物序列如下：
hasA-F：5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’
hasA-R：5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’
udgA-F：5’-caaccgagacaaaggaggacacatatgaaaattgccgtcgcagg-3’
udgA-R：5’-ccgccaaaacagccaagctgttagtcacgctggaaaatatcacgtgtataaact-3’。
本发明还提供一种高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中同时过表达内源的双功能UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因glmU(SEQ ID NO:3)、磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM(SEQ ID NO:4)以及氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS(SEQ ID NO:5)构建得到的。
本发明还提供所述高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：
S31、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法如上所述；
S32、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmU-F和glmU-R为引物进行PCR，获得约1500bp的双功能UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因glmU片段并进行PCR产物纯化；
S33、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmM-F和glmM-R为引物进行PCR，获得约1400bp的磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM片段并进行PCR产物纯化；
S34、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmS-F和glmS-R为引物进行PCR，获得约1900bp的氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS片段并进行PCR产物纯化；
S35、将质粒pXYJ-hasA用KpnI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将glmU、glmM、glmS片段连接到pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-glmUMS；
S36、将pXYJ-hasA-glmUMS转化(电转法条件同上)到所述重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS。
其中，所用引物序列如下：
glmU-F：5’-ttggcaggatccccgggtacaaggatttgagataatcttgagcg-3’
glmU-R：5’-ggccaagatcttagccttcctggttgtggacg-3’
glmM-F：5’-ggaaggctaagatcttggccaggccgtgca-3’
glmM-R：5’-tttctcgatcattagacttctgcaaccactgcag-3’
glmS-F：5’-cagaagtctaatgatcgagaaaaagttgttgtaaagtcatgc-3’
glmS-R：5’-gctgaattcgagctcggtacttattcgacggtgacagactttgcc-3’。
本发明还提供一种高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA中过表达外源的透明质酸酶合成酶基因Hyal(SEQ ID NO:6)构建得到的。
本发明还提供所述高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：
S41、基于水蛭的透明质酸酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸酶合成酶基因Hyal(SEQ ID NO:6)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的Hyal基因为模板，以hyal-F和hyal-R为引物进行PCR，获得约1500bp的Hyal片段，并进行PCR产物纯化；
S42、将带有信号肽的质粒pEC-S(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将Hyal片段连接到pEC-S上，获得的重组质粒命名为pEC-hyal；
S43、将pEC-hyal转化(电转法条件同上)到重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal。
其中，所用引物序列如下：
hyal-F：5’-ctacttccactgcacaaagcatgaaggagattgcggtcacg-3’
hyal-R：5’-gcctgcaggtcgactctagattactttttgcaggcctctacattgg-3’。
本发明还提供所述高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸中的应用。
将所述重组谷氨酸棒杆菌在2L的发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为1-10v/v％，发酵培养基为：葡萄糖30-100g/L、(NH4)2SO4 10-50g/L、玉米浆10-30g/L、KH2PO40.5-2g/L、K2HPO4 0.5-2g/L、MgSO4 1-5g/L、FeSO4·7H2O 0.01-1g/L、MnSO4·H2O 0.01-1g/L、谷氨酰胺0.5-2g/L、精氨酸0.1-2g/L；发酵过程温度控制在28-32℃，pH控制在6.8-7.3，转速为600-1200转/分钟；发酵3-5h时，通过加入0.5-10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵周期为36-72h，发酵结束后，得到含有透明质酸的发酵液。
优选地，发酵培养基为：葡萄糖50g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为1000转/分钟，利用NaOH溶液控制pH在7.0。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵48h，发酵结束后，得到含有透明质酸的发酵液。
本发明具有以下优点：
(一)本发明利用食品安全级的微生物谷氨酸棒杆菌，其本身不会分泌内毒素，简化了后提取过程，通过基因工程技术构建高产透明质酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株，产品无需复杂的分离就即可满足食品、化妆品及医药品的要求。
(二)本发明构建的高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其能够产生不同分子量的透明质酸(3000Da～200万Da)，依据分子量不同透明质酸的产量可达7g/L-20g/L，超过现有相关技术的产量，降低了透明质酸的生产成本。
(三)本发明构建的高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA，其发酵可产生分子量约为30万Da的透明质酸，产量可达9-10g/L；高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS，其发酵可产生分子量约为200万Da的透明质酸，产量可达6-7g/L；高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal，其发酵可产生分子量约为3000Da的透明质酸，产量可达15-20g/L。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1谷氨酸棒杆菌葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的敲除1、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-up-F和zwf-up-R为引物进行PCR，获得葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf上游约1000bp的同源片段zwf-up并进行PCR产物纯化；
2、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-down-F和zwf-down-R为引物进行PCR，获得zwf下游约1000bp的同源片段zwf-down并进行PCR产物纯化；
3、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI/XbaI进行双酶切，用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将zwf-up和zwf-down片段一步连接到酶切后的pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-zwf；
4、采用电穿孔仪(伯乐)将pK18-zwf通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌MB001中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上进行重组菌的第一次筛选。挑取阳性重组子进一步在液体LB培养基里过夜培养，然后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选。利用zwf-up-F和zwf-down-R为引物进行菌落PCR，敲除zwf基因的重组子能够扩增出2Kb大小的片段，该重组菌命名为C.glutamicumΔzwf。
其中，所用引物序列如下：
zwf-up-F：5’-acagctatgacatgattacgggcgattcctacgacgctca-3’
zwf-up-R：5’-taaattatggcacgatggtagtgtcacgatcc-3’
zwf-down-F：5’-taccatcgtgccataatttaggggcaaaaaatgatctttgaact-3’
zwf-down-R：5’-tgcatgcctgcaggtcgactgtgcgcgtactacatcaaccatag-3’。实施例2验证葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf的敲除对透明质酸产量的影响
基于兽疫链球菌的透明质酸合成酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸合成酶基因hasA(SEQ ID NO:7)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的hasA基因片段为模板，以hasA-F(5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’)和hasA-R(5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’)为引物进行PCR，获得约1400bp的hasA片段，并进行PCR产物纯化。将带有lacY基因(SEQ ID NO:8)的质粒pXYJ-12(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将hasA片段连接到pXYJ-12上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA。将质粒pXYJ-hasA通过电转法(条件同实施例1所述)分别转化野生型的谷氨酸棒杆菌MB001和重组菌C.glutamicumΔzwf，获得的重组菌分别命名为Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA。
将Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA在摇瓶中发酵，检测其透明质酸的产量。发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量。
透明质酸的检测方法为：取1mL的发酵液，向其中加入等量0.1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，在室温下静置30min，12000rpm条件下将发酵液离心10min，收集上清液，加入2倍体积的无水乙醇，于4℃条件下静置1h，充分沉淀。4℃，12000rpm条件下离心10min，弃去上清液，风干至乙醇完全挥发，用与原发酵液等体积的去离子水重悬沉淀。取300μL经过一次重悬稀释后的透明质酸溶液，向其中加入700μL的乙酸缓冲溶液(浓度为0.2mol/L的乙酸钠和0.15mol/L的NaCl，用乙酸调pH至6.0左右)，然后向其中加入2ml CTAB溶液(2.5g/L的CTAB，用0.5mol/L的NaOH溶液溶解)，反应进行5min后测定OD400值。
发酵结果显示，Cg/pXYJ-hasA和CgΔzwf/pXYJ-hasA的透明质酸的产量分别为0.3g/L和2.2g/L，因此敲除葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf对于提高透明质酸的产量具有重要的作用。
实施例3构建高产中等分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌
1、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法同实施例2所述；
2、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以udgA-F和udgA-R为引物进行PCR，获得约1200bp的UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA片段，并进行PCR产物纯化；
3、将质粒pXYJ-hasA用SalI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将udgA片段连接到质粒pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-udgA；
4、将pXYJ-hasA-udgA通过电转法(电转法条件同实施例1所述)转化到实施例1的重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，将获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA。
其中，所用引物序列如下：
hasA-F：5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’
hasA-R：5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’
udgA-F：5’-caaccgagacaaaggaggacacatatgaaaattgccgtcgcagg-3’
udgA-R：5’-ccgccaaaacagccaagctgttagtcacgctggaaaatatcacgtgtataaact-3’。
将CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA在2L发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为10v/v％，检测其透明质酸的产量。发酵培养基为：葡萄糖50g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L。发酵过程温度控制在32℃，转速为1000转/分钟，利用NaOH溶液控制pH在7.0。在发酵3h时，加入10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵48h后检测透明质酸的产量。透明质酸的产量达到了9.6g/L。利用凝胶过滤色谱法(PL aquagel-OH色谱柱，柱温25℃，流动相为0.2mol/L的NaCl，流速为1ml/min，检测器为示差折光检测器)检测透明质酸的分子量，其平均分子达到30万道尔顿。
实施例4构建高产高分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌
1、构建重组质粒pXYJ-hasA，方法同实施例2所述；
2、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmU-F和glmU-R为引物进行PCR，获得约1500bp的双功能UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因glmU片段并进行PCR产物纯化；
3、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmM-F和glmM-R为引物进行PCR，获得约1400bp的磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM片段并进行PCR产物纯化；
4、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以glmS-F和glmS-R为引物进行PCR，获得约1900bp的氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS片段并进行PCR产物纯化；
5、将质粒pXYJ-hasA用KpnI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将glmU、glmM、glmS片段连接到pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-glmUMS；
6、将pXYJ-hasA-glmUMS通过电转法(电转法条件同实施例1所述)转化到实施例1的重组谷氨酸棒杆菌Δzwf中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS。
其中，所用引物序列如下：
glmU-F：5’-ttggcaggatccccgggtacaaggatttgagataatcttgagcg-3’
glmU-R：5’-ggccaagatcttagccttcctggttgtggacg-3’
glmM-F：5’-ggaaggctaagatcttggccaggccgtgca-3’
glmM-R：5’-tttctcgatcattagacttctgcaaccactgcag-3’
glmS-F：5’-cagaagtctaatgatcgagaaaaagttgttgtaaagtcatgc-3’
glmS-R：5’-gctgaattcgagctcggtacttattcgacggtgacagactttgcc-3’。
将CgΔzwf/pXYJ-hasA-glmUMS在2L发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为10v/v％，检测其透明质酸的产量。发酵条件及检测方法同实施例3所述。透明质酸的产量达到6.8g/L，其平均分子达到200万道尔顿。
实施例5构建高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌
1、基于水蛭的透明质酸酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸酶合成酶基因Hyal(SEQ ID NO:6)，委托无锡青兰生物科技有限公司进行基因合成；以人工合成的Hyal基因为模板，以hyal-F和hyal-R为引物进行PCR，获得约1500bp的Hyal片段，并进行PCR产物纯化；
2、将带有信号肽的质粒pEC-S(购自Addgene)用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将Hyal片段连接到pEC-S上，获得的重组质粒命名为pEC-hyal；
3、将pEC-hyal通过电转法(电转法条件同实施例1所述)转化到实施例3的重组谷氨酸棒杆菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA中，筛选阳性克隆，获得的重组菌命名为CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal。
其中，所用引物序列如下：
hyal-F：5’-ctacttccactgcacaaagcatgaaggagattgcggtcacg-3’
hyal-R：5’-gcctgcaggtcgactctagattactttttgcaggcctctacattgg-3’。
将CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA/pEC-hyal在2L发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为10v/v％，检测其透明质酸的产量。发酵条件及检测方法同实施例3所述。透明质酸的产量达到18.2g/L，其平均分子达到3000道尔顿。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
<130> KHP191117135.9
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1545
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac tgcgcgaccc gcaggataaa 60
cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg 120
gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa accgcggatt gctgccccca 180
ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac 240
gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc gtgaaaatgt ttgggagcgc 300
ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac 360
ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac 420
tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc 480
atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac 540
aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct 600
gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt 660
tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca cgtccagatc 720
accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg catcggcgca 780
gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc catggaagaa 840
ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca 900
aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag 960
ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga gtccaccact 1020
gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg tgtgccgttc 1080
tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa 1140
gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca aaacgccatc 1200
gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt 1260
tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc cttcactgaa 1320
gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt ttggatgcgc tgttagatga atccagcctc 1380
ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc tggatccaat tcttgaagca 1440
tgggatgccg atggagaacc agaggattac ccagcgggta cgtggggtcc aaagagcgct 1500
gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataa 1545
<210> 2
<211> 1164
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
atgaaaattg ccgtcgcagg gctcggatat gttgggcttt caaatgcagc tctcctctct 60
aaaaatcata aagttgttgc agttgacatt gatgaagaac gagtgaaact agttcaagaa 120
tttcgttcgc caattgtcga tagcgatctc gaagaatatc tgtccactaa gcctcaaaac 180
ttaactgcca caacggacgc cgaagccgct tacaaaggcg cagattttat tgttattgca 240
acgccaacta attacgaccc agagtcaaac ttttttgata cttccagcgt tgagtccgta 300
attgagatag tccttaaggt ttctcctgga tccacaatcg taattaaatc gactatccct 360
gttggtttta catcggaact acgcattaag catccagaag cttcgattat tttttcacct 420
gagttcctgc gtgaaggccg agcattctac gacaatctct acccatccag agttgtcgtt 480
ggtgatcgca gtcctctggg ggaagaattt gcgactctgt tagctgaggg ggcaaaagaa 540
aagcctccga ttctacttac ggactcaact gaggcagagg cgattaaatt attttctaat 600
acatatcttg cactgcgagt tgcttttttc aacgaactgg atacttatgc gtctgttcga 660
agcttggata ctaagcagat tattgaaggg gtagggctcg atccacgtat tggatctcat 720
tacaataatc cttcatttgg atatggcgga tattgtcttc cgaaagatac gaaacagctt 780
ctcgccaact ataaggatgt cccgcagaat ctaatctctg cagtagtcca agcaaataag 840
actcgtaagg actttattgc agaggatatc ctcagtaaat cacctactgt agttggaatt 900
taccgccttg taatgaagtc tggatcagat aactttcgtt cttcttctat tcaaggagtc 960
atgaaacgaa ttaaggccaa gggaatcgaa attgtagtat ttgaaccgaa tctcggagaa 1020
gaaactttct acaattcgaa gatccttaat gacatcgaag agtttaagga ttactgcgac 1080
atcattattg caaatcgtcc aaccgatgag ctttctgatg taccagaaaa agtttataca 1140
cgtgatattt tccagcgtga ctaa 1164
<210> 3
<211> 1458
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 3
ttgagcgcaa gcgatttctc gagcgcagtt gtcgttttgg cagctggtgc cggaacccga 60
atgaaatcag acttacaaaa aacgttgcat agcatcggtg gacgcagtct catttcacat 120
agcttgcatg cagctgccgg gcttaatccc gagcacattg ttgcagtaat tggacatgga 180
cgcgaccagg tgggtccagc cgttgcccag gttgcagaag aactggaccg ggaagtcctc 240
atcgctatcc aagaggaaca aaatggcacg ggacacgctg tgcagtgcgc catggatcag 300
ctcgagggct ttgaaggcac gatcattgtc accaacggcg atgttcccct gctcaccgac 360
cacactctgt ctgcactgct ggatgcacac gtggaagttc caaccgctgt caccgtgttg 420
accatgcgtc tggatgaccc caccggctac ggccgcatcg tgcgcaacga agaaggcgaa 480
gtcaccgcca tcgttgagca aaaagatgct tcagcagaag tccaagccat cgatgaggtc 540
aactccggtg tctttgcttt cgacgccgcc atcttgcgtt ccgcactggc tgaactgaag 600
tccgacaacg ctcagggcga gctgtacctg accgacgtat tgggcattgc tcgtggcgag 660
ggccacccag tgcgcgccca caccgccgcc gatgctcgtg aactcgccgg tgtcaacgat 720
cgtgtgcagc tcgcagaagc cggcgccgaa ctaaaccgtc gcaccgtcat cgccgctatg 780
cgtggtggcg caaccatcgt tgatccagca accacctgga tcgatgtgga ggtttctatc 840
ggccgcgacg tgatcatcca ccctggcacc cagctcaagg gcgaaactgt catcggagac 900
cgcgttgaag ttggtccaga caccaccttg accaacatga ccatcggcga cggcgcatcc 960
gtaatccgca cccacggttt cgactccacc atcggtgaaa acgccaccgt tggccccttc 1020
acctacatcc gcccaggaac cacactggga ccagaaggca agctcggtgg cttcgtagaa 1080
accaagaagg ccacaatcgg ccgtggctcc aaggttccac acctcaccta tgtcggcgac 1140
gccaccatcg gcgaggaatc caacatcgga gcctcctctg tcttcgtgaa ctacgacggt 1200
gaaaacaagc accacaccac catcggcagc cacgttcgca ctggttctga caccatgttt 1260
atcgctccag tgaccgtggg tgacggagcg tattccggag ccggtacagt aattaaagac 1320
gatgttccgc caggagccct tgccgtgtcc ggcggacgcc aacgaaacat cgaaggctgg 1380
gtgcaaaaga agcgccctgg aaccgctgca gcacaagccg cagaagccgc ccaaaacgtc 1440
cacaaccagg aaggctaa 1458
<210> 4
<211> 1344
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 4
atgactcgac tatttggaac tgatggcgtc cgcggactag ccaatgaagt actcaccgca 60
cctttggcct tgaagctggg ggccgctgca gctcacgtac ttaccgcaga gaaacgggta 120
gatggacgtc gcccggttgc gatcgttggt agggatcctc gagtctctgg agagatgctc 180
gcggcagcac tttcagcagg catggccagc cagggtgttg atgtcattcg tgttggtgtc 240
atcccaaccc ctgctgttgc attcctcacc gatgattatg gcgctgacat gggcgtgatg 300
atttctgcat cccacaaccc aatgccggac aacggaatca agttcttctc tgcaggtgga 360
cacaagcttc cagaccatgt ggaagacgag attgagcgtg ttatggacag cttgccagca 420
gaaggcccaa cagggcatgg agttggccgt gtcatcgaag aagcaaccga tgcacaggac 480
cgttacctag agcacctgaa ggaagctgtt cctacgtcac ttgaaggcat caagattgtt 540
gtggatgcag ccaatggtgc ggcaagtgtt gtagctccaa cggcttatga ggctgcgggt 600
gcaactgtaa ttgctattca taacaagcca gactcataca acatcaacat ggactgcggt 660
tccacccaca ttgatcaggt gcaggcggca gtcctgaagc acggtgctga ccttggactc 720
gcgcatgacg gtgatgctga ccgttgtttg gctgtggaca aggatggcaa ccttgttgat 780
ggtgaccaaa tcatggcgct gttagccatt gcgatgaaag aaaacggcga gctgcgcaag 840
aacaccctcg tgggcactgt catgagcaac ctgggattga agattgctat ggatgaagcc 900
ggaattacac tgcgtaccac caaggtagga gaccgctacg tgctggaaga cctcaatgca 960
ggtggattca gcctgggcgg cgagcaatct ggccacattg ttcttccaga tcatggcacc 1020
actggcgatg gaactttgac tggtctttcc atcatggcgc gcatggctga aaccggaaag 1080
tccttgggcg agttggcaca agctatgacg gtgctgccac aggttctgat caatgtgcca 1140
gtttcggata agtccaccat cgtgagccac ccaagcgttg tggctgcgat cgcggaagca 1200
gaagctgagt tgggcgccac cggtcgcgtt cttcttcgtg cttctggcac cgaagagctt 1260
ttccgcgtga tggttgaggc tggagacaag gaacaagctc gtcgtatcgc gggacgtctt 1320
gctgcagtgg ttgcagaagt ctaa 1344
<210> 5
<211> 1872
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 5
atgtgtggaa ttgttggata tattggccaa gcgggcgact cccgtgatta ctttgctcta 60
gatgtagttg ttgaaggact acgtcgcctg gaataccgcg gatatgactc cgcaggtatt 120
gctattcacg ccaatggtga gattagctac cgaaagaagg ccggaaaggt tgctgcacta 180
gatgcagaaa tcgctaaagc acctcttcca gattctattt tgggaattgg acacacccgt 240
tgggcaactc atggtggccc aaccgatgtc aacgctcacc cccacgttgt ttccaatggc 300
aagcttgccg tagtacacaa cggcatcatc gaaaactttg cggaactgcg ctctgagctt 360
tccgctaagg gctacaactt tgtatccgat accgataccg aagttgctgc ttctttgctt 420
gctgaaattt acaatactca ggcaaacggt gacctcaccc ttgctatgca gctgaccggt 480
cagcgccttg agggtgcttt caccctgcta gctattcatg ctgatcacga tgaccgcatc 540
gttgcagctc gtcgtaactc tcctttggtt atcggcgtcg gcgagggcga gaacttcctc 600
ggatctgacg tttctggctt tattgattac acccgcaagg ctgtagagct ggctaatgac 660
caggttgtta ccatcaccgc tgatgattac gccatcacca actttgatgg atcagaagca 720
gttggcaagc ctttcgacgt ggagtgggac gctgcagctg ctgaaaaggg tggcttcggt 780
tccttcatgg agaaggaaat ccacgatcag ccagcagctg ttcgcgatac cctgatgggc 840
cgtcttgatg aagatggcaa gctcgttctt gatgagctgc gcatcgatga agctattctg 900
cgtagtgtcg acaagatcgt cattgttgct tgtggtactg cagcttatgc aggccaggtt 960
gctcgttacg ccattgagca ctggtgccgc atcccaaccg aggtggagct ggctcacgag 1020
ttccgttacc gcgacccaat cctcaacgag aagacccttg ttgtggcatt gtcccagtcc 1080
ggcgagacca tggataccct catggctgtt cgccacgcac gtgagcaggg tgccaaggtt 1140
gttgctattt gtaacactgt tggatccact cttccacgtg aagcagatgc gtccctgtac 1200
acctacgctg gccctgagat cgctgtggcg tccaccaagg cgttcttggc tcagatcact 1260
gcttcttact tgcttggcct gtacttggct cagctgcgcg gcaacaagtt cgctgatgag 1320
gtttcttcca ttctggacag cctgcgtgag atgcctgaga agattcagca ggtcatcgat 1380
gcagaagagc agatcaagaa gcttggccaa gatatggcag atgctaagtc tgtgctgttc 1440
ctgggccgcc acgttggttt cccagttgcg cttgagggtg cgttgaagct caaggagatc 1500
gcatacctgc acgctgaagg tttcgctgca ggcgagctca agcacggccc aattgctttg 1560
gttgaggaag gccagccgat cttcgttatc gtgccttcac ctcgtggtcg cgattccctg 1620
cactccaagg ttgtctccaa cattcaggag atccgtgcac gtggcgctgt caccatcgtg 1680
attgcagagg aaggcgatga ggctgtcaac gattacgcca acttcatcat ccgcattcct 1740
caggccccaa ccctgatgca gcctctgctg tccaccgtgc ctctgcagat ctttgcgtgc 1800
gctgtggcaa ccgcaaaggg ctacaacgtg gatcagcctc gtaacctggc aaagtctgtc 1860
accgtcgaat aa 1872
<210> 6
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaaggaga ttgcggtcac gattgatgac aaaaatgtaa tcgcttccgt gtctgagtct 60
ttccacggag tagcattcga cgcgtcgttg tttagcccaa aaggactctg gtcgtttgtc 120
gacattacct ctcccaaact tttcaagctg cttgaaggct tgagcccagg ttatttccgg 180
gttggaggaa cttttgcgaa ttggcttttt ttcgatctcg atgagaataa caaatggaag 240
gattattggg cgttcaaaga caagaccccc gagacggcta ccattacgcg gcggtggttg 300
ttccgtaaac agaataactt gaaaaaggag acgttcgacg atctcgttaa gctgacgaag 360
ggttctaaaa tgcgcctcct gttcgacctg aatgctgaag tgcggacggg ctacgagatc 420
ggtaaaaaga tgacgtcaac ctgggactcc tcagaggcag aaaaattgtt taaatactgt 480
gtgtcaaagg gatacggaga caatatcgac tgggagctcg gtaatgaacc agaccatact 540
tccgcgcata acctcacgga aaaacaagta ggagaagatt tcaaggcgtt gcacaaagtg 600
ttggagaaat atccgaccct caataaaggc tcactggtag gtccggatgt gggttggatg 660
ggtgtgtcgt acgtaaaggg cctggcagac ggtgcaggag accatgtcac ggcctttact 720
ctgcatcagt actactttga tggaaatacc tcggatgttt cgacgtattt ggacgcgact 780
tatttcaaga agcttcaaca gctctttgat aaggtcaaag atgttcttaa gaactcccca 840
cataaggaca agccgctctg gttgggagaa acttcttcag gttacaatag cggcacgaaa 900
gatgtgtcgg atcggtacgt cagcggtttt cttactcttg acaaacttgg tctgtctgct 960
gcaaataacg taaaagtggt tatccggcaa accatttata acggatacta cggtctcctc 1020
gacaaaaaca cgctcgaacc gaatcctgac tactggttga tgcacgtaca taatagcctt 1080
gttggcaata cggtttttaa agtggatgtc tccgatccca ccaacaaggc acgtgtctat 1140
gcccaatgta cgaagaccaa ctctaagcat actcaatccc gttattataa gggatctttg 1200
actatctttg cacttaacgt cggagatgaa gacgttactt tgaagattga tcaatactca 1260
ggtaagaaga tctatagcta catccttact cccgaaggcg gtcagctgac ctcgcagaag 1320
gttctcctga atggtaagga actcaagctt gtatctgatc aactcccaga acttaacgca 1380
gatgaatcta agacctcctt cacgctttcc cccaagactt tcggcttttt cgtggtatca 1440
gatgccaatg tagaggcctg caaaaagtaa 1470
<210> 7
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcgcaccc tgaagaacct gatcaccgtg gtggcattct ccatcttctg ggtgctgctg 60
atctacgtga acgtgtacct gttcggcgca aaaggctccc tgtccatcta tggcttcctg 120
ctgatcgcat acctgctggt gaagatgtcc ctgtccttct tctacaagcc attcaagggc 180
cgcgcaggcc aatataaggt ggcagcaatc atcccatcct acaacgaaga tgcagaatcc 240
ctgctggaaa ccctgaagtc cgtgcagcag cagacttacc cactggcaga aatctacgtg 300
gtggatgatg gctccgcaga tgaaactggc atcaagcgca tcgaagatta cgtgcgcgat 360
accggtgatc tgtcctccaa cgtgattgtg caccgctccg aaaagaacca aggcaagcgc 420
catgcacaag catgggcatt cgaacgctcc gatgcagatg tgttcctgac cgtggattcc 480
gatacctaca tctacccaga tgcactggaa gaactgctga agaccttcaa cgatccaacc 540
gtgttcgcag caactggcca cctgaatgtg cgtaaccgcc agaccaatct gttgactcgc 600
ctgaccgata tccgctacga taacgcattc ggcgtggaac gtgcagcaca gtctgtgact 660
ggcaacatcc tggtgtgttc cggtccactg tccgtgtatc gtcgtgaagt ggtggtgcca 720
aacatcgatc gctacatcaa ccagaccttc ctgggcatcc cagtgtccat tggcgatgat 780
cgctgcctga ccaactacgc aaccgatctg ggcaagaccg tgtatcagtc caccgcaaag 840
tgcatcaccg atgtgccaga taagatgtcc acctacctga agcagcagaa ccgctggaac 900
aagtccttct tccgcgaatc catcatctcc gtgaagaaga tcatgaacaa cccattcgtg 960
gcactgtgga ccatcctgga agtgtccatg ttcatgatgc tggtgtactc cgtggtggat 1020
ttcttcgtgg gcaacgtgcg cgaatttgat tggctgcgcg tgttggcatt cctggtgatc 1080
atcttcatcg tggcactgtg ccgcaacatc cactacatgc tgaagcaccc actgtccttc 1140
ctgctgtccc cattctatgg cgtgctgcac ctgtttgtgc tgcagccact gaagctgtac 1200
tccctgttca ccatccgcaa cgcagattgg ggcacccgta agaagctgct gtaa 1254
<210> 8
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60
tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120
agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180
ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240
accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300
tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360
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atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540
gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600
gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660
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caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780
tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840
ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900
gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960
ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020
tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080
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gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200
agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acagctatga catgattacg ggcgattcct acgacgctca 40
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taaattatgg cacgatggta gtgtcacgat cc 32
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taccatcgtg ccataattta ggggcaaaaa atgatctttg aact 44
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcatgcctg caggtcgact gtgcgcgtac tacatcaacc atag 44
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acagctatga catgattacg cgaaccacgc aatgcgtctc 40
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcctgcaggt cgactcgtct cggttggcag tgac 34
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caaccgagac aaaggaggac acatatgaaa attgccgtcg cagg 44
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccgccaaaac agccaagctg ttagtcacgc tggaaaatat cacgtgtata aact 54
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttggcaggat ccccgggtac aaggatttga gataatcttg agcg 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggccaagatc ttagccttcc tggttgtgga cg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggaaggctaa gatcttggcc aggccgtgca 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttctcgatc attagacttc tgcaaccact gcag 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagaagtcta atgatcgaga aaaagttgtt gtaaagtcat gc 42
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctgaattcg agctcggtac ttattcgacg gtgacagact ttgcc 45
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctacttccac tgcacaaagc atgaaggaga ttgcggtcac g 41
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcctgcaggt cgactctaga ttactttttg caggcctcta cattgg 46

Claims (6)

1.高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在重组菌Cg Δzwf/pXYJ-hasA-udgA中过表达外源的透明质酸酶合成酶基因Hyal构建得到的；其中，基因Hyal的序列如SEQ ID NO:6所示；
其中，所述重组菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA是通过在C.glutamicum Δzwf中过表达内源的UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA构建得到的；
所述C.glutamicum Δzwf是通过基因工程手段敲除谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf构建得到的；
所述C.glutamicum Δzwf的出发菌株为谷氨酸棒杆菌MB001。
2.根据权利要求1所述的高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA的具体构建方法，包括以下步骤：
S21、基于兽疫链球菌的透明质酸合成酶的氨基酸序列，设计了密码子优化的透明质酸合成酶基因hasA，序列如SEQ ID NO:7所示，以人工合成的hasA基因为模板，以hasA-F和hasA-R为引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行纯化，得到纯化的hasA片段；将携带有乳糖渗透酶基因LacY的载体pXYJ-12用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将上述纯化的hasA片段连接到载体pXYJ-12上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA；
S22、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组为模板，以udgA-F和udgA-R为引物进行PCR，获得UDP-葡萄糖脱氢酶基因udgA片段，并进行PCR产物纯化；
S23、将质粒pXYJ-hasA用SalI进行单酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将udgA片段连接到质粒pXYJ-hasA上，获得的重组质粒命名为pXYJ-hasA-udgA；
S24、将pXYJ-hasA-udgA转化到所述C.glutamicumΔzwf中，筛选阳性克隆，即得；
其中，引物序列如下：
hasA-F：5’-acagctatgacatgattacgcgaaccacgcaatgcgtctc-3’
hasA-R：5’-gcctgcaggtcgactcgtctcggttggcagtgac-3’
udgA-F：5’-caaccgagacaaaggaggacacatatgaaaattgccgtcgcagg-3’
udgA-R：5’-ccgccaaaacagccaagctgttagtcacgctggaaaatatcacgtgtataaact-3’。
3.根据权利要求1或2所述的高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述C.glutamicumΔzwf的具体构建方法，包括以下步骤：
S11、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-up-F和zwf-up-R为引物进行PCR，获得葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因zwf上游同源片段zwf-up并进行PCR产物纯化；
S12、以谷氨酸棒杆菌MB001的基因组DNA为模板，以zwf-down-F和zwf-down-R为引物进行PCR，获得zwf下游同源片段zwf-down并进行PCR产物纯化；
S13、将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB用EcoRI/XbaI进行双酶切，用GibsonAssembly试剂盒将zwf-up和zwf-down片段一步连接到酶切后的pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-zwf；
S14、将pK18-zwf转化到谷氨酸棒杆菌MB001中，筛选阳性克隆，即得；
其中，引物序列如下：
zwf-up-F：5’-acagctatgacatgattacgggcgattcctacgacgctca-3’
zwf-up-R：5’-taaattatggcacgatggtagtgtcacgatcc-3’
zwf-down-F：5’-taccatcgtgccataatttaggggcaaaaaatgatctttgaact-3’
zwf-down-R：5’-tgcatgcctgcaggtcgactgtgcgcgtactacatcaaccatag-3’。
4.权利要求1-3任一项所述高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S41、以人工合成的Hyal基因为模板，以hyal-F和hyal-R为引物进行PCR，获得Hyal片段，并进行PCR产物纯化；
S42、将带有信号肽的质粒pEC-S用EcoRI/XbaI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒将Hyal片段连接到pEC-S上，获得的重组质粒命名为pEC-hyal；
S43、将pEC-hyal转化到所述重组菌CgΔzwf/pXYJ-hasA-udgA中，筛选阳性克隆，即得；
其中，引物序列如下：
hyal-F：5’-ctacttccactgcacaaagcatgaaggagattgcggtcacg-3’
hyal-R：5’-gcctgcaggtcgactctagattactttttgcaggcctctacattgg-3’。
5.权利要求1-3任一项所述高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述重组谷氨酸棒杆菌在2L的发酵罐中进行发酵，装液量为1L，接种量为1-10％，发酵培养基为：葡萄糖30-100g/L、(NH4)2SO4 10-50g/L、玉米浆10-30g/L、KH2PO4 0.5-2g/L、K2HPO4 0.5-2g/L、MgSO4 1-5g/L、FeSO4·7H2O0.01-1g/L、MnSO4·H2O 0.01-1g/L、谷氨酰胺0.5-2g/L、精氨酸0.1-2g/L；发酵过程温度控制在28-32℃，pH控制在6.8-7.3，转速为600-1200转/分钟；发酵3-5h时，通过加入0.5-10.0mM乳糖诱导蛋白的表达和透明质酸的产生，发酵周期为36-72h，发酵结束后，得到含有透明质酸的发酵液。
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Application publication date: 20200421

Assignee: Beijing Green Kangcheng Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: TSINGHUA University

Contract record no.: X2022990000973

Denomination of invention: Recombinant Corynebacterium glutamicum with high yield of low molecular weight hyaluronic acid and its construction method and application

Granted publication date: 20210903

License type: Common License

Record date: 20221201

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