CN108707573B - 一种产生n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产生N‑乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用,所述基因工程菌利用阿拉伯糖或鼠李糖同时诱导N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径的强化，以及旁路代谢途径的弱化，实现精准调控。本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌W3110‑GLA‑1(阿拉伯糖诱导型)、W3110‑GLA‑2(鼠李糖诱导型)以葡萄糖为底物可高效合成N‑乙酰氨基葡萄糖，在5L发酵罐发酵72h后N‑乙酰氨基葡萄糖的产量达到168g/L、160g/L，转化率约48％、47％，具有较强的工业化生产潜力。

Description

一种产生N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种产生N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。
背景技术
N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-Glucosamine)是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的衍生物，又称作N-乙酰-D-葡萄糖胺，化学名为2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。N-乙酰氨基葡萄糖在酸性条件下可脱去乙酰基转化为氨基葡萄糖。目前，氨基葡萄糖广泛应用于医药、食品、化妆品等领域，具有较大的市场需求。
氨基葡萄糖被用于临床治疗关节炎、骨关节炎、风湿性关节炎、软骨损伤、关节损伤等疾病。此外，N-乙酰氨基葡萄糖可以抑制弹性蛋白酶的活性，抑制人多形核白细胞释放过氧化物。另外，N-乙酰氨基葡萄糖可以促进角蛋白细胞产生透明质酸，已被成功用于伤口愈合。
N-乙酰氨基葡萄糖具有促进纤维组织母细胞释放酸性粘多糖，恢复胃肠道保护结构的作用；具有增加血管周围组织的弹性，增加动脉毛细血管的血流量。人体内N-乙酰氨基葡萄糖也可作为细胞保护剂恢复粘膜的完整性和正常功能。已有临床试验确认N-乙酰氨基葡萄糖对炎症性肠道疾病具有明显减轻效果，因此，N-乙酰氨基葡萄糖可作为一种廉价的无毒药物治疗慢性肠炎。
体外Franz细胞实验表明N-乙酰氨基葡萄糖可有效的穿过皮肤，具有保湿性能。外用N-乙酰氨基葡萄糖可提高皮肤质量，改善面部色素沉积。N-乙酰氨基葡萄糖具有多种功能，被认为是化妆品中改善皮肤皱纹和颜色的有效成分。
目前，N-乙酰氨基葡萄糖的生产方法主要为甲壳素水解法，通过使用强酸对生物中的甲壳素进行酸解，使其相互连接的β键断裂，从而解离出N-乙酰氨基葡萄糖单体。该方法存在强酸废液污染环境、水解条件强烈、虾壳蟹壳来源造成部分人群过敏等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种产生N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述产生N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一株生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，具有诱导型启动子控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；包含T7启动子控制的来自酿酒酵母菌的Sc-gna1基因；具有多个T7启动子控制的来自大肠杆菌的glmS基因；nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ七个基因缺陷型；具有诱导型启动子控制的dCas9，利用CRISPR/dCas9基因干扰技术，动态干扰pfkA基因表达强度，使pfkA基因被关闭或以低水平表达；其中，
所述编码基因Sc-gna1(优选的基因组整合位点为nagE)的核苷酸序列为序列表400<1>所示序列；
所述编码基因glmS(优选的基因组整合位点为manX)的核苷酸序列为序列表400<2>所示序列；
所述编码基因T7RNA聚合酶的核苷酸序列为序列表400<5>所示序列；
所述编码基因nagA的核苷酸序列为序列表400<6>所示序列；
所述编码基因nagB的核苷酸序列为序列表400<7>所示序列；
所述编码基因nagC的核苷酸序列为序列表400<8>所示序列；
所述编码基因nagE的核苷酸序列为序列表400<9>所示序列；
所述编码基因manX的核苷酸序列为序列表400<10>所示序列；
所述编码基因manY的核苷酸序列为序列表400<11>所示序列；
所述编码基因manZ的核苷酸序列为序列表400<12>所示序列；
所述编码基因pfkA的核苷酸序列为序列表400<13>所示序列；
所述编码基因T7启动子的核苷酸序列为序列表400<14>所示序列；
所述编码基因T7终止子的核苷酸序列为序列表400<15>所示序列；
所述生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌E.coli W3110为宿主细胞。
优选的，上述生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌(E.coli W3110-GLA-1、E.coliW3110-GLA-2)，所述诱导型启动子为阿拉伯糖启动子Para或鼠李糖启动子Prha，其中，
所述编码阿拉伯糖启动子基因Para的核苷酸序列为序列表400<3>所示序列；
所述编码鼠李糖启动子基因Prha的核苷酸序列为序列表400<4>所示序列。
优选的，上述生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌(E.coli W3110-GLA-1、E.coliW3110-GLA-2)，是在大肠杆菌基因组上异源表达来自酿酒酵母菌中的Sc-gna1基因，多拷贝来源于大肠杆菌MG1655中的glmS基因，重构并强化大肠杆菌N-乙酰氨基葡萄糖合成通路，利用诱导剂诱导来源于T7噬菌体的RNA聚合酶表达，结合T7强启动子系统启动相关目的基因高效表达；同时利用诱导剂诱导dCas9的表达，对pfkA基因进行表达弱化得到的。
优选的，上述生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述诱导剂为阿拉伯糖或鼠李糖。
上述生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)nagBAC基因簇的敲除：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除nagBAC基因簇：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据nagBAC基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(nagBAC-UF/UR)和下游同源臂引物(nagBAC-DF/DR)，PCR扩增获取nagBAC基因的上、下游同源臂；
②采用重叠PCR技术以nagBAC基因的上下游同源臂为模板，PCR扩增获取nagBAC基因的上下游同源臂重叠片段；
③构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物nagBAC-F和nagBAC-R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
④提取步骤③阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤②所构建的nagBAC基因敲除片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功敲除nagBAC基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得敲除nagBAC基因的E.coli W3110菌株(敲除nagBAC基因及验证见图1：上游同源臂约450bp，下游同源臂约500bp，重叠后片段大小约950bp；原菌基因组鉴定引物PCR结果应3800bp，敲除成功后基因组PCR条带约950bp，电泳条带与设计大小一致，证明nagBAC基因敲除成功)；
(2)manXYZ基因簇的敲除：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除manXYZ基因簇：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据manXYZ基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(manXYZ-UF/UR)和下游同源臂引物(manXYZ-DF/DR)，PCR扩增获取manXYZ基因的上、下游同源臂；
②采用重叠PCR技术以manXYZ基因的上下游同源臂为模板，PCR扩增获取manXYZ基因的上下游同源臂重叠片段；
③构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物manXYZ-F和manXYZ-R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
④提取步骤③阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤②所构建的manXYZ基因敲除片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功敲除manXYZ基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得敲除manXYZ基因的E.coli W3110菌株；
(3)nagE基因的敲除：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除nagE基因：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据nagE基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(nagE-UF/UR)和下游同源臂引物(nagE-DF/DR)，PCR扩增获取nagE基因的上、下游同源臂；
②采用重叠PCR技术以nagE基因的上下游同源臂为模板，PCR扩增获取nagE基因的上下游同源臂重叠片段；
③构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物nagE-F和nagE-R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
④提取步骤③阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤②所构建的nagE基因敲除片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功敲除nagE基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得敲除nagE基因的E.coliW3110菌株(敲除nagE基因及验证见图2：上游同源臂约480bp，下游同源臂约460bp，重叠后片段大小约920bp；原菌基因组鉴定引物PCR结果应2570bp，敲除成功后基因组PCR条带约920bp，电泳条带与设计大小一致，证明nagE基因敲除成功)；
(4)T7RNA聚合酶(T7RNAP)的表达：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据阿拉伯糖启动子Para或鼠李糖启动子Prha基因序列分别设计一对引物(分别为araA-F/R或rhaB-F/R)，扩增阿拉伯糖启动子Para或鼠李糖启动子Prha基因；
②采用PCR技术以E.coli BL21基因组为模板，根据T7RNA聚合酶基因序列设计一对引物(T7-F/R)，扩增T7RNA聚合酶基因；
③采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(T7-UF/UR)和下游同源臂引物(T7-DF/DR)，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
④以步骤①、步骤②和步骤③中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得T7RNA聚合酶基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及加装阿拉伯糖或鼠李糖启动子的T7RNA聚合酶基因片段组成；
⑤构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物QT7-F/R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑥提取步骤⑤阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤④所构建的T7RNA聚合酶基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功整合T7RNA聚合酶基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合T7RNA聚合酶基因的E.coli W3110菌株；
(5)酿酒酵母菌Sc-gna1基因的引入：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将gna1基因整合于E.coli W3110菌株基因组中：
①采用PCR技术以酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)基因组为模板，根据Sc-gna1基因序列设计一对引物(gna1-F、gna1-R)扩增Sc-gna1基因，并将T7启动子和T7终止子序列添加到gna1片段扩增引物5’和3’端，扩增PT7-gna1片段；
②采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(Sc-gna1-UF、Sc-gna1-UR)和下游同源臂引物(Sc-gna1-DF、Sc-gna1-DR)，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得Sc-gna1基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及Sc-gna1基因片段组成；
④构建gRNA质粒使用的含靶序列的DNA片段通过引物gna1-F和gna1-R退火制得；将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑤提取步骤④阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤③所构建的gna1基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110细胞中，筛选成功整合gna1基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合gna1基因的E.coli W3110(整合gna1基因及验证见图3：上游同源臂约450bp，下游同源臂约400bp，中间gna1片段约630bp，重叠后整合片段大小约1500bp；原菌基因组鉴定引物PCR结果应无条带，整合成功后基因组PCR条带约1000bp，电泳条带与设计大小一致，证明gna1基因整合成功)；
(6)多拷贝glmS基因的整合：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将glmS基因整合于E.coli W3110菌株基因组中：
①采用PCR技术以基因组为模板，根据E.coli MG1655基因序列设计一对引物(glmS-F、glmS-R)扩增glmS基因，并将T7启动子和T7终止子序列添加到glmS片段扩增引物5’和3’端，扩增PT7-glmS片段；
②采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(glmS-UF、glmS-UR)和下游同源臂引物(glmS-DF、glmS-DR)，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得glmS基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及glmS基因片段组成；
④构建gRNA质粒使用的含靶序列的DNA片段通过引物ZglmS-F和ZglmS-R退火制得；将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑤提取步骤④阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤③所构建的glmS基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110细胞中，筛选成功整合glmS基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合glmS基因的E.coli W3110菌株；
⑥重复步骤①至⑤即得多拷贝glmS基因的E.coli W3110菌株；
(7)干扰pfkA基因的表达强度：
①采用PCR技术以dCas9的基因序列为模板，扩增dCas9基因，并将诱导型启动子(优选阿拉伯糖启动子Para或鼠李糖启动子Prha)添加到dCas9片段5’端，扩增Para-dCas9或Prha-dCas9片段；
②采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物和下游同源臂引物，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得Para-dCas9或Prha-dCas9基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及加装阿拉伯糖或鼠李糖启动子的dCas9基因片段组成；
④构建gRNA质粒使用的含靶序列的DNA片段通过引物退火制得；将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑤提取步骤④阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤③所构建的glmS基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110细胞中，筛选成功整合Para-dCas9或Prha-dCas9基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合Para-dCas9或Prha-dCas9基因的E.coliW3110菌株；
⑥采用上述①-⑤实验方案整合pfkA干扰序列，得到阿拉伯糖或鼠李糖诱导型pfkA基因干扰E.coli W3110菌株。
上述基因工程菌生产N-乙酰氨基葡萄糖方面的应用。
优选的，上述基因工程菌的应用，所述基因工程菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的具体方法如下：
摇瓶发酵：
(1)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，34-39℃，100-250rpm培养10-15h；
(2)摇瓶发酵培养：以5-10％的接种量接种至发酵培养基中，34-39℃，100-250rpm进行发酵培养，发酵前期(0-6h左右)添加终浓度2-15g/L的阿拉伯糖或鼠李糖溶液，诱导目的基因的表达,培养过程中通过微量进样器补加氨水使pH值维持在6.5-7.5，60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液)，发酵周期30-40h；
摇瓶发酵30-40h后N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到40-50g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母粉2-5g/L，(NH4)2SO41-5g/L，KH2PO41-5g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO4·7H2O 2-5mg/L，MnSO4·7H2O 1-4mg/L，VH0.05-2mg/L，VB10.1-1mg/L，其余为水，pH 6.8-7.2；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，阿拉伯糖或鼠李糖2-15g/L,酵母粉2-5g L，(NH4)2SO41-5g/L，KH2PO43-8g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO4·7H2O 5-10mg/L，MnSO4·7H2O 1-4mg/L，CaCl2·2H2O20-30mg/L，NaCl 0.5-2g/L，VH 0.05-2mg/L，VB1 0.1-1mg/L，其余为水，pH 6.8-7.2；
5L发酵罐发酵：
(1)活化斜面培养：从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于活化斜面，34-39℃培养10-15h，转接第二代活化斜面，培养10-15h；
(2)种子培养：取适量无菌水于活化斜面，将菌悬液转接至种子培养基中，pH 6.8-7.2；温度34-39℃；溶液25-40％之间，培养至细胞干重达到2-15g/L之间；
(3)发酵培养：按照10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2；温度维持在35-39℃；溶氧在25-40％之间；
在发酵前期(0-6h左右)添加终浓度2-15g/L的诱导剂(阿拉伯糖或鼠李糖溶液)，诱导目的基因的表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-5g/L，发酵周期为60-80h；
5L发酵罐60-80h后N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到140-170g/L；
活化斜面培养基组成为：酵母粉3-8g/L，蛋白胨8-12g/L，牛肉膏8-12g/L，NaCl 3-8g/L，蔗糖0.5-2g/L，琼脂条15-30g/L，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min；
种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母粉2-5g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO4·7H2O 2-5mg/L，MnSO4·7H2O 1-4mg/L，VH0.05-2mg/L，VB1 0.1-1mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母粉1-6g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，KH2PO4 3-8g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO4·7H2O 30-90mg/L，MnSO4·7H2O 1-5mg/L，Met 0.5-2g/L，VH 0.05-2mg/L，VB1 0.1-1mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
本发明的有益效果是：
本发明将来源于酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶基因(Sc-gna1)转入大肠杆菌中，并且多拷贝表达了果糖-6-磷酸氨基转移酶基因(glmS)，在大肠杆菌中重构并强化了N-乙酰氨基葡萄糖的合成通路。重组的菌株能以葡萄糖为原料催化合成N-乙酰氨基葡萄糖。
本发明通过敲除大肠杆菌代谢途径中消耗N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的nagA、nagB、nagC基因，防止N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物在大肠杆菌体内回流和降解，从而增加N-乙酰氨基葡萄糖的积累；敲除由胞外将N-乙酰氨基葡萄糖转运至胞内的N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因(nagE)及甘露糖转运系统基因(manX、manY、manZ)，使大肠杆菌所产生的N-乙酰氨基葡萄糖能在胞外积累，方便后续对N-乙酰氨基葡萄糖的提取与加工。
本发明利用CRISPR/dCas9基因干扰技术使6-磷酸果糖激酶基因(pfkA)表达关闭或表达量降低，从而使N-乙酰氨基葡萄糖合成过程中的前体物质6-磷酸-果糖更多地流向N-乙酰氨基葡萄糖合成途径，进而增加N-乙酰氨基葡萄糖的产量与转化率。
本发明所构建的产N-乙酰氨基葡萄糖的菌株经过一系列的改造，增强了葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通量，使得工程菌可以直接利用葡萄糖生产N-乙酰氨基葡萄糖，5L发酵罐发酵60-80h后N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到了140-170g/L。
附图说明
图1nagBAC基因簇的敲除及验证
其中，M：Marker，1：上游同源臂片段，2：下游同源臂片段，3：重叠片段，4：原菌基因组PCR产物，5：敲除后基因组PCR产物；
图2nagE基因的敲除及验证
其中，M：Marker，1：上游同源臂片段，2：下游同源臂片段，3：重叠片段，4：原菌基因组PCR产物，5：敲除后基因组PCR产物；
图3整合PT7-Sc-gna1基因及验证
其中，M：Marker，1：下游同源臂片段，2：上游同源臂片段，3：待整合PT7-Sc-gna1片段，4：重叠片段，5：原菌基因组PCR产物，6：整合后基因组PCR产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
E.coli W3110-GLA-1菌株构建
(1)nagBAC基因簇的敲除：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除nagBAC基因簇：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据nagBAC基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(nagBAC-UF/UR)和下游同源臂引物(nagBAC-DF/DR)，PCR扩增获取nagBAC基因的上、下游同源臂；
②采用重叠PCR技术以nagBAC基因的上下游同源臂为模板，PCR扩增获取nagBAC基因的上下游同源臂重叠片段；
③构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物nagBAC-F和nagBAC-R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
④提取步骤③阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤②所构建的nagBAC基因敲除片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功敲除nagBAC基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得敲除nagBAC基因的E.coli W3110菌株(敲除nagBAC基因及验证见图1：上游同源臂约450bp，下游同源臂约500bp，重叠后片段大小约950bp；原菌基因组鉴定引物PCR结果应3800bp，敲除成功后基因组PCR条带约950bp，电泳条带与设计大小一致，证明nagBAC基因敲除成功。)；
(2)manXYZ基因簇的敲除：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除manXYZ基因簇：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据manXYZ基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(manXYZ-UF/UR)和下游同源臂引物(manXYZ-DF/DR)，PCR扩增获取manXYZ基因的上、下游同源臂；
②采用重叠PCR技术以manXYZ基因的上下游同源臂为模板，PCR扩增获取manXYZ基因的上下游同源臂重叠片段；
③构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物manXYZ-F和manXYZ-R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
④提取步骤③阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤②所构建的manXYZ基因敲除片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功敲除manXYZ基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得敲除manXYZ基因的E.coli W3110菌株；
(3)nagE基因的敲除：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除nagE基因：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据nagE基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(nagE-UF/UR)和下游同源臂引物(nagE-DF/DR)，PCR扩增获取nagE基因的上、下游同源臂；
②采用重叠PCR技术以nagE基因的上下游同源臂为模板，PCR扩增获取nagE基因的上下游同源臂重叠片段；
③构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物nagE-F和nagE-R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
④提取步骤③阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤②所构建的nagE基因敲除片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功敲除nagE基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得敲除nagE基因的E.coliW3110菌株(敲除nagE基因及验证见图2：上游同源臂约480bp，下游同源臂约460bp，重叠后片段大小约920bp；原菌基因组鉴定引物PCR结果应2570bp，敲除成功后基因组PCR条带约920bp，电泳条带与设计大小一致，证明nagE基因敲除成功。)；
(4)T7RNA聚合酶(T7RNAP)的表达：
①采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据阿拉伯糖启动子Para基因序列设计一对引物(araA-F/R)，扩增阿拉伯糖启动子Para基因；
②采用PCR技术以E.coli BL21基因组为模板，根据T7RNA聚合酶基因序列设计一对引物(T7-F/R)，扩增T7RNA聚合酶基因；
③采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(T7-UF/UR)和下游同源臂引物(T7-DF/DR)，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
④以步骤①、步骤②和步骤③中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得T7RNA聚合酶基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及加装阿拉伯糖启动子的T7RNA聚合酶基因片段组成；
⑤构建含有Cas9切割识别序列的gRNA质粒，含靶序列的DNA片段通过引物QT7-F/R退火制得，将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑥提取步骤⑤阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤④所构建的T7RNA聚合酶基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110感受态细胞中，筛选成功整合T7RNA聚合酶基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合T7RNA聚合酶基因的E.coli W3110菌株；
(5)酿酒酵母菌Sc-gna1基因的引入：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将gna1基因整合于E.coli W3110菌株基因组中：
①采用PCR技术以酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)基因组为模板，根据Sc-gna1基因序列设计一对引物(gna1-F、gna1-R)扩增Sc-gna1基因，并将T7启动子和T7终止子序列添加到gna1片段扩增引物5’和3’端，扩增PT7-gna1片段；
②采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(Sc-gna1-UF、Sc-gna1-UR)和下游同源臂引物(Sc-gna1-DF、Sc-gna1-DR)，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得Sc-gna1基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及Sc-gna1基因片段组成；
④构建gRNA质粒使用的含靶序列的DNA片段通过引物gna1-F和gna1-R退火制得；将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑤提取步骤④阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤③所构建的gna1基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110细胞中，筛选成功整合gna1基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合gna1基因的E.coli W3110(整合gna1基因及验证见图3：上游同源臂约450bp，下游同源臂约400bp，中间gna1片段约630bp，重叠后整合片段大小约1500bp；原菌基因组鉴定引物PCR结果应无条带，整合成功后基因组PCR条带约1000bp，电泳条带与设计大小一致，证明gna1基因整合成功。)；
(6)多拷贝glmS基因的整合：
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将glmS基因整合于E.coli W3110菌株基因组中：
①采用PCR技术以基因组为模板，根据E.coli MG1655基因序列设计一对引物(glmS-F、glmS-R)扩增glmS基因，并将T7启动子和T7终止子序列添加到glmS片段扩增引物5’和3’端，扩增PT7-glmS片段；
②采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(glmS-UF、glmS-UR)和下游同源臂引物(glmS-DF、glmS-DR)，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得glmS基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及glmS基因片段组成；
④构建gRNA质粒使用的含靶序列的DNA片段通过引物ZglmS-F和ZglmS-R退火制得；将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑤提取步骤④阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤③所构建的glmS基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110细胞中，筛选成功整合glmS基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合glmS基因的E.coli W3110菌株；
⑥重复步骤①至⑤即得多拷贝glmS基因的E.coli W3110菌株；
(7)干扰pfkA基因的表达强度：
①采用PCR技术以dCas9的基因序列为模板，扩增dCas9基因，并将阿拉伯糖启动子Para添加到dCas9片段5’端，扩增Para-dCas9片段；
②采用PCR技术以E.coli W3110基因组为模板，根据整合位点基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物和下游同源臂引物，PCR扩增获取待整合位点基因的上、下游同源臂；
③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得Para-dCas9基因整合片段，所述基因整合片段由带整合位点基因上、下游同源臂基因片段及加装阿拉伯糖启动子的dCas9基因片段组成；
④构建gRNA质粒使用的含靶序列的DNA片段通过引物退火制得；将构建完成的gRNA质粒化转入DH5α化转感受态细胞，筛选阳性转化子；
⑤提取步骤④阳性转化子的重组gRNA质粒，并与步骤③所构建的glmS基因整合片段同时电转入含有pRedCas9质粒的E.coli W3110细胞中，筛选成功整合Para-dCas9基因的阳性转化子，消除阳性转化子中的pRedCas9质粒及gRNA质粒后获得整合Para-dCas9基因的E.coli W3110菌株；
⑥采用上述①-⑤实验方案整合pfkA干扰序列，得到阿拉伯糖诱导型pfkA基因干扰E.coli W3110-GLA-1菌株。
受鼠李糖诱导的菌株E.coli W3110-GLA-2的构建与上述步骤仅在步骤(4)①及步骤(7)①中存在区别，具体如下：(4)①采用PCR技术以E.coliW3110基因组为模板，根据鼠李糖启动子(Prha)基因序列设计一对引物(rhaB-F/R)，扩增鼠李糖启动子(Prha)基因。(7)①采用PCR技术以dCas9的基因序列为模板，扩增dCas9基因，并将鼠李糖启动子Prha添加到dCas9片段5’端，扩增Prha-dCas9片段
Figure BDA0001670513250000171
Figure BDA0001670513250000181
Figure BDA0001670513250000191
Figure BDA0001670513250000201
实施例2E.coli W3110-GLA-1菌株5L发酵罐发酵实验：
以实施例1构建的E.coli W3110-GLA-1菌株作为生产菌株发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖：
(1)斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接第二代斜面培养12h；
种子培养：无菌操作，取适量无菌水于第二代活化斜面，将菌悬液接入装有3L种子培养基的5L发酵罐中，通过pH电极控制自动流加氨水维持培养过程中pH稳定在7.0左右；通过温度电极自动控制发酵过程温度恒定在37℃；通过搅拌桨转速和通风量控制溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达6g/L；
(3)发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右；温度维持在37℃；溶氧维持在25-35％之间，发酵72h；
在发酵3h添加终浓度10g/L的阿拉伯糖，诱导目的基因的表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-5g/L。
活化斜面培养基组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 5g/L，蔗糖1g/L，琼脂条20g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min；
种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，柠檬酸2g/L，FeSO4·7H2O 2.8mg/L，MnSO4·7H2O 1.2mg/L，VH 0.1mg/L，VB1 0.5mg/L，消泡剂1滴其余为水，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min；
发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉6g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸2g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·7H2O 1.2mg/L，Met 1g/L，VH0.1mg/L，VB1 0.5mg/L，消泡剂1滴其余为水，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min。
液相色谱检测，72h发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量约为168g/L。
实施例3E.coli W3110-GLA-2菌株5L发酵罐发酵实验：
以构建的E.coli W3110-GLA-2菌株作为生产菌株发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖：
(1)斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接第二代斜面培养12h；
种子培养：无菌操作，取适量无菌水于第二代活化斜面，将菌悬液接入装有3L种子培养基的5L发酵罐中，通过pH电极控制自动流加氨水维持培养过程中pH稳定在7.0左右；通过温度电极自动控制发酵过程温度恒定在37℃；通过搅拌桨转速和通风量控制溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达6g/L；
(3)发酵培养：按照20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右；温度维持在37℃；溶氧维持在25-35％之间，发酵72h；
在发酵6h添加终浓度10g/L的鼠李糖，诱导目的基因的表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-5g/L。
活化斜面培养基组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 5g/L，蔗糖1g/L，琼脂条20g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min；
种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，柠檬酸2g/L，FeSO4·7H2O 2.8mg/L，MnSO4·7H2O 1.2mg/L，VH 0.1mg/L，VB1 0.5mg/L，消泡剂1滴其余为水，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min；
发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉6g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸2g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·7H2O 1.2mg/L，Met 1g/L，VH0.1mg/L，VB1 0.5mg/L，消泡剂1滴其余为水，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min。
液相色谱检测，72h发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量约为160g/L。
综上，本发明所述基因工程菌利用阿拉伯糖或鼠李糖同时诱导N-乙酰氨基葡萄糖合成途径的强化，以及旁路代谢途径的弱化，实现精准调控。N-乙酰氨基葡萄糖合成途径的强化采用CRISPR/Cas9技术按照以下方法进行构建：在出发大肠杆菌W3110中敲除nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ七个基因，采用阿拉伯糖或鼠李糖诱导T7噬菌体来源的RNA聚合酶合成，以实现T7启动子调控的N-乙酰氨基葡萄糖合成途径的诱导强化，包括引入来源于酵母菌的gna1基因(Sc-gna1)，对大肠杆菌的内源性glmS基因进行多拷贝强化。旁路代谢途径的弱化采用阿拉伯糖或鼠李糖诱导CRISPR/dCas9基因干扰系统，按照以下方法进行构建：在上述基因工程菌基础上，使用阿拉伯糖启动子(Para)或鼠李糖启动子(Prha)调控dCas9的表达，进而干扰pfkA基因的表达强度，以减弱糖酵解代谢。本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌W3110-GLA-1(阿拉伯糖诱导型)、W3110-GLA-2(鼠李糖诱导型)以葡萄糖为底物可高效合成N-乙酰氨基葡萄糖，在5L发酵罐发酵72h后N-乙酰氨基葡萄糖的产量分别达到168g/L、160g/L，具有较强的工业化生产潜力。
上述参照实施例对该一种产生N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种产生N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用
<150> 2017113336584
<151> 2017-12-14
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> 编码基因Sc-gna1(酿酒酵母菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(480)
<400> 1
atgagcttac ccgatggatt ttatataagg cgaatggaag agggggattt ggaacaggtc 60
actgagacgc taaaggtttt gaccaccgtg ggcactatta cccccgaatc cttcagcaaa 120
ctcataaaat actggaatga agccacagta tggaatgata acgaagataa aaaaataatg 180
caatataacc ccatggtgat tgtggacaag cgcaccgaga cggttgccgc tacggggaat 240
atcatcatcg aaagaaagat cattcatgaa ctggggctat gtggccacat cgaggacatt 300
gcagtaaact ccaagtatca gggccaaggt ttgggcaagc tcttgattga tcaattggta 360
actatcggct ttgactacgg ttgttataag attattttag attgcgatga gaaaaatgtc 420
aaattctatg aaaaatgtgg gtttagcaac gcaggcgtgg aaatgcaaat tagaaaatag 480
<210> 2
<211> 1830
<212> DNA
<213> 编码基因glmS(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1830)
<400> 2
atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60
ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120
ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180
gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240
ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300
atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360
tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420
actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480
atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540
attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600
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aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720
tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780
ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840
gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900
tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960
attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020
aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080
cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140
tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200
gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260
tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320
ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380
gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440
ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500
ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560
gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620
ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680
cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740
ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800
aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830
<210> 3
<211> 365
<212> DNA
<213> 编码阿拉伯糖启动子基因Para(启动子)
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(365)
<400> 3
attgaactcc ataatcaggt aatgccgcgg gtgatggatg atgtcgtaat attgggcact 60
ccctttcagt tgctcaatta tgttatttca cactgctatt gagataattc acaagtgtgc 120
gctcgctcgc aaaataaaat ggaatgatga aactgggtaa ttcctcgaag agaaaaatgc 180
aataagtaca attgcgcaac aaaagtaaga tctcggtcat aaatcaagaa ataaaccaaa 240
aatcgtaatc gaaagataaa aatctgtaat tgttttcccc tgtttagttg ctaaaaattg 300
gttacgttta tcgcggtgat tgttacttat taaaactgtc ctctaactac agaaggccct 360
acacc 365
<210> 4
<211> 144
<212> DNA
<213> 编码鼠李糖启动子基因Prha(启动子)
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(144)
<400> 4
atcaccacaa ttcagcaaat tgtgaacatc atcacgttca tctttccctg gttgccaatg 60
gcccattttc ctgtcagtaa cgagaaggtc gcgaattcag gcgcttttta gactggtcgt 120
aatgaaattc agcaggatca catt 144
<210> 5
<211> 2652
<212> DNA
<213> 编码基因T7 RNA聚合酶(T7噬菌体)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2652)
<400> 5
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 6
<211> 1149
<212> DNA
<213> 编码基因nagA(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1149)
<400> 6
atgtatgcat taacccaggg ccggatcttt accggccacg aatttcttga tgaccacgcg 60
gttgttatcg ctgatggcct gattaaaagc gtctgtccgg tagcggaact gccgccagag 120
atcgaacaac gttcactgaa cggggccatt ctctcccccg gttttatcga tgtgcagtta 180
aacggctgcg gcggcgtaca gtttaacgac accgctgaag cggtcagcgt ggaaacgctg 240
gaaatcatgc agaaagccaa tgagaaatca ggctgtacta actatctgcc gacgcttatc 300
accaccagcg atgagctgat gaaacagggc gtgcgcgtta tgcgcgagta cctggcaaaa 360
catccgaatc aggcgttagg tctgcatctg gaaggtccgt ggctgaatct ggtaaaaaaa 420
ggcacccata atccgaattt tgtgcgtaag cctgatgccg cgctggtcga tttcctgtgt 480
gaaaacgccg acgtcattac caaagtgacc ctggcaccgg aaatggttcc tgcggaagtc 540
atcagcaaac tggcaaatgc cgggattgtg gtttctgccg gtcactccaa cgcgacgttg 600
aaagaagcaa aagccggttt ccgcgcgggg attacctttg ccacccatct gtacaacgcg 660
atgccgtata ttaccggtcg tgaacctggc ctggcgggcg cgatcctcga cgaagctgac 720
atttattgcg gtattattgc tgatggcctg catgttgatt acgccaacat tcgcaacgct 780
aaacgtctga aaggcgacaa actgtgtctg gttactgacg ccaccgcgcc agcaggtgcc 840
aacattgaac agttcatttt tgcgggtaaa acaatatact accgtaacgg actttgtgtg 900
gatgagaacg gtacgttaag cggttcatcc ttaaccatga ttgaaggcgt gcgtaatctg 960
gtcgaacatt gcggtatcgc actggatgaa gtgctacgta tggcgacgct ctatccggcg 1020
cgtgcgattg gcgttgagaa acgtctcggc acactcgccg caggtaaagt agccaacctg 1080
actgcattca cacctgattt taaaatcacc aagaccatcg ttaacggtaa cgaggtcgta 1140
actcaataa 1149
<210> 7
<211> 801
<212> DNA
<213> 编码基因nagB(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(801)
<400> 7
atgagactga tccccctgac taccgctgaa caggtcggca aatgggctgc tcgccatatc 60
gtcaatcgta tcaatgcgtt caaaccgact gccgatcgtc cgtttgtact gggcctgccg 120
actggcggca cgccgatgac cacctataaa gcgttagtcg aaatgcataa agcaggccag 180
gtcagcttta agcacgttgt caccttcaac atggacgaat atgtcggtct gccgaaagag 240
catccggaaa gctactacag ctttatgcac cgtaatttct tcgatcacgt tgatattcca 300
gcagaaaaca tcaaccttct caacggcaac gccccggata tcgacgccga gtgccgccag 360
tatgaagaaa aaatccgttc ttacggaaaa attcatctgt ttatgggcgg tgtaggtaac 420
gacggtcata ttgcatttaa cgaaccggcg tcttctctgg cttctcgtac tcgtatcaaa 480
accctgactc atgacactcg cgtcgcaaac tctcgtttct ttgataacga tgttaatcag 540
gtgccaaaat atgccctgac tgtcggtgtt ggtacactgc tggatgccga agaagtgatg 600
attctggtgc tgggtagcca gaaagcactg gcgctgcagg ccgccgttga aggttgcgtg 660
aaccatatgt ggaccatcag ctgtctgcaa ctgcatccga aagcgatcat ggtgtgcgat 720
gaaccttcca ccatggagct gaaagttaag actttaagat atttcaatga attagaagca 780
gaaaatatca aaggtctgta a 801
<210> 8
<211> 1221
<212> DNA
<213> 编码基因nagC(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1221)
<400> 8
atgacaccag gcggacaagc tcagataggt aatgttgatc tcgtaaaaca gcttaacagc 60
gcggcggttt atcgcctgat tgaccagtac gggccaatct cgcggattca gattgccgag 120
caaagccagc ttgcccccgc cagcgtaacc aaaattacgc gtcagcttat cgaacgcggg 180
ctgatcaaag aagttgatca gcaggcctcc accgggggcc gccgcgctat ctccatcgtc 240
accgaaaccc gcaatttcca cgcaatcggc gtacggcttg gtcgtcatga cgccaccatc 300
actctgtttg atctcagcag caaagtgctg gcagaagaac attacccgct gccggaacgt 360
acccagcaaa cgctggaaca tgccctgttg aatgccattg ctcagtttat tgatagctac 420
cagcgcaaac tgcgcgagct gatcgcgatt tcggtgatcc tgccagggct tgttgacccg 480
gacagcggca aaattcatta catgccgcat attcaggtag aaaactgggg gctggtagaa 540
gctctggaag aacgttttaa agtgacctgt ttcgttggtc acgatatccg tagtctggcg 600
ctggcggagc actacttcgg tgcaagtcag gattgcgaag actccattct ggtgcgtgtc 660
catcgcggaa ccggggccgg gattatctct aacgggcgca tttttattgg ccgcaacggc 720
aacgtcggtg aaattggcca tattcaggtc gaaccgctgg gtgaacgctg ccactgcggc 780
aactttggct gcctggaaac tatcgctgcc aacgctgcca ttgaacaacg ggtgttgaat 840
ctgttaaagc agggctacca gagccgcgtg ccgctggacg actgcaccat caaaactatc 900
tgcaaagccg cgaacaaagg cgatagtctg gcgtcggaag taattgagta tgtcggtcgt 960
catctgggta aaaccatcgc cattgctatc aacttattta atccgcaaaa aattgttatt 1020
gccggtgaaa tcaccgaagc cgataaagtg ctgctccctg ctattgaaag ctgcattaat 1080
acccaggcgc tgaaggcgtt tcgcactaat ctgccggtgg tacgttctga gctggatcac 1140
cgctcggcaa tcggcgcttt tgcgctggta aaacgcgcca tgctcaacgg tattttgctc 1200
cagcatttgc tggaaaatta a 1221
<210> 9
<211> 1947
<212> DNA
<213> 编码基因nagE(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1947)
<400> 9
atgaatattt taggtttttt ccagcgactc ggtagggcgt tacagctccc tatcgcggtg 60
ctgccggtgg cggcactgtt gctgcgattc ggtcagccag atttacttaa cgttgcgttt 120
attgcccagg cgggcggtgc gatttttgat aacctcgcat taatcttcgc catcggtgtg 180
gcatccagct ggtcgaaaga cagcgctggt gcggcggcgc tggcgggtgc ggtaggttac 240
tttgtgttaa ccaaagcgat ggtgaccatc aacccagaaa ttaacatggg tgtactggcg 300
ggtatcatta ccggtctggt tggtggcgca gcctataacc gttggtccga tattaaactg 360
ccggacttcc tgagcttctt cggcggcaaa cgctttgtgc cgattgccac cggattcttc 420
tgcctggtgc tggcggccat ttttggttac gtctggccgc cggtacagca cgctatccat 480
gcaggcggcg agtggatcgt ttctgcgggc gcgctgggtt ccggtatctt tggtttcatc 540
aaccgtctgc tgatcccaac cggtctgcat caggtactga acaccatcgc ctggttccag 600
attggtgaat tcaccaacgc ggcgggtacg gttttccacg gtgacattaa ccgcttctat 660
gccggtgacg gcaccgcggg gatgttcatg tccggcttct tcccgatcat gatgttcggt 720
ctgccgggtg cggcgctggc gatgtacttc gcagcaccga aagagcgtcg tccgatggtt 780
ggcggtatgc tgctttctgt tgctgttact gcgttcctga ccggtgtgac tgagccgctg 840
gaattcctgt tcatgttcct tgctccgctg ctgtacctcc tgcacgcact gctgaccggt 900
atcagcctgt ttgtggcaac gctgctgggt atccacgcgg gcttctcttt ctctgcgggg 960
gctatcgact acgcgttgat gtataacctg ccggccgcca gccagaacgt ctggatgctg 1020
ctggtgatgg gcgttatctt cttcgctatc tacttcgtgg tgttcagttt ggttatccgc 1080
atgttcaacc tgaaaacgcc gggtcgtgaa gataaagaag acgagatcgt tactgaagaa 1140
gccaacagca acactgaaga aggtctgact caactggcaa ccaactatat tgctgcggtt 1200
ggcggcactg acaacctgaa agcgattgac gcctgtatca cccgtctgcg ccttacagtg 1260
gctgactctg cccgcgttaa cgatacgatg tgtaaacgtc tgggtgcttc tggggtagtg 1320
aaactgaaca aacagactat tcaggtgatt gttggcgcga aagcagaatc catcggcgat 1380
gcgatgaaga aagtcgttgc ccgtggtccg gtagccgctg cgtcagctga agcaactccg 1440
gcaactgccg cgcctgtagc aaaaccgcag gctgtaccaa acgcggtatc tatcgcggag 1500
ctggtatcgc cgattaccgg tgatgtcgtg gcactggatc aggttcctga cgaagcattc 1560
gccagcaaag cggtgggtga cggtgtggcg gtgaaaccga cagataaaat cgtcgtatca 1620
ccagccgcag ggacaatcgt gaaaatcttc aacaccaacc acgcgttctg cctggaaacc 1680
gaaaaaggcg cggagatcgt cgtccatatg ggtatcgaca ccgtagcgct ggaaggtaaa 1740
ggctttaaac gtctggtgga agagggtgcg caggtaagcg cagggcaacc gattctggaa 1800
atggatctgg attacctgaa cgctaacgcc cgctcgatga ttagcccggt ggtttgcagc 1860
aatatcgacg atttcagtgg cttgatcatt aaagctcagg gccatattgt ggcgggtcaa 1920
acaccgctgt atgaaatcaa aaagtaa 1947
<210> 10
<211> 972
<212> DNA
<213> 编码基因manX(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(972)
<400> 10
gtgaccattg ctattgttat aggcacacat ggttgggctg cagagcagtt gcttaaaacg 60
gcagaaatgc tgttaggcga gcaggaaaac gtcggctgga tcgatttcgt tccaggtgaa 120
aatgccgaaa cgctgattga aaagtacaac gctcagttgg caaaactcga caccactaaa 180
ggcgtgctgt ttctcgttga tacatgggga ggcagcccgt tcaatgctgc cagccgcatt 240
gtcgtcgaca aagagcatta tgaagtcatt gcaggcgtta acattccaat gctcgtggaa 300
acgttaatgg cccgtgatga tgacccaagc tttgatgaac tggtggcact ggcagtagaa 360
acaggccgtg aaggcgtgaa agcactgaaa gccaaaccgg ttgaaaaagc cgcgccagca 420
cccgctgccg cagcaccaaa agcggctcca actccggcaa aaccaatggg gccaaacgac 480
tacatggtta ttggccttgc gcgtatcgac gaccgtctga ttcacggtca ggtcgccacc 540
cgctggacca aagaaaccaa tgtctcccgt attattgttg ttagtgatga agtggctgcg 600
gataccgttc gtaagacact gctcacccag gttgcacctc cgggcgtaac agcacacgta 660
gttgatgttg ccaaaatgat tcgcgtctac aacaacccga aatatgctgg cgaacgcgta 720
atgctgttat ttaccaaccc aacagatgta gagcgtctcg ttgaaggcgg cgtgaaaatc 780
acctctgtta acgtcggtgg tatggcattc cgtcagggta aaacccaggt gaataacgcg 840
gtttcggttg atgaaaaaga tatcgaggcg ttcaagaaac tgaatgcgcg cggtattgag 900
ctggaagtcc gtaaggtttc caccgatccg aaactgaaaa tgatggatct gatcagcaaa 960
atcgataagt aa 972
<210> 11
<211> 801
<212> DNA
<213> 编码基因manY(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(801)
<400> 11
atggagatta ccactcttca aattgtgctg gtatttatcg tagcctgtat cgcaggtatg 60
ggatcaatcc tcgatgaatt tcagtttcac cgtccgctaa tcgcgtgtac cctggtgggt 120
atcgttcttg gggatatgaa aaccggtatt attatcggtg gtacgctgga aatgatcgcg 180
ctgggctgga tgaacatcgg tgctgcagtt gcgcctgacg ccgctctggc ttctatcatt 240
tctaccattc tggttatcgc aggtcatcag agcattggtg caggtatcgc actggcaatc 300
cctctggccg ctgcgggcca ggtactgacc atcatcgttc gtactattac cgttgctttc 360
cagcacgctg cggataaggc tgctgataac ggcaacctga cagcgatttc ctggatccac 420
gtttcttctc tgttcctgca agcaatgcgt gtggctattc cggccgtcat cgttgcgctg 480
tctgttggta ccagcgaagt acagaacatg ctgaatgcga ttccggaagt ggtgaccaat 540
ggtctgaata tcgccggtgg catgatcgtg gtggttggtt atgcgatggt tatcaacatg 600
atgcgtgctg gctacctgat gccgttcttc tacctcggct tcgtaaccgc agcattcacc 660
aactttaacc tggttgctct gggtgtgatt ggtactgtta tggcagtgct ctacatccaa 720
cttagcccga aatacaaccg cgtagccggt gcgcctgctc aggcagctgg taacaacgat 780
ctcgataacg aactggacta a 801
<210> 12
<211> 861
<212> DNA
<213> 编码基因manZ(大肠杆菌)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(861)
<400> 12
gtgagcgaaa tggttgatac aactcaaact accaccgaga aaaaactcac tcaaagtgat 60
attcgtggcg tcttcctgcg ttctaacctc ttccagggtt catggaactt cgaacgtatg 120
caggcactgg gtttctgctt ctctatggta ccggcaattc gtcgcctcta ccctgagaac 180
aacgaagctc gtaaacaagc tattcgccgt cacctggagt tctttaacac ccagccgttc 240
gtggctgcgc cgattctcgg cgtaaccctg gcgctggaag aacagcgtgc taatggcgca 300
gagatcgacg acggtgctat caacggtatc aaagtcggtt tgatggggcc actggctggt 360
gtaggcgacc cgatcttctg gggaaccgta cgtccggtat ttgcagcact gggtgccggt 420
atcgcgatga gcggcagcct gttaggtccg ctgctgttct tcatcctgtt taacctggtg 480
cgtctggcaa cccgttacta cggcgtagcg tatggttact ccaaaggtat cgatatcgtt 540
aaagatatgg gtggtggctt cctgcaaaaa ctgacggaag gggcgtctat cctcggcctg 600
tttgtcatgg gggcattggt taacaagtgg acacatgtca acatcccgct ggttgtctct 660
cgcattactg accagacggg caaagaacac gttactactg tccagactat tctggaccag 720
ttaatgccag gcctggtacc actgctgctg acctttgctt gtatgtggct actgcgcaaa 780
aaagttaacc cgctgtggat catcgttggc ttcttcgtca tcggtatcgc tggttacgct 840
tgcggcctgc tgggactgta a 861
<210> 13
<211> 963
<212> DNA
<213> 编码基因pfkA(T7噬菌体)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(963)
<400> 13
atgattaaga aaatcggtgt gttgacaagc ggcggtgatg cgccaggcat gaacgccgca 60
attcgcgggg ttgttcgttc tgcgctgaca gaaggtctgg aagtaatggg tatttatgac 120
ggctatctgg gtctgtatga agaccgtatg gtacagctag accgttacag cgtgtctgac 180
atgatcaacc gtggcggtac gttcctcggt tctgcgcgtt tcccggaatt ccgcgacgag 240
aacatccgcg ccgtggctat cgaaaacctg aaaaaacgtg gtatcgacgc gctggtggtt 300
atcggcggtg acggttccta catgggtgca atgcgtctga ccgaaatggg cttcccgtgc 360
atcggtctgc cgggcactat cgacaacgac atcaaaggca ctgactacac tatcggtttc 420
ttcactgcgc tgagcaccgt tgtagaagcg atcgaccgtc tgcgtgacac ctcttcttct 480
caccagcgta tttccgtggt ggaagtgatg ggccgttatt gtggagatct gacgttggct 540
gcggccattg ccggtggctg tgaattcgtt gtggttccgg aagttgaatt cagccgtgaa 600
gacctggtaa acgaaatcaa agcgggtatc gcgaaaggta aaaaacacgc gatcgtggcg 660
attaccgaac atatgtgtga tgttgacgaa ctggcgcatt tcatcgagaa agaaaccggt 720
cgtgaaaccc gcgcaactgt gctgggccac atccagcgcg gtggttctcc ggtgccttac 780
gaccgtattc tggcttcccg tatgggcgct tacgctatcg atctgctgct ggcaggttac 840
ggcggtcgtt gtgtaggtat ccagaacgaa cagctggttc accacgacat catcgacgct 900
atcgaaaaca tgaagcgtcc gttcaaaggt gactggctgg actgcgcgaa aaaactgtat 960
taa 963
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 编码基因T7启动子(T7噬菌体)
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(61)
<400> 14
taatacgact cactataggg tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac 60
c 61
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> 编码基因T7终止子(T7噬菌体)
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(48)
<400> 15
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttg 48

Claims (4)

1.一株生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于：所述生产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌以E.coli W3110为宿主细胞，在其基因组中整合诱导型启动子控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因， T7启动子控制的来自酿酒酵母菌的Sc-gna1基因，多拷贝T7启动子控制的来自大肠杆菌的glmS基因；敲除nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ七个基因，整合诱导型启动子控制的dCas9基因，利用CRISPR/dCas9基因干扰技术干扰pfkA基因表达强度，使pfkA基因被关闭或以低水平表达；其中，
所述Sc-gna1基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示；
所述glmS基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示；
所述T7RNA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.5所示序列；
所述nagA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.6所示；
所述nagB基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.7所示；
所述nagC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.8所示；
所述nagE基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.9所示；
所述manX基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.10所示；
所述manY基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.11所示；
所述manZ基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.12所示；
所述pfkA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.13所示；
所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.14所示；
所述诱导型启动子为阿拉伯糖启动子Para或鼠李糖启动子Prha，其中，
所述阿拉伯糖启动子Para的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示；
所述鼠李糖启动子Prha的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述基因工程菌生产N-乙酰氨基葡萄糖方面的应用。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌的应用，其特征在于：所述基因工程菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的具体方法如下：
5L发酵罐发酵：
(1)活化斜面培养：从-80℃冰箱保菌管中接种1-2环菌种，均匀涂布于活化斜面，34-39℃培养10-15h，转接第二代活化斜面，培养10-15h；
(2)种子培养：取适量无菌水于活化斜面，将菌悬液转接至种子培养基中，pH 6.8-7.2；温度34-39℃；溶氧25-40％之间，培养至细胞干重达到2-15g/L之间；
(3)发酵培养：按照10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2；温度维持在35-39℃；溶氧在25-40％之间；在发酵前期添加终浓度2-15g/L的诱导剂，诱导目的基因的表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-5g/L，发酵周期 为60-80h；
5L发酵罐60-80h后N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到140-170g/L；
活化斜面培养基组成为：酵母粉3-8g/L，蛋白胨8-12g/L，牛肉膏8-12g/L，NaCl 3-8g/L，蔗糖0.5-2g/L，琼脂条15-30g/L，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min；
种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母粉2-10g/L，(NH4) 2SO4 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/ L，MgSO4· 7H2O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO4· 7H2O 1-5mg/L，MnSO4· 7H2O 1-5mg/L，VH 0.05-2mg/L，VB1 0.1-2mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌 15min；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母粉1-6g/L，(NH4) 2SO4 1-5g/L，KH2PO4 3-8g/L，MgSO4· 7H2O 1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，FeSO4· 7H2O 30-90mg/L，MnSO4· 7H2O 1-5mg/L，Met 0.5-2g/L，VH 0.05-2mg/L，VB1 0.1-1mg/L，消泡剂1-2滴，其余为水，pH 6.8-7.2，115℃高压 蒸汽灭菌15min。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌的应用，其特征在于：所述诱导剂为阿拉伯糖或鼠李糖。
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