CN109810989B - Dna分子、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DNA分子、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制备方法。该DNA分子RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的RBS1能够提高脯氨酸羟化酶编码基因表达。

Description

DNA分子、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制 备方法

技术领域

本发明总地涉及氨基酸发酵领域，具体涉及DNA分子、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制备方法。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸，又称羟脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline，Hyp)是一种亚氨基酸，为L-脯氨酸经过羟基化得到的产物。羟脯氨酸大量存在于胶原中，也存在于弹性蛋白、牙齿珐琅、补体C1和伸展蛋白中。作为一种稀有亚氨基酸，羟脯氨酸在医药、化工、食品和美容等行业都具有广泛的应用。在医药领域，羟脯氨酸可以作为消炎药、碳青霉烯类等化学药物的合成前体，其衍生物N-乙酰-反式-4-羟脯氨酸是无毒副作用的炎症治疗药物奥沙西罗的有效成分，可以有效治疗结缔组织疾病，如骨关节炎等。在化工合成方面，羟脯氨酸是合成多种聚合物的必不可少的手性原料，还可以作为一种手性合成元件，用来合成聚酯碳酸、N-烷基吡咯、N-芳香基吡咯以及生物碱TAN1251A等具有高附加值的产品。在食品方面，由于羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料风味，可以作为增味剂和营养增强剂。在美容方面，羟脯氨酸具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因此许多化妆品中都添加有羟脯氨酸，以保养皮肤和延缓衰老。羟脯氨酸衍生物还具有保湿功能，日本协和发酵公司研究发现，羟脯氨酸的衍生物N-乙酰羟脯氨酸能有效地维持表皮细胞水分，在化妆品中添加N-乙酰羟脯氨酸可锁水保湿，使皮肤保持弹性。随着对其研究的不断深入，羟脯氨酸及其衍生物的应用范围也将进一步扩大。因此，羟脯氨酸具有非常广泛的应用前景。

目前，羟脯氨酸的生产方法主要有提取法和微生物转化法。然而，常用的生物提取法需经过强酸强碱处理，纯化工艺复杂，提取收率低，生产成本高，且废弃物污染严重。随着环境压力的增加和资源原料成本的上升，传统的生物提取法逐渐被市场淘汰。微生物转化法即利用酶的立体专一性反应，以发酵法或者催化法生产目标产物。反应多在常温常压的细胞内或者细胞外下进行，可高选择性地制备所需的产物。因发酵法较催化法具有底物选择性广、成本低等优点，所以利用微生物发酵法合成羟脯氨酸并将其产业化具有现实意义。

目前对于羟脯胺酸微生物转化法生产的研究报道较少，研究人员根据密码子的简并性与大肠杆菌对密码子的偏好性，优化脯氨酸4-羟化酶基因(DSp4h)在大肠杆菌的表达；敲除putA基因，以阻断脯氨酸向谷氨酸的降解途径；引入vgb基因，解决菌株发酵过程中的溶氧过低的问题，进一步提高羟脯胺酸的发酵产量。但目前以葡萄糖为底物发酵生产羟脯氨酸的产量仍然较低(25g/L，96h)，与实现工业化生产存在较大差距，因此，亟需选育高效合成羟脯氨酸的工程菌株，实现羟脯胺酸的微生物直接发酵法生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA分子，包含该DNA分子的表达载体和重组菌，重组菌的构建方法以及羟脯氨酸的制备方法。

本发明提供了一种DNA分子RBS1，其中，所述RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述RBS1能够调控脯氨酸4-羟化酶编码基因(DSp4h)的表达。

本发明还提供了一种表达载体，其中，所述表达载体含有脯氨酸4-羟化酶编码基因和位于其上游的前述RBS1。所述RBS1用于调控脯氨酸4-羟化酶编码基因的表达。

优选地，根据前述的表达载体，其中，所述脯氨酸4-羟化酶编码基因选自以下菌株的脯氨酸4-羟化酶编码基因和/或经过密码子优化的脯氨酸4-羟化酶编码基因中的一种或多种：链霉菌Streptomyces griseoviridus、真菌Clonostachys cylindrospora、指孢囊菌Dactylosporangium sp.、假单胞菌Pseudomonas stutzeri、紫色杆菌Janthinobacteriumsp.、博德特杆菌Bordetella bronchiseptica、根瘤菌Bradyrhizobium japonicum和无色菌Achromobacter xylosoxidans。其中，所述密码子优化包括：平衡GC含量、选择高频密码子和/或隐蔽酶切位点等。

优选地，根据前述的表达载体，其中，所述脯氨酸4-羟化酶编码基因如SEQ IDNO.2所示。

或优选地，根据前述的表达载体，其中，所述表达载体还含有5-磷酸谷氨酸激酶编码基因(proB)，优选如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述表达载体还含有位于所述5-磷酸谷氨酸激酶编码基因上游的RBS序列，所述RBS序列用于调控所述5-磷酸谷氨酸激酶编码基因的表达，所述RBS序列优选为AAAGGAGGA或如SEQ ID NO.4所示。具体地，在所述表达载体中的调控外源基因表达的启动子下游，RBS1和脯氨酸4-羟化酶编码基因在前，调控5-磷酸谷氨酸激酶编码基因的RBS序列和5-磷酸谷氨酸激酶编码基因在后。

本发明还提供一种生产羟脯氨酸的重组菌，其中，所述重组菌含有脯氨酸4-羟化酶编码基因和位于其上游的前述RBS1。具体地，所述重组菌具有一个或多个DSp4h的拷贝。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述脯氨酸4-羟化酶编码基因选自以下菌株的脯氨酸4-羟化酶编码基因和/或经过密码子优化的脯氨酸4-羟化酶编码基因中的一种或多种：链霉菌Streptomyces griseoviridus、真菌Clonostachys cylindrospora、指孢囊菌Dactylosporangium sp.、假单胞菌Pseudomonas stutzeri、紫色杆菌Janthinobacteriumsp.、博德特杆菌Bordetella bronchiseptica、根瘤菌Bradyrhizobium japonicum和无色菌Achromobacter xylosoxidans。所述脯氨酸4-羟化酶编码基因优选如SEQ ID NO.2所示。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌还含有5-磷酸谷氨酸激酶编码基因，优选如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述重组菌还含有位于所述5-磷酸谷氨酸激酶编码基因上游的RBS序列，所述RBS序列优选为AAAGGAGGA或如SEQ ID NO.4所示。具体地，所述重组菌中具有一个或多个proB的拷贝。

或优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌的琥珀酰辅酶A合成酶编码基因(sucCD)失活，或其调控元件为低转录或低表达活性的调控元件。

本发明还提供一种上述任一重组菌的构建方法，其中，所述构建方法包括：在出发菌中脯氨酸4-羟化酶编码基因上游加入前述RBS1；和/或采用前述的RBS1替换出发菌中位于脯氨酸4-羟化酶编码基因上游的RBS序列，所述出发菌为能够积累羟脯氨酸的菌株。

所述出发菌具体选自棒杆菌属、小杆菌属、短杆菌属中的一株细菌。优选地，所述棒杆菌属的细菌选自谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum、北京棒杆菌Corynebacterium pekinense、有效棒杆菌Corynebacterium efficiens、钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum、嗜热产氨棒杆菌Corynebacterium thermoaminogenes、产氨棒杆菌Corynebacterium aminogenes、百合棒杆菌Corynebacterium lilium、美棒杆菌Corynebacterium callunae和力士棒杆菌Corynebacterium herculis中的一株细菌，所述小杆菌属的细菌选自嗜氨小杆菌Microbacterium ammoniaphilum中的一株细菌，所述短杆菌属的细菌选自黄色短杆菌Brevibacteriaceae flvum、乳酸发酵短杆菌Brevibacteriaceae lactofermentum和产氨短杆菌Brevibacteriaceae ammoniagenes中的一株细菌。

优选地，根据前述的构建方法，其中，所述构建方法还包括：提高所述出发菌中脯氨酸4-羟化酶编码基因的表达，具体通过如下至少一种方式实现：(A)增加所述出发菌中脯氨酸4-羟化酶编码基因的拷贝数；(B)通过密码子优化所述出发菌中脯氨酸4-羟化酶编码基因，所述脯氨酸4-羟化酶编码基因优选如SEQ ID NO.2。

优选地，根据前述的构建方法，所述构建方法还包括：提高所述出发菌中5-磷酸谷氨酸激酶编码基因的表达，具体通过如下至少一种方式实现：(C)增加所述出发菌中5-磷酸谷氨酸激酶编码基因的拷贝数；(D)将所述5-磷酸谷氨酸激酶编码基因进行定点突变，所述定点突变为将第149位的甘氨酸突变为天冬氨酸；(E)在出发菌中脯氨酸4-羟化酶编码基因上游加入RBS序列，所述RBS序列优选为AAAGGAGGA或如SEQ ID NO.4(RBS2)所示；(F)采用RBS2替换出发菌中位于脯氨酸4-羟化酶编码基因上游的RBS序列。

优选地，根据前述的构建方法，其中，所述构建方法还包括：降低所述出发菌中琥珀酰辅酶A合成酶的表达，具体通过如下至少一种方式实现：(G)失活所述出发菌中琥珀酰辅酶A合成酶编码基因；(H)琥珀酰辅酶A合成酶编码基因的调控元件被替换为低转录或低表达活性的调控元件。

本发明还提供一种羟脯氨酸的制备方法，其中，所述制备方法包括：发酵上述任一重组菌。

本发明提供的RBS1能够提高脯氨酸羟化酶编码基因表达。

与现有的羟脯氨酸工程菌和羟脯氨酸发酵生产方法相比，本发明构建了遗传背景清楚的生产羟脯氨酸的重组菌。通过敲除位于TCA循环上的琥珀酰辅酶A合成酶编码基因，通过优化RBS调整5-磷酸谷氨酸激酶编码基因和DSp4h的表达比例，羟脯氨酸产量显著提高。发酵结束时的羟脯氨酸产量为10～60g/L，生产强度为0.1～2g/L/h。

本发明所提供的生产羟脯氨酸的重组菌发酵周期短，易于过程和成本控制，其开辟并且实践证明了新的提高羟脯氨酸的发酵产量的方法，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产羟脯氨酸，便于推广应用。

附图说明

图1为pWYE1442的质粒图谱；

图2为pWYE1444的质粒图谱；

图3为SDS-PAGE检测菌株Hyp-5和Hyp-7中proB*和DSp4h基因的诱导表达情况；

图4为Hyp-1的摇瓶发酵过程曲线；

图5是Hyp-2的摇瓶发酵过程曲线；

图6是Hyp-3的摇瓶发酵过程曲线；

图7是Hyp-5的摇瓶发酵过程曲线；以及

图8是Hyp-7的摇瓶发酵过程曲线；

附图标记：

RG，残糖(Residual Glucose)；OD₆₀₀，600nm光密度(Optical Density)；Hyp，羟脯氨酸(Hydroxyproline)；time，时间。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

本发明所述的“出发菌”(或又称“底盘菌”)是指用于本发明基因改造策略的初始菌株。该菌株可以是天然存在的菌株，也可以是通过诱变或遗传工程改造等方式选育的菌株。

本发明所述的“失活”指的是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果，包括但不限于，定点突变、插入失活和/或敲除。

本发明所述的基因敲除、基因插入、启动子替换和定点突变的方法能够为通过载体携带改造靶基因的同源臂发生同源重组实现。

本发明所述的导入某基因或增加某基因的拷贝数可通过构建包含该基因的重组质粒，再将重组质粒导入出发菌中实现，或也可直接将某基因插入出发菌染色体上的合适位点实现。

本发明所述的低转录或低表达活性的调控元件，在本发明中没有特别限制，只要能够起到降低所启动基因的表达即可。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1底盘菌CG415的构建

根据L-脯氨酸的代谢调节网络，L-脯氨酸合成路径上的第一个酶5-磷酸谷氨酸激酶(proB编码)受终产物L-脯氨酸的反馈抑制调节。

本实施例按照专利(CN101084312A)所述方法点突变ProB的第149位的甘氨酸为天冬氨酸，以野生型菌株ATCC13032为出发菌株，构建了可积累L-脯氨酸的底盘菌CG415(WT-proB^G446A)。

菌株的具体构建步骤如下：

染色体proB基因定点突变采用两步替换的方法，首先敲除proB基因，再在染色体上插入定点突变的proB基因。

1)敲除proB基因：先根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的proB基因及其上下游序列分别设计引物。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P1和P2为引物PCR扩增proB基因上游同源臂；以P3和P4为引物扩增proB基因下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P1和P4为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到918bp的含欲敲除基因proB的上下游同源臂的片段(SEQ ID NO：5)。其中，SEQ ID NO：5自5’末端第1-509位核苷酸为欲敲除基因proB的上游同源臂，SEQ ID NO：5自5’末端第510-918位核苷酸为欲敲除基因proB的下游同源臂。

纯化回收的PCR产物经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P5和P6为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1130bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行EcoR I和HindⅢ双酶切鉴定，得到918bp的为阳性。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-ΔproB构建成功，为将含欲敲除基因proB的上下游同源臂的片段(SEQ IDNO：5)插入载体pK18mobsacB的EcoR I和HindⅢ酶切位点间得到的载体。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

P1：CCGGAATTCCAAGTTGGGCATTGAGGACG(EcoR I)(SEQ ID NO：6)

P2：CAGCAGGCCCGCGCTTCCGGATTCATGTCCGTAT(SEQ ID NO：7)

P3：GGACATGAATCCGGAAGCGCGGGCCTGCTGGTGGCGG(SEQ ID NO：8)

P4：CCCAAGCTTGGCCGCACGCTCCACG(HindⅢ)(SEQ ID NO：9)

P5：ATGTGCTGCAAGGCGATTAA(SEQ ID NO：10)

P6：TATGCTTCCGGCTCGTATGT(SEQ ID NO：11)

P7：ATCACCGCACTAAGGGGCAGTTCCA(SEQ ID NO：12)

P8：GGACGACCAGAGTTATTAACCGCAA(SEQ ID NO：13)

将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-ΔproB电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以P7和P8为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，得到1200bp的为阳性，命名为CG405(WT-ΔproB)。

CG405(WT-ΔproB)经进一步序列测定分析，结果为ATCC13032染色体proB基因敲除成功，CG405构建成功。

2)插入定点突变的proB基因：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P1和P9为引物PCR扩增含G446A(第149位甘氨酸变为天冬氨酸)突变位点的proB基因上游片段，以P10和P4为引物扩增含G446A(第149位甘氨酸变为天冬氨酸)突变位点的proB基因下游片段。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P1和P4为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到2028bp的含有proB基因突变片段上下游同源臂的长片段(SEQ ID NO：14)。其中，SEQ ID NO：14自5’末端第1-509位核苷酸为proB基因上游片段，SEQ ID NO：14自5’末端第510-1609位核苷酸为点突变的proB基因，SEQ ID NO：14自5’末端第1610-2028位核苷酸为点突变的proB基因下游片段。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

P9：GTCACCAAAATTCACATCGGTGGTTGCCACGGT(SEQ ID NO：15)

P10：ACCGTGGCAACCACCGATGTGAATTTTGGTGAC(SEQ ID NO：16)

纯化回收的PCR产物经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P5和P6为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2240bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行EcoR I和HindⅢ双酶切鉴定，得到2028bp的为阳性。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-proB^G446A构建成功。

将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-proB^G446A电转化至谷氨酸棒杆菌CG405中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌。

以P7和P8为引物，对阳性菌进行PCR扩增鉴定，得到2310bp的为重组菌WT-proB^G446A，命名为谷氨酸棒杆菌CG415(WT-proB^G446A)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为成功对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体proB基因进行G446A点突变，谷氨酸棒杆菌CG415

(WT-proB^G446A)构建成功。proB基因的G446A点突变为将proB基因编码蛋白的第149位甘氨酸变为天冬氨酸。

实施例2羟脯氨酸重组菌Hyp-1的构建

DSp4h原始序列来源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp.)(GenBank ID：D78338.1)，根据谷氨酸棒杆菌密码子使用频率和其高表达基因的GC百分比含量进行优化，优化后的DSp4h基因序列见SEQ ID NO：2。

根据优化后的DSp4h基因序列设计引物，在起始密码子ATG前加入谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列(AAAGGAGGA)。以合成的DSp4h基因为模板，以WZ2286和WZ2287为引物PCR扩增得到连接的RBS和DSp4h基因，得到883bp的PCR产物为RBS和DSp4h片段(SEQ IDNO：35)。

再将纯化的上述PCR产物与经BamHI和EcoRI双酶切后的pXMJ19(购自于BiovectorScience Lab,Inc,货号SMD1168H)采用Gibson组装的方式一步连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氯霉素(10μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WZ207和WZ208为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1024bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，经进一步序列测定验证，重组质粒pWYE1424(pXMJ19-^RBSDSp4h)构建成功。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

WZ2286：acaggaaacagaattaattaagcttAAAGGAGGACAATCATGC(SEQ ID NO：17)

WZ2287：gctcggtacccggggatcctctagaTTAAACTGGCTGAGCCAG(SEQ ID NO：18)

WZ207：CAATTAATCATCGGCTCGTA(SEQ ID NO：19)

WZ208：ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(SEQ ID NO：20)

将序列测定正确的重组质粒pWYE1424(pXMJ19-^RBSDSp4h)电转化至谷氨酸棒杆菌CG415中，以WZ207和WZ208为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1024bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，羟脯氨酸重组菌Hyp-1(CG415/pXMJ19-^RBSDSp4h)构建成功。

实施例3羟脯氨酸重组菌Hyp-2的构建

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的sucCD基因(Genbank ID：1020511和1020512)及其上下游序列分别设计引物。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以WZ2206和WZ2207为引物PCR扩增sucCD基因上游同源臂；以WZ2208和WZ2209为引物扩增sucCD基因下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以WZ2206和WZ2209为引物，采用重叠延伸PCR技术扩增，得到1086bp的含欲敲除基因sucCD的上下游同源臂的片段(SEQ IDNO：21)。

纯化回收的PCR产物经EcoRI和XbaI双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WZ410和WZ411为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1298bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定，得到1086bp的为阳性。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-ΔsucCD构建成功，为将含欲敲除基因sucCD的上下游同源臂的片段(SEQ ID NO：21)插入载体pK18mobsacB的EcoRI和XbaI酶切位点间得到的载体。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

WZ2206：CCGGAATTCGAAATGGAATTGGCAGTGGA(EcoRI)(SEQ ID NO：22)

WZ2207：AGTAATAATCACGCACAGTGTGTCCTCATCAATACCAGTG(SEQ ID NO：23)

WZ2208：CACTGGTATTGATGAGGACACACTGTGCGTGATTATTACT(SEQ ID NO：24)

WZ2209：TGCTCTAGAGTTACAAAGCTGCAACTACC(XbaI)(SEQ ID NO：25)

WZ2206-1：GGTAGCGACTTCTTATGCTCAACTT(SEQ ID NO：26)

WZ2209-1：TTAGCCACAAATCCGCTGGTCAAAG(SEQ ID NO：27)

WZ410：ATGTGCTGCAAGGCGATTAA(SEQ ID NO：28)

WZ411：TATGCTTCCGGCTCGTATGT(SEQ ID NO：29)

将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-ΔsucCD电转化至谷氨酸棒杆菌CG415中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以上述引物WZ2206-1和WZ2209-1为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，得到1186bp的为阳性，命名为CG415ΔsucCD。CG415ΔsucCD经进一步序列测定分析，结果为染色体sucCD基因敲除成功，CG415ΔsucCD构建成功。

进一步将序列测定正确的重组质粒pWYE1424(pXMJ19-^RBSDSp4h)电转化至谷氨酸棒杆菌CG415ΔsucCD中，以WZ207和WZ208为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1024bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌CG415ΔsucCD中，羟脯氨酸重组菌Hyp-2(CG415ΔsucCD/pXMJ19-^RBSDSp4h)构建成功。

实施例4羟脯氨酸重组菌Hyp-3的构建

为进一步提高脯氨酸4-羟化酶DSp4h基因的表达，优化DSp4h基因的RBS序列得到序列RBS1，RBS1序列如SEQ ID NO.1，即GAACACACACCAAGAAGGAGGACCATA。

根据优化后的DSp4h基因序列设计引物，在起始密码子ATG前加入RBS1。以合成的DSp4h基因为模板，以WZ2277和WZ2287为引物PCR扩增连接的RBS1和DSp4h基因。再以纯化的上述PCR产物与酶切后的pXMJ19采用Gibson组装的方式一步连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氯霉素(10μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WZ207和WZ208进行菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子挑取三个，提取质粒进一步序列测定验证，重组质粒pWYE1448(pXMJ19-^RBS1DSp4h)构建成功。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

WZ2277：ACAGGAAACAGAATTAATTAGAACACACACCAAGAAGGAGGACCATAATGCTGACCCCAACCGAG(SEQ ID NO：30)

将序列测定正确的重组质粒pWYE1448(pXMJ19-^RBS1DSp4h)电转化至谷氨酸棒杆菌CG415ΔsucCD中，以WZ207和WZ208为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1042bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，羟脯氨酸工程菌Hyp-3(CG415ΔsucCD/pXMJ19-^RBS1DSp4h)构建成功。

实施例5羟脯氨酸重组菌Hyp-5和Hyp-7的构建

为进一步提高羟脯胺酸合成前体脯氨酸的供给，过表达解除反馈抑制的5-磷酸谷氨酸激酶编码基因proB^*。为获得最优的基因表达效率，根据proB^G446A(proB^*)和DSp4h是否携带优化的RBS，分别构建两个过表达质粒。

首先，构建5-磷酸谷氨酸激酶proB^*在DSp4h后用优化RBS的质粒：优化proB^*基因的RBS序列得到序列RBS2，RBS2序列如SEQ ID NO.4，即TACAAGAAATACACAGAAGGAGGTTTATTA。根据优化后的DSp4h基因和proB^*序列设计引物，在DSp4h起始密码子ATG前加入RBS1序列，在proB^*起始密码子ATG前加入RBS2序列，如图1所示构建质粒pWYE1442。以合成的DSp4h基因为模板，以WZ2277和WZ2278为引物PCR扩增得到连接的RBS1和DSp4h基因。以CG415的基因组为模板，以WZ2279和WZ2280为引物PCR扩增得到连接的RBS2和proB^*基因。再以纯化的上述PCR产物与酶切后的pXMJ19采用Gibson组装的方式一步连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135。在含氯霉素(10μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WZ207和WZ208进行菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子挑取三个，提取质粒进一步序列测定验证，重组质粒pWYE1442(pXMJ19-^RBS1DSp4h-^RBS2proB^*)构建成功。

再构建5-磷酸谷氨酸激酶proB^*在DSp4h后用传统RBS的质粒：根据优化后的DSp4h基因和proB^*序列设计引物，在DSp4h起始密码子ATG前加入RBS1序列，在proB^*起始密码子ATG前加入谷氨酸棒杆菌传统RBS序列(AAAGGAGGA)，如图2所示构建质粒pWYE1444。以合成的DSp4h基因为模板，以WZ2277和WZ2278为引物PCR扩增得到连接的RBS1和DSp4h基因。以CG415的基因组为模板，以WZ2530和WZ2280为引物PCR扩增得到连接的RBS和proB^*基因。再以纯化的上述PCR产物与酶切后的pXMJ19采用Gibson组装的方式一步连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氯霉素(10μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WZ207和WZ208进行菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子挑取三个，提取质粒进一步序列测定验证，重组质粒pWYE1444(pXMJ19-^RBS1DSp4h-^RBSproB^*)构建成功。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

WZ2278：CTTCTGTGTATTTCTTGTATTAAACTGGCTGAGCCAGAG(SEQ ID NO：31)

WZ2279：GCCAGTTTAATACAAGAAATACACAGAAGGAGGTTTATTAATGCGTGAGCGCATCTCC(SEQID NO：32)

WZ2280：GCTCGGTACCCGGGGATCCTTTACGCGCGGCTGGCGTA(SEQ ID NO：33)

WZ2530：GCCAGTTTAAAAAGGAGGACCGGAATGCGTG(SEQ ID NO：34)

将序列测定正确的重组质粒pWYE1442和pWYE1444分别电转化至谷氨酸棒杆菌CG415ΔsucCD中，以WZ207和WZ208为引物，采用菌落PCR鉴定转化子。

制备重组工程菌Hyp-5，Hyp-7和CG415ΔsucCD携带pXMJ19质粒的细胞裂解液，进行SDS-PAGE检测。结果如图3所示，与对照菌株(CG415ΔsucCD/pXMJ19)相比，含过表达质粒的重组菌Hyp-5和Hyp-7中，有明显的ProB和DSp4h蛋白的诱导表达条带，其中Hyp-5的ProB表达量较高，DSp4h的表达量较高；Hyp-7的ProB表达量较低，而DSp4h的表达量较高。结果表明通过优化RBS ProB和DSp4h的蛋白表达量显著提高。

实施例6无质粒羟脯氨酸重组菌Hyp-8的构建

为构建无质粒羟脯氨酸重组菌，采用在染色体上增加proB^G446A(proB^*)和DSp4h基因的拷贝数的方式，增强proB^G446A和DSp4h的表达。

首先构建在染色体上增加proB^G446A(proB^*)和DSp4h的拷贝数的同源重组质粒，在敲除sucCD的位置上整合一个拷贝的P_eftu-^RBS1DSp4h-proB^G446A-rrnB人工操纵子。DSp4h在启动子后的RBS为RBS1(GAACACACACCAAGAAGGAGGACCATA)(SEQ ID NO:1)。根据合成的DSp4h基因(SEQ ID NO:2)的序列及谷氨酸棒杆菌ATCC13032的sucCD上下游序列(SEQ ID NO:21)、P_eftu启动子序列(SEQ ID NO:36)、proB^G446A基因序列(SEQ ID NO:3)和终止子rrnB序列(SEQID NO:37)分别设计引物。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以WZ2544和WZ2545为引物扩增sucCD基因上游同源臂；以WZ2546和WZ2547为引物扩增P_eftu启动子；以WZ2548和WZ2549为引物，以pWYE1444为模板扩增DSp4h-proB^G446A；以pXMJ19质粒为模板，以WZ2550和WZ2551为引物扩增终止子rrnB，以WZ2552和WZ2553为引物扩增sucCD基因下游同源臂；再以纯化的上述PCR产物与pK18mobsacB采用Gibson组装的方式一步连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WZ410和WZ411为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到3912bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，经进一步序列测定验证，得到质粒命名为pK18mobsacB-ΔsucCD::(P_eftu-^RBS1DSp4h-proB^G446A-rrnB)。

将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-ΔsucCD::(P_eftu-^RBS1DSp4h-proB^G446A-rrnB)电转化至工程菌CG415ΔsucCD中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落分别以WZ2206-1和WZ2209-1为引物进行PCR扩增鉴定，得到工程菌CG415ΔsucCD::(P_eftu-^RBS1DSp4h-proB^G446A-rrnB)。经该工程菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功在敲除sucCD的位置上整合^RBS1DSp4h和proB^G446A基因一个拷贝的菌株，得到工程菌CG415ΔsucCD::(P_eftu-^RBS1DSp4h-proB^G446A-rrnB)，命名为Hyp-8。

上述所用的引物序列如下(5’→3’)：

WZ2544：AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGACCGCTCGAGGAAATGGAATTG(SEQ ID NO:38)

WZ2545：AGGGTAACGGCCATGTCCTCATCAATACCAGTGAG(SEQ ID NO:39)

WZ2546：ATTGATGAGGACATGGCCGTTACCCTGCGAA(SEQ ID NO:40)

WZ2547：TTGGTGTGTGTTCTGTATGTCCTCCTGGACTTCG(SEQ ID NO:41)

WZ2548：AGGAGGACATACAGAACACACACCAAGAAGG(SEQ ID NO:42)

WZ2549：CGCCAAAACAGCCCATTCTAGATTACGCGCG(SEQ ID NO:43)

WZ2550：GTAATCTAGAATGGGCTGTTTTGGCGGATGAG(SEQ ID NO:44)

WZ2551：ATCACGCACAGTGAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG(SEQ ID NO:45)

WZ2552：TTCTACAAACTCTCACTGTGCGTGATTATTAC(SEQ ID NO:46)

WZ2553：GGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTAGTCTAGATTACAAAGCTGC(SEQ ID NO:47)

实施例7羟脯氨酸重组菌制备羟脯氨酸

以上实施例中重组菌发酵涉及的培养基及步骤如下：

摇瓶发酵采用的发酵培养基：葡萄糖40g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，KH₂PO₄0.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.001g/L，CuSO₄ 0.0002g/L，NiCl₂·6H₂O 0.00002g/L，生物素0.0002g/L，pH7.0-7.2，2％CaCO₃，121℃高压灭菌20min。葡萄糖分开灭菌，115℃高压灭菌15min。MgSO₄·7H₂O，以及无机盐离子分开灭菌，121℃高压灭菌20min。维生素采用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，氯霉素10μg/ml。

摇瓶发酵具体步骤：

1)、种子液的获得

将上述重组菌Hyp-1、Hyp-2、Hyp-3、Hyp-5、Hyp-7和Hyp-8分别接种到种子培养基中，种子液培养条件为培养温度30℃，摇床转速为220r/min，培养时间12h，得到种子液，OD₆₀₀可为12。

2)、发酵

将种子液按照体积百分含量为3％接种到发酵培养基(500mL挡板三角瓶装液量为30mL)中，30℃，220r/min，培养60h。间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2之间，根据残糖情况，补加浓度为400g/L的葡萄糖母液，控制发酵液残糖在0-5g/L。

收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。

3)、检测羟氨酸含量

采用高效液相法，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法)：取50μL上述上清液于2mL离心管中，加入200μL NaHCO₃水溶液(0.5mol/L，pH 9.0)和100μL 1％的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液(体积比)，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至25℃，加入650μL KH₂PO₄水溶液(0.01mol/L，pH 7.2±0.05，用NaOH水溶液调整pH，放置15min过滤后可进样，进样量为5μL。

所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH 7.2±0.05，用40g/LKOH水溶液调整pH)，流动相B为55％乙腈水溶液(体积比)，流动相流速为1mL/min，洗脱过程如下表1所示：

表1 洗脱过程

以野生型菌株C.glutamicum ATCC13032为对照。

结果如表2所示。

表2为摇瓶发酵实验中羟脯氨酸重组菌Hyp-1、Hyp-2、Hyp-3、Hyp-5、Hyp-7和Hyp-8的最大OD₆₀₀，比生长速率和羟脯氨酸产量、转化率。

表2 重组菌摇瓶发酵的生长情况和羟脯氨酸产量、转化率

摇瓶发酵实验中，野生型菌株C.glutamicum ATCC13032发酵60小时无羟脯氨酸的积累。Hyp-1的羟脯氨酸产量60小时达到2.99g/L，其发酵过程如图4所示。在Hyp-1的基础上敲除sucCD的重组菌Hyp-2的羟脯氨酸产量为4.81g/L，其发酵过程如图5所示，与改造前菌株Hyp-1相比提高了1.61倍。在此基础上，单独优化了DSp4h基因的RBS使Hyp-3的产量进一步提高了1.76倍，其发酵过程如图6。最后，通过RBS优化5-磷酸谷氨酸激酶(proB^*)和DSp4h的表达量得到菌株Hyp-5和Hyp-7，其中Hyp-5具有更高的5-磷酸谷氨酸激酶表达量，Hyp-5发酵60小时羟脯氨酸产量为20.86g/L，发酵过程如图7。Hyp-7发酵60小时共积累21.72g/L的羟脯氨酸，其发酵过程如图8所示。Hyp-8发酵60小时共积累7.56g/L的羟脯氨酸。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> DNA分子基因、表达载体、重组菌及其构建方法，以及羟脯氨酸的制备方法

<130> 170721CI

<160> 47

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> RBS

<222> (1)..(27)

<223> RBS1

<400> 1

gaacacacac caagaaggag gaccata 27

<210> 2

<211> 819

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(819)

<223> 优化DSp4h基因

<400> 2

atgctgaccc caaccgagct gaagcagtac cgcgaggctg gctacctgct gatcgaggac 60

ggcctgggcc cacgcgaggt tgactgcctg cgccgcgctg ctgctgctct gtacgctcag 120

gactccccag accgcaccct ggagaaggac ggccgcaccg ttcgcgctgt tcacggctgc 180

caccgccgcg acccagtttg ccgcgacctg gttcgccacc cacgcctgct gggcccagct 240

atgcagatcc tgtccggcga cgtttacgtt caccagttca agatcaacgc taaggctcca 300

atgaccggcg acgtttggcc atggcaccag gactacatct tctgggctcg cgaggacggc 360

atggaccgcc cacacgttgt taacgttgct gttctgctgg acgaggctac ccacctgaac 420

ggcccactgc tgttcgttcc aggcacccac gagctgggcc tgatcgacgt tgagcgccgc 480

gctccagctg gcgacggcga cgctcagtgg ctgccacagc tgtccgctga cctggactac 540

gctatcgacg ctgacctgct ggctcgcctg accgctggcc gcggcatcga gtccgctacc 600

ggcccagctg gctccatcct gctgttcgac tcccgcatcg ttcacggctc cggcaccaac 660

atgtccccac acccacgcgg cgttgttctg gttacctaca accgcaccga caacgctctg 720

ccagctcagg ctgctccacg cccagagttc ctggctgctc gcgacgctac cccactggtt 780

ccactgccag ctggcttcgc tctggctcag ccagtttaa 819

<210> 3

<211> 1142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1142)

<223> 第149位甘氨酸变为天冬氨酸的5-磷酸谷氨酸激酶编码基因

<400> 3

cccaagctta aaggaggacc ggaatgcgtg agcgcatctc caacgctaag cgagtggtgg 60

tgaaaattgg ttcgtcctca ttgactaacg atgaggacgg acacaccgtc gatcccaacc 120

gcatcaacac tattgtcaat gccttgcaag cacgcatgga agctggctcg gacctcatcg 180

ttgtgtcctc tggcgcagtg gccgcgggaa tggccccgct tggattgagc acccggccca 240

cggaattggc agtcaagcag gctgcagcag cagtggggca agttcacctc atgcaccagt 300

ggggacgttc ttttgcccgg tatggtcgcc ccatcggcca ggtgcttctt accgcagctg 360

atgcaggaaa gcgtgatcgt gcgaggaatg cgcagcgtac catcgacaag ctgcgcattt 420

tgggcgcggt tcctatcgtc aatgaaaatg acaccgtggc aaccaccgat gtgaattttg 480

gtgacaacga ccgacttgct gcaattgtgg cgcacctggt gtcggctgat gctttggtgc 540

tgctcagtga cgtggatgga ctttttgata aaaaccctac tgatcccacc gcgaagttta 600

tttccgaggt tcgtgacggc aatgatttga aaggtgtcat tgccggcgac ggcggaaaag 660

tgggcaccgg tggcatggca tcaaaggtgt ctgctgcacg tttggcttcc cgaagtggcg 720

tgcctgtgct gttgacctct gcggcaaaca ttggcccagc actggaagac gcccaggtgg 780

gcactgtatt ccaccccaag gacaaccgcc tctccgcgtg gaagttctgg gctttgtatg 840

ccgcagatac tgcaggaaag atccgactcg atgacggcgc ggtggaagca gtgacctccg 900

gtggtaaatc tttgctggct gtgggcatta ctgaaatcat tggtgatttc cagcagggtg 960

agatcgtgga gatcttggga cctgccggcc aaatcatcgg gcgaggcgag gtgtcctacg 1020

attctgatac cttgcaatca atggttggta tgcaaacgca ggaccttcca gatggcatgc 1080

agcgcccggt agtgcatgca gattatctgt ccaactacgc cagccgcgcg taatctagaa 1140

tg 1142

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> RBS

<222> (1)..(30)

<223> RBS2

<400> 4

tacaagaaat acacagaagg aggtttatta 30

<210> 5

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_recomb

<222> (1)..(509)

<223> proB的上游同源臂的片段

<220>

<221> misc_recomb

<222> (510)..(918)

<223> proB的下游同源臂的片段

<400> 5

ccggaattcc aagttgggca ttgaggacgg gcttcgtaag gcaggagcac atgtgggtgc 60

aaacgtcacc atcggaggca tttccttcga gtgggagcca atgaccaccg ctggcgacga 120

tccagtcctt accggacgtg gcaccgatgt gcgccttgaa cagacctctc gtatctctgc 180

tgcagagcgt aaacgcgcat ctcaggtacg tcgtggcctc atcgatgagt tggattatgg 240

cgaggaccaa gaggcttccc gcgaacgctg ggaaggataa aaccgagcac ttttcaggtc 300

tacgtgtata cgatggtaac gctatgaatg atacgcagaa cacacctgaa agcgttcgat 360

tacgggataa tctcccaacg ccaacccaaa tggcgccggt gacagggctt cctgtcaccc 420

cctacagcca ggaagcaagc atcggtgcga gcttcccggc agtggatccg gacaccaaag 480

acagcgccgc atacggacat gaatccggaa gcgcgggcct gctggtggcg ggtggcgtcg 540

aaaagcattt ttaaaggagt ttaagacgat gaagtttgtt atgtatccgc atttgtggga 600

gtccacgacc gctgtcattg agggtggcgg acatgagcgg gttgaggata ttaaagatgc 660

agacttcatt ttctttaatg gttcagcgcc ggagttcccg gatttgccgg agaacatcaa 720

gttcgtgcag gcctccatgg cgggtattga tgcgctggtc aagcgtggtg tcgtcaatga 780

gaaggcacgt tgggcaaacg cggctggcct gtacgctgac accgttgctg agtccaccat 840

tggtttaatt ctggcgcaga tgcacatgca tgcgacgact cgtttggcta agtcgtggag 900

cgtgcggcca agcttggg 918

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> P1

<400> 6

ccggaattcc aagttgggca ttgaggacg 29

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<223> P2

<400> 7

cagcaggccc gcgcttccgg attcatgtcc gtat 34

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(37)

<223> P3

<400> 8

ggacatgaat ccggaagcgc gggcctgctg gtggcgg 37

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> P4

<400> 9

cccaagcttg gccgcacgct ccacg 25

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> P5

<400> 10

atgtgctgca aggcgattaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> P6

<400> 11

tatgcttccg gctcgtatgt 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> P7

<400> 12

atcaccgcac taaggggcag ttcca 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> P8

<400> 13

ggacgaccag agttattaac cgcaa 25

<210> 14

<211> 2028

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_recomb

<222> (1)..(509)

<223> 含有proB基因突变片段上游同源臂的长片段

<220>

<221> gene

<222> (510)..(1609)

<223> 第149位甘氨酸变为天冬氨酸的proB基因

<220>

<221> misc_recomb

<222> (1610)..(2028)

<223> 含有proB基因突变片段下游同源臂的长片段

<400> 14

ccggaattcc aagttgggca ttgaggacgg gcttcgtaag gcaggagcac atgtgggtgc 60

aaacgtcacc atcggaggca tttccttcga gtgggagcca atgaccaccg ctggcgacga 120

tccagtcctt accggacgtg gcaccgatgt gcgccttgaa cagacctctc gtatctctgc 180

tgcagagcgt aaacgcgcat ctcaggtacg tcgtggcctc atcgatgagt tggattatgg 240

cgaggaccaa gaggcttccc gcgaacgctg ggaaggataa aaccgagcac ttttcaggtc 300

tacgtgtata cgatggtaac gctatgaatg atacgcagaa cacacctgaa agcgttcgat 360

tacgggataa tctcccaacg ccaacccaaa tggcgccggt gacagggctt cctgtcaccc 420

cctacagcca ggaagcaagc atcggtgcga gcttcccggc agtggatccg gacaccaaag 480

acagcgccgc atacggacat gaatccggaa tgcgtgagcg catctccaac gctaagcgag 540

tggtggtgaa aattggttcg tcctcattga ctaacgatga ggacggacac accgtcgatc 600

ccaaccgcat caacactatt gtcaatgcct tgcaagcacg catggaagct ggctcggacc 660

tcatcgttgt gtcctctggc gcagtggccg cgggaatggc cccgcttgga ttgagcaccc 720

ggcccacgga attggcagtc aagcaggctg cagcagcagt ggggcaagtt cacctcatgc 780

accagtgggg acgttctttt gcccggtatg gtcgccccat cggccaggtg cttcttaccg 840

cagctgatgc aggaaagcgt gatcgtgcga ggaatgcgca gcgtaccatc gacaagctgc 900

gcattttggg cgcggttcct atcgtcaatg aaaatgacac cgtggcaacc accagtgtga 960

attttggtga caacgaccga cttgctgcaa ttgtggcgca cctggtgtcg gctgatgctt 1020

tggtgctgct cagtgacgtg gatggacttt ttgataaaaa ccctactgat cccaccgcga 1080

agtttatttc cgaggttcgt gacggcaatg atttgaaagg tgtcattgcc ggcgacggcg 1140

gaaaagtggg caccggtggc atggcatcaa aggtgtctgc tgcacgtttg gcttcccgaa 1200

gtggcgtgcc tgtgctgttg acctctgcgg caaacattgg cccagcactg gaagacgccc 1260

aggtgggcac tgtattccac cccaaggaca accgcctctc cgcgtggaag ttctgggctt 1320

tgtatgccgc agatactgca ggaaagatcc gactcgatga cggcgcggtg gaagcagtga 1380

cctccggtgg taaatctttg ctggctgtgg gcattactga aatcattggt gatttccagc 1440

agggtgagat cgtggagatc ttgggacctg ccggccaaat catcgggcga ggcgaggtgt 1500

cctacgattc tgataccttg caatcaatgg ttggtatgca aacgcaggac cttccagatg 1560

gcatgcagcg cccggtagtg catgcagatt atctgtccaa ctacgccagc cgcgcgtaaa 1620

gcgcgggcct gctggtggcg ggtggcgtcg aaaagcattt ttaaaggagt ttaagacgat 1680

gaagtttgtt atgtatccgc atttgtggga gtccacgacc gctgtcattg agggtggcgg 1740

acatgagcgg gttgaggata ttaaagatgc agacttcatt ttctttaatg gttcagcgcc 1800

ggagttcccg gatttgccgg agaacatcaa gttcgtgcag gcctccatgg cgggtattga 1860

tgcgctggtc aagcgtggtg tcgtcaatga gaaggcacgt tgggcaaacg cggctggcct 1920

gtacgctgac accgttgctg agtccaccat tggtttaatt ctggcgcaga tgcacatgca 1980

tgcgacgact cgtttggcta agtcgtggag cgtgcggcca agcttggg 2028

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(33)

<223> P9

<400> 15

gtcaccaaaa ttcacatcgg tggttgccac ggt 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(33)

<223> P10

<400> 16

accgtggcaa ccaccgatgt gaattttggt gac 33

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(43)

<223> WZ2286

<400> 17

acaggaaaca gaattaatta agcttaaagg aggacaatca tgc 43

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(42)

<223> WZ2287

<400> 18

ctcggtaccc ggggatcctc tagattaaac tggctgagcc ag 42

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> WZ207

<400> 19

caattaatca tcggctcgta 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> WZ208

<400> 20

accgcttctg cgttctgatt 20

<210> 21

<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_recomb

<222> (1)..(472)

<223> 含欲敲除基因sucCD的上下游同源臂的片段

<220>

<221> misc_recomb

<222> (473)..(1086)

<223> 含欲敲除基因sucCD的上下游同源臂的片段

<400> 21

ccgctcgagg aaatggaatt ggcagtggat ctttttgaat accaagcacg ggacctcttt 60

gaaacccatg gtgtgccagt gttgaaggga attgtggcat caacaccaga ggcggcgagg 120

aaagcggctg aggaaatcgg cggactgacc gtcgtcaagg ctcaggtcaa ggtgggcgga 180

cgtggcaagg cgggtggcgt ccgtgtggca ccgacgtcgg ctcaggcttt tgatgctgcg 240

gatgcgattc tcggcatgga tatcaaagga cacactgtta atcaggtgat ggtggcgcag 300

ggcgctgaca ttgctgagga atactatttc tccattttgt tggatcgcgc gaatcgttcg 360

tatctggcta tgtgctctgt tgaaggtggc atggagatcg agatcctggc gaaggaaaag 420

cctgaagctt tggcaaaggt ggaagtggat cccctcactg gtattgatga ggacacactg 480

tgcgtgatta ttactgaggg catcccagtg cgtgacgctt ctgaggcgtg ggcttatgcc 540

aagaaggtgg gacacacccg catcattggc cctaactgcc caggcattat tactcccggc 600

gaatctcttg cgggaattac gccggcaaac attgcaggtt ccggcccgat cgggttgatc 660

tcaaagtcgg gaacactgac ttatcagatg atgtacgaac tttcagatat tggcatttct 720

acggcgattg gtattggcgg tgacccaatc atcggtacaa cccatatcga cgctctggag 780

gcctttgaag ctgatcctga gaccaaggca atcgtcatga tcggtgagat cggtggagat 840

gcagaggaac gcgctgctga cttcatttct aagcacgtga caaaaccagt tgtgggttac 900

gtggcaggct ttaccgcccc tgaaggaaag accatggggc atgctggcgc catcgtgaca 960

ggttcagaag gcactgcgcg agcaaagaag catgcattgg aggccgtggg tgttcgcgtg 1020

ggaacaactc cgagtgaaac cgcgaagctt atgcgtgagg tagttgcagc tttgtaatct 1080

agacta 1086

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> WZ2206

<400> 22

ccggaattcg aaatggaatt ggcagtgga 29

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> WZ2207

<400> 23

agtaataatc acgcacagtg tgtcctcatc aataccagtg 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(40)

<223> WZ2208

<400> 24

cactggtatt gatgaggaca cactgtgcgt gattattact 40

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(29)

<223> WZ2209

<400> 25

tgctctagag ttacaaagct gcaactacc 29

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> WZ2206-1

<400> 26

ggtagcgact tcttatgctc aactt 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<223> WZ2209-1

<400> 27

ttagccacaa atccgctggt caaag 25

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> WZ410

<400> 28

atgtgctgca aggcgattaa 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> WZ411

<400> 29

tatgcttccg gctcgtatgt 20

<210> 30

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(65)

<223> WZ2277

<400> 30

acaggaaaca gaattaatta gaacacacac caagaaggag gaccataatg ctgaccccaa 60

ccgag 65

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(39)

<223> WZ2278

<400> 31

cttctgtgta tttcttgtat taaactggct gagccagag 39

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(58)

<223> WZ2279

<400> 32

gccagtttaa tacaagaaat acacagaagg aggtttatta atgcgtgagc gcatctcc 58

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(38)

<223> WZ2280

<400> 33

gctcggtacc cggggatcct ttacgcgcgg ctggcgta 38

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<223> WZ2530

<400> 34

gccagtttaa aaaggaggac cggaatgcgt g 31

<210> 35

<211> 883

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> RBS

<222> (1)..(39)

<223> RBS

<220>

<221> gene

<222> (40)..(883)

<223> 优化DSp4h片段

<400> 35

acaggaaaca gaattaatta agcttaaagg aggacaatca tgctgacccc aaccgagctg 60

aagcagtacc gcgaggctgg ctacctgctg atcgaggacg gcctgggccc acgcgaggtt 120

gactgcctgc gccgcgctgc tgctgctctg tacgctcagg actccccaga ccgcaccctg 180

gagaaggacg gccgcaccgt tcgcgctgtt cacggctgcc accgccgcga cccagtttgc 240

cgcgacctgg ttcgccaccc acgcctgctg ggcccagcta tgcagatcct gtccggcgac 300

gtttacgttc accagttcaa gatcaacgct aaggctccaa tgaccggcga cgtttggcca 360

tggcaccagg actacatctt ctgggctcgc gaggacggca tggaccgccc acacgttgtt 420

aacgttgctg ttctgctgga cgaggctacc cacctgaacg gcccactgct gttcgttcca 480

ggcacccacg agctgggcct gatcgacgtt gagcgccgcg ctccagctgg cgacggcgac 540

gctcagtggc tgccacagct gtccgctgac ctggactacg ctatcgacgc tgacctgctg 600

gctcgcctga ccgctggccg cggcatcgag tccgctaccg gcccagctgg ctccatcctg 660

ctgttcgact cccgcatcgt tcacggctcc ggcaccaaca tgtccccaca cccacgcggc 720

gttgttctgg ttacctacaa ccgcaccgac aacgctctgc cagctcaggc tgctccacgc 780

ccagagttcc tggctgctcg cgacgctacc ccactggttc cactgccagc tggcttcgct 840

ctggctcagc cagtttaatc tagaggatcc ccgggtaccg agc 883

<210> 36

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(200)

<223> Peftu启动子

<400> 36

tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60

ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120

aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180

gaagtccagg aggacataca 200

<210> 37

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> terminator

<222> (1)..(426)

<223> rrnB终止子

<400> 37

ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga 60

agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc 120

atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg 180

agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 240

tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc 300

ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac 360

tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca 420

aactct 426

<210> 38

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(51)

<223> WZ2544

<400> 38

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ccgctcgagg aaatggaatt g 51

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(35)

<223> WZ2545

<400> 39

agggtaacgg ccatgtcctc atcaatacca gtgag 35

<210> 40

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<223> WZ2546

<400> 40

attgatgagg acatggccgt taccctgcga a 31

<210> 41

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<223> WZ2547

<400> 41

ttggtgtgtg ttctgtatgt cctcctggac ttcg 34

<210> 42

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<223> WZ2548

<400> 42

aggaggacat acagaacaca caccaagaag g 31

<210> 43

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<223> WZ2549

<400> 43

cgccaaaaca gcccattcta gattacgcgc g 31

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(32)

<223> WZ2550

<400> 44

gtaatctaga atgggctgtt ttggcggatg ag 32

<210> 45

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(37)

<223> WZ2551

<400> 45

atcacgcaca gtgagagttt gtagaaacgc aaaaagg 37

<210> 46

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(32)

<223> WZ2552

<400> 46

ttctacaaac tctcactgtg cgtgattatt ac 32

<210> 47

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(51)

<223> WZ2553

<400> 47

ggaaacagct atgaccatga ttacgaattc tagtctagat tacaaagctg c 51

Claims (5)

1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有脯氨酸4-羟化酶编码基因和位于其上游的RBS1，5-磷酸谷氨酸激酶编码基因和位于其上游的RBS序列；

所述RBS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，脯氨酸4-羟化酶编码基因序列如SEQ IDNO.2所示，

所述RBS序列为AAAGGAGGA或如SEQ ID NO.4所示，5-磷酸谷氨酸激酶编码基因如SEQID NO.3所示。

2.一种生产羟脯氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求1所述的表达载体，以及

所述重组菌的琥珀酰辅酶A合成酶编码基因失活，或其调控元件为低转录或低表达活性的调控元件。

3.一种权利要求2重组菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

在出发菌中转入权利要求1所述的表达载体，

所述出发菌为能够积累羟脯氨酸的菌株。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

降低所述出发菌中琥珀酰辅酶A合成酶的表达，通过如下至少一种方式实现：失活所述出发菌中琥珀酰辅酶A合成酶编码基因，

或所述出发菌中琥珀酰辅酶A合成酶编码基因的调控元件被替换为低转录或低表达活性的调控元件。

5.一种羟脯氨酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：发酵权利要求2的重组菌。

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