CN105385703A

CN105385703A - 高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建

Info

Publication number: CN105385703A
Application number: CN201510702317.4A
Authority: CN
Inventors: 张震宇; 林凡; 孙付保; 于林
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2016-03-09

Abstract

高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建。本发明公开了一种利用基因敲除获得反式-4-羟基-L-脯氨酸的生物合成方法。在大肠杆菌BL21(DE3)△putA的基础上敲除基因sucA，打断TCA循环中由α-酮戊二酸生成琥珀酸(由α-酮戊二酸脱氢酶复合体催化的)的过程，同时插入反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因(hyp)，之后转入质粒pUC19-Ptrp2-hyp-vgb。由羟化酶取代α-酮戊二酸脱氢酶的作用，“回补”TCA循环过程，保证TCA循环进行的同时产生羟脯氨酸。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在生产反式-4-羟脯氨酸中的应用，摇瓶发酵结果表明，培养基优化后的羟脯氨酸产量为1344.1mg/L，是优化前的5.53倍左右。与同样转入质粒pUC19-Ptrp2-hyp-vgb的原菌相比，在产羟脯氨酸方面具有优势。

Description

高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建

技术领域

本发明涉及高产反式-4-羟脯氨酸菌株的构建，简单的说就是利用基因敲除和途径取代的方法与理论来构建菌株，属于基因工程领域。

背景技术

反式-4-羟脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-ProLine)，又名L-羟脯氨酸，是胶原蛋白的主要组成成分。羟脯氨酸在很多领域具有重要的应用价值，如医药、食品、生化以及美容行业等领域。如在医药方面，反式-4-羟脯氨酸是很多化学品合成的手性合成子，如消炎药、碳青霉烯类、血管紧张肽转化酶抑制剂、抗高血压药物等，此外，由于其具有多种生理功能和较为独特的生物活性，可作为治疗如风湿性关节炎、结缔组织受损等软组织疾病的药物。在食品中的作用，如利用其呈苦味中的独特甜味的性质，可用于改善果汁的风味。在美容业，作为化妆品添加剂，可起到抗氧化、抗辐射、保湿的作用，用于保养皮肤和延缓衰老。

最初，羟脯氨酸是通过动物胶原蛋白的水解获得的，但该过程存在复杂、耗时、废弃物过多的缺点。之后也有关于用微生物产羟脯氨酸的报导，但那些方法存在低产率、高成本的问题，很难用于工业生产。故需要进一步改进生产菌株，优化生产工艺，降低生产成本，提高生产得率。

本实验室已有的研究结果包括以下几个部分。根据密码子的简并性与大肠杆菌对密码子的偏好性，优化反式-4-羟化酶基因(hyp)。通过改变同义密码子调整该基因的mRNA的5’端，使其呈开放结构，以提高mRNA的翻译效率，使其能在大肠杆菌中得到更好的表达。同时，选用组成型启动子——色氨酸串联启动子(Ptrp2)来控制羟化酶基因的表达。该启动子的特点就是不需要诱导剂的诱导，有利于羟脯氨酸后续的纯化。在实验室已有质粒的基础上，优化表达载体，最终选用全细胞酶活最高的质粒——pUC19-Ptrp2-hyp作为最适表达载体。之后，敲除基因putA，以打断L-脯氨酸向L-谷氨酸的降解途径，使得更多的L-脯氨酸进入反式-4-羟脯氨酸的生产途径。引入vgb基因，解决菌株生长过程中的溶氧过低的问题，进一步提高发酵产量。

发明内容

考虑到L-脯氨酸在生成反式-4-羟脯氨酸的过程中，有α-酮戊二酸、氧分子以及亚铁离子(Fe²⁺)作为底物，产物中有琥珀酸、CO₂。而α-酮戊二酸生成琥珀酸是TCA循环过程中一个步骤，因此，考虑用L-脯氨酸的羟基化过程来取代TCA循环中的该过程，既保证菌株的正常生长，又可以得到羟脯氨酸。

本发明技术内容如下：

(1)构建含有打靶片段——sucA上下游同源臂、羟化酶基因以及抗性筛选基因Kan的载体pET21a-sucA’-Kan-hyp(pET21AKH)。

(2)在大肠杆菌BL21(DE3)ΔputA的基础上，敲除sucA基因。

(3)转入质粒pUHVT4，之后进行发酵条件的优化与验证。

附图说明：

图1实验思路与基本理论图。

图2含有打靶片段的质粒pET21AKH的图谱。

图3表达质粒pUHVT4图谱。

具体实施方式

(1)实验中涉及的主要试剂配制

LB培养基：1g/L胰蛋白胨，1g/L氯化钠，1g/L酵母提取物(YeastExtract)。其中固体培养基：加入1.5％-2％的琼脂粉。

各种抗性平板：在(1)中的已灭菌的固体培养基的基础上，添加抗生素。配制浓度为50mg/mL的抗生素母液，过滤除菌后-20℃保存。待灭菌后的固体培养基冷却至60℃左右时，加入抗生素母液(稀释1000倍)。其中，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素的终浓度均为50μg/mL。

发酵培养基：葡萄糖8g/L，甘油10g/L，硫酸铵13g/L，玉米浆8g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，氯化钠2g/L，氯化钙0.015g/L，硫酸镁0.3g/L，亚铁离子4mM，初始L-脯氨酸100mM。

柠檬酸缓冲液：50g柠檬酸，26.3gNaOH，146.1g结晶乙酸钠，溶于1L的水中，之后加入200mL水和300mL的正丙醇，混匀。

氯胺T试剂：1.41g氯胺T，溶于10ml的水中，之后加入10mL的正丙醇和80mL的柠檬酸缓冲液，混匀。

显色剂：5g对二甲基苯甲醛，溶于17.5mL的高氯酸中，待溶解后缓缓加入32.5mL的异丙酮，混匀。

(2)相关的测量方法及比色法的原理

羟脯氨酸含量的测定：将浓度为1g/L的羟脯氨酸标样稀释10倍，得到浓度为100mg/L的反式-4-羟脯氨酸溶液，按照下表进行稀释：

反式-4-羟脯氨酸溶液(μL)	0	25	50	75	100	125
							去离子水(μL)	2500	2475	2450	2425	2400	2375
L-羟脯氨酸终浓度(mg/L)	0	1	2	3	4	5

按照上述表格在试管中添加完毕后，向每支试管中加入1mL的氯胺T，反应20min后，再加入1mL的显色剂，60℃水浴20min，冷却后用分光光度计测定560nm处的吸光值(A₅₆₀)。以吸光值(A₅₆₀)为横坐标，以L-羟脯氨酸终浓度为纵坐标，绘制反式-4-L-羟脯氨酸的标准曲线。要测发酵液中的L-羟脯氨酸的浓度，需取1mL的发酵液，12000rpm离心2min，估计发酵液中的L-羟脯氨酸的大致浓度，取适量的上清液，稀释合适的倍数，之后的步骤与得到标准曲线的操作一致。

比色法的原理：首先，羟脯氨酸与氯胺T反应，被氧化后生成含有吡咯环的物质，然后加入含有高氯酸溶液和对二甲基苯甲醛的显色剂，其中的高氯酸可以除去剩余的氯胺T，之后可以生成红色化合物，用紫外可见分光光度计在558±2nm处测定吸光值，通过与标准样品的比较可以对羟脯氨酸进行定量。

实施例1：构建含有打靶片段的载体

以大肠杆菌的基因组为模板，PCR得到sucA基因的上下游源臂；以质粒pKD4为模板，PCR得到Kan抗性基因；之后将三者以摩尔比1:1:1的比例进行添加，做融合PCR，得到含有sucA基因上下游同源臂以及Kan抗性基因的初步打靶片段(在设计引物时，上游同源臂的5’端引入NdeI，下游同源臂的5’端引入XhoI，在上游同源臂与Kan抗性基因之间引入酶切位点HindIII和BamHI)。将融合片段与载体pUCm-T进行连接，通过卡那抗性平板进行筛选，将验证正确的质粒进行NdeI和XhoI双酶切，与同样双酶切的质粒pET21a进行连接，得到含有pET21a-上游-Kan-下游的载体。由于在质粒pUC19(pUHVT4)的hyp基因两端具有HindIII和BamHI的酶切位点，通过酶切连接将其连接在质粒pET21a-上游-Kan-下游，得到pET21a-sucA’-Kan-hyp(pET21AKH)。

实施例2：sucA基因敲除

①制备大肠杆菌BL21(DE3)ΔputA的电转感受态：将质粒pKD46(温度敏感性质粒)转入制备好的大肠杆菌BL21(DE3)ΔputA的化转感受态中，之后按照电转感受态的制备方法，制备相应的电转感受态。

②基因敲除：将打靶片段电转进制备好的电转感受态中，利用Red重组系统，实现打靶片段与基因组的重组交换。将复苏后的菌株涂布卡那平板，进行初步筛选。

③菌落PCR验证：从平板上挑取单菌落，同时在另一块平板上进行保存，将挑取的菌落融入无菌水中，按照正常的PCR体系，以验证引物作为引物，跑胶验证PCR产物大小。

④消除卡那抗性：将验证正确的菌株制备化转感受态，转入辅助质粒pCP20(温度敏感性质粒)，用氨苄平板或氯霉素平板进行筛选。该质粒表达的重组酶可识别抗性基因两端的FLP序列，去除两个FLP位点之间的序列，只留下一个FLP位点，从而消除抗性基因。

⑤验证抗性基因的丢失：将上步平板上筛选出的单菌落，42℃培养以丢掉质粒pCP20后，分别点种于无抗性、氨苄、卡那平板，保存只在无抗性平板上生长的单菌落。但是，由于在操作过程中，kan基因的FRT位点序列有所改变，故不能将抗性基因去除，又由于此后不再做基因组相关的实验操作，故不影响后续实验。至此，获得了带有抗性基因kan的双敲除大肠杆菌BL21(DE3)ΔputAΔsucA。

实施例3：转入质粒pUHVT4，之后进行发酵条件的单因素优化。

制备大肠杆菌BL21(DE3)ΔputAΔsucA的化转感受态，将质粒pUHVT4转入感受态细胞中，转化体系：质粒3μl，KCM10μl，水37μl，感受态50μl。混匀后，冰浴30min，42℃热激90s，之后在冰上放置5min左右，加入600μl的液体LB培养基，37℃复苏1h左右，涂布氨苄平板。之后挑取单菌落培养，提取质粒，酶切验证。将验证正确的菌保存，用于后续的发酵优化。

实施例4：培养条件的单因素优化

对发酵条件，如pH，接种量，培养基的每个成分，进行单因素优化。根据发酵结果，发酵优化后较优的发酵培养基：葡萄糖17g/L，玉米浆5g/L，硫酸铵5.5g/L，甘油6g/L，磷酸氢二钾11g/L，氯化钙0.005g/L，硫酸镁1g/L，亚铁1mM。接种量6％，pH为8.5，初始脯氨酸添加量100mM，35℃220rpm12h。培养基优化前的羟脯氨酸产量为243mg/L，培养基优化后的羟脯氨酸产量为1344.1mg/L，是优化前的5.53倍左右。实验室之前做的实验，大肠杆菌BL21(DE3)(pUHVT4)在初始脯氨酸添加量为400mM时，35℃220rpm发酵24h时的产量为1270mg/L。相对比较而言，该菌在产羟脯氨酸上具有一定的优势。

Claims

1.一种生物合成生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。其特征在于，通过敲除基因sucA(编码α-酮戊二酸脱氢酶复合体的E1亚基，及α-酮戊二酸脱羧酶)打断TCA循环中由α-酮戊二酸到琥珀酸的过程，转化含有色氨酸串联启动子(Ptrp2)、反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因(hyp)、透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pUC19-Ptrp2-hyp—vgb(之后简称pUHVT4)。L-脯氨酸在羟化酶的催化作用下，以α-酮戊二酸为共同底物，生成反式-4-羟脯氨酸，同时生成琥珀酸。利用该反应过程的特点，由羟化酶取代α-酮戊二酸脱氢酶的作用，在脯氨酸羟基化的同时又不影响TCA循环的正常进行。

2.根据权利要求1所述的一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的生物合成方法，其特征在于：通过敲除基因sucA，打断TCA循环中由α-酮戊二酸到琥珀酸的过程，由脯氨酸羟基化的过程来“回补”该过程，此方法具有稳定性。

3.根据权利要求1所述的基因敲除不局限于sucA单敲除，包括其他功能相同的基因的单敲除或双敲除，如sucB、sucC、sucD、sucAB、sucCD。

4.根据权利要求1所述的基础菌不局限于putA缺失菌，包括其他的任何有利于L-脯氨酸羟脯氨酸积累的菌株。

5.根据权利要求1所述的阻断或减弱微生物代谢途径的方法包括:基因敲除、基因定点突变、RNA干扰、加大其他途径的关键酶的表达量等。

6.根据权利要求1所述的启动子不局限于色氨酸串联启动子，包括其他任何可以有效调控基因表达的启动子：如tac启动子、T7启动子、lac乳糖启动子、λ噬菌体转录启动子PL与PR等。

7.根据权利要求1所述的菌种不限于大肠杆菌BL21(DE3)，包括其他的任何能够将游离的L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌属。