CN106085996A - 复合稳定剂及添加该复合稳定剂的nmn转移酶的酶活测定方法 - Google Patents

复合稳定剂及添加该复合稳定剂的nmn转移酶的酶活测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种复合稳定剂及添加该复合稳定剂的NMN转移酶的酶活测定方法，具有这样的特征，该方法包括以下步骤：步骤一，制备粗酶液；步骤二，将制备得到的粗酶液分装于多个离心管中，向其中一部分离心管中加入保护剂，向另一部分离心管中加入双蒸水；步骤三，向两部分离心管中分别加入缓冲溶液、底物以及金属离子，混匀后置于水浴锅中反应，加入EDTA反应后，离心，去除沉淀，取上清液；步骤四，取上清液并测定反应产物的吸光值；步骤五，以未加保护剂的粗酶液为对照，得到相对酶活力。本发明复合稳定剂由常见的组分组成，成分简单、成本低廉，能有效提高NMN转移酶的稳定性，并且应用前景广阔；NMN转移酶的酶活测定方法简单实用，效果直观。

Description

复合稳定剂及添加该复合稳定剂的NMN转移酶的酶活测定 方法
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种复合稳定剂及添加该复合稳定剂的NMN转移酶的酶活测定方法。
背景技术
NMN转移酶(Nmnat)在生物体生命活动中起着十分重要的作用，是一类有助于多种蛋白复合装配、蛋白折叠以及蛋白损伤后再折叠的蛋白质，可以在蛋白折叠过程中与三磷酸腺苷(ATP)相耦联，利用烟酰胺单核苷酸(NMN)生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和NAAD，维持体内NAD的平衡；也是一种指示蛋白和应激反应蛋白，可作为生物药剂的靶标和调控目的基因的转录合成。大量研究表明，NMN转移酶在自然界中来源极为广泛，主要是植物、动物、微生物，如此丰富的资源，以及人类对NMN转移酶研究的不断深入，使得NMN转移酶在医药、生物、工业生产等领域得到了广泛应用。
NMN转移酶作为一种同源性蛋白，在生产、加工和贮存过程，由于外界因素，如温度、有机溶剂、pH、金属离子、酶修饰、降解等影响，均易导致酶稳定性降低，甚至失活。酶制剂容易失活，已成为限制其工业生产和应用的重要因素，因此提高NMN转移酶的热稳定性、减少失活率和延长贮存期是当前研究重点。
目前提高酶稳定性的方法主要有化学修饰、固定化和添加保护剂等。然而，化学修饰主要对酶蛋白肽链上某些残基进行共价修饰，会引起酶活性的改变；尽管酶的固定化处理后稳定性增加，易从反应中分离，能反复多次使用，便于运输和贮存，利于自动化生产，但是酶的活性降低，使用范围减小。因此，目前酶的稳定化方法最常用的是添加保护剂，但对NMN转移酶添加保护剂，尚未有人进行过。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种复合稳定剂作为保护剂来提高NMN转移酶的稳定性。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种复合稳定剂，用于提高NMN转移酶的稳定性，其特征在于，包含：浓度为0.5～1.5g/L的山梨醇，浓度为0.5～1.5g/L的海藻酸钠，体积分数为0.5～1.5％的二甲基亚砜。
进一步的，本发明还提供了一种NMN转移酶的酶活测定方法，采用上述的复合稳定剂作为保护剂，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，制备NMN转移酶的粗酶液；步骤二，将制备得到的NMN转移酶的粗酶液分装于多个1～2mL的离心管中，向其中一部分离心管中加入预定量的保护剂，向另一部分离心管中加入与保护剂相同的量的双蒸水；步骤三，向两部分离心管中分别加入等量的缓冲溶液、底物以及金属离子，分别混匀后置于30～40℃的水浴锅中反应1～2h，加入乙二胺四乙酸(EDTA)反应5～10min后，在转速为4000～8000r/min条件下离心1～5min，去除沉淀，取上清液；步骤四，取上清液并在340nm处测定反应产物的吸光值OD340，吸光值OD340代表NMN转移酶酶活力的大小；步骤五，以未加保护剂的粗酶液为对照100％，得到相对酶活力。
在本发明提供的NMN转移酶的酶活测定方法中，还可以具有这样的特征，其中，在步骤一中，NMN转移酶的粗酶液的制备方法包括以下子步骤：子步骤一，将大肠杆菌划线接种到固体培养基上，在35～40℃的条件下培养12～18h，得到含有大肠杆菌的固体培养基；子步骤二，取一定量的LB培养基溶于双蒸水中，调节其pH值为6.0～8.0，在121℃条件下灭菌15～30min，得到浓度为20～30g/L的活化液；子步骤三，在无菌环境下从固体培养基上挑取大肠杆菌接种到活化液中，并加入终浓度为20～40μg/ml的硫酸卡那霉素，在35～40℃条件下培养过夜，得到含有活化的大肠杆菌菌体的液体；子步骤四，将含有活化的大肠杆菌菌体的液体按照体积分数为1～5％的接种量接入经过灭菌的发酵培养基中，在温度为35～40℃，摇床转速为180～200r/min的条件下，发酵培养至OD600为0.5～0.7时，加入终浓度为5～10mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为20～30℃，摇床转速为150～200r/min条件下，诱导培养8～12h，收集得到含烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵液；子步骤五，将发酵液放置于离心管中，在8000～12000r/min条件下离心搅拌5～10min，收集含有烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的菌体沉淀。子步骤六，向菌体沉淀中加入pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，用移液枪吹吸数次使菌体均匀悬浮，再用超声波破碎菌体；子步骤七，破壁后的菌体在转速为8000～12000r/min，温度4℃条件下，冷冻离心15～30min，收集上清液，上清液为NMN转移酶的粗酶液。
在本发明提供的NMN转移酶的酶活测定方法中，还可以具有这样的特征，其中，在步骤二中，预定量为100μL。
在本发明提供的NMN转移酶的酶活测定方法中，还可以具有这样的特征，其中，在步骤三中，缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液，底物为烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)，金属离子为Mn2 +。
在本发明提供的NMN转移酶的酶活测定方法中，还可以具有这样的特征，其中，在步骤三中，乙二胺四乙酸的质量浓度为0.155mol/L，加入的体积为100μL。
在本发明提供的NMN转移酶的酶活测定方法中，还可以具有这样的特征，其中，在子步骤一中，固体培养基的制备方法为：将浓度为25g/L的LB培养基和浓度为20g/L的琼脂用双蒸水溶解于500ml的锥形瓶中，加入NaOH调节pH为7.0，在121℃条件下高压灭菌20min，得到固体培养基。
发明的作用与效果
本发明提供了一种复合稳定剂及添加该复合稳定剂的NMN转移酶的酶活测定方法，该复合稳定剂包含山梨醇、海藻酸钠以及二甲基亚砜这些常见组分，成分简单、成本低廉，能有效提高NMN转移酶的稳定性，并且应用前景广阔。另外，本发明的NMN转移酶的酶活测定方法采用对照实验比较稳定剂对NMN转移酶的稳定性作用，方法简单实用，效果直观。
具体实施方式
以下结合实施例进一步阐述本发明，对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均视为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
固体培养基：将浓度为25g/L的LB培养基和浓度为20g/L的琼脂用双蒸水溶解于500ml的锥形瓶中，加入NaOH调节pH为7.0，在121℃条件下高压灭菌20min，得到固体培养基。
发酵培养基成分：浓度为24g/L的酵母粉，浓度为12g/L的胰蛋白胨，浓度为4ml/L的甘油，浓度为2.31g/L KH2PO4以及浓度为12.54g/L的K2HPO4。
实施例一
1、复合稳定剂
本实施例的复合稳定剂包含：浓度为1.5g/L的山梨醇，浓度为1.0g/L的海藻酸钠，体积分数为0.5％的二甲基亚砜。
2、酶活测定方法
采用上述成分含量的复合稳定剂作为保护剂来提高NMN转移酶的稳定性，NMN转移酶的酶活测定方法包括以下步骤：
步骤一，制备NMN转移酶的粗酶液：将大肠杆菌划线接种到固体培养基上，在37℃的条件下培养12h，得到含有大肠杆菌的固体培养基；取一定量的LB培养基溶于双蒸水中，调节其pH值为7.0，在121℃条件下灭菌20min，得到浓度为25g/L的活化液；在无菌环境下从固体培养基上挑取大肠杆菌接种到活化液中，并加入终浓度为30μg/ml的硫酸卡那霉素，在37℃条件下培养过夜，得到含有活化的大肠杆菌菌体的液体；将含有活化的大肠杆菌菌体的液体按照体积分数为1％的接种量接入经过灭菌的发酵培养基中，在温度为37℃，摇床转速为200r/min的条件下，发酵培养至OD600为0.6时，加入终浓度为8mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为25℃，摇床转速为180r/min条件下，诱导培养8h，收集得到含烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵液；将发酵液放置于离心管中，在温度为4℃、转速为8000r/min条件下离心搅拌6min，收集含有烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的菌体沉淀，向菌体沉淀中加入pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，用移液枪吹吸数次使菌体均匀悬浮，再用超声波破碎菌体；破壁后的菌体在转速为12000r/min，温度4℃条件下，冷冻离心20min，收集上清液，上清液即为NMN转移酶的粗酶液。
步骤二，将制备得到的NMN转移酶的粗酶液分装于多个1mL的离心管中，向其中一部分离心管中加入100μL的保护剂，向另一部分离心管中加入100μL的双蒸水；
步骤三，向两部分离心管中分别加入1mol/L PH7.5的Tris-HCl缓冲液、烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)、Mn2+，分别混匀后置于37℃的水浴锅中反应2h，加入100μL质量浓度为0.155mol/L为乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反应5min后，在转速为8000r/min条件下离心1min，去除沉淀，取上清液；
步骤四，取上清液并在340nm处测定反应产物的吸光值OD340，吸光值OD340代表NMN转移酶酶活力的大小；
步骤五，以未加保护剂的NMN转移酶的粗酶液为对照100％，得到相对酶活力。
实施例一作用与效果
根据本实施例的NMN转移酶的酶活测定方法，其中添加了本实施例成分含量的复合稳定剂作为保护剂的相对酶活为114.23％，未添加保护剂的酶活为15.8％。
实施例二
1、复合稳定剂
该复合稳定剂包含：浓度为1.0g/L的山梨醇，浓度为0.5g/L的海藻酸钠，体积分数为1.5％的二甲基亚砜。
2、酶活测定方法
采用上述成分含量的复合稳定剂作为保护剂来提高NMN转移酶的稳定性，NMN转移酶的酶活测定方法包括以下步骤：
步骤一，制备NMN转移酶的粗酶液：将大肠杆菌划线接种到固体培养基上，在35℃的条件下培养16h，得到含有大肠杆菌的固体培养基；取一定量的LB培养基溶于双蒸水中，调节其pH值为6.0，在121℃条件下灭菌15min，得到浓度为20g/L的活化液；在无菌环境下从固体培养基上挑取大肠杆菌接种到活化液中，并加入终浓度为20μg/ml的硫酸卡那霉素，在35℃条件下培养过夜，得到含有活化的大肠杆菌菌体的液体；将含有活化的大肠杆菌菌体的液体按照体积分数为3％的接种量接入经过灭菌的发酵培养基中，在温度为35℃，摇床转速为180r/min的条件下，发酵培养至OD600为0.5时，加入终浓度为5mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为20℃，摇床转速为150r/min条件下，诱导培养10h，收集得到含烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵液；将发酵液放置于离心管中，在温度为4℃、转速为10000r/min条件下离心搅拌5min，收集含有烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的菌体沉淀，向菌体沉淀中加入pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，用移液枪吹吸数次使菌体均匀悬浮，再用超声波破碎菌体；破壁后的菌体在转速为10000r/min，温度4℃条件下，冷冻离心15min，收集上清液，上清液即为NMN转移酶的粗酶液。
步骤二，将制备得到的NMN转移酶的粗酶液分装于多个2mL的离心管中，向其中一部分离心管中加入100μL的保护剂，向另一部分离心管中加入100μL的双蒸水；
步骤三，向两部分离心管中分别加入1mol/L PH7.5的Tris-HCl缓冲液、烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)、Mn2+，分别混匀后置于30℃的水浴锅中反应1h，加入100μl质量浓度为0.155mol/L为乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反应8min后，在转速为6000r/min条件下离心3min，去除沉淀，取上清液；
步骤四，取上清液并在340nm处测定反应产物的吸光值OD340，吸光值OD340代表NMN转移酶酶活力的大小；
步骤五，以未加保护剂的NMN转移酶的粗酶液为对照100％，得到相对酶活力。
实施例二作用与效果
根据本实施例的NMN转移酶的酶活测定方法，其中添加了本实施例成分含量的复合稳定剂作为保护剂的相对酶活为102.90％，未添加保护剂的酶活为15.8％。
实施例三
1、复合稳定剂
该复合稳定剂包含：浓度为0.5g/L的山梨醇，浓度为1.5g/L的海藻酸钠，体积分数为1.0％的二甲基亚砜。
2、酶活测定方法
采用上述成分含量的复合稳定剂作为保护剂来提高NMN转移酶的稳定性，NMN转移酶的酶活测定方法包括以下步骤：
步骤一，制备NMN转移酶的粗酶液：将大肠杆菌划线接种到固体培养基上，在40℃的条件下培养18h，得到含有大肠杆菌的固体培养基；取一定量的LB培养基溶于双蒸水中，调节其pH值为8.0，在121℃条件下灭菌30min，得到浓度为30g/L的活化液；在无菌环境下从固体培养基上挑取大肠杆菌接种到活化液中，并加入终浓度为30μg/ml的硫酸卡那霉素，在40℃条件下培养过夜，得到含有活化的大肠杆菌菌体的液体；将含有活化的大肠杆菌菌体的液体按照体积分数为5％的接种量接入经过灭菌的发酵培养基中，在温度为40℃，摇床转速为190r/min的条件下，发酵培养至OD600为0.7时，加入终浓度为10mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为30℃，摇床转速为200r/min条件下，诱导培养12h，收集得到含烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵液；将发酵液放置于离心管中，在温度为4℃、转速为12000r/min条件下离心搅拌10min，收集含有烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的菌体沉淀，向菌体沉淀中加入pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，用移液枪吹吸数次使菌体均匀悬浮，再用超声波破碎菌体；破壁后的菌体在转速为8000r/min，温度4℃条件下，冷冻离心30min，收集上清液，上清液即为NMN转移酶的粗酶液。
步骤二，将制备得到的NMN转移酶的粗酶液分装于多个1.5mL的离心管中，向其中一部分离心管中加入100μL的保护剂，向另一部分离心管中加入100μL的双蒸水；
步骤三，向两部分离心管中分别加入1mol/L PH7.5的Tris-HCl缓冲液、烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)、Mn2+，分别混匀后置于40℃的水浴锅中反应1.5h，加入100μL质量浓度为0.155mol/L为乙二胺四乙酸溶液(EDTA)反应10min后，在转速为4000r/min条件下离心5min，去除沉淀，取上清液；
步骤四，取上清液并在340nm处测定反应产物的吸光值OD340，吸光值OD340代表NMN转移酶酶活力的大小；
步骤五，以未加保护剂的NMN转移酶的粗酶液为对照100％，得到相对酶活力。
实施例三作用与效果
根据本实施例的NMN转移酶的酶活测定方法，其中添加了本实施例成分含量的复合稳定剂作为保护剂的相对酶活为91.62％，未添加保护剂的酶活为15.8％。
以上实施例仅为本发明构思下的基本说明，不对本发明进行限制。而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种复合稳定剂，用于提高NMN转移酶的稳定性，其特征在于，包含：
浓度为0.5～1.5g/L的山梨醇，浓度为0.5～1.5g/L的海藻酸钠，体积分数为0.5～1.5％的二甲基亚砜。
2.一种NMN转移酶的酶活测定方法，采用权利要求1所述的复合稳定剂作为保护剂，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备NMN转移酶的粗酶液；
步骤二，将制备得到的所述粗酶液分装于多个1～2mL的离心管中，向其中一部分离心管中加入预定量的所述保护剂，向另一部分离心管中加入与所述保护剂相同的量的双蒸水；
步骤三，向两部分离心管中分别加入等量的缓冲溶液、底物以及金属离子，分别混匀后置于30～40℃的水浴锅中反应1～2h，加入乙二胺四乙酸(EDTA)反应5～10min后，在转速为4000～8000r/min条件下离心1～5min，去除沉淀，取上清液；
步骤四，取所述上清液并在340nm处测定反应产物的吸光值OD340，所述吸光值OD340代表NMN转移酶酶活力的大小；
步骤五，以未加所述保护剂的所述粗酶液为对照100％，得到相对酶活力。
3.根据权利要求2所述NMN转移酶的酶活测定方法，其特征在于：
其中，在步骤一中，所述NMN转移酶的粗酶液的制备方法包括以下子步骤：
子步骤一，将大肠杆菌划线接种到固体培养基上，在35～40℃的条件下培养12～18h，得到含有大肠杆菌的固体培养基；
子步骤二，取一定量的LB培养基溶于双蒸水中，调节其pH值为6.0～8.0，在121℃条件下灭菌15～30min，得到浓度为20～30g/L的活化液；
子步骤三，在无菌环境下从所述固体培养基上挑取大肠杆菌接种到所述活化液中，并加入终浓度为20～40μg/ml的硫酸卡那霉素，在35～40℃条件下培养过夜，得到含有活化的大肠杆菌菌体的液体；
子步骤四，将所述含有活化的大肠杆菌菌体的液体按照体积分数为1～5％的接种量接入经过灭菌的发酵培养基中，在温度为35～40℃，摇床转速为180～200r/min的条件下，发酵培养至OD600为0.5～0.7时，加入终浓度为5～10mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为20～30℃，摇床转速为150～200r/min条件下，诱导培养8～12h，收集得到含烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵液；
子步骤五，将所述发酵液放置于离心管中，在8000～12000r/min条件下离心搅拌5～10min，收集含有烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的菌体沉淀。
子步骤六，向所述菌体沉淀中加入pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，用移液枪吹吸数次使菌体均匀悬浮，再用超声波破碎所述菌体；
子步骤七，破壁后的所述菌体在转速为8000～12000r/min，温度4℃条件下，冷冻离心15～30min，收集上清液，所述上清液为所述NMN转移酶的粗酶液。
4.根据权利要求2所述NMN转移酶的酶活测定方法，其特征在于：
其中，在步骤二中，所述预定量为100μL。
5.根据权利要求2所述NMN转移酶的酶活测定方法，其特征在于：
其中，在步骤三中，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液，所述底物为烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)，所述金属离子为Mn2+。
6.根据权利要求2所述NMN转移酶的酶活测定方法，其特征在于：
其中，在步骤三中，所述乙二胺四乙酸的质量浓度为0.155mol/L，加入的体积为100μL。
7.根据权利要求3所述NMN转移酶的酶活测定方法，其特征在于：
其中，在子步骤一中，所述固体培养基的制备方法为：将浓度为25g/L的LB培养基和浓度为20g/L的琼脂用双蒸水溶解于500ml的锥形瓶中，加入NaOH调节pH为7.0，在121℃条件下高压灭菌20min，得到所述固体培养基。
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