KR20150130613A

KR20150130613A - Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법

Info

Publication number: KR20150130613A
Application number: KR1020140057184A
Authority: KR
Inventors: 조재용
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2015-11-24
Also published as: KR101622460B1

Abstract

본 발명은 세포막 단백질의 활성이 감소 또는 불활성화 된 것을 특징으로 하는, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 미생물, 세포막 단백질의 활성이 감소되거나 불활성화된 재조합 벡터, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 제조방법 및 이를 이용한 L-오르니틴 제조방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-오르니틴의 제조방법{Corynebacterium glutamicum having improved L-ornithine production and method for preparing L-ornithine using the same}

L-오르니틴은 생체내의 요소 회로 상에 존재하는 아미노산 중의 하나이며, 아르기닌 생합성 과정의 중간물질로서 간 기능을 촉진시키는 의약성분으로 알려진 바 있다. L-오르니틴은 시트룰린, 프롤린과 같이 암모니아에 대한 해독기능을 갖고 있어 간장 질환의 치료제로서 사용될 뿐 아니라, 비만을 예방하는 식품소재로서도 이용되고 있으며, 주름살개선과 같은 피부미용작용 등 새로운 기능성이 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 이와 같이 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.

구체적으로 오르니틴 생산에 이용되는 미생물로는 자외선 처리 등에 의하여 시트룰린 또는 아르기닌 영양 요구성 돌연변이주인 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)(교와하꼬공업(주), 일본, 미국 특허 제 2,988,489호), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 동속 카와사키(B. kawasaki), 동 속 플라붐(B. flavum)(아지노모토, 일본 특허공고 제68-8712, 68-8714 및 69-26,910호), 동속 케토글루타미쿰(B. ketoglutamicum), 아스로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(C. hydrocarboclastus)(교와하꼬공업(주), 미국 특허 제3,574,061호)등이 알려져 있다. 또한 아르기닌이나 시트룰린의 영양 요구성 균주인 아스로박터 시트레우스(A. citreus), 브레비박테리움 락토페르멘툼(B. Lactofermentum), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)(아지노모토(주), 유럽특허 공개 제 0393708 A2) 중 마이코페놀산(mycophenolic acid) 또는 오르니티놀(ornithinol)에 저항성을 갖는 영양 요구성 돌연변이 균주를 선별하여 오르니틴 생산에 사용하는 것이 알려져 있다.

상기 미국 특허 제3,574,061호에서는 영양 요구성 돌연변이주인 브레비박테리움 케토글루타미쿰(ATCC 21092)을 탄화수소, 예를 들어, 파라핀을 주요 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 L-오르니틴을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 이 방법에 의하면 오르니틴의 생산성은 4일간의 배양에서 8.6 mg/ml로 그다지 높지 않았다.

그러나 L-오르니틴의 산업적 대량생산은 여전히 요구되고 있기 때문에 이를 위하여 L-오르니틴의 생산방법을 더욱 개발할 필요성이 있다.

한편, L-오르니틴은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp) 미생물 중 하나인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 미생물에 의해 글루타메이트로부터 순환경로(cyclic pathway)를 통해 생합성 되고, 상기 생합성 과정은 argB 유전자에 의해 코딩된 N-아세틸글루타메이트 키나아제(N-acetylglutamate kinase), argC 유전자에 의해 코딩된 N-아세틸글루타메이트 세미알데하이드 디하이드로게나제(N-acetylglutamate semialdehyde dehydrogenase), argD 유전자에 의해 코딩된 N-아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제(N-acetylornithine aminotransferase), 및 argJ 유전자에 의해 코딩된 오르니틴 N-아세틸트랜스퍼라제(ornithine N-acetyltransferase)에 의해 촉매화 된다.

본 발명자는 이전의 연구에서, 시트룰린과 프롤린 생합성 유전자가 결손되고 아르기닌 억제자(ArgR)에 의한 피드백 제어가 차단된 돌연변이 균주에서 argCJBD 오페론 유전자의 상동적 발현(homologous expression)으로 L-오르니틴의 생산량이 증가하였으나, 상기 L-오르니틴의 생산량 증가는 글루타메이트의 추가적인 공급에 의존적이지 않음을 보고한 바 있다[Hwang et al., (2008) J Microbiol Biotechnol 18:704-710]. 그러나 L-오르니틴의 생합성 경로로 최대의 카본 플럭스를 유지하기 위해서는 argCJBD 유전자의 과 발현뿐 아니라, 다른 방법을 통한 L-오르니틴 제조방법의 필요성이 여전히 요구되고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자는 L-오르니틴을 보다 효과적으로 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 세포막 단백질을 코딩하는 유전자로 추정되는 NCgl0929 ORF 염기서열의 일부를 염색체로부터 결실을 유도할 경우, L-오르니틴의 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 내재적 세포막 단백질인 아미노산 트랜스포터의 활성이 감소 또는 불활성화 된 것을 특징으로 하는, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 미생물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 이용한 L-오르니틴 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일구현예는 내재적 세포막 단백질인 아미노산 트랜스포터의 활성의 감소 또는 불활성화 된 것을 특징으로 하는, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 미생물에 관한 것이다.

L-오르니틴 생산 미생물의 NCgl0929 유전자 염기서열 일부의 결실을 유도하여 NCgl0929 유전자가 코딩하는 세포막 단백질의 기능이 불활성화됨으로써 세포내 글루타메이트의 농도가 증가되고, L-오르니틴 생산능이 향상되도록 변이된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 제공한다.

구체적인 본 발명의 일구현예는, 활성의 감소 또는 불활성화는 서열번호 1의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 부위 특이적 결실을 통해 이루어진, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어진 NCg10929 유전자일 수 있다.

본 발명에서, 상기 “활성의 감소 또는 불활성화”는 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이한 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 의하여 유발된 것일 수 있으며, 바람직하게는 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

“불활성화”란, 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미하며, 상기 개시된 돌연변이에 의한 방법뿐 아니라 당업계에 알려진 임의의 불활성화 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.

본 발명자는 L-오르니틴의 생산성이 우수한 미생물을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, L-오르니틴 또는 L-오르니틴 생합성의 전구체에 해당하는 글루타메이트의 배출 및 흡수 경로에 주목하게 되었다. 통상적으로, 코리네박테리움 속 미생물 세포에서는 lysE 유전자로부터 발현되는 세포막 단백질이 라이신 및 아르기닌의 배출 경로에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 NCgl1221 유전자로부터 발현되는 세포막 단백질이 글루타메이트의 배출 경로에 직접 관여하는 것으로 밝혀진 바 있다 [Nakamura et al., (2007) Appl Environ Microbiol 73:4491-4498]. 그러나 아직까지 코리네박테리움 속 미생물, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포에서 오르니틴의 배출 및 흡수 경로에 직접 관여하는 세포막 단백질이 알려진 바 없다. 이에 놀랍게도 이와 유사한 기능을 지니는 세포막 단백질의 활성을 변화시킴으로써 L-오르니틴 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 용어 "L-오르니틴"이란, 고등동물의 생체 내의 요소 회로 상에 존재하는 염기성 아미노산으로서, 간에 대해 독성이 강한 암모니아를 무독성의 요소로 변환, 오줌으로 배출함으로써 간을 보호하는 역할을 하는 아미노산을 의미한다. L-오르니틴은 성장호르몬을 분비시킴으로써 근육합성을 증가시키고 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 많이 이용되고 있다. 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 작용 등의 새로운 기능이 있는 것으로 밝혀졌다. L-오르니틴은 L-오르니틴알파케토글루타메이트염(OKG: L-오르니틴과 알파케토글루타메이트가 2:1의 비율로 함유되어 있음)의 형태로 근육증강, 비만예방 및 면역증강소재로서도 폭넓게 이용되고 있다. L-오르니틴은 유럽에서는 간장 장애를 개선하는 의약품으로서 이용되고 있고, 일본에서는 L-오르니틴산염의 형태로 식품소재로서 사용되고 있으며, 미국에서는 식품보조제로서 사용되고 있다.

본 발명에서 용어, “L-오르니틴 생산”이란, 미생물에 내재적으로 존재하는 유전자들로부터 발현되는 일련의 효소들을 사용하여 글루타메이트로부터 오르니틴을 생산하는 일련의 대사과정을 의미한다.

본 발명의 용어, "L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물"이란, 상기 L-오르니틴을 내재적으로 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물의 염색체 상에서 본원 발명 세포막 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 모두가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 의미하며, NCgl0929가 결실되어, 세포내 글루타메이트가 축적되어 오르니틴 생산능이 향상될 수 있는 미생물은 제한없이 포함될 수 있다.

또한, 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자는 특별히 제한되지 않으나, 서열번호 2로 이루어지는 NCgl0929일 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 속 미생물은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518(수탁번호 KACC91938P)일 수 있다.

본 발명의 용어 "NCgl0929 유전자"란, "Cgl0968 유전자"라고도 하며, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포에서 NCgl0929 유전자가 코딩하는 단백질은 대장균 (Escherichia coli)의 ydgI 유전자가 코딩하는 ArcD 단백질과 28% 이상의 상동성을 나타낸다. 상기 NCgl0929 유전자는 1,506개의 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)로서, 501개의 아미노산으로 구성된 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 트랜스포터 (amino acid transporter)를 생성하는 것으로 추정된다.

본 발명에서 용어,“상동성”이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다.

본 발명에서는 실시예를 통하여 L-오르니틴 생산 미생물의 염색체에서 NCgl0929 유전자의 일부가 결실된 경우, L-오르니틴의 생산성을 향상시키는 것을 확인하였는바, L-오르니틴의 생산성 향상을 위하여 NCgl0929 유전자의 일부 또는 전부를 결실시켜 사용할 수 있으며, 상기 생산성 향상은 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 이용하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 용어 "아미노산 트랜스포터(amino acid transporter)"란 세포막 단백질로서 다양한 종류의 아미노산의 배출 또는 흡수 이동에 관여하는 단백질을 의미하며, L형 아미노산을 기질로서 사용할 수 있으며, 사용되는 기질에 따라 다양한 종류의 트랜스포터 단백질이 존재할 수 있다. 본 발명 실시예 4에서는 아미노산 트랜스포터를 코딩하는 것으로 추정되는 NCgl0929 유전자의 일부 서열을 결실시킴으로써 L-오르니틴의 생산능이 향상되는 것을 확인하였다(표 4). 따라서, 본 발명에서 상기 아미노산 트랜스포터와 동일한 활성을 갖는 한 서열번호 1의 아미노산 서열 뿐 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

아울러, 본 발명의 상기 각 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 모균주로 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(ATCC13032, argF△, argR△, NCgl2053△, NCgl2582△, NCgl0281△)(KACC91800P)을 사용하였으며, 여기에 NCg10929 염기서열의 부위 특이적으로 결실된 변이주를 제조하였는바, 본 발명의 일구현예는 글루코스 디하이드로게나제(GDH)를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부가 추가로 결실된 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는 세포막 단백질을 코딩하는 유전자 내에 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이한 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하여, 세포막 단백질의 활성이 감소되거나 불활성화된, 재조합 벡터에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어진 NCg10929 유전자일 수 있다.

본 발명에서 용어, “재조합 벡터”란, 숙주세포의 염색체와 따로 복제될 수 없는 벡터로서, 유전자 삽입물이 상기 숙주세포의 염색체상의 특정 유전자와 상동 재조합 될 수 있는 필수적인 구성요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 구체적으로 항생제 마커로서 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며 더욱 구체적으로 상기 항생제 내성 유전자로서 카나마이신 내성 유전자를 사용할 수 있다.

통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으며, 구체적으로 pK18mobsacB 벡터로부터 유래된 것을 사용할 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 NCgl0929 유전자의 일부 또는 전부가 결실된 유전자를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 도 1에 도시된 개열지도를 가지는 pSJC3501일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물의 염색체상에 존재하는 세포막 단백질을 코딩하는 유전자를 상동 재조합의 방법으로 변이시켜서, 세포막 단백질의 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, L-오르니틴의 생산성이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물의 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로,

ⅰ) 세포막 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 서열이 변이된 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계;

ⅱ) L-오르니틴을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입될 수 있고 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계;

ⅲ) 상기 수득한 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질 전환체를 수득하는 단계; 및

ⅳ) 상기 형질 전환체 중에서 세포막 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어진 NCg10929 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

아울러, 상기 숙주세포는 이에 제한되지 않으나 L-오르니틴을 생산하는 미생물을 이용할 수 있는데, 세포막 단백질 활성이 억제되어 세포내 글루타메이트의 배출 기능이 억제된 미생물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 L-오르니틴을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으며, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518(수탁번호 KACC91938P)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, Escherichia coli의 아미노산 트랜스포터 ArcD의 아미노산 서열과 28%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 세포막 단백질로 추정되는 NCgl0929 유전자를 선별하고(실시예 1), NCgl0929 유전자 염기서열의 일부가 결실된 폴리뉴클레오타이드를 pK18mobsacB 벡터에 도입하여 재조합 벡터 pSJC3501을 제작하였으며(실시예 2 및 도 1), L-오르니틴을 생산할 수 있으면서도, 염색체 상에서 글루코오스 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 일부가 모두 결실된 숙주 미생물인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260에 상기 재조합 벡터 pSJC3501을 형질 전환하여 상동재조합을 유도함으로써 세포막 단백질을 코딩하는 NCgl0929 유전자의 일부 염기서열이 염색체로부터 결실된 형질 전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518을 제작하였다(실시예 3). 또한, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518에서 세포 내의 글루타메이트 및 L-오르니틴의 농도가 증가된 것을 확인하였다(표 3 및 표 4).

이에 따라, 본 발명자는 L-오르니틴을 생산할 수 있으면서도, 염색체 상에서 글루코오스 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 일부가 모두 결실된 숙주 미생물 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260에 상기 유전체 재조합 벡터 pSJC3501을 형질 전환하여 상동 재조합을 유도함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 염색체의 NCgl0929 유전자의 일부 부위가 결실된 형질 전환체 균주를 "코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518(Corynebacterium glutamicum SJ9518)"라 명명하고, 2014년 03월 20일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC91938P를 부여받았다.

본 발명의 또 다른 일구현예는,

i) 탄소원 또는 질소원이 포함된 배양 배지에 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 접종하고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및

ii) 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예를 들어, 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 또한, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으며, 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 오르니틴은 배양액으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당 원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.

또한, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

아울러, 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

구체적으로, 공지된 L-오르니틴 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서는, 대조군(숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260) 및 본 발명의 형질 전환체(코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518)를 각각 배양하고, 이로부터 생산되는 내재적 글루타메이트의 농도를 측정 및 비교한 결과, 본 발명에서 제공하는 형질 전환체의 내재적 글루타메이트의 농도는 대조군에 비하여, 약 71% 정도 증가함을 알 수 있었다(표 3). 또한, 상기 대조군 및 본 발명의 형질 전환체에서 생산된 L-오르니틴의 농도를 측정 및 비교한 결과, 본 발명에서 제공하는 형질 전환체에서 생산된 L-오르니틴의 농도는 대조군에 비하여, 약 68.8% 정도 증가함을 확인하였다(표 4).

본 발명의 내재적 세포막 단백질의 활성이 감소된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물은 세포내 글루타메이트의 농도가 증가되고, L-오르니틴 생산능이 향상되도록 변이된 것으로서, L-오르니틴 생합성 대사경로의 특이적 탄소흐름 증대에 의하여 L-오르니틴의 생산수율을 향상시킬 수 있으므로, L-오르니틴의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내에 존재하는 세포막 단백질을 코딩하는 유전자인 NCg10929를 변이시키기 위한 벡터 pSJC3501의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 코리네박테리움 글루타미쿰의 내재적 아미노산 트랜스포터 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 선별

코리테박테리움 속 미생물의 대표적인 예인 코리네박테리움 글루타미쿰의 내재적 아미노산 트랜스포터의 일종인 L-오르니틴 임포터(importer) 단백질을 코딩하는 유전자를 선별하기 위하여, 일반이 접근 가능한 데이터베이스인 NCBI database(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 Escherichia coli 유래의 아미노산 트랜스포터를 코딩하는 유전자인 ydgI의 아미노산 서열을 query sequence로 이용하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 검색한 결과, 28%의 상동성을 나타내는 NCgl0929 유전자의 ORF 서열(서열번호 2)을 선별하였다. 상기 선별된 NCgl0929 유전자는 세포막 단백질로 추정되는 아미노산 서열(서열번호 1)을 코딩하는 유전자임을 확인하였다. 이에 이와 같이 새롭게 동정된 서열번호 2의 기능을 확인하기 위해 하기 실험을 수행하였다.

실시예 2. 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCgl0929 유전자가 코딩하는 세포막 단백질의 기능 확인

2-1. L-오르니틴 요구성을 나타내는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9500 균주의 제조

상기 실시예 1에서 확인한 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCgl0929 유전자가 코딩하는 세포막 단백질이 L-오르니틴 임포터로서의 기능을 지니는지 여부를 조사하기 위하여, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032)로부터 L-오르니틴 요구성 균주를 제조하고, L-오르니틴 요구성의 유전적 배경에서 NCgl0929 ORF의 염기서열이 부위 특이적으로 결실된 변이주(gene-disrupted mutant strain)를 제조하였다.

먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로 한 argCF 프라이머 및 argDR 프라이머, NCg10929의 서열을 근거로 0929F1, 0929R1, 0929F2 및 0929F2 프라이머를 제작하였다(표 1).

서열번호	프라이머 명칭	염기서열(5'-3')	제한효소
3	argCF	gctctagaTCCAGTTCAGGAAGCACC	XbaI
4	argDR	gctctagaACTTTGGTCCCTCGAGTG	XbaI
5	0929F1	cccaagcttCATCGCCACCATGAATCG	HindIII
6	0929R1	ggggtaccTTGGGCGATGACTGAACC	KpnI
7	0929F2	ggggtaccTTCCTCAACGAGACCACC	KpnI
8	0929R2	gctctagaTGGCAGTTGTAGGGAAGG	XbaI

상기 표 1에서, 밑줄친 서열은 괄호 안에 나타낸 바와 같은 제한효소에 대한 제한위치를 나타내며, 대문자는 세균성 유전자의 서열을 의미한다. NCgl0929의 개방해독틀 DNA 서열의 Genbank accession number는 NC_003450이다.

야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC13032)로부터 오르니틴 요구성 균주를 제조하기 위하여 오르니틴 생합성 대사과정의 효소들을 인코딩하는 argCJBD 오페론의 인프레임(in-frame) 부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 지니는 변이주를 제조하였다. 이를 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pK18mobsacB를 사용하여 수행하였으며, argCJBD 오페론이 내부적으로 인프레임 결실된 폴리뉴클레오이드 단편을 지니는 pK18mobsacB 유도체, pSJC3509를 제작하였다.

상기 pSJC3509는 4,838bp의 XbaI 말단을 포함하는 argCJBD 오페론 DNA 단편으로부터 3,447bp의 NcoI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함하는 pK18mobsacB 유도체이며, 상기 XbaI 말단을 포함하는 argCJBD 오페론 뉴클레오타이드 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 게놈 DNA를 주형으로 argCF 프라이머(서열번호 3)와 argDR 프라이머(서열번호 4) 쌍을 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다.

PCR 반응물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA 2 ㎕(250 ng), 10pmole의 argCF 프라이머 및 와 argDR 프라이머를 각각 2 ㎕(10 pmole), taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20 ㎕(2 unit), 멸균 증류수 24 ㎕로 구성하였으며, 변성(95℃, 30초), 어닐링(55℃, 30초) 및 중합반응(68℃, 1분)을 25회 반복하는 조건을 사용하였다.

상기 재조합 벡터 pSJC3509를 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 균주 (ATCC 13032)에 전기천공법을 이용하여 형질전환 시키고(van der Rest et al. 1999), 상기 재조합 벡터가 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되도록 하였다. 그 후, 10%의 수크로오스에서 2차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제(excision)를 유도하였다.

이후 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 argCJBD 유전자가 모두 결실된 것을 확인하고 SJ9500으로 명명하였으며, 최소배지에서 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9500 균주의 오르니틴 요구성을 확인하였다.

2-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9500 균주에서의 NCg10929 ORF( open reading frame )의 부위 특이적 서열이 결실된 변이주 제조 및 NCg10929 코딩 단백질의 기능 확인

상기 2-1에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9500 균주에서 NCgl0929 ORF의 염기서열이 부위 특이적으로 결실된 변이주를 제조하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 상기 pK18mobsacB 벡터를 사용하여 NCgl0929 ORF 염기서열의 일부가 인프레임으로 결실된 뉴클레오타이드 단편을 포함하는 pK18mobsacB 유도체, pSJC3501을 제작하였다.

상기 pSJC3501은 2,108bp에 해당하는 NCgl0929 ORF의 HindIII-XbaI 말단을 포함하는 pK18mobsacB 유도체이며, NCgl0929 ORF의 KpnI 절편의 내부적 유전자 염기서열의 소실을 포함한다. KpnI 절편의 내부적 유전자 염기서열의 소실을 포함하는 NCgl0929 ORF 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 0929F1-0929R1 프라이머(서열번호 5 및 6)와 0929F2-0929R2 프라이머(서열번호 7 및 8) 쌍으로 교차 PCR을 수행하여 제조하였다.

이때, PCR 반응물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA 2 ㎕(250 ng), 0929F1-0929R1 프라이머와 0929F2-0929R2 프라이머 각각 2 ㎕(10 pmole), taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20 ㎕(2 unit) 및 멸균 증류수 24 ㎕를 포함하고, 변성 (94℃ 1분), 어닐링 (58℃ 1분) 및 신장 (70℃ 1분)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 1,009 bp 및 1,099 bp의 폴리뉴클레오이드 단편을 각각 수득하고, 이들을 pK18mobsacB에 도입하여, HindIII-XbaI 말단을 포함하는 2,108bp에 해당하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 pK18mob0929를 수득하였다 (도 1). 도 1은 유전체 재조합 벡터 pSJC3501의 개열지도를 나타내는 개략도이다.

재조합 벡터 pSJC3501를 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9500 균주에 전기천공법을 이용하여 형질전환 시키고 상기 플라스미드는 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되도록 하였다. 그 후 10%의 수크로오스에서 2차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제를 유도하였다.

이후, 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR을 통해 NCgl0929 ORF의 부위 특이적 염기서열이 염색체로부터 결실된 것을 확인하고 SJ9504로 명명하였다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9504 균주는 최소배지에서는 세포의 생육이 불가하지만, 오르니틴이 포함된 최소배지에서는 세포의 생육이 회복되는 것을 확인하였다 (표 2). 이로부터 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCgl0929 유전자가 코딩하는 세포막 단백질은 오르니틴 임포터의 기능을 지니지 않는 것을 알 수 있었다.

균주	최소배지의 콜로니 형성 여부
균주	오르니틴 존재시	오르니틴 부재시
SJ9500	+	-
SJ9504	+	-

실시예 3. 코리네박테리움 글루타미쿰의 오르니틴 생산균주에서 NCgl0929 염기서열의 부위-특이적 변이주의 제조

본 발명의 유전체 재조합 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260 (ATCC13032, argF△, argR△, NCgl2053△, NCgl2582△, NCgl0281△)(KACC91800P)에서 NCgl0929 ORF의 염기서열이 부위 특이적으로 결실된 변이주를 제조하였다.

부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 상기 실시예 2-2 에서 제조한 pK18mbsacB 유도체인 재조합 벡터, pSJC3501을 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260 균주에 전기천공법으로 도입하여 형질 전환시키고, 상기 재조합 벡터가 싱글 크로스오버에 의해 염색체에 도입되도록 하였다. 그 후 10%의 수크로오스에서 2차 재조합을 통해 염색체로부터 플라스미드의 절제를 유도하였다.

유전자 특이적 프라이머를 사용한 다이아그너스틱 PCR을 통해 NCg10929 ORF의 부위 특이적 염기서열이 염색체로부터 결실된 것을 확인하고, SJ9518로 명명하였으며, 2014년 03월 20일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC91938P를 부여받았다.

실시예 4. NCg10929 ORF 의 부위 특이적 염기서열이 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 L-오르니틴 생산량 증가 확인

상기 실시예 3에서 제조한 L-오르니틴 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518로부터 L-오르니틴 생산을 위해 하기와 같은 방법으로 배양하였다. 이때, 대조군으로 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260을 배양하여 사용하였다.

종배지로 Recovery Glucose 배지(80g BHI, 20g 글루코오스, 60g 소르비톨/L)을 사용하여 24 시간 배양하였다. 생산배지는 MMY 배지[0.8g KH₂PO₄, 10g (NH₄)₂SO₄, 1g MgSO₄7H₂O, 1.2g Na₂HPO₄, 2mg MnSO₄H₂O, 2mg FeSO₄7H₂O, 1mg ZnSO₄7H₂O, 10g 효모 추출액, 및 60g 글루코스/L, pH 7.0]를 사용하였다.

종배지를 함유하는 100㎖ 배플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ8260(대조군)과 상기 제조된 변이주 SJ9518을 각각 접종하고 24시간 동안 진탕배양(200 rpm)하였다. 종배지에서 배양된 배양물을 수득하여 수득한 균체를 MMY 배지 10 ㎖가 담긴 100 ㎖ 배플 플라스크에서 600 nm에서 흡광도가 0.4 ~ 0.5 정도를 나타내도록 재현탁 하고, 배지 10 ㎖당 0.2 g의 멸균된 CaCO₃를 첨가하였으며, 30?의 200rpm 회전식 교반기에서 배양하였다.

상기 배양물로부터 각 균주의 생육도, 세포 조 추출물 및 배양 상층액의 글루타메이트의 농도 및 배양 상층액에서의 L-오르니틴의 농도를 측정하고 비교하였다.

4-1. 글루타메이트의 농도 측정

상기 배양물로부터 600 nm에서 분광법으로 세포의 생육도를 측정하였고, 글루타메이트의 농도는 Glutamate Assay 키트를 사용한 발색 반응을 이용하여 측정하였다(Abcam Inc., MA, USA). 이 때, 실험 결과는 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10 % 이하였다. 측정한 글루타메이트 농도는 하기 표 3에 나타내었다.

균주	글루타메이트 농도 (nmol)		생육도 (OD₆₀₀)
균주	세포내	세포외	생육도 (OD₆₀₀)
SJ8260	2.79	7.84	47.6
SJ9518	4.78	4.13	46.7

상기 표 3에서 보듯이, NCgl0929 ORF의 부위 특이적 염기서열이 염색체로부터 결실된 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518은 대조군 SJ8260과 비교했을 때, 세포내 글루타메이트의 농도는 약 71% 정도 증가하였으나 세포외 글루타메이트의 농도는 약 47% 감소하였음을 확인하였다. 또한, 변이주와 대조군은 생육도의 차이는 나타나지 않았다. 이와 같은 사실은 NCgl0929 ORF가 코딩하는 세포막 단백질이 오르니틴의 세포막 이동에 관여하기 보다는 글루타메이트의 배출에 관여하는 기능을 지니는 것을 뒷받침하는 것이다.

상기 결과에 따라 본 발명의 형질 전환체인 SJ9518(NCgl0929 ORF의 부위 특이적 염기서열이 염색체로부터 결실된 변이주)에서 세포내 글루타메이트의 농도가 증가되었고, 오르니틴 생합성의 전구체인 세포내 글루타메이트 농도의 증가는 L-오르니틴의 생산량 증가를 유도할 수 있을 것으로 예상되므로, 본 발명의 형질 전환체가 실제로 L-오르니틴의 생산량의 증가를 나타내는지 여부를 확인하였다.

4-2. L-오르니틴의 농도 측정

대조군(SJ8260)과 형질 전환체(SJ9518)를 각각 상기와 같은 방법으로 배양하고, 배양이 종료된 후, 각 균주의 L-오르니틴의 농도를 측정하고 비교하여 하기 표 4에 나타내었다. 이때, 균주의 생육도는 600 nm에서 분광법으로 측정하고, L-오르니틴의 농도는 Agilent 1100 series HPLC 및 Zorbax Eclipse C18 column을 사용하여 측정하였다. L-오르니틴의 농도는 Agilent 1100 series HPLC 및 Zorbax Eclipse C18 column을 사용하여 정량하였다. 이 때, 실험 결과는 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10 % 이하였다.

균주	L-오르니틴 농도 (g L^-1)	생육도 (OD₆₀₀)
SJ8260	14.1	47.6
SJ9518	23.8	46.7

상기 표 4에서 나타난 바와 같이, L-오르니틴의 농도는 대조군(SJ8260)에 비하여, SJ9518의 경우 약 68.8% 정도 증가함을 확인하였다. 또한, 변이주와 대조군은 생육도의 차이는 나타나지 않았다. 이와 같은 사실은 코리네박테리움 글루타미쿰 NCgl0929 ORF의 부위 특이적 염기서열이 염색체로부터 결실된 변이주인 SJ9518에서 세포내 글루타메이트의 농도가 증가되었고, 오르니틴 생합성의 전구체인 세포내 글루타메이트 농도의 증가는 L-오르니틴의 생산량 증가를 유도하였음을 나타낸다.

상기와 같은 결과는 본 발명 서열번호 1의 세포막 단백질의 활성이 감소 또는 불활성화 된 코리네박테리움 속 균주는 세포내 글루타메이트 농도가 증가되고, 세포내 오르니틴 생합성의 전구체인 글루타메이트 농도의 증가는 L-오르니틴의 생산량을 증가시키는 것을 시사하는 것이다.

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91938P

20140320

<110> SANGJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Corynebacterium glutamicum having improved L-ornithine production and method for preparing L-ornithine using the same <130> KPA140341-KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 501 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(501) <223> L-ornithine importer <400> 1 Met Asn Thr Gln Ser Asp Ser Ala Gly Ser Gln Gly Ala Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ser Arg Thr Val Ser Ile Arg Thr Leu Ile Ala Leu Ile Ile Gly Ser 20 25 30 Thr Val Gly Ala Gly Ile Phe Ser Ile Pro Gln Asn Ile Gly Ser Val 35 40 45 Ala Gly Pro Gly Ala Met Leu Ile Gly Trp Leu Ile Ala Gly Val Gly 50 55 60 Met Leu Ser Val Ala Phe Val Phe His Val Leu Ala Arg Arg Lys Pro 65 70 75 80 His Leu Asp Ser Gly Val Tyr Ala Tyr Ala Arg Val Gly Leu Gly Asp 85 90 95 Tyr Val Gly Phe Ser Ser Ala Trp Gly Tyr Trp Leu Gly Ser Val Ile 100 105 110 Ala Gln Val Gly Tyr Ala Thr Leu Phe Phe Ser Thr Leu Gly His Tyr 115 120 125 Val Pro Leu Phe Ser Gln Asp His Pro Phe Val Ser Ala Leu Ala Val 130 135 140 Ser Ala Leu Thr Trp Leu Val Phe Gly Val Val Ser Arg Gly Ile Ser 145 150 155 160 Gln Ala Ala Phe Leu Thr Thr Val Thr Thr Val Ala Lys Ile Leu Pro 165 170 175 Leu Leu Cys Phe Ile Ile Leu Val Ala Phe Leu Gly Phe Ser Trp Glu 180 185 190 Lys Phe Thr Val Asp Leu Trp Ala Arg Asp Gly Gly Val Gly Ser Ile 195 200 205 Phe Asp Gln Val Arg Gly Ile Met Val Tyr Thr Val Trp Val Phe Ile 210 215 220 Gly Ile Glu Gly Ala Ser Val Tyr Ser Arg Gln Ala Arg Ser Arg Ser 225 230 235 240 Asp Val Ser Arg Ala Thr Val Ile Gly Phe Val Ala Val Leu Leu Leu 245 250 255 Leu Val Ser Ile Ser Ser Leu Ser Phe Gly Val Leu Thr Gln Gln Glu 260 265 270 Leu Ala Ala Leu Pro Asp Asn Ser Met Ala Ser Val Leu Glu Ala Val 275 280 285 Val Gly Pro Trp Gly Ala Ala Leu Ile Ser Leu Gly Leu Cys Leu Ser 290 295 300 Val Leu Gly Ala Tyr Val Ser Trp Gln Met Leu Cys Ala Glu Pro Leu 305 310 315 320 Ala Leu Met Ala Met Asp Gly Leu Ile Pro Ser Lys Ile Gly Ala Ile 325 330 335 Asn Ser Arg Gly Ala Ala Trp Met Ala Gln Leu Ile Ser Thr Ile Val 340 345 350 Ile Gln Ile Phe Ile Ile Ile Phe Phe Leu Asn Glu Thr Thr Tyr Val 355 360 365 Ser Met Val Gln Leu Ala Thr Asn Leu Tyr Leu Val Pro Tyr Leu Phe 370 375 380 Ser Ala Phe Tyr Leu Val Met Leu Ala Thr Arg Gly Lys Gly Ile Thr 385 390 395 400 His Pro His Ala Gly Thr Arg Phe Asp Asp Ser Gly Pro Glu Ile Ser 405 410 415 Arg Arg Glu Asn Arg Lys His Leu Ile Val Gly Leu Val Ala Thr Val 420 425 430 Tyr Ser Val Trp Leu Phe Tyr Ala Ala Glu Pro Gln Phe Val Leu Phe 435 440 445 Gly Ala Met Ala Met Leu Pro Gly Leu Ile Pro Tyr Val Trp Thr Arg 450 455 460 Ile Tyr Arg Gly Glu Gln Val Phe Asn Arg Phe Glu Ile Gly Val Val 465 470 475 480 Val Val Leu Val Val Ala Ala Ser Ala Gly Val Ile Gly Leu Val Asn 485 490 495 Gly Ser Leu Ser Leu 500 <210> 2 <211> 1506 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(1506) <223> NCg10929 ORF <400> 2 gtgaatactc aatcagattc tgcggggtct caaggtgcag cggccacaag tcgtactgta 60 tctattagaa ccctcatcgc gctgatcatc ggatcgaccg tcggcgcggg aattttctcc 120 atccctcaaa acatcggctc agtcgcaggt cccggcgcga tgctcatcgg ctggctgatc 180 gccggtgtgg gcatgttgtc cgtagcgttc gtgttccatg ttcttgcccg ccgtaaacct 240 cacctcgatt ctggcgtcta cgcatatgcg cgtgttggat tgggcgatta tgtaggtttc 300 tcctccgctt ggggttattg gctgggttca gtcatcgccc aagttggcta cgcaacgtta 360 tttttctcca cgttgggcca ctacgtaccg ctgttttccc aagatcatcc atttgtgtca 420 gcgttggcag ttagcgcttt gacctggctg gtgtttggag ttgtttcccg aggaattagc 480 caagctgctt tcttgacaac ggtcaccacc gtggccaaaa ttctgcctct gttgtgcttc 540 atcatccttg ttgcattctt gggctttagc tgggagaagt tcactgttga tttatgggcg 600 cgtgatggtg gcgtgggcag catttttgat caggtgcgcg gcatcatggt gtacaccgtg 660 tgggtgttca tcggtatcga aggtgcatcg gtatattccc gccaggcacg ctcacgcagt 720 gatgtcagcc gagctaccgt gattggtttt gtggctgttc tccttttgct ggtgtcgatt 780 tcttcgctga gcttcggtgt actgacccaa caagagctcg ctgcgttacc agataattcc 840 atggcgtcgg tgctcgaagc tgttgttggt ccatggggtg ccgcattgat ttcgttgggt 900 ctgtgtcttt cggttcttgg ggcctatgtg tcctggcaga tgctctgcgc agaaccactg 960 gcgttgatgg caatggatgg cctcattcca agcaaaatcg gggccatcaa cagccgcggt 1020 gctgcctgga tggctcagct gatctccacc atcgtgattc agattttcat catcattttc 1080 ttcctcaacg agaccaccta cgtctccatg gtgcaattgg ctaccaacct atacttggtg 1140 ccttacctgt tctctgcctt ttatctggtc atgctggcaa cacgtggaaa aggaatcacc 1200 cacccacatg ccggcacacg ttttgatgat tccggtccag agatatcccg ccgagaaaac 1260 cgcaaacacc tcatcgtcgg tttagtagca acggtgtatt cagtgtggct gttttacgct 1320 gcagaaccgc agtttgtcct cttcggagcc atggcgatgc ttcccggctt aatcccctat 1380 gtgtggacaa ggatttatcg tggcgaacag gtgtttaacc gctttgaaat cggcgtggtt 1440 gttgtcctgg tcgttgctgc cagcgcgggc gttattggtt tggtcaacgg atcactatcg 1500 ctttaa 1506 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argCF primer <400> 3 gctctagatc cagttcagga agcacc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> argDR primer <400> 4 gctctagaac tttggtccct cgagtg 26 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0929F1 primer <400> 5 cccaagcttc atcgccacca tgaatcg 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0929R1 primer <400> 6 ggggtacctt gggcgatgac tgaacc 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0929F2 primer <400> 7 ggggtacctt cctcaacgag accacc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0929R2 primer <400> 8 gctctagatg gcagttgtag ggaagg 26

Claims

내재적 세포막 단백질인 아미노산 트랜스포터의 활성의 감소 또는 불활성화 된 것을 특징으로 하는, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 미생물.
제1항에 있어서, 상기 활성의 감소 또는 불활성화는 서열번호 1의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자에 부위 특이적 결실을 통해 이루어진, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
제2항에 있어서, 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 이루어진 NCg10929 유전자인, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
제1항에 있어서, 상기 활성의 감소 또는 불활성화는 상기 세포막 단백질을 코딩하는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이한 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법에 의하여 유발되는 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물은 글루코스 디하이드로게나제(GDH)를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부가 추가로 결실된 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 SJ9518(수탁번호 KACC91938P)인, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
i) 세포막 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 서열이 변이된 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계;
ii) L-오르니틴을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입될 수 있고 염색체상에서 상동재조합을 수행할 수 있는 벡터에 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계;
ⅲ) 상기 수득한 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질 전환체를 수득하는 단계; 및
iv) 상기 형질 전환체 중에서 세포막 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 제조방법.
i) 탄소원 또는 질소원이 포함된 배양 배지에 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 접종하고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
ii) 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 L-오르니틴의 회수는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.