CN101824435A - 一种罗非鱼神经肽y重组蛋白的表达系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统。本发明是将带酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因克隆入毕赤酵母表达载体中得到重组毕赤酵母表达载体，再将重组毕赤酵母表达载体转化入毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组株，该重组株表达罗非鱼神经肽Y重组蛋白。利用本发明罗非鱼神经肽Y重组蛋白表达系统可以获得来源稳定、成本低廉的罗非鱼神经肽Y重组蛋白，该重组蛋白可用于制备鱼苗促生长剂或添加剂，可有效促进鱼类生长。
Description
技术领域
本发明涉及罗非鱼神经肽Y蛋白领域，具体涉及一种罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统。
背景技术
神经肽Y(NPY)是Tatemoto于1982年首次从猪脑中提取的一种含36个氨基酸的单链多肽，其开放阅读框全长300bp，编码99个氨基酸，其中含有28个氨基酸的信号肽，36个氨基酸的成熟肽和一个功能未知的肽尾，所述36个氨基酸的成熟肽是真正的活性神经肽Y。NPY是一种内源性的促食欲因子，属胰多肽家族，与两种肠内分泌肽(胰腺肽和肽YY)具有高度同源性。NPY有2个相互逆平行的螺旋区，1个富含脯氨酸的螺旋和1个
螺旋，2个螺旋区都有两性电离的特点，2个螺旋之间借疏水键维持其稳定的三级结构。当NPY的三级结构发生改变时，其生物活性便消失。NPY广泛分布于中枢及外周神经系统的神经元中，同时也存在于心脏、骨骼肌、肝脏、肾上腺等器官中。大量研究表明，NPY在中枢神经系统能刺激动物摄食，改变机体代谢环境，激活脂肪组织的脂蛋白酶，促进脂肪的合成与储存。通过在脑室注射和腹腔注射的研究发现NPY具有促进鱼类摄食，影响激素分泌、血压、性行为以及调节体温和能量平衡等各种生物功能。
罗非鱼(Tilapia)，俗称非洲鲫鱼，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科Cichlidae、罗非鱼属Tilapia(亦称丽鲷科，丽鲷属)。该属原产于非洲，有600多种，目前被养殖的有15种。其外形、个体大小类似鲫鱼，属广盐性鱼类，海淡水中皆可生存；耐低氧，一般栖息于水的下层，但随水温变化或鱼体大小改变栖息水层。罗非鱼食性广泛，价格低廉，是世界性的主要养殖鱼类，被誉为21世纪穷人的蛋白质，也是中国主要的出口经济鱼类之一。但目前在罗非鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其生长的基因工程产品饵料添加剂。
酵母是最简单的真核生物，以其作为宿主表达外源蛋白有很大的优势：生长繁殖快，易培养，操作简单；能对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如糖基化、乙酰化等；安全性高，无致病性。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能将甲醇作为代谢的唯一碳源和能源。毕赤酵母表达系统有很多优点在科研及生产中广泛应用：使用强的可诱导启动子-AOX1基因启动子、外源基因以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定性好、重组蛋白以高水平分泌到几乎无蛋白的培养基中，利用表达蛋白的纯化、容易进行高密度发酵，适合于产业化生产。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一种罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统。
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
一种罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统，包括表达载体和重组株，该表达系统是将带酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因克隆入毕赤酵母表达载体中得到重组毕赤酵母表达载体，再将重组毕赤酵母表达载体转化入毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组株，该重组株表达罗非鱼神经肽Y重组蛋白。
上述表达系统中，所述带酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因的合成方法是以罗非鱼神经肽Y克隆入载体pTZ57R/T中，以其为模板设计三个引物，上游引物A含有XhoI酶切位点，如SEQ ID NO：1所示；下游引物B含有XbaI酶切位点和6×His标签序列，如SEQ ID NO：2所示；下游引物C含有XbaI酶切位点，不含6×His标签序列，如SEQ ID NO：3所示；通过PCR方法得到两段带有不同酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因。其中，含有6×His标签序列的下游引物B在6×His标签序列后面加TGA终止密码子以阻止pPICZ
A载体自身的标签表达，不含有6×His标签序列的下游引物C不添加终止密码子，只表达pPICZ
A载体自身的6×His和myc标签。
A与B、A与C通过PCR方法得到两段带有不同酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因。将这两段基因序列分别克隆入毕赤酵母表达载体中，得到两个重组毕赤酵母表达载体D和E。两个重组毕赤酵母表达载体D和E分别转入毕赤酵母X-33感受态细胞中，经培养得到的两个毕赤酵母重组株F和G。
本发明罗非鱼神经肽Y重组蛋白，是由表达系统中的两个毕赤酵母重组株F和G经发酵培养、分离纯化得到的。这两种蛋白产物所连接的标签不同，一个为6×His，另一个为6×His和myc标签加上两间隔氨基酸序列，即目的蛋白序列与6×His标签序列之间的序列和6×His和myc两标签之间的序列。
本发明罗非鱼神经肽Y重组蛋白的生产方法为：将毕赤酵母重组株接种在含有BMGY的培养基中培养，离心收集菌体并重悬于YPM培养基中培养，收集上清，经分离纯化后得到罗非鱼神经肽Y重组蛋白。
上述生产方法优选为：将毕赤酵母重组株接种在含有BMGY的液体培养基中，30℃，250rpm培养至OD600为4~6，离心收集菌体并重悬菌体于YPM液体培养基中，使其OD600为2~3，30℃，250rpm培养12h后收集上清，经分离纯化后得到罗非鱼神经肽Y重组蛋白。
本发明罗非鱼神经肽Y重组蛋白可以用于制备鱼苗促生长剂或饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明罗非鱼神经肽Y重组蛋白表达系统和生产方法可以获得来源稳定、成本低廉的罗非鱼神经肽Y重组蛋白，该重组蛋白用于鱼类的养殖中，可以作为鱼苗的促生长剂或添加剂，有效促进鱼类生长。
附图说明
图1是吉富罗非鱼下丘脑总RNA凝胶电泳图；
图2是实施例1中PCR扩增产物的电泳鉴定图；
图3和图4是实施例2中PCR扩增产物的电泳鉴定图；
图5是D、E和空载体pPICZA的质粒提取图；
图6是D。E和空载体pPICZ
A质粒线性化后回收电泳图；
图7是两种神经肽Y重组蛋白的特异表达PAGE图，其中，NC1为转化空载体pPICZ
A的酵母阴性对照，NC2为转化毕赤酵母载体D的酵母不用甲醇诱导阴性对照，NC3为转化毕赤酵母载体E的酵母不用甲醇诱导阴性对照；
图8是诱导表达NPY1蛋白24h后的PAGE图；
图9是诱导表达NPY1蛋白24h后的western检测图；
图10是NPY2蛋白表达情况随时间变化图；
图11是不同诱导时间下NPY2蛋白的western检测图；
图12是NPY1蛋白与6×His binding柱结合后用咪唑洗脱的PAGE图，其中，1~10为NPY1与6×His binding柱结合后用咪唑洗脱的洗脱液1~10，CH为上清上样后穿流液浓缩物，WH为上样wash后的wash液浓缩，M为蛋白marker，NS为过柱前上清浓缩物；
图13是NPY2蛋白与6×His binding柱结合后用咪唑洗脱的PAGE图，其中，M为蛋白marker，C为上清过Ni柱后的穿流液；
图14是50天内各实验组的平均个体体重图；
图15是50天内各组平均饲料系数图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1 罗非鱼神经肽Y基因片段的克隆
提取吉富罗非鱼下丘脑总RNA(图1)后，以AP引物反转录成cDNA。以cDNA为模板，根据已发表的Oreochromis sp.YC-2004(red tilapia)神经肽Y基因的序列(GenBank：AY779047.1)设计一对引物，引物：上游引物如SEQ ID NO：4所示，下游AUAP克隆神经肽Y基因起始密码子到PolyA尾的基因序列，PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；下边为35个循环，95℃变性15秒，53℃退火15秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2。从图2可见第一次PCR扩增了一段长约630bp的序列，序列如SEQ ID NO：5所示。将630bp的扩增产物连接到pTZ57R/T载体上得到重组质粒T-TiNPY。将重组质粒用的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的PCR产物是罗非鱼神经肽Y基因从起始密码子到PolyA尾的基因片段，此片段包含了罗非鱼神经肽Y基因的整个开放阅读框。
实施例2 带酶切接头的吉富罗非鱼神经肽Y基因合成
根据上述已所克隆到的神经体Y基因序列及限制性内切酶XhoI和XbaI的识别序列，设计合成两对特异性引物：
上游引物A如SEQ ID NO：1所示，共43bp，是在NPY基因的成熟肽序列前添加了XhoI酶切识别位点及后面的信号肽编码序列。
下游引物B如SEQ ID NO：2所示，共45bp，是在NPY基因成熟肽序列后添加了6×His标签、终止密码子及酶切识别位点。
下游引物C如SEQ ID NO：3所示。利用实施例1中得到的载体T-TiNPY为模板进行PCR反应，PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；下边为35个循环，95℃变性15秒，65℃退火15秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分钟。
PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3和图4，可见PCR扩增了一段长约166bp(图3)的序列1(如SEQ ID NO：6所示)和一段长约为144bp(图4)的2序列(如SEQ ID NO：7所示)。
实施例3 含吉富罗非鱼神经肽Y基因的毕赤酵母表达载体D和E的构建
1和2PCR产物用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切后，酶切产物用
Gel Extraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化约160bp和140左右的罗非鱼神经肽Y基因片段；载体质粒pPICZ
A经限制性内切酶Xba I及Xho I双酶切后分离纯化3.6kb的大片段，分别与两个神经肽Y基因片段按1∶3混合，用NEB T4连接酶16℃连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用低盐LB平板筛选具Zeocin抗性的转化子，以标准方法提取质粒(图5)，得到大小约3.8kb的重组质粒，通过以5-AOX为引物测序，所得序列为目的序列并可推出相应的编码氨基酸序列(如SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9所示)，证明罗非鱼神经肽Y基因已克隆入毕赤酵母表达载体pPICZA中，重组质粒命名为D和E质粒。
实施例4 能高效表吉富罗非鱼神经肽Y的毕赤酵母重组株F与G的构建
按照invitrogen公司的The EasyselectTM Pichia Expression Kit说明书制备毕赤酵母X-33感受态细胞，重组质粒D与E用PmeI线形化后凝胶回收(图6)，用标准方法电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，在含Zeocin 200ug/ml的YPDS平板上30℃进行培养。约4d后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼神经肽Y的毕赤酵母重组株F与G。
实施例5 利用毕赤酵母基因工程菌F与G生产重组吉富罗非鱼神经肽Y
挑取毕赤酵母基因工程菌F与G单菌落接种在培养基中30℃，250rpm培养24h，再将这5ml培养物加到200mlBMGY培养液中30℃，250rpm培养至OD600为4~6，离心收集细胞并用YPM液体培养基重悬细胞沉淀使其OD600为2~3，30℃，250rpm培养12~14h后离心收集上清即为表达出来的重组吉富罗非鱼神经肽Y蛋白。取1ml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加2×电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pPICZ
A转化X-33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图7，显示F在4~6KD处(将特异蛋白统称为NPY1)，G-X-33在6~10KD(将特异蛋白统称为NPY2)处上下出现了二至三条蛋白条带，而阴性对照不出现此带。按照理论，工程菌F与G表达出来的NPY蛋白的大小分别应约为5.1Kd和6.9Kd，PAGE图中显示的目的蛋白多于一个条带，通过蛋白N端测序表明是蛋白在分泌至胞外时信号肽的剪切不完全或者过剪切(即把目的蛋白的一部分N端序列剪切掉)所致；目的蛋白大小与估计值有细微差别，推测可能是糖基化及分子量marker误差所致。在诱导表达NPY是应严格控制诱导时间，随着诱导时间的推移，NPY会降解成一种小肽，这种小肽对猪NPY多克隆抗体无阳性反应，但是能与6×His binding柱结合，很可能是NPY的N端被严重降解。
NPY1与NPY2都能与Novagen公司的His-bind Resin结合并被分离出来。将重组斜带石斑鱼神经肽Y蛋白采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为兔抗猪NPY多克隆抗体(购自Calbiochem公司)，二抗为羊抗兔IgG-HRP(购自博士德生物工程有限公司)。显示兔抗猪NPY多克隆抗体能识别用毕赤酵母表达的重组NPY蛋白，证明得到的蛋白是重组吉富罗非鱼NPY。
对NPY2上面两条带的蛋白的N端进行氨基酸测序表明，NPY的N端序列影响了其N端信号肽的剪切，或者剪切不完全，或者剪切或降解过度，所测得的N端氨基酸序列有五种情况。
第一条带：(1)EAEAYPVK：比2少，但比3多，可能占20~30％；(2)EAYPVKPE：从峰值看占至少60~70％；(3)YPVKPENP：可能占5~10。
NPY第二条带主要有两种序列：(1)YPVKPENP：占大多数；(2)VKPENPGE：占少数。
表达的NPY1特异条带和免疫情况跟NPY2相似，因此可以推测NPY1个条带的情况可能相同结果见图(8~13)。
实施例6 两种重组吉富罗非鱼神经肽Y对罗非鱼摄食和生长的作用
一、实验材料：1、罗非鱼：吉富罗非鱼180条，每条65~79g左右，取自广东番禺罗非鱼良种场。2、罗非鱼饲料：酵母表达培养物10000g离心10Min取上清，测定NPY1、NPY2第一条和第二条带的浓度并以此为根据确定上清NPY含量。直接将上清喷洒在普通型罗非鱼饲料表面，-20度保存。根据所喷洒的酵母培养上清的量和种类分为5种：
1.喷洒含NPY2的酵母培养上清，至NPY2上两条带含量为0.15ugNPY/g饲料。
2.喷洒含NPY2的酵母培养上清，至NPY2上两条带含量为0.3ugNPY/g饲料。
3.喷洒含NPY2的酵母培养上清，至NPY2上两条带含量为0.6ugNPY/g饲料。
4.喷洒相应体积的水，作为阴性对照。
5.喷洒含NPY1的酵母培养上清，至NPY1上两条带含量为0.3ugNPY/g饲料。
二、实验条件：15个玻璃缸，淡水充气循环过滤系统，水温：26~28摄氏度温控。每天8:00至20:00的12小时光照，PH约为6.7。
三、实验方案：表达上清均匀喷洒到饲料表面，干燥后-20度储存。15个缸分为5组，每组3个平行，每缸随机放养12条鱼条。第1、2、3这三个实验组分别投喂NPY2添加加剂量分别为0.15、0.3、0.6ug NPY2/g饲料的饲料；第4个实验组为阴性对照，投喂无不添加培养酵母表达上清的饲料；第5组投喂添加剂量为0.3ug NPY1/g饲料的饲料，。
1.驯化：驯化2周，每天9:00和18:00喂食2％/gbw.
2.投喂实验：驯化2周后，每天9:00和18:00分别投喂五种饲料，至饱食(一小时内不再摄食)，未吃完的饲料用渔网捞出烘干，计算每缸鱼的摄食量。实验进行50天，每10天测量每缸鱼的体重，测量前24h不喂食。测量每缸鱼驯化结束后实验开始时的体长和五十天后实验结束时的体长。
3.组织提取：实验结束后取每条鱼的肝、肌肉、脑垂体、下丘。测肝重指数，肌肉干湿重比，蛋白脂肪含量等。评价含有NPY1或NPY2的酵母表达上清对罗非鱼生长及摄食的影响或作用。
四、实验结果：
表1
注：表中所给数据为平均数及3个重复的标准误，表中不同的上标字母表示差异显著(P＜0.05)。SGR(％/d)＝(lnWt-lnW0)/d×100，Wt为实验结束尾均重(g)，W0为实验开始尾均重(g)，d为实验天数。饲料系数＝饲料消耗量(g)/鱼体增重(g)
从体重增长来看，五个实验组，每个实验组平均每条罗非鱼体重增长都超过100％。其中，第1组(投喂0.15ugNPY2/g饲料)比第4组(投喂普通饲料的对照组)体重增加量高29.65％；第2组(投喂0.3ugNPY2/g饲料)比第4组(投喂普通饲料的对照组)体重增加量高32.11％；第3组(投喂0.6ugNPY2/g饲料)比第4组(投喂普通饲料的对照组)体重增加量高12.60％；第5组(投喂0.3ugNPY1/g饲料)比第4组(投喂普通饲料的对照组)体重增加量高43.05％。(每组体重增长是三个平行的平均值，每个平行有12条鱼n＝12)
从起始体重和末体重来看，实验起始5个投喂组之间体重无任何显著性差异两两之间P＞0.05。实验结束时第1组体重比第4组体重高15.31％(P＜0.001)；第2组体重比第4组体重高16.59％(P＜0.001)；第3组体重比第4组体重高6.29％(P＝0.088＞0.05)；第5组体重比第4组体重高22.45％(P＜0.001)。
从体长来看，起始时各组无显著性差异，五十天和实验结束时第1组(P＜0.01)、2组(P＜0.001)、3组(P＜0.05)、5组(P＜0.001)体长均高于第4组对照组。
饲料摄取量上第1组、第2组、第5组比第4组(对照组)高18.03％(P＜0.01)，20.80％(P＜0.01)，9.41％(P＞0.05，无显著性差异)，30.22％(P＜0.001)。饲料系数方面，第1、2、5组分别为1.72±0.017(P＜0.01)，1.73±0.017(P＜0.01)，1.73±0.031(P＜0.01)，均明显小于第4组(饲料系数为1.89±0.02)。第3组饲料系数为1.85±0.065，相对对照组无显著性差异。
肝脏与内脏方面各组之间无显著性差异，肝脏内脏没有明显畸变。
结论：本发明作为一种新型环保基因产品饲料添加剂，能有效促进罗非鱼生长摄食并有效降低饲料系数(图14、15)。
一种罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中山大学
<120>一种罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统
<130>
<160>9
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cggcctcgag aaaagagagg ctgaagctta cccagtgaaa cca 43
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgatctagat caatgatgat gatgatgatg atacctctgt cttgt 45
<210>3
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
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<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
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<210>5
<211>630
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
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tgcttgggcg ccttgacgga ggcataccca gtgaaaccag agaaccccgg ggaggacgcc 120
cccgcggagg agctggccaa gtactactca gccctgagac attacatcaa cctcattaca 180
agacagaggt atgggaagag atccagtcct gagattctgg acacactggt ctcagagctg 240
ctgctgaagg aaagcacaga cacgcttcca cagtcaagat atgacccatc aatgtggtga 300
tgctgccatc actctcgtct cgctcactgc tgtcccgcca gcgctgacat tctgacctct 360
acacgtccgt cacttacctc ctacaccaaa cgaacaccac gcctctgccc tcctttcgcc 420
tccatgagcc gcaacgtata tatccaaccc ctcttcctta cgcatcagcc acacccaaca 480
ctgcttgaag tctgtgccat aaaactgtaa atactttatt ctgagtcgtc atctgtgcaa 540
catgatcgta aagtggagga gggggggtct gctgattgta ttgtatattt gtgctattaa 600
agattcactg tttgaaaaaa aaaaaaaaaa 630
<210>6
<211>166
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cggcctcgag aaaagagagg ctgaagctta cccagtgaaa ccagagaacc ccggggagga 60
cgcccccgcg gaggagctgg ccaagtacta ctcagccctg agacattaca tcaacctcat 120
tacaagacag aggtatcatc atcatcatca tcattgatct agatca 166
<210>7
<211>144
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cggcctcgag aaaagagagg ctgaagctta cccagtgaaa ccagagaacc ccggggagga 60
cgcccccgcg gaggagctgg ccaagtacta ctcagccctg agacattaca tcaacctcat 120
tacaagacag aggtatctag agca 144
<210>8
<211>226
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ctcgagaaaa gagaggctga agcttaccca gtgaaaccag agaaccccgg ggaggacgcc 60
cccgcggagg agctggccaa gtactactca gccctgagac attacatcaa cctcattaca 120
agacagaggt atcatcatca tcatcatcat tgatctagat caacaaaaac tcatctcaga 180
agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattga 226
<210>9
<211>201
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ctcgagaaaa gagaggctga agcttaccca gtgaaaccag agaaccccgg ggaggacgcc 60
cccgcggagg agctggccaa gtactactca gccctgagac attacatcaa cctcattaca 120
agacagaggt atctagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac 180
catcatcatc atcatcattg a 201
Claims (8)
1.一种罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统，包括表达载体和重组株，其特征在于是将带酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因克隆入毕赤酵母表达载体中得到重组毕赤酵母表达载体，再将重组毕赤酵母表达载体转化入毕赤酵母感受态细胞，得到毕赤酵母重组株，该重组株表达罗非鱼神经肽Y重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统，其特征在于所述带酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因的合成方法是以罗非鱼神经肽Y克隆入载体中，以其为模板设计三个引物，上游引物A含有XhoI酶切位点，如SEQID NO：1所示；下游引物B含有XbaI酶切位点和6×His标签序列，如SEQ IDNO：2所示；下游引物C含有XbaI酶切位点，不含6×His标签序列，如SEQ IDNO：3所示；通过PCR方法得到两段带有不同酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因。
3.根据权利要求2所述的罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统，其特征在于所述重组毕赤酵母表达载体是将两段带有不同酶切接头的罗非鱼神经肽Y基因分别克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ□A中得到的两个重组毕赤酵母表达载体D和E。
4.根据权利要求3所述的罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统，其特征在于所述毕赤酵母重组株是将两个重组毕赤酵母表达载体D和E分别转入毕赤酵母X-33感受态细胞中，经培养得到的两个毕赤酵母重组株F和G。
5.权利要求4所述罗非鱼神经肽Y重组蛋白的表达系统表达的罗非鱼神经肽Y重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白是由两个毕赤酵母重组株F和G经发酵培养、分离纯化得到的。
6.权利要求5所述罗非鱼神经肽Y重组蛋白的生产方法，其特征在于所述方法为：将毕赤酵母重组株接种在含有BMGY的培养基中培养，离心收集菌体并重悬于YPM培养基中培养，收集上清，经分离纯化后得到罗非鱼神经肽Y重组蛋白。
7.根据权利要求6所述罗非鱼神经肽Y重组蛋白的生产方法，其特征在于所述方法为：将毕赤酵母重组株接种在含有BMGY的液体培养基中，30℃，250rpm培养至OD600为2~6，离心收集菌体并重悬菌体于YPM液体培养基中，使其OD600为1，30℃，250rpm培养12h后收集上清，经分离纯化后得到罗非鱼神经肽Y重组蛋白。
8.权利要求5所述罗非鱼神经肽Y重组蛋白的应用，其特征在于所述重组蛋白用于制备鱼苗促生长剂或饲料添加剂。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101984057A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-03-09 | 山东大学 | 一种尼罗罗非鱼性别差异性分子标记及其应用 |
| CN104371007A (zh) * | 2014-11-14 | 2015-02-25 | 中山大学 | 一种能促进罗非鱼生长激素表达的多肽pp1及其应用 |
| CN109097381A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-12-28 | 深圳大学 | 一种石斑鱼重组神经肽y的融合表达载体、制备方法以及其本身 |
| CN109369793A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-02-22 | 浙江海洋大学 | 虎斑乌贼神经肽sCAP及其用途 |
| CN113354723A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-09-07 | 中山大学 | 吉富罗非鱼神经分泌肽gl及其应用 |
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2009
- 2009-12-25 CN CN200910214231A patent/CN101824435A/zh active Pending
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