CN104955470B

CN104955470B - 利用了hmgb1片段的针对脊髄损伤的新型治疗方法

Info

Publication number: CN104955470B
Application number: CN201380067951.4A
Authority: CN
Inventors: 玉井克人; 山崎尊彦; 崔文浩
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Storm & Co. Ltd.; Osaka University NUC
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2017-06-16
Anticipated expiration: 2033-10-24
Also published as: MX365899B; HK1213201A1; KR20150102957A; TR201807769T4; BR112015008745A2; RU2649069C2; SG11201503215XA; JP6253590B2; US9688733B2; MX2015005253A; CA2889299C; CN104955470A; KR102146822B1; WO2014065348A1; EP2913059A4; ES2673861T3; JPWO2014065348A1; AU2013335685B2; CA2889299A1; DK2913059T3

Abstract

本发明合成了由HMGB1蛋白的一部分构成的具有适当长度的片段肽，并确认了该肽显示脊髄损伤的治疗效果。

Description

利用了HMGB1片段的针对脊髄损伤的新型治疗方法

技术领域

本发明涉及包含HMGB1片段的针对脊髄损伤的新型治疗用药物组合物及其用途。

背景技术

骨髄间充质干细胞是具有多能性的生物体内干细胞，已知能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨等。近年来已开始报告，通过对具有脑梗塞等组织损伤的患者施用自体骨髄间充质干细胞，能够促进组织损伤的痊愈。但是，骨髄间充质干细胞由于是存在于骨髄中的稀少的细胞，因此能够从患者采集的量存在限制。因此，难以确保宽范围的组织损伤的治疗所需要量的骨髄间充质干细胞。因此，现在发展了通过将骨髄间充质干细胞临时培养、使其增殖来确保治疗所需的细胞数的方法。但是，将骨髄间充质干细胞维持未分化状态地进行培养是极其困难的。另外，还存在很多病毒、细菌的污染、细胞的癌化等这样附随的需要解决的课题。另外，用于培养安全性、品质得到保证的细胞的费用极其可观。

另一方面，已知骨髄间充质干细胞对脊髄损伤具有痊愈促进效果。该效果推测是由于具有多能性的骨髄间充质干细胞分化成神经细胞、或者聚集于损伤组织的骨髄间充质干细胞供给生长因子等具有组织损伤改善效果的成分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2008/053892

专利文献2：WO2007/015546

专利文献3：WO2009/133939

专利文献4：WO2009/133943

专利文献5：WO2009/133940

专利文献6：WO2004/004763

非专利文献

非专利文献1：Bustin等、Mol Cell Biol、19：5237-5246、1999年

非专利文献2：Hori等、J.Biol.Chem.、270、25752-25761、1995年

非专利文献3：Wang等、Science、285：248-251、1999年

非专利文献4：Muller等、EMBO J、20：4337-4340、2001年

非专利文献5：Wang等、Science、285：248-251、1999年

非专利文献6：Germani等、J Leukoc Biol.、81(1)：41-5、2007年

非专利文献7：Palumbo等、J.Cell Biol.、164：441～449、2004年

非专利文献8：Merenmies等、J.Biol.Chem.、266：16722-16729、1991年

非专利文献9：Wu Y等、Stem cells、25：2648-2659、2007年

非专利文献10：Tamai等、Proc Natl Acad Sci USA.、108(16)：6609-6614、2011年

非专利文献11：Yang等、J Leukoc Biol.81(1)：59-66、2007年

非专利文献12：Basso等、J Neurotrauma.、23(5)：635-659、2006年

非专利文献13：Rahimi-Movaghar等、Int J Neurosci.、118(10)：1359-1373、2008年

非专利文献14：Quertainmont R等、PloS One.、7(6)：e39500、2012年

发明内容

发明所要解决的课题

脊髄损伤虽然是下半身的麻痹所导致的歩行困难等对患者而言生活品质极大丧失的疾病，但是却无望自然痊愈，甚至尚没有建立有效的治疗方法。如上所述，目前细胞治疗等再生医疗在脊髄损伤治疗中的应用受到期待，但尚在开发中。另外，即使得以实用化，也还没有解决高额的治疗费用等课题。

但是，若能够通过施用具有将骨髄间充质干细胞动员到损伤部位的活性的药物来促进脊髄损伤的痊愈，则可期待能够对目前几乎没有有效治疗方法的脊髄损伤的患者提供廉价且安全的治疗方法。

用于解决课题的手段

迄今为止，发明者们已清楚了，HMGB1(高迁移率族蛋白-1，High mobility groupbox 1)是具有刺激骨髄中的间充质干细胞游走、动员到血中的活性的蛋白。一直以来，已知HMGB1是非组蛋白核蛋白的主要成分，其分子内具有BoxA和BoxB这2个DNA结合区域。另外还已知，核内的HMGB1的功能在于使核小体结构松弛并构建最适合转录反应的结构。但是，近年来清楚了，核蛋白HMGB1虽然不具有分泌信号，但却被分泌到细胞外而发挥各种活性。最深入的研究是作为炎症的中介物(mediator)的功能。例如弄清楚了，在小鼠的败血症模型(LPS施用模型)中，在TNFα刺激下从吞噬细胞分泌的HMGB1是败血症的中介物(Wang etal.：Science1999；285：248-251)，并作为候补受体而已知TLR4。另外，HMGB1的最有名的受体为RAGE，已报告该受体与HMGB1的结合影响细胞的游走活性和炎症性的信号传递。

本发明中，公开了含有HMGB1片段的针对脊髄损伤的新型治疗用药物组合物及其用途。

具体而言，本发明者们通过肽合成制作了由HMGB1蛋白的第1～44个氨基酸构成的肽(序列号5)、由第11～44个氨基酸构成的HMGB1片段(序列号4)。将制作的各HMGB1片段施用给能够评价脊髄损伤的治疗效果的小鼠疾病模型，确认了该片段对脊髄损伤的治疗效果。

本申请基于该认识，提供以下发明。

[1]一种用于治疗脊髄损伤的药物组合物，其含有HMGB1片段肽。

[2]根据[1]的药物组合物，其中，所述HMGB1片段肽为包含选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列的肽。

[3]根据[1]的药物组合物，其中，所述HMGB1片段肽为由选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列构成的肽。

[4]一种脊髄损伤的治疗方法，其包含施用HMGB1片段肽的工序。

[5]根据[4]的方法，其中，所述HMGB1片段肽为包含选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列的肽。

[6]根据[4]的方法，其中，所述HMGB1片段肽为由选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列构成的肽。

[7]一种用于治疗脊髄损伤的HMGB1片段肽。

[8]根据[7]的HMGB1片段肽，其中，所述HMGB1片段肽为包含选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列的肽。

[9]根据[7]的HMGB1片段肽，其中，所述HMGB1片段肽为由选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列构成的肽。

[10]HMGB1片段肽在制造用于治疗脊髄损伤的药物中的用途。

[11]根据[10]的用途，其中，所述HMGB1片段肽为包含选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列的肽。

[12]根据[10]的用途，其中，所述HMGB1片段肽为由选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列构成的肽。

附图说明

图1A为表示各种合成肽的PDGFRα阳性株化骨髄间充质干细胞的游走刺激活性的照片。包含最小片段即HMGB1片段肽(17～25)的所有片段肽显示细胞游走刺激活性。

图1B为表示不同长度的HMGB1片段肽所具有的PDGFRα阳性株化骨髄间充质干细胞的游走刺激活性的照片。各肽通过肽合成制作。附随的图是对各片段肽的细胞游走刺激活性进行定量化而得到的。通过该实验，显示HMGB1片段肽(17-25)为具有游走刺激活性的最小片段。

图2A中，与阴性对照组(PBS施用)相比，HMGB1片段(11-44)施用组中可见显著性的神经症状的改善效果。(相对于PBS：*p<0.05，**p<0.01)

图2B为脊髄的HE染色的图。与阴性对照组(PBS施用)相比，在HMGB1片段(11-44)施用组中，脊髄的损伤部位的尺寸缩小，在病理组织中也可见治疗效果。

图3为经时比较HMGB1全长和HMGB1片段(11-44)施用组在制作了脊髄损伤的动物疾病模型中的神经症状改善效果的图。

图4为比较HMGB1片段(11-44和1-44)施用组在制作了脊髄损伤的动物疾病模型中的神经症状改善效果的图。(#：1～44，相对于PBS：#p<0.05；*：11～44，相对于PBS：*p<0.05)

具体实施方式

本发明提供用于治疗脊髄损伤的药物组合物，其含有具有细胞游走刺激活性的HMGB1片段肽。本发明的用于治疗脊髄损伤的药物组合物在本说明书中也表述为药物、药剂或药学的组合物。

本发明中，“脊髄损伤”是指脊髄的外因性或内因性损伤。脊髄的外因性损伤中包括例如脊髄的外伤性损伤等，但并不限定于此。另外，本说明书中，脊髄的外因性损伤也仅表述为“脊髄损伤”。

本发明中，细胞游走刺激活性是指刺激细胞游走的活性。本说明书中，细胞游走刺激活性也表述为细胞游走诱导活性或细胞诱导活性。

本发明的药物组合物对施用、添加部位没有限定。即，该组合物施用给需要再生的脊髓损伤部位、与该损伤部位不同的部位、血中等的任意部位，均能够发挥其效果。例如，通过施用、添加该组合物，细胞被动员到施用、添加部位或其附近的部位，诱导或促进损伤的再生。又例如，通过将该组合物施用、添加到损伤部位或其附近，细胞被动员到该损伤处，诱导或促进损伤部位的再生。再例如，通过将该组合物施用、添加到与需要再生的组织不同的组织，骨髄细胞被从骨髄通过末梢循环动员到需要再生的组织，诱导或促进再生。这里，“末梢循环”也称为“血液循环”、“末梢循环血流”。

施用到与需要再生的组织不同的组织是指，施用到除需要再生的部位以外的部位(与需要再生的部位不同的部位)。因此，“与需要再生的组织不同的组织”也可表述为与需要再生的组织不同的部位、与需要再生的部位不同的部位、远离需要再生的组织的部位、远离需要再生的部位的部位、位于需要再生的部位的远端的部位、位于需要再生的组织的远端的组织、远端部、远端组织。即，本发明的组合物可有效用于使难以从体外直接施用药剂的组织再生。另外，作为与需要再生的组织不同的组织，可例示出血液组织、肌肉组织、皮下组织、皮内组织、腹腔等。

另外，本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举未分化的细胞、处于各分化阶段的细胞，但不限定于这些。另外，本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举干细胞、非干细胞等，但不限定于这些。干细胞包括循环性的干细胞或非循环性的干细胞。作为非循环性的干细胞，可以例示常驻在组织中的组织干细胞。作为循环性的干细胞，可以例示血中循环性的干细胞。

另外，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举骨髄来源的细胞或造血系干细胞，但不限定于此。本说明书中，“造血系干细胞”为能够分化成中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等白细胞、以及红细胞、血小板、肥大细胞、树突细胞等血细胞系细胞的干细胞；作为标记物，已知对于人而言为CD34阳性、CD133阳性，对于小鼠而言为CD34阴性、c-Kit阳性、Sca-1阳性、Lineagemarker阴性。另外，造血系干细胞的特征在于，在培养皿中培养的情况下，难以单独培养，需要与基质细胞共培养。

本说明书中，“骨髄细胞”是指存在于骨髄内的细胞，另一方面，“骨髄来源的细胞”是指从骨髄动员到骨髄外的“骨髄细胞”。“骨髄细胞”包括包含存在于骨髄中的组织前体细胞集团的细胞。另外，“骨髄来源的细胞”可以是包括成血管干细胞(mesoangioblast)的细胞，也可以是除外成血管干细胞的细胞。

组织前体细胞定义为具有向血液系以外的特定组织细胞分化的单向分化能力的未分化细胞，包括具有向上述的间充质系组织、上皮系组织、神经组织、实体器官、血管内皮分化的能力的未分化细胞。

本说明书中，“骨髄间充质干细胞”、“骨髄间质多能细胞”、或“骨髄多能干细胞”为存在于骨髄内的细胞，是具有如下特征的细胞：从骨髄中直接采集或从其他组织(血液或皮肤、脂肪、其他组织)间接地采集，能够作为附着到培养皿(塑料或玻璃制)上的贴壁细胞进行培养、增殖，且具有向骨、软骨、脂肪等间充质系组织(间充质干细胞)或骨骼肌、心肌以及神经组织、上皮组织(多能干细胞)分化的能力，是可以通过骨髄细胞采集而获得的细胞。

“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”是以造血系干细胞和来源于造血系干细胞的白细胞、红细胞、血小板、成骨细胞、纤维细胞等分化细胞或者迄今为止被称为骨髄间充质干细胞或骨髄间质多能干细胞或骨髄多能干细胞的细胞为代表的干细胞。本说明书中，“骨髄干细胞”是指存在于骨髄内的干细胞，另一方面，“骨髄来源的干细胞”是指从骨髄动员到骨髄外的“骨髄干细胞”。本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举“骨髄来源的干细胞”，但不限定于此。“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”可以通过骨髄采集(骨髄细胞采集)或末梢血采血来分离。造血系干细胞为非贴壁细胞，但“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”的一部分通过由骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血得到的血液中的单核细胞级分细胞培养，能够以贴壁细胞的形式获得。

另外，“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”包括间充质干细胞，优选具有向成骨细胞(诱导分化时可以通过确认钙的沉积来确定)、软骨细胞(可以通过阿尔新蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来确定)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性来确定)以及成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、腱细胞等间充质系细胞以及神经细胞、上皮细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、血管内皮细胞分化的能力。分化后的细胞不限定于上述细胞，也包括向肝脏、肾脏、胰腺等实体器官细胞分化的能力。

另外，从骨髄动员到骨髄外的“骨髄来源的骨髄间充质干细胞”、“骨髄来源的骨髄间质多能细胞”或“骨髄来源的骨髄多能干细胞”是可以通过末梢血采血以及从脂肪等间充质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织中采集而获得的细胞。

另外，这些细胞具有如下特征：通过采集后直接施用到生物体的损伤部或者将暂时附着到培养皿上的细胞施用到生物体的损伤部，还具有向例如构成皮肤的角化细胞等上皮系组织、构成脑的神经系的组织分化的能力。

骨髄间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髄多能干细胞、或被从骨髄动员到骨髄外的这些细胞优选除了具有向成骨细胞(诱导分化时可以通过确认钙的沉积来确定)、软骨细胞(可以通过阿尔新蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来确定)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性来确定)分化的能力外，还具有例如向成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、腱细胞等间充质系细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞(表达细胞角蛋白家族、毛发角蛋白家族等)、上皮系细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、内皮细胞以及肝脏、肾脏、胰腺等实体器官细胞分化的能力，但分化后的细胞并不限定于上述细胞。

作为人骨髄细胞、人骨髄来源的细胞，可以例示通过骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血、脂肪采集而获得、能够通过直接培养或在分离单核细胞级分后进行培养而以贴壁细胞的形式获得的细胞，但并不限定于此。作为人骨髄细胞、人骨髄来源的细胞的标记物，可以例示：PDGFRα阳性、Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、CD90阳性、CD29阳性、Flk-1阴性、CD105阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD71阳性、Stro-1阳性、CD106阳性、CD166阳性、CD31阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。

另外，作为小鼠骨髄细胞、小鼠骨髄来源的细胞，可以例示能够通过骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血、脂肪采集而获得、通过直接培养或在分离单核细胞级分后进行培养而以贴壁细胞的形式获得的细胞，但并不限定于此。作为小鼠骨髄细胞、小鼠骨髄来源的细胞的标记物，可以例示：CD44阳性、PDGFRα阳性、PDGFRβ阳性、CD45阴性、Lin阴性、Sca-1阳性、c-kit阴性、CD90阳性、CD29阳性、Flk-1阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。

本发明中，作为被刺激游走的细胞，可以列举PDGFRα阳性细胞，但不限定于此。另外，对被刺激游走的PDGFRα阳性细胞没有特别限制，优选为骨髄来源的PDGFRα阳性细胞。另外，作为除PDGFRα以外的标记物，可以例示：CD29阳性、CD44阳性、CD90阳性、CD271阳性、CD11b阴性、Flk-1阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。作为PDGFRα阳性细胞，可以例示：PDGFRα阳性的骨髄来源的细胞、PDGFRα阳性的骨髄来源的骨髄间充质干细胞、常驻在PDGFRα阳性的组织内的组织细胞(例如可以例示成纤维细胞等)、PDGFRα阳性的骨髄来源的细胞等能够通过由骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血得到的血液中的单核细胞级分细胞培养以贴壁细胞的形式得到的细胞等，但并不限定于这些。

作为本发明中的HMGB1蛋白，可以例示：作为人来源的HMGB1蛋白的包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白、作为编码该蛋白的DNA的包含序列号2所示的碱基序列的DNA，但并不限定于这些。

本发明中的“具有细胞游走刺激活性的HMGB1片段肽”是指具有细胞游走刺激活性的由HMGB1蛋白的一部分构成的肽。本发明的由HMGB1蛋白的一部分构成的片段肽只要具有细胞游走刺激活性，则没有特别限制，优选为由本发明者们通过实验确认的具有细胞游走刺激活性的片段中最小的肽片段、即至少包含HMGB1蛋白的第17～25个氨基酸序列(序列号3)的HMGB1片段肽(图1)。

本发明中，作为由具有细胞游走刺激活性的HMGB1片段构成的肽，可例示出以下的片段，但并不限定于这些。

本发明中，作为具有细胞游走刺激活性的HMGB1片段，可列举出包含选自序列号3、序列号4和序列号5的氨基酸序列中的氨基酸序列的片段肽、即具有细胞游走刺激活性的HMGB1片段肽。作为这些片段肽，可列举出例如至少包含序列号3的片段肽(17-25)且以序列号4的片段肽(11-44)为上限的片段肽、或至少包含序列号4的片段肽(11-44)且以序列号5的片段肽(1-44)为上限的片段肽、或至少包含序列号3的片段肽(17-25)且以序列号5的片段肽(1-44)为上限的片段肽等，但并不限定于这些。

本发明中，作为具有细胞游走刺激活性的HMGB1片段肽，可列举出由选自序列号3、序列号4和序列号5的氨基酸序列中的氨基酸序列构成的片段肽、即具有细胞游走刺激活性的HMGB1片段肽。

本发明的组合物的施用方法可列举出经口施用或非经口施用，作为非经口施用方法，具体而言，可列举出注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等，但并不限定于这些。作为注射施用的例子，例如可通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等将本发明的组合物施用到全身或局部的(例如皮下、皮内、皮肤表面、眼球或者眼睑结膜、鼻腔粘膜、口腔内和消化管粘膜、阴道/子宫内粘膜或损伤部位等)。

另外，作为本发明的组合物的施用方法，可例示出例如血管内施用(动脉内施用、静脉内施用等)、血液内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、腹腔内施用，但并不限定于这些。

另外，对施用部位没有限制，可例示出需要再生的组织部位或其附近、与需要再生的组织不同的部位、或相对于需要再生的组织为远端且不同位置的部位。可列举出例如血中(动脉内、静脉内等)、肌肉、皮下、皮内、腹腔内，但并不限定于这些。

另外，可以根据患者的年龄、症状适当选择施用方法。在施用本发明的肽的情况下，可以在例如1次施用以每1kg体重计为0.0000001mg至1000mg的范围内选择施用量。或者，可以在例如每一位患者为0.00001至100000mg/body的范围内选择施用量。在施用分泌本发明的肽的细胞或插入有编码该肽的DNA的基因治疗用载体的情况下，也可以以使该肽的量在上述范围内的方式施用。但是，本发明的药物组合物并不限定于这些施用量。

本发明的HMGB1片段肽可通过将编码该肽的DNA组入适当的表达体系制备基因重组体(recombinant)来得到，或者也可以人工合成。本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，MarkPublishing Company，Easton，U.S.A)，可以同时含有药物上容许的载体、添加物。可以列举例如：表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、助悬剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但不限定于这些，可以适当使用其他常用的载体。具体而言，可以列举：轻质硅酸酐、乳糖、微晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。

另外，本说明书中引用的所有现有技术文献作为参考并入本说明书中。

通过以下的实施例对本发明进行进一步例示，但本发明并不限定于下述的实施例。

实施例1

合成肽迁移活性的确认

(方法)

委托MBL(株式会社医学生物学研究所)采用固相法合成以下的肽。需要说明的是，虽然基于小鼠HMGB1的序列合成肽，但小鼠和人的HMGB1从第1～169个氨基酸序列全部一致，具有100％同源性。

由HMGB1的第1～10个的氨基酸序列构成的合成肽(1-10)、

由第1～34个氨基酸序列构成的合成肽(1-34)、

由第11～20个氨基酸序列构成的合成肽(11-20)、

由第11～25个氨基酸序列构成的合成肽(11-25)、

由第11～30个氨基酸序列构成的合成肽(11-30)、

由第11～34个氨基酸序列构成的合成肽(11-34)、

由第11～44个氨基酸序列构成的合成肽(11～44)、

以及，作为阳性对照，将由HEK293生产的小鼠全长HMGB1(1-215(HEK))调整为100μg/ml，放入趋化小室的下层，研究对小鼠骨髄间充质干细胞株(MSC-1细胞，大阪大学玉井等制作(Tamai等，Proc Natl Acad Sci U S A.，108(16)：6609-6614，2011年)的迁移活性。

(结果)

至少合成肽(11-34)、(1-34)、(11～44)、(1～44)、(11-30)可见与阳性对照同等以上的活性(图1A)。另外，合成肽(11-25)也可见活性(图1A)。

(方法)

为了进一步收缩活性中心部分，如下合成了短肽。

由HMGB1的第11～25个氨基酸序列构成的合成肽(11-25)、

由第12～25个氨基酸序列构成的合成肽(12-25)、

由第13～25个氨基酸序列构成的合成肽(13-25)、

由第14～25个氨基酸序列构成的合成肽(14-25)、

由第15～25个氨基酸序列构成的合成肽(15-25)、

由第16～25个氨基酸序列构成的合成肽(16-25)、

由第17～25个氨基酸序列构成的合成肽(17-25)。

作为阳性对照，使用将1日龄小鼠皮肤(1只的量)浸入PBS并在4℃下孵育12小时而得到的离心上清(皮肤提取物)、和由HEK293生产的小鼠全长HMGB1(1-215(HEK))。将株化骨髄间充质干细胞株(MSC-1)加入趋化小室的上层，这些蛋白/合成肽以5μM或10μM的浓度插入趋化小室的下层。迁移分析采用与上述同样的方法施行。

(结果)

全部的合成肽可见活性(图1B)。HMGB1片段肽(17-25)显示为具有游走刺激活性的最小片段。

实施例2

(方法)

受验动物使用小鼠C57BL6/J、7周龄雌性小鼠。用异氟醚进行吸入麻醉，切开背部正中线的皮肤使第9胸椎的椎弓露出并切除。使该部位的硬膜露出，用微型持针器从硬膜上将脊髄夹住3秒钟，制作外伤性脊髄损伤。在制作脊髄损伤后将皮肤缝合。脊髄损伤的确认通过评价手术第二天两后肢的麻痹来进行，将未见麻痹的小鼠从试验中排除。将HMGB1的片段(氨基酸序列：第11～44个氨基酸、合成肽，由MBL制造)100μg稀释到Dulbecco的PBS(D-PBS)200μL中，制备试验药。阴性对照使用D-PBS 200μL。手术第二天从尾静脉进行初次施用，之后每日进行计5次的施用。关于神经症状的评价，在术后的第1、3、7、10、14、17、21日进行BMS(后肢运动功能评分，Basso Mouse Scale)评分。

(结果)

BMS评分中，与PBS施用组相比，施用了HMGB1片段的组中从手术后第3日可观察到显著性的神经症状的改善。特别是术后第3日、第7日、第14日、第17日的症状改善显著(图2A)。另外，在损伤部位的脊髄的HE染色像中，阴性对照组可见宽范围的损伤(D1)，而HMGB1片段(11～44肽)施用组可见损伤部分(D2)缩小、病理组织上也可见治疗效果(图2B)。

(考察)

通过施用HMGB1片段，可见脊髄受到损伤的小鼠的神经症状明显改善。本试验中使用的HMGB1片段可见骨髄间充质干细胞的动员活性，可期待被动员的骨髄间充质干细胞产生脊髄损伤的治疗效果。作为针对骨髄间充质干细胞的组织损伤的作用，除了因多能性而向神经分化引起的组织再生以外，还可期待骨髄间充质干细胞所分泌的生长因子、细胞因子等引起的损伤组织的保护作用。本次试验中推测，到术后第1周至的短期效果为后者的作用，之后前者的作用再发挥影响。

实施例3

(方法)

受验动物使用小鼠C57BL6/J、7周龄雌性小鼠。用异氟醚进行吸入麻醉，切开背部正中线的皮肤使第9胸椎的椎弓露出并切除。使该部位的硬膜露出，用微型持针器从硬膜上将脊髄夹住3秒钟，制作外伤性脊髄损伤。在制作脊髄损伤后将皮肤缝合。脊髄损伤的确认通过评价手术第二天两后肢的麻痹来进行，将未见麻痹的小鼠从试验中排除。HMGB1的片段通过将(氨基酸序列：第11～44个氨基酸、合成肽，由MBL制造)100μg稀释到Dulbecco的PBS(D-PBS)200μL中来制备。HMGB1的全长蛋白如已报告的通过将使HEK293表达、制造并精制的HMGB1(100μg)稀释到D-PBS200μL中来制备。阴性对照使用D-PBS 200μL。手术第二天从尾静脉进行初次施用，之后后每日进行计5次的施用。关于神经症状的评价，在术后的第1、3、7、14日进行BMS评分。

(结果)

用BMS评分评价神经症状的改善效果。在第7、14日的任一时刻，HMGB1片段(第11～44个氨基酸)施用组中均可见最有效的治疗效果。HMGB1(全长)施用组虽与阴性对照组相比可见治疗效果，但却未见如HMGB1片段(第11～44个氨基酸)那样的治疗效果(图3)。

(考察)

在制作脊髄损伤后，在早期、HMGB1全长施用组可见介于HMGB1片段(第11～44个氨基酸)施用组与阴性对照组中间的程度的治疗效果，但在脊髄损伤制作后第14日，在HMGB1片段(第11～44个氨基酸)施用组可见与其他组相比极其良好的改善。通过本次实验清楚了，在治疗效果方面具有针对脊髄损伤的超出全长蛋白的有效性。由于如本片段这样可化学合成的肽在药物制造中能够大量制造廉价且均匀的制品，因此考虑在实用化方面的有用性极高。

实施例4

(方法)

受验动物使用小鼠C57BL6/J、7周龄雌性小鼠。用异氟醚进行吸入麻醉，切开背部正中线的皮肤使第9胸椎的椎弓露出并切除。使该部位的硬膜露出，用微型持针器从硬膜上将脊髄夹住3秒钟，制作外伤性脊髄损伤。在制作脊髄损伤后将皮肤缝合。脊髄损伤的确认通过评价手术第二天两后肢的麻痹来进行，将未见麻痹的小鼠从试验中排除。HMGB1的片段通过将(氨基酸序列：第11～44个氨基酸和第1～44个氨基酸、合成肽，由MBL制造)100μg稀释到D-PBS 200μL中制备。阴性对照使用D-PBS 200μL。手术第二天从尾静脉进行初次施用，之后每日进行计5次的施用。关于神经症状的评价，在术后的第1、3、7、10、14、17、21、28日进行BMS评分。

(结果)

用BMS评分评价神经症状的改善效果。在17、21、28日的任一时刻，与阴性对照组相比在HMGB1片段(第11～44个氨基酸和第1～44个氨基酸)施用组均可见治疗效果。由第11～44个氨基酸构成的HMGB1片段和由第1～44个氨基酸构成的HMGB1片段的治疗效果基本为同程度(图4)。

(考察)

HMGB1片段11～44、1～44均可见在脊髄损伤的治疗效果方面的有效性。如图1所示，发明者们清楚了，HMGB1的骨髄间充质干细胞动员活性的核心区域之一为由第17个氨基酸至第25个氨基酸构成的肽。11～44的片段、1～44的片段均包含17～25，推测这些肽显示药效的核心肽为17～25的序列。据报告HMGB1全长蛋白动员骨髄间充质干细胞时并不介由RAGE(2011年PNAS玉井等)，并且也没有11～44的片段、1～44的片段为RAGE等已知受体的配体的报告，由此推测这些片段以迄今为止尚未知道的受体为靶。

产业上的可利用性

通过本发明，提供用于治疗脊髄损伤的维持了PDGFRα阳性细胞的动员活性的HMGB1片段肽的新用途。本发明的HMGB1片段肽相对于全长由215个氨基酸构成的HMGB1蛋白，分子量为约20％以下。这样的片段肽能够通过使用了肽合成机的化学合成来生产，因此在将肽制造为药物的情况下，可期待提高精制纯度、稳定生产、削减成本。

另外已知，全长的HMGB1具有与作为内毒素之一的LPS(脂多糖)结合的活性，当药品中即使少量混入LPS时，也会引起发热等，并常常与严重的副作用相关联，因此严格限制LPS在药品中的混入。HMGB1由于与LPS具有亲和性，因此难以将药品中混入的LPS完全除去。但是通过肽化会与LPS的亲和性降低，因此预计药品中LPS的混入也减少。因此，通过使用本发明中确定的包含PDGFRα阳性细胞动员部分的HMGB1片段，能够开发出更安全的脊髓损伤治疗用药物组合物。

通过将本发明的HMGB1片段直接施用到需要再生的脊髓损伤部位或其附近部位，能够诱导或促进该损伤的再生。此外，在静脉内施用等的方法中，通过将本发明的HMGB1片段施用到与需要再生的部位不同的部位，还能够诱导或促进脊髓损伤的再生。如此，本发明中，能够通过在一般诊疗中广泛施行的静脉施用进行脊髓损伤的治疗，因此能够将治疗剂以任意的次数、任意的浓度安全且简便地进行施用。与以往的治疗方法相比，该情况是本申请发明极其优异的方面之一。

另外，在目前的再生医疗或细胞治疗的现场，在生物体外培养患者来源的稀少的骨髄多能干细胞、在使其增殖后用于治疗，但该培养过程有伴随着细胞劣化(癌化或细菌、病毒等的污染)的危险，因此需要充分的安全管理。与此相对，基于本发明的治疗剂由于不包含将细胞取出到体外的工序、或增加人工操作的工序，因此认为安全性较高。与以往的治疗方法相比，该情况也是本申请发明优异的方面之一。

Claims

1.HMGB1片段肽在制造用于治疗脊髄损伤的药物中的用途，其中，所述HMGB1片段肽为至少包含序列号3的片段肽且以序列号5的片段肽为上限的片段肽。

2.HMGB1片段肽在制造用于治疗脊髄损伤的药物中的用途，其中，所述HMGB1片段肽为由选自序列号3、序列号4和序列号5中的氨基酸序列构成的肽。